特許 7624504 ミトコンドリアＤＮＡ品質管理

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-22

(45)【発行日】2025-01-30

(54)【発明の名称】ミトコンドリアＤＮＡ品質管理

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20250123BHJP

   C12Q 1/6809 20180101ALI20250123BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6809 Z

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2023507707

(86)(22)【出願日】2021-08-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-30

(86)【国際出願番号】 US2021044874

(87)【国際公開番号】W WO2022032052

(87)【国際公開日】2022-02-10

【審査請求日】2024-08-06

(31)【優先権主張番号】63/062,566

(32)【優先日】2020-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ルオユー

(72)【発明者】

【氏名】リム、ウェイ キアット

(72)【発明者】

【氏名】アトワル、グリンダ

【審査官】戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】J. Mol. Diagn.，2019年，vol.21, no.4，pp.593-601

【文献】bioRxiv，2020年07月17日，pp.1-25，doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.06.080952

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／６８－１／６８９７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の汚染された生物学的試料を特定する方法であって、前記方法が、
単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列決定リードを取得することと、
前記生物学的試料の各々について、前のステップからの前記ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、
各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、
各生物学的試料について総ヘテロプラスミー数を決定することと、
高ヘテロプラスミー数を有する生物学的試料に二次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、
同じ個体由来の前記生物学的試料の大部分に割り当てられた前記一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料を検出することと、
同じ個体由来の前記生物学的試料の大部分に割り当てられた前記一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料が汚染された生物学的試料であると決定することと、
前記１つ以上の汚染された生物学的試料を廃棄することと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記ヘテロプラスミーを特定することは、配列決定カバレッジ、マイナー対立遺伝子頻度、及びマイナー対立遺伝子の存在を決定することを含み、ヘテロプラスミーが存在するのは、ｉ）前記配列決定カバレッジが、≧５０である場合、ｉｉ）前記マイナー対立遺伝子頻度が、≧１％である場合、及びｉｉｉ）ＤＮＡデータについて、前記マイナー対立遺伝子が各鎖から少なくとも２回観察される場合、またはＲＮＡデータについて、前記マイナー対立遺伝子が少なくとも３回観察される場合である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ホモプラスミーを特定することは、配列決定カバレッジ及び１つ以上の対立遺伝子の存在を決定することを含み、ホモプラスミーが存在するのは、ｉ）前記配列決定カバレッジが、≧１０である場合、及びｉｉ）特定の核酸部位において１つの対立遺伝子のみが観察され、対応する参照対立遺伝子とは異なるか、または特定の核酸部位において複数の対立遺伝子が観察され、メジャー対立遺伝子が前記対応する参照対立遺伝子とは異なり、前記特定の核酸部位がヘテロプラスミー基準を満たさない場合である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記一次ｍｔＤＮＡハプログループを各生物学的試料に割り当てることが、前記ホモプラスミー及び前記ヘテロプラスミーのメジャー対立遺伝子を使用して、各生物学的試料についてのｍｔＤＮＡ配列を構築することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記二次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることが、前記ホモプラスミー及び前記ヘテロプラスミーのマイナー対立遺伝子を使用して二次ｍｔＤＮＡ配列を構築することと、前記割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料を、汚染された信頼できない生物学的試料として特定することと、を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記方法が、前記汚染された生物学的試料中の全てのヘテロプラスミーのヘテロプラスミー頻度の中央値を決定することによって、生物学的試料の汚染レベルを決定することを更に含み、前記ヘテロプラスミー頻度の前記中央値が大きいほど、前記汚染レベルが大きくなる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記方法が、ヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定する前に、品質管理及びアダプター配列除去のために前記核酸配列決定アッセイから取得した前記ｍｔＤＮＡ配列決定リードを処理して、品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記方法が、
前記品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、
前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをヒト参照ゲノムにマッピングすることと、
ｉ）前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、前記ミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、または前記ミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチが、ヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合、及び
ｉｉ）前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを保持することと、を更に含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記方法が、選別及び重複除去のために、前記保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記方法が、前記ヘテロプラスミー及び前記ホモプラスミーを特定する前、及び／または、品質管理及びアダプター配列除去のために前記ｍｔＤＮＡ配列決定リードを処理する前に、前記核酸配列決定アッセイから取得した前記ｍｔＤＮＡ配列決定リードを所望の深度までダウンサンプリングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記生物学的試料が、血液または組織である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記方法が、前記複数の生物学的試料に対して前記核酸配列決定アッセイを実行する前に、前記生物学的試料中の核酸分子を増幅することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記配列決定アッセイが、次世代配列決定（ＮＧＳ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ＮＧＳが、全ゲノム配列決定を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＮＧＳが、全エクソーム配列決定を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ＮＧＳが、ＲＮＡ配列決定を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記ＮＧＳが、亜硫酸水素塩配列決定を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

１つ以上の汚染された生物学的試料を特定する方法であって、前記方法が、
単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）生配列決定リードを取得することと、
品質管理及びアダプター配列除去のために前記ｍｔＤＮＡ生配列決定リードを処理して、品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、
前記品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、
前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをヒト参照ゲノムにマッピングすることと、
ｉ）前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、前記ミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、または前記ミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチが、ヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合、及び
ｉｉ）前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、前記候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを保持することと、
選別及び重複除去のために、前記保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することと、
前記生物学的試料の各々について、前記保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、
各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、
各生物学的試料について総ヘテロプラスミー数を決定することと、
高ヘテロプラスミー数を有する生物学的試料に二次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、
同じ個体由来の前記生物学的試料の大部分に割り当てられた前記一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料を検出することと、
前記割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料が汚染された生物学的試料であると決定することと、
前記１つ以上の汚染された生物学的試料を廃棄することと、
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、部分的には、誤標識されているか、または汚染されている可能性がある信頼できない生物学的試料を特定する方法を対象とする。

【背景技術】

【0002】

１０年以上にわたり、次世代配列決定（ＮＧＳ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料の大規模なバッチの配列決定を可能にするため、生物学的及び生物医学的研究の重要な構成要素となっている。ＮＧＳは、大規模なコホート遺伝子調査のための全ゲノム及び全エクソーム配列決定、臨床評価における疾患遺伝子発現シグネチャ特定のためのバルクＲＮＡ－ｓｅｑ、腫瘍研究／診断における組織生検配列決定、ならびに最近出現したシングルセル配列決定研究などの幅広い用途を有し、多くの異なる課題及び疑問に対する回答及び解決策を提供する。しかしながら、大規模な試料を含む研究では、試料同一性の複雑化は、一般的かつほぼ避けられない課題である。試料特定エラー率の推定値は、実際には０．２％～６％の範囲であり得る（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、及び、非特許文献４）。エラーは、様々な程度で発生する可能性がある：１）試料間の完全な入れ替え、及び／または２）１つ以上の他の試料による１つの試料の汚染。試料処理中の様々なステップで、試料収集中の試料の誤標識、ピペット操作中の材料の流出、配列決定を実行する際のプールされたライブラリ内でのインデックスの入れ替え、及び他の多くの予期しない状況などのエラーが発生する可能性がある。試料の入れ替え／汚染は、その後、下流分析の品質及び精度を低下させるであろう。例えば、全トランスクリプトーム解析における試料の入れ替えは、誤った発見につながるか、または差次的に発現される遺伝子を検出する能力を喪失させる場合がある。がん研究では、体細胞変異の多くが非常に低い頻度（５％未満）で存在していたことを考えると、それら変異の特定が日常的に使用され、したがって、低レベル（１％～５％）の汚染でさえ、偽陽性の変異コールをもたらす場合がある。それらの理由から、試料の入れ替え及び汚染の正確な検出は、大規模なＮＧＳ研究における重要な品質管理ステップである。

【0003】

ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞において不可欠な小器官である。ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、ミトコンドリア内に位置する１６．５ｋｂの環状ＤＮＡ分子であり、ミトコンドリア機能にとって不可欠な遺伝子産物をコードする。単一の細胞内には数百～数千のｍｔＤＮＡコピーがある。ｍｔＤＮＡは母性遺伝であり、組換えはごくわずかである。ｍｔＤＮＡは片親遺伝であり、個体群レベルでの組換えはごくわずかであるため、経時的に獲得された変異により、ヒト個体群がいくつかの別個のｍｔＤＮＡハプログループに細分化されている。平均して、２名のランダムな個体は、ミトコンドリアゲノムに３０～４０ヌクレオチドの差異を有するであろう（非特許文献５、非特許文献６、及び、非特許文献７）。そのマルチコピー性質のために、ｍｔＤＮＡ変異は、細胞のｍｔＤＮＡのごく一部にしか存在しない場合が多い（ヘテロプラスミーと呼ばれる状態）。変異を担持するｍｔＤＮＡのパーセンテージは、ヘテロプラスミー頻度と呼ばれる。対照的に、全てのｍｔＤＮＡ分子において変異が見出される場合、この変異は、ホモプラスミーと呼ばれる。以前の研究では、一般的に健康な個体群では、ほとんどの個体がミトコンドリアゲノム中に５個未満のヘテロプラスミー（頻度＞１～２％）を保有することが実証された（非特許文献８及び非特許文献９）。試料のバッチの場合、同じ個体から収集された試料は全て、同じハプログループに属する必要がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１３，１３９，９３－１００

【文献】Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１８，１９，３３２

【文献】Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１５，７５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐ５－０２－０８

【文献】Ｓｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１５．１４４，６６７－６７４

【文献】Ｇｕｎｎａｒｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，２，２２８

【文献】Ｓｌａｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９１，１２９，５５５－５６２

【文献】Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１４，１１１，Ｅ４５４８－Ｅ４５５０

【文献】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１７，１８，８９０

【文献】Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１４，１１１，１０６５４－１０６５９

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、信頼できない生物学的試料を特定する方法であって、当該方法が、ａ）単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列決定リードを取得することと、ｂ）生物学的試料の各々について、前のステップからのｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、ｃ）各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることであって、同じ個体由来の生物学的試料の大部分に割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループを有する任意の生物学的試料が、誤標識された生物学的試料である信頼できない生物学的試料である、割り当てることと、を含む、方法を提供する。

【0006】

本開示はまた、信頼できない生物学的試料を特定する方法であって、当該方法が、ａ）単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）生配列決定リードを取得することと、ｂ）生物学的試料の各々について、前のステップからのｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、ｃ）各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、ｄ）各生物学的試料について総ヘテロプラスミー数を決定することであって、生物学的試料のヘテロプラスミー数が高い場合、ヘテロプラスミー部位におけるマイナー対立遺伝子に基づいて、生物学的試料に二次ｍｔＤＮＡハプログループが割り当てられ、割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料が、汚染された信頼できない試料である、決定することと、を含む、方法を提供する。

【0007】

本開示はまた、信頼できない生物学的試料を特定する方法であって、当該方法が、ａ）単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）生配列決定リードを取得することと、ｂ）品質管理及びアダプター配列除去のためにｍｔＤＮＡ生配列決定リードを処理して、品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｃ）品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｄ）ｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、ミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、またはミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチが、ヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合、及びｉｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをヒト参照ゲノムに再マッピングし、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを保持することと、ｅ）選別及び重複除去のために、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することと、ｆ）生物学的試料の各々について、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、ｇ）各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることであって、同じ個体由来の生物学的試料の大部分に割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループを有する任意の生物学的試料が、誤標識された生物学的試料である信頼できない生物学的試料である、割り当てることと、を含む、方法を提供する。

【0008】

本開示はまた、信頼できない生物学的試料を特定する方法であって、当該方法が、ａ）単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）生配列決定リードを取得することと、ｂ）品質管理及びアダプター配列除去のためにｍｔＤＮＡ生配列決定リードを処理して、品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｃ）品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｄ）ｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、ミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、またはミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチが、ヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合、及びｉｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをヒト参照ゲノムに再マッピングし、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを保持することと、ｅ）選別及び重複除去のために、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することと、ｆ）生物学的試料の各々について、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、ｇ）各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、ｈ）各生物学的試料について総ヘテロプラスミー数を決定することであって、生物学的試料のヘテロプラスミー数が高い場合、生物学的試料に二次ｍｔＤＮＡハプログループが割り当てられ、割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料が、汚染された信頼できない試料である、決定することと、を含む、方法を提供する。

【0009】

本特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）付きの本特許または本特許出願公開の写しは請求及び必要手数料の支払いに応じて米国特許庁より提供される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本明細書に記載の品質管理分析を実施するための好適なステップを示す代表的な概略図を示す。ボックス１では、ｍｔＤＮＡホモプラスミー及びヘテロプラスミーを、ｆａｓｔｑファイルから特定する。任意選択的なダウンサンプリングステップは、高いｍｔＤＮＡカバレッジを有する試料に適用することができる。リードのＱＣ後、２段階のマッピング戦略によってｍｔＤＮＡリードを選択する。ｍｔＤＮＡマッピング結果からｍｔＤＮＡバリアントを特定し、バリアント情報に基づいて、一次及び二次ｍｔＤＮＡハプログループを各試料に割り当てる。ボックス２では、所与の個体由来の試料のハプログループ割り当てを比較することによって、試料の入れ替え／誤標識を検出することができる。ボックス３では、試料汚染は、異常な高いｍｔＤＮＡヘテロプラスミー数及びマッチしていない一次及び二次ハプログループによって検出できる。

【図2A】仮想汚染試料に対する本明細書に記載の方法の性能を示す。仮想汚染試料は、１０００人ゲノムプロジェクト（１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）からの２つの試料を異なる比率で混合することによって作成した。Ｘ軸は理論的汚染レベルを示し、Ｙ軸は各仮想汚染試料から特定されるヘテロプラスミー頻度を示す。各色のドットは、１つのヘテロプラスミーを表し、黒色のドットは、試料中のヘテロプラスミー頻度の平均を表し、エラーバーは、頻度の標準誤差を表す。頻度の平均は、理論的汚染レベルと有意に相関している（ピアソン相関＝０．９９６７８１、Ｐ値＝６．２１２ｅ－０９）。

【図2B】仮想汚染試料に対する本明細書に記載の方法の性能を示す。仮想汚染試料は、１０００人ゲノムプロジェクト（１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）からの２つの試料を異なる比率で混合することによって作成した。Ｘ軸は理論的汚染レベルを示し、Ｙ軸は各仮想汚染試料から特定されるヘテロプラスミー頻度を示す。各色のドットは、１つのヘテロプラスミーを表し、黒色のドットは、試料中のヘテロプラスミー頻度の平均を表し、エラーバーは、頻度の標準誤差を表す。頻度の平均は、理論的汚染レベルと有意に相関している（ピアソン相関＝０．９９６７８１、Ｐ値＝６．２１２ｅ－０９）。

【図3】仮想汚染試料における汚染の検出の結果を示す。

【図4-1】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図4-2】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図4-3】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図4-4】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図4-5】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図4-6】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図4-7】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ１における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-1】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-2】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-3】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-4】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-5】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-6】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-7】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【図5-8】ＲＮＡ－ｓｅｑデータ２における試料の入れ替え及び汚染の検出からの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書では、ｍｔＤＮＡ配列情報を活用して、ＮＧＳデータ中の潜在的な試料の誤標識及び汚染を検出するための方法を提示する。ｍｔＤＮＡ多型及び変異は、特定の生物学的試料の同一性を推定するために使用でき、試料の誤標識の指標として機能し得る。加えて、生物学的試料が別の生物学的試料からのＤＮＡ／ＲＮＡによって汚染される場合、異常なｍｔＤＮＡ変異パターンが明らかにされ、これは、汚染物質を特定し、更に定量化するのを助けることができる。核ＤＮＡ変異に基づくアプローチと比較して、本明細書に記載の方法は、低カバレッジの配列決定データにおいても、より高い感度を可能にする。

【0012】

本明細書に記載の方法は、十分なｍｔＤＮＡリードを含む任意のＮＧＳデータを入力として取得し、データからｍｔＤＮＡバリアント（ヘテロプラスミー及びホモプラスミー）を特定し、バリアント情報を使用して各試料にハプログループを割り当てて、潜在的な試料の入れ替えまたは誤標識を検出することができる。試料のヘテロプラスミー情報を評価することによって、本明細書に記載の方法は、個体間の汚染を更に検出することができる。

【0013】

本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、制限するように意図するものではない。
ヒトは、野生型（または参照）ｍｔＤＮＡ分子を有し、変異体ｍｔＤＮＡ分子を有し得る。ヒトが変異体ｍｔＤＮＡ分子を有しない場合、そのようなヒトは、ホモプラスミー野生型（またはホモプラスミー参照）であると考えられる。ヒトが野生型ｍｔＤＮＡ分子を有しない（すなわち、変異体ｍｔＤＮＡしか有しない）場合、そのようなヒトは、ホモプラスミー変異体であると考えられる。したがって、ホモプラスミーは、変異体ｍｔＤＮＡの全てのコピーを有しているか、または全く有していないことの尺度である。

【0014】

ヒトが野生型ｍｔＤＮＡ分子と変異体ｍｔＤＮＡ分子の混合物を有する場合、ヒトは、ヘテロプラスミーを有すると考えられる。変異型コピーの割合は、本明細書では「ヘテロプラスミー頻度」と呼ばれる。例えば、ヒトがｍｔＤＮＡ分子の８つのコピーを有し、遺伝子Ａに特定の変異を有する８つのｍｔＤＮＡ分子の単一のコピーを有すると仮定すると、そのようなヒトのヘテロプラスミー頻度は、１２．５％（すなわち、１／８）であると考えられる。ヘテロプラスミーは、特定の個体のｍｔＤＮＡゲノム内の各変異について決定することができる。したがって、（野生型ｍｔＤＮＡと比較して）２つのｍｔＤＮＡ変異を有する個体は、２つのヘテロプラスミーを有することができる。各ヘテロプラスミーは、それ自体のヘテロプラスミー頻度に関連している。

【0015】

本開示は、信頼できない生物学的試料を特定する方法を提供する。本方法は、単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列決定リードを取得することを含む。本方法はまた、生物学的試料の各々について、ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおける１つ以上のヘテロプラスミー及びホモプラスミーの存在を特定することを含む。本方法はまた、各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることを含む。同じ個体由来の生物学的試料の大部分に割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料は、信頼できない生物学的試料である。そのような信頼できない生物学的試料は、例えば、別の生物学的試料と誤標識されているか、または入れ替えられている可能性がある。

【0016】

核酸配列決定アッセイは、任意の核酸配列決定プロトコルである。いくつかの実施形態では、配列決定アッセイは、次世代配列決定（ＮＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳは、全ゲノム配列決定を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳは、全エクソーム配列決定を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳは、ＲＮＡ配列決定を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＳは、亜硫酸水素塩配列決定を含む。

【0017】

核酸配列決定アッセイは、単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して実行される。いくつかの実施形態では、複数の生物学的試料は、わずか２個～数千個の試料であり得る。いくつかの実施形態では、複数の生物学的試料は、わずか２個～数百個の試料であり得る。いくつかの実施形態では、複数の生物学的試料を、１つ以上の臨床研究から取得する。いくつかの実施形態では、単一個体の複数の生物学的試料は、別の個体由来の複数の生物学的試料と混合またはバッチされてもよい。各生物学的試料についてのｍｔＤＮＡ配列決定リードを取得する。

【0018】

生物学的試料の各々についてのｍｔＤＮＡ配列決定リードにおける１つ以上のヘテロプラスミー及びホモプラスミーの存在を決定する。したがって、ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおいて特定された各変異について、ヘテロプラスミー及びホモプラスミー分析を実行する。全てのヘテロプラスミーの合計は、特定の生物学的試料についての総ヘテロプラスミー数によって表される。各ｍｔＤＮＡ変異部位についてのｍｔＤＮＡ配列決定リード情報をコンパイルして、各単一の部位におけるマッピングされたリードの配列決定情報の要約を提供する。いくつかの実施形態では、コンパイルすることは、例えば、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐ関数（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５，２０７８－２０７９）を使用して実施できる。各ｍｔＤＮＡ変異部位についてのｍｔＤＮＡ配列決定リード情報を、配列品質によってフィルタリングして、例えば、配列決定エラーを低減するために、配列決定品質が低い配列決定塩基を除去する。いくつかの実施形態では、配列品質スコア（Ｑ）を決定する。これは、配列決定エラー確率に対数的に関連する特性である（Ｑ＝－１０^＊ｌｏｇ_１０（Ｐ）（式中、Ｐは、配列決定エラー確率である））。いくつかの実施形態では、配列品質Ｑは、≧２０である。Ｑが２０の場合、配列決定エラー確率は、１％である。

【0019】

いくつかの実施形態では、ヘテロプラスミーは、配列カバレッジ、マイナー対立遺伝子の存在、及びマイナー対立遺伝子頻度を決定することによって特定される。配列決定カバレッジは、既知のｍｔＤＮＡ参照塩基にアライメントするリードの数を表す。いくつかの実施形態では、配列決定カバレッジは、≧５０である。配列決定カバレッジは、Ｑ＜２０である塩基を除いて、ｍｐｉｌｅｕｐによって生成される。いくつかの実施形態では、マイナー対立遺伝子頻度は、ＤＮＡ配列決定データについては≧１％であり、ＲＮＡ配列決定データについては≧５％である。いくつかの実施形態では、マイナー対立遺伝子が各ＤＮＡ鎖から少なくとも２回観察されるか、またはＲＮＡについてマイナー対立遺伝子が少なくとも３回観察される。例えば、以下のｍｔＤＮＡ配列決定リードが取得され得る（第１の配列は参照配列である）。

【0020】

【化1】

【0021】

【化2】

【0022】

この候補ｍｔＤＮＡヘテロプラスミー部位についてのヘテロプラスミー頻度は、２５％（２／８）である。この特定の分析では、配列決定品質は＞２０であり、配列決定カバレッジは＞５０である。マイナー対立遺伝子は、ＤＮＡの両方の鎖において観察される。したがって、この特定の変異部位（すなわち、候補ｍｔＤＮＡヘテロプラスミー部位）は、ｍｔＤＮＡヘテロプラスミーである。

【0023】

いくつかの実施形態では、ホモプラスミーは、配列決定カバレッジ及び１つ以上の対立遺伝子の存在を決定することによって特定される。ホモプラスミーが存在するのは、ｉ）配列カバレッジが≧１０である場合、及びｉｉ）特定の核酸変異部位で１つの対立遺伝子のみが観察され、対応する参照対立遺伝子とは異なるか、または特定の核酸変異部位において複数の対立遺伝子が観察され、メジャー対立遺伝子が対応する参照対立遺伝子とは異なり、特定の核酸部位がヘテロプラスミーではなく、ヘテロプラスミー特定基準を満たさない場合である。

【0024】

いくつかの実施形態では、一次ｍｔＤＮＡハプログループを各生物学的試料に割り当てることは、各生物学的試料についてのｍｔＤＮＡ配列を構築することを含む。いくつかの実施形態では、各生物学的試料についてのｍｔＤＮＡ配列は、ホモプラスミー及びヘテロプラスミーのメジャー対立遺伝子を使用して構築する。いくつかの実施形態では、ＨａｐｌｏＧｒｅｐ２を使用して、構築されたｍｔＤＮＡ配列に基づいて、一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てる（Ｗｅｉｓｓｅｎｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１６，４４，Ｗ５８－Ｗ６３）。ＨａｐｌｏＧｒｅｐ２は、Ｐｈｙｌｏｔｒｅｅにおける位置ごとの変異発生に対応する事前に計算された系統発生的重みに基づいてハプログループが分類されるアルゴリズムである。一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てるための同様のツールとしては、ｍｔｈａｐ（ワールドワイドウェブ「ｄｎａ．ｊａｍｅｓｌｉｃｋ．ｃｏｍ／ｍｔｈａｐ／」）及びｈａｐｌｏｆｉｎｄ（ワールドワイドウェブ「ｈａｐｌｏｆｉｎｄ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／」）が挙げられる。

【0025】

同じ個体由来の生物学的試料の大部分に割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料は、信頼できない生物学的試料である。いくつかの実施形態では、信頼できない生物学的試料は、誤標識されている。いくつかの実施形態では、信頼できない生物学的試料は、別の生物学的試料と入れ替えられている。いくつかの実施形態では、１つ以上の誤標識された試料は、正しく再標識される。いくつかの実施形態では、１つ以上の誤標識された試料は、廃棄される。

【0026】

いくつかの実施形態では、本方法は、各生物学的試料についてヘテロプラスミー数を決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、ヘテロプラスミー頻度は、各生物学的試料についてのｍｔＤＮＡ配列において特定された各変異について決定される。生物学的試料のヘテロプラスミー数が高い場合、生物学的試料に、二次ｍｔＤＮＡハプログループが割り当てられる。いくつかの実施形態では、高いヘテロプラスミー数を有するための閾値は、≧１０個のヘテロプラスミーである。

【0027】

いくつかの実施形態では、二次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることは、ホモプラスミー及びヘテロプラスミーのマイナー対立遺伝子を使用して二次ｍｔＤＮＡ配列を構築することを含む。割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料は、汚染された信頼できない試料である。一次ハプログループの選択肢は、二次ハプログループの選択肢と同一である。

【0028】

いくつかの実施形態では、本方法は、生物学的試料の汚染レベルを決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、汚染レベルは、汚染された試料中の全てのヘテロプラスミーのヘテロプラスミー頻度の中央値を決定することによって示される。ヘテロプラスミー頻度の中央値が大きいほど、汚染レベルは大きくなる。実際の汚染パーセントとヘテロプラスミー頻度の中央値／平均との間には強い相関がある。例えば、ヘテロプラスミー頻度の中央値が６％である場合、汚染レベルも約６％である。

【0029】

いくつかの実施形態では、本方法は、ヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定する前に、品質管理及びアダプター配列除去のために核酸配列決定アッセイから取得したｍｔＤＮＡ配列決定リードを処理することを更に含む。このような実施形態では、核酸配列決定アッセイから取得したｍｔＤＮＡ配列決定リードが、ｍｔＤＮＡ生配列決定リードである。ｍｔＤＮＡ生配列決定リードの処理を実施する際に、品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードが生成される。いくつかの実施形態では、品質管理及びアダプター配列除去のための核酸配列決定アッセイから取得したｍｔＤＮＡ配列決定リードの処理は、「Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ」（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１４，３０，２１１４－２１２０）を使用することによって実施できる。この処理ステップは、後続のｍｔＤＮＡバリアント特定の精度を改善する。処理に使用できるもう１つのツールは、ｃｕｔａｄｐｔである（ワールドワイドウェブ「ｃｕｔａｄａｐｔ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｓｔａｂｌｅ／」）。

【0030】

いくつかの実施形態では、本方法は、ヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定する前に、２段階のマッピングプロセスを更に含む。いくつかの実施形態では、核酸配列決定アッセイから取得したｍｔＤＮＡ配列決定リードは、２段階のマッピングプロセスにおいて使用することができる。いくつかの実施形態では、品質管理及びアダプター配列除去プロセスから取得した品質制御されたｍｔＤＮＡ配列決定リードは、２段階のマッピングプロセスにおいて使用することができる。これらの実施形態では、（核酸配列決定アッセイから取得した）ｍｔＤＮＡ配列決定リードまたは（品質管理及びアダプター配列除去プロセスから取得した）品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア参照ゲノムは、ミトコンドリアゲノムについての改訂ケンブリッジ参照配列（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｒＣＲＳ）である。いくつかの実施形態では、マッピングステップは、「ｂｏｗｔｉｅ２」（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９，３５７－３５９）またはｂｗａを使用して実施できる。第１のマッピングステップから取得した候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを、ヒト参照ゲノム全体に再マッピングする。いくつかの実施形態では、ヒト参照ゲノムは、核ゲノムについてはＧＲＣｈ３８である。更に、ＧＲＣｈ３７も使用できる。いくつかの実施形態では、マッピングステップは、「ｂｏｗｔｉｅ２」を使用して実施できる。

【0031】

２段階のマッピングプロセスを実施すると、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、２つの状況下で保持される：１）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードがミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、またはミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチがヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合に、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが保持される、及び２）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５個未満のミスマッチ塩基である場合に、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが保持される。

【0032】

いくつかの実施形態では、本方法は、選別及び重複除去のために、（核酸配列決定アッセイから取得した）ｍｔＤＮＡ配列決定リードを処理することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、選別及び重複除去のために、（品質管理及びアダプター配列除去プロセスから取得した）品質管理されたｍｔＤＮＡ配列決定リードを処理することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、選別及び重複除去のために、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することを更に含む。いくつかの実施形態では、選別及び重複除去のための処理は、「ｓａｍｔｏｏｌｓツールキット」（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５，２０７８－２０７９）を使用することによって実施できる。これらの処理ステップは、標準的な次世代配列決定（ＮＧＳ）データ処理ステップである。ＧＡＴＫツールキットも使用できる。

【0033】

いくつかの実施形態では、本方法は、ヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定する前に、核酸配列決定アッセイから取得したｍｔＤＮＡ配列決定リードを所望の深度までダウンサンプリングすることを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、品質管理及びアダプター配列除去のためにｍｔＤＮＡ生配列決定リードを処理する前に、核酸配列決定アッセイから取得したｍｔＤＮＡ配列決定リードを所望の深度までダウンサンプリングすることを更に含む。いくつかの実施形態では、全トランスクリプトームデータセットからのｍｔＤＮＡ生配列決定リードを、１０００万リードまでダウンサンプリングすることができる。いくつかの実施形態では、ダウンサンプリングは、「ｓｅｑｔｋ」（ワールドワイドウェブ「ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｓｅｑｔｋ」）を使用することによって実施できる。ＲＮＡ ｓｅｑデータのｍｔＤＮＡ含有量は、通常、非常に高い。したがって、ｍｔＤＮＡカバレッジが大きいほど、計算時間が長くなるため、本明細書に記載の方法論を実行するのに全ての配列が必要とされるわけではない。いくつかの実施形態では、所望の深度は、約１０００であるが、約２００と低い可能性がある。使用できる追加のツールとしては、ＦＡＳＴＱ－ＳＡＭＰＬＥ（ワールドワイドウェブ「ｈｏｍｅｓ．ｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／～ｄｃｊｏｎｅｓ／ｆａｓｔｑ－ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔｑ－ｓａｍｐｌｅ．ｈｔｍｌ」）などがある。

【0034】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、複数の試料に対して核酸配列決定アッセイを実行する前に、個体から複数の生物学的試料を取得することを更に含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、血液、組織、または腫瘍生検である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、複数の試料に対して核酸配列決定アッセイを実行する前に、生物学的試料中の核酸分子を増幅することを更に含む。

【0035】

本開示はまた、信頼できない生物学的試料を特定する方法であって、当該方法が、ａ）単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてＤＮＡ生配列決定リードを取得することと、ｂ）品質管理及びアダプター配列除去のためにＤＮＡ生配列決定リードを処理して、品質管理されたＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｃ）品質管理されたＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｄ）ｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、ミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、またはミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチが、ヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合、及びｉｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをヒト参照ゲノムに再マッピングし、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを保持することと、ｅ）選別及び重複除去のために、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することと、ｆ）生物学的試料の各々について、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、ｇ）各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることであって、同じ個体由来の生物学的試料の大部分に割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループを有する任意の生物学的試料が、誤標識された生物学的試料である信頼できない生物学的試料である、割り当てることと、を含む、方法を提供する。本方法のステップは、本明細書に記載のプロセスによって実施できる。

【0036】

本開示はまた、信頼できない生物学的試料を特定する方法であって、当該方法が、ａ）単一の個体から取得した複数の生物学的試料の各生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行して、各生物学的試料についてＤＮＡ生配列決定リードを取得することと、ｂ）品質管理及びアダプター配列除去のためにＤＮＡ生配列決定リードを処理して、品質管理されたＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｃ）品質管理されたＤＮＡ配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングして、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを生成することと、ｄ）ｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードが、ミトコンドリア参照ゲノムに一意にマッピングされているか、またはミトコンドリア参照ゲノムに対するミスマッチが、ヒト参照ゲノムに対するものよりも少ない場合、及びｉｉ）候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのアライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをヒト参照ゲノムに再マッピングし、候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを保持することと、ｅ）選別及び重複除去のために、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードのマッピング後処理を実行することと、ｆ）生物学的試料の各々について、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードにおけるヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定することと、ｇ）各生物学的試料に一次ｍｔＤＮＡハプログループを割り当てることと、ｈ）各生物学的試料について総ヘテロプラスミー数を決定することであって、生物学的試料のヘテロプラスミー数が高い場合、生物学的試料に二次ｍｔＤＮＡハプログループが割り当てられ、割り当てられた一次ｍｔＤＮＡハプログループとは異なる割り当てられた二次ｍｔＤＮＡハプログループを有する生物学的試料が、汚染された信頼できない試料である、決定することと、を含む、方法を提供する。本方法のステップは、本明細書に記載のプロセスによって実施できる。

【0037】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ワークフローとして実施できる。例えば、Ｐｙｆｌｏｗ（ワールドワイドウェブ「ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ｐｙｆｌｏｗ」を参照のこと）などの多数のワークフロー管理ツールを使用して、ステップを一緒に効率化できる。

【0038】

本明細書に記載の方法は、いくつかの利点を有する。第一に、本方法は、各試料についてのまたは個体群の対立遺伝子頻度レベルでのいかなる核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）バリアント情報も必要としない－この種の情報は、多くの研究、特にＲＮＡ－ｓｅｑ研究には利用できないことが多い。第二に、本方法は、全ゲノムマッピングされたｂａｍファイル、全ゲノムバリアントＶＣＦファイルなどの、入力として集中的に前処理された配列決定データを必要としない。本方法は、ｆａｓｔｑファイルを入力として直接取ることができる。第三に、本方法は、低カバレッジの配列決定データに適用できる。通常、ｎＤＮＡバリアントに基づく方法には、低レベルの汚染を検出するために高いカバレッジ（＞５０倍）が必要である。ｍｔＤＮＡの複数コピーの性質に起因して、例えば、１０００人ゲノムプロジェクトで２～４倍の低カバレッジデータであっても、ｍｔＤＮＡカバレッジは依然として１０００～２０００倍と高い可能性があり、これは１％と低い汚染レベルを検出するのに十分である。第四に、本方法は、高い計算能力を必要とせず、１０００倍のｍｔＤＮＡカバレッジを有する典型的な試料を、単一のプロセッサ及び４Ｇｂメモリを使用して１０～２０分で処理することができる。ｍｔＤＮＡ含有量が高い試料は、処理に時間がかかる可能性があるが、処理時間を短縮するためにダウンサンプリングすることができる。本方法は、標準的なＮＧＳデータ処理パイプラインに簡単に組み込むことができ、問題のある試料を特定し、下流のデータ分析の精度を更に向上させることにより、重要な品質管理ステップとして機能する。

【0039】

本明細書に開示される主題をより効率的に理解できるようにするため、実施例を以下に提供する。これらの実施例は、例示目的のためのものであり、いかようにも特許請求される主題を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。

【実施例】

【0040】

実施例１：ｍｔＤＮＡ変異（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の特定及びハプログループの割り当て
一般的な方法論
ｍｔＤＮＡ変異（ホモプラスミー及びヘテロプラスミーの両方）は、例えば、図１に示される分析を実行することによって、次世代配列決定データから特定される（ボックス１を参照のこと）。複数の生物学的試料に対して核酸配列決定アッセイを実行する際に、例えば、ワールドワイドウェブ「ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｓｅｑｔｋ」に見出すことができる「ｓｅｑｔｋ」を使用して、生配列決定リードを所望の深度までダウンサンプリングして、計算負荷を低減することができる（図１、ボックス１、「ステップ０」を参照のこと）。このステップは任意選択的であり、実行する必要はない。

【0041】

核酸配列決定アッセイから（任意選択的に、前のダウンサンプリングステップから）取得した生ｍｔＤＮＡ配列決定リードを、「Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ」（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１４，３０，２１１４－２１２０）を使用することによって、品質管理及びアダプター配列除去のために処理する（図１、ボックス１、「ステップ１」を参照のこと）。

【0042】

候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを取得するために、「ｂｏｗｔｉｅ２」（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９，３５７－３５９）を使用して、品質制御された配列決定リードをミトコンドリア参照ゲノムにマッピングする（図１、ボックス１、「ステップ２」を参照のこと）。核ゲノム中の核ミトコンドリアＤＮＡセグメント（ＮＵＭＴ）は、ミトコンドリアゲノムにミスマッピングされ、ｍｔＤＮＡリードとしてカウントされる場合がある。ＮＵＭＴの影響を最小限に抑えるために、第２のラウンドのマッピングを実行することができ、それにより、第１のラウンドからのマッピングされたリードを、ヒト参照ゲノム全体、核ゲノムについてのＧＲＣｈ３８、及びミトコンドリアゲノムについての改訂ケンブリッジ参照配列（ｒＣＲＳ）に再マッピングする。ａ）リード（リードペア）がミトコンドリアゲノムに一意にマッピングされているか、またはミトコンドリアゲノムに対するミスマッチが、核ゲノムに対するものよりも少ない場合、及びｂ）アライメントミスマッチカウントが５未満である場合に、リード（またはリードペア）が保持される。

【0043】

「ｓａｍｔｏｏｌｓツールキット」（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５，２０７８－２０７９）によって、保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードを更に処理し、これにはｓａｍからｂａｍへの変換、選別、及び重複除去が含まれる（図１、ボックス１、「ステップ３」を参照のこと）。

【0044】

「ｓａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐ関数」（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５，２０７８－２０７９）を使用して、各ｍｔＤＮＡ部位についての保持された候補ｍｔＤＮＡ配列決定リードをコンパイルし、配列決定品質（＞＝２０）によって塩基を更にフィルタリングし、ヘテロプラスミー及びホモプラスミーを特定する（図１、ボックス１、「ステップ４」を参照のこと）。ヘテロプラスミーは、以下の基準で特定される：ａ）配列決定カバレッジ＞＝５０、ｂ）マイナー対立遺伝子頻度＞＝１％、及びｃ）ＤＮＡデータについては、マイナー対立遺伝子が各鎖から少なくとも２回観察されなければならず、ＲＮＡデータについては、マイナー対立遺伝子が少なくとも３回観察されなければならない。ホモプラスミーは、以下の基準で特定される：ａ）配列決定カバレッジ＞１０、及びｂ１）所与の部位で１つの対立遺伝子のみが観察され、参照対立遺伝子とは異なるか、またはｂ２）複数の対立遺伝子が観察され、メジャー対立遺伝子が参照とは異なるが、当該部位がヘテロプラスミー基準を満たさない。

【0045】

各試料についてのｍｔＤＮＡ配列を、ホモプラスミー情報及びヘテロプラスミー部位におけるメジャー対立遺伝子を使用して構築し、「ＨａｐｌｏＧｒｅｐ２」（Ｗｅｉｓｓｅｎｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１６，４４，Ｗ５８－Ｗ６３）を使用して、構築された配列に基づいてハプログループを割り当てる（図１、ボックス１、「ステップ５」を参照のこと）。このステップで割り当てられたハプログループは、各試料の一次ハプログループと呼ばれる。

【0046】

特定の試料が異常な高いヘテロプラスミー数を有する場合、ホモプラスミー情報及びヘテロプラスミー部位におけるマイナー対立遺伝子を使用して二次ｍｔＤＮＡ配列を構築し、この二次ｍｔＤＮＡ配列に基づいて二次ハプログループを割り当てる（図１、ボックス１、「ステップ６」を参照のこと）。

【0047】

試料の誤標識／入れ替えの検出（図１、ボックス２を参照のこと）
複数の試料では、本明細書に記載されるように、各試料に一次ハプログループを割り当てることができる。全ての試料が正確に処理される場合には、同じ個体由来の試料全てが、同じハプログループに割り当てられる。逆に、これら試料間で２つ以上のハプログループが割り当てられる場合には、少数のハプログループが割り当てられた試料（複数可）は、ハプログループがマッチしていない（すなわち、誤標識されているか、または別の試料と入れ替えられている）と考えられる。例えば、以下の表１において、試料００１は、試料００８と入れ替えられていると考えられる。

【0048】

【表1】

【0049】

試料の汚染の検出及び定量化（図１、ボックス３を参照のこと）
特定の試料において異常な高いヘテロプラスミー数が観察された場合、試料は、汚染されている可能性がある。一次及び二次ハプログループを、ヘテロプラスミー部位におけるメジャー対立遺伝子及びマイナー対立遺伝子それぞれに基づいて、疑わしい試料に割り当てる（図１、ボックス１、「ステップ５」及び「ステップ６」を参照のこと）。一次ハプログループと二次ハプログループが異なる場合、試料は汚染された試料であると考えられる。

【0050】

試料が汚染されていると判断された場合、試料中の全てのヘテロプラスミーの頻度の中央値が、汚染レベルを表すために使用される。
実施例２：誤標識された試料を検出するためのｍｔＤＮＡハプログループの使用
試料を複数の個体から収集し、各個体は複数の試料を有する。臨床試料のバッチについてのＲＮＡ－ｓｅｑデータを取得した後、ｍｔＤＮＡハプログループを各試料に割り当てる（表２を参照のこと）。同じ個体から収集した試料は、同じｍｔＤＮＡハプログループに属する必要がある。ｍｔＤＮＡハプログループがマッチしていないことは、試料が誤標識されている可能性があることを示唆している。ハプログループがＬ３ｈ１ａ１である試料は、誤標識された試料であると考える必要がある。

【0051】

【表2】

【0052】

実施例３：試料の汚染を検出するためのｍｔＤＮＡヘテロプラスミーの使用
仮想汚染試料の調製
２個体の全ゲノム配列決定ｆａｓｔｑファイルであるＨＧ００２９０及びＮＡ１９０８６を、１０００人ゲノムプロジェクトからダウンロードした（「ｆｔｐ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｖｏｌ１／ｆｔｐ／」のｆｔｐサイトを参照のこと）。配列決定リードを２個体からサンプリングし、ＮＡ１９０８６リードを様々な比率（０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、及び４０％）でＨＧ００２９０に混合して、仮想汚染試料を作製した。

【0053】

現実のデータセット
ＤＮＡ配列決定データを、１０００人ゲノムプロジェクトからダウンロードした（「ｆｔｐ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｖｏｌ１／ｆｔｐ／」のｆｔｐサイトを参照のこと）。各個体について、ミトコンドリアゲノムにマッピングされたリードを、ｂａｍファイルからｓａｍｔｏｏｌｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５，２０７８－２０７９）によって抽出し、その後、ペアエンドｆａｓｔｑファイルに変換した。ｆａｓｔｑファイルは、本明細書に記載の方法のための入力として使用した。

【0054】

２つのＲＮＡ－ｓｅｑ研究のｆａｓｔｑファイルを、ＧＥＯ（ＧＳＥ８１２６６及びＧＳＥ１２７１６５）からダウンロードした。ＧＳＥ８１２６６は、６１個のペアエンド（２×７５ｂｐ）試料及び１６個のシングルエンド（５０ｂｐ）試料を含む、７７個の回腸及び前嚢回腸（ｐｒｅｐｏｕｃｈ ｉｌｅｕｍ）試料についての全トランスクリプトームデータを含んでいた。ＧＳＥ１２７１６５は、５７名の喉頭扁平上皮細胞癌患者からの全トランスクリプトームデータを含み、各患者は、腫瘍試料及び隣接する正常試料を有していた。全ての試料は、１５０ｂｐのリード長を有するペアエンドであった。

【0055】

分析性能
仮想汚染試料を分析した。２個体の全ゲノム配列決定データであるＨＧ００２９０及びＮＡ１９０８６を、１０００人ゲノムプロジェクトからダウンロードした（Ａｕｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２６，６８－７４）。ＨＧ００２９０はハプログループＵ５ａ２ａ１ａに属し、１つのヘテロプラスミーがこの個体のｍｔＤＮＡゲノムにおいて特定され（２６１０Ｔ＞Ｃ １．４％）、一方、ＮＡ１９０８６はハプログループＤ４ｂ１ａ１に属し、２つのヘテロプラスミーが特定された（１６４６Ｔ＞Ｃ ２．１％、１２７８５Ｔ＞Ｔ ２１．３％）。２個体は、ミトコンドリアゲノムに４５ヌクレオチドの差異があった。

【0056】

仮想汚染試料は、２つの試料由来の配列決定リードを０．１％～４０％の範囲の一連の比率（ａ ｓｅｒｉｅｓ ｒａｔｉｏ）で混合することによって作製した。ＨＧ００２９０を元の試料として扱い、ＮＡ１９０８６を汚染物質として扱った。各汚染試料には、リード長が１００ｂｐである５，０００万個のリードペアが含まれていた。仮想汚染試料を、汚染分析のために本明細書に記載の方法によって処理し、結果を図３に要約する。汚染レベルが２％を超えると、試料から４５～４６個のヘテロプラスミーが特定され、これは正常範囲（１個体で１～２個のヘテロプラスミー）をはるかに上回っていた。これらヘテロプラスミーは、ほぼ全ての予想部位をカバーしていた（２個体間での４５個の分離部位に加えて、ＨＧ００２９０における元のヘテロプラスミー２６１０ Ｔ＞Ｃ）。２％試料では、予想部位が１つだけ欠落していた。一次ハプログループは、６つの試料全てについてＵ５ａ２ａ１ａ（元の試料ＨＧ００２９０と同じ）であり、二次ハプログループは、Ｄ４ｂ１ａ１（汚染物質と同じ）であった。汚染レベルが１％であったとき、２９個のヘテロプラスミーが検出された。１７箇所の欠落部位を手動でチェックし、これらの部位は全て何らかのヘテロプラスミー信号を示すことが確認されたが、ヘテロプラスミー頻度特定カットオフが１％に設定されていたため、これらの部位はカットオフされなかった。１％試料の二次ハプログループをＤ４ｂ１ａ１に正しく割り当てた。汚染レベルが０．１％及び０．５％であった場合には、１個のみ及び１１個のヘテロプラスミーが検出され、これら２つの試料についての二次ハプログループは依然としてＵ５ａ２ａ１ａであったため、これらの低汚染レベル試料では汚染を確実に検出することができなかった。これらの結果は、ヘテロプラスミー数と二次ハプログループの割り当てを組み合わせることによって、１％の低い汚染を検出できたことを示す。

【0057】

人工汚染試料中のヘテロプラスミー頻度を更に評価した。各試料中のヘテロプラスミー頻度には多少の変動があったが、頻度の平均及び中央値は理論的汚染レベルと有意に相関していた（図２及び図３を参照、平均及び中央値については、それぞれピアソン相関＝０．９９６７８１、０．９９７９９３５、Ｐ値＝６．２１２ｅ－０９、１．１８９ｅ－０９）。したがって、所与の試料が本明細書に記載の方法によって汚染されていると検出された場合、汚染レベルは、試料中のヘテロプラスミー頻度の平均／中央値によって相対的に定量化することができる。

【0058】

現実のデータアプリケーション：ＲＮＡ－ｓｅｑデータ
低頻度（＜５％）のヘテロプラスミー特定をＤＮＡ－ｓｅｑデータよりもＲＮＡ－ｓｅｑデータにおいてより困難にする可能性があるいくつかの要因がある：１）逆転写ステップ中に導入されたエラー、２）ＲＮＡ編集／改変、及び／または３）遺伝子発現レベルの変動に起因するｍｔＤＮＡゲノム全体にわたる不均一なカバレッジ。したがって、偽陽性ヘテロプラスミーを減少させるために、頻度＞５％のヘテロプラスミーのみが、ＲＮＡデータにおいて信頼できるヘテロプラスミーであると考えられた。更に、３つの明確に定義されたｍｔＤＮＡ編集部位：２９５、２６１７及び１３７１０（Ｂａｒ－Ｙａａｃｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０１３，２３，１７８９－１７９６、及びＨｏｄｇｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３４４，４１３－４１５）を除外した。

【0059】

本明細書に記載の方法を、異なる疾患または組織タイプのコンテキストを評価するために、２つのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータセットに適用した。まず、本明細書に記載の方法を、２５名の対象由来の７７個の試料を含むデータセットに適用した（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．，２０１７，２３，３６６－３７８）。この研究におけるほとんどの対象は、異なる組織（回腸及び前嚢回腸）由来の及び／または異なる生検時点（４ヶ月、８ヶ月、１２ヶ月など）での試料を有していた。このデータセットにおける１６個の試料は、５０ｂｐリード長のシングルエンド試料であり、６１個の試料は、７５リード長のペアエンド試料であった。各試料について、１０００万リード（ペア）をランダムにサンプリングして試験した。まず、試料への一次ハプログループの割り当てを評価した。このデータセットでは、同じ対象由来の試料は全て、同じｍｔＤＮＡハプログループに割り当て（図４を参照）、これは試料の入れ替えがないことを示した。次いで、これら試料中の潜在的な汚染を評価した。試料ＳＲＲ３４９３８３３を除いて、５％ヘテロプラスミー頻度カットオフでは、他の全ての試料は、最大でも６個のヘテロプラスミーを有し、二次ハプログループの割り当ては、一次ハプログループと同じであった（図４を参照）。試料ＳＲＲ３４９３８３３では、正常範囲よりもはるかに高い２９個のヘテロプラスミーが特定され、ヘテロプラスミー頻度の中央値は１４．８％であった。この試料の二次ハプログループはＪ１ｃ８ａであり、これもまた一次ハプログループＵ５ｂ２ａ１ａとは異なっていた。これらの結果は、試料ＳＲＲ３４９３８３３がＪ１ハプログループ由来の別の試料によって潜在的に汚染され、汚染レベルが約１４．８％であることを示した。

【0060】

本明細書に記載の方法を、腫瘍試料を含むデータセットにも適用した（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ，２０２０，１９，９９）。このデータセットには、５７名の喉頭扁平上皮細胞癌患者由来の試料が含まれており、それぞれが腫瘍試料及び対になった隣接する正常な粘膜試料を有する。このデータセットでは、同じ患者由来の対になった腫瘍試料及び隣接する正常な試料は全て、同じハプログループに割り当て（図５を参照）、試料の入れ替えは検出されなかった。全ての試料は、ヘテロプラスミー数が低く、一次及び二次ハプログループの割り当てが同じであり、したがって、検出可能な汚染もなかった。このデータセットによって、本明細書に記載の方法は、腫瘍試料の同一性を特定できることが実証された。

【0061】

早期かつ正確な試料の入れ替え及び汚染の検出は、疑わしい試料をフィルタリングし、その後の分析のための品質を向上させることができるため、大規模なＮＧＳデータの重要な品質管理ステップである。これらの実施例では、ＮＧＳデータから特定されるｍｔＤＮＡ変異を使用することによって、試料の入れ替え及び個体間汚染を検出するための効率的な方法が提示される。本方法論は、いかなるデータの前処理も行わずに、デマルチプレックスされたｆａｓｔｑファイルを入力として取ることができる。まず、複数の試料を有する個体についての任意の試料の入れ替えを検出する。潜在的な汚染を更に検出して定量化し、次いで、汚染物質の供給源試料を示唆する。１０００人ゲノムプロジェクト及び２つのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータセットからの全ゲノムＤＮＡ配列決定データをこれらの例の実施例（ｗｏｒｋｉｎｇ ｅｘａｍｐｌｅｓ）として使用したが、本明細書に記載の方法は、オフサイトｍｔＤＮＡリード、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータなどを含む全エクソーム配列決定データなどの、ｍｔＤＮＡリードを含む任意のＮＧＳデータセットに一般化することができる。本明細書に記載のシミュレーション結果は、本明細書に記載の方法が、１％の低い汚染を効果的に検出したことを示している。

【0062】

本明細書に記載されているものに加えて、記載されている主題の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。本出願で引用された各参考文献（雑誌記事、米国及び米国以外の特許、特許出願公開、国際特許出願公開、遺伝子バンク受入番号、等を含むが、これらに限定されない）は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図4-6】

【図4-7】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図5-6】

【図5-7】

【図5-8】