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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-23
(45)【発行日】2025-01-31
(54)【発明の名称】多発性硬化症の治療における制御性Ｔ細胞の髄腔内投与
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20250101AFI20250124BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20250124BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
A61P25/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2022534320
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-13
(86)【国際出願番号】 PL2020000094
(87)【国際公開番号】W WO2021118374
(87)【国際公開日】2021-06-17
【審査請求日】2023-07-11
(31)【優先権主張番号】P.432200
(32)【優先日】2019-12-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(73)【特許権者】
【識別番号】522059461
【氏名又は名称】グダニスキ ウニバルステット メディッチニー
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】トゥロンコフスキー、ピオット
(72)【発明者】
【氏名】チョウォジニック、カミル
【審査官】六笠 紀子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１７０１７６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１６５００７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１８７１０１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５１８９７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１０５２６５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性硬化症における臨床使用のための、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－制御性Ｔ細胞からなる医薬製品であって、前記医薬製品は髄腔内投与されるものである、医薬製品。
【請求項2】
多発性硬化症の治療のための髄腔内投与用の医薬製品の調製のための、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－制御性Ｔ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
多発性硬化症の治療における制御性Ｔ細胞の髄腔内投与
【0002】
本発明は、治療における臨床使用のための、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－制御性Ｔ細胞からなる医薬製品に関するものである。本製品は、多発性硬化症の治療において髄腔内投与される。
【背景技術】
【0003】
多発性硬化症（ＭＳ）は、ミエリン鞘に感作された自己免疫性Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖｓ）が血液脳関門を破壊し、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンを破壊する免疫介在性疾患である。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、Ｔｃｏｎｖｓに作用する抑制活性により、この破壊を阻害する可能性があると仮説が立てられる。
【0004】
Ｔｒｅｇｓリンパ球は末梢血リンパ球全体の約１％を占めるが、自己の組織の耐性を維持するために重要である。制御性Ｔ細胞の欠如は、Ｘ連鎖性免疫不全症候群、多発性内分泌障害および腸疾患（ＩＰＥＸ）の患者の場合に見られるように、多くの自己免疫疾患および過敏症を引き起こす。このような自己免疫症候群のひとつに多発性硬化症もある。
【0005】
Ｔｒｅｇリンパ球は、ステロイドとして炎症反応を抑制し、免疫抑制的に作用することから、「インテリジェント ステロイド（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ｓｔｅｒｏｉｄｓ）」と呼ぶことができるが、対照的に、Ｔｒｅｇ細胞の生理的抑制効果は、病理学的反応（例えば、自身の組織に対して向けられる）のみに関係するものである。本発明者らの観察を含む臨床試験の結果から、Ｔｒｅｇリンパ球による治療が安全であり、外来および危険な抗原（ウイルス、細菌、がん細胞）に対する免疫応答を損なわないことが示されている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 欧州特許出願公開第３１３１５６０号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１７／１０５２６５号
（特許文献３） 国際公開第２０１８／０２４８９５号
（特許文献４） 米国特許出願公開第２０１４／１７０１７６号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１） Ｎ．ＭＡＲＥＫ－ＴＲＺＯＮＫＯＷＳＫＡ ＥＴ ＡＬ，"Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ？－Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ"， ＤＩＡＢＥＴＥＳ ＣＡＲＥ，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．９，２０ Ｊｕｎｅ ２０１２ （２０１２－０６－２０），ｐａｇｅ １８１７－１８２０
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 欧州特許出願公開第３１３１５６０号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１７／１０５２６５号
（特許文献３） 国際公開第２０１８／０２４８９５号
（特許文献４） 米国特許出願公開第２０１４／１７０１７６号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１） Ｎ．ＭＡＲＥＫ－ＴＲＺＯＮＫＯＷＳＫＡ ＥＴ ＡＬ，"Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ？－Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ"， ＤＩＡＢＥＴＥＳ ＣＡＲＥ，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．９，２０ Ｊｕｎｅ ２０１２ （２０１２－０６－２０），ｐａｇｅ １８１７－１８２０
【発明の概要】
【0006】
本発明は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－制御性Ｔ細胞からなる医薬製品の髄腔内注射による投与方法を提供するものである。
【0007】
本発明の対象は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－制御性Ｔ細胞からなる医薬製品である。
【0008】
本製品は、多発性硬化症と診断された患者の治療のために、髄腔内投与される。
【0009】
本製品は、髄腔内投与される。
【0010】
本製品は、多発性硬化症に投与される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１－本試験における臨床結果を示す。 患者は試験全体を通して、プロトコルで計画された神経学的検査を受けた。生活の質はＥＱ．－５Ｄ質問票（ＥＱ－５Ｄ）で評価され、身体的／神経学的状態は、ＥＤＳＳスケールとＭＳＦＣスケールのコンポーネントであるＴｉｍｅｄ ２５－Ｆｏｏｔ Ｗａｌｋ（ＦＷＴ）、利き腕（９－ＨＰＴ Ｐ）および非利き腕（９－ＨＰＴ Ｌ）９ホールペグテスト、ペース型聴覚連続加算テスト（ＰＡＳＡＴ）によってモニターした。スコアは中央値（最小値－最大値）で静脈内投与と髄腔内投与の患者を分けて追跡調査を通して示され、ドットは生データを表す。 図１Ｓ－ＣＯＮＳＯＲＴフローチャートを示す。
【図2】図２－ＭＲＩを使用したＣＮＳの疾患の進行を示す 患者は試験全体を通して、プロトコルで計画されたＭＲＩ検査を受けた。最も重要な変化は、ＦＬＡＩＲ配列のプラークの総体積、ＦＬＡＩＲ配列上の最も大きな５つのプラークの体積、およびプラーク数の変化の指標として示される。「ｙ」軸の変化指標は、‘０’日（Ｔｒｅｇ投与直前）を‘Ｉ００’とし、それ以降の検査での変化量を比例して算出した。造影増強病変の値の変化と微小出血の数は絶対数で示した。静脈内投与と髄腔内投与の患者について、追跡期間中の指標と絶対値を別々に中央値（最小値－最大値）で示し、ドットは生データを表す。グループ間の差は線で結びアスタリスク（＊）でマークされ、特定グループの経時的変化は線で結びハッシュ（＃）でマークされる。 図２Ｓ－ＭＲＩを使用したＣＮＳの疾患の進行に関する追加データを示す。 患者は試験全体を通して、計画されたＭＲＩ検査を受けた。チャートは、試験期間中のＣＮＳ（灰白質、白質、脳、脳皮質、脳実質、脳脊髄液）の特定の構造の体積の変化と灰白質と白質のＴ１低強度を示している。データは、「ｙ」軸の変化の指標として表され、‘０’日目からの変数の個々の値を‘Ｉ００’として扱い、以下の検査での変化を比例して計算される。指標は、追跡期間中、静脈内投与と髄腔内投与の患者を分けて中央値（最小値－最大値）で表示し、ドットは生データを表す。
【図3】図３－試験全体を通してのＴｒｅｇとＴｃｏｎｖのレベルを示す フローサイトメトリー解析、代表的なフローヒストグラムとゲーティング戦略［Ａ］。フローデータの解析は、前方対側方散乱ドットプロットとリンパゲート（ＰＩ）の生成から開始された。これを用いて、ＣＤ３対ＣＤ４のドットプロットとＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート（Ｐ２）を作成した。このゲートは、Ｔｒｅｇ細胞（左欄のドットプロット）とＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（右欄のドットプロット）を解析するために使用された。ＣＤ１２７－ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞をカバーするＴｒｅｇゲート（Ｐ３左欄）を確立し、このゲートにおけるＦｏｘＰ３の発現をＦｏｘＰ３対Ｈｅｌｉｏｓドットプロットで確認し、これを用いて３つのゲート（全Ｔｒｅｇｓ ＦｏｘＰ３＋（Ｐ４左欄）、胸腺ｔＴｒｅｇｓ ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋（Ｐ５）および末梢ｐＴｒｅｇｓ ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ－（Ｐ６））を作成した。すべてのＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ ＦｏｘＰ３＋）、胸腺ｔＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋）、末梢ｐＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋ Ｈｅｌｉｏｓ）のレベルはチャート［Ｂ］に示されている。さらにＣＤ６２Ｌ対ＣＤ４５ＲＡのドットプロットはＴｒｅｇＦｏｘＰ３＋ゲートとＴｃｏｎｖＦｏｘＰ３－ゲートを作成してナイーブ細胞／メモリー細胞の割合を評価した。Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋）およびＴｃｏｎｖｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ／－－ＣＤ１２７＋ＦｏｘＰ３－）内のＴｎ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋－Ｑ２）、Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ－Ｑ１）、Ｔｅｒｎ（ＣＤ６２ＬＣＤ４５ＲＡ－－Ｑ３）のレベルはチャート［Ｃ］に示した。以下のマーカー：ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ４、ＣＤ１０３、ＣＣＲ８、ＣＤ１８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、４－１ＢＢおよび０Ｘ４０を発現するＴｒｅｇ ＦｏｘＰ３＋の割合は、３つのＴｒｅｇゲート全て（Ｐ４からＰ６－［Ａ］の左欄ヒストグラム）から分析された。ヒストグラムの例は、ＣＤ３９発現の解析（［Ａ］の左欄ヒストグラムのＱ２－１象限）を示しているが、他のマーカーについても同じことが実行された。Ｔｒｅｇ解析のために取得したファイルを用いて、Ｔｃｏｎｖ細胞における同じマーカーの発現も評価した。Ｔｃｏｎｖは、もともとＴｒｅｇ解析に用いたＰ３ゲートとＰ４ゲートの位置を反転させることで検出された。ＣＤ１２７＋ＣＤ２５ｌｏｗ／－細胞をカバーするＴｃｏｎｖゲート（［Ａ］のＰ３右欄ヒストグラム）が確立され、このゲートにおけるＦｏｘＰ３の欠如がＦｏｘＰ３対Ｈｅｌｉｏｓのドットプロットで確認され、これを用いてＴｃｏｎｖ ＦｏｘＰ３－ゲート（［Ａ］のＰ４右欄ヒストグラム）を生成した。以下のマーカー：ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１０３、ＣＣＲ８、ＣＤ１８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、４－１ＢＢおよび０Ｘ４０を発現するＴｃｏｎｖの割合を、右欄ヒストグラムＰ４ゲートから分析した。この例は、ＣＤ３９発現の解析を示す（［Ａ］の右欄ヒストグラムのＱ２－１象限）。マーカーを発現しているＴｒｅｇとＴｃｏｎｖのレベル（Ｐ４ゲートから）をヒートマップとして示した。クラスタのツリーは、ＴｒｅｇｓとＴｃｏｎｖｓの間で対照的な発現をするマーカーを見つけるために並べられた［ヒートマップＤ、詳細なレベルは図３Ｓにも記載されている］。同様のクラスタリング解析は、胸腺ｔＴｒｅｇｓ（［Ａ］の左欄ヒストグラムのＰ５からのＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋）と末梢ｐＴｒｅｇｓ（［Ａ］の左欄ヒストグラムのＰ６からのＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ－）を比較して対比した［ヒートマップＥ］。［Ａ］に示すフロー解析における正のシグナルのカットオフは、アイソタイプコントロールと蛍光マイナス１（ＦＭＯ）ゲーティングに基づいて確立された。矢印はゲーティングの階層を示す。特にドットプロットでは、集団を明確に示すために、ドット数を減らした。フローサイトメーターは、独立したサービスオペレーターによって操作上認定され（ＯＱ）、ＣＳ&Ｔビーズ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）を用いて定期的に品質管理を行った。チャート［Ｂ］および［Ｃ］では、Ｔｒｅｇｓ製剤投与時（‘０’日目）、投与後＋３、＋６、＋１２ヶ月目の細胞の割合を、／Ｖ．グループ及びｔｃ．グループに分けて示している。結果は中央値（最小値－最大値）で示し、ドットは生データを表す。図中のアスタリスク［＊］は、有意差を示す。 図３Ｓ－試験全体を通してのＴｒｅｇとＴｃｏｎｖのサブセットのレベルを示す（図３のヒートマップに対応するパーセンテージ値） Ａ．ケモカイン受容体またはインテグリンを発現するＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖのサブセットの割合は、Ｔｒｅｇ製剤投与時（‘０’日目）、投与後＋３、＋６、および＋１２ヶ月目に各試験グループについて別々に示されている。Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋）およびＴｃｏｎｖｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ／－ＣＤ１２７＋ＦｏｘＰ３）内のＣＣＲ１０＋、ＣＸＣＲ４＋、ＣＣＲ４＋、ＣＤ１０３＋、ＣＣＲ８＋およびＣＤ１８＋細胞の割合を示している。結果は中央値（最小値－最大値）で示し、ドットは生データを表す。 Ｂ．Ｔｒｅｇの機能に重要な受容体や他の分子を発現するＴｒｅｇとＴｃｏｎｖｓのサブセットの割合は、Ｔｒｅｇ製剤投与時（‘０’日目）、投与後＋３、＋６、＋１２ヶ月目に、各試験グループ別に示されている。Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋）およびＴｃｏｎｖｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ／－ＣＤ１２７＋ＦｏｘＰ３）内のＣＤ３９＋、ＣＤ７３＋、ＣＴＬＡ－４＋、ＰＤ－１＋、４－ｌＢＢ＋およびＯＸ４０＋細胞の割合を示している。結果は中央値（最小値－最大値）で示し、ドットは生データを表す。 Ｃ．ｔＴｒｅｇｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋）とｐＴｒｅｇｓ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ）のサブセットは、試験グループごとにＴｒｅｇｓ製剤投与時（０日）、投与後＋３、＋６および＋１２ヶ月目に分けて表示されている。有意差のあるサブセット：ＣＣＲ１０＋、ＣＤ１０３＋、ＣＤ３９＋、ＣＤ７３＋およびＣＴＬＡ－４＋のみを示す。結果は中央値（最小値－最大値）で表示され、ドットは生データを表す。
【図4】図４－試験全体を通しての血清サイトカインレベルを示す Ｔｒｅｇを静脈内または髄腔内に注射した患者の血清中のサイトカインレベルをヒートマップとして示した。クラスタのツリーは、これら２つの患者グループの間でレベルが対照的なサイトカインのクラスタを見つけるために並べられた（詳細なレベルは図４Ｓにもある）。サイトカインのレベルは、各試験グループについて、Ｔｒｅｇｓ製剤投与時（‘０’日目）、投与後１４日目、＋３日目、＋６日目、＋９日目、＋１２ヶ月目に分けて表示した。アスタリスク［＊］は、これらの２つの患者グループの間でレベルが有意に異なっていたサイトカインを示す。 図４Ｓ－試験全体を通しての血清サイトカインレベルを示す（図４のヒートマップに対応する割合値） 患者血清中のサイトカインレベルは、Ｔｒｅｇｓ製剤投与時（‘０’日目）、投与後１４日目、３日目、６日目、９日目、１２ヶ月目に、各試験グループ別に示した。グループ間で有意にレベルが異なるサイトカインは、太字で表示されている。これらは、ＴＧＦアルファ、および炎症に関連するＭＣＰ３、ＣＸＣＬ８、ＩＬ１ＲＡを含む。結果は中央値（最小値－最大値）で表示され、ドットは生データを表す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらはその限定ではない。
【0013】
本試験のプロトコル
本試験はヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。プロトコルはＥｕｄｒａＣＴデータベースに２０１４－００４３２０－２２の番号で登録され、グダニスク医科大学の施設審査委員会から承認を受けた（第ＮＫＢＢＮ／４１４／２０１２およびＮＫＢＢＮ／４１４－１６３／２０１７）。医療処置を開始する前に、募集時に参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。
本試験はヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。プロトコルはＥｕｄｒａＣＴデータベースに２０１４－００４３２０－２２の番号で登録され、グダニスク医科大学の施設審査委員会から承認を受けた（第ＮＫＢＢＮ／４１４／２０１２およびＮＫＢＢＮ／４１４－１６３／２０１７）。医療処置を開始する前に、募集時に参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【0014】
１４名のＭＳ患者（１８～５５歳）が、Ｔｒｅｇを静脈内投与（ｉｖ．ｎ＝１１）または髄腔内投与（ｔｃ．ｎ＝３）する２グループに分けられた（表１および図ＩＳ）。ｉｖ．グループから１名の患者が追跡期間中に妊娠したため、試験から脱落した。参加基準は以下の通り：再発寛解型ＭＳ（ＭｃＤｏｎａｌｄｓ基準または改訂ＭｃＤｏｎａｌｄ基準による診断）で、過去１年間に少なくとも１回の再発、または過去２年間に少なくとも２回の再発があり、拡張障害状態スケール（ＥＤＳＳ）が最大４点、書面によるインフォームドコンセントが可能で、採血のための静脈アクセスが適切にできることであった。最も重要な除外基準は、Ｔｒｅｇｓ製剤投与の６ヶ月前までに投与されたインターフェロンベータを含む免疫抑制剤であった。唯一の例外は、再発の治療としてのみ投与可能なグルココルチコイドであった。その他の除外基準は以下の通りである：他の自己免疫疾患；診断された免疫不全；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、結核（ＴＢ）、全身性真菌症を含む活動性感染症の存在または既往；悪性腫瘍の既往；診断された血球減少症；血栓活性の上昇または過去の血栓症の既往；組み入れ前の過去２年間の心血管イベントによる入院；鬱血乳頭と定義した頭蓋内圧亢進；網膜症；動脈性高血圧症；マクロアルブミン尿症の存在または既往；手順に関連する患者の過度の不安；治験責任医師が本試験への安全な参加を妨げると考える医学的状態；既知の活発なアルコールまたは薬物乱用；妊娠検査陽性（女性被験者の場合）；試験中および適切な場合は中止後４ヶ月間、有効な避妊手段を用いることを望まない；試験中または適切な場合は中止後４ヶ月以内に、生殖の意思があること（男性被験者の場合）。
【0015】
追跡調査はＴｒｅｇ投与時（"０"日目）に開始し、投与後＋１４日目、＋３ヶ月目、＋６ヶ月目、＋９ヶ月目、および＋１２ヶ月目の訪問で、１２ヶ月間続いた。測定された終了点は、治療の副作用の量と強さ、年間の再発回数、ＥＤＳＳスケールの少なくとも１点の悪化、多発性硬化症機能複合（ＭＳＦＣ）スケールの変化、ＭＡＧＮＩＭＳ ２０１５コンセンサスによるＭＲＩの変化、生活の質（ＱＯＬ）質問票、末梢血リンパ球免疫表現型、および血清サイトカインレベルの変化を含む。
【表1】
【0016】
Ｔｒｅｇの製造および投与
Ｔｒｅｇの調製は、これまでの試験と同様にＧＭＰ（医薬品の製造管理及び品質管理の基準）条件下で製造した［１０－１３］。
Ｔｒｅｇの調製は、これまでの試験と同様にＧＭＰ（医薬品の製造管理及び品質管理の基準）条件下で製造した［１０－１３］。
【0017】
患者の静脈末梢血（４５０ｍｌ）から、ＨＥＰＡ封入型ＦＡＣＳソーター（Ｉｎｆｌｕｘ，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）で交換滅菌サンプルラインを用いて、以下の表現型のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ ｌｉｎ ｄｏｕｂｌｅｔに細胞を分離した。ソート自体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（ドイツ）のＧＭＰグレードモノクローナル抗体（蛍光色素／クラス／クローン）：抗ＣＤ４（Ｖｉｏ－ｂｌｕｅ、ＩｇＧ１、Ｍ－Ｔ４６６）、抗ＣＤ２５（ＰＥ、ＩｇＧ１、３Ｇ１０）および抗ＣＤ１２７（ＡＰＣ、ＩｇＧ１、ＭＢ１５－１８Ｃ９）による細胞の染色とゲーティングに基づいていた。ソート後のＴｒｅｇ純度の平均は「９８％」（範囲９７～１００％）であった。さらに、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ポーランド）のモノクローナル抗体：（蛍光色素／クラス／クローン）：抗ＣＤ３（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ＩｇＧ１、ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４（Ｖ－５００、ＩｇＧ１、ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ ＩｇＧ１、ＳＫＩ）、抗ＣＤ１９（ＰｅｒＣＰ、ＩｇＧ１、４Ｇ７）、ＣＤ１４（ＰｅｒＣＰ、ｌｇＧ２ｂ、ＭｆＲ９）、抗ＣＤ１６（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＩｇＧ１、３Ｇ８）、抗ＣＤ２５（ＰＥ、ＩｇＧ１、Ｍ－Ａ２５１）、および抗ＣＤ１２７（ＡＰＣ、ＩｇＧ１、ｈｌＬ－７Ｒ－Ｍ２１）を用いて、Ｔｒｅｇのソート後のサンプルから表現型および不純物を確認した。
【0018】
静脈内投与では、臨床グレードの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、インターロイキン２（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、不活性化自己血清を使用して最大１４日間Ｔｒｅｇの増殖を行った［中央値（最小－最大）＝１１（１０－１４）］。培地（Ｘ－Ｖｉｖｏ２０、Ｌｏｎｚａ）は、増殖の全期間を通じて、１０％血清および１０００Ｕｌ／ｍｌのＩＬ２を補充した。ビーズは、膨張の初期に１：１の比率で細胞に加え、その後、＋７、＋８、＋９日目の継代中に１：１の比率を回復させた。ビーズから培養物を洗浄し、１０％血清と低レベルのＩＬ２（１００Ｕｌ／ｍｌ）中で培養の最後の２４～４８時間放置した。自己ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖｓを用いたセンチネル培養は、機能試験用のＴレスポンダーの供給源として、１０％血清と低レベルのＩＬ２（１００Ｕｌ／ｍｌ）で行った。放出時の最終生成物は、ＦｏｘＰ３発現を９０％以上［中央値（最小－最大）＝９１％（９０－９７）］；ＣＤ６２Ｌ発現を８０％以上［中央値（最小－最大）＝８７％（８１－９５）］；ＩＦＮｙ抑制アッセイを通過し、微生物検査は陰性であった。培養物の品質管理は、＋７日目および生成物放出時に実施した。ＩＦＮｙ抑制アッセイは、以前に記載されたように実施した［１４］。簡単に説明すると、増殖培養物からのＴｒｅｇのサンプル（ビーズから洗浄し、少なくとも２４時間静置する）を、自己センチネルＴｃｏｎｖ細胞と１：１の比率で共培養した。対照は、ＩＦＮｙを産生するように刺激した、または刺激していないＴｃｏｎｖｓまたはＴｒｅｇｓのみの培養物から構成された。アッセイ直前に、ＴｃｏｎｖｓをＴｒｅｇｓと区別するために細胞トレーサーＣＦＳＥ（ＣＦＤＡ ｋｉｔ Ｔｈｅｒｍｏ，米国）で染色し、アッセイ終了時にＩＦＮｙ陽性ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖｓの比率を別々に示すことができた。培養物の刺激と染色は、細胞内染色キット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ポーランド）を用いて、製造元の説明に従って行った。培養物を５０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート、５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ，ポーランド）および２μｌ／ｍｌのサイトカイン漏出阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ポーランド）で５時間刺激した。その後、細胞を抗ＩＦＮｙ抗体で染色した。このアッセイのポジティブな読み出しは、Ｔｃｏｎｖｓのみの培養物におけるＩＦＮｙの産生と比較した場合、Ｔｒｅｇと共培養したＴｃｏｎｖｓによるＩＦＮｙ産生の少なくとも２５％［中央値（最小－最大）＝６９％（５２－９５）］の抑制であった。ＴｒｅｇによるＩＦＮｙの産生は、細胞の２％を超えることはなかった。微生物の安全性は、増殖培地の上清の微生物学的培養結果が陰性であること（ＢＤ Ｂａｃｔｅｃ ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｕｒｏｐｅ）、増殖培地の上清のエンドトキシン検査が陰性であること（Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＰＴＳ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ／Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｒｅａｄｅｒ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，米国）、増殖培地の上清のグラム染色陰性（Ｇｒａｍ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｕｒｏｐｅ）、生成物中にＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２の遺伝物質がないこと（Ｃｏｂａｓ ＭＰＸ，Ｒｏｃｈｅ，Ｅｕｒｏｐｅ）により確認された。また、すべての微生物の放出後の結果が陰性であることが確認されるまで、製品への汚染の可能性に関連した有害な症状がないか、患者を追跡調査した。すぐに使用できるＴｒｅｇの調製物は、組織確立からの放出後２時間以内に投与する必要があった。最終用量は４０ｘ１０６のＴｒｅｇｓ／ｋｇ ｂ．ｗ．であった。放出後、調製物を完全に洗浄し、２５０ｍｌの注射用０．９％ ＮａＣＩ（Ｐｏｌｆａ，ワルシャワ）に懸濁し、患者にゆっくりと静脈内投与した。
【0019】
髄腔内投与患者に対しては、１ｍｌｎ（１ｘ１０６）の新鮮な単離Ｔｒｅｇ（増殖なし）を上記の放出基準に従って調べた後、１０ｍｌの０．９％ＮａＣＩに懸濁させた。その後、穿刺針によるＬ４／Ｌ５またはＬ５／Ｓ１腰椎穿刺時に緩徐に注射投与した。注射後６時間のベッド・レジメンがあった。
【0020】
臨床評価
訪問先での定期的な身体的／神経学的検査とは別に、患者は認定神経内科医によるＥＤＳＳおよびＭＳＦＣスケール［１５］に従って疾患の進行をモニターし、ＥＱ－５Ｄ質問票［１６］に従ってＱＯＬをモニターされた。以下の臨床検査が実施された（有意に異常な値のみ示す）：全血球計算、代謝、腎臓および肝臓パネル、Ｃ反応性タンパク質レベル、尿検査。
訪問先での定期的な身体的／神経学的検査とは別に、患者は認定神経内科医によるＥＤＳＳおよびＭＳＦＣスケール［１５］に従って疾患の進行をモニターし、ＥＱ－５Ｄ質問票［１６］に従ってＱＯＬをモニターされた。以下の臨床検査が実施された（有意に異常な値のみ示す）：全血球計算、代謝、腎臓および肝臓パネル、Ｃ反応性タンパク質レベル、尿検査。
【0021】
ＭＲＩ評価
脳のＭＲＩは、ＭＡＧＮＩＭＳ ２０１５標準プロトコルに従って実施した（３Ｄ Ｔｌ強調、３Ｄ Ｔ２－ＦＬＡＩＲ、３Ｄ Ｔ２強調、および単回投与後のガドリニウム造影Ｔｌ強調画像、すべてノンギャップ切片厚<３ｍｍ、ＤＷＩシーケンス（<５ｍｍ切片厚、１，５ Ｔｅｓｌａ Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ａｅｒａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、ドイツ））。ＭＲＩは投与後＋３ヶ月、＋６ヶ月、＋１２ヶ月の診察時に実施された。病変とその進行の評価はＢｒａｉｎＭａｇｉｘソフトウェア（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）とＰｈｉｌｉｐｓ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅ Ｐｏｒｔａｌ １０を用いて行い、プラークと造影増強プラークの総数を２人の観察者がカウントした。
脳のＭＲＩは、ＭＡＧＮＩＭＳ ２０１５標準プロトコルに従って実施した（３Ｄ Ｔｌ強調、３Ｄ Ｔ２－ＦＬＡＩＲ、３Ｄ Ｔ２強調、および単回投与後のガドリニウム造影Ｔｌ強調画像、すべてノンギャップ切片厚<３ｍｍ、ＤＷＩシーケンス（<５ｍｍ切片厚、１，５ Ｔｅｓｌａ Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ａｅｒａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、ドイツ））。ＭＲＩは投与後＋３ヶ月、＋６ヶ月、＋１２ヶ月の診察時に実施された。病変とその進行の評価はＢｒａｉｎＭａｇｉｘソフトウェア（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）とＰｈｉｌｉｐｓ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅ Ｐｏｒｔａｌ １０を用いて行い、プラークと造影増強プラークの総数を２人の観察者がカウントした。
【0022】
免疫応答
末梢血中のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋ ＴｒｅｇｓとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ／－ＣＤ１２７＋ ＦｏｘＰ３－Ｔｃｏｎｖｓを追跡するために１０色パネルを用いて免疫表現型分類が行われた。両方の集団において、これらのサブセットの機能にとって重要な抗原の発現を追跡した。特に、ナイーブ／メモリーサブセットの割合を以下の表現型：ナイーブ／Ｔｎ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー／Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡ）、およびエフェクターメモリー／Ｔｅｍ（ＣＤ６２Ｌ ＣＤ４５ＲＡ）に基づいて決定した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇｓはさらに、転写因子Ｈｅｌｉｏｓの発現に基づいて、末梢［ｐＴｒｅｇ Ｈｅｌｉｏｓ（－）］と胸腺［ｔＴｒｅｇ Ｈｅｌｉｏｓ（＋）］サブセットに分けられた［１７］（図２Ｓ）。
末梢血中のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋ ＴｒｅｇｓとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ／－ＣＤ１２７＋ ＦｏｘＰ３－Ｔｃｏｎｖｓを追跡するために１０色パネルを用いて免疫表現型分類が行われた。両方の集団において、これらのサブセットの機能にとって重要な抗原の発現を追跡した。特に、ナイーブ／メモリーサブセットの割合を以下の表現型：ナイーブ／Ｔｎ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー／Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡ）、およびエフェクターメモリー／Ｔｅｍ（ＣＤ６２Ｌ ＣＤ４５ＲＡ）に基づいて決定した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇｓはさらに、転写因子Ｈｅｌｉｏｓの発現に基づいて、末梢［ｐＴｒｅｇ Ｈｅｌｉｏｓ（－）］と胸腺［ｔＴｒｅｇ Ｈｅｌｉｏｓ（＋）］サブセットに分けられた［１７］（図２Ｓ）。
【0023】
この手順では、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ポーランド）から購入した以下の抗ヒトモノクローナル抗体（蛍光色素／クラス／クローン）：抗ＣＤ３（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ／ＩｇＧ１／ＵＣＨＴｌまたはＶ５００－Ｃ／ＩｇＧ１／クローンＳＫ７）、抗ＣＤ４（ＰｅｒＣＰまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００／ＩｇＧ１／ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ＣＤ２５（ＰＥまたはＢＶ７８６／ＩｇＧ１／Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ１２７（ＦＩＴＣまたはＢＵＶ７３７／ＩｇＧ１／ｈｌＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、抗ＣＤ４５ＲＡ（ＰＥ－Ｃｙ７／ＩｇＧ１／Ｌ４８）、抗ＣＤ７３（ＢＵＶ７３７／ＩｇＧ１／ＡＤ２）、抗ＣＤ２７９（ＢＶ６０５／ＩｇＧ１／ＥＨ１２．１）、抗ＣＤ１３７（ＢＶ６５０／ｌｇＧｌ／４Ｂ４－ｌ）、抗ＣＤ１３４（ＢＶ７１１／ＩｇＧ１／ＡＣＴ３５）、抗ＣＤ１５２（ＢＶ７８６／ＩｇＧ１／ＢＮＩ３）抗ＣＤ１８（ＦＩＴＣ／ＩｇＧ１／Ｌ１３０）、抗ＣＤ１８４（ＰＥ－ＣＦ５９４／ＩｇＧ１／１２Ｇ－５）、抗ＣＤ１９４（ＢＶ６０５／ＩｇＧ１／ｌＧｌ）、抗ＣＤ３９（ＢＶ６５０／ＩｇＧ１／ＴＵ６６またはＢＵＶ７３７／ＩｇＧ１／ＴＵ６６）およびａｎｔｉ－ＣＤ１０３ （ＢＵＶ３９５／ＩｇＧ１／Ｂｅｒ－ＡＣＴ８）を使用した。抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ－Ｃｙ７／ＩｇＧ１／３Ｂ５）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）から；ＦｏｘＰ３染色キットおよび抗Ｈｅｌｉｏｓ（ｅＦｌｕｏｒ４５０／ＩｇＧ１／２２Ｆ６）は、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（米国）から；抗ＣＣＲ８（ＰｅｒＣＰ／ＩｇＧ１／９１７０４）および抗ＣＣＲＩＯ（ＰＥ／ＩｇＧ１／３１４３０５）は、Ｒ&Ｄ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ（英国）から供給された。
【0024】
３８種類のサイトカインの血清レベル：ＩＦＮアルファ２、ＩＦＮガンマ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＳＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１７、ＩＬ２、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬｌα、ＩＬｌｂｅｔａ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ９、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ、ＥＧＦ、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－アルファ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＦＬＴ－３Ｌ、ＩＬ７、エオタキシン、ＣＸ３ＣＬ－１、ＣＸＣＬ－１、ＭＣＰ－３、ＣＣＬ２２、ＩＬ８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１アルファおよびＭＩＰ－１βは、ｌｕｍｉｎｅｘ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｒｃｋ，米国）上のＢｅａｄ ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙで測定された。すべてのアッセイは、製造元の説明書に従って実施した。
【0025】
統計解析
データはソフトウェアＳｔａｔｉｓｔｉｃａ １２．０ （ＳｔａｔＳｏｆｔ、ポーランド）を用いて計算した。クラスタ分析は、ＣｌｕｓｔＶｉｓソフトウェア（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/#mathematics）で行った。解析はノンパラメトリック検定で行った。Ｐ<０．０５を統計的に有意とした。
データはソフトウェアＳｔａｔｉｓｔｉｃａ １２．０ （ＳｔａｔＳｏｆｔ、ポーランド）を用いて計算した。クラスタ分析は、ＣｌｕｓｔＶｉｓソフトウェア（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/#mathematics）で行った。解析はノンパラメトリック検定で行った。Ｐ<０．０５を統計的に有意とした。
【0026】
結果
１．１．安全性
試験期間中、重篤な有害事象は報告されなかった。Ｔｒｅｇを静脈内投与（ｉｖ．）した患者では、中等度の有害事象が認められた。最も一般的な副作用は、中枢神経系における病変の再発および進行であった。興味深いことに、Ｔｒｅｇｓを髄腔内投与（ｔｃ．）した患者では、副作用は認められなかった（表２）。
１．１．安全性
試験期間中、重篤な有害事象は報告されなかった。Ｔｒｅｇを静脈内投与（ｉｖ．）した患者では、中等度の有害事象が認められた。最も一般的な副作用は、中枢神経系における病変の再発および進行であった。興味深いことに、Ｔｒｅｇｓを髄腔内投与（ｔｃ．）した患者では、副作用は認められなかった（表２）。
【表2】
【0027】
生活の質の分析では、ＥＱ－５Ｄフォームを用いた自己評価では、悪化は見られなかった。結果は、追跡期間中を通じて、両グループで同様であった（すべての検定ｐ>０．０５、図１）。
【0028】
１．２．有効性－臨床
ＥＤＳＳスケールで評価した臨床状態には、試験期間を通じてグループ間で差は認められなかった［クラスカル・ウォリス ＡＮＯＶＡ：０日目：Ｈ＝０．１８ ｐ＝０．６６；６ｍ：Ｈ＝０．３６ ｐ＝０．５４；１２ｍ：Ｈ＝０．０２９ ｐ＝０．８６］（図１）となった。しかし、ＥＤＳＳスケールの１年後の悪化は、ｔｃ．グループでは０から０．３、ｉｖ．グループでは０から１であった。ｉｖ．グループでは、１０名中３名がＥＤＳＳで１点を超える悪化を示した。髄腔内投与グループでは、このような悪化は見られなかった。静脈内投与した５名の患者で合計１２回の再発が認められ、その頻度は年間１～３回であった。一方、ｔｃ．投与グループでは再発は認められなかった。
ＥＤＳＳスケールで評価した臨床状態には、試験期間を通じてグループ間で差は認められなかった［クラスカル・ウォリス ＡＮＯＶＡ：０日目：Ｈ＝０．１８ ｐ＝０．６６；６ｍ：Ｈ＝０．３６ ｐ＝０．５４；１２ｍ：Ｈ＝０．０２９ ｐ＝０．８６］（図１）となった。しかし、ＥＤＳＳスケールの１年後の悪化は、ｔｃ．グループでは０から０．３、ｉｖ．グループでは０から１であった。ｉｖ．グループでは、１０名中３名がＥＤＳＳで１点を超える悪化を示した。髄腔内投与グループでは、このような悪化は見られなかった。静脈内投与した５名の患者で合計１２回の再発が認められ、その頻度は年間１～３回であった。一方、ｔｃ．投与グループでは再発は認められなかった。
【0029】
ＭＳＦＣスケールを用いて評価した臨床状態は、どのグループでも変化はなく、試験期間中、どのスケール構成要素においてもグループ間で差は認められなかった（すべての検定ｐ>０．０５、図１）。
【0030】
１．３．有効性－ＭＲＩ
ＭＲＩの解析では、ｉｖ．グループと比較して、ｔｃ．グループでは疾患の活動性が低いことが明らかになった（図２）。
ＭＲＩの解析では、ｉｖ．グループと比較して、ｔｃ．グループでは疾患の活動性が低いことが明らかになった（図２）。
【0031】
ＦＬＡＩＲ配列では、ＣＮＳのプラーク体積は、ｉｖ．グループでは増加したが、ｔｃ．グループでは変化がなかった［フリードマンのＡＮＯＶＡ：ｉｖ．：ｘ２＝１２．７９ ｐ＝０．００５；ｔｃ．：ｘ２＝４．５ ｐ＝０．２１］。両グループ間の差は、追跡期間中の６ヶ月と１２ヶ月で有意であった［クラスカル・ウォリス ＡＮＯＶＡ：３ｍ：Ｈ＝１．６５ ｐ＝０．１９；６ｍ：１－１＝６．１４ ｐ＝０．０１３；１２ｍ：Ｈ＝５．３３ ｐ＝０．０４７］。また、５つの最大プラークの体積でも差が見られた［クラスカル・ウォリス ＡＮＯＶＡ：３ｍ：Ｈ＝０．０１ ｐ＝０．９１；６ｍ：Ｈ＝７．７７ ｐ＝０．００５；１２ｍ：Ｈ＝２．３４ ｐ＝０．０６７］、および、新しいプラークの数［クラスカル・ウォリス ＡＮＯＶＡ：３ｍ：Ｈ＝３．７６ ｐ＝０．１５；６ｍ：Ｈ＝５．１０ ｐ＝０．０７６；１２ｍ：Ｈ＝４．６１ ｐ＝０．０９１］を各グループ間で比較した。興味深いことに、追跡期間中のプラーク総量の増加の原因は、既存の最大プラークの変化［５つの最大プラークからの平均体積に関するフリードマンのＡＮＯＶＡ：ｉｖ．：ｘ２＝３．６６ ｐ＝０．３０；ｔｃ．：ｘ２＝３．９０ ｐ＝０．２７］ではなく、ｉｖ．グループでのプラーク数の増加［プラーク数に関するフリードマンのＡＮＯＶＡ：ｉｖ．ｘ２＝２０．７７ ｐ＝０．０００１；ｔｃ．ｘ２＝５．５ ｐ＝０．１３］であった。また、ｉｖ．グループでは造影増強Ｔ１病変が試験終了時に有意に減少した。しかし、ｔｃ．グループでは追跡期間中、これらの病変は認められなかった［フリードマンのＡＮＯＶＡ：ｉｖ．：ｘ２＝１１．４１ ｐ＝０．００９；ｔｃ．：全数‘０’］。ＣＮＳの主要な構造の体積やＴ１低強度の体積は、両グループ間で差がなかった（図３Ｓ）。
【0032】
１．４．免疫応答
１．４．１．Ｔｒｅｇサブセット
ＦｏｘＰ３＋ ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖｓのレベルには、追跡期間中もグループ間でも有意な変化は見られなかった（すべての検定でｐ>０．０５、図３）。しかし、Ｔｒｅｇの投与経路にかかわらず、すべての患者において、いくつかの測定されたサブセットにおいてＴｒｅｇはＴｃｏｎｖと異なっていた。全患者を対象に、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖを比較すると、ＴｒｅｇはＴｃｍ表現型を主に含み（５０％以上）、ＴｃｏｎｖはＴｎ表現型を主に含む（５０％以上）（図３Ｃおよび表１Ｓ）。また、Ｔｒｅｇはケモカイン受容体であるＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ４、インテグリンＣＤ１０３、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９、および２つの共刺激分子であるＣＴＬＡ－４と４－１ＢＢなど、Ｔｃｏｎｖｓではほとんど検出されなかった複数の受容体を発現することも明らかになった（図３Ｓ－Ａ、Ｂおよび表１Ｓ）。これらの受容体の発現におけるＴｒｅｇとＴｏｎｖｓの違いは、クラスタ分析で確認された（図３Ｄ）。
１．４．１．Ｔｒｅｇサブセット
ＦｏｘＰ３＋ ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖｓのレベルには、追跡期間中もグループ間でも有意な変化は見られなかった（すべての検定でｐ>０．０５、図３）。しかし、Ｔｒｅｇの投与経路にかかわらず、すべての患者において、いくつかの測定されたサブセットにおいてＴｒｅｇはＴｃｏｎｖと異なっていた。全患者を対象に、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖを比較すると、ＴｒｅｇはＴｃｍ表現型を主に含み（５０％以上）、ＴｃｏｎｖはＴｎ表現型を主に含む（５０％以上）（図３Ｃおよび表１Ｓ）。また、Ｔｒｅｇはケモカイン受容体であるＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ４、インテグリンＣＤ１０３、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９、および２つの共刺激分子であるＣＴＬＡ－４と４－１ＢＢなど、Ｔｃｏｎｖｓではほとんど検出されなかった複数の受容体を発現することも明らかになった（図３Ｓ－Ａ、Ｂおよび表１Ｓ）。これらの受容体の発現におけるＴｒｅｇとＴｏｎｖｓの違いは、クラスタ分析で確認された（図３Ｄ）。
【0033】
さらに、全患者の約２０％のＴｒｅｇは、これらの細胞の末梢由来を示唆する転写因子Ｈｅｌｉｏｓを発現していなかった（図３Ｂ）。そこで、Ｔｒｅｇを胸腺ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ（＋）ｔＴｒｅｇｓと末梢ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ（－）ｐＴｒｅｇｓに分けて、さらに詳しく解析した。比較すると、ｔＴｒｅｇはＣＣＲ１０＋細胞、ＣＤ１０３＋細胞、ＣＤ７３＋細胞、ＣＤ３９＋細胞の割合が高く、ｐＴｒｅｇはＣＴＬＡ－４＋細胞の割合が高かった（図３Ｓ－Ｃおよび表１Ｓ）。クラスタ解析の結果、ＣＣＲ１０、ＣＤ１０３、ＣＤ３９の発現が高く、ＣＴＬＡ－４受容体の発現が低いことが、ｔＴｒｅｇとｐＴｒｅｇの相違点として確認された（図３Ｅ）。
【表3】
【0034】
１．４．２．サイトカイン
この試験では、患者の血清で測定された３８種類のサイトカインのアレイも含まれていた。静脈内投与患者と比較すると、髄腔内投与患者はＭＣＰ－３、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ８などの炎症に関連するいくつかの因子のレベルが高かった。興味深いことに、脳栄養因子ＴＧＦａのレベルもｉｖ．投与グループよりｔｃ．投与グループで高かった（表２Ｓ、図４Ｓ）。同じクラスタに位置するＭＣＰ－３、ＩＬ１ＲＡのレベルは、ｔｃ．グループとｉｖ．グループで異なった（図４）。他の測定されたサイトカインのレベルは、試験グループ間および各グループ内において、経過観察期間中に差は認められなかった。
この試験では、患者の血清で測定された３８種類のサイトカインのアレイも含まれていた。静脈内投与患者と比較すると、髄腔内投与患者はＭＣＰ－３、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ８などの炎症に関連するいくつかの因子のレベルが高かった。興味深いことに、脳栄養因子ＴＧＦａのレベルもｉｖ．投与グループよりｔｃ．投与グループで高かった（表２Ｓ、図４Ｓ）。同じクラスタに位置するＭＣＰ－３、ＩＬ１ＲＡのレベルは、ｔｃ．グループとｉｖ．グループで異なった（図４）。他の測定されたサイトカインのレベルは、試験グループ間および各グループ内において、経過観察期間中に差は認められなかった。
【表4】
【0035】
参考文献
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【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】