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特許7624967ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする組み合わされたキメラ抗原受容体並びにその適用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-23
(45)【発行日】2025-01-31
(54)【発明の名称】ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする組み合わされたキメラ抗原受容体並びにその適用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20250124BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250124BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250124BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250124BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250124BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250124BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250124BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250124BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250124BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20250124BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C07K16/28
C07K16/46
C12N5/10
A61P35/00
A61K39/395 N
A61K35/17
C12P21/08
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022506548
(86)(22)【出願日】2020-08-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-28
(86)【国際出願番号】 CN2020109645
(87)【国際公開番号】W WO2021184673
(87)【国際公開日】2021-09-23
【審査請求日】2023-08-15
(31)【優先権主張番号】202010188038.1
(32)【優先日】2020-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】16/877,069
(32)【優先日】2020-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522043220
【氏名又は名称】アベルゼータ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ，イーホン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ヤンフェン
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ，ユーティアン
(72)【発明者】
【氏名】ヂュー，シギュイ
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ，シン
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ジャーチー
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３６８０９８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５０８２１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５３７４３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cancer Immunology Research，2016年，Vol.4, No.6，pp.498-508
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、その構造が以下の式ＩＩで表され、Ｌ－Ｖ Ｌ１ －Ｖ Ｈ１ －Ｉ－Ｖ Ｈ２ －Ｖ Ｌ２ －Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩ）
式中、
各「－」は独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり、
Ｌは任意のシグナルペプチド配列であり、
Ｖ Ｌ１ は抗ＣＤ２０抗体軽鎖可変領域であり、
Ｖ Ｈ１ は抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域であり、
Ｉは可動性リンカーであり、
Ｖ Ｈ２ は抗ＣＤ１９抗体重鎖可変領域であり、
Ｖ Ｌ２ は抗ＣＤ１９抗体軽鎖可変領域であり、
Ｈは任意のヒンジ領域であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
Ｃは共刺激シグナル伝達分子であり、
ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列である、キメラ抗原受容体。
【請求項2】
前記ＶＨ１のアミノ酸配列が配列番号３に示され、前記ＶＬ１のアミノ酸配列が配列番号４に示される、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項3】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【請求項4】
前記細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である、請求項３に記載の細胞。
【請求項5】
請求項３に記載の細胞を含む、疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項6】
前記疾患が癌又は腫瘍である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって（ｉ）それぞれ配列番号４及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び重鎖可変領域（ＶＨ１）を含み、Ｖ Ｌ １がＶ Ｈ １のＮ末端に位置する抗ＣＤ２０抗原結合領域；
（ｉｉ）それぞれ配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び重鎖可変領域（ＶＨ２）を含み、Ｖ Ｈ ２がＶ Ｌ ２のＮ末端に位置する抗ＣＤ１９抗原結合領域；
（ｉｉｉ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメイン；
（ｉｖ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する共刺激シグナル伝達領域；及び
（ｖ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、二重特異性ＣＡＲ。
【請求項8】
前記抗ＣＤ２０抗原結合領域がＣＤ２０に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、前記抗ＣＤ１９抗原結合領域がＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖである、請求項７に記載の二重特異性ＣＡＲ。
【請求項9】
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド；及び（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するヒンジ領域
をさらに含む、請求項７に記載の二重特異性ＣＡＲ。
【請求項10】
Ｎ末端からＣ末端の方向に、前記シグナルペプチド、ＶＬ１、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ２、前記ヒンジ領域、前記膜貫通ドメイン、前記共刺激シグナル伝達領域、及び前記細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項９に記載の二重特異性ＣＡＲ。
【請求項11】
請求項７に記載の二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞。
【請求項12】
Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項13】
請求項１１に記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関し、より詳細には、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする組み合わされたキメラ抗原受容体並びにその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
血液系の悪性腫瘍はヒト悪性腫瘍の約１０％を占め、血液系の悪性腫瘍の９５％はＢリンパ球に由来する。伝統的な化学療法及び放射線療法は、血液系の悪性腫瘍の治療において重要な役割を果たす。一部の患者は有意な効果を有するが、ほとんどの患者にとって治癒することは困難である。新規かつ効果的な治療は、この分野で関心の的のトピックとなっている。
【0003】
養子Ｔ細胞療法は、悪性腫瘍の臨床治療においてその強力な有効性及び明るい見通しを示している。現在、養子Ｔ細胞療法は血液腫瘍を治療するための最も有望な方法の１つとして見なされている。ＣＤ１９は、ほとんどのＢ細胞悪性腫瘍の表面に高度に発現される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－改変Ｔ細胞を独立して使用して、ＣＤ１９発現Ｂ細胞の再発性難治性悪性腫瘍を標的とする複数の施設が、前例のない成功を達成した。現在、ＦＤＡによって承認された２つのＣＡＲ－Ｔ製品の両方は、ＣＤ１９抗原を標的とし、慢性リンパ性白血病適等の適応症も拡大している。抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔの有効性は顕著であるが、多くの研究は、ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法に多くの問題も存在することを示している。治療結果が悪く、再発しやすい一部の患者が依然として存在する。この理由には、腫瘍細胞が抗原エスケープを起こしやすいことが含まれる。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ－細胞療法の最近の実験は、患者の９０％が完全寛解を達成したが、これらの患者の１１％が最終的に再発し、再発患者は主にＣＤ１９陰性腫瘍を有する患者であったことを示した。特に、再発性難治性急性Ｂ細胞リンパ腫（Ｒ／Ｒ Ｂ－ＡＬＬ）の治療においてＣＡＲＴ１９を使用して、ペンシルベニア大学医学大学院で行われた臨床試験では、患者の最大９４％が完全寛解を達成した。この臨床試験の初期の奏効率は高かったが、完全寛解を達成した治療の１ヶ月後にほぼ４０％の患者が再発し、再発患者の６０％超がＣＤ１９陰性腫瘍細胞エスケープを有していた。抗原エスケープは、ＮＹ－ＥＳＯ１を発現する養子移入特異性Ｔ細胞受容体及びメラノーマを治療する癌ワクチンで見出されている。自然突然変異及び選択的拡大が抗原エスケープの主な理由である。
【0004】
したがって、腫瘍を効果的に治療し、抗原エスケープを防止する方法を発展させる当技術分野における緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、腫瘍を効果的に治療し、抗原エスケープを防止する方法を提供することである。
【0006】
本発明の目的は、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする組み合わされたキメラ抗原受容体及びその調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
具体的には、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする組み合わされたキメラ抗原受容体の配列、並びにその改変Ｔ細胞（ＣＡＲＴ－１９／２０）の調製方法及び活性同定を提供することが本発明の目的である。本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫の治療に使用するためのキメラ抗原受容体構造を提供する。
【0008】
本開示は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。二重特異性ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号４及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び重鎖可変領域（ＶＨ１）を含む抗ＣＤ２０抗原結合領域と、（ｉｉ）それぞれ配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び重鎖可変領域（ＶＨ２）を含む抗ＣＤ１９抗原結合領域と、とを含む。
【0009】
特定の実施形態では、ＶＬ１はＶＨ１のＮ末端に位置する。特定の実施形態では、ＶＨ２はＶＬ２のＮ末端に位置する。
【0010】
抗ＣＤ２０抗原結合領域は、ＣＤ２０に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。抗ＣＤ１９抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖであり得る。特定の実施形態では、ＣＤ２０に特異的に結合するｓｃＦｖは、ＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖのＮ末端に位置する。
【0011】
二重特異性ＣＡＲは、（ａ）リーダー配列、（ｂ）ヒンジ領域、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域、（ｅ）細胞質シグナル伝達ドメイン、又は（ｆ）それらの組合わせを更に含み得る。
【0012】
共刺激シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、ＰＤ１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、又はそれらの組合わせに由来し得る。
【0013】
細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来し得る。
【0014】
ヒンジ領域は、Ｉｇ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はそれらの組合わせに由来し得る。
【0015】
膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、又はそれらの組合わせに由来し得る。
【0016】
特定の実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有し得る。
【0017】
本開示は、本発明の二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞を提供する。免疫細胞は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。免疫細胞は、同種又は自己由来であり得る。
【0018】
本発明の二重特異性ＣＡＲをコードする核酸も本開示に包含される。
【0019】
本開示は更に、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【0020】
本開示は、癌を治療する方法を提供する。方法は、免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。
【0021】
癌は血液癌であり得る。癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍であり得る。癌は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、及び／又は多発性骨髄腫であり得る。癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、又はそれらの組合わせであり得る。
【0022】
本発明の第１の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、キメラ抗原受容体の構造は以下の式Ｉで示され、
Ｌ－ｓｃＦｖ１－Ｉ－ｓｃＦｖ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（Ｉ）
式中、
各「－」は独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり、
Ｌは任意のシグナルペプチド配列であり、
Ｉは可動性リンカーであり、
Ｈは任意のヒンジ領域であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
Ｃは共刺激シグナル伝達分子であり、
ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列であり、
ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２のうち１つはＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインであり、他方はＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインである。
Ｌ－ｓｃＦｖ１－Ｉ－ｓｃＦｖ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（Ｉ）
式中、
各「－」は独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり、
Ｌは任意のシグナルペプチド配列であり、
Ｉは可動性リンカーであり、
Ｈは任意のヒンジ領域であり、
ＴＭは膜貫通ドメインであり、
Ｃは共刺激シグナル伝達分子であり、
ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列であり、
ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２のうち１つはＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインであり、他方はＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインである。
【0023】
別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１は、ＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインであり、ｓｃＦｖ２は、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインである。
【0024】
別の好ましい実施形態では、ＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインの構造は、以下の式Ａ又は式Ｂに示され、
ＶＨ１－ＶＬ１（Ａ）；ＶＬ１－ＶＨ１（Ｂ）
ＶＨ１は抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域であり、ＶＬ１は抗ＣＤ２０抗体軽鎖可変領域であり、「－」はリンカーペプチド又はペプチド結合である。
ＶＨ１－ＶＬ１（Ａ）；ＶＬ１－ＶＨ１（Ｂ）
ＶＨ１は抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域であり、ＶＬ１は抗ＣＤ２０抗体軽鎖可変領域であり、「－」はリンカーペプチド又はペプチド結合である。
【0025】
別の好ましい実施形態では、ＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインの構造は、式Ｂに示される。
【0026】
別の好ましい実施形態では、ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号１に示され、ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号２に示されるか、又は
ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号３に示され、ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号４に示される。
ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号３に示され、ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号４に示される。
【0027】
別の好ましい実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は、可動性リンカー（又はリンカーペプチド）と連結され、可動性リンカー（又はリンカーペプチド）は、配列番号７（ＧＧＧＧＳ）に示されるような１～４、好ましくは２～４、より好ましくは３～４の連続した配列である。
【0028】
別の好ましい実施形態では、ＶＬ１及びＶＨ１は、配列番号１９に示されるような可動性リンカーと連結される。
【0029】
別の好ましい実施形態では、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインの構造は、以下の式Ｃ又は式Ｄに示され、
ＶＬ２－ＶＨ２（Ｃ）；ＶＨ２－ＶＬ２（Ｄ）
式中、ＶＬ２は抗ＣＤ１９抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨ２は抗ＣＤ１９抗体重鎖可変領域であり、「－」はリンカーペプチド又はペプチド結合である。
ＶＬ２－ＶＨ２（Ｃ）；ＶＨ２－ＶＬ２（Ｄ）
式中、ＶＬ２は抗ＣＤ１９抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨ２は抗ＣＤ１９抗体重鎖可変領域であり、「－」はリンカーペプチド又はペプチド結合である。
【0030】
別の好ましい実施形態では、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインの構造は、式Ｄに示される。
【0031】
別の好ましい実施形態では、ＶＬ２のアミノ酸配列は配列番号５に示され、ＶＨ２のアミノ酸配列は配列番号６に示される。
【0032】
別の好ましい実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ２は、可動性リンカー（又はリンカーペプチド）と連結され、可動性リンカー（又はリンカーペプチド）は、配列番号７（ＧＧＧＧＳ）に示されるような１～４、好ましくは２～４、より好ましくは３～４の連続した配列である。
【0033】
別の好ましい実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ１は、配列番号２０に示されるように可動性リンカーと連結される。
【0034】
別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１及び／又はｓｃＦｖ２は、マウス由来、ヒト化、ヒト化及びマウス由来のキメラ、又は完全ヒト化一本鎖抗体可変領域フラグメントである。
【0035】
別の好ましい実施形態では、キメラ抗原受容体の構造は、以下の式ＩＩに示され、
Ｌ－ＶＬ１－ＶＨ１－Ｉ－ＶＨ２－ＶＬ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（ＩＩ）
式中、各要素は上記の通りである。
Ｌ－ＶＬ１－ＶＨ１－Ｉ－ＶＨ２－ＶＬ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（ＩＩ）
式中、各要素は上記の通りである。
【0036】
別の好ましい実施形態では、可動性リンカーＩの配列は、配列番号７（ＧＧＧＧＳ）に示されるような２～６、好ましくは３～４の連続した配列を含む。
【0037】
別の好ましい実施形態では、可動性リンカーＩの配列は、配列番号７に示される通りである。
【0038】
別の好ましい実施形態では、Ｌは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ１３７、及びそれらの組合わせからなる群から選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。
【0039】
別の好ましい実施形態では、Ｌは、ＣＤ８に由来するシグナルペプチドである。
【0040】
別の好ましい実施形態では、Ｌのアミノ酸配列は配列番号８に示される。
【0041】
別の好ましい実施形態では、Ｈは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、Ｉｇ４、及びそれらの組合わせからなる群から選択されるタンパク質のヒンジ領域である。
【0042】
別の好ましい実施形態では、Ｈは、Ｉｇ４に由来するヒンジ領域である。
【0043】
別の好ましい実施形態では、Ｈのアミノ酸配列は配列番号９に示される。
【0044】
別の好ましい実施形態では、ＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、及びそれらの組合わせからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通領域である。
【0045】
別の好ましい実施形態では、ＴＭは、ＣＤ８又はＣＤ２８に由来する膜貫通領域である。
【0046】
別の好ましい実施形態では、ＴＭの配列は配列番号１０又は１１に示される。
【0047】
別の好ましい実施形態では、Ｃは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、及びそれらの組合わせからなる群から選択されるタンパク質の共刺激シグナル伝達分子である。
【0048】
別の好ましい実施形態では、Ｃは、４－１ＢＢ又はＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達分子である。
【0049】
別の好ましい実施形態では、Ｃのアミノ酸配列は配列番号１２又は１３に示される。
【0050】
別の好ましい実施形態では、ＣＤ３ζのアミノ酸配列は配列番号１４に示される。
【0051】
別の好ましい実施形態では、ＣＡＲのアミノ酸配列は配列番号１５又は１６に示される。
【0052】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合領域が、配列番号３又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【0053】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合領域が、配列番号４又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0054】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗原結合領域が、配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【0055】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗原結合領域が、配列番号５に記載のアミノ酸配列と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0056】
抗ＣＤ２０抗原結合領域の重鎖可変領域は、オファツムマブ抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３の３０～３５位、５０～６６位、９９～１１１位にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、又はＬｅｕ１６抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（配列番号１の３１～３５位、５０～６６位、９９～１１１位にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0057】
抗ＣＤ２０抗原結合領域の軽鎖可変領域は、オファツムマブ抗体の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号４の２４～３４位、５０～５６位、８９～９７位にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、又はＬｅｕ１６抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（配列番号２の２４～３３位、４９～５５位、８８～９６位にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0058】
抗ＣＤ２０抗原結合領域の重鎖可変領域は、オファツムマブ抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、又はＬｅｕ１６抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0059】
抗ＣＤ２０抗原結合領域の軽鎖可変領域は、オファツムマブ抗体の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、又はＬｅｕ１６抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0060】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合領域の重鎖可変領域が、オファツムマブ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号３の３０～３５位、５０～６６位、９９～１１１位に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、抗ＣＤ２０抗原結合領域の軽鎖可変領域が、オファツムマブ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号４の２４～３４位、５０～５６位、８９～９７位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【0061】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合領域の重鎖可変領域が、オファツムマブ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、抗ＣＤ２０抗原結合領域の軽鎖可変領域が、オファツムマブ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【0062】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合領域の重鎖可変領域が、Ｌｅｕ１６抗体の重鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号１の３１～３５位、５０～６６位、９９～１１１位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、抗ＣＤ２０抗原結合領域の軽鎖可変領域が、Ｌｅｕ１６抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号２の２４～３３位、４９～５５位、８８～９６位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【0063】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合領域の重鎖可変領域が、Ｌｅｕ１６抗体の重鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、抗ＣＤ２０抗原結合領域の軽鎖可変領域が、Ｌｅｕ１６抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【0064】
抗ＣＤ１９抗原結合領域の重鎖可変領域は、ＦＭＣ６３抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番６の３１～３５位、５０～６５位、９８～１０９位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0065】
抗ＣＤ１９抗原結合領域の軽鎖可変領域は、ＦＭＣ６３抗体の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号５の２４～３４位、５０～５６位、８９～９７位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0066】
抗ＣＤ１９抗原結合領域の重鎖可変領域は、ＦＭＣ６３抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0067】
抗ＣＤ１９抗原結合領域の軽鎖可変領域は、ＦＭＣ６３抗体の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号６３、配列番号６４、配列番号３９のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９９％、少なくとも又は約８１％、少なくとも又は約８２％、少なくとも又は約８３％、少なくとも又は約８４％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約８６％、少なくとも又は約８７％、少なくとも又は約８８％、少なくとも又は約８９％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９１％、少なくとも又は約９２％、少なくとも又は約９３％、少なくとも又は約９４％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９６％、少なくとも又は約９７％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、あるいは約１００％同一である、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含み得る。
【0068】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗原結合領域の重鎖可変領域が、ＦＭＣ６３抗体の重鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号６の３１～３５位、５０～６５位、９８～１０９位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、抗ＣＤ１９抗原結合領域の軽鎖可変領域が、ＦＭＣ６３抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号５の２４～３４位、５０～５６位、８９～９７位のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【0069】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗原結合領域の重鎖可変領域が、ＦＭＣ６３抗体の重鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、抗ＣＤ１９抗原結合領域の軽鎖可変領域が、ＦＭＣ６３抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲと同一の３つのＣＤＲ（配列番号６３、配列番号６４、配列番号３９のそれぞれに記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【0070】
本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を提供する。
【0071】
別の好ましい実施形態では、核酸分子が単離される。
【0072】
別の好ましい実施形態では、核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号１７又は１８に示される。
【0073】
本発明の第３の態様では、本発明の第２の態様の核酸分子を含むベクターを提供する。
【0074】
別の好ましい実施形態では、ベクターはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【0075】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、及びそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0076】
別の好ましい実施形態では、ベクターはＤＮＡウイルス及びレトロウイルスベクターを含む。
【0077】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0078】
別の好ましい実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【0079】
本発明の第４の態様では、本発明の第３の態様のベクターを含むか、又は本発明の第２の態様の外因性核酸分子がそのゲノムに組み込まれているか、又は本発明の第１の態様のキメラ抗原受容体を発現する、宿主細胞を提供する。
【0080】
別の好ましい実施形態では、細胞は単離された細胞である。
【0081】
別の好ましい実施形態では、細胞は遺伝子操作された細胞である。
【0082】
別の好ましい実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
【0083】
別の好ましい実施形態では、細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である。
【0084】
別の好ましい実施形態では、細胞はＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を標的とする。
【0085】
本発明の第５の態様では、本発明の第１の態様のキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、本発明の第２の態様の核酸分子又は本発明の第３の態様のベクターを、Ｔ細胞に形質導入し、それによりＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程を含む。
【0086】
別の好ましい実施形態では、方法は、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞の機能及び有効性を検出する工程を更に含む。
【0087】
本発明の第６の態様では、本発明の第１の態様のキメラ抗原受容体、本発明の第２の態様の核酸分子、本発明の第３の態様のベクター、又は本発明の第４の態様の宿主細胞、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤若しくは賦形剤を含む製剤を提供する。
【0088】
別の好ましい実施形態では、製剤は液体製剤である。
【0089】
別の好ましい実施形態では、製剤の調合は注射剤である。
【0090】
別の好ましい実施形態では、製剤は、本発明の第４の態様の宿主細胞を含み、宿主細胞の濃度は、１×１０３～１×１０８細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０４～１×１０７細胞／ｍｌである。
【0091】
本発明の第７の態様では、腫瘍又は癌を予防及び／又は治療するための薬品又は製剤を調製するための、本発明の第１の態様のキメラ抗原受容体、本発明の第２の態様の核酸分子、本発明の第３の態様のベクター、又は本発明の第４の態様の宿主細胞の使用を提供する。
【0092】
別の好ましい実施形態では、腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、及びそれらの組合わせからなる群から選択され、好ましくは、腫瘍は血液腫瘍である。
【0093】
別の好ましい実施形態では、血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及びそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0094】
別の好ましい実施形態では、固形腫瘍は、胃癌、胃癌の腹膜転移、肝臓癌、白血病、腎臓癌、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、上咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、神経膠腫、子宮内膜癌、及びそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0095】
本発明の第８の態様では、本発明の第４の態様の細胞を調製するためのキットを提供し、該キットは、容器、及び容器内に配置された、本発明の第２の態様の核酸分子又は本発明の第３の態様のベクターを含む。
【0096】
本発明の第９の態様では、癌又は腫瘍の予防及び／又は治療のための、本発明の第４の態様の細胞、又は本発明の第６の態様の製剤の使用を提供する。
【0097】
本発明の第１０の態様では、適切な量の本発明の第４の態様の細胞又は本発明の第６の態様の製剤を、治療を必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療する方法を提供する。
【0098】
別の好ましい実施形態では、疾患は癌又は腫瘍である。
【0099】
上記の本発明の様々な技術的特徴及び（実施例のような）以下に具体的に説明される様々な技術的特徴は、本発明の範囲内で互いに組み合わされて、新たな又は好ましい技術的解決策を構成することができ、紙面の制限のために１つずつ説明する必要はないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0100】
【図1】図１は、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする組み合わされたキメラ抗原受容体の構造を示す。ＣＡＲの構造は、リーダー配列、抗原認識配列、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域、及びＣＤ３ζシグナル伝達領域を含む。
【図2B】図２Ｂは、培養上清中のＩＦＮγの分泌レベルを示す。具体的には、７日間培養した１×１０５のＣＡＲ－Ｔ１９／２０細胞を採取し、ＣＤ１９陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋腫瘍細胞株、ＣＤ２０陽性Ｋ５６２－ＣＤ２０＋腫瘍細胞株、ＣＤ１９及びＣＤ２０二重陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋腫瘍細胞株、ＣＤ１９及びＣＤ２０を天然に発現するＲＡＪＩ腫瘍細胞株、並びにＣＤ１９及びＣＤ２０二重陰性Ｋ５６２腫瘍細胞株と共に、又は腫瘍細胞なしで、２００μｌのＧＴ－５５１培地中で、１：１の比で１８時間、それぞれ培養した。次いで、Ｔ細胞膜の表面上のＣＤ１３７の発現レベル及び培養上清中のＩＦＮγの分泌レベルをそれぞれ検出した。
【図3A】図３Ａは、主に共培養後の上清中のＬＤＨの分泌レベルを検出することによる、ＣＡＲ－Ｔ１９／２０細胞の殺腫瘍活性の検出を示す。具体的には、１×１０４細胞のＣＤ１９陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋腫瘍細胞株、ＣＤ２０陽性Ｋ５６２－ＣＤ２０＋腫瘍細胞株、ＣＤ１９及びＣＤ２０二重陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋腫瘍細胞株、ＣＤ１９及びＣＤ２０を天然に発現するＲＡＪＩ若しくはＲＡＭＯＳ腫瘍細胞株、又はＣＤ１９及びＣＤ２０二重陰性Ｋ５６２腫瘍細胞株を、１００μｌのＧＴ－５５１培地中で、図に示す比率で８時間、それぞれ対応するＴ細胞と共培養した。次いで、ＬＤＨの分泌レベルを検出し、この図は、対応する共培養試料におけるＬＤＨ放出の百分率の統計分析結果を示す。
【図3B】図３Ｂは、主にＴ細胞膜の表面上のＣＤ１０７ａの発現レベルを検出することによる、ＣＡＲ－Ｔ１９／２０細胞の殺腫瘍活性の検出を示す。具体的には、１×１０５のＣＡＲ－Ｔ１９／２０細胞を採取し、ＣＤ１９陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋腫瘍細胞株、ＣＤ２０陽性Ｋ５６２－ＣＤ２０＋腫瘍細胞株、ＣＤ１９及びＣＤ２０二重陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋腫瘍細胞株、ＣＤ１９及びＣＤ２０を天然に発現するＲＡＪＩ若しくはＲＡＭＯＳ腫瘍細胞株、並びにＣＤ１９及びＣＤ２０二重陰性Ｋ５６２腫瘍細胞株と共に、又は腫瘍細胞なしで、２００μｌのＧＴ－５５１培地中で、１：２の比で４時間培養した。次いで、Ｔ細胞膜の表面上のＣＤ１３７の発現レベルをそれぞれ検出した。
【図6】図６は、ＣＤ１９若しくはＣＤ２０又は両方を有する細胞に結合するが、両方の抗原を欠く細胞には結合されないキメラ抗体を示し、二重特異性結合ドメインが結合のために１つのみの同族抗原を必要とし、新しい特異性認識部位は形成されなかったことを示している。
【図8A】図８Ａは、ＣＡＲ－Ｔ２０．１、ＣＡＲ－Ｔ２０．５、ＣＡＲ－Ｔ２０．６、ＣＡＲ－Ｔ２０．７、ＣＡＲ－Ｔ２０．８、ＣＡＲ－Ｔ２０．９及びＣＡＲ－Ｔ２０．１０をスクリーニングするためのＩＦＮγ放出アッセイの結果を示し、これらのＣＡＲ－Ｔの中で、ＣＡＲ－Ｔ２０．９（Ｌｅｕ１６）及びＣＡＲ－Ｔ２０．１０（Ｌｅｕ１６）のみが、より高い陽性ＩＦＮγ放出を示した。
【図8B】図８Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ２０．１、ＣＡＲ－Ｔ２０．９、ＣＡＲ－Ｔ２０．１０、ＣＡＲ－Ｔ２０．１１、ＣＡＲ－Ｔ２０．１２、ＣＡＲ－Ｔ２０．１３、ＣＡＲ－Ｔ２０．１４、ＣＡＲ－Ｔ２０．１５及びＣＡＲ－Ｔ２０．１６をスクリーニングするためのＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。これらのＣＡＲ－Ｔの中で、ＣＡＲ－Ｔ２０．１０（Ｌｅｕ１６）及びＣＡＲ－Ｔ２０．１４（ＯＦ）が、より高い陽性ＩＦＮγ放出を示した。
【図8C】図８Ｃは、ＣＡＲ－Ｔ２０．９、ＣＡＲ－Ｔ２０．１２、ＣＡＲ－Ｔ２０．１４、ＣＡＲ－Ｔ２０．１７、ＣＡＲ－Ｔ２０．１８、及びＣＡＲ－Ｔ２０．１９をスクリーニングするためのＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。これらのＣＡＲ－Ｔの中で、ＣＡＲ－Ｔ２０．１４（ＯＦ）及びＣＡＲ－Ｔ２０．１９（ＯＦ）は、より高い陽性ＩＦＮγ放出を示した。
【発明を実施するための形態】
【0101】
広範かつ集中的な研究の後、本発明者等は、予想外にも、ＣＤ１９及びＣＤ２０を同時に標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。具体的には、本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ２０を同時に標的とするキメラ抗原受容体であって、シグナルペプチド、抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達領域を含む、キメラ抗原受容体を提供する。更に、抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、多数のスクリーニングによって得られ、多重反復構造を有するペプチドフラグメント（Ｇ４Ｓ）と連結された。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９抗原及びＣＤ２０抗原の両方を同時に認識することができ、単一標的ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療中に、抗原発現の下方制御又は欠失によって引き起こされる免疫エスケープのリスクを低下させる。単一抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及び他の二重標的ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする）と比較して、２つの標的を同時に認識する本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対するより強力な殺傷能力、より少ない細胞傷害性、より低い副作用、より広い治療範囲、より低い再発率及びより良好な有効性を有する。本発明は、これに基づき完成された。
【0102】
用語
本開示をより理解しやすくするために、いくつかの用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書で特に明記されない限り、以下の各用語は以下に示される意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通して記載される。
本開示をより理解しやすくするために、いくつかの用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書で特に明記されない限り、以下の各用語は以下に示される意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通して記載される。
【0103】
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値又は組成物について許容可能な誤差範囲内の値又は組成物を指すことができ、これは値又は組成物がどのように測定又は決定されるかに部分的に依存するであろう。
【0104】
「投与する」という用語は、注射又は注入等による、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、又は他の非経口投与を含む、当業者に既知の様々な方法及び送達システムのうちのいずれか１つを使用する、対象への本発明の生成物の物理的導入を指す。
【0105】
「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン、又はその抗原結合部分を含み得るが、これらに限定されない。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、定常ドメインＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分され得、これらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域内に散在される。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含み、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【0106】
ＣＤ２０
抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔの有効性は顕著であるが、多くの研究は、ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法に今なお多くの問題が存在することを示している。治療結果が悪く、再発しやすい一部の患者が依然として存在する。これには、腫瘍細胞が抗原エスケープを起こしやすいことが含まれる。
抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔの有効性は顕著であるが、多くの研究は、ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法に今なお多くの問題が存在することを示している。治療結果が悪く、再発しやすい一部の患者が依然として存在する。これには、腫瘍細胞が抗原エスケープを起こしやすいことが含まれる。
【0107】
ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ抗原のエスケープを防止するために、本発明者等は、ＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を標的とする組み合わされた二重特異性ＣＡＲ（すなわち、ＢＩＣＡＲ）を設計して、ＣＤ１９抗原がエスケープし、腫瘍細胞で発現されない場合に、ＣＤ２０が認識されて、インビボで腫瘍細胞を取り除くことができる。
【0108】
ＣＤ２０は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ治療後の一部のＣＤ１９陰性患者を含む、Ｂ細胞急性リンパ性白血病を有するほとんどの患者において発現される。ＣＤ２０は、グリコシル化タンパク質であり、最初に同定されたＢ細胞膜マーカである。ＣＤ２０はＢ１としても知られており、ＭＳ４Ａ遺伝子によってコードされる。ＣＤ２０分子は４つの膜貫通疎水性領域を有し、そのＮ末端及びＣ末端は細胞質側に位置し、細胞の外側に２つの閉ループを形成し、それぞれ大ループ及び小ループと呼ばれる。ＣＤ２０は、正常及び癌性Ｂ細胞の９５％超で特異的に発現される。これらの細胞はプレＢ細胞段階及びその後の発達段階にあり、ＣＤ２０は、細胞が形質細胞に分化するまで発現を停止する。本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法のために別の標的としてＣＤ２０を使用する。
【0109】
ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体
細胞免疫療法は、新しく非常に効果的な腫瘍治療モデルであり、癌の新しい種類の自己免疫治療である。細胞免疫療法は、バイオテクノロジー及び生物学的薬剤を使用して患者から採取された免疫細胞をインビトロで培養及び増幅し、次いで細胞を患者に注入し戻して、身体の自己免疫機能を刺激及び増強し、それによって腫瘍を治療する目的を達成する方法である。当業者は、有効性を高め、副作用を低減するための新しい細胞免疫療法を開発することに取り組んできた。
細胞免疫療法は、新しく非常に効果的な腫瘍治療モデルであり、癌の新しい種類の自己免疫治療である。細胞免疫療法は、バイオテクノロジー及び生物学的薬剤を使用して患者から採取された免疫細胞をインビトロで培養及び増幅し、次いで細胞を患者に注入し戻して、身体の自己免疫機能を刺激及び増強し、それによって腫瘍を治療する目的を達成する方法である。当業者は、有効性を高め、副作用を低減するための新しい細胞免疫療法を開発することに取り組んできた。
【0110】
本発明は、初代ヒトＴ細胞に効果的に組み込むことができ、Ｔ細胞が活性化された時にＣＤ１９及びＣＤ２０を同時に標的化することができる、合理的かつ最適化された単鎖設計及びシステム、すなわち、組み合わされた二重特異性ＣＡＲを提案する。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、２つの抗原（ＣＤ１９及びＣＤ２０）を認識することができる。本発明は、抗原エスケープを防止するための非常に有効な潜在的方法を提供する。
【0111】
本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ２０を同時に標的とするＣＡＲを使用する。単一の抗原を標的とするＣＡＲと比較して、親和性が増強され、Ｔ細胞の活性が増加し、標的は相加効果又は相乗効果を有する。加えて、腫瘍細胞におけるＣＤ１９及びＣＤ２０の不均一な発現レベルのために、二重標的ＣＡＲ－Ｔ療法はより広い範囲を有する。腫瘍細胞の表面上のＣＤ１９及びＣＤ２０を同時に標的とするＣＡＲ－Ｔは、単一表面抗原の下方制御又は欠失によって引き起こされる抗原エスケープの可能性を低減することができる。
【0112】
二重特異性は、同じＣＡＲが２つの異なる抗原に特異的に結合し、免疫認識することができ、ＣＡＲが抗原のいずれか１つに結合することによって免疫応答を生成することができることを意味する。
【0113】
本発明のＣＤ１９及びＣＤ２０二重特異性ＣＡＲは、単一の構造を有し、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２０ｓｃＦｖを含む。ここで、ＣＡＲはＣＤ１９ｓｃＦｖ及びＣＤ２０ｓｃＦｖを含み、ＣＤ１９ｓｃＦｖ及びＣＤ２０ｓｃＦｖのアミノ酸配列、配列決定及びヒンジは、その機能に影響を及ぼす主な因子である。
【0114】
具体的には、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとしても知られる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域及びζ鎖を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子を含む細胞内ドメインの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体又はそのリガンドではなく、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な細胞表面分子である。
【0115】
リンカーは、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に組み込まれ得る。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、一般に、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン又は細胞質ドメインに連結させる役割を果たす任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。リンカーは、０～３００のアミノ酸、好ましくは２～１００のアミノ酸、最も好ましくは３～５０のアミノ酸を含み得る。
【0116】
本発明の好ましい実施形態では、本発明で提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明のＣＡＲがＴ細胞で発現される場合、抗原結合特異性に基づいて抗原認識が行われ得る。ＣＡＲがその会合した抗原に結合すると、ＣＡＲは腫瘍細胞に影響を及ぼし、腫瘍細胞が成長することができず、死に至るか、又は他の方法で影響を受け、患者の腫瘍負荷を縮小又は排除する。抗原結合ドメインは、好ましくは、共刺激分子及びζ鎖のうち１つ以上からの細胞内ドメインに融合される。好ましくは、抗原結合ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの組合わせの細胞内ドメインと融合される。
【0117】
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」及び「単鎖抗体フラグメント」は、抗原結合活性を有する、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又は単一Ｆｖフラグメントを指す。Ｆｖ抗体は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域を含まない。Ｆｖ抗体は、全ての抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントを有する。一般に、Ｆｖ抗体はまた、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。抗原結合ドメインは、通常、ｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）である。ｓｃＦｖの大きさは、典型的には完全抗体の１／６である。単鎖抗体は、好ましくは、ヌクレオチド鎖によってコードされるアミノ酸鎖配列である。本発明の好ましい実施形態として、ｓｃＦｖは、ＣＤ１９及びＣＤ２０を特異的に認識する抗体を含む。
【0118】
ヒンジ領域及び膜貫通領域（膜貫通ドメイン）に関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計され得る。一実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを回避し、それによって受容体複合体の他のメンバとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
【0119】
本発明のＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。
【0120】
好ましくは、本発明のＣＡＲ構造は、同様に、シグナルペプチド配列（リーダー配列としても知られる）、抗原認識配列（抗原結合ドメイン）、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達領域（ζ鎖部分）を含む。接続の順序を図１に示す。
【0121】
別の好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲはＴＮ－ＬＥＵ－１９である。ＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインは、Ｌｅｕ１６抗体由来の単鎖可変領域の重鎖配列（配列番号１）及び軽鎖（ＶＬ）配列（配列番号２）を含む。
【0122】
Ｌｅｕ１６抗体由来の単鎖可変領域の重鎖配列（ＶＨ）：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＤＹＹＣＡＲＳＮＹＹＧＳＳＹＷＦＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１）
ＬＥＵ－ＶＨ－ＣＤＲ１：配列番号１、位置３１～３５；
ＬＥＵ－ＶＨ－ＣＤＲ２：配列番号１、位置５０～６６；
ＬＥＵ－ＶＨ－ＣＤＲ３：配列番号１、位置９９～１１１。
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＤＹＹＣＡＲＳＮＹＹＧＳＳＹＷＦＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１）
ＬＥＵ－ＶＨ－ＣＤＲ１：配列番号１、位置３１～３５；
ＬＥＵ－ＶＨ－ＣＤＲ２：配列番号１、位置５０～６６；
ＬＥＵ－ＶＨ－ＣＤＲ３：配列番号１、位置９９～１１１。
【0123】
Ｌｅｕ１６抗体由来の単鎖可変領域の軽鎖配列（ＶＬ）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＮＹＭＤＷＹＱＫＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２）
ＬＥＵ－ＶＬ－ＣＤＲ１：配列番号２、位置２４～３３；
ＬＥＵ－ＶＬ－ＣＤＲ２：配列番号２、位置４９～５５；
ＬＥＵ－ＶＬ－ＣＤＲ３：配列番号２、位置８８～９６。
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＮＹＭＤＷＹＱＫＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２）
ＬＥＵ－ＶＬ－ＣＤＲ１：配列番号２、位置２４～３３；
ＬＥＵ－ＶＬ－ＣＤＲ２：配列番号２、位置４９～５５；
ＬＥＵ－ＶＬ－ＣＤＲ３：配列番号２、位置８８～９６。
【表1】
【表2】
【0124】
別の好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲはＴＮ－ＯＦ－１９である。ＣＤ２０を標的とする抗原結合ドメインは、オファツムマブ抗体由来の単鎖可変領域の重鎖配列（配列番号３）及び軽鎖配列（配列番号４）を含む。
【0125】
オファツムマブ抗体に由来する単鎖可変領域の重鎖配列（ＶＨ）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＤＩＱＹＧＮＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３）
ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ１：配列番号３、位置３０～３５。ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ１の配列は、ＮＤＹＡＭＨ（配列番号４０）である。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＤＩＱＹＧＮＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３）
ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ１：配列番号３、位置３０～３５。ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ１の配列は、ＮＤＹＡＭＨ（配列番号４０）である。
【0126】
ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ２：配列番号３、位置５０～６６。ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ２の配列は、ＴＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４１）である。
【0127】
ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ３：配列番号３、位置９９～１１１。ＯＦ－ＶＨ－ＣＤＲ３の配列は、ＤＩＱＹＧＮＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号４２）である。
【0128】
オファツムマブ抗体に由来する単鎖可変領域の軽鎖配列（ＶＬ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号４）
ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ１：配列番号４、位置２４～３４。ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ１の配列は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号４３）である。
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号４）
ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ１：配列番号４、位置２４～３４。ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ１の配列は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号４３）である。
【0129】
ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ２：配列番号４、位置５０～５６。ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ２の配列は、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）である。
【0130】
ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ３：配列番号４、位置８９～９７。ＯＦ－ＶＬ－ＣＤＲ３の配列は、ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号４５）である。
【0131】
別の好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲにおけるＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインは、ＦＭＣ６３抗体に由来する単鎖可変領域の軽鎖（ＶＬ）配列（配列番号５）及び重鎖配列（配列番号６）を含む。
【0132】
ＦＭＣ６３抗体に由来する単鎖可変領域の軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ（配列番号５）
ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ１：配列番号５、位置２４～３４。ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ１の配列は、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（配列番号６３）である。
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ（配列番号５）
ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ１：配列番号５、位置２４～３４。ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ１の配列は、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（配列番号６３）である。
【0133】
ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ２：配列番号５、位置５０～５６。ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ２の配列は、ＨＴＳＲＬＨＳ（配列番号６４）である。
【0134】
ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ３：配列番号５、位置８９～９７。ＦＭＣ６３－ＶＬ－ＣＤＲ３の配列は、ＱＱＧＮＴＬＰＹＴ（配列番号３９）である。
【0135】
ＦＭＣ６３抗体に由来する単鎖可変領域の軽鎖（ＶＬ）のヌクレオチド配列：
ｇａｃａｔｃｃａｇａ ｔｇａｃａｃａｇａｃ ｔａｃａｔｃｃｔｃｃ ｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔ ｃｔｃｔｇｇｇａｇａ ｃａｇａｇｔｃａｃｃ ６０
ａｔｃａｇｔｔｇｃａ ｇｇｇｃａａｇｔｃａ ｇｇａｃａｔｔａｇｔ ａａａｔａｔｔｔａａ ａｔｔｇｇｔａｔｃａ ｇｃａｇａａａｃｃａ １２０
ｇａｔｇｇａａｃｔｇ ｔｔａａａｃｔｃｃｔ ｇａｔｃｔａｃｃａｔ ａｃａｔｃａａｇａｔ ｔａｃａｃｔｃａｇｇ ａｇｔｃｃｃａｔｃａ １８０
ａｇｇｔｔｃａｇｔｇ ｇｃａｇｔｇｇｇｔｃ ｔｇｇａａｃａｇａｔ ｔａｔｔｃｔｃｔｃａ ｃｃａｔｔａｇｃａａ ｃｃｔｇｇａｇｃａａ ２４０
ｇａａｇａｔａｔｔｇ ｃｃａｃｔｔａｃｔｔ ｔｔｇｃｃａａｃａｇ ｇｇｔａａｔａｃｇｃ ｔｔｃｃｇｔａｃａｃ ｇｔｔｃｇｇａｇｇｇ ３００
ｇｇｇａｃｃａａｇｃ ｔｇｇａｇａｔｃａｃ ａ ３２１（配列番号２１）
ｇａｃａｔｃｃａｇａ ｔｇａｃａｃａｇａｃ ｔａｃａｔｃｃｔｃｃ ｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔ ｃｔｃｔｇｇｇａｇａ ｃａｇａｇｔｃａｃｃ ６０
ａｔｃａｇｔｔｇｃａ ｇｇｇｃａａｇｔｃａ ｇｇａｃａｔｔａｇｔ ａａａｔａｔｔｔａａ ａｔｔｇｇｔａｔｃａ ｇｃａｇａａａｃｃａ １２０
ｇａｔｇｇａａｃｔｇ ｔｔａａａｃｔｃｃｔ ｇａｔｃｔａｃｃａｔ ａｃａｔｃａａｇａｔ ｔａｃａｃｔｃａｇｇ ａｇｔｃｃｃａｔｃａ １８０
ａｇｇｔｔｃａｇｔｇ ｇｃａｇｔｇｇｇｔｃ ｔｇｇａａｃａｇａｔ ｔａｔｔｃｔｃｔｃａ ｃｃａｔｔａｇｃａａ ｃｃｔｇｇａｇｃａａ ２４０
ｇａａｇａｔａｔｔｇ ｃｃａｃｔｔａｃｔｔ ｔｔｇｃｃａａｃａｇ ｇｇｔａａｔａｃｇｃ ｔｔｃｃｇｔａｃａｃ ｇｔｔｃｇｇａｇｇｇ ３００
ｇｇｇａｃｃａａｇｃ ｔｇｇａｇａｔｃａｃ ａ ３２１（配列番号２１）
【0136】
ＦＭＣ６３抗体に由来する単鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖のアミノ酸配列：
ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号６）
ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ１：配列番号６、位置３１～３５。ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ１の配列は、ＤＹＧＶＳ（配列番号６０）である。
ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号６）
ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ１：配列番号６、位置３１～３５。ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ１の配列は、ＤＹＧＶＳ（配列番号６０）である。
【0137】
ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ２：配列番号６、位置５０～６５。ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ２の配列は、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号６１）である。
【0138】
ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ３：配列番号６、位置９８～１０９。ＦＭＣ６３－ＶＨ－ＣＤＲ３の配列は、ＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹ（配列番号６２）である。
【0139】
ＦＭＣ６３抗体に由来する単鎖可変領域の重鎖（ＶＨ）のヌクレオチド配列：
ｇａｇｇｔｇａａａｃ ｔｇｃａｇｇａｇｔｃ ａｇｇａｃｃｔｇｇｃ ｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃ ｃｃｔｃａｃａｇａｇ ｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃ ６０
ａｃａｔｇｃａｃｔｇ ｔｃｔｃａｇｇｇｇｔ ｃｔｃａｔｔａｃｃｃ ｇａｃｔａｔｇｇｔｇ ｔａａｇｃｔｇｇａｔ ｔｃｇｃｃａｇｃｃｔ １２０
ｃｃａｃｇａａａｇｇ ｇｔｃｔｇｇａｇｔｇ ｇｃｔｇｇｇａｇｔａ ａｔａｔｇｇｇｇｔａ ｇｔｇａａａｃｃａｃ ａｔａｃｔａｔａａｔ １８０
ｔｃａｇｃｔｃｔｃａ ａａｔｃｃａｇａｃｔ ｇａｃｃａｔｃａｔｃ ａａｇｇａｃａａｃｔ ｃｃａａｇａｇｃｃａ ａｇｔｔｔｔｃｔｔａ ２４０
ａａａａｔｇａａｃａ ｇｔｃｔｇｃａａａｃ ｔｇａｔｇａｃａｃａ ｇｃｃａｔｔｔａｃｔ ａｃｔｇｔｇｃｃａａ ａｃａｔｔａｔｔａｃ ３００
ｔａｃｇｇｔｇｇｔａ ｇｃｔａｔｇｃｔａｔ ｇｇａｃｔａｃｔｇｇ ｇｇｃｃａａｇｇａａ ｃｃｔｃａｇｔｃａｃ ｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ ３６０
（配列番号２２）
ｇａｇｇｔｇａａａｃ ｔｇｃａｇｇａｇｔｃ ａｇｇａｃｃｔｇｇｃ ｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃ ｃｃｔｃａｃａｇａｇ ｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃ ６０
ａｃａｔｇｃａｃｔｇ ｔｃｔｃａｇｇｇｇｔ ｃｔｃａｔｔａｃｃｃ ｇａｃｔａｔｇｇｔｇ ｔａａｇｃｔｇｇａｔ ｔｃｇｃｃａｇｃｃｔ １２０
ｃｃａｃｇａａａｇｇ ｇｔｃｔｇｇａｇｔｇ ｇｃｔｇｇｇａｇｔａ ａｔａｔｇｇｇｇｔａ ｇｔｇａａａｃｃａｃ ａｔａｃｔａｔａａｔ １８０
ｔｃａｇｃｔｃｔｃａ ａａｔｃｃａｇａｃｔ ｇａｃｃａｔｃａｔｃ ａａｇｇａｃａａｃｔ ｃｃａａｇａｇｃｃａ ａｇｔｔｔｔｃｔｔａ ２４０
ａａａａｔｇａａｃａ ｇｔｃｔｇｃａａａｃ ｔｇａｔｇａｃａｃａ ｇｃｃａｔｔｔａｃｔ ａｃｔｇｔｇｃｃａａ ａｃａｔｔａｔｔａｃ ３００
ｔａｃｇｇｔｇｇｔａ ｇｃｔａｔｇｃｔａｔ ｇｇａｃｔａｃｔｇｇ ｇｇｃｃａａｇｇａａ ｃｃｔｃａｇｔｃａｃ ｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ ３６０
（配列番号２２）
【0140】
具体的には、本発明のＣＡＲにおける他のエレメントの配列は以下の通りである。
【0141】
リーダー配列は、ＣＤ８抗原のリーダー配列である。
【0142】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）
【0143】
単鎖可変領域の重鎖と軽鎖との間のリンカー配列（すなわち、可動性リンカーＩ）は以下の通りである。
【0144】
ＣＤ２０ ｓｃｆｖのＶＬとＶＨとの間のリンカーのアミノ酸配列：
ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号１９）
ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のリンカーのアミノ酸配列：
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２０）
ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号１９）
ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のリンカーのアミノ酸配列：
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２０）
【0145】
ヒンジ領域は、ＩｇＧ４ヒンジの短い形態の配列から選択される。
【0146】
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号：９）
【0147】
膜貫通領域は、ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）又はＣＤ２８（ＣＤ２８ＴＭ）抗原の膜貫通領域配列である。
【0148】
ＣＤ８ＴＭ：ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１０）
ＣＤ２８ＴＭ：ＭＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１１）
ＣＤ２８ＴＭ：ＭＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１１）
【0149】
共刺激因子シグナル領域は、４－１ＢＢ又はＣＤ２８細胞質シグナル伝達モチーフの配列に由来する。
【0150】
４－１ＢＢ：ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１２）
ＣＤ２８：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１３）
ＣＤ２８：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１３）
【0151】
ＣＤ３ζのシグナル伝達領域は、ＴＣＲ複合体中のＣＤ３ζの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）の配列に由来する。
【0152】
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１４）
【0153】
好ましい実施形態では、本発明で構築される２つのＣＡＲの完全な核酸配列及びアミノ酸配列は以下の通りである。
【0154】
ＴＮ－ＯＦ－１９の完全な核酸配列は以下の通りである。
【0155】
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＴＡＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＡＴＡＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧ（配列番号１８）
【0156】
ＴＮ－ＯＦ－１９の完全なアミノ酸配列は以下の通りである。
【0157】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＤＩＱＹＧＮＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＭＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１６）
【0158】
ＴＮ－ＬＥＵ－１９の完全な核酸配列は以下の通りである。
【0159】
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＡＡＴＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＧＴＡＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧ（配列番号１７）
【0160】
ＴＮ－ＬＥＵ－１９の完全アミノ酸配列は以下の通りである。
【0161】
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＮＹＭＤＷＹＱＫＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＤＹＹＣＡＲＳＮＹＹＧＳＳＹＷＦＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＭＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１５）
【0162】
本発明のＢＩＣＡＲの設計は、以下の利点を有する。
【0163】
第１に、ＣＤ１９及びＣＤ２０は、ほとんどの悪性Ｂ細胞腫瘍で発現される。第２に、一般に、Ｔ細胞認識能を高めるためにＣＡＲ構造を拡大する場合、有害な標的化の増加、細胞傷害性の増加、及び副作用の増加等の問題に遭遇することが多い。しかし、ＣＤ１９及びＣＤ２０の両方は同じ腫瘍毒性曲線を有するＢ細胞においてのみ発現されるため、これはＣＤ１９及びＣＤ２０には当てはまらない。最後に、Ｂ細胞におけるＣＤ１９及びＣＤ２０の発現は、Ｂ細胞の生存を促進することができる。また、治療中の両抗原の喪失は、非常に低い確率の事象である。したがって、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とすることにより、悪性Ｂ細胞の抗原エスケープの効果的な防止をもたらすことが期待される。
【0164】
ＣＤ１９又はＣＤ２０の単一ＣＡＲと比較して、ＢＩＣＡＲは以下の利点を有する。
【0165】
第１に、２つの独立したＣＡＲを発現させる場合と比較して、単一のＴ細胞においてＢＩＣＡＲを発現する場合、ＤＮＡフットプリントが有意に減少する（ＤＮＡ長が４０％減少する）。構造の大きさ及び長さは、ウイルスベクターのパッケージング及び形質導入効率に有意に影響を及ぼし得、したがって臨床的有効性に直接影響を及ぼす。第２に、２つの異なる単一ＣＡＲの混合物と比較して、ＢＩＣＡＲは、治療コストを有意に削減でき（ＢＩＣＡＲは、更なる負担を加えることなく、現在のＴ細胞製造プロセスと完全に適合する）、臨床的治癒率を増加させることができる。最後に、ＣＤ１９及びＣＤ２０は多数の臨床研究で検証されており、比較的安全である。
【0166】
本発明では、ＣＤ１９マウス由来モノクローナル抗体ＦＭＣ６３の配列、並びにＣＤ２０マウス由来モノクローナル抗体ｌｅｕ－１６及びオファツムマブの配列に基づいて、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とする２種類のキメラ抗原受容体構造（ＴＮ－ＬＥＵ－１９、ＴＨ－ＯＦ－１９）を構築した。我々は、初代Ｔ細胞におけるこれらの２つのキメラ抗原受容体の発現レベル、インビトロ活性化能、及び腫瘍細胞殺傷有効性の分析及び同定を完了した。最後に、ＴＮ－ＬＥＵ－１９又はＴＨ－ＯＦ－１９キメラ抗原受容体で改変されたＴ細胞は、ＣＤ１９及びＣＤ２０陽性抗原を保有する悪性腫瘍をインビトロで殺傷し、インビボで除去する強力な能力を有し、オファツムマブはｌｅｕ１６よりも良好であることが見出された。これは、ＣＤ１９及びＣＤ２０陽性白血病及びリンパ腫の治療におけるＣＡＲ－Ｔの臨床適用のための新しい有効な方法及び調製を提供する。
【0167】
本発明は、単一特異性及び二重特異性ＣＡＲを設計及び最適化した。これらのＣＡＲは、ＣＤ１９又はＣＤ２０を発現するＢ細胞悪性腫瘍に対して強力な殺傷能力を有する。ＢＩＣＡＲは、単一のＴ細胞生成物がＢ細胞白血病及びリンパ腫に関連する２つの臨床的に検証された抗原を標的とすることを可能にし、最終的に単一の抗原の喪失又はエスケープに起因する腫瘍再発のリスクを低下させる。本発明は、新しいＢＩＣＡＲの設計で更に使用することができ、したがって抗原の適用性を高め、癌に対するＴ細胞療法の有効性を高める。
【0168】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」、「ＣＡＲ－Ｔ」、「ＣＡＲＴ」、「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は全て、本発明の第４の態様のＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ構造は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達領域を順に含み、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、複数の反復構造を有するペプチド（Ｇ４Ｓ）と連結される。単一の抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔと比較して、２つの標的を同時に認識するＣＡＲ－Ｔ細胞はより致死的であり、治療の範囲がより広範囲である。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」、「ＣＡＲ－Ｔ」、「ＣＡＲＴ」、「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は全て、本発明の第４の態様のＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ構造は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達領域を順に含み、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、複数の反復構造を有するペプチド（Ｇ４Ｓ）と連結される。単一の抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔと比較して、２つの標的を同時に認識するＣＡＲ－Ｔ細胞はより致死的であり、治療の範囲がより広範囲である。
【0169】
ベクター
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で既知の組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすることによって、遺伝子含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、又は標準的な技術を使用して、遺伝子を含む細胞及び組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を合成的に作製することができる。
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で既知の組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすることによって、遺伝子含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、又は標準的な技術を使用して、遺伝子を含む細胞及び組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を合成的に作製することができる。
【0170】
また、本発明は、本発明の発現カセットが挿入されたベクターを提供する。レンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定した組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期の遺伝子移入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞等の非増殖性細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルス等のオンコ－レトロウイルスに由来するベクターを超える利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、免疫原性が低いという利点を有する。
【0171】
要約すると、本発明の発現カセット又は核酸配列は、典型的かつ作動可能的にプロモータに連結され、発現ベクターに組み込まれる。ベクターは、真核生物における複製及び組込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネータ、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモータを含む。
【0172】
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫及び遺伝子療法に使用され得る。遺伝子送達のための方法は当技術分野で公知である。例えば、明細書全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本発明は遺伝子療法ベクターを提供する。
【0173】
核酸は、多数の種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特定の目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターを含む。
【0174】
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモータ配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号、国際公開第０１／２９０５８号、及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【0175】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、多数のウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。当該分野で既知の技術を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルスシステムが当技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【0176】
更なるプロモータ要素、例えばエンハンサは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の１０ｂｐ上流の領域３０－１に位置するが、多くのプロモータは、開始部位の下流にも機能的要素を含有することが最近示されている。プロモータエレメント間の間隔は柔軟であることが多く、その結果、エレメントが他方に対して反転又は移動する場合、プロモータ機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータでは、活性が低下し始める前に、プロモータエレメント間の間隔が５０ｂｐまで増加され得る。プロモータに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協調的又は独立して機能することができるとみられる。
【0177】
適切なプロモータの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモータ配列である。適切なプロモータの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかし、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、並びにアクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータ等であるがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモータを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモータ配列も使用され得る。更に、本発明は構成的プロモータの使用に限定されるべきではなく、誘導性プロモータも本発明の一部として企図される。誘導性プロモータの使用は、そのような発現が望まれる場合に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例としては、メタロチオネインプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【0178】
ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカ遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有して、ウイルスベクターを介して遺伝子導入されること、又は感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカは、別個のＤＮＡ片に担持され得、同時遺伝子導入手順で使用され得る。選択マーカ及びレポーター遺伝子の両方を、適切な制御配列に隣接させて、宿主細胞における発現を可能にすることができる。有用な選択マーカとしては、例えば、ｎｅｏ等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【0179】
レポーター遺伝子は、潜在的に遺伝子導入された細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織に存在しないか、又は発現されない遺伝子であり、ポリペプチドをコードし、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされる遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現システムは周知であり、既知の技術を使用して調製され得るか、又は商業的に入手され得る。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物がプロモータとして同定される。そのようなプロモータ領域は、レポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモータ駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
【0180】
遺伝子を細胞に導入及び発現させる方法は、当技術分野で既知である。発現ベクターに関連して、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入され得る。
【0181】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を含む。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウム法である。
【0182】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス等に由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【0183】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースのシステム、例えば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【0184】
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）のために、脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されていてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在していてもよく、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに付着していてもよく、リポソームに封入されていてもよく、リポソームと複合体を形成していてもよく、脂質を含有する溶液中に分散されていてもよく、脂質と混合されていてもよく、脂質と組み合わされていてもよく、脂質中に懸濁液として含まれていてもよく、ミセルを含有若しくはミセルと複合体を形成していてもよく、又は他の方法で脂質と会合していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中のいずれかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、溶液中に単に散在してもよく、場合によっては大きさ又は形状が均一でない凝集体を形成する。脂質は、天然に存在するか、又は合成脂質でもよい脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴、並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒド等の長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
【0185】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【0186】
調製
本発明は、本発明の第４の態様のＣＡＲ－Ｔ細胞、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む製剤を提供する。一実施形態では、製剤は液体製剤である。好ましくは、製剤は注射剤である。好ましくは、製剤中のＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度は１×１０３～１×１０８細胞／ｍｌであり、より好ましくは１×１０４～１×１０７細胞／ｍｌである。
本発明は、本発明の第４の態様のＣＡＲ－Ｔ細胞、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む製剤を提供する。一実施形態では、製剤は液体製剤である。好ましくは、製剤は注射剤である。好ましくは、製剤中のＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度は１×１０３～１×１０８細胞／ｍｌであり、より好ましくは１×１０４～１×１０７細胞／ｍｌである。
【0187】
一実施形態では、製剤は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；グリシン等のポリペプチド又はアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の製剤は、好ましくは静脈内投与用に製剤化される。
【0188】
治療用途
本発明は、本発明の発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入された細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用する治療用途を含む。形質導入されたＴ細胞は、腫瘍細胞マーカＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とし、Ｔ細胞を相乗的に活性化し、Ｔ細胞免疫応答を引き起こし、それによって腫瘍細胞に対する殺傷有効性を有意に高めることができる。
本発明は、本発明の発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入された細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用する治療用途を含む。形質導入されたＴ細胞は、腫瘍細胞マーカＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とし、Ｔ細胞を相乗的に活性化し、Ｔ細胞免疫応答を引き起こし、それによって腫瘍細胞に対する殺傷有効性を有意に高めることができる。
【0189】
したがって、本発明はまた、哺乳動物における標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【0190】
一実施形態では、本発明は、自己由来の患者（又は異種ドナー）からのＴ細胞を単離し、活性化し、遺伝子改変して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、次いで同じ患者に注射する、細胞療法のクラスを含む。この方法では、移植片対宿主病の確率は極めて低く、抗原は非ＭＨＣ拘束的にＴ細胞によって認識される。更に、１つのＣＡＲ－Ｔは、抗原を発現する全ての癌を治療することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞はインビボで複製することができ、長期持続性がもたらされて、持続的な腫瘍制御を導くことができる。
【0191】
一実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、強いインビボＴ細胞増殖を経ることができ、長期間持続することができる。更に、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がＣＡＲ中の抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法手法の一部であり得る。例えば、抗ＣＤ１９ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９及びＣＤ２０を発現する細胞に対して特異的に免疫応答を誘発する。
【0192】
本明細書に開示されるデータは、ＣＤ１９ＣＤ２０ ｓｃＦｖ、ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びに４－１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを具体的に開示しているが、本発明は、本明細書の他の箇所に記載されるように、構築物の各成分について任意の数の変異を含むと解釈されるべきである。
【0193】
治療され得る癌は、血管新生されない又は大部分が血管新生されない腫瘍、及び血管新生される腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（例えば白血病及びリンパ腫である血液腫瘍等）又は固形腫瘍を含み得る。本発明のＣＡＲで治療される癌の種類には、癌腫、芽細胞腫及び肉腫、並びに特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、並びに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫及び黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌も含まれる。
【0194】
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液（又は血行性）の癌の例には、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽球、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行型及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び骨髄形成異常症が含まれる。
【0195】
固形腫瘍は、通常嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。様々な種類の固形腫瘍が、それらを形成する細胞の種類に対して命名される（肉腫、癌腫、及びリンパ腫等）。肉腫及び癌腫等の固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、悪性リンパ腫、膵臓癌及び卵巣癌が挙げられる。
【0196】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化及び／又はインビボ療法のためのワクチンの一種として役立ち得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【0197】
エクスビボ免疫化に関して、以下の少なくとも１つが、哺乳動物に細胞を投与する前にインビトロで行われる。ｉ）細胞を増殖させること、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること、及び／又はｉｉｉ）細胞の凍結保存。
【0198】
エクスビボ手順は当技術分野で周知であり、以下でより完全に考察される。簡潔には、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離し、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変する（すなわち、インビトロで形質導入又は遺伝子導入する）。ＣＡＲ改変細胞は、治療上の利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与され得る。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、ＣＡＲ改変細胞はレシピエントに対して自己由来であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種、同系又は異種であり得る。
【0199】
エクスビボ免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するためのインビボ免疫化のための組成物及び方法を提供する。
【0200】
本発明は、腫瘍を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。
【0201】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは希釈剤及び／又はＩＬ－２、ＩＬ－１７若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団等の他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与され得る。簡潔には、本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的又は生理学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載の標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；グリシン等のポリペプチド又はアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは静脈内投与用に製剤化される。
【0202】
本発明の医薬組成物は、治療（又は予防）される疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患の種類及び重症度等の要因によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定され得る。
【0203】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与され得、それらの範囲内の全ての整数値を含むことが一般に示され得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの用量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に対する最適な用量及び治療レジメンは、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【0204】
主題組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、埋込又は移植を含む任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、又は腹腔内で患者に投与され得る。一実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくはｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射され得る。
【0205】
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法、又はＴ細胞が治療レベルまで増殖される当技術分野で既知の他の方法を使用して、活性化及び増殖された細胞が、（例えば、前に、同時に、又は後に）抗ウイルス療法、シドホビル及びインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）又はＭＳ患者のためのナタリズマブ治療又は乾癬患者のためのエファリズマブ治療又はＰＭＬ患者のための他の治療等の薬剤による治療を含むが、これらに限定されない任意の数の関連する治療様式と併せて患者に投与される。更なる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線照射、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６等の免疫抑制剤、抗体、又は他の免疫療法剤と組み合わせて使用され得る。更なる実施形態では、本発明の細胞組成物は、（例えば、前に、同時に、又は後に）骨髄移植、又はフルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド等の化学療法剤の使用と併せて患者に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法による標準的な治療を受け、その後、末梢血幹細胞移植を受ける場合がある。特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖免疫細胞の注入を受ける。更なる実施形態では、増殖細胞は、手術の前又は後に投与される。
【0206】
患者に投与される上記治療の用量は、治療されている状態及び治療のレシピエントの正確な性質によって変化するであろう。患者投与のための用量のスケーリングは、当技術分野で認められている慣例に従って行うことができる。一般に、１×１０６～１×１０１０の本発明の改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ－１９／２０細胞）を、例えば、静脈内注入による各治療又は各治療過程の手段によって患者に適用することができる。
【0207】
本発明の利点は以下の通りである。
【0208】
（１）本発明のキメラ抗原受容体に関して、細胞外抗原結合ドメインは、特異性抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖであり、特定の抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを特定のヒンジ領域及び細胞内ドメインに組み合わせることによって形成されたＣＡＲは、低い細胞傷害性及び低い副作用で腫瘍細胞を殺傷する大きな能力を示す。
【0209】
（２）本発明によって提供されるキメラ抗原受容体は、Ｔ細胞がＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスに感染した後、ＣＡＲタンパク質の安定な発現及び膜局在化を達成することができる。
【0210】
（３）本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、インビボでのより長い生存時間及び強力な抗腫瘍有効性を有し、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３リンカー領域を有する最適化されたＣＡＲは、Ｆｃ受容体の結合及びその後のＡＤＣＣ作用（抗体依存性細胞障害）を回避することができる。
【0211】
（４）２つの独立したＣＡＲと比較して、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体は、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの両方を含み、ＤＮＡフットプリントが有意に減少し（ＤＮＡ長が４０％減少する）、構造の大きさが小さく、ウイルスベクターのパッケージング及び形質導入有効性に有益であり、したがって臨床的有効性が直接改善する。更に、本発明の二重特異性ＣＡＲは、コストがより低く、治癒率がより高く、より安全である。
【0212】
（５）本発明のＴＮ－ＬＥＵ－１９又はＴＨ－ＯＦ－１９キメラ抗原受容体で改変されたＴ細胞は、ＣＤ１９及びＣＤ２０陽性抗原を保有する悪性腫瘍をインビトロで殺傷し、インビボで除去する非常に強力な能力を有し、オファツムマブがより強力である。これは、ＣＤ１９及びＣＤ２０陽性白血病及びリンパ腫の治療におけるＣＡＲ－Ｔの臨床適用のための新しい有効な方法及び調製を提供する。
【0213】
（６）本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、大部分の悪性Ｂ細胞腫瘍に対して殺傷効果を有し、より広い治療範囲及びより大きな適用率を有し、腫瘍細胞のエスケープをより効果的に防止することができる。
【0214】
本発明を、具体例を参照して以下に更に説明する。これらの実施例は例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。以下の実施例に記載される特定の条件のない実験方法は、一般に、従来の条件下で、又は製造業者の指示に従って行われる。百分率及び部分は、特に明記しない限り重量によるものである。
【0215】
［実施例１］
レンチウイルス発現ベクターの構築
全長ＤＮＡを合成し、クローニングして、プラスミドコードを構築した。ｐＷＰＴレンチウイルスベクターをクローニングベクターとして選択し、クローニング部位はＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉ部位であった。ここで、本発明で設計された２つのＣＡＲの構造を図１に示す。ＴＮ－ＬＥＵ－１９のアミノ酸配列を配列番号１５に示し、ＴＮ－ＯＦ－１９のアミノ酸配列を配列番号１６に示す（Ｌ－（ＯＦ）ＶＬ－（ＯＦ）ＶＨ－Ｉ－（ＦＭＣ６３）ＶＨ－（ＦＭＣ６３）ＶＬ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζの構造を有する）。
レンチウイルス発現ベクターの構築
全長ＤＮＡを合成し、クローニングして、プラスミドコードを構築した。ｐＷＰＴレンチウイルスベクターをクローニングベクターとして選択し、クローニング部位はＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉ部位であった。ここで、本発明で設計された２つのＣＡＲの構造を図１に示す。ＴＮ－ＬＥＵ－１９のアミノ酸配列を配列番号１５に示し、ＴＮ－ＯＦ－１９のアミノ酸配列を配列番号１６に示す（Ｌ－（ＯＦ）ＶＬ－（ＯＦ）ＶＨ－Ｉ－（ＦＭＣ６３）ＶＨ－（ＦＭＣ６３）ＶＬ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζの構造を有する）。
【0216】
［実施例２］
二重特異性ＣＡＲのインビトロ活性化能の検出
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によって健康なドナーの静脈血から単離した。０日目に、ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）及びレトロネクチン（ＴＡＫＡＲＡ）で予めコーティングした細胞培養フラスコ中でＰＢＭＣを活性化した。培地は、１％ヒトアルブミン及び３００Ｕ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）を含有するＧＴ－５５１細胞培養培地であった。３日目に、活性化ＰＢＭＣに精製ＴＮ－ＬＥＵ－１９又はＴＮ－ＯＦ－１９レンチウイルス溶液を形質導入した。６日目から、ＴＮ－ＯＦ－１９及びＴＮ－ＬＥＵ－１９のＣＡＲ－Ｔ細胞を対応する活性アッセイのために採取することができる。プロテインＬ法を使用して、７日間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞膜の表面上のＣＡＲ遺伝子コードタンパク質の発現レベルを決定した。
二重特異性ＣＡＲのインビトロ活性化能の検出
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によって健康なドナーの静脈血から単離した。０日目に、ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）及びレトロネクチン（ＴＡＫＡＲＡ）で予めコーティングした細胞培養フラスコ中でＰＢＭＣを活性化した。培地は、１％ヒトアルブミン及び３００Ｕ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）を含有するＧＴ－５５１細胞培養培地であった。３日目に、活性化ＰＢＭＣに精製ＴＮ－ＬＥＵ－１９又はＴＮ－ＯＦ－１９レンチウイルス溶液を形質導入した。６日目から、ＴＮ－ＯＦ－１９及びＴＮ－ＬＥＵ－１９のＣＡＲ－Ｔ細胞を対応する活性アッセイのために採取することができる。プロテインＬ法を使用して、７日間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞膜の表面上のＣＡＲ遺伝子コードタンパク質の発現レベルを決定した。
【0217】
Ｔ細胞活性化マーカＣＤ１３７及びＩＦＮγ放出を、７日間培養したＣＤ１９／２０二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して検出した。１×１０５のＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ２０陽性Ｋ５６２－ＣＤ１９＋、Ｋ５６２－ＣＤ２０＋、Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋及びＲａｊｉ（天然にＣＤ１９及びＣＤ２０を発現する）腫瘍細胞株、並びにＣＤ１９ＣＤ２０陰性Ｋ５６２腫瘍細胞株、又は腫瘍細胞なしで、２００μｌのＧＴ－５５１培地中で、１：１の比で１８時間、それぞれ共培養した。次いで、Ｔ細胞の表面上のＣＤ１３７の発現レベル及び培養上清中のＩＦＮγの分泌レベルをそれぞれ検出した。
【0218】
結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。２つのＣＡＲＴ細胞の表面上のＣＤ１３７の発現を検出し、培養上清中のＩＦＮγの発現を検出した。ここで、ＴＮ－ＯＦ－１９細胞は、ＴＮ－ＬＥＵ－１９よりも高いＣＤ１３７活性化レベル及びＩＦＮγ放出レベルを有する。
【0219】
［実施例３］
インビトロでのＣＤ１９／２０二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性の検出
実施例２で調製したＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＬＤＨ放出アッセイによって細胞傷害性について試験した。標的細胞は、Ｋ５６２、Ｋ５６２－ＣＤ１９＋、Ｋ５６２－ＣＤ２０＋、Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋、及びＲａｊｉ細胞であり、エフェクター細胞はＮＴ、ＴＮ－ＬＥＵ－１９、及びＴＮ－ＯＦ－１９細胞である。エフェクター細胞数：標的細胞数＝５：１、１０：１、２０：１、４０：１とするエフェクター－標的比を設定した。結果を図３Ａに示す。ＴＮ－ＬＥＵ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方は、ＣＤ１９／２０陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを良好に誘導し、ＬＤＨを放出することができる。
インビトロでのＣＤ１９／２０二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性の検出
実施例２で調製したＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＬＤＨ放出アッセイによって細胞傷害性について試験した。標的細胞は、Ｋ５６２、Ｋ５６２－ＣＤ１９＋、Ｋ５６２－ＣＤ２０＋、Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋、及びＲａｊｉ細胞であり、エフェクター細胞はＮＴ、ＴＮ－ＬＥＵ－１９、及びＴＮ－ＯＦ－１９細胞である。エフェクター細胞数：標的細胞数＝５：１、１０：１、２０：１、４０：１とするエフェクター－標的比を設定した。結果を図３Ａに示す。ＴＮ－ＬＥＵ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方は、ＣＤ１９／２０陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを良好に誘導し、ＬＤＨを放出することができる。
【0220】
ＣＡＲ－Ｔ１９／２０細胞によって誘導される腫瘍細胞殺傷中のＣＤ１０７ａ（Ｔ細胞脱顆粒のマーカ）放出レベルをフローサイトメトリによって分析した。１×１０５細胞の有効細胞ＣＡＲ－Ｔ１９／２０（ＴＮ－ＯＦ－１９及びＴＮ－ＬＥＵ－１９）を、２×１０５の標的腫瘍細胞とそれぞれ共培養した。標的細胞は、それぞれＫ５６２－ＣＤ１９＋、Ｋ５６２－ＣＤ２０＋、Ｋ５６２－ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋、及びＫ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｒｏｍａｓ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋）である。結果を図３Ｂに示す。両方のＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞殺傷中にＣＤ１０７ａの放出を良好に誘導することができる。ここで、ＴＮ－ＯＦ－１９細胞は、ＴＮ－ＬＥＵ－１９細胞よりも細胞傷害性のマーカとしてのＣＤ１０７ａの放出がわずかに高い。
【0221】
［実施例４］
マウスにおける移植腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ１９／２０の阻害効果
動物に注射した腫瘍細胞は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＲａｊｉ細胞（ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ）であった。この実験では、腫瘍細胞Ｒａｊｉを注射し、マウスにおいて１週間成長させ、次いでエフェクターＴ細胞を注射した。エフェクターＴ細胞を３つの群：ＮＴ、ＴＮ－ＬＥＵ－１９、及びＴＮ－ＯＦ－１９に分けた。増殖したエフェクターＴ細胞を尾静脈を通してＮＳＧマウスに注射し、次いでマウスの蛍光強度（ＩＶＩＳ蛍光イメージングによる）及びマウスの体重を７日ごとに記録した。実験を２１日目に中止し、統計結果を分析した。
マウスにおける移植腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ１９／２０の阻害効果
動物に注射した腫瘍細胞は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＲａｊｉ細胞（ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ）であった。この実験では、腫瘍細胞Ｒａｊｉを注射し、マウスにおいて１週間成長させ、次いでエフェクターＴ細胞を注射した。エフェクターＴ細胞を３つの群：ＮＴ、ＴＮ－ＬＥＵ－１９、及びＴＮ－ＯＦ－１９に分けた。増殖したエフェクターＴ細胞を尾静脈を通してＮＳＧマウスに注射し、次いでマウスの蛍光強度（ＩＶＩＳ蛍光イメージングによる）及びマウスの体重を７日ごとに記録した。実験を２１日目に中止し、統計結果を分析した。
【0222】
結果を図４に示す。図４Ａは、３群のマウスへのエフェクターＴ細胞の注射後のマウスの体重変化を示す。ＣＡＲＴ－ＴＮ－ＯＦ－１９及びＣＡＲＴ－ＴＮ－ＬＥＵ－１９の２種類のＣＡＲＴ細胞と比較して、ＮＴのマウスは体重の有意な減少を示し、両方のＣＡＲＴ細胞群のマウスは体重がわずかに増加した。図４Ｂは、３群のマウスの平均蛍光強度を示す。結果は、ＮＴ群のマウスの平均蛍光強度が有意に増加したが、２つのＣＡＲＴ細胞群のマウスの蛍光強度の平均は減少したことを示し、ＴＮ－ＯＦ－１９及びＴＮ－ＬＥＵ－１９ＣＡＲＴ細胞の両方が、ＮＴと比較して腫瘍の成長を阻害することができることを示している。ここで、ＴＮ－ＯＦ－１９細胞は、１４日後にＴＮ－ＬＥＵ－１９細胞よりも腫瘍成長に対するより良好な阻害を有し、ＴＮ－ＬＥＵ－１９群の腫瘍成長曲線は有意に再発した。図４Ｃは、２つのＣＡＲＴ細胞群及びＮＴ群における蛍光強度のＩＶＩＳイメージングを示す。ＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビボでＴＮ－ＬＥＵ－１９細胞よりも良好に腫瘍細胞を阻害又は殺傷することができる。
【0223】
［実施例５］
インビボでのＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の阻害効果の比較
１×１０６のホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞を、尾静脈注射によって６～８週齢のＮＰＧマウス（ＮＯＤ－Ｃｇ．ＰｒｋｄｃＳＣＩＤ ＩＬ－２Ｒｇｃｎｕｌｌ／ｖｓｔ）に投与した。７日後、腫瘍生着を、Ｄ－ルシフェリンのｉ．ｐ．注射及び１８０秒間のＢｒｕｋｅｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｘｔｒｅｍｅイメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｘｔｒｅｍｅ ＢＩ）での１０～１５分後のイメージングによって測定した。マウスを、腫瘍負荷に基づいて試験群（ｎ＝６／群）に等しく分配した。ＴＮ－ＯＦ－１９（Ｌ）、ＴＮ－ＯＦ－１９（Ｍ）、ＴＮ－ＯＦ－１９（Ｈ）群を、尾静脈注射によって、１×１０６、２．５×１０６、及び５×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞で別々に処置した。１×１０６の形質導入されていないＴ細胞（Ｎ．Ｔ．）及び同じドナー由来の単一標的ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として用いた。腫瘍成長を、注射後７、１０、２１日目のマウス全身平均放射輝度に基づいて評価した。図５Ａは、二重特異性ＴＮ－ＯＦ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、インビボでＣＤ１９特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好に腫瘍細胞を阻害又は死滅させることができることを示す。特に処置の初期段階において、二重特異性ＴＮ－ＯＦ－１９ ＣＡＲ－Ｔは、有意により速い阻害効果を示す。図５Ｂは、４つのＣＡＲ－Ｔ細胞群及びＮＴ群における蛍光強度のＩＶＩＳイメージングを示す。
インビボでのＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の阻害効果の比較
１×１０６のホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞を、尾静脈注射によって６～８週齢のＮＰＧマウス（ＮＯＤ－Ｃｇ．ＰｒｋｄｃＳＣＩＤ ＩＬ－２Ｒｇｃｎｕｌｌ／ｖｓｔ）に投与した。７日後、腫瘍生着を、Ｄ－ルシフェリンのｉ．ｐ．注射及び１８０秒間のＢｒｕｋｅｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｘｔｒｅｍｅイメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｘｔｒｅｍｅ ＢＩ）での１０～１５分後のイメージングによって測定した。マウスを、腫瘍負荷に基づいて試験群（ｎ＝６／群）に等しく分配した。ＴＮ－ＯＦ－１９（Ｌ）、ＴＮ－ＯＦ－１９（Ｍ）、ＴＮ－ＯＦ－１９（Ｈ）群を、尾静脈注射によって、１×１０６、２．５×１０６、及び５×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞で別々に処置した。１×１０６の形質導入されていないＴ細胞（Ｎ．Ｔ．）及び同じドナー由来の単一標的ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として用いた。腫瘍成長を、注射後７、１０、２１日目のマウス全身平均放射輝度に基づいて評価した。図５Ａは、二重特異性ＴＮ－ＯＦ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、インビボでＣＤ１９特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好に腫瘍細胞を阻害又は死滅させることができることを示す。特に処置の初期段階において、二重特異性ＴＮ－ＯＦ－１９ ＣＡＲ－Ｔは、有意により速い阻害効果を示す。図５Ｂは、４つのＣＡＲ－Ｔ細胞群及びＮＴ群における蛍光強度のＩＶＩＳイメージングを示す。
【0224】
［実施例６］
ＴＮ－ＯＦ １９ＣＡＲにおけるＣＤ２０／ＣＤ１９二重特異性ｓｃＦＶの抗原特異性
ＴＮ－ＯＦ １９ＣＡＲにおける二重特異性ｓｃＦｖの親和性及び特異性を調べるために、インフレームでＣＤ２０ ｓｃＦｖ（オファツムマブｍＡｂに由来する）及びＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３ｍＡｂに由来する）を、ウサギＩｇＧ１のＦｃ領域と連結させることによって、キメラウサギモノクローナル抗体を作製した。ＣＤ１９及びＣＤ２０ ｓｃＦｖを、Ｇ４Ｓリンカーによって交互に連結した。分子の順序はＯＦ ＶＬ－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－ＦＭＣ６３ ＶＨ－ＶＬであり、これはＴＮ－ＯＦ－１９のｓｃＦｖと同じである。一過性遺伝子導入後に２９３Ｔ細胞でキメラ抗体を発現させた。染色の特異性に対するこのキメラ抗体の検証をフローサイトメトリによって行った。簡潔には、３つの安定細胞株（Ａ５４９－ＣＤ１９、Ａ５４９－ＣＤ２０、Ａ５４９－ＣＤ１９－ＣＤ２０）を標的として使用し、ＣＤ１９－ＣＤ２０－Ａ５４９細胞及びＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞を対照として使用した。全ての細胞を洗浄し、再懸濁し、２％血清で３０分間ブロッキングした。５×１０５の細胞をＦＡＣＳバイアルに移し、洗浄し、組換え抗体（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）で４℃で１時間染色した。洗浄後、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を４℃、暗所で３０分間添加した。最後に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。図６は、ＣＤ１９若しくはＣＤ２０又は両方を有する細胞に結合するが、両方の抗原を欠く細胞には結合されないキメラ抗体を示し、二重特異性結合ドメインが結合のために１つのみの同族抗原を必要とし、新しい特異性認識部位は形成されなかったことを示している。
ＴＮ－ＯＦ １９ＣＡＲにおけるＣＤ２０／ＣＤ１９二重特異性ｓｃＦＶの抗原特異性
ＴＮ－ＯＦ １９ＣＡＲにおける二重特異性ｓｃＦｖの親和性及び特異性を調べるために、インフレームでＣＤ２０ ｓｃＦｖ（オファツムマブｍＡｂに由来する）及びＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３ｍＡｂに由来する）を、ウサギＩｇＧ１のＦｃ領域と連結させることによって、キメラウサギモノクローナル抗体を作製した。ＣＤ１９及びＣＤ２０ ｓｃＦｖを、Ｇ４Ｓリンカーによって交互に連結した。分子の順序はＯＦ ＶＬ－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－ＦＭＣ６３ ＶＨ－ＶＬであり、これはＴＮ－ＯＦ－１９のｓｃＦｖと同じである。一過性遺伝子導入後に２９３Ｔ細胞でキメラ抗体を発現させた。染色の特異性に対するこのキメラ抗体の検証をフローサイトメトリによって行った。簡潔には、３つの安定細胞株（Ａ５４９－ＣＤ１９、Ａ５４９－ＣＤ２０、Ａ５４９－ＣＤ１９－ＣＤ２０）を標的として使用し、ＣＤ１９－ＣＤ２０－Ａ５４９細胞及びＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞を対照として使用した。全ての細胞を洗浄し、再懸濁し、２％血清で３０分間ブロッキングした。５×１０５の細胞をＦＡＣＳバイアルに移し、洗浄し、組換え抗体（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）で４℃で１時間染色した。洗浄後、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を４℃、暗所で３０分間添加した。最後に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。図６は、ＣＤ１９若しくはＣＤ２０又は両方を有する細胞に結合するが、両方の抗原を欠く細胞には結合されないキメラ抗体を示し、二重特異性結合ドメインが結合のために１つのみの同族抗原を必要とし、新しい特異性認識部位は形成されなかったことを示している。
【0225】
［実施例７］
ＣＤ２０特異性ＣＡＲの（ＣＤ２０／１９二重特異性ＣＡＲを作製するための）スクリーニング及び機能の検証
ＣＤ２０／ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲの構築前に、我々は、ＣＤ２０特異性ｓｃＦＶ候補をスクリーニングし、絞り込むための広範な研究を行った。図７は、６つの異なるｓｃＦｖ及び異なるヒンジ／ＴＭ／シグナル伝達ドメインを有する１６のＣＤ２０特異性ＣＡＲの構造を示す。全長ＤＮＡを合成し、クローニングして、プラスミドコードの構築を達成し、我々は、これらのＣＡＲの抗腫瘍活性を様々なＣＤ２０発現標的細胞で試験した。
ＣＤ２０特異性ＣＡＲの（ＣＤ２０／１９二重特異性ＣＡＲを作製するための）スクリーニング及び機能の検証
ＣＤ２０／ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲの構築前に、我々は、ＣＤ２０特異性ｓｃＦＶ候補をスクリーニングし、絞り込むための広範な研究を行った。図７は、６つの異なるｓｃＦｖ及び異なるヒンジ／ＴＭ／シグナル伝達ドメインを有する１６のＣＤ２０特異性ＣＡＲの構造を示す。全長ＤＮＡを合成し、クローニングして、プラスミドコードの構築を達成し、我々は、これらのＣＡＲの抗腫瘍活性を様々なＣＤ２０発現標的細胞で試験した。
【0226】
図８Ａは、ＣＡＲ－Ｔ２０．１、ＣＡＲ－Ｔ２０．５、ＣＡＲ－Ｔ２０．６、ＣＡＲ－Ｔ２０．７、ＣＡＲ－Ｔ２０．８、ＣＡＲ－Ｔ２０．９及びＣＡＲ－Ｔ２０．１０をスクリーニングするためのＩＦＮγ放出アッセイの結果を示し、これらのＣＡＲ－Ｔの中で、ＣＡＲ－Ｔ２０．９（Ｌｅｕ１６）及びＣＡＲ－Ｔ２０．１０（Ｌｅｕ１６）のみが、より高い陽性ＩＦＮγ放出を示した。
【0227】
図８Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ２０．１、ＣＡＲ－Ｔ２０．９、ＣＡＲ－Ｔ２０．１０、ＣＡＲ－Ｔ２０．１１、ＣＡＲ－Ｔ２０．１２、ＣＡＲ－Ｔ２０．１３、ＣＡＲ－Ｔ２０．１４、ＣＡＲ－Ｔ２０．１５及びＣＡＲ－Ｔ２０．１６をスクリーニングするためのＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。これらのＣＡＲ－Ｔの中で、ＣＡＲ－Ｔ２０．１０（Ｌｅｕ１６）及びＣＡＲ－Ｔ２０．１４（ＯＦ）が、より高い陽性ＩＦＮγ放出を示した。
【0228】
図８Ｃは、ＣＡＲ－Ｔ２０．９、ＣＡＲ－Ｔ２０．１２、ＣＡＲ－Ｔ２０．１４、ＣＡＲ－Ｔ２０．１７、ＣＡＲ－Ｔ２０．１８、及びＣＡＲ－Ｔ２０．１９をスクリーニングするためのＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。これらのＣＡＲ－Ｔの中で、ＣＡＲ－Ｔ２０．１４（ＯＦ）及びＣＡＲ－Ｔ２０．１９（ＯＦ）は、より高い陽性ＩＦＮγ放出を示した。
【0229】
図９Ａは、ＬＤＨ放出アッセイによって細胞傷害性について試験した、ＣＡＲ－Ｔ２０．１７（Ｌｅｕ１６の第３世代）、ＣＡＲ－Ｔ２０．１８（Ｌｅｕ１６の第２世代）、ＣＡＲ－Ｔ２０．１９（ＯＦの第２世代）細胞の結果を示す。標的細胞は、ＣＤ２０陽性細胞株Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ、並びにＣＤ２０陰性Ｍｏｌｔ４である。３つ全てのＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２０陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し、ＬＤＨを放出することができ、ＣＡＲ－Ｔ２０．１７、ＣＡＲ－Ｔ２０．１８、及びＣＡＲ－Ｔ２０．１９が、標的細胞ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ及びＲｏｍａｓ細胞に対して強力な殺傷効果を有したことを示している。
【0230】
図９Ｂは、ＮＳＧマウス研究における腫瘍成長のインビボ阻害を示す。動物に注射した腫瘍細胞は、ルシフェラーゼを発現するＲａｊｉである。この実験では、腫瘍細胞Ｒａｊｉを注射し、マウスにおいて１週間成長させ、次いで、エフェクターＴ細胞を尾静脈を通して注射し、次いで、マウスの蛍光強度（ＩＶＩＳ蛍光イメージングによる）及びマウスの体重を７日ごとに記録した。実験を２１日目に中止し、統計結果を分析した。結果は、ＣＡＲ－Ｔ２０．１９（ＯＦ）細胞が、１４日後に、ＣＡＲ－Ｔ２０．１７（Ｌｅｕ１６）及びＣＡＲ－Ｔ２０１．８（Ｌｅｕ１６）細胞よりも腫瘍成長に対する良好な阻害を有することを示す。
【0231】
実施例７（図７～９）の要約では、多数の実験及び比較を通して、２０．１、２０．２、２０．４、２０．５、２０．６、２０．７、２０．８及び２０．１５は基本的に無効であり、２０．１１、２０．１２及び２０．１３は特定の効果を有するが、それらの効果は２０．９、２０．１０、２０．１４、２０．１６、２０．１７、２０．１８及び２０．１９の効果よりも小さく、２０．１９（ＯＦ）の効果が最良であることが見出された。上記の構造に基づいて、ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（ＯＦ）及びＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３）を、新しい二重特異性キメラ抗原受容体ＴＮ－ＯＦ－１９においてタンデムに使用し、更なる分析のための最良の候補と見なした。
【0232】
実施例７に関与するＣＤ２０特異性ＣＡＲのアミノ酸配列を表１に示す。
【表3】
【0233】
［実施例８］
ＴＮ－ＯＦ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の第Ｉ相臨床試験
第Ｉ相試験を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｏｎｇｊｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、ｒ／ｒ ＮＨＬ患者で実施して、Ｃ－ＣＡＲ０３９（すなわち、ＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＮＣＴ０４３１７８８５）の安全性及び有効性を評価した。Ｔ細胞を採取するためのアフェレーシスの後、Ｃ－ＣＡＲ０３９を製造し、標準的な３日間のシクロホスファミド／フルダラビン移植前処置後に単回静脈内投与として注入した。Ｃ－ＣＡＲ０３９を、１８日間の静脈間（ｖｅｉｎ ｔｏ ｖｅｉｎ）時間中央値を有する、無血清、半自動化デジタル閉鎖システムで製造した。製造成功率は１００％であった。２０２０年８月３日現在、１６名の患者に、１．０×１０６～５．０×１０６のＣＡＲ－Ｔ細胞／ｋｇの用量範囲でＣ－ＣＡＲ０３９を注入した。１４名の患者は、少なくとも１ヶ月の評価可能な安全性データを有し、１３名の患者（ＤＬＢＣＬ患者１１名、ＦＬ患者２名）は、１ヶ月以上の有効性データを有していた。図１０は、ＣＡＲ０３９ｒ／ｒ ＮＨＬ研究設計及びフローチャートを示す。
ＴＮ－ＯＦ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の第Ｉ相臨床試験
第Ｉ相試験を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｏｎｇｊｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、ｒ／ｒ ＮＨＬ患者で実施して、Ｃ－ＣＡＲ０３９（すなわち、ＴＮ－ＯＦ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＮＣＴ０４３１７８８５）の安全性及び有効性を評価した。Ｔ細胞を採取するためのアフェレーシスの後、Ｃ－ＣＡＲ０３９を製造し、標準的な３日間のシクロホスファミド／フルダラビン移植前処置後に単回静脈内投与として注入した。Ｃ－ＣＡＲ０３９を、１８日間の静脈間（ｖｅｉｎ ｔｏ ｖｅｉｎ）時間中央値を有する、無血清、半自動化デジタル閉鎖システムで製造した。製造成功率は１００％であった。２０２０年８月３日現在、１６名の患者に、１．０×１０６～５．０×１０６のＣＡＲ－Ｔ細胞／ｋｇの用量範囲でＣ－ＣＡＲ０３９を注入した。１４名の患者は、少なくとも１ヶ月の評価可能な安全性データを有し、１３名の患者（ＤＬＢＣＬ患者１１名、ＦＬ患者２名）は、１ヶ月以上の有効性データを有していた。図１０は、ＣＡＲ０３９ｒ／ｒ ＮＨＬ研究設計及びフローチャートを示す。
【0234】
投与された患者の年齢の中央値は５８．５歳（範囲：２８～７１歳）であった。前治療のライン数中央値は２であった（範囲：２～５回の前治療）。３名（２１％）の患者が以前に自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を受けていた。
【表4】
【表5】
【0235】
Ｃ－ＣＡＲ０３９治療は、グレード３以上のＣＲＳがなく、神経細胞毒性事象もなく、良好に許容された。可逆的グレード１～２のＣＲＳが患者のうち９名（８２％）で観察された。移植前処置による血球減少症は一般的であり、可逆的であった。
【0236】
１ヶ月の評価では、１２／１３の患者が臨床的改善を示し（ＯＲＲ＝９２％）、ＤＬＢＣＬ患者の１１／１１が治療に応答した（ＯＲＲ＝１００％）。追跡期間中央値は７０日（範囲：３５～２５７日）であった。最良総合効果（ＢＯＲ）には、１０例の完全奏効（ＣＲ）及び２例の部分応答（ＰＲ）が含まれる。
【0237】
図１１は、Ｃ－ＣＡＲ０３９臨床結果の要約を示す。
【0238】
図１２は、Ｃ－ＣＡＲ０３９治療前後の患者の例を示す。
【0239】
［実施例９］
Ｃ－ＣＡＲ０３９のＰＫプロファイル
末梢血におけるＣ－ＣＡＲ０３９の増殖及び拡大は、腫瘍退縮と正の相関があった。Ｃ－ＣＡＲ０３９ ＡＵＣ（０～２８日）及びＣｍａｘと臨床応答との間の相関の正の初期傾向が観察される。
Ｃ－ＣＡＲ０３９のＰＫプロファイル
末梢血におけるＣ－ＣＡＲ０３９の増殖及び拡大は、腫瘍退縮と正の相関があった。Ｃ－ＣＡＲ０３９ ＡＵＣ（０～２８日）及びＣｍａｘと臨床応答との間の相関の正の初期傾向が観察される。
【0240】
【0241】
末梢血におけるＣ－ＣＡＲ０３９の増殖及び拡大は、腫瘍退縮と正の相関があった。Ｃ－ＣＡＲ０３９ ＡＵＣ（０～２８日）及びＣｍａｘと臨床応答との間の相関の正の初期傾向が観察される。
【表7】
【表8】
【0242】
Ｃ－ＣＡＲ０３９は、ｒ／ｒ ＮＨＬ患者の初期臨床試験において有望な有効性及び好ましい安全性プロファイルを示す。初期の臨床的有効性シグナルは有望であり、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ療法と好都合に比較される。これらの所見は、安全性、有効性及び奏効期間を確認するために、より長い追跡期間でより多くの患者において評価する必要がある。
【0243】
［実施例１０］
Ｃ－ＣＡＲ０６６（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ２０．１９（ＯＦ））の第Ｉ相臨床試験
ＣＤ１９標的化エピトープの喪失による再発は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法の治療上の課題を提示する。これらの患者は、一般に予後不良である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）のための証明された治療標的であり、以前に承認され、広く使用されているモノクローナル抗体療法によって支持されている。Ｃ－ＣＡＲ０６６は、新規な第２世代キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）療法である。前臨床研究は、Ｃ－ＣＡＲ０６６（オファツムマブのｓｃＦＶに由来する）が、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、及びオビヌツズマブのｓｃＦＶに由来するＣＡＲ－Ｔと比較して優れた抗腫瘍活性を有することを示唆する。
Ｃ－ＣＡＲ０６６（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ２０．１９（ＯＦ））の第Ｉ相臨床試験
ＣＤ１９標的化エピトープの喪失による再発は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法の治療上の課題を提示する。これらの患者は、一般に予後不良である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）のための証明された治療標的であり、以前に承認され、広く使用されているモノクローナル抗体療法によって支持されている。Ｃ－ＣＡＲ０６６は、新規な第２世代キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）療法である。前臨床研究は、Ｃ－ＣＡＲ０６６（オファツムマブのｓｃＦＶに由来する）が、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、及びオビヌツズマブのｓｃＦＶに由来するＣＡＲ－Ｔと比較して優れた抗腫瘍活性を有することを示唆する。
【0244】
ＮＣＴ０４０３６０１９は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法で以前に治療されたｒ／ｒ Ｂ細胞リンパ腫を有する対象におけるＣ－ＣＡＲ０６６の安全性及び有効性を評価するための単一群、単施設、非ランダム化第Ｉ相臨床試験である。この試験の主な目的は、治療下で発現する有害事象の発生率及び重症度を評価することである。第２の目的は、全奏効率（ＯＲＲ）、ＰＦＳ、及びＯＳを決定することを含む。Ｃ－ＣＡＲ０６６は、無血清半自動化デジタル閉鎖系で製造される。Ｃ－ＣＡＲ０６６は、標準的な３日間のシクロホスファミド／フルダラビン移植前処置後に、単回静脈内用量として患者に投与される。
【0245】
図１４は、Ｃ－ＣＡＲ０６６－ＮＨＬ試験設計を示す。
【0246】
２０２０年８月３日現在、７名の患者（全てＤＬＢＣＬ）が登録され、２．０×１０６～５．０×１０６のＣＡＲ－Ｔ細胞の用量範囲を有するＣ－ＣＡＲ０３９が注入された。製造成功率は１００％であった。全ての患者が抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ治療後に再発し、患者のうちの１名のみが抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法後にＣＲを達成した。
【表9】
【0247】
Ｃ－ＣＡＲ０６６治療は、６名の患者において可逆的なグレード１～２のＣＲＳ、別の患者においてグレード３のＣＲＳで良好に許容され、神経細胞毒性事象はなかった。６／７の患者が臨床的改善を示した（最良総合効果率、ＯＲＲ＝８５．７％）。最良総合効果には、３ＣＲ及び３ＰＲが含まれる。全ての患者がＣ－ＣＡＲ０６６処置に応答し、異なる程度の腫瘍退縮（４５～１００％）を示した。
【表10】
【0248】
６／７の患者が臨床的改善を示した（最良総合効果率、ＯＲＲ＝８５．７％）。最良総合効果には、３ＣＲ及び３ＰＲが含まれる。全ての患者がＣ－ＣＡＲ０６６処置に応答し、異なる程度の腫瘍退縮（４５～１００％）を示した。
【表11】
【0249】
図１５は、Ｃ－ＣＡＲ０６６による治療の前後の患者のＰＥＴ－ＣＴの一例を示す。
【0250】
Ｃ－ＣＡＲ０６６は好ましい安全性プロファイルを有し、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法後のｒ／ｒ ＮＨＬ患者において有望な初期有効性を示す。これは、Ｃ－ＣＡＲ０６６が抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔ療法と比較して異なる作用機序を有することを示す。ＣＤ２０及びＣＤ１９腫瘍抗原の両方を標的化することにより、Ｂ細胞悪性腫瘍患者においてＣＤ１９又はＣＤ２０のいずれかを単独で標的化するよりも優れた臨床的利益を導くことができる。
【0251】
本出願で言及される全ての文献は、あたかもそれぞれが個別に参照により組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。更に、本発明の上記の教示を読んだ後、当業者は様々な変更又は修正を行うことができ、その同等物は添付の特許請求の範囲に定義される特許請求の範囲に含まれることも理解されるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】