特許 7625408 細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-24

(45)【発行日】2025-02-03

(54)【発明の名称】細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20250127BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20250127BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20250127BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20250127BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20250127BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20250127BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20250127BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07 ZNA

G01N33/48 P

C12Q1/6806 Z

C12N15/10 100Z

G01N33/50 P

C12Q1/37

C12M1/00 A

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020198628

(22)【出願日】2020-11-30

(65)【公開番号】P2022086551

(43)【公開日】2022-06-09

【審査請求日】2023-08-17

(73)【特許権者】

【識別番号】305002028

【氏名又は名称】社会医療法人大雄会

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】菊池 有純

【審査官】戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５１８４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０２０／１６６９７８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１７／１９８６９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】BMC Vet. Res.，2019年，vol.15, article no.1，pp.1-9

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８

Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体試料中に含まれる細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮する方法であって、
（ｉ）細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを含む液体試料に、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加するステップと、これにより、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡと硫酸プロタミンまたはスペルミジンとの凝集物が得られ、
（ｉｉ）前記凝集物を回収するステップと
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）の後、プロテアーゼにより前記凝集物を消化するステップ
を含む方法。

【請求項2】

前記液体試料が生体液試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

硫酸プロタミンまたはスペルミジンおよびプロテアーゼを含んでなる、セルフリーＤＮＡを濃縮するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、疾患を診断するためには、生体から病変の一部を採取する生検が行われてきたが、近年では、より低侵襲な検査方法として、生体液試料を用いるリキッドバイオプシーが注目されている。リキッドバイオプシーの解析対象としては、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、エクソソームなどの細胞外小胞（ＥＶｓ）などが挙げられる。

【0003】

ｃｆＤＮＡは、スピンカラムや磁気ビーズを用いた従来の核酸抽出方法により抽出することができる（非特許文献１）。しかし、ｃｆＤＮＡは、生体液試料１ｍＬあたりナノグラムレベルという非常に少ない量でしか存在しないため、大量の生体液試料を必要とすることが問題となる。また、ＥＶｓは、超遠心分離や、膜表面上の抗原を認識する抗体を用いた免疫沈降などにより抽出することができるが（非特許文献２）、やはり回収効率や操作性が不良であるという問題がある。ｃｆＤＮＡやＥＶｓを抽出するためのキットも多数市販されているが、いずれも比較的高価である。したがって、ｃｆＤＮＡおよびＥＶｓを、高収率かつ低コストで抽出できる手法の確立が望まれている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｍｅｄｄｅｂ，Ｒ．ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６５， Ｎｏ．５， ｐｐ．６２３－６３３（２０１９）

【文献】Ｙａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ．８， ｐｐ．３６８４－３７０７（２０２０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、従来技術の諸問題を解消し、簡便な操作により、生体液試料から細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを高収率かつ低コストで抽出する方法を提供することを目的としてなされたものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明者は、鋭意研究の結果、生体液試料に硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加することにより、生体液試料中の細胞外小胞およびセルフリーＤＮＡを良好に濃縮できることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、液体試料中に含まれる細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮する方法であって、（ｉ）細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを含む液体試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料に、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加するステップと、これにより、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡと、硫酸プロタミンまたはスペルミジンとの凝集物が得られ、（ｉｉｉ）前記凝集物を回収するステップとを含む方法を提供するものである。

【0008】

前記液体試料は、生体液試料であることが好ましい。

【0009】

上記方法は、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）の後、プロテアーゼにより前記凝集物を消化するステップをさらに含んでもよい。

【0010】

また、本発明は、一実施形態によれば、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを含んでなる、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮するためのキットを提供するものである。

【0011】

セルフリーＤＮＡの抽出のためには、上記キットは、プロテアーゼをさらに含むことが好ましい。

【発明の効果】

【0012】

本発明に係る方法によれば、生体液試料に硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加することにより、生体液試料に微量に含まれる細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮でき、高効率かつ低コストでの細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡの抽出が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、血漿試料から得られた上清およびペレット溶解液（エクソソーム抽出液）に含まれるリポタンパク質を検出した電気泳動像である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

【0015】

本発明は、第一の実施形態によれば、液体試料中に含まれる細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮する方法であって、（ｉ）細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを含む液体試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料に、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加するステップと、これにより、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡと、硫酸プロタミンまたはスペルミジンとの凝集物が得られ、（ｉｉｉ）前記凝集物を回収するステップとを含む方法である。

【0016】

本実施形態の方法では、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを含む液体試料を準備して使用する。

【0017】

「細胞外小胞」（以下、「ＥＶｓ」とも記載する）とは、細胞から分泌される脂質二重膜小胞を意味する。なお、ＥＶｓは、その大きさや表面マーカーに基づいて、エクソソーム、マイクロベシクルおよびアポトーシス小体に大別されるが、本実施形態におけるＥＶｓは、それらのいずれであってもよく、それらの混合物であってもよい。また、「セルフリーＤＮＡ」（以下、「ｃｆＤＮＡ」とも記載する）とは、細胞の死滅または損傷によって細胞から放出された遊離ＤＮＡ断片を意味する。

【0018】

本実施形態における細胞外小胞およびセルフリーＤＮＡは、いかなる細胞から分泌されたものであってよく、正常細胞または疾患細胞のいずれから分泌されたものであってもよい。ＥＶｓおよびｃｆＤＮＡが由来する細胞の種類は特に限定されず、例えば、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、神経細胞、幹細胞、がん細胞、それらに由来する初代培養細胞または株化細胞などであってよい。したがって、本実施形態におけるｃｆＤＮＡは、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）であり得る。また、細胞が由来する生物も特に限定されず、任意の脊椎動物であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。

【0019】

本実施形態における液体試料は、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを含むものであれば特に限定されず、例えば、生体から得られた体液や、細胞を培養して得られた培養上清などであってよい。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、胃液、膵液、胆汁、汗、涙、母乳、鼻汁、腸液などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0020】

次いで、液体試料に硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加する。これにより、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡと硫酸プロタミンまたはスペルミジンとの凝集物を得ることができる。液体試料に添加する硫酸プロタミンの終濃度は、例えば、１００μｇ／ｍｌ～１５ｍｇ／ｍｌの範囲であってよく、好ましくは、６００μｇ／ｍｌ～６．５ｍｇ／ｍｌの範囲であってよい。液体試料に添加するスペルミジンの終濃度は、例えば、０．８μｇ／ｍｌ～８５μｇ／ｍｌの範囲であってよく、好ましくは、４μｇ／ｍｌ～４５μｇ／ｍｌの範囲であってよい。液体試料に硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加した後は、室温で一定時間（例えば１０～３０分間）インキュベートすることが好ましい。

【0021】

ＥＶｓおよびｃｆＤＮＡを安定化させ、抽出効率をさらに向上させるために、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加する前に、または添加すると同時に、他の成分を適宜添加してもよい。そのような他の成分としては、例えば、塩化ナトリウムなどの塩、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ＰＢＳなどの緩衝液、テトラエチレングリコールジメチルエーテルなどを挙げることができる。

【0022】

次いで、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡと硫酸プロタミンまたはスペルミジンとの凝集物を回収する。凝集物は、例えば、４℃、１６，０００×ｇで１０～３０分間遠心分離することにより回収することができる。

【0023】

本実施形態の方法は、その後、プロテアーゼにより前記凝集物を消化するステップをさらに含んでもよい。凝集物を消化することにより、特にｃｆＤＮＡの抽出効率が改善され得る。本実施形態におけるプロテアーゼは、特に限定されず、例えば、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、カテプシンＬ、カテプシンＫ、パパインなどのシステインプロテアーゼ；ペプシン、キモシン、カテプシンＤなどのアスパラギン酸プロテアーゼなどであってよく、これらから選択される単独または２種類以上を組み合わせて用いることができる。本実施形態におけるプロテアーゼは、好ましくはプロテイナーゼＫである。プロテアーゼの濃度は、プロテアーゼの種類により適宜変更され得るが、例えばプロテイナーゼＫであれば、１０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの範囲であってよく、好ましくは、１５ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌの範囲であってよい。また、消化条件は、プロテアーゼの種類により適宜変更され得るが、例えばプロテイナーゼＫであれば、室温～７０℃で１０～３０分間インキュベートすればよい。

【0024】

細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡと硫酸プロタミンまたはスペルミジンとの凝集物またはそのプロテアーゼによる消化物は、ＰＢＳなどの緩衝液に溶解した後、すでに確立された公知のＥＶｓ／ｃｆＤＮＡの抽出方法に供することができる。例えば、ｃｆＤＮＡは、スピンカラムや磁気ビーズを用いて抽出することができ、ＥＶｓは、超遠心分離や表面マーカーに対する抗体を用いた免疫沈降により抽出することができる。これらの方法に基づいてＥＶｓおよび／またはｃｆＤＮＡを抽出するためのキットも多数市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。

【0025】

本実施形態の方法は、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを添加するのみにより、試料中のＥＶｓおよび／またはｃｆＤＮＡを濃縮することができ、高効率かつ低コストでのＥＶｓおよび／またはｃｆＤＮＡの抽出を可能とする。

【0026】

本発明は、第二の実施形態によれば、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを含んでなる、細胞外小胞および／またはセルフリーＤＮＡを濃縮するためのキットである。本実施形態における「細胞外小胞」および「セルフリーＤＮＡ」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。

【0027】

本実施形態のキットは、上記構成に加え、プロテアーゼをさらに含んでもよい。実施形態における「プロテアーゼ」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。また、本実施形態のキットは、ＥＶｓおよび／またはｃｆＤＮＡの抽出に用いるバッファーやその他の試薬、ＥＶｓおよび／またはｃｆＤＮＡの抽出手順を記載した説明書などをさらに含んでもよい。

【実施例】

【0028】

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

【0029】

＜１．ｃｆＤＮＡの抽出＞
（１）ｃｆＤＮＡを含有する液体試料の準備
ｃｆＤＮＡを含有する液体試料として、血漿試料、尿試料、および培養上清試料を以下の手順により準備した。
血漿試料： ＥＤＴＡ２Ｋ入り採血管（ＢＤバキュテイナ採血管、日本ＢＤ）を用いて５人の健常者から血液を採取し、２，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を回収し、さらに１３，０００ｒｐｍ（１６，０６０×ｇ）で１５分間遠心して得られた上清を血漿試料とした。
尿試料： ５人の健常者から採取した尿を２，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を回収し、さらに１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して得られた上清を尿試料とした。
培養上清試料： １０％ＦＣＳ（富士フイルム和光純薬、５５６－３３８６５）を添加したＲＰＭＩ１６４０（富士フイルム和光純薬、１８９－０２０２５）中で、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）を５０ｍｌフラスコでコンフルエントになるまで培養した。その後培地を回収し、２，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を回収し、さらに１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して得られた上清を培養上清試料とした。

【0030】

（２）血漿試料からのｃｆＤＮＡの抽出
（２－１）硫酸プロタミンを用いたｃｆＤＮＡの抽出
１ｍＬの血漿試料（ｎ＝１０）に、１／２０量の５ＭのＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬、１９１－０１６６５）（５０μＬ）を添加して混合し、さらに３／２０量の１％硫酸プロタミン（富士フイルム和光純薬、１６０－０５１９３）（１５０μＬ）を加えて混合した。室温で１０分間静置した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。２００μＬのＰＢＳを加えてペレットを溶解し、２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）（ロシュ・ダイアグノスティックス、３１１５８３６００１）を４０μＬ添加して、または添加せずに、室温で３０分間静置した。その後、通常の核酸抽出キットであるＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス、１７９６８２８）を用いてｃｆＤＮＡを抽出した。ｃｆＤＮＡの溶出は、５０μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒにより行った。

【0031】

（２－２）スペルミジンを用いたｃｆＤＮＡの抽出
１ｍＬの血漿試料（ｎ＝１０）に、１／１０量の５ＭのＮａＣｌ（１００μＬ）を添加して混合し、さらに１／１０量の０．０１％スペルミジン（富士フイルム和光純薬、１９１－１３８３１）（１００μＬ）を加えて混合した。室温で１０分間静置した後、５００μＬのテトラエチレングリコールジメチルエーテル（東京化成工業）を加えて混合し、さらに室温で１０分間静置した。その後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を除去した。１６０μＬのＰＢＳを加えてペレットを溶解し、２０ｍｇ／ｍＬのＰｒｏＫを８０μＬ添加して、または添加せずに、室温で３０分間静置した。その後、通常の核酸抽出キットであるＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｃｆＤＮＡを抽出した。ｃｆＤＮＡの溶出は、５０μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒにより行った。

【0032】

対照として、ｃｆＤＮＡ抽出のための専用キットであるｃｏｂａｓ ｃｆＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス、０７２４７７３７１９０）を用いて、同量（１ｍＬ）の血漿試料（ｎ＝１０）からｃｆＤＮＡを抽出した。

【0033】

抽出されたｃｆＤＮＡ溶液を、ＫＡＰＡ ｈｇ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＱＣ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス、ＫＫ４９６６）付属の１２９ ｂｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｘを用いて定量した。反応および解析には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、抽出されたｃｆＤＮＡ溶液の濃度（平均値±ＳＤ）を決定した。

【0034】

［反応液組成（１０μＬ）］
・ｃｆＤＮＡ溶液 １μＬ
・２×ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス、０６４０２７１２００１） ５μＬ
・Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｘ １μＬ
・蒸留水 残量

【0035】

［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：９５℃ １０分
・ステップ２～３（４０サイクル）：９５℃ １０秒、６２℃ ３０秒

【0036】

結果を表１に示す。硫酸プロタミンを用いてｃｆＤＮＡを凝集させることにより、市販のｃｆＤＮＡ抽出専用キットと同等の効率でｃｆＤＮＡを抽出できることが示された。さらに、硫酸プロタミン－ｃｆＤＮＡ凝集物をＰｒｏＫで消化することにより、市販のｃｆＤＮＡ抽出専用キットよりも高い効率でｃｆＤＮＡを抽出できることができた。スペルミジンを用いた場合も、スペルミジン－ｃｆＤＮＡ凝集物をＰｒｏＫで消化することにより、市販のｃｆＤＮＡ抽出専用キットよりも高い効率でｃｆＤＮＡを抽出できることができた。これらの結果から、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを用いた方法は、低コストでありながらｃｆＤＮＡを効率よく抽出することができるものであること、および、さらにＰｒｏＫ処理を行うことにより、ｃｆＤＮＡを高効率で抽出できることが示された。

【0037】

表１．血漿試料からのｃｆＤＮＡの抽出

【表1】

【0038】

（３）尿試料からのｃｆＤＮＡの抽出
１ｍＬの血漿試料に代えて２ｍＬの尿試料（ｎ＝５）を用い、上記１（２－１）と同様の手順により、硫酸プロタミンおよびＰｒｏＫを用いた方法と市販のｃｆＤＮＡ抽出キットを用いた方法とのｃｆＤＮＡ抽出効率を比較した。

【0039】

結果を表２に示す。硫酸プロタミンおよびＰｒｏＫを用いた方法により、市販のｃｆＤＮＡ抽出専用キットを用いた方法よりも高い効率でｃｆＤＮＡを抽出できることが確認された。

【0040】

表２．尿試料からのｃｆＤＮＡの抽出

【表2】

【0041】

（４）試料中のｃｆＤＮＡの濃縮
１ｍＬの血漿試料に代えて、１ｍＬ、２．５ｍＬ、５ｍＬまたは１０ｍＬの尿試料または培養上清試料（それぞれｎ＝３）を用い、上記１（２－１）と同様の手順により、硫酸プロタミンおよびＰｒｏＫを用いてｃｆＤＮＡを抽出し、５０μＬのｃｆＤＮＡ溶出液を得た。

【0042】

結果を表３および４に示す。尿試料および培養上清試料のいずれの場合も、出発量依存的にｃｆＤＮＡの収量が増加した。この結果から、硫酸プロタミンおよびＰｒｏＫを用いた方法は、高効率でｃｆＤＮＡを濃縮できるものであることが示された。

【0043】

表３．尿試料中のｃｆＤＮＡの濃縮

【表3】

【0044】

表４．培養上清試料中のｃｆＤＮＡの濃縮

【表4】

【0045】

＜２．エクソソームの抽出＞
（１）エクソソーム含有生体液試料からのエクソソームの抽出
１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で、浮遊性ヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ２０１（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）を３７℃にてコンフルエントになるまで培養した。細胞を回収し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄後、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０中で４８時間培養した。培養液を回収し、２，０００×ｇで１５分間遠心し、回収した上清をポアサイズ０．２２μｍの滅菌シリンジフィルター（Ｈａｗａｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＬＰＥＳ２５２２Ｓ）でろ過した。ろ過後の上清に、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、４４７８３５９）を加え、４℃で一晩インキュベートした。その後、１３，０００ｒｐｍで６０分間遠心し、上清を除去し、ペレットをＰＢＳ（－）で懸濁した。懸濁液のタンパク質量をＱｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｑ３３２１１）を用いて測定し、ＰＢＳ（－）を用いてタンパク質濃度を１０μｇ／ｍＬに調製したエクソソーム溶液を得た。

【0046】

上記１（１）で調製した血漿試料および尿試料（それぞれｎ＝３）４７５μＬに対してＲＮａｓｅＡ（１０Ｕ）を加えて３７℃で３０分間インキュベート後、上記エクソソーム溶液２５μＬを添加した。得られたエクソソーム試料溶液に、１／２０量の５ＭのＮａＣｌを添加して混合し、さらに３／２０量の１％硫酸プロタミンを加えて混合した；または、得られたエクソソーム試料溶液に、１／１０量の５ＭのＮａＣｌを添加して混合し、さらに１／１０量の０．０１％スペルミジンを加えて混合した。室温で１０分間静置後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を除去した。１５０μＬのＰＢＳを加えてペレットを溶解し、エクソソーム抽出液を得た。対照として、市販のエクソソーム抽出試薬であるＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、４４８４４５０）またはＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｆｒｏｍ ｕｒｉｎｅ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、４４８４４５２）を用いて、同量の同試料からエクソソーム抽出液を調製した。

【0047】

エクソソームの抽出効率は、エクソソーム抽出液から精製されたｍｉＲＮＡを定量することにより評価した。具体的には、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス、５０８０５７６００１）を用いてｍｉＲＮＡを精製し、５０μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒにより溶出した。次いで、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス、０４８９７０３００１）を用い、ｃＤＮＡを合成した。プライマーには、ステムループＲＴプライマー（５’－ＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡ－３’：配列番号１）を用いた。反応液の組成は、キット付属の説明書の記載に準じた（１／２スケール）。逆転写反応は、以下の条件により行った。

【0048】

［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：１６℃ ３０分
・ステップ２～４（６０サイクル）：３０℃ ３０秒、４２℃ ３０秒、５０℃ １秒
・ステップ５（１サイクル）：８５℃、５分

【0049】

得られた反応液をＴＥ緩衝液により５倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液とした。続いて、以下の条件により、ｍｉＲ－２１についてのリアルタイムＰＣＲを行った。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて反応および解析を行い、Ｃｐ値（平均値±ＳＤ）を算出した。

【0050】

［反応液組成（１０μＬ）］
・ｃＤＮＡ溶液 ２．５μＬ
・２×ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス、６４０２６８２００１） ５μＬ
・１０μＭ フォワードプライマー（５’－ＧＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’：配列番号２） ０．２μＬ
・１０μＭ リバースプライマー（５’－ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ－３’：配列番号３） ０．２μＬ
・１０μＭ ユニバーサルプローブライブラリー プローブ＃８２（ロシュ・ダイアグノスティックス、０４６８９０５４００１） ０．２μＬ
・蒸留水 残量

【0051】

［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：９５℃ １０分
・ステップ２～３（４０サイクル）：９５℃ １０秒、６０℃ ３０秒

【0052】

結果を表５および６に示す。硫酸プロタミンおよびスペルミジンのいずれを用いた場合も、市販のエクソソーム抽出試薬と同等またはそれ以上の効率でエクソソームを抽出できることが示された。

【0053】

表５．エクソソームを添加した血漿試料から抽出されたｍｉＲ－２１のＣｐ値

【表5】

【0054】

表６．エクソソームを添加した尿試料から抽出されたｍｉＲ－２１のＣｐ値

【表6】

【0055】

（２）試料中のエクソソームの濃縮
１ｍＬまたは１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０に、上記２（１）で調製したエクソソーム溶液を２０μＬまたは２００μＬを添加したものを試料として用いた以外は、上記２（１）と同様の手順により、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを用いて試料中のエクソソームを抽出し、ｍｉＲ－２１についてのＣｐ値（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を算出した。

【0056】

結果を表７および８に示す。硫酸プロタミンまたはスペルミジンのいずれを用いた方法でも、出発量依存的にエクソソームの収量が増加したことが確認された。この結果から、硫酸プロタミンまたはスペルミジンのいずれを用いた方法も、高効率でエクソソームを濃縮できるものであることが示された。

【0057】

表７．尿試料中のエクソソームの濃縮

【表7】

【0058】

表８．培養上清試料中のエクソソームの濃縮

【表8】

【0059】

（３）エクソソーム抽出に伴うリポタンパク質の混入
血漿中にはＬＤＬやＨＤＬといったリポタンパク質が存在しており、リポタンパク質粒子にもｍｉＲＮＡが含まれる。そのため、正確なエクソソーム解析を行うためには、エクソソーム抽出におけるリポタンパク質の混入を排除する必要がある。そこで、本発明の方法におけるリポタンパク質の混入の有無を確認した。

【0060】

上記１（１）で調製した血漿試料（ｎ＝２）５００μＬに、１／２０量の５ＭのＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬、１９１－０１６６５）を添加して混合し、さらに３／２０量の１％硫酸プロタミンを加えて混合した；または、１／１０量の５ＭのＮａＣｌを添加して混合し、さらに１／１０量の０．０１％スペルミジンを加えて混合した。室温で１０分間静置した後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を回収した。ペレットに５００μＬのＰＢＳを加え、ペレット溶解液（エクソソーム抽出液）を得た。対照として、市販のエクソソーム抽出試薬であるＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ）を用いて、同量の同試料から上清およびペレット溶解液を得た。上清およびペレット溶解液をクイックジェルＬＩＰＯ（ヘレナ研究所、Ｊ７１５）に供し、エパライザ２（ヘレナ研究所）で電気泳動を行った。電気泳動の結果を画像として取得し、ＩｍａｇｅＪによりバンド強度を数値化した（解析を３重に行い、平均値±ＳＤを算出した）。

【0061】

結果を図１に示す。レーン１：血漿試料１からプロタミン処理により得られた上清、レーン２：血漿試料１からプロタミン処理により得られたペレット溶解液、レーン３：血漿試料２からプロタミン処理により得られた上清、レーン４：血漿試料２からプロタミン処理により得られたペレット溶解液、レーン５：血漿試料１からスペルミジン処理により得られた上清、レーン６：血漿試料１からスペルミジン処理により得られたペレット溶解液、レーン７：血漿試料２からスペルミジン処理により得られた上清、レーン８：血漿試料２からスペルミジン処理により得られたペレット溶解液、レーン９：血漿試料１から市販試薬処理により得られた上清、レーン１０：血漿試料１から市販試薬処理により得られたペレット溶解液、レーン１１：血漿試料２から市販試薬処理により得られた上清、レーン１２：血漿試料２から市販試薬処理により得られたペレット溶解液、レーン１３：血漿試料１、およびレーン１４：血漿試料２。また、図１の各バンド強度を表９に示す。硫酸プロタミンまたはスペルミジンを用いて調製されたペレット溶解液には、リポタンパク質はごく微量しか含まれていなかったのに対し、市販のエクソソーム抽出試薬を用いて調製されたペレット溶解液には、リポタンパク質の有意な混入が確認された。この結果から、硫酸プロタミンまたはスペルミジンを用いてエクソソームを抽出する方法は、リポタンパク質の混入を最小限に抑えることができ、高純度のエクソソームを調製できるものであることが示された。

【0062】

表９．エクソソーム抽出物へのリポタンパク質の混入

【表9】

【図1】

【配列表】

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