特許 7625518 ４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）及び／またはＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内及び／または静脈内投与によって、がんを治療する療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-24

(45)【発行日】2025-02-03

(54)【発明の名称】４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）及び／またはＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内及び／または静脈内投与によって、がんを治療する療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20250127BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250127BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20250127BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20250127BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250127BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250127BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250127BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250127BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250127BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20250127BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250127BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61K38/17

A61K39/00 H

A61K39/21

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K45/00

A61K48/00

A61P35/00

A61P43/00 121

C12N7/01 ZNA

C12N15/12

【請求項の数】 30

(21)【出願番号】P 2021527213

(86)(22)【出願日】2019-11-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-18

(86)【国際出願番号】 EP2019081942

(87)【国際公開番号】W WO2020104531

(87)【国際公開日】2020-05-28

【審査請求日】2022-10-18

(31)【優先権主張番号】18207238.9

(32)【優先日】2018-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】62/807,720

(32)【優先日】2019-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【微生物の受託番号】ECACC  00083008

(73)【特許権者】

【識別番号】509296443

【氏名又は名称】バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100221981

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 大成

(72)【発明者】

【氏名】ラウターバッハ・ヘニング

(72)【発明者】

【氏名】ヒンターベルガー・マリア

(72)【発明者】

【氏名】メディナ・エチェベルス・ホセ

【審査官】濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０３７１２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】4-1BB ligand enhances tumor-specific immunity of poxvirus vaccines，Vaccine，2006年，Vol. 24, No. 23，p. 4975-4986，doi: 10.1016/j.vaccine.2006.03.042

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ１２Ｎ １５／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

－ 組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含み、対象に腫瘍内投与される、前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、および
－ 任意選択的に担体および／または薬学的に許容可能な希釈剤、
を含み、対象に腫瘍内投与される、医薬組成物。

【請求項2】

－ 組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含み、対象に腫瘍内投与される、前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、
－ 少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニスト、および
― 任意選択的に担体および／または薬学的に許容可能な希釈剤との組み合わせ、
を含み、対象に腫瘍内投与される、医薬組成物。

【請求項3】

前記組み換え改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）が、
（ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸
をさらに含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ＴＡＡをコードする第１の核酸が、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質をコードする、請求項１～３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）抗原Ｇｐ７０、ｐ１５、ＭＥＬ及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記組み換えＭＶＡを得るために使用されるＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ－ＢＮである、請求項１～６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアンタゴニストまたはアゴニストから選択されている、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項9】

腫瘍内投与により対象における腫瘍を治療するための医薬の製造に使用するためのものである、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項10】

組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含み、対象に腫瘍内投与される、前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）の、腫瘍内投与により、がん性腫瘍において炎症応答を増強するため、腫瘍サイズを縮小させるためおよび／またはがん性腫瘍を有する対象において生存率を上昇させるための医薬の製造における使用。

【請求項11】

前記組み換え改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）が、
（ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸
をさらに含む、請求項１０に記載の使用。

【請求項12】

ＴＡＡをコードする第１の核酸が、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質をコードする、請求項１０または１１に記載の使用。

【請求項13】

前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇから選択される、請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）抗原Ｇｐ７０、ｐ１５、ＭＥＬ及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択される、請求項１０～１３のいずれか１つに記載の使用。

【請求項15】

前記組み換えＭＶＡを得るために使用されるＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ－ＢＮである、請求項１０～１４のいずれか１つに記載の使用。

【請求項16】

腫瘍内投与により、がん性腫瘍において炎症応答を増強するため、腫瘍サイズを縮小させるためおよび／またはがん性腫瘍を有する対象において生存率を上昇させるための医薬の製造に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物の使用。

【請求項17】

腫瘍内投与により、がん性腫瘍において炎症応答を増強するため、腫瘍サイズを縮小させるためおよび／またはがん性腫瘍を有する対象において生存率を上昇させるための医薬の製造に使用するための、請求項２に記載の医薬組成物の使用。

【請求項18】

－ 組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、（ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含み、対象に腫瘍内投与される、前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、および
－ 任意選択的に担体および／または薬学的に許容可能な希釈剤、
を含み、対象に腫瘍内投与される、医薬組成物。

【請求項19】

－ 組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、（ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含み、対象に腫瘍内投与され、ＴＡＡをコードする第１の核酸が、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質をコードする、前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、
－ 少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニスト、および
－ 任意選択的に担体および／または薬学的に許容可能な希釈剤、
の組み合わせを含み、対象に腫瘍内投与される、医薬組成物。

【請求項20】

前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇから選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）抗原Ｇｐ７０、ｐ１５、ＭＥＬ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記組み換えＭＶＡを得るために使用されるＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ－ＢＮである、請求項１９～２１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアンタゴニストまたはアゴニストから選択される、請求項１９～２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【請求項24】

腫瘍内投与により対象における腫瘍を治療するための医薬の製造に使用するためのものである、請求項１９～２３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【請求項25】

組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、（ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含み、対象に腫瘍内投与され、ＴＡＡをコードする第１の核酸が、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質をコードする、前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）の、腫瘍内投与により、がん性腫瘍において炎症応答を増強するため、腫瘍サイズを縮小させるためおよび／またはがん性腫瘍を有する対象において生存率を上昇させるための医薬の製造における使用。

【請求項26】

前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇから選択される、請求項２５に記載の使用。

【請求項27】

前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）抗原Ｇｐ７０、ｐ１５、ＭＥＬ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の使用。

【請求項28】

前記組み換えＭＶＡを得るために使用されるＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ－ＢＮである、請求項２５～２７のいずれか１つに記載の使用。

【請求項29】

腫瘍内投与により、がん性腫瘍において炎症応答を増強するため、腫瘍サイズを縮小させるためおよび／またはがん性腫瘍を有する対象において生存率を上昇させるための医薬の製造における、請求項１８に記載の医薬組成物の使用。

【請求項30】

腫瘍内投与により、がん性腫瘍において炎症応答を増強するため、腫瘍サイズを縮小させるためおよび／またはがん性腫瘍を有する対象において生存率を上昇させるための医薬の製造における、請求項１９に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんを治療する療法に関するものであり、その治療は、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）をコードする核酸を含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを静脈内投与または腫瘍内投与することを含む。組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス（組み換えＭＶＡ」または「ｒＭＶＡ」ともいう）は、本明細書で使用する場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＭＶＡを指す。より具体的な態様では、本発明は、ＴＡＡをコードする核酸と、４－１ＢＢＬをコードする核酸とを含む組み換えＭＶＡの静脈内投与または腫瘍内投与を含む。追加の態様では、本発明は、ＴＡＡをコードする核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸とを含む組み換えＭＶＡの静脈内投与または腫瘍内投与を含む。追加の態様では、本発明は、ＴＡＡ、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）及びＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡの静脈内投与及び／または腫瘍内投与を含む。

【背景技術】

【0002】

組み換えポックスウイルスは、感染性生物に対する免疫療法ワクチンとして、さらに最近では、腫瘍に対する免疫療法ワクチンとして使用されてきた（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８）：１０３１－１０３４）。

【0003】

感染症及びがんに対する免疫療法ワクチンとして有用であることが証明されているポックスウイルス株の１つは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス（単に「ＭＶＡ」と称する場合もある）である。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を５１６代連続継代することによって作られた（論評については、Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３：６－１４を参照されたい）。これらの長期継代により、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、その欠失ゲノム配列が約３１キロベースであったので、トリ細胞での複製に関して、宿主細胞が非常に限られているものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１－１０３８）。様々な動物モデルにおいて、この得られたＭＶＡが、際立って非病原性であることが示された（Ｍａｙｒ ＆ Ｄａｎｎｅｒ（１９７８）Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５－３４）。より安全な製品（ワクチンまたは医薬など）の開発用に、安全性プロファイルが向上されたＭＶＡ株が説明されてきている（国際公開第ＷＯ２００２０４２４８０号を参照されたい。例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照されたいが、これらの特許はいずれも、参照により、本明細書に援用される）。このようなバリアントは、非ヒト細胞及び非ヒト細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においては、増殖的に複製できるが、ヒト細胞株（特にＨｅＬａ細胞株、ＨａＣａｔ細胞株及び１４３Ｂ細胞株を含む）においては複製能力がない。このような株は、例えば、著しく免疫力が低下しており、複製型ウイルスに対する感受性が高いトランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９のような特定のマウス株においても、インビボでの増殖的複製が不可能である（米国特許第６，７６１，８９３号を参照されたい）。このようなＭＶＡバリアント及びその誘導体（組み換え体を含む）は、「ＭＶＡ－ＢＮ」と称され、説明されている（国際公開第ＷＯ２００２／０４２４８０号を参照されたい。例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照されたい）。

【0004】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードするポックスウイルスベクターを用いると、がん患者の腫瘍サイズを縮小させ、全生存率を向上させる成果が見られることが示されている（例えば、ＷＯ２０１４／０６２７７８を参照されたい）。がん患者に、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＭＵＣ１及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙのようなＴＡＡをコードするポックスウイルスベクターを投与すると、そのがんと闘うために、その患者で、活発かつ特異的なＴ細胞応答が生じることが示されている（上記文献を参照されたい。Ｇｕａｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（２４），ｄｏｉ １０．１１５８／０００８－５４７２．ＳＡＢＣＳ－０９－５０８９）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．１：１０８７－９５も参照されたい）。

【0005】

多くのがん細胞及び腫瘍細胞上で発現することが見出されたＴＡＡの一種は、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である。ＥＲＶは、以前は外来性であったレトロウイルスの残骸であって、宿主の生殖系列に侵入して、それ以降、遺伝的集団にわたり垂直伝搬されてきたものである（Ｂａｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ａｒｔｉｃｌｅ １７８を参照されたい）。ＥＲＶに誘導される遺伝子組み換えイベント、及び正常細胞遺伝子の調節障害には、腫瘍の形成に寄与する作用があることが立証されている（上記文献を参照されたい）。さらに、特定のＥＲＶタンパク質に発がん特性がある証拠がある（上記文献を参照されたい）。ＥＲＶは、例えば乳房、卵巣、メラノーマ、前立腺、膵臓及びリンパ腫を含む多種多様ながんで発現することが見出されている。（例えば、Ｂａｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：１７８、Ｃｅｇｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：４、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：１５２８－３５、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２０：８１－９０、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５８６９－７７、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８（１３ Ｓｕｐｐｌ．），ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｐｒｉｌ ２０１８，Ａｂｓｔｒａｃｔ １２５７、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ－Ｇａｌｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：９３２９－３６、Ｓｃｈｉａｖｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５５１０－１６、Ｍａｌｉｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７６２８１、Ｆａｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３１：３４－４５、Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：８７３５－４１、Ｂｕｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：４１７２－８０、Ｓｅｒａｆｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｔ’ｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１５：８４９－６２、Ｉｒａｍａｎｅｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ ２１：５１－７、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９７：１１３９－４６、Ｇｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３２：１４８４－９２、Ａｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｆｒｏｎｔ． Ｏｎｃｏｌ．９：１８０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１９：４－２３を参照されたい。）

【0006】

ＭＶＡのようなポックスウイルスは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）のようなＣＤ４０アゴニスト（ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい）、または４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）のような４－１ＢＢアゴニスト（Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１０５５２０）と組み合わせると、ＴＡＡによるその効果に加えて、有効性が増強されることが示されている。

【0007】

ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌは、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子（「ＴＮＦＲ／ＴＮＦ」）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０が、Ｂ細胞、マクロファージ及びＤＣを含む多くの種類の細胞上で構成的に発現するのに対して、そのリガンドであるＣＤ４０Ｌは、主に活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（１１）：５７０７－５７１７、Ｍａ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ（２００９）Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（５）：２６５－２７２）。感染または免疫後の早い段階における、ＤＣとＣＤ４＋ Ｔ細胞との同族相互作用により、ＤＣに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をプライミングすることが「許諾」される（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４－４７８）。ＤＣへの許諾により、共刺激分子がアップレギュレートされ、ＤＣの生存率が上昇し、クロスプレゼンテーション能が向上する。このプロセスは主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によって媒介されるが（Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７８－４８０、Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４８０－４８３）、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌに依存しない機序も存在する（ＣＤ７０、ＬＴ．ベータ．Ｒ）。興味深いことに、ＤＣ上に発現したＣＤ４０Ｌと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上に発現したＣＤ４０との直接的な相互作用も示唆されており、ヘルパーに依存しないＣＴＬ応答が生じることに対する考え得る説明が提示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０：２１８－２２７）。

【0008】

４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬは、ＴＮＦＲ／ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。４－１ＢＢＬは、活性化Ｂ細胞、単球及びＤＣで発現する共刺激リガンドである。４－１ＢＢは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＤＣ、単球及び好中球を含むいくつかの自然免疫細胞集団によって構成的に発現される。興味深いことに、４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞上で発現するが、休止Ｔ細胞では発現しない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．２２９：１９２－２１５）。４－１ＢＢの結合により、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）の増殖及び産生が誘導されるとともに、Ｂｃｌ－ｘＬのような抗アポトーシス分子のアップレギュレーションを通じて、Ｔ細胞の生存が増強される（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．２４４：１９７－２１７）。重要なことに、４－１ＢＢが刺激されると、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を通じて、ＮＫ細胞の増殖、ＩＦＮ－γの産生及び細胞溶解活性が増強される（Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：２４２３－３２）。

【0009】

４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬの免疫軸は現在、様々な免疫療法策によって探求されている。例として、自家キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の移植では、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において臨床効果が見られ、２０１７年にＦＤＡから認可された。腫瘍特異的抗体に由来する細胞外ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζ、及び共刺激モチーフ４－１ＢＢを組み合わせたＣＡＲを患者の自家Ｔ細胞に導入する。４－１ＢＢの付加は、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ持続性及び抗腫瘍傷害性に不可欠である（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：４６１７ｅ２７）。現在、４－１ＢＢを標的とする抗体について研究されている。

【0010】

いくつかの研究で、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ経路を標的とするアゴニスト抗体は、単独療法として使用すると、抗腫瘍活性を見せることが示されている（Ｐａｌａｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２：６０８－２３）。４－１ＢＢを標的とするアゴニスト抗体（ＢＭＳのウレルマブ、Ｐｆｉｚｅｒのウトミルマブ）は現在、臨床開発段階にある。近年、４－１ＢＢＬを他の療法と組み合わせた研究は、成果が様々である。例えば、ＭＣ３８（マウス腺癌）腫瘍を以前から有するが、Ｂ１６メラノーマ腫瘍を有さないマウスに、ＣＴＬＡ－４に対する抗体及び抗４－１ＢＢを投与したところ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞依存性の有意な腫瘍退縮が観察されたとともに、これらの腫瘍に対する免疫が長期に持続した。別の例では、抗４－１ＢＢ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）－４６９４９２）で処置したところ、Ｍ１０９腫瘍の退縮は中程度にしか見られなかったが、ＥＭＴ６腫瘍の成長は有意に遅延された。

【0011】

腫瘍微小環境は、浸潤免疫細胞から、がん細胞、細胞外マトリックス、内皮細胞、及び腫瘍の進行に影響を及ぼすその他の関与細胞まで、様々な種類の細胞で構成されている。この複雑に絡み合った平衡状態は、患者ごとに変化するのみならず、同じ対象の病変内で変化する（Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ １７０（５）：９２７－９３８）。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現に基づき、腫瘍を層別化したことにより、がんに対する客観的奏効を得るための炎症環境の重要性が浮かび上がっている（Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７５（１１）：２１３９－４５）。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の遺伝子発現プロファイルのがん種横断的解析により、腫瘍炎症シグネチャーが、免疫療法に対する客観的奏効と相関することが裏付けられている（Ｄａｎａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ６（１）：６３）。

【0012】

近年、がん療法でのワクチン投与経路を改善する試みは、皮下注射から静脈内投与経路に拡大されてきている。例えば、異種抗原をコードするＭＶＡワクチンの静脈内投与により、その抗原に対する強力な特異的免疫応答を誘導できたことが示された（ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい）。さらに、そのＭＶＡワクチンにＣＤ４０Ｌを含めた場合に、免疫応答が増強した。

【0013】

細菌由来の物質（コーリートキシン）を腫瘍病変に接種すると、治癒応答が得られることが長きにわたり伝えられ、抗腫瘍応答を促す際の局所感染の役割が浮き彫りになっている（Ｃｏｌｅｙ（１９０６）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．３（Ｓｕｒｇ Ｓｅｃｔ）：１－４８）。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、細菌産物及びウイルスを腫瘍病変に局所投与すると、ｉ）Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）のような炎症誘発性サイトカインの分泌、ｉｉ）アラーミン及び熱ショックタンパク質のような危険シグナル、ならびにｉｉｉ）腫瘍抗原の放出を含むイベントのカスケードをその投与後に起こす抗微生物プログラムが誘導される（Ａｚｎａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：３１－３９）。未処置の腫瘍病変で退縮が評価されてきたが（（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ８（６）：６７）、免疫療法剤を腫瘍に局所投与すると、全身性免疫応答が誘導される。

【0014】

ここ数年、ＭＶＡワクチンの腫瘍内投与について報告されている。ＧＭ－ＣＳＦを発現するＭＶＡの腫瘍内注射、及びＤＮＡワクチンによる免疫により、ＨＰＶ１６ Ｅ７腫瘍を有するマウスの生存期間が長くなったことが見出された（Ｎｅｍｅｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ５４：４）。ＭＶＡの腫瘍内注射に関する他の研究では、膵臓腫瘍の成長阻害を示すことはできなかった（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３（２）：ｅ０１９３１３１）。熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射により、危険シグナルであるＩ型インターフェロンの産生と、樹状細胞による抗原クロスプレゼンテーションに依存する抗腫瘍免疫応答が誘導された（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（１１）：ｅａａｌ１７１３）。

【0015】

能動免疫療法及びがんワクチンを含むさらなるがん治療に対するアンメットメディカルニーズがかなり存在するのは明らかである。加えて、患者の免疫応答の複数の領域で、免疫応答の増強を誘導できる療法に対するニーズが存在する。多くの態様では、本開示の実施形態は、現在利用可能であるがん治療を増加及び改善させるワクチン、療法及び併用療法を提供することによって、これらのニーズに対応する。

【発明の概要】

【0016】

本発明の様々な実施形態では、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と４－１ＢＢリガンド（本明細書では、４１ＢＢＬ、４－１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌともいう）とをコードする組み換えＭＶＡは、腫瘍内投与または静脈内投与すると、がん患者の治療の効果を高め、及び／またはその治療を増強することが示された。より具体的には、本開示の様々な実施形態では、組み換えＭＶＡを単独で投与した場合と比べて、腫瘍における炎症が増大し、腫瘍における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が減少し、腫瘍におけるＴ細胞の疲弊が低減され、腫瘍特異的Ｔ細胞とＮＫ細胞活性化が増加し、腫瘍体積の縮小が増大し、及び／またはがんである対象の生存率が上昇したことが確認された。

【0017】

本発明の様々な実施形態では、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とをコードする組み換えＭＶＡは、腫瘍内投与または静脈内投与すると、がん患者の治療を増強することが確認された。より具体的には、本開示の様々な実施形態では、組み換えＭＶＡを単独で投与した場合と比べて、腫瘍における炎症が増大し、腫瘍における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が減少し、腫瘍におけるＴ細胞の疲弊が低減され、腫瘍特異的Ｔ細胞とＮＫ細胞活性化が増加し、腫瘍体積の縮小が増大し、及び／またはがんである対象の生存率が上昇したことが確認された。

【0018】

追加の実施形態では、本発明は、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）をコードする核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与及び／または腫瘍内投与すると、がん患者の治療を増強するＭＶＡウイルスを含む。

【0019】

したがって、一実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、その対象のそのがん性腫瘍における炎症応答が増強され、腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法を含む。

【0020】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、ＴＡＡ及び抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、その対象のそのがん性腫瘍における炎症応答が増強され、腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法を含む。

【0021】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）をコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与及び／または静脈内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを投与すると、ＴＡＡ、抗原ＣＤ４０Ｌ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを、異なる注射経路によって注射する（すなわち、非腫瘍内注射または非静脈内注射する）場合と比べて、その対象のそのがん性腫瘍における炎症応答が増強され、腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法を含む。

【0022】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に静脈内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを静脈内投与すると、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内注射する場合と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、そのＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される方法を含む。

【0023】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に静脈内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを静脈内投与すると、ＴＡＡ及び抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内注射する場合と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、そのＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される方法を含む。

【0024】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に静脈内投与及び／または腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを静脈内投与及び／または腫瘍内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内注射または非腫瘍内注射する場合と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、そのＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される方法を含む。

【0025】

さらに別の実施形態では、本発明は、対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法であって、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、異種の腫瘍関連抗原及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比べて、その腫瘍における炎症応答が増強される方法を含む。

【0026】

さらに別の実施形態では、本発明は、対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法であって、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、異種の腫瘍関連抗原及び抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比べて、その腫瘍における炎症応答が増強される方法を含む。

【0027】

さらに別の実施形態では、本発明は、対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法であって、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与及び／または静脈内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与及び／または静脈内投与すると、異種の腫瘍関連抗原をコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射または非静脈内注射によって生じる炎症応答と比べて、その腫瘍における炎症応答が増強される方法を含む。

【0028】

様々な追加の実施形態では、本発明は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを提供する。

【0029】

様々な追加の実施形態では、本発明は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0030】

様々な追加の実施形態では、本発明は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、ｃ）４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0031】

さらに別の実施形態では、抗原４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡは、チェックポイント阻害剤アンタゴニストの投与と組み合わせて、患者に腫瘍内投与すると、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはそのがん患者の生存率を上昇させる。

【0032】

さらに別の実施形態では、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡは、チェックポイント阻害剤アンタゴニストの投与と組み合わせて、患者に腫瘍内投与すると、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはそのがん患者の生存率を上昇させる。

【0033】

さらに別の実施形態では、抗原ＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡは、チェックポイント阻害剤アンタゴニストの投与と組み合わせて、患者に腫瘍内及び／または静脈内投与すると、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはそのがん患者の生存率を上昇させる。

【0034】

別の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、その抗体の投与と同時またはその抗体の投与の後に投与する。より好ましい実施形態では、その組み換えＭＶＡは、その抗体の後に投与する。

【0035】

別の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、同じ投与経路（複数可）によって、その抗体の投与と同時またはその抗体の投与の後に投与する。別の実施形態では、その組み換えＭＶＡは、１つもしくは複数の異なる投与経路によって、またはその抗体の投与の後に投与する。

【0036】

さらに別の実施形態では、本発明は、がん患者における抗体療法を増強する方法であって、その方法が、本発明の併用医薬をがん患者に投与することを含み、その併用医薬を投与すると、その抗体療法を単独で投与する場合と比べて、その抗体療法によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強される方法を含む。

【0037】

好ましい実施形態では、その第１の核酸は、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質であるＴＡＡをコードする。より好ましい実施形態では、そのＥＲＶタンパク質は、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する。より好ましい実施形態では、そのＥＲＶタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択されている。

【0038】

好ましい実施形態では、その第１の核酸は、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）ペプチドであるＴＡＡをコードする。より好ましい実施形態では、そのＥＲＶペプチドは、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する。より好ましい実施形態では、そのＥＲＶペプチドは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ）の偽遺伝子から選択されている。

【0039】

他の好ましい実施形態では、その第１の核酸は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択したＴＡＡをコードする。

【0040】

１つ以上の好ましい実施形態では、その組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体である。

【0041】

様々な追加の実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストのいずれかと組み合わせて、がんである対象に投与する。さらなる実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、ＴＡＡに特異的な抗体と組み合わせて、がんである対象に投与して、がんである対象を治療する。より好ましい実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳから選択した免疫チェックポイント分子のアンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせて投与する。最も好ましい実施形態では、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、抗体を含む。最も好ましい実施形態では、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0042】

本発明のさらなる目的及び利点は、一部が下記の説明に示されており、一部は、その説明から明らかとなるか、または本発明を実施することにより認識し得る。本発明の目的及び利点は、添付の請求項で特に指摘されている要素及び組み合わせによって認識及び実現されることになる。

【0043】

添付の図面は、本明細書に援用され、本明細書の一部を成すが、本発明の１つ以上の実施形態を例示するとともに、その明細と併せて、本発明の原理を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞によって、ＣＤ８ Ｔ細胞を４－１ＢＢＬの媒介により共刺激すると、ＤＣの必要性なしに、サイトカインの産生に影響が及ぶことを示している。これに対して、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌでは、ＤＣの存在下でのみ、サイトカインの産生が増強される。実施例２に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後、樹状細胞（ＤＣ）を作製した。Ｂ１６．Ｆ１０細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを感染させ、感染した腫瘍細胞を回収し、指示されている場合には、ＤＣの存在下で共培養した。ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、上記の共培養物に加えた。細胞を培養し、Ｌｕｍｉｎｅｘによってサイトカイン濃度を解析するために、その上清を採取した。ＩＬ－６（図１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図１Ｂ）、ＩＬ－２（図１Ｃ）及びＩＦＮ－γ（図１Ｄ）の上清濃度が示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図2】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞は直接、すなわち、ＤＣの必要性なしに、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の、活性化エフェクターＴ細胞への分化を促すが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染した腫瘍細胞の、ＣＤ４０Ｌの媒介による共刺激は、ＤＣの存在に依存することを示している。実施例３に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後、樹状細胞（ＤＣ）を作製した。Ｂ１６．Ｆ１０（メラノーマモデル）細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを感染させた。その翌日、感染した腫瘍細胞を回収し、（指示されている場合に）ＤＣの存在下で共培養した。ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、その共培養物を１：５の比率で加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。続いて、細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。図２Ａは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図では「ＣＤ８＋」として示されている）上のＴ－ｂｅｔのＧＭＦＩを示しており、図２Ｂは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４＋ グランザイムＢ＋ ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋のパーセンテージを示している。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図3】ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかをコードするＭＶＡに感染させると、腫瘍細胞株及びマクロファージにおける腫瘍細胞死が誘導されることを示している。実施例４に記載されているように、腫瘍細胞株Ｂ１６．ＯＶＡ（図３Ａ及び３Ｂ）、ＭＣ３８（図３Ｃ）ならびにＢ１６．Ｆ１０（図３Ｄ）にベクターを、示されているＭＯＩで、２０時間感染させた。細胞の生存率について、フローサイトメトリーによって解析した。図３Ａ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅは、死細胞のパーセンテージ（「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ＋」）を示している。図３Ｂ：図３Ａの上清中のＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡによって定量した。図３Ｅ：骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、示されているＭＯＩで、２０時間感染させた。細胞の生存率について、フローサイトメトリーによって解析した。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図4】ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬがインビボで、ＮＫ細胞の活性化を誘導することを示している。実施例５に記載されているように、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）もしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡを２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせたもののいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を静脈内免疫した。２４時間後、マウスを殺処分し、フローサイトメトリー解析のために、脾臓を処理した。ＣＤ６９（Ａ）及びＣＤ７０（Ｂ）の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）が示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図5】ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬによる免疫静脈内によって、インビボにおいて、血清ＩＦＮ－γの分泌が促進されることを示している。実施例６に記載されているように、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）もしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡを２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせたもののいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を静脈内免疫した。図５Ａ：６時間後に、マウスから採血を行い、血清を全血から単離し、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって求めた。図５Ｂ：３時間後、２１時間後及び４５時間後に、マウスに、ブレフェルジンＡを静脈内注射して、タンパク質の分泌を停止した。免疫から６時間後、２４時間後及び４８時間に、マウスを殺処分し、脾細胞をフローサイトメトリーによって解析した。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図6】Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスにおいて、「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）で静脈内免疫すると、血清ＩＦＮ－γの分泌が促進されることを示している。実施例７に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡ（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）もしくはｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。６時間後に、マウスから採血を行い、血清を全血から単離し、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって求めた。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図7】「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）で静脈内プライム免疫及び静脈内ブースト免疫を行った後、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びベクター特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が増加することを示している。実施例８に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４匹／群）に、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡを２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせたもののいずれかで、静脈内プライム免疫を０日目に行い、ブースト免疫を４１日目に行った。プライム免疫から６日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６４日目に、マウスから採血を行い、末梢血のフローサイトメトリー解析を行った。図７Ａは、末梢血白血球（ＰＢＬ）のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示しており、図７Ｂは、ＰＢＬのうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。プライム免疫から７０日目に、マウスを殺処分した。脾臓を摘出し、フローサイトメトリー解析を行った。図７Ｃは、生細胞のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示しており、図７Ｄは、生細胞のうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図8】４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスを静脈内注射すると、４－１ＢＢＬをコードしない組み換えＭＶＡと比べて、抗腫瘍作用が増大することを示している。実施例９に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）を静脈内投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。

【図9】４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスを腫瘍内注射したところ、抗腫瘍作用が増強されたことを示している。実施例１０に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、１２日目及び１５日目（灰色の破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」として示されている）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」として示されている）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」として示されている）を腫瘍内投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。

【図10】確立された大腸癌に対して、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスを腫瘍内注射することによる抗腫瘍作用を示している。実施例１１に記載されているように、ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から１４日目（黒い点線）、１９日目及び２２日目（黒い破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＴＡＡ（図では「ｒＭＶＡ」として示されている）もしくはＭＶＡ－ＴＡＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」として示されている）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。これらの実験では、組み換えＭＶＡによってコードされるＴＡＡには、抗原ＡＨ１Ａ５、ｐ１５Ｅ及びＴＲＰ２が含まれていた。

【図11】チェックポイントの遮断と、腫瘍標的化抗体が、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ（本明細書では「ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ」ともいう）の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与と相乗効果を発揮することを示している。実施例１２に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、指示されている場合（チェック印）には、２００μｇのＩｇＧ２ａ、抗ＴＲＰ－１または抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与した。腫瘍の接種から１３日目（黒い点線）、１８日目及び２１日目（灰色の破線）に、マウスをＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。

【図12】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射すると、抗ＣＤ１３７抗体による治療よりも優れた抗腫瘍作用が得られることを示している。実施例１３に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞をｓ．ｃ．（皮下）投与した。７日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬまたは１０μｇの抗４－１ＢＢ（３Ｈ３）抗体のいずれかを腫瘍内注射した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図１２Ａには、腫瘍平均体積が示されている。図１２Ｂ：プライミングから１２日目に、末梢血リンパ球をＯＶＡデキストラマーで染色し、ＦＡＣＳによって解析した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちのＯＶＡデキストラマー＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図13】内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍作用を示している。実施例１４に記載されているように、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ｗｔ細胞をｓ．ｃ．（皮下）投与した。腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、ＣＴ２６．ｗｔ腫瘍担持マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から１２日目に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ｒＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはｒＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均直径（図１３Ａ）及び腫瘍平均体積（図１３Ｂ）である。図１３Ｃ：免疫から７日後に、血液細胞を再刺激したものであり、刺激後の血液中のＣＤ８＋ ＣＤ４４＋ ＩＦＮ－γ＋ 細胞のパーセンテージが示されている。

【図14】内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０及びＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍作用を示している。実施例１５に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞をｓ．ｃ．（皮下）投与した。７日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ｒＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはｒＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。示されているのは、腫瘍平均体積（図１４Ａ）と、免疫から７日後に、ｐ１５ｅペプチドで刺激した後の血液中のＣＤ８＋ ＣＤ４４＋ ＩＦＮ－γ＋ 細胞のパーセンテージである（図１４Ｂ）。

【図15】ＩＴ免疫に対するサイトカイン／ケモカインＭＶＡ－ＢＮ骨格応答は、４－１ＢＢＬのアジュバント作用によって増大し得る。本明細書では、「アジュバント作用」とは、組み換えＭＶＡの特定のコードタンパク質または成分によって、その組み換えＭＶＡの他のコードタンパク質（複数可）または成分（複数可）がもたらす免疫応答が増大することであるように意図されている。この図においては、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した（実施例２３を参照されたい）。１０日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝６匹のマウス／群）。６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。サイトカイン／ケモカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘによって解析した。図１５には、免疫マウスにおいて、サイトカイン／ケモカインがアップレギュレートしたことが示されている。

【図16】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫に対するサイトカイン／ケモカインの炎症誘発性応答が増大する。５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した（実施例２３及び２４を参照されたい）。１０日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝６匹のマウス／群）。６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。サイトカイン／ケモカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘによって解析した。図１６は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫したマウスにおいて、ＭＶＡ－ＢＮの場合と比べてアップレギュレートするサイトカイン／ケモカインを示している。

【図17】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）のＴ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９～１３日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内注射した（実施例２５を参照されたい）。免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを殺処分し、腫瘍及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）をコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＣＤ４５＋ 細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が示されている。

【図18】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後のＴＭＥ及び流入ＬＮのＴ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９～１３日後、腫瘍の測定値が５．５×５．５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＤ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内注射した（実施例２６を参照されたい）。免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを殺処分し、腫瘍及びＴｄＬＮ（腫瘍流入リンパ節）をコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。図１８Ａ：腫瘍（左パネル）及びＴｄＬＮ（右パネル）におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちのＫｉ６７＋ 細胞のパーセンテージが示されている。図１８Ｂ：ｉ．ｔ．免疫から７日後の腫瘍におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちのＰＤ１のＧＭＦＩが示されている。図１８Ｃ：ｉ．ｔ．免疫から７日後の腫瘍におけるＯＶＡ特異的Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇの比率が示されている。

【図19】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後のＴＭＥ及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）のＮＫ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９～１３日後、腫瘍の測定値が５．５×５．５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内注射した（実施例２７を参照されたい）。免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを殺処分し、腫瘍及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）をコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＮＫ細胞数、ならびに腫瘍及びＴｄＬＮ内のＮＫ細胞のＣＤ６９、グランザイムＢ及びＫｉ６７表面マーカーのＧＭＦＩが示されている。

【図20】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに媒介される抗腫瘍作用のＣＤ８ Ｔ細胞依存性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳまたは２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例２８を参照されたい）。この１回目の注射から５日目及び８日目に、これらの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射を繰り返した（縦の破線）。加えて、１回目の免疫の１日前、１日後、４日後、７日後、１１日後に、コントロール抗体であるＩｇＧ２ｂアイソタイプ（左及び中央のパネル）、または抗ＣＤ８抗体（２．４３、右パネル）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（１００μｇ／マウス）。腫瘍の成長を等間隔で測定したものであり、腫瘍平均直径が示されている。

【図21-1】ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの媒介による抗腫瘍作用のＢａｔｆ３＋ ＤＣ依存性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｔｆ３－／－ マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後（縦の破線）、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例２９を参照されたい）。１回目の腫瘍内注射から５日目及び８日目に、このｉ．ｔ．注射を繰り返した（縦の破線）。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２１Ａ：腫瘍平均直径が示されている。図２１Ｂ：１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞（すなわちＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的Ｔ細胞）の存在について解析した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図21-2】ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの媒介による抗腫瘍作用のＢａｔｆ３＋ ＤＣ依存性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｔｆ３－／－ マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後（縦の破線）、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例２９を参照されたい）。１回目の腫瘍内注射から５日目及び８日目に、このｉ．ｔ．注射を繰り返した（縦の破線）。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２１Ａ：腫瘍平均直径が示されている。図２１Ｂ：１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞（すなわちＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的Ｔ細胞）の存在について解析した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図22-1】Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ担持マウスにおける、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与におけるＮＫ細胞の役割である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＩＬ１５Ｒα－／－マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例３０を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。腫瘍平均直径（図２２Ａ）及び生存率（％）（図２２Ｂ）が示されている。１回目の免疫から１１日後に、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した（図２２Ｃ）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマー＋（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図22-2】Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ担持マウスにおける、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与におけるＮＫ細胞の役割である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＩＬ１５Ｒα－／－マウスに、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例３０を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。腫瘍平均直径（図２２Ａ）及び生存率（％）（図２２Ｂ）が示されている。１回目の免疫から１１日後に、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した（図２２Ｃ）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマー＋（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図23】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによるＩＴ免疫に応じた、ＮＫ細胞依存性サイトカイン／ケモカインプロファイルを示している。５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス及びＩＬ１５Ｒα－／－マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した（実施例３１を参照されたい）。７日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝２～３匹のマウス／群）。６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。サイトカイン／ケモカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘによって解析した。図２３には、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した後、ＩＬ１５Ｒαの非存在下で減少するサイトカイン／ケモカインが示されている。

【図24-1】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおいて、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果をＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの場合と比較したものを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３２を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２４Ａは、腫瘍平均直径を示しており、図２４Ｂは、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで処置したマウスの白斑の外観を示している。１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した。ｐ１５Ｅで再刺激後のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが、図２４Ｃに示されている。

【図24-2】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおいて、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果をＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの場合と比較したものを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３２を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２４Ａは、腫瘍平均直径を示しており、図２４Ｂは、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで処置したマウスの白斑の外観を示している。１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した。ｐ１５Ｅで再刺激後のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが、図２４Ｃに示されている。

【図25-1】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおけるＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの腫瘍内投与の抗腫瘍効果である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３３を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。腫瘍平均直径が図２５Ａに示されている。１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、ｐ１５ｅペプチドで再刺激した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが図２５Ｂに示されている。

【図25-2】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおけるＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの腫瘍内投与の抗腫瘍効果である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３３を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。腫瘍平均直径が図２５Ａに示されている。１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、ｐ１５ｅペプチドで再刺激した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが図２５Ｂに示されている。

【図26-1】ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣｔ２６ｗｔ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１３日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３４を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２６Ａは、腫瘍平均直径を示しており、図２６Ｂは、生存率（％）を示している。図２６Ｃ：１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、ＡＨ１ペプチドで再刺激したものである。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図26-2】ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣｔ２６ｗｔ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１３日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３４を参照されたい）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図２６Ａは、腫瘍平均直径を示しており、図２６Ｂは、生存率（％）を示している。図２６Ｃ：１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、ＡＨ１ペプチドで再刺激したものである。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図27】４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌをさらに含むＭＶＡ－ｇｐ７０を腫瘍内注射した後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）のＴ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを腫瘍内注射した（実施例３５を参照されたい）。免疫から３日後、マウスを殺処分し、腫瘍及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）を採取し、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。図２７は、腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＣＤ８^＋ Ｔ細胞、ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＫｉ６７^＋ ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の数を示している。データは、平均±標準誤差を示している。

【図28】４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌをさらに発現するＭＶＡ－ｇｐ７０を腫瘍内注射した後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）のＴ細胞の定量解析及び定性解析を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した（実施例３６を参照されたい）。９日後、腫瘍の測定値が５．５×５．５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを腫瘍内注射した免疫から３日後、マウスを殺処分し、腫瘍及びＴｄＬＮを採取し、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、得られた個々の細胞をフローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＮＫ細胞、Ｋｉ６７^＋ ＮＫ細胞及びグランザイムＢ^＋ ＮＫ細胞の数が示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【図29-1】ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の静脈内投与の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ＷＴ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１２日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを静脈内注射した（実施例３７を参照されたい）。図２９Ａは、腫瘍平均直径を示しており、図２９Ｂは、生存率（％）を示している。１回目の免疫から７日後に、血液を採取し、ＡＨ１ペプチドで再刺激した。図２９Ｃは、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ^＋ ＣＤ４４^＋ Ｔ細胞のパーセンテージを平均±標準誤差として示している。

【図29-2】ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の静脈内投与の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ＷＴ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１２日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを静脈内注射した（実施例３７を参照されたい）。図２９Ａは、腫瘍平均直径を示しており、図２９Ｂは、生存率（％）を示している。１回目の免疫から７日後に、血液を採取し、ＡＨ１ペプチドで再刺激した。図２９Ｃは、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ^＋ ＣＤ４４^＋ Ｔ細胞のパーセンテージを平均±標準誤差として示している。

【発明を実施するための形態】

【0045】

上記の概要及び下記の詳細な説明のいずれも、例示及び説明のためのものに過ぎず、特許請求されているような本発明を制限するものではないことを理解されたい。

【0046】

本願で説明及び例示されているように、本発明の組み換えＭＶＡ及び方法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。様々な態様において、本発明により、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び抗原４－１ＢＢＬを含む組み換えＭＶＡを、がんである対象に腫瘍内投与または静脈内投与すると、その対象において抗腫瘍作用が増大することが示されている。本明細書でさらに詳細に説明されているように、この抗腫瘍作用の増大には、腫瘍体積の縮小の増大、全生存率の上昇、ＴＡＡに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の増強、及び炎症応答の増強（ＮＫ細胞活性の増大、サイトカインの産生の増加など）が含まれる。

【0047】

本願で説明及び例示されているように、本発明の組み換えＭＶＡ及び方法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。様々な態様において、本発明により、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び抗原ＣＤ４０Ｌを含む組み換えＭＶＡを、がんである対象に腫瘍内投与または静脈内投与すると、その対象において抗腫瘍作用が増大することが示されている。本明細書でさらに詳細に説明されているように、この抗腫瘍作用の増大には、腫瘍体積の縮小の増大、全生存率の上昇、ＴＡＡに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の増強、及び炎症応答の増強（ＮＫ細胞活性の増大、サイトカインの産生の増加など）が含まれる。

【0048】

追加の態様では、本発明の様々な実施形態によって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び抗原４－１ＢＢＬを含む組み換えＭＶＡを、少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニスト／アゴニストと組み合わせて腫瘍内投与すると、がんである対象において、腫瘍の縮小が増大し、全生存率が上昇することが示されている。

【0049】

さらなる態様では、本発明の様々な実施形態によって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び抗原４－１ＢＢＬを含む組み換えＭＶＡを、腫瘍特異的抗体と組み合わせて腫瘍内投与すると、がんである対象において、腫瘍の縮小が増大し、全生存率が上昇することが示されている。

【0050】

以前に、組み換えＭＶＡウイルスで抗原４－１ＢＢＬをコードさせたことはあるが、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡの免疫原性上の効果は不明であった（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（８）：ｅ１０５５２０を参照されたい）。Ｓｐｅｎｃｅｒの文献では、ＭＶＡベクターまたはアデノウイルスベクターのいずれかで、４－１ＢＢＬとトランスジェニック抗原を共発現させることにより、マウスＣＤ８ Ｔ細胞の応答が増大したが、ヒト以外の霊長類動物において、４－１ＢＢＬをコードするアデノウイルスベクターを筋肉内投与した後には、ＩＦＮ－γ応答の増大はまったく見られなかった（上記文献、２ページ、６ページ）。さらに、がんを治療し、腫瘍及び／または腫瘍細胞を破壊することの一環として、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡを用いる免疫原性上の効果は未知であった。

【0051】

本開示の様々な実施形態により、４－１ＢＢＬとＴＡＡをコードするＭＶＡ（本明細書では、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬという）は、ヒトのような対象のがんを治療するのに有効であり得ることが示されている。本明細書に示され、説明されているように、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを投与すると、がんである対象の免疫応答の複数局面を増強でき、腫瘍細胞を効果的に低減及び殺傷することができる。本開示の様々な実施形態の抗腫瘍作用の増強のうちの１つ以上が、以下で概説されている。

【0052】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの静脈内投与により、抗腫瘍作用が増強される。少なくとも１つの態様では、本発明は、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ）であって、静脈内投与するものであり、静脈内投与すると、４－１ＢＢＬをコードしない組み換えＭＶＡを静脈内投与する場合と比べて、または４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡを非静脈内投与する場合（例えば、４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡを皮下投与する場合）と比べて、抗腫瘍作用が増強される組み換えＭＶＡを含む。これらの抗腫瘍作用の増強には、ＮＫ細胞応答の増強（図４に示されている）、ＩＦＮ－γの分泌増加によって示されるような、炎症応答の増強（図５及び６に示されている）、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の増加の増大（図７に示されている）、ならびに腫瘍の縮小の増大（図８に示されている）が含まれる。

【0053】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、その腫瘍における炎症が増強される。本発明の別の態様では、腫瘍細胞をＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬには感染させたが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染させないと、抗原をクロスプレゼンテーションするＤＣの非存在下で、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が活性化されて、Ｔ細胞由来のサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γなど）が産生されることが確認された（図１Ａ～１Ｄ）。活性化されると、ナイーブＴ細胞によって産生される成長因子であって、樹状細胞及び骨髄系細胞サブセットの成熟を誘導するＧＭ－ＣＳＦ（Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４６２５－４６２９）のケースでは、これは予想外であった。抗原をクロスプレゼンテーションするＤＣの存在下では、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染させた腫瘍細胞によって刺激された抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γを産生したが、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬの場合のようなＩＬ－２またはＧＭ－ＣＳＦを産生しなかった（図１Ａ～１Ｄ）。興味深いことに、ＤＣによって産生される重要なサイトカインであるＩＬ－６が大量に検出された（図１Ａ）。

【0054】

有益な一態様では、腫瘍における炎症が増強されると、腫瘍部位で、多数のＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）に、腫瘍細胞を殺傷させることができる（例えば、Ｌａｎｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ．２８（ｓｕｐｐｌ １２）：ｘｉｉ１８－ｘｉｉ３２を参照されたい）。これらの炎症性腫瘍は、「ホット」腫瘍としても知られており、ＴＩＬ、サイトカイン及びその他の炎症分子の数の増加に鑑みると、腫瘍細胞の破壊性が増強可能になる。

【0055】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、腫瘍体積が縮小し、全生存率が上昇する。一態様では、本発明は、抗原４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡ（ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ）であって、腫瘍内投与するものであり、その腫瘍内投与によって、４－１ＢＢＬをコードしない組み換えＭＶＡを腫瘍内投与する場合と比べて、がんである対象における抗腫瘍作用が増強される組み換えＭＶＡを含む。

【0056】

以前に、組み換えＭＶＡウイルスが腫瘍内投与されたことはあるが（例えば、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３：ｅ０１９３１３１及びＮｅｍｅｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ５４：３２６－３３を参照されたい）、それらの研究は、結果が様々である。例えば、Ｎｅｍｅｃｋｏｖａの研究では、ＧＭ－ＣＳＦを発現するワクシニアウイルスＭＶＡの腫瘍内注射と、ＤＮＡワクチンによる免疫により、ＨＰＶ１６誘発性腫瘍を有するマウスの生存期間が長くなったことが見出された（Ｎｅｍｅｃｋｏｖａの文献のアブストラクトを参照されたい）。また、Ｗｈｉｔｅらの研究では、ＭＶＡの腫瘍内注射後、膵臓腫瘍の成長阻害を示すことはできなかった（Ｗｈｉｔｅの文献のアブストラクトを参照されたい）。

【0057】

本開示の一環で、ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードする１つ以上の核酸を含む組み換えＭＶＡを対象に腫瘍内投与した。図９に示されているように、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射したところ、組み換えＭＶＡ ＴＡＡの場合と比べて、腫瘍体積が有意に縮小したことが示された。

【0058】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡを、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストと組み合わせて腫瘍内投与すると、抗腫瘍作用が増大する。様々な実施形態では、本発明は、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを、免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストと組み合わせて投与することを含む。好ましくは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与は、静脈内投与または腫瘍内投与である。本発明のＭＶＡを免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストと組み合わせることは有益である。この併用により、より有効ながん治療が得られるからである。例えば、本発明の併用剤及び／または併用療法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。少なくとも１つの態様では、その併用剤は、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を相乗的に増強し、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストと組み合わせると、がん患者の腫瘍体積を縮小し、生存率を上昇させる。

【0059】

本願で得られたデータによって、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストと組み合わせると、抗腫瘍作用が増大することが示されている。さらにいえば、図１１に示されているように、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与をＰＤ－１抗体の腹腔内投与と組み合わせたところ、ＰＤ－１単独の場合と比べて、腫瘍体積が縮小した。

【0060】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与を、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体と組み合わせて投与すると、抗腫瘍作用が増大する。様々な実施形態では、本発明は、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを、ＴＡＡに特異的な抗体と組み合わせて投与することを含む。好ましくは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与は、静脈内投与または腫瘍内投与である。本発明のＭＶＡを、ＴＡＡ特異的抗体と組み合わせることは有益であり、これらは協働して、より有効ながん治療をもたらすことができる。

【0061】

例示的な一態様では、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与によって誘導される、ＮＫ細胞応答の増強は、ＴＡＡ特異的抗体と相乗的に作用して、対象の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する。がんである対象におけるＡＤＣＣがこのように増強されると、腫瘍細胞の殺傷及び腫瘍の破壊が増加する。

【0062】

本願で得られたデータによって、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬをＴＡＡ特異的抗体と組み合わせると、抗腫瘍作用が増大することが示されている。さらにいえば、図１１に示されているように、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与をＴＲＰ－１抗体の腹腔内投与と組み合わせたところ、ＴＲＰ－１抗体単独の場合と比べて、腫瘍体積が縮小した。

【0063】

本発明に従って、プライム免疫及びブースト免疫の一環として、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを投与すると、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加が増大する。別の態様では、本発明は、同種及び／または異種でのプライム－ブーストレジメンの一環として、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを投与する方法を提供する。好ましくは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与は、静脈内投与または腫瘍内投与である。図７に示されているように、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加は、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの静脈内投与によるプライミング及びブースティングの際に増大した。

【0064】

定義
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の付された単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「核酸」という場合には、その核酸が１つ以上含まれ、「その方法」という場合には、当業者に知られている同等の工程及び方法であって、修正可能であるか、または本明細書に記載されている方法と置き換え可能である工程及び方法への言及が含まれる。

【0065】

別段に示されていない限り、一連の要素の前に付された「少なくとも」という用語は、その一連の要素の１つ１つを指すと理解されたい。当業者は、慣用的に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載されている発明の具体的実施形態の均等物を数多く認識するか、または確認できるであろう。このような均等物は、本発明に含まれるように意図されている。

【0066】

本明細書及び下記の請求項の全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、示されている整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群を含むことを示唆しているが、いずれかの他の整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群を除外しないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、または場合によっては、本明細書で使用する場合、「有する」という用語に置き換えることができる。あまり好ましくはないが、上記の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する）のいずれも、本明細書において、本発明の態様または実施形態の関連で使用する場合にはいずれも、「～からなる」という用語に置き換えることができる。本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の要素で指定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「～から本質的になる」という場合には、その請求項の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を及ぼさない材料または工程は除外されない。

【0067】

本明細書で使用する場合、示されている複数の要素間に置かれた「及び／または」という接続語は、個々の選択肢、及び選択肢を組み合わせたものの両方を含むものとして理解する。例えば、２つの要素が、「及び／または」によって接続されている場合、第１の選択肢は、その第２の要素を含まずに、その第１の要素を適用可能であることを指す。第２の選択肢は、その第１の要素を含まずに、その第２の要素を適用可能であることを指す。第３の選択肢は、その第１の要素及び第２の要素を併せて適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、その意味の範囲内に入り、すなわち、本明細書で使用する場合の「及び／または」という用語の要件を満たすと理解されたい。その選択肢のうちの２つ以上を同時に適用することも、その意味の範囲内に入り、すなわち、「及び／または」という用語の要件を満たすと理解されたい。

【0068】

本明細書に記載されているような「変異」または「改変」タンパク質または抗原は、本明細書では、欠失、付加、挿入及び／または置換のようないずれかの改変を核酸またはアミノ酸に加えたものとして定義する。

【0069】

本明細書に記載されている核酸配列に関する「配列相同性パーセント（％）または配列同一性パーセント（％）」は、候補配列と参照配列をアラインメントし、必要に応じて、配列同一性パーセントが最大になるように、ギャップを導入した後、いずれの保存的置換も配列同一性としてみなさない場合に、候補配列内のヌクレオチドのうち、参照配列（すなわち、由来元の核酸配列）内のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドのパーセンテージとして定義する。ヌクレオチドの配列同一性パーセントまたは配列相同性パーセントを求めるためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）というソフトウェアのような公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野の技術の範囲内である様々な方法で行うことができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたって、アラインメントを最大限にするのに必要ないずれかのアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを定めることができる。

【0070】

例えば、核酸配列の適切なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）によって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３）によって標準化されたスコアリングマトリックスを用いることによって、アミノ酸配列に適用できる。配列の同一性パーセントを求めるための、このアルゴリズムの例示的なインプリメンテーションは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）によって、「ＢｅｓｔＦｉｔ」というユーティリティアプリケーション内に供給されている。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から入手可能）に記述されている。本発明の関連において、同一性パーセントを求めるための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｔｕｒｒｏｋが開発し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）が流通させているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いることができ、その際、デフォルトパラメーターをスコア表に使用する（例えば、ギャップオープンペナルティー：１２、ギャップエクステンションペナルティー：１、ギャップ：６）。生成されたデータから、「マッチ」値に「配列同一性」が反映される。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の好適なプログラムは概して、当該技術分野において知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで使用するＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ、ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ、ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ、ｃｕｔｏｆｆ＝６０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ、Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲというデフォルトパラメーターを用いて使用できる。これらのプログラムの詳細は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／というインターネットアドレスで見ることができる。

【0071】

「プライム－ブーストワクチン接種」または「プライム－ブーストレジメン」という用語は、所定の抗原を標的とするワクチンの１回目のプライミング注射を行ってから、間隔を空けて、同じワクチンのブースティング注射を１回以上行うことを用いるワクチン接種策またはワクチン接種レジメンを指す。プライム－ブーストワクチン接種は、同種であっても異種であってもよい。同種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射と１回以上のブースティング注射の両方に、同じ抗原及び同じベクターを含むワクチンを使用する。異種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射と１回以上のブースティング注射の両方で、同じ抗原を含むが、プライミング注射と１回以上のブースティング注射で、異なるベクターを含むワクチンを使用する。例えば、同種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射で、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射で、１つ以上の抗原を発現する同じ組み換えポックスウイルスを使用してよい。これに対して、異種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射で、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射で、１つ以上の抗原を発現する異なる組み換えポックスウイルスを使用してよい。

【0072】

「組み換え」という用語は、天然では見られないか、または天然では見られない構成で、別のポリヌクレオチドに連結されている、半合成または合成の供給源のポリヌクレオチド、ウイルスまたはベクターを意味する。「組み換えＭＶＡ」または「ｒＭＶＡ」とは、本明細書で使用する場合、概して、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）が意図されている。

【0073】

本明細書で使用する場合、腫瘍体積を縮小することまたは腫瘍体積の縮小は、腫瘍の体積及び／またはサイズの縮小として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解されている臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。腫瘍の体積及び／またはサイズの縮小と関連するいくつかの例示的な臨床試験エンドポイントとしては、奏効率（ＲＲ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）などを挙げることができるが、これらに限らない。

【0074】

本明細書で使用する場合、生存率の上昇は、がん患者の生存率の上昇として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解される臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。生存率の上昇と関連付けられた例示的ないくつかの臨床試験エンドポイントとしては、全生存率（ＯＳ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）などが挙げられるが、これらに限らない。

【0075】

本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」または「異種」遺伝子は、野生型ポックスウイルスゲノム（例えば、ワクシニア、鶏ポックスまたはＭＶＡ）に存在しない核酸配列またはアミノ酸配列であると理解されたい。「導入遺伝子」または「異種遺伝子」とは、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスに存在するときには、その組み換えポックスウイルスを宿主細胞に投与後、その遺伝子が、対応する異種遺伝子産物として、すなわち「異種抗原」及び＼または「異種タンパク質」として発現するような方法で、そのポックスウイルスゲノムに導入されたものであると当業者は理解する。発現は通常、そのポックスウイルス感染細胞内での発現を可能にする調節エレメントに、その異種遺伝子を機能的に連結することによって行われる。好ましくは、その調節エレメントは、天然または合成のポックスウイルスプロモーターを含む。

【0076】

「ベクター」とは、異種のポリヌクレオチドを含むことができる組み換えＤＮＡプラスミド、組み換えＲＮＡプラスミド、または組み換えウイルスを指す。その異種のポリヌクレオチドは、予防目的または療法目的の、対象とする配列を含んでよく、任意に、発現カセットの形態であってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、最終標的の細胞または対象において複製できる必要はない。この用語には、クローニングベクター及びウイルスベクターが含まれる。

【0077】

併用剤及び方法
様々な実施形態では、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡであって、腫瘍内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内投与によって誘導される炎症応答及びＴ細胞応答と比べて、炎症応答及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される組み換えＭＶＡを含む。

【0078】

様々な追加の実施形態では、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸であって、腫瘍内投与すると、ＴＡＡをコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの腫瘍内投与によって誘導される腫瘍内炎症応答及びＴ細胞応答と比べて、腫瘍内炎症応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される核酸を含む。

【0079】

腫瘍における炎症応答の増強本開示の様々な態様では、ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードする組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、組み換えＭＶＡを単独で投与した場合と比べて、腫瘍における炎症応答の増強が誘導されることが確認された。少なくとも１つの態様では、本開示による、腫瘍における「炎症応答の増強」は、腫瘍及び／または腫瘍細胞における１）ＩＦＮ－γの発現の増加、及び／または２）グランザイムＢ（ＧｒａＢ）の発現の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本開示に従って、腫瘍及び／または腫瘍細胞において炎症応答が増強されたか否かは、当該技術分野において知られているように、ケモカイン及びサイトカインの分泌を含め、炎症応答の増大を示す１つ以上の分子の発現が増加したか判断するために測定することによって判断できる。例示的な炎症応答マーカーには、ＮＫ細胞の出現頻度及び／または活性を測定するのに有用であるマーカーのうちの１つ以上が含まれ、ＩＦＮ－γ及び／またはグランザイムＢ（ＧｒａＢ）のうちの１つ以上が含まれる。これらの分子及びその測定は、当該技術分野において理解されている実証済みのアッセイであり、既知の技法に従って行うことができる。例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏらの文献（（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：１５９－１６５）を参照されたい。

【0080】

ＮＫ細胞応答の増強本開示の様々な追加の態様では、ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードする組み換えＭＶＡを腫瘍内投与または静脈内投与すると、組み換えＭＶＡを単独で投与する場合と比べて、腫瘍または腫瘍環境におけるＮＫ細胞応答の増強が誘導されることが確認された。一態様では、本開示による「ＮＫ細胞応答の増強」は、１）ＮＫ細胞出現頻度の上昇、２）ＮＫ細胞の活性化の増大、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本開示に従って、ＮＫ細胞応答が増強されたか否かは、ＮＫ細胞出現頻度の上昇、ＮＫ細胞の活性化の増大、及び／またはＮＫ細胞の増殖の増加を示す１つ以上の分子の発現を測定することによって判断できる。ＮＫ細胞の出現頻度及び／または活性を測定するのに有用である例示的なマーカーには、ＮＫｐ４６、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ、ＣＤ５６及び／またはＢｃｌ－ＸＬのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の活性化を測定するのに有用である例示的なマーカーには、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ－ＸＬのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の増殖を測定するのに有用である例示的なマーカーには、Ｋｉ６７が含まれる。これらの分子及びその測定は、当該技術分野において理解されている実証済みのアッセイであり、既知の技法に従って行うことができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：１５９－１６５を参照されたい）。加えて、それらの分子を測定するためのアッセイは、本開示の実施例５及び６に見ることができる。少なくとも一態様では、１）ＮＫ細胞出現頻度の上昇は、ＣＤ３－ＮＫｐ４６＋細胞が、治療前／ベースラインと比べて、少なくとも２倍増加することとして定義でき、２）ＮＫ細胞の活性化の増大は、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ－ＸＬの発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも２倍増加することとして定義でき、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加は、Ｋｉ６７の発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも１．５倍増加することとして定義する。

【0081】

Ｔ細胞応答の増強本願によれば、「Ｔ細胞応答の増強」は、１）ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度の上昇、２）ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大、及び／または３）ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本願に従って、Ｔ細胞応答が増強されたか否かは、１）ＣＤ８ Ｔ細胞出現頻度の上昇、２）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の増大、及び／または３）ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加を示す１つ以上の分子の発現を測定することによって判断できる。ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度、活性化及び増殖を測定するのに有用である例示的なマーカーにはそれぞれ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４、ならびにＫｉ６７が含まれる。抗原特異的Ｔ細胞の出現頻度は、ＭＨＣマルチマー（ペンタマー、もしくは本願によって示されているようデキストラマーなど）によって測定することができる。このような測定及びアッセイ、ならびに本発明の方法及び組成物を評価するのに用いるのに適する他の測定及びアッセイは、当該技術分野において、確立及び理解されている。

【0082】

一態様では、ＣＤ８ Ｔ細胞出現頻度の上昇は、ＩＦＮ－γ及び／またはデキストラマー＋ＣＤ８ Ｔ細胞が、治療前／ベースラインと比べて、少なくとも２倍増加することによって特徴付けられる。ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大は、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４の発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも２倍増大することとして特徴付けられる。ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加は、Ｋｉ６７の発現が、治療前／ベースラインの発現と比べて、少なくとも２倍増加することとして特徴付けられる。

【0083】

代替的な態様では、Ｔ細胞応答の増強は、エフェクターサイトカインの発現の増加、及び／または細胞傷害性エフェクター機能の増加によって特徴付けられる。エフェクターサイトカインの発現の増加は、治療前／ベースラインと比べた場合の、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－２のうちの１つ以上の発現によって測定できる。細胞傷害性エフェクター機能の増加は、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ及び／またはパーフォリンのうちの１つ以上の発現、及び／または標的細胞の抗原特異的な殺傷によって測定できる。

【0084】

本明細書に記載されているアッセイ、サイトカイン、マーカー及び分子、ならびにその測定は、当該技術分野において確立及び理解されており、既知の技法に従って行うことができる。加えて、Ｔ細胞応答を測定するためのアッセイは、Ｔ細胞応答を解析した実施例に見ることができ、その実施例としては、実施例２、３、８、１３及び１４が挙げられるが、これらに限らない。

【0085】

本発明によって認識された、Ｔ細胞応答の増強は、ＮＫ細胞応答の増強及び炎症応答の増強と組み合わさると特に有益である。Ｔ細胞の増強により、がん患者において、初期の自然免疫応答を回避し、及び／または初期の自然免疫応答に耐えた腫瘍細胞が効果的に標的とされ、殺傷されるからである。

【0086】

さらに追加の実施形態では、本明細書に記載されている併用剤及び方法は、ヒトがん患者の治療に用いるものである。好ましい実施形態では、そのがん患者は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、尿路上皮、子宮頸部または結腸直腸癌からなる群から選択したがんに罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている。さらに追加の実施形態では、本明細書に記載されている併用剤及び方法は、乳癌、結腸直腸癌またはメラノーマ、好ましくはメラノーマ、より好ましくは結腸直腸癌、最も好ましくは結腸直腸癌に罹患しており、及び／またはそのがんと診断されているヒトがん患者の治療に用いるものである。

【0087】

特定の例示的な腫瘍関連抗原
特定の実施形態では、免疫応答は、対象において、細胞関連ポリペプチド抗原に対して起きるものである。特定のこのような実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。

【0088】

「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸が、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに連結したポリマーを指す。そのアミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または天然アミノ酸の化学的類似体であってよい。この用語は、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子も指し、少なくとも２つのポリペプチドを含むときには、それらのポリペプチドは、複合体を形成するか、共有結合されているか、または非共有結合されていてよい。タンパク質におけるポリペプチド（複数可）は、糖化及び／または脂質化されていることができ、及び／または補欠分子族を含むことができる。

【0089】

内在性レトロウイルスタンパク質（ＥＲＶ）
好ましくは、本発明のＴＡＡは、内在性レトロウイルスタンパク質（ＥＲＶ）に含まれる。より好ましくは、そのＥＲＶは、ヒトＨＥＲＶ－Ｋタンパク質ファミリーのＥＲＶである。最も好ましくは、そのＨＥＲＶ－Ｋタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ群特異抗原（ｇａｇ）タンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ「メラノーマリスクマーカー」（ｍｅｌ）タンパク質から選択されている（例えば、Ｃｅｇｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：４を参照されたい）。

【0090】

ＥＲＶは、ヒトゲノムの８％を占め、数百年前における生殖細胞系列への感染に由来する。ヒトゲノムに挿入されたこれらのエレメントの大半は、大きく変異しているので、転写または翻訳は行われない。しかしながら、わりと最近獲得したほんの一部のＥＲＶは依然として機能しており、翻訳されて、場合によっては、ウイルス粒子を産生さえする。ＥＲＶの転写は非常に限られている。その座位は通常、高度にメチル化されており、その結果、体細胞では翻訳されないからである（Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ（２０１６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６： ２０７－１９）。細胞ストレス（化学物質、ＵＶ照射、ホルモン、サイトカイン）のような一部の状況下でのみ、ＥＲＶは再活性化し得る。重要なことに、ＥＲＶは、多種多様ながんでも発現するが、正常組織では発現しない（Ｃｅｇｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：４、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：１５２８－３５）。この非常に限られた発現パターンにより、ＥＲＶは、免疫寛容機序に暴露されないか、またはまれにしか暴露されないようになり、おそらく、その結果、コンピテントなＥＲＶ特異的Ｔ細胞レパートリーが得られる。このように、ＥＲＶは、ＭＶＡで腫瘍抗原（「ＴＡＡ」）として用いることができる。

【0091】

様々な追加の実施形態では、そのＴＡＡには、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、サバイビン、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２もしくはＢｒａｃｈｙｕｒｙが単独で含まれるか、またはこれらを組み合わせたものが含まれるが、これらに限らない。このような例示的な組み合わせとしては、例えばＭＶＡにおけるＣＥＡ及びＭＵＣ－１（ＣＶ３０１としても知られる）を挙げてよい。他の例示的な組み合わせとしては、ＰＡＰ及びＰＳＡを挙げてよい。

【0092】

さらなる実施形態では、追加のＴＡＡとしては、５αレダクターゼ、α－フェトプロテイン、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＣＡ－１２５、ＣＡＳＰ－８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ－ｍｙｃ、Ｃｏｘ－２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－ファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、サイモシン－β－１５、ＴＮＦ－α、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを挙げてよいが、これらに限らない。

【0093】

好ましいＰＳＡ抗原は、１５５位におけるイソロイシンのロイシンへのアミノ酸変化を含む（米国特許第７，２４７，６１５号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。

【0094】

本発明の１つ以上の好ましい実施形態では、その異種ＴＡＡは、ＨＥＲ２及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙから選択されている。

【0095】

そのＴＡＡを含むＭＶＡの投与後に、本発明の少なくとも１つの目的または所望の結果（例えば免疫応答の刺激など）が達成されるならば、いずれのＴＡＡを用いてもよい。本明細書で言及されているＴＡＡを含むＴＡＡの例示的な配列は、当該技術分野において知られており、本発明の組成物及び方法で用いるのに適する。本発明の組成物及び方法で用いるＴＡＡの配列は、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に開示されている配列と同一であってよく、あるいは、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に開示されているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかとの配列同一性が１００％未満（少なくとも９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える値など）であってもよい。すなわち、本発明の少なくとも１つの目的または所望の結果が達成されるならば、本発明の組成物または方法で用いるＴＡＡの配列は、当該技術分野において知られており、及び／または本明細書に開示されている参照配列と、ヌクレオチドまたはアミノ酸が２０個未満、または１９個未満、１８個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、１１個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満もしくは１個未満異なっていてよい。当業者は、本発明のＭＶＡまたは方法で用いる際のＴＡＡの適合性を確保するために、ＴＡＡを評価する技法及びアッセイに精通している。

【0096】

改変腫瘍関連抗原
特定の実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原は、ポリペプチド抗原に由来するエピトープが、ＡＰＣの表面上のクラスＩ ＭＨＣ分子と会合した状態で提示されると、そのエピトープをその表面上に提示する細胞に対して、ＣＴＬ応答が誘導されるように改変されている。特定のこのような実施形態では、少なくとも１つの第１の外来ＴＨエピトープは、提示されるときには、ＡＰＣの表面上のクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合している。特定のこのような実施形態では、細胞関連抗原は、腫瘍関連抗原である。

【0097】

エピトープを提示できる例示的なＡＰＣとしては、樹状細胞及びマクロファージが挙げられる。追加の例示的なＡＰＣとしては、１）クラスＩ ＭＨＣ分子に結合したＣＴＬエピトープ、及び２）クラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合したＴＨエピトープを同時に提示できるいずれかの飲作用ＡＰＣまたは食作用ＡＰＣが挙げられる。

【0098】

特定の実施形態では、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇ、ＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、サバイビン、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２またはＢｒａｃｈｙｕｒｙなど（これらに限らない）のＴＡＡのうちの１つ以上に対する改変は、本明細書に記載されているＴＡＡのうちのその１つ以上と主に反応するポリクローナル抗体が、対象への投与後に誘発されるように行われている。このような抗体は、腫瘍細胞を攻撃及び排除することができるとともに、転移性細胞が発現して転移に至るのを防ぐことができる。この抗腫瘍作用のエフェクター機構は、補体依存性及び抗体依存性の細胞傷害によって媒介されることになる。加えて、誘導された抗体は、成長因子依存性のオリゴ二量化と、受容体のインターナリゼーションの阻害を通じて、がん細胞の成長を阻害することもできる。特定の実施形態では、このような改変ＴＡＡは、腫瘍細胞によって提示される既知のＴＡＡエピトープ及び／または推定ＴＡＡエピトープに対するＣＴＬ応答を誘導できる。

【0099】

特定の実施形態では、改変ＴＡＡポリペプチド抗原は、その細胞関連ポリペプチド抗原のＣＴＬエピトープと、バリエーションを含み、そのバリエーションは、ＣＴＬエピトープまたは外来のＴＨエピトープを少なくとも１つ含む。特定のこのような改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例では、ＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む１つ以上のポリペプチド抗原ＨＥＲ２と、外来のＴＨエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含むバリエーションを含むことができ、このＴＡＡの作製方法は、米国特許第７，００５，４９８号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び同第２００６／０００８４６５号に記載されている。

【0100】

特定のこのような改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例では、ＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む１つ以上のポリペプチド抗原ＭＵＣ－１と、外来のエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含むバリエーションを含むことができ、このＴＡＡの作製方法は、米国特許出願公開第２０１４／０３６３４９５号に記載されている。

【0101】

追加のプロミスキャスなＴ細胞エピトープは、様々なＨＬＡ－ＤＲによってコードされる大部分のＨＬＡ－ＤＲ分子と結合できるペプチドを含む。例えば、ＷＯ９８／２３６３５（Ｆｒａｚｅｒ ＩＨら。Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄに譲渡）、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３ ３３７３、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：７７８ ７８０、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８ ２２８、Ｃｈｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７８：２７ ４７、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：１９７ ２０３及びＦａｌｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：２３０ ２４２を参照されたい。この最後の参照文献では、ＨＬＡ－ＤＱリガンド及びＨＬＡ－ＤＰリガンドについても論じられている。これらの参照文献に列挙されているすべてのエピトープは、本明細書に記載されているような天然エピトープの候補として関連がある。これらのエピトープ候補と共通のモチーフを共有するエピトープであるからである。

【0102】

特定の他の実施形態では、そのプロミスキャスなＴ細胞エピトープは、ハプロタイプの大部分と結合できる人工のＴ細胞エピトープである。特定のこのような実施形態では、人工のＴ細胞エピトープは、ＷＯ９５／０７７０７及び対応する論文Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１ ７６１に記載されているようなｐａｎ ＤＲエピトープペプチド（「ＰＡＤＲＥ」）である。

【0103】

４－１ＢＢＬ（本明細書では、「４１ＢＢＬ」または「４－１ＢＢリガンド」ともいう）
本開示によって例示されているように、組み換えＭＶＡ及び関連する方法の一部として、４－１ＢＢＬを含めると、がんである対象において、腫瘍内投与または静脈内投与の際に、抗腫瘍作用の増大及び増強が誘導される。したがって、様々な実施形態では、ＴＡＡをコードすることに加えて、抗原４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡが存在する。

【0104】

４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬは、ＴＮＦＲ／ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。４－１ＢＢＬは、活性化Ｂ細胞、単球及びＤＣで発現する共刺激リガンドである。４－１ＢＢは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＤＣ、単球及び好中球を含むいくつかの自然免疫細胞集団によって構成的に発現される。興味深いことに、４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞上で発現するが、休止Ｔ細胞では発現しない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．２２９：１９２－２１５）。４－１ＢＢの結合により、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）の増殖及び産生が誘導されるとともに、Ｂｃｌ－ｘＬのような抗アポトーシス分子のアップレギュレーションを通じて、Ｔ細胞の生存が増強される（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．２４４：１９７－２１７）。重要なことに、４－１ＢＢが刺激されると、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を通じて、ＮＫ細胞の増殖、ＩＦＮ－γの産生及び細胞溶解活性が増強される（Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：２４２３－３２）。

【0105】

１つ以上の好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、本発明のＭＶＡによってコードされる。１つ以上の他の好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、ヒト４－１ＢＢＬである。さらに好ましい実施形態では、その４－１ＢＢＬは、配列番号３との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である配列、すなわち、配列番号３に示されているアミノ酸配列と異なるアミノ酸が１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。さらに好ましい実施形態では、その４－１ＢＢＬは、配列番号３を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む。追加の実施形態では、４－１ＢＢＬをコードする核酸は、配列番号４との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列、すなわち、その配列において、配列番号４に示されている核酸配列と異なる核酸が２０個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である核酸配列を含む。より好ましい実施形態では、その４－１ＢＢＬは、配列番号４を含む核酸を含む。

【0106】

ＣＤ４０Ｌ
本開示によって示されているように、ＣＤ４０Ｌを併用剤及び関連方法の一部として含めることにより、腫瘍体積の縮小がさらに増大し、無増悪生存期間が長くなり、本発明によって実現する生存率が上昇する。したがって、様々な実施形態では、本発明の併用治療は、ＣＤ４０Ｌをがん患者に投与することをさらに含む。好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、本明細書に記載されているような組み換えＭＶＡの一部としてコードされる。

【0107】

ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞を含む多くの種類の細胞上に構成的に発現するが、そのリガンドＣＤ４０Ｌは、主に活性化ヘルパーＴ細胞上に発現する。感染または免疫後の早い段階における、樹状細胞とヘルパーＴ細胞との同族相互作用により、樹状細胞に、ＣＴＬ応答をプライミングすることが「許諾」される。樹状細胞への許諾により、共刺激分子がアップレギュレートされ、生存率が上昇し、クロスプレゼンテーション能が向上する。このプロセスは主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によって媒介される。しかしながら、ＣＤ４０Ｌでは、多様な刺激を誘導する、膜結合型の構成から、可溶性（単量体または三量体）の構成まで、様々な構成が説明されており、ＡＰＣの活性化、増殖及び分化を誘導または抑制する。

【0108】

１つ以上の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、本発明のＭＶＡによってコードされる。１つ以上の他の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌである。さらに好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号１との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である配列、すなわち、配列番号１に示されているアミノ酸配列と異なるアミノ酸が１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である配列を有するアミノ酸をコードする核酸を含む。さらに好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号１を含むアミノ酸をコードする核酸を含む。追加の実施形態では、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、配列番号２との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列、すなわち、その配列において、配列番号２に示されている核酸配列と異なる核酸が２０個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である核酸配列を含む。より好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、配列番号２を含む核酸を含む。

【0109】

免疫チェックポイント分子アンタゴニスト
本明細書に記載されているように、少なくとも一態様では、本発明は、免疫チェックポイントアンタゴニストを使用することを含む。このような免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能に干渉し、及び／またはその機能をブロックするように機能する。いくつかの好ましい免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、ならびにＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）が挙げられる。

【0110】

加えて、例示的な免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、Ｉｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）を挙げることができるが、これらに限らない。

【0111】

このような免疫チェックポイント分子アンタゴニストとしては、免疫チェックポイント分子に特異的に結合して、その免疫チェックポイント分子の生物学的な活性及び機能を阻害及び／またはブロックする抗体を挙げることができる。

【0112】

他の免疫チェックポイント分子アンタゴニストとしては、免疫チェックポイント分子の発現に干渉するアンチセンス核酸ＲＮＡ、及び免疫チェックポイント分子の発現に干渉する低分子干渉ＲＮＡを挙げることができる。

【0113】

加えて、アンタゴニストは、免疫チェックポイントの機能を阻害またはブロックする低分子の形態であることができる。これらの低分子のいくつかの非限定的な例としては、ＮＰ１２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖによる（Ｄ）ＰＰＡ－１、高親和性ＰＤ－１（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）、ＢＭＳ－２０２及びＢＭＳ－８（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ））、ＣＡ１７０／ＣＡ３２７（Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、ならびにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の低分子阻害剤が挙げられる。

【0114】

加えて、アンタゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害またはブロックするＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）の形態であることができる。例えば、Ｒｏｔｈｅらの文献（（２０１８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３２（３）：２３３－２４３）を参照されたい。

【0115】

加えて、アンタゴニストは、Ａｆｆｉｍｅｒ（登録商標）の形態であることができることが想定されている。Ａｆｆｉｍｅｒは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害またはブロックするＦｃ融合タンパク質である。免疫チェックポイントアンタゴニストとして機能できる他の融合タンパク質は、免疫チェックポイント融合タンパク質（例えば抗ＰＤ－１タンパク質ＡＭＰ－２２４）、及びＵＳ２０１７／０１８９４７６に記載されているような抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質である。

【0116】

免疫チェックポイント分子アンタゴニスト候補は、当該技術分野において知られている様々な技法及び／または本願で開示されている様々な技法によって、インビトロまたはマウスモデルで、機能（免疫チェックポイント分子の機能に干渉する能力など）に関してスクリーニングできる。

【0117】

ＩＣＯＳアゴニスト本発明は、ＩＣＯＳアゴニストをさらに含む。ＩＣＯＳアゴニストは、ＩＣＯＳを活性化する。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上に発現する正の共刺激分子であり、そのリガンドに結合すると、活性化Ｔ細胞の増殖を促す（Ｄｏｎｇ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：９７－１０１）。

【0118】

一実施形態では、そのアゴニストは、ＩＣＯＳの天然のリガンドであるＩＣＯＳ－Ｌである。そのアゴニストは、結合特性及び活性化特性を保持する変異形態のＩＣＯＳ－Ｌであることができる。変異形態のＩＣＯＳ－Ｌは、インビトロで、ＩＣＯＳを刺激する活性についてスクリーニングできる。

【0119】

免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストの抗体。好ましい実施形態では、免疫チェックポイント分子アンタゴニスト及び／または免疫チェックポイント分子アゴニストはそれぞれ、抗体を含む。本明細書に記載されているように、様々な実施形態では、その抗体は、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、当該技術分野において周知の技法によって作製できる。このような抗体は、その抗体の抗原結合部位を介して、その免疫チェックポイント分子に、（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、免疫チェックポイントのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などをその免疫原として用いることができる。より具体的には、そのポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含む。

【0120】

より好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒトがん患者の治療用として、主権国家の政府から認可されている抗体、または認可プロセスにある抗体である。すでに認可済みであるか、または認可プロセスにあるこれらの抗体のいくつかの非限定的な例としては、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（登録商標）及びトレメリムマブ）、ＰＤ－１（ペムブロリズマブ、ランブロリズマブ、アンプリミューン－２２４（ＡＭＰ－２２４））、アンプリミューン－５１４（ＡＭＰ－５１４）、ニボルマブ、ＭＫ－３４７５（Ｍｅｒｃｋ）、ＢＩ７５４０９１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））、ＰＤ－Ｌ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）、ＭＥＤ１４７３６（ＡＺＮ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ））、ＬＡＧ－３（ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ－９８６０１６、ＢＩ７５４１１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＭＫ－４２８９（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＳＲ－０３３（Ｔｅｓａｒｏ））が挙げられる。

【0121】

例示的な一態様では、免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、ならびにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドを用いて、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３またはＩＣＯＳに特異的に結合する抗体を調製できる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはナノボディ）、二価抗体断片（ダイアボディ）など）、ならびに組み換え及び合成によって作製したいずれかの結合パートナーが含まれるように意図されている。

【0122】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体本発明の様々な実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、ＴＡＡに特異的な抗体と組み合わせるか、またはその抗体と組み合わせて投与する。より具体的な実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的な抗体と組み合わせるか、またはその抗体と組み合わせて投与する。当該技術分野では、多くのがんにおいて、１つ以上の抗原が、その腫瘍細胞膜上に発現または過剰発現すると理解されている。例えば、Ｄｕｒｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６：３０－５、Ｍｏｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １８３６：１８７－９６、Ａｒｔｅａｇａ（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１１．１７７、Ｆｉｎｎ（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ．５：３４７－５４、Ｇｉｎａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５１：３６４－９を参照されたい。抗原が腫瘍細胞上に発現または過剰発現しているか判断するアッセイは、特定の抗原に対する抗体の作製方法とともに、当該技術分野において容易に理解される（上記文献を参照されたい）。

【0123】

より具体的な実施形態では、本発明の併用医薬及び関連する方法は、抗体を含み、その抗体は、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む。少なくとも１つの態様では、その抗体の特徴（例えばａ）及びｂ））によって、その抗体が、ＮＫ細胞、マクロファージ、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マスト細胞及び／または樹状細胞のようなエフェクター細胞に結合し、その細胞と相互作用できるようになるとともに、その抗体が、腫瘍細胞上に発現する腫瘍抗原に結合できるようになる。好ましい実施形態では、その抗体は、Ｆｃドメインを含む。追加の好ましい実施形態では、その抗体は、ＮＫ細胞に結合して、その細胞と相互作用することができる。

【0124】

腫瘍細胞上に発現する抗原に対するいくつかの例示的な抗体であって、本開示によって想定されている抗体としては、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブＣａｍｐａｔｈ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ－５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブＤａｒｚａｌｅｘ（登録商標））、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ－２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７－Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えばオレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えばＭＯｖ１８－ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ－２０２）、抗メソセリン（例えばＭＯＲＡｂ－００９）、抗ＴＲＰ２、ならびに抗ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、ハジュマ、ＡＢＰ９８０及び／またはペルツズマブ）が挙げられるが、これらに限らない。

【0125】

より好ましい実施形態では、本発明の一部として含まれる抗体には、患者に投与すると、腫瘍細胞上の対応する抗原に結合して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体が含まれる。さらに好ましい実施形態では、その抗体は、がんの治療用として認可済みまたは認可前の状態である抗体を含む。

【0126】

さらに好ましい実施形態では、その抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＣＤ２０抗体である。

【0127】

最も好ましい実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ハジュマ、ＡＢＰ９８０及びアド－トラスツズマブエムタンシンから選択されている。

【0128】

最も好ましい実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブであり、抗ＣＤ２０はリツキシマブである。

【0129】

本明細書に記載されているように、様々な実施形態では、その抗体は、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、当該技術分野において周知の技法によって作製できる。このような抗体は、その抗体の抗原結合部位を介して、ＴＡＡに（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、ＴＡＡのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などをその免疫原として用いることができる。より具体的には、そのポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含む。

【0130】

抗体
本発明の様々な実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、１）免疫チェックポイントアンタゴニストもしくは免疫チェックポイントアゴニストである抗体、または２）ＴＡＡ特異的抗体のいずれかと組み合わせ、及び／またはその抗体と組み合わせて投与する。

【0131】

その抗体は、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、当該技術分野において周知の技法によって作製できることが想定されている。このような抗体は、その抗体の抗原結合部位を介して、免疫チェックポイント分子またはＴＡＡに（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、免疫チェックポイント及び／またはＴＡＡのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などをその免疫原として用いることができる。より具体的には、そのポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含む。

【0132】

これらの抗原決定基、すなわちエピトープは、線状エピトープまたは立体構造（不連続）エピトープのいずれであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドのうちの単一のアミノ酸セクションで構成され、立体構造エピトープ、すなわち不連続エピトープは、ポリペプチド鎖の異なる領域に由来する複数のアミノ酸セクションであって、タンパク質フォールディングにより、近接するようになるアミノ酸セクションで構成される（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９６））。折り畳まれたタンパク質は、複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数は非常に多い。しかしながら、タンパク質の立体構造及び立体障害性により、それらのエピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数よりも少ない（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９６））。エピトープは、当該技術分野において知られている方法のいずれかによって特定できる。

【0133】

ＴＡＡ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３もしくはＩＣＯＳのような免疫チェックポイント分子に特異的に結合し、その機能をブロックする抗体（「アンタゴニスト抗体」）またはその機能を増強／活性化する抗体（「アゴニスト抗体」）が、ｓｃＦＶ断片を含め、本発明に含まれる。このような抗体は、従来の手段によって作製できる。

【0134】

一実施形態では、本発明には、ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子に対するモノクローナル抗体であって、そのＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子の機能をブロックする抗体（「アンタゴニスト抗体」）、またはその機能を増強／活性化する抗体（「アゴニスト抗体」）が含まれる。

【0135】

抗体は、その標的に、高いアビディティかつ高い特異性で結合できる。それらの抗体は、その抗体結合部位が、２つのタンパク質（例えば、ＰＤ－１とその標的リガンド）間の相互作用部位に近接すると、それらのタンパク質間の相互作用を立体的に阻害できる比較的大きい分子（約１５０ｋＤａ）である。本発明にはさらに、免疫チェックポイント分子リガンド結合部位のすぐ近くにあるエピトープに結合する抗体が含まれる。

【0136】

様々な実施形態では、本発明には、分子間相互作用（例えばタンパク質間相互作用）に干渉する抗体、及び分子内相互作用（例えば、分子内の立体構造の変化）を妨げる抗体が含まれる。抗体は、免疫チェックポイント分子の生物学的な活性をブロックするか、または増強／活性化する能力についてスクリーニングできる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも、従来の技法によって調製できる。

【0137】

例示的な一態様では、ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、ならびにＴＡＡまたはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドを用いて、ＴＡＡ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３もしくはＩＣＯＳに特異的に結合する抗体を調製できる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはナノボディ）、二価抗体断片（ダイアボディ）など）、ならびに組み換え及び合成によって作製したいずれかの結合パートナーが含まれるように意図されている。別の例示的な態様では、抗体は、免疫チェックポイント分子に、Ｋｄ約１０^７Ｍ^－１以上で結合する場合には、免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものと定義する。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技法、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄらが説明した技法（（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０）を用いて、容易に求めることができる。

【0138】

ポリクローナル抗体は、様々な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから、当該技術分野において周知である手順を用いて、容易に作製できる。概して、精製したＴＴＡもしくはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドであって、適切にコンジュゲートされているペプチドを宿主動物に、典型的には非経口注射によって投与する。ブースター免疫後、少量の血清試料を採取し、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのポリペプチドに対する反応性について試験する。このような測定に有用である各種アッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されているアッセイ、ならびに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットプロットアッセイ及びサンドイッチアッセイのような手順が挙げられる。米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号を参照されたい。

【0139】

モノクローナル抗体は、周知の手順を用いて、容易に調製できる。例えば、米国特許再発行特許第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、同第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｍ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）に記載されている手順を参照されたい。

【0140】

例えば、マウスのような宿主動物に、単離及び精製した免疫チェックポイント分子を少なくとも１回、好ましくは、約３週間の間隔で少なくとも２回、腹腔内注射できる。続いて、従来のドットプロット法または抗体捕捉（ＡＢＣ）によって、マウス血清をアッセイして、融合するにはどのマウスが最良かを判断する。約２～３週間後、そのマウスに、免疫チェックポイント分子の静脈内ブーストを行う。その後、マウスを殺処分し、確立されたプロトコールに従って、脾臓細胞を市販のミエローマ細胞（Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）など）と融合する。簡潔に述べると、ミエローマ細胞を培地中で数回洗浄し、１つのミエローマ細胞に対して約３個の脾臓細胞という比率で、マウス脾臓細胞に融合する。融合剤は、当該技術分野において用いられているいずれかの好適な融合剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができる。融合細胞を選択的に成長させる培地を含むプレートに、融合細胞を播種する。続いて、融合細胞を約８日間成長させることができる。得られたハイブリドーマの上清を回収し、最初にヤギ抗マウスＩｇでコーティングしたプレートに加える。洗浄後、標識免疫チェックポイント分子ポリペプチドのような標識を各ウェルに加えてから、インキュベートする。その後、陽性のウェルを検出することができる。陽性のクローンをバルク培養で成長させることができ、その後、上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製する。

【0141】

本発明のモノクローナル抗体は、Ａｌｔｉｎｇ－Ｍｅｅｓらの文献（（１９９０）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：１－９，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”）に記載されているような代替的な技法を用いて作製でき、この文献は、参照により、本明細書に援用される。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を導入するための組み換えＤＮＡ技法を用いて構築できる。このような技法は、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：３９４）に記載されている。

【0142】

従来の技法によって作製できる、このような抗体の抗原結合断片も、本発明に含まれる。このような断片の例としては、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限らない。遺伝子操作技法によって作製される抗体断片及び誘導体も提供する。

【0143】

本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ヒト化型のマウスモノクローナル抗体が含まれる。このようなヒト化抗体は、既知の技法によって調製でき、その抗体をヒトに投与したときに、免疫原性が低下するという利点をもたらすことができる。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）と、ヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位と、ヒト抗体に由来する可変領域断片（抗原結合部位が欠損している）を含むことができる。キメラ抗体、及びさらに操作されたモノクローナル抗体の作製手順としては、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎらの文献（（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３）、Ｌｉｕらの文献（（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３４３９）、Ｌａｒｒｉｃｋらの文献（（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４）、ならびにＷｉｎｔｅｒ及びＨａｒｒｉｓの文献（（１９９３）ＴＩＰＳ １４：１３９）に記載されている手順が挙げられる。抗体をトランスジェニックに作製する手順は、ＧＢ２，２７２，４４０、ならびに米国特許第５，５６９，８２５号及び同第５，５４５，８０６号に見ることができ、これらの特許はいずれも、参照により、本明細書に援用される。

【0144】

遺伝子操作法によって作製した抗体（ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体など）であって、標準的な組み換えＤＮＡ技法を用いて作製できる抗体を使用できる。このようなキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている標準的なＤＮＡ技法を用いる遺伝子操作によって、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際公開第ＷＯ８７／０２６７１号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願公開第０１８４１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．の欧州特許出願公開第０１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願公開第０１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願公開第０１２５０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２ ５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０に記載されている方法を用いて作製できる。

【0145】

合成及び半合成の抗体に関しては、そのような用語は、抗体断片、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（例えば、マウス－ヒト抗体、ヒト－マウス抗体）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、及び完全合成の抗体様分子（ただし、これらに限らない）を網羅するように意図されている。

【0146】

治療用途では、患者の、抗体に対する免疫応答を最小限にするために、ヒトの定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が好ましい場合が多い。このような抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物を免疫することよって作製できる。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７６４：５２５－５３５（１９９５）を参照されたい。

【0147】

ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子に対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製した、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを用いて、ＦａｂファージディスプレイライブラリーまたはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなコンビナトリアルな免疫グロブリンライブラリーを構築することによって調製することもできる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７、及びＧｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４を参照されたい。加えて、抗体可変領域のコンビナトリアルなライブラリーは、既知のヒト抗体を変異させることによって作製できる。例えば、ランダムに改変された変異誘発済みオリゴヌクレオチドを例えば用いることによって、免疫チェックポイント分子と結合することが知られているヒト抗体の可変領域を変異させて、変異可変領域のライブラリーを作製することができ、続いて、その免疫チェックポイント分子に結合するように、そのライブラリーをスクリーニングできる。免疫グロブリンの重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ領域内でランダム変異誘発を誘導する方法、ランダム化した重鎖及び軽鎖を掛け合わせて、対を形成する方法、ならびにスクリーニング方法は、例えば、Ｂａｒｂａｓらの国際公開第ＷＯ９６／０７７５４号、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４５７－４４６１に見ることができる。

【0148】

免疫グロブリンライブラリーは、ディスプレイパッケージの集団、好ましくは、繊維状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団によって発現させて、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーを作製する際に用いるのに特に適する方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇらの国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒらの国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒらの国際公開第ＷＯ９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄらの国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇらの国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄらの国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｌａｄｎｅｒらの国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０ １３７２、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１、Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ｓｕｐｒａ、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３５７６－３５８０、Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３－１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：４１３３－４１３７及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７９７８－７９８２に見ることができる。ディスプレイパッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面に提示させたら、その抗体ライブラリーをスクリーニングして、ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子と結合する抗体を発現するパッケージを特定及び単離する。

【0149】

組み換えＭＶＡ
本発明のより好ましい実施形態では、本発明で開示されている１つ以上のタンパク質及びヌクレオチドは、組み換えＭＶＡに含まれている。本開示によって説明及び例示されているように、様々な態様において、本開示の組み換えＭＶＡの静脈内投与により、がん患者における免疫応答の増強が誘導される。したがって、１つ以上の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているＴＡＡのうちの１つ以上をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0150】

本発明を実施する際に有用であるとともに、ブダペスト条約の規定下で寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）に、寄託番号ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７で、１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、及びＥＣＡＣＣ００１２０７０７で、２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５株であり、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、Ｖ０００８３００８という番号で寄託されたＭＶＡ－ＢＮ株及びその誘導体が、追加の例示的な株である。

【0151】

ＭＶＡ－ＢＮの「誘導体」とは、本明細書に記載されているようなＭＶＡ－ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの部分の１つ以上が異なるウイルスを指す。ＭＶＡ－ＢＮ及びその誘導体は、複製能力がなく、複製能力がないとは、インビボ及びインビトロで、増殖的に複製できないことを意味する。より具体的には、インビトロのＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖的に複製できるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：７６１－７７１）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ受託番号９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ受託番号８５１２０６０２）及びヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ－２）では増殖的に複製できないものとして説明されている。加えて、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株において、ウイルス増幅率が、ＭＶＡ－５７５の少なくとも２分の１、より好ましくは３分の１である。ＭＶＡ－ＢＮ及びその誘導体のこれらの特性に関する試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０（米国特許出願公開第２００３／０２０６９２６号）及びＷＯ０３／０４８１８４（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９９号）に記載されている。

【0152】

上の段落に記載されているように、インビトロで、ヒト細胞株において「増殖的に複製できない」または「増殖的複製能がない」という用語は、例えば、ＷＯ０２／４２４８０で説明されており、この特許には、上述のような所望の特性を有するＭＶＡを得る方法も教示されている。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを使用して、感染後４日でインビトロでウイルス増幅率が１未満であるウイルスに当てはまる。

【0153】

「生殖複製の失敗」という用語は、感染後４日で１未満という、前段落に記載されているような、インビトロでのヒト細胞株におけるウイルス増幅率を有するウイルスを指す。ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイは、ウイルス増幅率の決定に適用可能である。

【0154】

前の段落で説明したように、インビトロでのヒト細胞株におけるウイルスの増幅または複製は、通常、「増幅率」と呼ばれる、感染細胞から産生されたウイルス（出力）と、最初の位置で細胞に感染するために最初に使用された量（入力）との比率として表される。増幅率「１」は、感染細胞から産生されるウイルスの量が、細胞に感染するために最初に使用された量と同じである増幅状態を定義し、すなわち、感染細胞とはウイルスの感染及び再生を許容するということである。これに対して、増幅率が１未満であること、すなわち、侵入量よりも産生量が少ないことにより、増殖的に複製されていないこと、すなわち、ウイルスの減弱が示される。

【0155】

本明細書では、「アジュバント作用」とは、組み換えＭＶＡの特定のコードタンパク質または成分によって、その組み換えＭＶＡの他のコードタンパク質（複数可）または成分（複数可）がもたらす免疫応答が増大することであるように意図されている。

【0156】

発現カセット／制御配列様々な態様では、本明細書に記載されている１つ以上の核酸は、１つ以上の発現カセット内に組み込まれており、このカセットでは、その１つ以上の核酸が、発現制御配列に機能的に連結されている。「機能的に連結された」とは、記載されている構成要素が、意図した形式で機能可能になる関係にあること、例えば、プロモーターに、核酸を転写させて発現させるような関係にあることを意味する。コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、そのコード配列の発現が、その発現制御配列と適合する条件下で行われるように連結されている。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの初めにある開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及びフレーム内終止コドンが挙げられるが、これらに限らない。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期Ｉプロモーター、ならびに各種ポックスウイルスプロモーター（３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、ＰｒＨｙｂプロモーター、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ－４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター及びＰＲ１２３８プロモーターといったワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来のプロモーター及びＦＰＶ由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限らない）が挙げられるが、これらに限らない。追加のプロモーターは、ＷＯ２０１０／０６０６３２、ＷＯ２０１０／１０２８２２、ＷＯ２０１３／１８９６１１、ＷＯ２０１４／０６３８３２及びＷＯ２０１７／０２１７７６にさらに記載されており、これらの特許は、参照により、本明細書に全体が援用される。

【0157】

追加の発現制御配列としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに所望の宿主系において、所望の組み換えタンパク質（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸配列の適切な転写及びその後に行われる翻訳に必要ないずれかの他の配列が挙げられるが、これらに限らない。本発明のポックスウイルスベクターは、所望の宿主系において、核酸配列を含む発現ベクターの移入及びその後に行われる複製に必要な追加のエレメントも含んでよい。当業者はさらに、このようなベクターが、従来の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ｉｎ“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を用いて容易に構築されるとともに、市販されていることを理解するであろう。

【0158】

本発明の併用剤の投与方法及び投与レジメン
１つ以上の態様では、本発明の併用剤は、同種及び／または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与できる。図７に示されているデータによって部分的に示されているように、同種でのプライムブーストレジメンは、対象の特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答を増大させる。したがって、１つ以上の実施形態では、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるための併用剤及び／または方法であって、そのがん患者に、本開示の併用剤を投与することを含み、その併用剤を同種または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与する併用剤及び／または方法が存在する。

【0159】

導入遺伝子を含む組み換えＭＶＡウイルスの作製
本発明で提供する組み換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において知られている常法によって作製できる。組み換えポックスウイルスを得るか、または外来のコード配列をポックスウイルスゲノムに挿入するための方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡの単離、ＲＮＡの単離、ウエスタンブロット解析、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅技法のような標準的な分子生物学的技法の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載されており、ウイルスの取扱い及び操作の技法は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｈｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））に記載されている。同様に、ＭＶＡの取扱い、操作及び遺伝子組み換えの技法及びノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｅｌｌｉｏｔｔ（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）（例えば、“Ｃｈａｐｔｅｒ ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ”を参照されたい）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ：“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ”を参照されたい））に記載されている。

【0160】

本発明で開示されている様々な組み換えＭＶＡウイルスの作製には、様々な方法を適用可能である場合がある。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物に配置されてもよい。これとは別に、挿入するＤＮＡ配列は、プロモーターにライゲーションできる。このプロモーター－遺伝子連結体をプラスミドコンストラクト内に配置して、そのプロモーター－遺伝子連結体の両端が、非必須の座位を含むポックスウイルスＤＮＡ領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡと隣接するようにできる。得られたプラスミドコンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内で増殖させることによって増幅して、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドを、培養物がＭＶＡウイルスに感染すると同時に、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にトランスフェクトしてもよい。プラスミド内の相同ＭＶＡウイルスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列の存在によって修飾されたポックスウイルスを生成し得る。

【0161】

好ましい実施形態によれば、細胞の好適な細胞培養物、例えばＣＥＦ細胞にＭＶＡウイルスを感染させることができる。続いて、感染した細胞に、本開示で提供される１つ以上の核酸などの外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第１のプラスミドベクターをトランスフェクトしてもよい（好ましくは、ポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で）。上で説明したように、そのプラスミドベクターは、そのＭＶＡウイルスゲノムの所定部分への外来配列の挿入を誘導できる配列も含む。任意に、そのプラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに機能的に連結されたマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含むカセットも含む。好適なマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ネオマイシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはその他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットの使用により、作製した組み換えポックスウイルスの特定及び単離が簡略になる。ただし、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても識別され得る。その後、上記のようにして得た組み換えポックスウイルスを、さらなる細胞に感染させて、その細胞に、第２の外来遺伝子または異種の遺伝子を１つまたは複数含む第２のベクターをトランスフェクションすることができる。念のため、この遺伝子は、そのポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入するべきであり、その第２のベクターにおいても、そのポックスウイルスと相同な配列であって、そのポックスウイルスのゲノムへの１つまたは複数の第２の外来遺伝子の組み込みを誘導する配列が異なる。相同組み換えが行われた後、外来遺伝子または異種遺伝子を２つ以上含む組み換えウイルスを単離できる。追加の外来遺伝子をその組み換えウイルスに導入するには、前の感染工程で単離した組み換えウイルスを用いることによって、かつトランスフェクション用のさらなる外来遺伝子を１つまたは複数含むさらなるベクターを用いることによって、感染及びトランスフェクションの工程を繰り返すことができる。

【0162】

あるいは、上記のような、感染及びトランスフェクションの工程は、置き換えることが可能であり、すなわち、まず、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによって、好適な細胞にトランスフェクションしてから、その細胞にポックスウイルスを感染させることができる。さらなる代替策として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、得られたすべての組み換えウイルスを細胞に共感染させ、すべての外来遺伝子を含む組み換え体についてスクリーニングすることも可能である。第３の代替策は、ＤＮＡゲノムと外来配列をインビトロでライゲーションし、ヘルパーウイルスを用いて、組み換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムを再構築することである。第４の代替策は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の細菌種において、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたＭＶＡウイルスゲノムと、そのＭＶＡウイルスゲノム内の所望の組み込み部位に隣接する配列と相同なＤＮＡ配列に挟まれた線状外来配列との間で相同組み換えを起こすことである。

【0163】

本開示の核酸の１つ以上は、ＭＶＡウイルスまたはＭＶＡウイルスベクターの好適ないずれかの部分に挿入し得る。そのＭＶＡウイルスの好適な部分は、ＭＶＡゲノムの非必須部分である。そのＭＶＡゲノムの非必須部分は、そのＭＶＡゲノムの遺伝子間領域または既知の欠失部位１～６であってよい。この代わりに、またはこれに加えて、その組み換えＭＶＡの非必須部分は、ＭＶＡゲノムのコード領域のうち、ウイルスの成長には必須ではないコード領域であることができる。しかしながら、その挿入部位は、ＭＶＡゲノム内のこれらの好ましい挿入部位に限定されない。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）のような少なくとも１つの細胞培養系において増幅及び増殖できる組み換え体を得ることが可能な限りは、そのウイルスゲノムのいずれの位置にも、本発明の核酸（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、ＰＲＡＭＥ、ＦＯＬＲ１、ＣＤ４０Ｌ及び／または４－１ＢＢＬ）、ならびに本明細書に記載されているようないずれかの付随のプロモーターを挿入し得ることは、本発明の範囲内であるからである。

【0164】

好ましくは、本発明の核酸は、そのＭＶＡウイルスの遺伝子間領域（ＩＧＲ）の１つ以上に挿入してよい。「遺伝子間領域」という用語は好ましくは、そのＭＶＡウイルスゲノムの隣接する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間、好ましくは、そのＭＶＡウイルスゲノムの２つの必須ＯＲＦの間に位置するウイルスゲノム部分を指す。ＭＶＡにおいては、特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７及びＩＧＲ１４８／１４９から選択する。

【0165】

これに加えてまたはこの代わりに、ＭＶＡウイルスでは、ヌクレオチド配列は、そのＭＶＡゲノムの既知の欠失部位、すなわち、欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのうちの１つ以上に挿入し得る。「既知の欠失部位」という用語は、ＣＥＦ細胞での連続継代を通じて欠失したＭＶＡゲノム部分を指し、この部分は、５１６代目の継代時に、そのＭＶＡの由来元である親ウイルス、特には、例えばＭｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌらの文献（（２００７）Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９－３２５９）に記載されているような親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）のゲノムと比べて特徴付けられたものである。

【0166】

ワクチン
特定の実施形態では、本開示の組み換えＭＶＡは、ワクチンの一部として配合できる。ワクチンの調製の際には、そのＭＶＡウイルスを生理学的に許容可能な形態に変換できる。

【0167】

例示的な調製法は、以下のとおりである。精製ウイルスを５×１０^８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に配合した状態で、－８０℃で保存する。ワクチン注射剤の調製の際には、例えば、１×１０^８～１×１０^９個のウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２％のペプトン及び１％のヒトアルブミンの存在下で、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で凍結乾燥できる。あるいは、ワクチン注射剤は、ウイルスを調合物中で段階凍結乾燥することによって調製できる。特定の実施形態では、その調合物は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドンのような追加の添加剤、またはインビボ投与に適する抗酸化剤、不活性ガス、安定剤、もしくは組み換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含む（ただし、これらに限らない）その他の添加剤を含む。続いて、そのアンプルを密閉し、好適な温度、例えば４℃～室温で、数カ月保存することができる。しかしながら、必要がない限りは、そのアンプルは、好ましくは－２０℃未満、最も好ましくは約－８０℃の温度で保存する。

【0168】

ワクチン接種または療法を伴う様々な実施形態では、その凍結乾燥体は、０．１～０．５ｍｌの水溶液、好ましくは、生理食塩水、または１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．７）のようなトリス緩衝液に溶解する。本開示の組み換えＭＶＡ、ワクチンまたは医薬組成物は、溶液において、１０^４ ～１０^１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０^５～５×１０^９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０^６～５×１０^９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたは１０^７～５×１０^９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲で配合できることが想定されている。ヒトに対して好ましい用量には、１０^６～１０^１０ ＴＣＩＤ５０が含まれ、１０^６ ＴＣＩＤ５０、１０^７ ＴＣＩＤ５０、１０^８ ＴＣＩＤ５０、５×１０^８ ＴＣＩＤ５０、１０^９ ＴＣＩＤ５０、５×１０^９ ＴＣＩＤ５０または１０^１０ ＴＣＩＤ５０という用量が含まれる。投与用量及び投与数の最適化は、当業者の技術及び知見の範囲内である。

【0169】

１つ以上の好ましい実施形態では、本明細書に定められているように、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に静脈内投与する。他の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に腫瘍内投与する。他の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に静脈内投与及び腫瘍内投与の両方を同時または異なる時点に行う。

【0170】

追加の実施形態では、本発明の免疫チェックポイントアンタゴニストもしくは免疫チェックポイントアゴニスト、または好ましくは抗体は、全身投与または局所投与、すなわち、腹腔内経路、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮内経路または熟練施術者に知られているいずれかの他の投与経路によって投与できる。

【0171】

キット、組成物及び使用方法
様々な実施形態では、本発明には、ａ）本明細書に記載されている核酸を含む組み換えＭＶＡ、及び／またはｂ）本明細書に記載されている１つ以上の抗体を含むキット、併用医薬、医薬組成物及び／または免疫原性併用剤が含まれる。

【0172】

そのキット及び／または組成物は、本開示の組み換えポックスウイルスの入った１つまたは複数の容器またはバイアル、本開示の抗体の入った１つ以上の容器またはバイアルを、その組み換えＭＶＡ及び抗体の投与に関する説明とともに含むことができることが想定されている。より具体的な実施形態では、そのキットは、最初のプライミング投与で、その組み換えＭＶＡ及び抗体を投与してから、その後に、その組み換えＭＶＡ及び抗体のブースティング投与を１回以上行うことについての説明を含むことができることが想定されている。

【0173】

本発明で提供するキット及び／または組成物は概して、薬学的に許容可能であり及び／または認可された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、希釈剤及び／または安定剤を１つ以上含んでよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであることができる。好適な担体は典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などのようなゆっくり代謝される大きな分子である。

【0174】

特定の例示的な実施形態
実施形態１は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、その対象のそのがん性腫瘍における炎症応答が増強され、腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法である。

【0175】

実施形態２は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に静脈内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを静脈内投与すると、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内注射する場合と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、そのＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される方法である。

【0176】

実施形態３は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に投与することを含み、その組み換えＭＶＡを投与すると、組み換えＭＶＡ及び抗原４－１ＢＢＬを単独で投与する場合と比べて、その対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法である。

【0177】

実施形態４は、対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法であって、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、異種の腫瘍関連抗原及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比べて、その腫瘍における炎症応答が増強される方法である。このような炎症応答の増強は、本明細書の別の箇所で論じられており、その増強としては例えば、ＮＫ細胞及びＴ細胞の誘導を挙げることができる。

【0178】

実施形態５は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、内在性レトロウイルス抗原（ＥＲＶ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に投与することを含み、その組み換えＭＶＡを投与すると、組み換えＭＶＡ及び抗原４－１ＢＢＬを単独で投与する場合と比べて、その対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法である。

【0179】

実施形態６は、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法であって、その対象がヒトである方法である。

【0180】

実施形態７は、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である方法である。

【0181】

実施形態８は、実施形態７に記載の方法であって、そのＥＲＶが、腫瘍細胞で発現するＥＲＶタンパク質である方法である。

【0182】

実施形態９は、実施形態７～８のいずれか１つに記載の方法であって、そのＥＲＶが、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する方法である。

【0183】

実施形態１０は、実施形態９に記載の方法であって、そのＨＥＲＶ－Ｋタンパク質が、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌタンパク質から選択されている方法である。

【0184】

実施形態１１は、実施形態９に記載の方法であって、そのＨＥＲＶ－Ｋタンパク質が、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌタンパク質及びそれらの免疫原性断片から選択されている方法である。

【0185】

実施形態１２は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている方法である。

【0186】

実施形態１３は、実施形態１～６及び１２のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）及びムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）からなる群から選択されている方法である。

【0187】

実施形態１４は、実施形態１～６、及び１２のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、ＰＡＰまたはＰＳＡからなる群から選択されている方法である。

【0188】

実施形態１５は、実施形態１～６、１２及び１４のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、ＰＳＡである方法である。

【0189】

実施形態１６は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８、ＦＬＩＣＥとしても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥ－ファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ－１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、サイモシン－β－１５、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、ＴＰ１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙからなる群、ならびにこれらを組み合わせたものから選択されている方法である。

【0190】

実施形態１７は、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法であって、その組み換えＭＶＡが、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸をさらに含む方法である。

【0191】

実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法であって、少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストをその対象に投与することをさらに含む方法である。

【0192】

実施形態１９は、実施形態１８に記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳから選択されている方法である。

【0193】

実施形態２０は、実施形態１８～１９のいずれか１つに記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１である方法である。

【0194】

実施形態２１は、実施形態２０に記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＬＡＧ－３をさらに含む方法である。

【0195】

実施形態２２は、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、抗体を含む方法である。

【0196】

実施形態２３は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法であって、第２のＴＡＡに特異的な抗体をその対象に投与することをさらに含む方法である。

【0197】

実施形態２４は、実施形態２３に記載の方法であって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的である方法である。

【0198】

実施形態２５は、実施形態２３に記載の方法であって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む方法である。

【0199】

実施形態２６は、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法で用いる医薬組成物である。

【0200】

実施形態２７は、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法で用いるワクチンである。

【0201】

実施形態２８は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡである。

【0202】

実施形態２９は、実施形態２８に記載の組み換えＭＶＡであって、そのＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である組み換えＭＶＡである。

【0203】

実施形態３０は、実施形態２９に記載の組み換えＭＶＡであって、そのＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する。

【0204】

実施形態３１は、実施形態３０に記載の組み換えＭＶＡであって、そのレトロウイルスタンパク質Ｋが、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌタンパク質から選択されている組み換えＭＶＡである。

【0205】

実施形態３２は、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡであって、ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸をさらに含む組み換えＭＶＡである。

【0206】

実施形態３３は、ａ）実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストとを含む併用医薬である。

【0207】

実施形態３４は、実施形態３３に記載の併用医薬であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳから選択されている併用医薬である。

【0208】

実施形態３５は、実施形態３４に記載の併用医薬であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１である併用医薬である。

【0209】

実施形態３６は、実施形態３５に記載の併用医薬であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＬＡＧ－３をさらに含む併用医薬である。

【0210】

実施形態３７は、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の併用医薬であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、抗体を含む併用医薬である。

【0211】

実施形態３８は、ａ）実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡと、ｂ）第２のＴＡＡに特異的な抗体とを含む併用医薬である。

【0212】

実施形態３９は、実施形態３８に記載の併用医薬であって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的である併用医薬である。

【0213】

実施形態４０は、実施形態３９に記載の併用医薬であって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む併用医薬である。

【0214】

実施形態４１は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させるのに用いるものである。

【0215】

実施形態４２は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法で用いるものであり、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬をその対象に腫瘍内投与することを含み、その腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、その対象のそのがん性腫瘍における炎症応答が増強され、腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。

【0216】

実施形態４３は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法で用いるものであり、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬をその対象に静脈内投与することを含み、その静脈内投与により、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内投与する場合と比べて、その対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。

【0217】

実施形態４４は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がんである対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法で用いるものであり、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬をその対象に腫瘍内投与することを含み、その腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、その対象のがん性腫瘍における炎症応答が増強されるものである。

【0218】

実施形態４５は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、対象のがんを治療する方法で用いるものである。

【0219】

実施形態４６は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がんを治療する方法で用いるものであり、そのがんが、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、尿路上皮、子宮頸部または結腸直腸癌からなる群から選択されているものである。

【0220】

実施形態４７は、実施形態４４に記載の組み換えＭＶＡであって、その炎症応答の増強が、その腫瘍に局在化する組み換えＭＶＡである。

【0221】

実施形態４８は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に腫瘍内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、その対象のそのがん性腫瘍における炎症応答が増強され、腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法である。

【0222】

実施形態４９は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に静脈内投与することを含み、その組み換えＭＶＡを静脈内投与すると、ＴＡＡ及び抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内注射する場合と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、そのＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される方法である。

【0223】

実施形態５０は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に投与することを含み、その組み換えＭＶＡを投与すると、組み換えＭＶＡ及び抗原ＣＤ４０Ｌを単独で投与する場合と比べて、その対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する方法である。

【0224】

実施形態５１は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法で用いるものであり、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬をその対象に静脈内投与及び／または腫瘍内投与することを含み、前記静脈内投与及び／または腫瘍内投与により、１）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、２）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、または３）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの群から選択したいずれかのＭＶＡを非静脈内または非腫瘍内投与する場合と比べて、その対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。

【0225】

実施形態５２は、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬であって、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法で用いるものであり、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の併用医薬をその対象に静脈内投与及び腫瘍内投与することを含み、前記静脈内投与及び腫瘍内投与により、１）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、２）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、または３）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの群から選択したいずれかのＭＶＡを非静脈内投与または非腫瘍内投与する場合と比べて、その対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。前記静脈内投与及び腫瘍内投与は、当業者には明らかなように、同時または異なる時点に行うことができる。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、前記方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に腫瘍内投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比べて、前記がん性腫瘍における炎症応答が増強され、前記対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する前記方法。
２．がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、前記方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に静脈内投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを静脈内投与すると、ＴＡＡ及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非静脈内注射する場合と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、前記ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される前記方法。
３．がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、前記方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含む前記対象に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを投与すると、組み換えＭＶＡ及び抗原４－１ＢＢＬを単独で投与する場合と比べて、前記対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する前記方法。
４．対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法であって、前記方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に腫瘍内投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、異種の腫瘍関連抗原及び抗原４－１ＢＢＬをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比べて、前記腫瘍における炎症応答が増強される前記方法。
５．前記対象が、ヒトである、上記１に記載の方法。
６．前記ＴＡＡが、腫瘍細胞で発現する内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である、上記１に記載の方法。
７．前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択されている、上記６に記載の方法。
８．前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＰＲＡＭＥ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、ｐ１５、ＭＥＬ及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている、上記１に記載の方法。
９．がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、前記方法が、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを投与すると、組み換えＭＶＡ及び抗原４－１ＢＢＬを単独で投与する場合と比べて、前記対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する前記方法。
１０．前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリー由来である、上記９に記載の方法。
１１．前記レトロウイルスタンパク質Ｋが、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇタンパク質から選択されている、上記１０に記載の方法。
１２．前記組み換えＭＶＡが、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸をさらに含む、上記１に記載の方法。
１３．少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストを前記対象に投与することをさらに含む、上記１に記載の方法。
１４．前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアンタゴニストまたはアゴニストから選択される、上記１３に記載の方法。
１５．前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、抗体である、上記１４に記載の方法。
１６．がんの治療で用いる組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含み、前記組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、前記組み換えＭＶＡを非腫瘍内注射する場合と比べて、そのヒト患者のがん性腫瘍における炎症応答が増強され、前記がん性腫瘍のサイズが縮小し、及び／または全生存率が上昇する前記組み換えＭＶＡ。
１７．ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸をさらに含む、上記１６に記載の用途用の組み換えＭＶＡ。
１８．前記ＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である、上記１６に記載の用途用の組み換えＭＶＡ。
１９．前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇから選択されている、上記１８に記載の用途用の組み換えＭＶＡ。
２０．前記ＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、ｐ１５、ＭＥＬ及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている、上記１６に記載の用途用の組み換えＭＶＡ。
２１．がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、（ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む前記組み換えＭＶＡ。
２２．前記ＴＡＡが、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーのＥＲＶタンパク質である、上記２１に記載の組み換えＭＶＡ。
２３．前記ＥＲＶタンパク質が、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択されている、上記２２に記載の組み換えＭＶＡ。
２４．ｃ）ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸をさらに含む、上記２３に記載の組み換えＭＶＡ。
２５．（ａ）上記２４に記載の組み換えＭＶＡと、（ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストとを含む併用医薬。
２６．前記免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは前記免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアンタゴニストまたはアゴニストから選択されている、上記２５に記載の併用医薬。
２７．がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を上昇させる方法であって、前記方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを投与すると、組み換えＭＶＡ、抗原４－１ＢＢＬ及び抗原ＣＤ４０Ｌを単独で投与する場合と比べて、前記対象の腫瘍の縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する前記方法。
２８．対象のがん性腫瘍における炎症応答の増強を誘導する方法であって、前記方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に腫瘍内投与することを含み、前記組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、異種の腫瘍関連抗原をコードする第１の核酸と、抗原４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、抗原ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比べて、前記腫瘍における炎症応答が増強される前記方法。
２９．前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に静脈内投与することを含む、上記２７に記載の方法。
３０．前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に腫瘍内投与することを含む、上記２７に記載の方法。
３１．前記組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に静脈内投与及び腫瘍内投与することを含む、上記２７に記載の方法。
３２．前記静脈内投与と前記腫瘍内投与とを異なる時点に行う、上記３１に記載の方法。

【実施例】

【0226】

下記の実施例には、本発明が例示されているが、実施例は、いかなる場合も、請求項の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

【0227】

実施例１：組み換えＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ＴＡＡ－ＣＤ４０Ｌの構築
本発明の要素を実現させる組み換えＭＶＡウイルスの作製は、示されている導入遺伝子を、それらのプロモーターとともにベクターＭＶＡ－ＢＮに挿入することによって行った。導入遺伝子及び選択カセットと、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的座位と相同な配列とを含む組み換えプラスミドを用いて、導入遺伝子を挿入した。ＭＶＡ－ＢＮに感染させたＣＥＦ細胞に、その組み換えプラスミドをトランスフェクションすることによって、そのウイルスゲノムとその組み換えプラスミドとの間の相同組み換えを生じさせた。続いて、その選択カセットを挟み込んでいるｌｏｘＰ部位を特異的に標的とし、それにより、その介在配列を切除するＣＲＥ－リコンビナーゼを発現するプラスミドの助けにより、第２の工程中に、その選択カセットを欠失させた。

【0228】

ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＯＶＡまたはＯＶＡ及び４－１ＢＢＬ（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。

【0229】

ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌの構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＯＶＡ及びＣＤ４０Ｌ（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。

【0230】

ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの構築の際には、組み換えプラスミドには、２つの導入遺伝子ｇｐ７０及び４－１ＢＢＬ（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）と、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を含めた。同様に、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌの構築の際には、組み換えプラスミドには、２つの導入遺伝子ｇｐ７０及びＣＤ４０Ｌ（それぞれ、その前にはプロモーター配列を配置した）を含め、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１－ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの構築が所望されるときには、その組み換えプラスミドに適切な変更を加える。

【0231】

ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋの構築の際には、組み換えプラスミドに、導入遺伝子ＨＥＲＶ－Ｋを含め、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬの構築の際には、組み換えプラスミドに、導入遺伝子ＨＥＲＶ－Ｋ及び４－１ＢＢＬを含め、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの構築の際には、組み換えプラスミドに、導入遺伝子ＨＥＲＶ－Ｋ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌを含めた。各導入遺伝子または導入遺伝子群の前に、プロモーター配列を配置するとともに、そのウイルスゲノムに相同組み換えが生じるように、ＭＶＡ－ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を配置した。

【0232】

上記のｍＢＮ ＭＶＡの作製の際には、ＣＥＦ細胞培養物にそれぞれ、ＭＶＡ－ＢＮを接種し、それぞれ、対応する組み換えプラスミドをトランスフェクションした。次に、選択圧をかける薬剤を含む培地中のＣＥＦ培養物に、これらの細胞培養物から得た試料を接種し、蛍光を発現しているウイルスクローンをプラーク精製によって単離した。蛍光タンパク質を含む選択カセットをこれらのウイルスクローンから欠失させるのには、第２の工程において、ＣＲＥを介した組み換え（各コンストラクトにおいて、その選択カセットを挟み込んでいる２つのｌｏｘＰ部位を伴う）を介在させた。その第２の組み換え工程後、ＭＶＡ－ＢＮの標的座位内にプロモーターが挿入された状態で、導入遺伝子配列のみ（例えば、ＯＶＡ、４－１ＢＢＬ、ｇｐ７０、ＨＥＲＶ－Ｋ及び／またはＣＤ４０Ｌ）が保持された。選択カセットが欠失したプラーク精製済みウイルスのストックを調製した。

【0233】

記載されているコンストラクトを接種した細胞で、その所定の導入遺伝子の発現を証明する。

【0234】

本明細書に記載されているコンストラクトの作製は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）でクローン型のＭＶＡ－ＢＮを用いることによって行った。組み換えプラスミドには、それぞれプロモーターの下流に、記載されている導入遺伝子配列を含めた。ＭＶＡにも存在することにより、組み込み部位の特異的な標的化を可能にする配列をそれらのプラスミドに含めた。簡潔に述べると、ＢＡＣ ＤＮＡをＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクションし、それらの細胞に、ヘルパーウイルスとしてのショープ線維腫ウイルスを重感染させることによって、感染性ウイルスをＢＡＣから再構築した。ＣＥＦ細胞培養液で３代追加継代した後、ヘルパーウイルスを含まない状態のコンストラクトを得た。例示的なＭＶＡ作製法は、Ｂａｕｒらの文献（（２０１０）Ｖｉｒｏｌ．８４：８７４３－５２，“Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｂｒｅａｋｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｖｅｃｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ８Ｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”）にも見られる。

【0235】

実施例２：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞によって、ＣＤ８ Ｔ細胞を４－１ＢＢＬの媒介により共刺激すると、ＤＣの必要性なしに、サイトカインの産生に影響が及ぶ
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後、樹状細胞（ＤＣ）を作製した。Ｂ１６．Ｆ１０（メラノーマモデル）細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬをＭＯＩ１０で感染させ、一晩、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。その翌日、感染した腫瘍細胞を回収し、指示されている場合には、１：１の比率のＤＣの存在下で４時間、３７℃、５％ＣＯ２で共培養した。ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。続いて、Ｌｕｍｉｎｅｘによってサイトカイン濃度を解析するために、培養上清を採取した。結果は、図１に、ＩＬ－６（図１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図１Ｂ）、ＩＬ－２（図１Ｃ）及びＩＦＮ－γ（図１Ｄ）の上清濃度として示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【0236】

以前報告された内容と一致して、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌは、ＤＣの活性化と、その抗原提示能に大きな影響を及ぼした。すなわち、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染したＦＬＤＣによって、大量のＩＬ－６が産生された（図１Ａ）。重要なことに、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答は、ＤＣの存在下の場合のみ誘導でき、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染させたＢ１６．Ｆ１０細胞自体によって直接は誘導できなかった（図１Ｂ及び１Ｃ）。これらの結果から、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌの効果を得るには、ＤＣが明らかに必要であることが示されている。これに対して、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによっては、ＤＣにおけるＩＬ－６の産生は誘導されなかったが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染したＢ１６．Ｆ１０細胞では、Ｔ細胞活性化サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＧＭ－ＣＳＦの分泌が、ＤＣに依存せずに誘導された（図１Ａ～１Ｄ）。

【0237】

実施例３：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞は直接（すなわち、ＤＣの必要性なしに）、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の、活性化エフェクターＴ細胞への分化を促す
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後、樹状細胞（ＤＣ）を作製した。Ｂ１６．Ｆ１０（メラノーマモデル）細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬをＭＯＩ１０で感染させ、一晩、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。その翌日、感染した腫瘍細胞を回収し、指示されている場合には、１：１の比率のＤＣの存在下で４時間、３７℃、５％ＣＯ２で共培養した。その一方で、ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。続いて、細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。結果は、図２に、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＴ－ｂｅｔのＧＭＦＩ（図２Ａ）、及びＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４＋ グランザイムＢ＋ ＩＦＮ－γ＋ ＴＮＦα＋のパーセンテージ（図２Ｂ）として示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【0238】

その結果から、クロスプレゼンテーションするＤＣの非存在下では、グランザイムＢ＋及びＩＦＮγ＋の細胞傷害性エフェクターＴ細胞の誘導は、４－１ＢＢＬに依存していたことが示されている（図２Ｂ）。図１に示されている結果と併せると、これらの知見により、ＭＶＡによってコードされる４－１ＢＢＬは、ＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌ（ＤＣの活性化を介して作用する）とは対照的に、ＤＣに依存せずに、Ｔ細胞に直接作用することが示されている。

【0239】

実施例４：ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかをコードするＭＶＡに感染させると、腫瘍細胞株及びマクロファージにおける腫瘍細胞死が誘導される
腫瘍細胞株Ｂ１６．ＯＶＡ（図３Ａ及び３Ｂ）、ＭＣ３８（図３Ｃ）ならびにＢ１６．Ｆ１０（図３Ｄ）を、示されているＭＯＩで、２０時間感染させた。続いて、細胞の生存率について、フローサイトメトリーによって解析した。図３Ａの試料における血清ＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡによって定量した（図３Ｂ）。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、示されているＭＯＩで、２０時間感染させた。続いて、細胞の生存率について、フローサイトメトリーによって解析した。結果は、図３Ａ～３Ｅに示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【0240】

図３Ａ及び３Ｂに示されているように、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染させたところ、ＰＢＳで処置した腫瘍細胞と比べて、細胞死が中程度に誘導された。興味深いことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬへの感染により、感染から１８時間後、腫瘍細胞死が有意に増強された。

【0241】

我々は、これらの結果を非抗原性細胞株でさらに確認するために、ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ（いずれも、ＴＡＡをコードさせなかった）に感染させたＭＣ３８腫瘍細胞（図３Ｃ）及びＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞（図３Ｄ）を用いて、同様のアッセイを行った。一貫して、上記の腫瘍細胞株において、上記のＭＶＡへの感染により、細胞死が誘導され、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）が効率的に死滅した（図３Ｅ）。勘案すると、これらのデータから、ＭＶＡへの感染により、腫瘍細胞及びマクロファージが死滅し、この死滅は、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬを組み換えＭＶＡによって発現させると増加することが示された。

【0242】

腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に感染させると、いわゆる免疫原性細胞死（ＩＣＤ）が誘導される（Ｗｏｒｋｅｎｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：２５１－５６）。ＩＣＤは、免疫系に対してアラーミンとして作用して、抗原提示を増強させることによって、抗腫瘍免疫を誘導するカルレティキュリン、ＡＴＰまたはＨＭＧＢ１のような細胞内タンパク質の放出を含む。我々は、分泌ＨＭＧＢ１によって、ＭＶＡに感染させると、ＩＣＤが誘導されるかを調べた。我々は、予想外にも、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌでは、ＭＶＡ－ＯＶＡと比べて、ＨＭＧＢ１の有意な増加が誘導されたことを見出した（図３Ｂ）。

【0243】

実施例５：４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡは、インビボで、ＮＫ細胞の活性化を誘導する
生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図４では「ｒＭＶＡ」）、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図４では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）もしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡを２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせたもののいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を静脈内免疫した。２４時間後、マウスを殺処分し、フローサイトメトリー解析のために、脾臓を処理した。結果は、図４Ａ及び図４Ｂに示されている。ＣＤ６９（図４Ａ）及びＣＤ７０（図４Ｂ）の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）が示されている。データは、平均±標準誤差として示されており、２回の独立した実験を表すものである。

【0244】

その結果から、４－１ＢＢＬをＭＶＡ－ＯＶＡに加えることによって、４－１ＢＢＬをコードしないＭＶＡ－ＯＶＡをＩＶ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞応答の質が増強され、ＮＫ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９及びＣＤ７０の両方が、ＭＶＡ－ＯＶＡの場合と比べて、著しくアップレギュレートしたことが示されている（図４Ａ及びＢ）。４－１ＢＢＬブロッキング抗体を同時注射したところ、ＭＶＡ－ＯＶＡによって誘導される、ＮＫ細胞の活性化は、４－１ＢＢＬにまったく依存していないが、過剰な４－１ＢＢＬシグナルをＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって送達すると増強できたことが示された。

【0245】

実施例６：４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡで静脈内免疫すると、インビボにおいて、血清ＩＦＮ－γの分泌が促進される
生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）もしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡを２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせたもののいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を静脈内免疫した。結果は、図５Ａ及び５Ｂに示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。図５Ａ：６時間後に、マウスから採血を行い、血清を全血から単離し、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって求めた。図５Ｂ：３時間後、２１時間後及び４５時間後に、マウスにブレフェルジンＡを静脈内注射して、タンパク質の分泌を停止した。免疫から６時間後、２４時間後、及び４８時間後にマウスを殺処分し、脾細胞をフローサイトメトリーによって解析した。

【0246】

４－１ＢＢによって媒介された、ＮＫ細胞の活性化は、ＮＫエフェクターサイトカインＩＦＮγｒの血清レベルの上昇と整合していた（図５Ａ）。ＮＫ細胞は、活性化すると、大量のＩＦＮ－γを産生することが知られている。血清中のＩＦＮ－γレベルの上昇が、ＮＫ細胞に由来したものであり得るかを判断するために、示されている組み換えＭＶＡベクターを静脈内注射した後、様々な時点に、ＩＦＮ－γを産生するＮＫ細胞の割合を求めた。注射から６時間後、測定されたＩＦＮ－γ血清中レベルが高かった時に、ＩＦＮ－γ＋ ＮＫ細胞のパーセンテージが最も高くなり、その後、ゆっくり低下した（図５Ｂ）。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを用いたときに、ＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞の出現頻度が最も高いことが観察された。勘案すると、これらのデータから、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬの静脈内免疫により、ＮＫ細胞が強力に活性化され、ＮＫ細胞エフェクターサイトカインＩＦＮ－γの産生が増加することが示されている。

【0247】

実施例７：Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスにおいて、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬで静脈内免疫すると、血清ＩＦＮ－γの分泌が促進される
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）をｉ．ｖ．（静脈内）投与した。６時間後に、マウスから採血を行い、血清を全血から単離し、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって求めた。結果は、図６に示されている。データは、平均±標準誤差として示されている。

【0248】

図６に示されているデータから、ＮＫ細胞に対して、他の実験で報告されている作用と同様の作用をメラノーマ腫瘍モデルでも得ることができたことが示されている。免疫から６時間後、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫した腫瘍担持マウスの方が、血清ＩＦＮ－γレベルの上昇が大きかったことから、ＮＫ細胞の顕著な活性化が示された（図６）。

【0249】

実施例８：ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬでの静脈内プライム免疫及び静脈内ブースト免疫によって、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びベクター特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加が増強される
図７Ａ～７Ｄに、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬでの静脈内プライム免疫後及び静脈内ブースト免疫後の抗原特異的及びベクター特異的が示されている。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４匹／群）に、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡ（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）もしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡを２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせたもののいずれかで、静脈内プライム免疫を０日目に行い、４１日目にブースト免疫を行った。プライム免疫後、６日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６４日目に、マウスから採血を行い、末梢血のフローサイトメトリー解析を行った。プライム免疫後、７０日目に、マウスを殺処分した。脾臓を摘出し、フローサイトメトリー解析を行った。

【0250】

結果は、図７Ａ～７Ｄに示されている。図７Ａは、末梢血白血球（ＰＢＬ）のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示しており、図７Ｂは、ＰＢＬのうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。図７Ｃは、生細胞のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。図７Ｄは、生細胞のうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。データは、平均±標準誤差として示されている。

【0251】

その結果から、１回目の免疫後、７日目に、Ｂ８特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が最大数に達し、２回目の免疫後、４１日目にさらに増加したことが示されている（図７Ａ及びＢ）。４１日目の時点に、抗原特異的Ｔ細胞応答という点で、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬの効果は、Ｂ８及びＯＶＡのいずれでも、ｒＭＶＡと比べて明らかであった。興味深いことに、４－１ＢＢＬブロッキング抗体を同時注射したところ、ｒＭＶＡによって誘導されるＴ細胞応答は、４－１ＢＢＬにまったく依存していないが、過剰な４－１ＢＢＬシグナルをＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって送達すると増強できたことが示された（図７Ａ及びＢ）。これらの結果と一致して、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬでのプライム／ブースト免疫により、脾臓においても、１回目の免疫から７０日後に、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答及びＢ８特異的Ｔ細胞応答が改善した（図７Ｃ及びＤ）。

【0252】

実施例９：ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射による、抗腫瘍作用の増大
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図８に示されているように、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスを静脈内投与したところ、腫瘍の成長遅延が長期化することにより、ＭＶＡまたはコントロール（ＰＢＳ）と比べて、腫瘍体積が縮小した。

【0253】

実施例１０：４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射による、抗腫瘍作用の増強
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、１２日目及び１５日目（灰色の破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図９Ａ～９Ｄに示されているように、ＴＡＡと、４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬのいずれかとをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射によって、抗腫瘍作用の増強が得られた。より具体的には、図９Ｄに示されているように、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスでは、腫瘍の成長の縮小が有意に増大した。本発明は、いずれの特定の作用機序または作用経路にも制約されないが、４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌの間で観察された違いに関する仮説の１つは、４－１ＢＢＬが、ＮＫ細胞及びＴ細胞を活性化しようとする一方で、ＣＤ４０Ｌが、ＤＣを活性化させようとする点である。Ｂ１６メラノーマ腫瘍の方が、Ｔ細胞浸潤性が高い（Ｍｏｓｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ．５（１）：２９－４１）ので、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡは、この条件においては、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡよりも有効である。

【0254】

４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌが、腫瘍の成長または直径にその作用を及ぼす正確な機序または経路にかかわらず、図９に示されているデータにより、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡを腫瘍内注射することにより、腫瘍の成長制御性が長期化し、場合によっては、腫瘍が完全に拒絶されたことが示された。

【0255】

実施例１１：確立された大腸癌に対して、ＴＡＡ及びＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射することによる、抗腫瘍作用の増強
ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から１４日目（黒い点線）、１９日目及び２２日目（黒い破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＴＡＡ（図では「ｒＭＶＡ」）もしくはＭＶＡ－ＴＡＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。結果は、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに、確立された非抗原性ＭＣ３８大腸癌について示されている。この実験において、ＭＶＡによって発現されるＴＡＡには、抗原ＡＨ１Ａ５、ｐ１５Ｅ及びＴＲＰ２が含まれていた。

【0256】

これらの結果から、ＭＣ３８大腸癌モデルにおいて、１つ以上のＴＡＡに加えて、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡを腫瘍内注射すると、腫瘍の成長を有意に遅延できることが示されている。

【0257】

実施例１２：免疫チェックポイントの遮断及び腫瘍抗原に特異的抗体は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と相乗効果を発揮する
Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ細胞（５×１０^５個）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍の直径が約５ｍｍに達したら、マウスを群分けし（ｎ＝５匹／群）、指示されている場合（チェック印）には、２００μｇのＩｇＧ２ａ、抗ＴＲＰ－１または抗ＰＤ－１を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍の接種から１３日目（黒い点線）、１８日目及び２１日目（灰色の破線）に、マウスをＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。結果は、図１１に示されている。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）Ｔｒｐ１（抗Ｔｒｐ１）に特異的な抗体をＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と組み合わせたところ、抗ＰＤ－１単独の場合と比べて、腫瘍体積の縮小が増大した（図１１、中央の行）。免疫チェックポイント分子ＰＤ－１に対する抗体をＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と組み合わせたところ、抗ＰＤ－１単独の場合と比べて、腫瘍体積の縮小が増大した（図１１、下の行）。

【0258】

これらの実験から、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＴＲＰ－１抗体が、単剤として、腫瘍の成長の制御を増強した一方で、いずれかの抗体とＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを組み合わせたところ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによってもたらされる治療効果が向上したことが示されている。この実施例では、腫瘍内ＭＶＡ ４－１ＢＢＬと、チェックポイントの遮断またはＴＡＡ標的化抗体のいずれかとの併用療法は、いずれの単独療法よりも、治療活性が大きかった。このデータから、相乗作用を得るために、ＡＤＣＣを誘導する可能性のある腫瘍特異的抗体と、４－１ＢＢＬを発現するＭＶＡの腫瘍内注射を組み合わせてもよいことも示されている。

【0259】

実施例１３：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射は、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体による治療よりも抗腫瘍作用が優れている
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目、１２日目及び１５日目（黒い破線）に、ＰＢＳ、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ、または１０μｇの抗４－１ＢＢ（３Ｈ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のいずれかを腫瘍内注射した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。

【0260】

図１２Ａには、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの抗腫瘍作用が、抗４－１ＢＢＬアゴニスト抗体（３Ｈ３）よりも優れていることが示されている。図１２Ｂには、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内免疫した場合のみに、血液中のＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答が誘導され、抗４－１ＢＢＬアゴニスト抗体では、血液中のＯＶＡ特異的Ｔ細胞がまったく誘導されなかったことが示されている。

【0261】

したがって、これらのデータから、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの腫瘍内処置は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答及び腫瘍の成長制御の両方の点で、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体よりも強力であることが示されている。

【0262】

実施例１４：ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４０Ｌをコードするとともに、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡを静脈内注射すると、抗腫瘍作用が増大する
ＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍をそのマウスに導入してから１２日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図１３Ａ及び１３Ｂに示されているように、内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡウイルスを静脈内投与したところ、ＭＶＡまたはコントロール（ＰＢＳ）の場合と比べて、腫瘍体積が縮小した。加えて、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬによってＣＤ４０Ｌをコードさせたところ、その抗腫瘍作用がさらに向上した。

【0263】

図１３Ｃには、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌの静脈内注射により、血液中でＧｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導されたことが示されている。

【0264】

したがって、これらの実験では、ＭＶＡは、マウスタンパク質ｇｐ７０（マウス白血病ウイルスのエンベロープタンパク質）であるモデルＥＲＶをコードするように構築した（「ＭＶＡ－ｇｐ７０」）。共刺激分子ＣＤ４０Ｌをさらに含むＭＶＡも作製した（「ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ」）。ＣＴ２６．ｗｔ大腸癌モデルを用いて、これらの新規コンストラクトの潜在的な抗腫瘍作用を試験した。ＣＴ２６．ｗｔ細胞は、高レベルのｇｐ７０を発現することが示されている（例えば、Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ（２０１３）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２：ｅ２６８８９を参照されたい）。ＣＴ２６．ｗｔ腫瘍担持マウスを作製し、腫瘍が少なくとも５ｍｍ×５ｍｍになったら、上記のように、静脈内免疫した。ＭＶＡ単独での免疫では、腫瘍の成長遅延の誘導は、中程度であった。これに対して、ＭＶＡ－ｇｐ７０で免疫したところ、５個中３個の腫瘍が完全に拒絶された（図１３Ａ及びＢ）。ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌで免疫したところ、さらに顕著な結果が得られ、５個中４個の腫瘍が拒絶された（図１３Ａ及びＢ）。

【0265】

免疫後、これらの抗腫瘍応答が、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞の誘導と相関するか判断するために、Ｈ－２Ｋｄ拘束性ｇｐ７０エピトープＡＨ１を用いて、血液の再刺激を行った。その結果（図１３Ｃ）から、ＭＶＡ－Ｇｐ７０で処置したマウス及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌで処置したマウスにおいて、ｇｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が強力に誘導されたことが示されている（図１３Ｃ）。

【0266】

実施例１５：Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４０Ｌをコードするとともに、内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡを静脈内注射すると、抗腫瘍作用が増大する
腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、腫瘍測定値が約５×５ｍｍとなったら、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍の成長を等間隔で測定した。図１４Ａに示されているように、内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０とＣＤ４０ＬとをコードするＭＶＡウイルスを静脈内投与したところ、ＭＶＡまたはコントロール（ＰＢＳ）の場合と比べて、腫瘍体積が縮小した。

【0267】

図１４Ｂには、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌの静脈内注射により、血液中でＧｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導されたことが示されている。

【0268】

したがって、これらの実験で、ＭＶＡ－Ｇｐ７０及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる治療の有効性が、追加の独立した腫瘍モデルにおいて示された。Ｂ１６．Ｆ１０は、Ｃ５７ＢＬ／６由来のメラノーマ細胞株であり、高レベルのＧｐ７０を発現する（Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ（２０１３）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ ２：ｅ２６８８９）。ＭＶＡ単独（「ＭＶＡ－ＢＮ」）で処置したところ、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍の成長がある程度遅延し、アジュバント非添加のＭＶＡ－Ｇｐ７０の作用に匹敵していた（図１４Ａ）。しかしながら、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌでは、コントロールであるＭＶＡ骨格単独の場合よりも抗腫瘍作用が強かった（図１４Ａ）。追加の実験により、Ｇｐ７０抗原をコードするＭＶＡを投与した群ではいずれも、Ｈ－２Ｋｂ拘束性ｇｐ７０エピトープｐ１５ｅに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が見られたが、ＭＶＡによってＣＤ４０Ｌもコードさせた場合には、末梢Ｔ細胞応答の大幅な増加は観察されなかったことが示された（図１４Ｂ）。

【0269】

実施例１６：ｇｐ７０及び４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射による、抗腫瘍作用の増大［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを静脈内投与する。腫瘍の成長を等間隔で測定する。ヒト内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質のマウスホモログは、正常なマウス組織でも高度には発現せず、マウス腫瘍組織でも顕著には発現しないので、ヒトＥＲＶの有効性は、マウスモデルでは効果的には研究できない。Ｇｐ７０は、充分に研究されてきたマウスＥＲＶタンパク質である（例えば、Ｂｒｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（１２）：６３９６－６４０５、Ｂａｓｈｒａｔｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：５７５－５８４及びＮｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １８：１１５－１２０を参照されたい）。したがって、ｇｐ７０特異的ながんワクチンのマウスにおける試験では、ヒトにおけるＥＲＶ特異的ながんワクチンの有効性に関する強力な予測値が得られる可能性が非常に高い。

【0270】

実施例１７：ｇｐ７０と、４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬのいずれかとをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射による、抗腫瘍作用の増強［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、１２日目及び１５日目（灰色の破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与する。腫瘍の成長を等間隔で測定した。

【0271】

実施例１８：ｒＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬを投与すると、感染した腫瘍細胞の直接抗原提示によって、サイトカインの産生に影響が及ぶ［仮想実施例］
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後、樹状細胞（ＤＣ）を作製する。Ｂ１６．Ｆ１０細胞に、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬをＭＯＩ１０で感染させ、一晩置く。その翌日、感染した腫瘍細胞を回収し、指示されている場合には、１：１の比率のＤＣの存在下で４時間、３７℃、５％ＣＯ２で共培養する。ＨＥＲＶ－Ｋ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＨＥＲＶ－Ｋ免疫マウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養する。続いて、Ｌｕｍｉｎｅｘによってサイトカイン濃度を解析するために、培養上清を採取する。サイトカインレベルの測定には、（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＧＭ－ＣＳＦ、（Ｃ）ＩＬ－２及び（Ｄ）ＩＦＮγを含める。データは、平均±標準誤差として示す。

【0272】

実施例１９：ｒＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬを投与すると、感染した腫瘍細胞の直接抗原提示によって、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が活性化エフェクターＴ細胞に誘導される［仮想実施例］
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後、樹状細胞（ＤＣ）を作製する。Ｂ１６．Ｆ１０細胞に、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬをＭＯＩ１０でを感染させ、一晩置く。その翌日、感染した腫瘍細胞を回収し、指示されている場合には、１：１の比率のＤＣの存在下で４時間、３７℃、５％ＣＯ２で共培養する。その一方で、ＨＥＲＶ－Ｋ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＨＥＲＶ－Ｋ免疫マウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養する。続いて、細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析する。サイトカイン解析は、（Ａ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＴ－ｂｅｔのＧＭＦＩ、及び（Ｂ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４＋ グランザイムＢ＋ ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋のパーセンテージについて行う。データは、平均±標準誤差として示す。

【0273】

実施例２０：ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかをコードするｒＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋに感染させると、腫瘍細胞株及びマクロファージにおいて腫瘍細胞死が誘導される［仮想実施例］
腫瘍細胞株Ｂ１６．ＯＶＡ（Ａ及びＢ）、ＭＣ３８（Ｃ）、ならびにＢ１６．Ｆ１０（Ｄ）を、示されているＭＯＩで、２０時間感染させる。続いて、細胞の生存率について、フローサイトメトリーによって解析する。（Ａ）の試料における血清ＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡによって定量する。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、示されているＭＯＩで、２０時間感染させる。続いて、細胞の生存率について、フローサイトメトリーによって解析する。データは、平均±標準誤差として示す。

【0274】

実施例２１：４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡを腫瘍内投与すると、腫瘍において、Ｔｒｅｇ細胞が減少し、Ｔ細胞疲弊が軽減される［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与する。５日後、マウスを殺処分し、脾臓及び腫瘍を摘出し、染色して、蛍光色素コンジュゲート抗体によって、Ｔｒｅｇの浸潤とＴ細胞疲弊を評価する。（Ａ）は、腫瘍内浸潤しているＣＤ４５＋ 白血球のうちのＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージであり、（Ｂ）は、腫瘍内浸潤しているＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ－１の幾何平均蛍光強度、（Ｃ）は、腫瘍内浸潤しているＣＤ８ Ｔ細胞上のＬａｇ－３の幾何平均蛍光強度である。データは、平均±標準誤差として示す。

【0275】

実施例２２：免疫チェックポイントの遮断と、腫瘍抗原特異的抗体は、ｒＭＶＡ ｇｐ－７０－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と相乗効果を発揮する［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、指示されている場合（チェック印）には、２００μｇのＩｇＧ２ａ、抗ＴＲＰ－１または抗ＰＤ－１を投与する。腫瘍の接種から１３日目（黒い点線）、１８日目及び２１日目（灰色の破線）に、マウスをＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内免疫する。腫瘍の成長を等間隔で測定する。

【0276】

実施例２３：ＩＴ免疫に対するサイトカイン／ケモカインＭＶＡ－ＢＮ骨格応答は、４－１ＢＢＬアジュバント作用によって増大できる
組み換えＭＶＡが、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の炎症を誘導する可能性を評価するために、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍由来の組織において、サイトカイン及びケモカインを解析した。まず、５×１０^５個のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した。１０日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝５～６匹のマウス／群）。

【0277】

注射から６時間後、サイトカイン及びケモカインの発現を測定した（図１５）。ＰＢＳで処置した組織におけるサイトカイン／ケモカインの発現は、腫瘍への針の挿入及び生理食塩水のせん断圧力によって誘導される基底の炎症プロファイルを表す。ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１５及びＴＮＦ－αを含むサイトカイン、ならびにＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２及びＭＩＰ２などのケモカインがアップレギュレートした（図１５）。ヒトにおいて、ＮＦ－κβの活性化により誘導され、ＩＬ－８の産生を刺激するＩＬ－２５（ＩＬ－１７Ｅとしても知られる）も検出された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６６０－６４）。興味深いことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを注射した腫瘍では、ＭＶＡ－ＢＮを注射した腫瘍、またはＭＶＡ－ＯＶＡを注射した腫瘍病変と比べて、ＩＬ－６、ＩＦＮ－αまたはＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒαのような炎症誘発性サイトカインの有意な増加が見られた。

【0278】

実施例２４：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫に対する、サイトカイン／ケモカインの炎症誘発性応答が増大する
実施例２３に記載されているようにして、マウス及び腫瘍を処置した。印象的なことに、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦを含むいくつかの炎症誘発性サイトカインは、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内免疫した後のみに産生された（図１６）。ＩＬ－１８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ３及びＩＬ－２２を含む他の炎症誘発性サイトカインの産生は、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した場合に増強されたが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＰＢＳ単独では増強されなかった。

【0279】

勘案すると、このデータによって、ＭＶＡで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫すると、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において炎症性サイトカイン／ケモカインシフトを誘導することによって、炎症応答を増強できることが示されている。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内免疫した際に、ＭＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡと比べて、作用の増大が観察された。このことから、４－１ＢＢＬを追加すると、組み換えＭＶＡに対して「アジュバント作用」が発揮されると言うことができる。

【0280】

実施例２５：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後のＴＭＥ及び流入ＬＮのＴ細胞の定量解析及び定性解析
ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後に、炎症によって誘導される細胞プロセスをさらに深く理解するために、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後の様々な時点における自然免疫浸潤及び適応免疫浸潤の詳細な解析を行った。Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスに、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。プライム免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを殺処分した。腫瘍及び腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）を取り出し、コラゲナーゼ及びＤＮａｓｅで処理し、単一細胞をフローサイトメトリーによって解析した。免疫細胞集団を解析して、それらのサイズ、増殖挙動及び機能状態を求めた。

【0281】

結果から、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍にＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを注射したところ、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫から７日後に、ＣＤ４５^＋白血球の腫瘍内浸潤が誘導されたことが示された（図１７、一番上の行、左側のヒストグラム）。興味深いことに、特に、４－１ＢＢＬを発現するＭＶＡの注射後、ｉ．ｔ．（腫瘍内）免疫から３日後にすでに、ＴｄＬＮにおけるＣＤ４５^＋白血球数の増加が観察された（図１７、一番上の行、右側のヒストグラム）。ＴｄＬＮにおいて、この差は、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫から７日後にさらに拡大したことから、ＴｄＬＮでは、ＭＶＡでの免疫により媒介される抗腫瘍作用が、免疫から３日目に迅速に開始されることが示唆された。

【0282】

ワクチン接種ベースの抗腫瘍療法の一局面は、腫瘍特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞及び腫瘍特異的ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増加及び再活性化と、腫瘍におけるそれらの富化である。免疫から１週間後に、腫瘍内で、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞の両方が増加した（ＣＤ４＋細胞は、図１７の２行目、左側のヒストグラム、ＣＤ８＋細胞は、図１７の３行目、左側のヒストグラム）。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでｉ．ｔ．免疫後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、腫瘍内では７日目までに増加し、ＴｄＬＮでは、増加が３日目に開始され、７日目にピークに達した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は主に、腫瘍内で、７日目までに、ＣＤ４５^＋ 細胞の増加に寄与した。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを注射したところ、ＭＶＡ－ＯＶＡを注射した場合と比べて、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞集団が、腫瘍（７日目）及びｄＬＮ（３日目及び７日目）の両方でさらに増加した。

【0283】

ＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を定量したところ、特に、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで処置した群において、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫から７日後に、腫瘍微小環境内で増加したことが明らかになった（図１７、左下）。印象的なことに、ＴｄＬＮにおけるＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増加は、免疫から３日目にピークに達し、その増加は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ処置群の方が大きかった（図１７、右下）。勘案すると、これらのデータによって、ＭＶＡ－ＯＶＡ、特にＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内免疫すると、適応免疫応答の発生が増強され、腫瘍流入リンパ節では、治療から３日後に開始され、腫瘍微小環境では、７日目までに、抗原特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が有意に増加することが示されている。

【0284】

実施例２６：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射による、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導
ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射によって誘導された、腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）内のＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、高い増殖能を示した。Ｋｉ６７（細胞増殖の指標）を発現するＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＴｄＬＮにおいて、ＭＶＡ－ＯＶＡで処置後、ＰＢＳの場合よりも高かったとともに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫したマウスで、さらに上昇した（図１８Ａ）。さらに、ＭＶＡ－ＯＶＡでの免疫後及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの免疫後、７日目までに、腫瘍内のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞によって、疲弊マーカーＰＤ－１がダウンレギュレートされたことから、機能性の回復が示唆された（図１８Ｂ）。

【0285】

Ｔｒｅｇ細胞（「制御性Ｔ細胞」ともいう）は、抗腫瘍免疫応答の強力な阻害因子である（例えば、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２７：１０９－１１８を参照されたい）。ＭＶＡ－ＯＶＡの腫瘍内注射により、腫瘍内で、ＯＶＡ特異的Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇの比率（すなわち、Ｔｒｅｇ細胞に対する「Ｔｅｆｆ」細胞、すなわち、「エフェクターＴ細胞」の比率）が上昇し、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで処置してから７日目に、さらなる上昇が見られた（図１８Ｃ）。したがって、ＭＶＡ－ＯＶＡ、特にＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内処置したところ、抗腫瘍免疫応答にとって有益であるＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞に有利に働くように、腫瘍内Ｔｒｅｇの出現頻度が低下した。

【0286】

実施例２７：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後のＴＭＥ及び流入ＬＮのＮＫ細胞の定量解析及び定性解析
ＭＶＡ－ＯＶＡでｉ．ｔ．免疫後、ＮＫ細胞を定量したところ、腫瘍内免疫から１日後、腫瘍内のＮＫ細胞の減少が見られた（図１９、一番上の行、左側のヒストグラム）。これらの変化は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを使用した場合に、より顕著であった。同時に、ＭＶＡ－ＯＶＡでの免疫及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの免疫のいずれでも、免疫から３日後及び７日後に、腫瘍流入リンパ節（ＴｄＬＮ）内のＮＫ細胞が増加したが（図１９、一番上の行、右側のヒストグラム）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって、ＴｄＬＮにおけるＮＫ細胞の最も大きい増加が誘導された。

【0287】

ＣＤ６９は、ＮＫ細胞の早期活性化のマーカーである。ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬというウイルスベクターのいずれでも、腫瘍及び流入リンパ節（ＴｄＬＮ、図１９、２行目）において、活性化マーカーＣＤ６９が即時にアップレギュレートした。さらに、ｉ．ｔ．免疫により、様々な時点に、腫瘍及びＴｄＬＮのいずれでも、ＮＫ細胞においてグランザイムＢが誘導され、このことは、細胞傷害性ＮＫ細胞の機能増強を示している（図１９、３行目）。

【0288】

そして、ＮＫ細胞の増殖能を、Ｋｉ６７の発現によって解析した。ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内処置したマウスの腫瘍及びＴｄＬＮにおいて、３日目に、ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現が有意に増加した（図１９、一番下の行）。

【0289】

これらの結果から、４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡ－ＯＶＡ（すなわちＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）によって、腫瘍内注射後に、ＭＶＡ－ＯＶＡと比べて、ＮＫ細胞上のＣＤ６９、グランザイムＢ及びＫｉ６７表面マーカーの発現がさらに増加したことが示されている。これらの実験では、腫瘍内免疫療法後、抗腫瘍Ｔ細胞応答及び抗腫瘍ＮＫ細胞応答を生じさせる際の流入リンパ節（ＴｄＬＮ）の顕著な役割も明らかなる。

【0290】

本発明は、いずれの特定の作用機序にも制約されないが、３日目に、ＴｄＬＮ内のＴ細胞が増加し、７日目に、Ｔ細胞の腫瘍内浸潤が遅延すること（図１７を参照されたい）から、腫瘍特異的Ｔ細胞をＴｄＬＮでプライミング及び増殖させた後に、腫瘍に移動させて、腫瘍細胞を殺傷するというシナリオが支持される。ウイルスベクターの腫瘍内注射により、ＴｄＬＮにおいて、ＮＫ細胞が直接活性化されることによって、さらに、ＤＣの活性化が誘導される可能性もある。

【0291】

実施例２８：腫瘍内ＭＶＡがん療法におけるＣＤ８ Ｔ細胞の役割
腫瘍及びＴｄＬＮにおけるＴ細胞応答の解析（例えば図１７）により、腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置後、両方の部位で腫瘍特異的Ｔ細胞の増加が見られた。実験を行って、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの媒介する抗腫瘍作用にＴ細胞が寄与することについて調べた。これらの実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ細胞（５×１０^５細胞）を注射し、数回の処置のうちの１回の後、腫瘍の成長をモニタリングした。処置には、１００μｇのＣＤ８－Ｔ細胞枯渇抗体（「αＣＤ８」、クローン２．４３）またはアイソタイプコントロール抗体の存在下または非存在下で、ＰＢＳまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射することが含まれていた。腫瘍の直径が５ｍｍに達したら、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの（ｉ．ｔ．）注射を行い、その注射を１週間以内に２回繰り返した。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－ＢＢＬの１回目の注射を行う１日前に、マウスに、抗ＣＤ８抗体またはＩｇＧ２ｂ抗体のいずれかをｉ．ｐ．注射し、その後、２週間以内に、この処置を４回繰り返した。図２０に示されているデータによって、有効なＭＶＡ腫瘍療法には、ＣＤ８ Ｔ細胞が不可欠であったことが示されている。勘案すると、これらのデータによって、腫瘍の成長を制御するには、腫瘍及びＴｄＬＮ内の腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＭＶＡの誘導によって活性化及び増加することが重要な事象であることが示されている。

【0292】

実施例２９：ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの媒介による抗腫瘍作用のＢａｔｆ３＋ ＤＣ依存性
我々は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって誘導される抗腫瘍免疫応答に寄与する根底の細胞体及び分子体を解明するために、様々な関与免疫細胞の役割を調べた。強力に貪食を行って、適応免疫系の細胞に、抗原及び共刺激シグナルを提示する能力を持つ樹状細胞（ＤＣ）は、抗腫瘍免疫における重大な因子とみなされている。ＣＤ８α＋ ＤＣ（「ｃＤＣ１」としても知られる）を含め、様々なサブタイプのＤＣが、腫瘍に対する強力な免疫応答の活性化に関与している。このＤＣサブセットには、免疫応答の際に抗原をクロスプレゼンテーションする特有の能力があり、ＣＤ８α＋ ＤＣは、感染（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５４４８－５５、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１１９－２９）及びがん（Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２６：６３８－５２）に応答して、ＩＬ－１２を産生する主要な細胞である。ＣＤ８α＋ ＤＣは、腫瘍関連抗原のクロスプレゼンテーションによって、抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞を強力に誘導する細胞でもある（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐａｕｌｅｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６：７１－７９、Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４：９２４－３８）。ＣＤ８α＋ ＤＣの発現は重大なことに、転写因子Ｂａｔｆ３に依存する（Ｈｉｌｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１０９７－１１００）。

【0293】

我々は、腫瘍内ＭＶＡがん療法における、このＤＣサブセットの重要性を評価するために、野生型のＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスと、Ｂａｔｆ３欠損（Ｂａｔｆ３－／－）Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスを使用した。図２１Ａには、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍は、クロスプレゼンテーションするＤＣの非存在下（Ｂａｔｆ３－／－）の方が、著しく速く成長したことが示されており、これにより、腫瘍に対する免疫応答の誘導における、この抗原提示細胞（ＡＰＣ）サブセットの重要な役割が示されている。以前の実験と一致して、野生型マウスでは、ＭＶＡ－ＯＶＡの腫瘍内注射により、腫瘍の成長が遅延し、症例の１つでは、腫瘍が完全に消失した。マウスにＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを注射したところ、この作用は向上し、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで処置した５匹のマウスのうち３匹において、腫瘍が拒絶された（図２１Ａ）。興味深いことに、クロスプレゼンテーションするＤＣの非存在下（Ｂａｔｆ３－／－）でも、腫瘍内ＭＶＡ免疫療法は、野生型群と比べて、まったく損なわれなかった（図２１Ａ）。しかしながら、Ｂａｔｆ３－ＤＣは、４－１ＢＢＬによって誘導される抗腫瘍応答に関与すると見られる（図２１Ａ、下図）。

【0294】

１回目の免疫から１１日後に、末梢血中のＣＤ８^＋ Ｔリンパ球集団のフローサイトメトリー解析を行ったところ（図２１Ｂ）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫したＢａｔｆ３^－／－腫瘍担持マウスでは、ＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の出現頻度は、野生型の対応マウスと比べて、少ししか低下しなかったことが示された。本発明は、いずれの特定の作用機序にも制約されたり、依存したりすることもないが、これらのデータによって、Ｂａｔｆ３依存性ＤＣが、ＭＶＡを用いる腫瘍内がん療法において、余剰的な役割を果たすことが示唆されている。

【0295】

実施例３０：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与におけるＮＫ細胞の役割
ＮＫ細胞は、４－１ＢＢを発現することが知られており、ＮＫ細胞上の４－１ＢＢの結合により、これらの細胞の増殖及び細胞傷害性が増大することが示されている（Ｍｕｎｔａｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７３－８１）。我々は、以前の実験（図１９を参照されたい）で、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射により、増殖の増強に付随して、ＮＫ細胞上で、活性化マーカーのＣＤ６９、及び細胞傷害性マーカーのグランザイムＢが著しくアップレギュレートしたことを見出した。

【0296】

我々は、４－１ＢＢＬにより誘導される抗腫瘍免疫応答におけるＮＫ細胞の役割を調べるために、ＩＬ１５Ｒα^－／－マウスを使用した。ＩＬ－１５受容体αサブユニット（ＩＬ－１５Ｒα）は、ＮＫ細胞の発生に不可欠なことが示されている多機能サイトカインであるＩＬ－１５の高親和性結合を媒介する（Ｌｏｄｏｌｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：６６９－７６）。野生型のＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスと、ＩＬ１５Ｒα欠損（ＩＬ１５Ｒα^－／－）Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスを作製し、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内免疫した。ＭＶＡ－ＯＶＡで処置したマウスでは、ＩＬ－１５Ｒαの有無にかかわらず、同程度の治療効果が見られた（図２２Ａ）。興味深いことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを用いた場合に野生型マウスで観察された利点（５匹のマウスのうちの３匹で、腫瘍が拒絶された）は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで処置したＩＬ１５Ｒα欠損腫瘍担持マウスでは完全に喪失した（腫瘍が拒絶されたのは、５匹のマウスのうちの１匹であった。図２２Ａを参照されたい）。これらの結果は、腫瘍接種後のマウスの生存率にも表れている（図２２Ｂ）。

【0297】

ＩＬ１５Ｒαの欠損は、マウスにおいて、ＮＫ細胞の発生に影響を及ぼすのみならず、Ｔ細胞のホメオスタシス及びＬＮへの移動も低減させ、ＣＤ８メモリーＴ細胞を選択的に減少させることが知られている（Ｌｏｄｏｌｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：６６９－７６）。したがって、我々は、上記の処置に対するＴ細胞応答も調べた。我々の以前のデータと一致して、野生型マウスにおいて、ＭＶＡ－ＯＶＡで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫したところ、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導され、この誘導が、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによってさらに増大したことを我々は観察した（図２２Ｃ）。しかしながら、ＩＬ１５Ｒα^－／－マウスにおけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答は、野生型マウスで見られた応答と同程度であった。

【0298】

本発明は、いずれの特定の作用機序または作用経路にも制約されないが、これらの知見から、ＩＬ１５Ｒα^－／－腫瘍担持マウスが、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘導できることが示されており、したがって、４－１ＢＢＬにより増強される、ＮＫ細胞の活性化及び機能が、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内処置の治療効果に寄与するという考えが裏付けけられている。

【0299】

実施例３１：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内免疫に応じたＮＫ細胞依存性サイトカイン／ケモカインプロファイル
ＮＫ細胞上の４－１ＢＢＬ－４－１ＢＢ相互作用によって選択的に誘導されたサイトカインを特定するために、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内処置した野生型Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスまたはＩＬ１５Ｒα^－／－Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスから得た腫瘍組織において、サイトカイン及びケモカインを解析した。

【0300】

以前の実験では、組み換えＭＶＡの腫瘍内注射から６時間後に、多数のサイトカイン及びケモカインが増加したことが示された（図１５及び１６）。これらの実験では、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍に注射した場合、４－１ＢＢＬで刺激すると、ＮＫ細胞によって産生されることが知られているＩＦＮ－γ、ＣＣＬ３及びＣＣＬ５のような炎症誘発性のサイトカインまたはケモカインの産生が、ＭＶＡ－ＯＶＡを注射した場合よりも有意に増加した（図２３）。４－１ＢＢＬによって誘導されるこの増加は、ＩＬ１５Ｒα^－／－マウスでは完全に消失したことから、ｒＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射によって、腫瘍微小環境では、注射から６時間後に、ＮＫ細胞に起因する別のサイトカインプロファイル及びケモカインプロファイルが誘導されることが示された。

【0301】

実施例３２：ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果のＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬとの比較
Ｇｐ７０は、ストローマ細胞及び免疫細胞の組成の点で、いずれも別個の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を示す多くの同系腫瘍モデル（Ｂ１６．Ｆ１０、ＣＴ２６、ＭＣ３８、４Ｔ１、ＥＬ４など）で発現する自己腫瘍抗原である。我々は、この実施例で、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍内免疫において、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかに加えて、腫瘍抗原ｇｐ７０をコードするＭＶＡの効能を試験した。

【0302】

Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍のサイズが約５０ｍｍ^３に達したら、マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌで腫瘍内免疫した。結果は、図２４に示されている。

【0303】

ＭＶＡ－ｇｐ７０で免疫したところ、腫瘍の一過性かつ中度な成長制御が誘導された。この抗腫瘍作用は、ウイルスにＣＤ４０Ｌを発現させると増強できた。しかしながら、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで腫瘍内免疫した場合に、最も強力な治療効果が得られ、処置した５匹のうち２匹において、腫瘍が完全に消失した（図２４Ａ）。

【0304】

印象的なことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで処置した後に腫瘍が治癒したマウスでは、腫瘍が見られた斑の色素が喪失した（図２４Ｂ）。この脱色素は、自己免疫病態の白斑を示すものであり、自己反応性Ｔ細胞による、メラニン細胞の破壊の結果である。このメラニン細胞破壊により、組み換えＭＶＡによる免疫系の活性化が、そのＭＶＡによってコードされるＴＡＡ（この実施例ではｇｐ７０）に限らないことが示唆されている。むしろ、他の抗原に対する免疫系の活性化のこのような拡大（エピトープ拡大として知られる現象）により、治療転帰を向上させ得るさらに広範な免疫応答が得られる。

【0305】

免疫によって誘導される抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、１回目の免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した。ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ならびにＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれで免疫した場合も、測定可能なｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞応答が誘導され、その範囲は１～２％であった（図２４Ｃ）。重要なことに、この応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを投与したマウスにおいて、大幅に（５倍超）増大した。ｐ１５Ｅペプチドによる再刺激に対するこの抗原特異的Ｔ細胞応答は、異なる治療群における治療効果と相関した。

【0306】

実施例３３：ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果
４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌとともに、腫瘍抗原ｇｐ７０を発現する組み換えＭＶＡを作製し、Ｂ１６メラノーマモデルにおいて、腫瘍内試験を行った。Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍が約５０ｍｍ^３に達したら、マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、またはｇｐ７０を発現しない対応するＭＶＡコンストラクトで腫瘍内免疫した。

【0307】

ＭＶＡ－ｇｐ７０で免疫したところ、腫瘍の一過性かつ有意な成長制御が誘導された（図２５Ａ）。この抗腫瘍作用は、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬをウイルスに発現させると増強できた。しかしながら、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌで腫瘍内免疫した場合に、最も強力な治療効果が得られ、５匹の処置マウスのうち４匹において、腫瘍が完全に消失した（図２５Ａ）。印象的なことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌで処置した４匹の治癒マウスのうちの３匹で、腫瘍のあった場所の色素の喪失が見られ、上記の実施例３２で論じたように、この喪失は、自己免疫病態の白斑を示すものである。

【0308】

加えて、１回目の免疫から１１日後に、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞応答を血液中で測定した。ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ならびにＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫した場合に、測定可能な腫瘍特異的Ｔ細胞応答が誘導され、その範囲は１～２％であった。この応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを投与したマウスにおいて、大幅に（５倍超）増大し（図２５Ｂ）。

【0309】

勘案すると、Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマモデルでは、ＭＶＡ－ｇｐ７０に対して、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかでアジュバント添加を行った時に、抗腫瘍効果を増強できたが、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌで、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌを併せて発現させたところ、さらに強力な作用が観察された。

【0310】

実施例３４：ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍における、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫療法
続いて、Ｔ細胞及び骨髄系細胞が豊富であり、免疫原性があるとみなされたことが説明されたＣＴ２６大腸癌モデルを用いて、コンストラクトを試験した（例えば、Ｍｏｓｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ．５：２９－４１を参照されたい）。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＣＴ２６．ｗｔ大腸癌細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３に達したら、マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌで腫瘍内免疫した。

【0311】

ＭＶＡ－ｇｐ７０でｉ．ｔ．免疫した場合に、腫瘍の一過性かつ有意な成長制御が誘導された。ＭＶＡにＣＤ４０Ｌを発現させたところ、この抗腫瘍作用は増強されなかったが、印象的なことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで免疫した場合に、最も強力な治療効果が得られ、すべての処置マウスで、腫瘍が完全に消失した（図２６Ａ）。しかしながら、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる処置では、治療効果の向上は見られなかった。留意すべきことに、ｇｐ７０をコードせず、共刺激分子のみをコードするウイルスでも、腫瘍の有意な成長遅延が見られたが、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬに匹敵する結果を得ることはできなかった。これらの知見は、処置マウスの全生存率に表れた（図２６Ｂ）。

【0312】

ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌで処置したマウスの血液において、Ｈ２－Ｌｄ ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープＡＨ－１に対するＧｐ７０特異的Ｔ細胞応答が容易に検出された（図２６Ｃ）。この応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを投与したマウスで、大幅に（１０倍超）増大し、このことは、図２６Ａ及び２６Ｂに示されている治療効果と相関した。ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌでの処置により、血液におけるＡＨ－１特異的Ｔ細胞応答も増強された（図２６Ｃ）。

【0313】

実施例３５：ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬをＢ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスにＩＴ注射した後の腫瘍微小環境及び腫瘍流入ＬＮの網羅的解析
上記のデータによって、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスをＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌで腫瘍内処置した場合に、処置マウスの８０％で腫瘍が拒絶されたことが示された（図２６を参照されたい）。この腫瘍モデルの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及びＴｄＬＮを調べるために、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスに、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。プライム免疫から３日後に、マウスを殺処分した。３日目の時点に、自然免疫系成分及び適応免疫系成分の両方で変化が見られた、ＯＶＡ系での以前の実験に基づき、３日目を選択した（図１７を参照されたい）。腫瘍及びＴｄＬＮを取り出し、フローサイトメトリーを用いて単一細胞を解析する目的で、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化した。免疫細胞集団の存在量、ならびにそれらの増殖挙動及び機能状態を評価した。

【0314】

４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡ及びＣＤ４０Ｌアジュバント添加ＭＶＡを腫瘍内注射した場合には、ペンタマー染色によって測定したところ、３日目時点で、腫瘍内のＣＤ８ Ｔ細胞またはｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞の数について、優れた結果は得られなかった。しかしながら、ＴｄＬＮでは、ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによって、ＣＤ８ Ｔ細胞が増加し、４－１ＢＢＬを加えた場合に、さらに大きい作用が得られた（図２７、右上）。４－１ＢＢＬを加えることによって得られた増加は、ＴｄＬＮ内のｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞でさらに顕著であったため、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかでｉ．ｔ．免疫することにより、腫瘍特異的なＣＤ８ Ｔ細胞が増加した（図２７、右中央）。ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数は、これらの細胞の増殖状態とも相関した。例えば、４－１ＢＢＬとともに、ｇｐ７０と、任意にＣＤ４０ＬをＭＶＡに加えたところ、ＴｄＬＮにおいて、最も多いＫｉ６７＋ ｇｐ７０－ｐ１５Ｅ ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導された（図２７、右下）。

【0315】

これらのデータにより、ＭＶＡ－ｇｐ７０で腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫すると、処置から３日目に、腫瘍及び腫瘍流入リンパ節において、適応免疫応答の発生が増強される一方で、４－１ＢＢＬまたは４－１ＢＢＬと、ＣＤ４０Ｌのアジュバント作用により、ＴｄＬＮにおいて、ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が特異的に増大したことが示されている。

【0316】

実施例３６：ＭＶＡを腫瘍内注射した後の腫瘍及びＴｄＬＮにおけるＮＫ細胞の誘導
ＭＶＡ－ＯＶＡの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により、１日目及び３日目にそれぞれ、ＮＫ細胞が活性化及び増加した（図１９）。続いて、我々は、様々なＭＶＡコンストラクトを注射してから３日目に、ＮＫ細胞の浸潤、活性化及び増加を調べた。組み換えＭＶＡでｉ．ｔ．免疫した後に、ＮＫ細胞を定量したところ、腫瘍（図２８、左上）及びＴｄＬＮ（図２８、右上）に浸潤しているＮＫ細胞の増加が見られた。ＭＶＡに４－１ＢＢＬをコードさせた場合（例えば、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ）に、浸潤が増加した。ＭＶＡ－ｇｐ７０の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により、腫瘍（図２８、左中央を参照されたい）及びＴｄＬＮ（図２８、右中央）において、ＮＫ細胞（Ｋｉ６７＋）の増殖が誘導され、４－１ＢＢＬまたは４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌでアジュバント添加を行うことにより、ＴｄＬＮにおいて、この作用が増強された。

【0317】

グランザイムＢは、ＮＫ細胞の細胞傷害性のマーカーである（例えば、Ｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１５：３１５－２２を参照されたい）。組み換えＭＶＡを腫瘍内注射した後の腫瘍及びＴｄＬＮにおいて、グランザイムＢ＋ ＮＫ細胞が誘導された（図２８、左下）。この実施例でも、４－１ＢＢＬまたは４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを組み換えＭＶＡに加えた場合に、ＴｄＬＮ内の細胞傷害性ＮＫ細胞の数が中度に増加した（図２８、右下）。

【0318】

勘案すると、これらのデータにより、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫療法後のＮＫ細胞及びＴＡＡ特異的Ｔ細胞の増加及び機能における、ＭＶＡコード４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの重要な役割が明らかになっている。すなわち、ｇｐ７０及び４－１ＢＢＬまたはｇｐ７０、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを用いた腫瘍内処置により、ｇｐ７０のような内在性レトロウイルス自己抗原に対するＴ細胞応答を増強することができる。

【0319】

実施例３７：ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる静脈内免疫療法
上述の実験では、共刺激分子４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌとともに、腫瘍抗原ｇｐ７０をコードする新規ＭＶＡコンストラクトは、腫瘍内に適用したところ、非常に強力であったことが示された（図２５及び２６）。加えて、Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈら（（２０１３）Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２５１）は、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡが、静脈内投与したときに、自然免疫応答及び適応免疫応答を増強することを見出した。我々は、この実施例では、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる静脈内（ｉ．ｖ．）免疫も、腫瘍の成長を制御できるかを問うた。

【0320】

ＣＴ２６．ＷＴ大腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３に達したら、マウスをＰＢＳ、またはＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ７０不含）で静脈内免疫した。ＭＶＡ－ｇｐ７０でｉ．ｖ．免疫したところ、５匹のうちの２匹で腫瘍が消失した（図２９Ａ）。４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０Ｌのいずれかを含むｇｐ７０発現ウイルスで処置したマウスでは、抗腫瘍応答が著しく向上し、４－１ＢＢＬの場合には５匹中３匹、ＣＤ４０Ｌの場合には５匹中４匹のマウスが治癒した。重要なことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌでｉ．ｖ．処置した場合には、すべての処置マウスで、腫瘍の成長制御が長期化し、５匹のマウスのうちの３匹で、腫瘍が拒絶された（図２９Ａ）。留意すべきことに、共刺激分子を含むに過ぎず、ｇｐ７０は含まない組み換えＭＶＡでも、腫瘍の成長が有意に遅延したが、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの場合に観察されたのと同様には腫瘍拒絶は見られなかった（図２９Ａ）。これらの知見は、処置マウスの全生存率に表れた（図２９Ｂ）。

【0321】

ＰＢＬのペプチド再刺激による、血液中の腫瘍指向性ＣＤ８ Ｔ細胞応答の解析によって、すべてのＭＶＡ処置群において、ＡＨ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が有意に誘導され、これにより、ＣＤ４０Ｌの存在下（すなわち、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ）で、この誘導がさらに増大し得ることが明らかになった（図２９Ｃ）。

【0322】

実施例３８：ＨＥＲＶ－Ｋ抗原を含む組み換えＭＶＡ
ヒト内在性レトロウイルスＫスーパーファミリータンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ）、特にＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇであるＴＡＡを含む、ＭＶＡベースのベクター（「ＭＶＡ－ｍＢＮ４８９」、「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ１－４－１－ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ」ともいう）を設計する。このＭＶＡは、ヒトＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードするように、かつｈ４－１ＢＢＬを発現するか、ｈＣＤ４０Ｌを発現するか、またはｈ４－１ＢＢＬ及びｈＣＤ４０Ｌの両方を発現するようにも設計する。

【0323】

実施例３９：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードするＭＶＡによる腫瘍内免疫
高度に弱毒化された非複製型ワクシニアウイルスＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、様々ながんに対する特異的かつ活発な免疫応答を誘導する４つのヒト導入遺伝子からなるように設計されている。そのベクターは、ヒトＴＡＡであるＢｒａｃｈｙｕｒｙと、３つのヒト共刺激分子、すなわち、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても知られる）、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５４としても知られる）及び白血球機能関連抗原－３（ＬＦＡ－３、ＣＤ５８としても知られる）を共発現する。その３つの共刺激分子（すなわち、ＴＲＩａｄ ｏｆ ＣＯｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＴＲＩＣＯＭ（商標））は、そのヒトＴＡＡ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙに対する免疫応答を最大限に高める目的で含まれている。

【0324】

Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、Ｔ－ｂｏｘファミリー内の転写因子であり、ＥＭＴ（がんの進行と関連するプロセス）の動因である。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、正常組織と比べて、がん細胞で過剰発現し、いくつかの治療法に対する、がん細胞の耐性、及び転移能と関連付けられている。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを発現することが知られているがんとしては、肺、乳房、卵巣、脊索腫、前立腺、結腸直腸及び膵臓腺癌が挙げられる。

【0325】

ＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードするＭＶＡの安全性及び潜在的な治療効果を示すために、インビトロ試験及び臨床試験が行われた。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ４：１７７７－９０（“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｖｉａ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ｙｅａｓｔ ｖａｃｃｉｎｅ”）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５ａ）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ３：１３２（“Ｐｈａｓｅ Ｉ，ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＭＶＡ－ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＴＲＩＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５ｂ）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ．３：１２４８－５６（“Ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｙｅａｓｔ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ（ＧＩ－６３０１）ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ”））を参照されたい。

【0326】

第１相臨床開発段階での静脈内経路の使用の裏付けとして、ＮＨＰ（カニクイザル）において、ＧＬＰ準拠の反復投与毒性試験を実施して、ＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ＭＶＡ－ｍＢＮ２４０Ｂ）の潜在的ないずれかの毒性を評価する。その毒性試験には、ＮＨＰにおけるＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの空間的分布及び時間分布を評価する生体内分布パートが含まれる。

【0327】

ＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、例えば放射線及び／またはチェックポイント阻害剤のような別の治療と任意に組み合わせて、ＭＶＡを腫瘍内注射することによってがん患者を治療する第ＩＩＩ相試験で使用する。

【0328】

本明細書に記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載されている発明の趣旨から逸脱せずに変更または修正してよいことは明らかであろう。我々は、後述の請求項の範囲及び趣旨の範囲内である上記のような修正形態または変更形態のすべてを特許請求する。

【0329】

配列表
付随の配列表に列挙されている核酸配列及びアミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基については標準的な略記、アミノ酸については、１文字表記または３文字表記のいずれかを用いて示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、示されている鎖に言及することによっていずれも、その相補鎖が含まれるものとして理解されたい。

【0330】

配列表内の配列：
配列番号１：ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列（２６１アミノ酸）
配列番号２：ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌ（７９２ヌクレオチド）
配列番号３：ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００３８０２．１のｈ４－１ＢＢＬ（２５４アミノ酸）
配列番号４：ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００３８０２．１のｈ４－１ＢＢＬ

【0331】

配列番号１
ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌ（２６１アミノ酸）
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ

【0332】

配列番号２
ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌ（７９２ヌクレオチド）
ｎｔ配列：
ａｔｇａｔｃｇａｇａｃａｔａｃａａｃｃａｇａｃａａｇｃｃｃｔａｇａａｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｇａｃｔｇｃｃｔａｔｃａｇｃａｔｇａａｇａｔｃｔｔｃａｔｇｔａｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇａｔｃａｃｃｃａｇａｔｇａｔｃｇｇｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｇａｃｇｇｃｔｇｇａｃａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｇａｇａｇａａａｃｃｔｇｃａｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｔｇｔｔｃａｔｇａａｇａｃｃａｔｃｃａｇｃｇｇｔｇｃａａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａｇａａｇｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｇｃｇａｇｇａａａｔｃａａｇａｇｃｃａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｔｔｃｇｔｇａａｇｇａｃａｔｃａｔｇｃｔｇａａｃａａａｇａｇｇａａａｃｇａａｇａａａｇａｇａａｃｔｃｃｔｔｃｇａｇａｔｇｃａｇａａｇｇｇｃｇａｃｃａｇａａｔｃｃｔｃａｇａｔｃｇｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｇａｔｃａｇｃｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｃａａｃａａｇｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｇｇｇｃｃｇａｇａａｇｇｇｃｔａｃｔａｃａｃｃａｔｇａｇｃａａｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｔｇｇａｇａａｃｇｇｃａａｇｃａｇｃｔｇａｃａｇｔｇａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｔａｃｔａｃａｔｃｔａｃｇｃｃｃａａｇｔｇａｃｃｔｔｃｔｇｃａｇｃａａｃａｇａｇａｇｇｃｃａｇｃｔｃｔｃａｇｇｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇａａｇｔｃｔｃｃｔｇｇｃａｇａｔｔｃｇａｇｃｇｇａｔｔｃｔｇｃｔｇａｇａｇｃｃｇｃｃａａｃａｃａｃａｃａｇｃａｇｃｇｃｃａａａｃｃｔｔｇｔｇｇｃｃａｇｃａｇｔｃｔａｔｔｃａｃｃｔｃｇｇｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｃａａｇｃｇｔｇｔｔｃｇｔｇａａｔｇｔｇａｃａｇａｃｃｃｔａｇｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃａｃｇｇｃａｃｃｇｇｃｔｔｔａｃａｔｃｔｔｔｃｇｇａｃｔｇｃｔｇａａｇｃｔｇｔｇａｔｇａｔａｇ

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25-1】

【図25-2】

【図26-1】

【図26-2】

【図27】

【図28】

【図29-1】

【図29-2】

【配列表】

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