特許 7625519 ウイルスの製造

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-24

(45)【発行日】2025-02-03

(54)【発明の名称】ウイルスの製造

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20250127BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20250127BHJP

   C12M 1/12 20060101ALN20250127BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

C12M1/00 D

C12M1/12

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2021528362

(86)(22)【出願日】2019-11-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-19

(86)【国際出願番号】 US2019062643

(87)【国際公開番号】W WO2020106975

(87)【国際公開日】2020-05-28

【審査請求日】2022-11-14

(31)【優先権主張番号】62/770,577

(32)【優先日】2018-11-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521244488

【氏名又は名称】カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ライト， ポール アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】ワック， ケイティ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ミンルイ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァスール， ジャッキー

(72)【発明者】

【氏名】ホリー， スーザン ニコル

(72)【発明者】

【氏名】レンショー， オーガスト アレン

(72)【発明者】

【氏名】ジュー， グワンユー

(72)【発明者】

【氏名】ヴェンデル， ミシェル キャサリン

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２１３５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２６５４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－０６７７２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】BMC Proceedings，2013, Vol.7, Suppl.6, #P60, pp.1-3

【文献】Journal of Virological Methods，2017, Vol.243, pp.68-73

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／００

Ｃ１２Ｍ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

製造方法であって、組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を生産するために、バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させることを含み、前記複数のウイルス感染宿主細胞は、約０．０００１～約０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）でウイルスに感染しており、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記バイオリアクターが固定床を含み、前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物が、約５０％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含み、組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団が、１０μｇ／ｌ×１０ ^９ ＰＦＵ未満の宿主細胞タンパク質および３００ｎｇ／ｌ×１０ ^９ ＰＦＵ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む、方法。

【請求項2】

前記固定床がマイクロキャリアを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記固定床が約０．０１Ｌから約２５Ｌ、または約２０Ｌから約１００Ｌの体積を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記固定床が少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記複数のウイルス感染宿主細胞が、前記バイオリアクター中に少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ^２から約１５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物を約２４時間から約９６時間成長させる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物が約３２℃から約３８℃の温度で維持される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物が約７．０から約７．５のｐＨで維持される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

アルカリ性緩衝液中でインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

細胞デブリを分解するための酵素とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記インキュベートすることの間の前記酵素の濃度が約５０ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記インキュベートすることが約２時間から約８時間行われる、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記インキュベートすることが約２２℃から約２８℃の温度で行われる、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

細胞デブリを分解するための前記酵素がベンゾナーゼ（登録商標）を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記アルカリ性緩衝液がトリス緩衝液を含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびベロ細胞からなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが組換え腫瘍溶解性ポックスウイルスを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

濾過した溶解物を生成するための濾過をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物を生成するために、前記濾過した溶解物の１つ以上のタンジェンシャルフロー濾過工程を実施することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記１つ以上のタンジェンシャルフロー濾過工程の後に１．２μｍ濾過をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

精製された組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団が、前記溶解物中に組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団の少なくとも約５０％～約９０％を含む、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１８年１１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／７７０，５７７号に基づく利益を主張し、この出願はその全体が参考として本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

背景
ウイルスは、多くの分野、例えば治療法、例えば腫瘍溶解性療法における使用が認められ得る。腫瘍溶解性ウイルスは、多くのタイプのがんの処置に大いに有望である。多くの場合では、天然に存在するウイルスの遺伝子工学を介して生成された組換え腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞を根絶するための有効なツールであることが証明されている。しかし、腫瘍溶解性ウイルスの治療適用は、多くの側面において高水準の要件を有する。例えば、臨床的に適用可能なウイルスは高純度であることが必要とされる場合がある。また治療効果を得るために高力価のウイルスが必要とされる場合がある。更に、治療適用のためにウイルス生産をどのようにスケールアップするかも依然として大きな課題のままである。したがって、ウイルスを製造する改善された方法が望ましい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

要旨
一態様では、本開示は：バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させて、１宿主細胞あたり少なくとも約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）から約３５０ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む製造方法を提供する。

【0004】

一態様では、本開示は（ｉ）バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させること；および（ｉｉ）前記培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記回収することが、前記培養物を溶解して、組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団を含む溶解物を生産することを含むこと、および（ｉｉｉ）前記溶解物を清澄化して、精製された組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を生産することであって、精製された組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団が、前記溶解物中に前記集団組換え腫瘍溶解性ウイルスの少なくとも約５０％から約９０％を含むことを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む製造方法を提供する。

【0005】

一態様では、本開示は：バイオリアクター中で成長させた複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、約１．５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むことを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む製造方法を提供する。

【0006】

一態様では、本開示は：バイオリアクター中で成長させた複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、前記培養物１ｍＬあたり約１．５×１０^８から約２×１０^１０ＰＦＵのウイルス力価を含むことを含み、バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む製造方法を提供する。

【0007】

一態様では、本開示は、（ｉ）バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させること；および（ｉｉ）前記培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することがアルカリ性条件で行われる製造方法を提供する。

【0008】

一態様では、本開示は、バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させて、組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を生産することであって、前記複数のウイルス感染宿主細胞が約０．０００１から約０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスに感染していることを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む製造方法を提供する。

【0009】

一態様では、本開示は、（ｉ）バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させることであって、前記複数のウイルス感染宿主細胞が、約０．０００１から約０．０１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスに感染していること、（ｉｉ）前記培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、約１．５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むことを含む製造方法を提供する。

【0010】

一部の実施形態では、前記バイオリアクターは固定床を含む。一部の実施形態では、前記固定床はマイクロキャリアを含む。一部の実施形態では、前記固定床は約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む。一部の実施形態では、前記固定床は少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む。一部の実施形態では、前記固定床は少なくとも約９６ｇ／Ｌの圧縮密度を含む。

【0011】

一部の実施形態では、前記複数のウイルス感染宿主細胞は、前記バイオリアクター中に少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ^２から約１５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種される。一部の実施形態では、前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物は約２４時間から約９６時間成長させる。一部の実施形態では、前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物は約４８時間から約７２時間成長させる。一部の実施形態では、前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物は少なくとも約２０％から約１００％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含む。一部の実施形態では、前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物は約３２℃から約３８℃の温度で維持される。一部の実施形態では、前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物は約７．０から約７．５のｐＨで維持される。一部の実施形態では、前記複数のウイルス感染細胞は、約０．０００５から約０．２の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスに感染している。

【0012】

一部の実施形態では、方法は、アルカリ性緩衝液中でインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む。一部の実施形態では、方法は、細胞デブリを分解するための酵素とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む。一部の実施形態では、方法は細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む。一部の実施形態では、前記回収することは、アルカリ性緩衝液中でインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む。一部の実施形態では、前記回収することは、細胞デブリを分解するための酵素とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む。一部の実施形態では、前記回収することは、細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む。一部の実施形態では、前記インキュベート中の前記酵素の濃度は、約５０ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、前記インキュベートすることは約２時間から約８時間行われる。一部の実施形態では、前記インキュベートすることは約２２℃から約２８℃の温度で行われる。一部の実施形態では、細胞デブリを分解するための前記酵素はベンゾナーゼ（登録商標）を含む。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液は８を超えるｐＨを構成する。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液は８．０を超えるｐＨから約１０．０のｐＨを構成する。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液は約９．５のｐＨを構成する。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液はトリス緩衝液を含む。一部の実施形態では、方法は前記インキュベート中のｐＨをモニタリングすることを更に含む。

【0013】

一部の実施形態では、方法は、濾過を行って、濾過した溶解物を生成することを更に含む。一部の実施形態では、方法は、細胞デブリを分解するための酵素で前記濾過した溶解物を処理することを更に含む。一部の実施形態では、前記処理することはアルカリ性条件で行われる。一部の実施形態では、前記処理することは約１０時間から約２４時間行われる。一部の実施形態では、前記処理することに続いて前記濾過した溶解物のタンジェンシャルフロー濾過が行われて、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物が生成される。一部の実施形態では、前記タンジェンシャルフロー濾過は、前記濾過した溶解物を濃縮することを含み、続いて透析濾過の少なくとも１巡目および２巡目が行われる。一部の実施形態では、透析濾過の前記１巡目は、約７．０から約７．５のｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、透析濾過の前記１巡目は、約１０倍体積の前記緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、約７．０から約７．５のｐＨを構成する前記緩衝液は、約１５ｍＭから約４０ｍＭのトリス濃度を含む。一部の実施形態では、約７．０から約７．５のｐＨを構成する前記緩衝液は、少なくとも約５体積％から少なくとも約２０体積％のスクロースを更に含む。一部の実施形態では、透析濾過の前記２巡目は、７．５を超えるｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、透析濾過の前記２巡目は、７．５を超えるｐＨを構成する前記緩衝液との約６倍体積の前記緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、７．５を超えるｐＨを構成する前記緩衝液は、約１０ｍＭから約３０ｍＭのトリス濃度を含む。一部の実施形態では、７．５を超えるｐＨを構成する前記緩衝液は、少なくとも約５体積％から少なくとも約１０体積％のスクロースを更に含む。

【0014】

一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約５ｎｇから約１００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約０．１μｇから約１０μｇの宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記単位用量は、約１×１０^９から約１×１０^１３ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０^９ＰＦＵあたり、最大約４００ｎｇ、約２００ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０ｎｇ、または約４０ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス１×１０^９ＰＦＵのあたり、最大約８０ｎｇ、約４０ｎｇ、約２０ｎｇ、約１０ｎｇ、または約８ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０^９ＰＦＵあたり、最大約７．５μｇ、約７μｇ、約６μｇ、約５μｇ、または約４μｇの宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス１×１０^９ＰＦＵあたり、最大約１．５μｇ、約１．４μｇ、約１．２μｇ、約１μｇ、または約０．８μｇの宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０^９ＰＦＵあたり、最大約１００ｎｇ、約６０ｎｇ、約５０ｎｇ、約３０ｎｇ、または約２５ｎｇの、前記培養物中において使用される血清アルブミンを含む。

【0015】

一部の実施形態では、前記宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびベロ細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む。

【0016】

一態様では、本開示は、本明細書において記載する方法によって生産される組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を含む組成物を提供する。

【0017】

一態様では、本開示は、１宿主細胞あたり少なくとも約５０ＰＦＵから約３５０ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む宿主細胞の培養物を含むバイオリアクターを提供する。

【0018】

一部の実施形態では、バイオリアクターは固定床を含み、前記固定床は宿主細胞の前記培養物を含む。一部の実施形態では、宿主細胞の前記培養物は、前記固定床内のマイクロキャリア中で増殖される。一部の実施形態では、バイオリアクターは宿主細胞の前記培養物を含み、前記培養物は約１，０００細胞／ｃｍ^２前記固定床から約１０，０００細胞／ｃｍ^２前記固定床の宿主細胞密度を含む。一部の実施形態では、前記固定床は約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む。一部の実施形態では、前記固定床は少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む。一部の実施形態では、前記固定床は約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む。

【0019】

一態様では、本開示は、約１．５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むバイオリアクターを提供する。一部の実施形態では、バイオリアクターは固定床を含み、前記固定床は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む培養物を含む。一部の実施形態では、前記固定床は約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む。一部の実施形態では、前記固定床は少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む。一部の実施形態では、前記固定床は約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む。

【0020】

一態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約７２時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、約１．５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むことを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することがアルカリ性条件で行われる方法を提供する。

【0021】

一部の実施形態では、前記バイオリアクターは固定床を含む。一部の実施形態では、前記固定床はマイクロキャリアを含む。一部の実施形態では、前記固定床は約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む。一部の実施形態では、前記固定床は少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む。一部の実施形態では、前記固定床は少なくとも約９６ｇ／Ｌの圧縮密度を含む。一部の実施形態では、前記宿主細胞は、前記バイオリアクター中に少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ^２から約１５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種される。一部の実施形態では、前記更なる培養物は、少なくとも約２０％から約１００％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含む。一部の実施形態では、前記更なる培養物は約５０％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含む。一部の実施形態では、前記更なる培養物は約３２℃から約３８℃の温度で維持される。一部の実施形態では、前記更なる培養物は約３６℃の温度で維持される。一部の実施形態では、前記更なる培養物は約７．０から約７．５のｐＨで維持される。一部の実施形態では、前記更なる培養物は約７．２のｐＨで維持される。一部の実施形態では、前記回収することは、細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む。一部の実施形態では、前記インキュベート中の細胞デブリを分解するための前記酵素の濃度は、約５０ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、前記インキュベートすることは約２２℃から約２８℃の温度で行われる。一部の実施形態では、前記インキュベートすることは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、または最大約３０℃の温度で行われる。一部の実施形態では、前記インキュベートすることは約２５℃の温度で行われる。一部の実施形態では、前記インキュベートすることは約２７℃の温度で行われる。一部の実施形態では、細胞デブリを分解するための前記酵素はベンゾナーゼ（登録商標）を含む。一部の実施形態では、細胞デブリを分解するための前記細胞酵素はベンゾナーゼ（登録商標）を含み、前記インキュベートすることは、前記ベンゾナーゼ（登録商標）の存在下、約１５０ＩＵ／ｍＬの濃度、約２７℃の温度で約５時間行われる。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液は８を超えるｐＨを構成する。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液は８．０を超えるｐＨから約１０．０のｐＨを構成する。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液は約９．５のｐＨを構成する。一部の実施形態では、前記アルカリ性緩衝液はトリス緩衝液を含む。

【0022】

一部の実施形態では、方法は、前記インキュベート中のｐＨをモニタリングすることを更に含む。

【0023】

一部の実施形態では、方法は、濾過を行って、濾過した溶解物を生成することを更に含む。一部の実施形態では、方法は、前記濾過した溶解物を細胞溶解酵素で処理することを更に含む。一部の実施形態では、前記処理することはアルカリ性条件で行われる。一部の実施形態では、前記処理することは約１０時間から約２４時間行われる。一部の実施形態では、前記処理することは約４℃の温度で約１８時間行われる。一部の実施形態では、前記処理することに続いて、前記濾過した溶解物のタンジェンシャルフロー濾過が行われて、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物が生成される。一部の実施形態では、前記タンジェンシャルフロー濾過は、前記濾過した溶解物を濃縮することを含み、続いて透析濾過の少なくとも１巡目および２巡目が行われる。一部の実施形態では、濃縮の２巡目を行ってもよい。一部の実施形態では、透析濾過の前記１巡目は、約９．０から約９．５のｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、透析濾過の前記１巡目は約２０倍体積の前記緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、約９．０から約９．５のｐＨを構成する前記緩衝液は、約４０ｍＭから約１００ｍＭのトリス濃度を含む。一部の実施形態では、透析濾過の前記２巡目は、約７．０から約８．０のｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、透析濾過の前記２巡目は約１０倍体積の前記緩衝液交換を含む。一部の実施形態では、約７．０から約８．０のｐＨを構成する前記緩衝液は、約１５ｍＭから約３０ｍＭのトリス濃度を含む。一部の実施形態では、約７．０から約８．０のｐＨを構成する前記緩衝液は、少なくとも約５体積％から少なくとも約２０体積％のスクロースを更に含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約５ｎｇから約１００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約０．１μｇから約１０μｇの宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記単位用量は、約１×１０^９から約１×１０^１３ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０^９ＰＦＵあたり、最大約４００ｎｇ、約２００ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０ｎｇ、または約４０ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス１×１０^９ＰＦＵあたり、最大約２０００ｎｇ、約１０００ｎｇ、約５００ｎｇ、約２５０ｎｇ、または約２００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０^９ＰＦＵあたり最大約７．５μｇ、約７μｇ、約６μｇ、約５μｇ、または約４μｇの宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス１×１０^９ＰＦＵあたり、最大約３７．５μｇ、約３５μｇ、約３０μｇ、約２５μｇ、または約２０μｇの宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０^９ＰＦＵあたり、最大約１００ｎｇ、約６０ｎｇ、約５０ｎｇ、約３０ｎｇ、または約２５ｎｇの前記培養物中において使用される血清アルブミンを含む。

【0024】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３６℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約７２時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0025】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００３ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を、約３５℃の温度および約４５％の溶存酸素圧レベルで約４８時間成長させて複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約８．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0026】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３２℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約２４時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約８．０のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0027】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物は約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約７．８のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0028】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００５ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0029】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３６℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約７２時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０^１２ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0030】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００３ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３５℃の温度および約４５％の溶存酸素圧レベルで約４８時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０^１２ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約８．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0031】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３２℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約２４時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０^１２ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約８．０のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0032】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０^１２ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約７．８のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0033】

別の態様では、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００５ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０^１２ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法を提供する。

【0034】

一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉｉｉ）で回収された組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団を精製して、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物を生産することを更に含む。一部の実施形態では、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物は、少なくとも約２×１０^１１から約７×１０^１１ＰＦＵのウイルスを含む。
参照による組込み

【0035】

この明細書において言及する全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の文献、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的にかつ個々に示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0036】

本開示の新規な特徴を添付の特許請求の範囲に特に記載する。本開示の特徴および利点のより良い理解は、開示の原理が利用される例示の実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られることになる：

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１は、例示的なウイルスの製造プロセスのフローチャートである。

【0038】

【図2】図２は、例示的なウイルスの製造プロセスのフローチャートである。

【0039】

【図3】図３は、例示的なウイルスの製造プロセスのフローチャートである。

【0040】

【図4】図４は、例示的なウイルスの製造プロセスのフローチャートである。

【0041】

【図5】図５は、例示的なウイルスの製造プロセスのフローチャートである。

【0042】

【図6】図６は、ウイルスを製造するための例示的な下流プロセスのフローチャートである。

【0043】

【図7】図７は、ウイルスを製造するための例示的な下流プロセスのフローチャートである。

【0044】

【図8】図８は、ウイルスを製造するための例示的な下流プロセスのフローチャートである。

【0045】

【図9】図９は、ウイルスを製造するための例示的な下流プロセスのフローチャートである。

【0046】

【図10】図１０は、清澄化プロセスのための例示的な設定の概略図を示す。

【0047】

【図11】図１１は、ＴＦＦおよび透析濾過プロセスのための例示的な設定の概略図を示す。

【0048】

【図12】図１２は、最終的な濾過プロセスのための例示的な設定の概略図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

詳細な説明
ある特定の定義

【0050】

本明細書において使用する専門用語は、特定の場合を記載するためだけのものであり、限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示さない限り、複数形を含んでいてもよい。更に、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」という用語、またはこれらの変形が発明を実施するための形態および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲で、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の様式で包含的であることを意図する。

【0051】

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって判定される特定の値に関する許容される誤差範囲内を意味する場合があり、どのように値が測定されたかまたは判定されたか、例えば測定システムの制限に一部依存することになる。例えば、「約」は、所与の値における慣行に従って１以内または１を超える標準偏差を意味する場合がある。特定の値が本出願および特許請求の範囲において記載される場合、特に記載がない限り、「約」という用語は、特定の値に関して許容される誤差範囲、例えば「約」という用語によって修飾された値の±１０％を意味することが仮定されるべきである。

【0052】

「個体」、「患者」、または「対象」という用語は、区別せずに使用してもよい。いずれの用語も、医療従事者（例えば医師、正看護師、ナースプラクティショナー、医師の助手、オーダリ、またはホスピスワーカー）の監督（例えば継続的または断続的な）によって特徴付けられる状況を必要としたり、限定したりするものではない。一部の実施形態では、患者、対象、または個体は医療従事者監督下にあり得る。

【0053】

「突然変異」という用語は、本明細書で使用される場合、欠失、異種核酸の挿入、反転または置換を指す場合があり、当技術分野において通常理解されるようなオープンリーディングフレーム切断突然変異を含む。

【0054】

「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、個々のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸のセグメント（「コード配列」または「コード領域」とも称される）を、必要に応じて関連する調節領域、例えば、プロモーター、オペレーター、ターミネーターなどとともに指す場合があり、それは、コード配列の上流または下流に位置していてもよい。

【0055】

「組換えウイルス」および「改変ウイルス」という用語は、本明細書において区別せずに使用され、そのゲノム中に１つまたは複数の突然変異を含むウイルスを指す場合があり、これらに限定されないが、欠失、異種核酸の挿入、逆位、置換またはこれらの組合せを含む。

【0056】

「腫瘍溶解性」という用語は、本明細書で使用される場合、がんまたは腫瘍細胞を殺傷することを指す場合があり、その殺傷は、例えば前記細胞の直接的な溶解を介した薬剤、例えば腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによるもの、前記細胞に対する免疫応答、アポトーシス、毒性タンパク質の発現、オートファジーおよびタンパク質合成のシャットダウン、抗腫瘍免疫の誘導、または任意のこれらの組合せを刺激することによるものである。薬剤、例えば腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる感染したがんまたは腫瘍細胞の直接的な溶解は、前記細胞内のウイルスの複製の結果であり得る。ある特定の例では、「腫瘍溶解性」という用語は、前記細胞を溶解せずにがんまたは腫瘍細胞を殺傷することを指す。

【0057】

「対象」という用語は、これらに限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウスを含む動物を指す場合がある。「対象」および「患者」という用語は、例えば哺乳動物対象、例えばヒト対象への言及で本明細書において区別せずに使用される。

【0058】

「処置する」、「処置すること」、および「処置」という用語は、障害、疾患、もしくは状態；または障害、疾患、もしくは状態と関連する症状のうちの１つまたは複数を軽減または消失させること；または障害、疾患、または状態自体の原因を軽減または根絶することを含むことを意味する場合がある。処置の望ましい効果としては、これらに限定されるものではないが、疾患の出現または再発を阻止すること、症状を緩和させること、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果を減少させること、転移を阻止すること、疾患の進行速度を減少させること、疾患状況を改善または緩和すること、および予後を寛解または改善することがあり得る。

【0059】

本開示の一態様は、ウイルスを製造するための方法およびシステムを提供する。一部の場合では、本明細書において提供する方法およびシステムは、ウイルスの製造において効率的および生産的であり得る。例えば、本明細書において記載する方法およびシステムは、ウイルスを１宿主細胞あたり高力価で生産することができる。本明細書において記載する方法およびシステムは、産業規模で、例えば、１生産サイクルあたり高収率で、例えば、宿主細胞の感染、ウイルス感染細胞の培養から、ウイルスの回収ならびにウイルスの清澄化および精製までのウイルスの生産に適用することができる。本明細書において提供する方法は、限られた量のタンパク質または核酸の混入を含むか、これらを全く含まない高純度のウイルス調製物を生産することができる。一部の場合では、本明細書において提供する方法およびシステムは、組換えウイルスの生産に適用することができる。一部の場合では、本明細書において提供する方法およびシステムは、腫瘍溶解性ウイルスの生産に適用することができる。

【0060】

本明細書において提供するウイルスを製造する方法は、バイオリアクター中でウイルス感染宿主細胞を含む細胞培養物を成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法およびシステムは、固定床バイオリアクターを使用してウイルス感染宿主細胞を培養してもよい。ウイルスを製造する方法は、宿主細胞に感染させて（接種して）、ウイルス感染宿主細胞を含む細胞培養物を生成することを含んでいてもよい。ウイルスを製造する方法は、細胞培養物からウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含んでいてもよい。一部の場合では、ウイルスの集団を回収することは、アルカリ性条件で行ってもよい。方法は、回収から得られた細胞溶解物の清澄化および精製を行って、精製したウイルス調製物を生成することを含んでいてもよい。一部の場合では、清澄化および精製は、細胞溶解物を濾過することを含んでいてもよい。一部の場合では、清澄化および精製は、細胞溶解物を、細胞デブリを分解するための酵素で処理し、続いて濾過することを含んでいてもよい。方法はまた、濾過を行って、高純度の濃縮ウイルス調製物を生成することを含んでいてもよい。一部の場合では、濾過はタンジェンシャルフロー濾過を含んでいてもよい。

【0061】

本明細書において提供するウイルスを製造する方法は、（ａ）複数の宿主細胞を感染させて（接種して）、ウイルス感染宿主細胞を含む細胞培養物を生成すること；（ｂ）バイオリアクター中でウイルス感染宿主細胞を含む細胞培養物を成長させること；（ｃ）細胞培養物からウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団をアルカリ性条件で回収すること；および（ｄ）回収から得られた細胞溶解物の清澄化および精製を行って、精製したウイルス調製物を生成することを含んでいてもよい。一部の場合では、清澄化および精製は：（ｉ）細胞デブリを分解するための酵素で細胞溶解物を処理すること；および（ｉｉ）処理された細胞溶解物の濾過を行って、高純度の濃縮ウイルス調製物を生成することを含んでいてもよい。

【0062】

本明細書において提供する方法は、細胞培養物を成長させて、ウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスを、１宿主細胞あたり少なくとも約５０ＰＦＵ（ＰＦＵ／細胞）、少なくとも約６０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約７０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約８０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約９０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１１０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１２０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１４０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１６０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１８０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２２０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２４０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２５０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２６０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２８０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２９０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約３００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約３２０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約３４０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約３５０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約３６０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約３８０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約４００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約４５０ＰＦＵ／細胞、少なくとも約５００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約６００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約７００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約８００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約９００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約１０００ＰＦＵ／細胞、少なくとも約２０００ＰＦＵ／細胞、または少なくとも約５０００ＰＦＵ／細胞の力価で生産することを含んでいてもよい。一部の場合では、方法は、細胞培養物を成長させて、ウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスを、約５０ＰＦＵ／細胞から約３５０ＰＦＵ／細胞の力価で生産することを含んでいてもよい。一部の場合では、方法は、細胞培養物を成長させて、ウイルスを約１００ＰＦＵ／細胞から約３００ＰＦＵ／細胞、１５０ＰＦＵ／細胞から約３００ＰＦＵ／細胞、２００ＰＦＵ／細胞から約３００ＰＦＵ／細胞、２５０ＰＦＵ／細胞から約３００ＰＦＵ／細胞、１００ＰＦＵ／細胞から約５００ＰＦＵ／細胞、２００ＰＦＵ／細胞から約５００ＰＦＵ／細胞、２５０ＰＦＵ／細胞から約５００ＰＦＵ／細胞、３００ＰＦＵ／細胞から約５００ＰＦＵ／細胞、４００ＰＦＵ／細胞から約５００ＰＦＵ／細胞、１００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、２００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、３００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、４００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、５００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、６００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、７００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、８００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞、または９００ＰＦＵ／細胞から約１０００ＰＦＵ／細胞の力価で生産することを含んでいてもよい。

【0063】

本明細書において提供する方法は、約１．５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵのウイルスを含む培養物から、ウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含んでいてもよい。一部の場合では、方法は、少なくとも約１×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約１．５×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約２×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約２．５×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約３×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約４×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約５×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約７．５×１０^１１ＰＦＵ、少なくとも約１×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約１．５×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約２×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約２．５×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約３×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約４×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約５×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約７．５×１０^１２ＰＦＵ、少なくとも約１×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約１．５×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約２×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約２．５×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約３×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約４×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約５×１０^１３ＰＦＵ、少なくとも約７．５×１０^１３ＰＦＵ、または少なくとも約１×１０^１４ＰＦＵのウイルスを含む培養物からウイルスの集団を回収することを含んでいてもよい。一部の場合では、方法は、約１×１０^１１から約１×１０^１４ＰＦＵ、約５×１０^１１から約１×１０^１４ＰＦＵ、約１×１０^１２から約１×１０^１４ＰＦＵ、約５×１０^１２から約１×１０^１４ＰＦＵ、約１×１０^１３から約１×１０^１４ＰＦＵ、約５×１０^１３から約１×１０^１４ＰＦＵ、約１×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵ、約２×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵ、約５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵ、約１×１０^１２から約５×１０^１３ＰＦＵ、約２×１０^１２から約５×１０^１３ＰＦＵ、約５×１０^１２から約５×１０^１３ＰＦＵ、または約１×１０^１３から約５×１０^１３ＰＦＵのウイルスを含む培養物からウイルスを回収することを含んでいてもよい。

【0064】

本明細書において提供する方法は、前記培養物１ｍＬあたり約１．５×１０^８から約２×１０^１０ＰＦＵ、例えば前記培養物１ｍＬあたり約１．５×１０^８から約５×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、２．５×１０^８から約７．５×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、５×１０^８から約２．５×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、１．５×１０^９から約５×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、２．５×１０^９から約１×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、５×１０^９から約１．５×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、または約７．５ ｘ１０^９から約２×１０^１０ＰＦＵのウイルス力価で、ウイルスを含む培養物から、ウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含んでいてもよい。

【0065】

本明細書において提供する方法は、培養物から、ウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収して、ウイルスの集団を含む溶解物を生産し、溶解物を清澄化して、精製したウイルスの集団を生産することを含んでいてもよく、精製したウイルスの集団は、溶解物中に少なくとも約５０％から約９０％のウイルスの集団を含んでいてもよい。一部の場合では、精製したウイルスの集団は、細胞培養物中に少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を含んでいてもよい。一部の場合では、精製したウイルスの集団は、細胞培養物中に約４０％から約９９％、約５０％から約９９％、約６０％から約９９％、約７０％から約９９％、約８０％から約９９％、約９０％から約９９％、約９５％から約９９％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約８５％から約９０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約７５％から約８０％、約４０％から約５０％、約４０％から約６０％、約４０％から約７０％、約５０％から約６０％、または約５０％から約７０％のウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を含んでいてもよい。

【0066】

本明細書において提供する方法は、回収したウイルス溶解物を精製して、ウイルスの精製調製物を生成することを含んでいてもよい。本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、ウイルスの単位用量中に多くとも約２ｎｇ、多くとも約３ｎｇ、多くとも約４ｎｇ、多くとも約５ｎｇ、多くとも約６ｎｇ、多くとも約７ｎｇ、多くとも約８ｎｇ、多くとも約９ｎｇ、多くとも約１０ｎｇ、多くとも約１１ｎｇ、多くとも約１２ｎｇ、多くとも約１３ｎｇ、多くとも約１４ｎｇ、多くとも約１５ｎｇ、多くとも約１６ｎｇ、多くとも約１７ｎｇ、多くとも約１８ｎｇ、多くとも約１９ｎｇ、多くとも約２０ｎｇ、多くとも約２１ｎｇ、多くとも約２２ｎｇ、多くとも約２３ｎｇ、多くとも約２４ｎｇ、多くとも約２５ｎｇ、多くとも約２８ｎｇ、多くとも約３０ｎｇ、多くとも約５０ｎｇ、多くとも約７５ｎｇ、多くとも約１００ｎｇ、多くとも約５００ｎｇ、多くとも約７５０ｎｇ、多くとも約１μｇ、または多くとも約２μｇの宿主細胞ＤＮＡを含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、ウイルスの単位用量中に約２ｎｇ、約３ｎｇ、約４ｎｇ、約５ｎｇ、約６ｎｇ、約７ｎｇ、約８ｎｇ、約９ｎｇ、約１０ｎｇ、約１１ｎｇ、約１２ｎｇ、約１３ｎｇ、約１４ｎｇ、約１５ｎｇ、約１６ｎｇ、約１７ｎｇ、約１８ｎｇ、約１９ｎｇ、約２０ｎｇ、約２１ｎｇ、約２２ｎｇ、約２３ｎｇ、約２４ｎｇ、約２５ｎｇ、約２８ｎｇ、約３０ｎｇ、約５０ｎｇ、約８２ｍｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約５００ｎｇ、約７５０ｎｇ、約１μｇ、または約２μｇの宿主細胞ＤＮＡを含んでいてもよい。一部の場合では、ウイルスの精製調製物中の宿主細胞ＤＮＡは、シリカベースのカラムを使用したＤＮＡの抽出および精製、または標準的な方法によるＤＮＡの抽出によって測定してもよい。一部の場合では、ウイルスの精製調製物中の宿主細胞ＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）またはＱｉａｇｅｎ（登録商標）キットを用いたプロセシングの後に、宿主細胞ゲノムに特異的なプローブを備えた定量的リアルタイムＰＣＲによって測定してもよい。本明細書において提供する場合、ウイルスの単位用量は、約０．５×１０^９、約１×１０^９、約２×１０^９、約５×１０^９、約７．５×１０^９、約１×１０^１０、約２×１０^１０、約５×１０^１０、約７．５×１０^１０、約１×１０^１１、約２×１０^１１、約５×１０^１１、約７．５×１０^１１、約１×１０^１２、約２×１０^１２、約５×１０^１２、約７．５×１０^１２、約１×１０^１３、約２×１０^１３、約５×１０^１３、約７．５×１０^１３、約１×１０^１４、約２×１０^１４、約５×１０^１４、約７．５×１０^１４、約１×１０^１５、または約１×１０^１６ＰＦＵのウイルスを含んでいてもよい。一部の場合では、ウイルスの単位用量は、約１×１０^９から約１×１０^１３ＰＦＵのウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスを含んでいてもよい。一部の場合では、ウイルスの単位用量は、約１×１０^９から約１×１０^１３のウイルス、例えば５×１０^９のウイルスを含んでいてもよい。一部の例では、ウイルスの単位用量は、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープウイルス（ＣＥＶ）および細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）を含んでいてもよい。

【0067】

本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、５×１０^９のウイルスの用量中に多くとも約５ｎｇ、多くとも約１０ｎｇ、多くとも約１５ｎｇ、多くとも約２０ｎｇ、多くとも約２５ｎｇ、多くとも約２８ｎｇ、多くとも約３０ｎｇ、多くとも約３３ｎｇ、多くとも約３５ｎｇ、多くとも約４０ｎｇ、多くとも約４５ｎｇ、多くとも約５０ｎｇ、多くとも約８０ｎｇ、多くとも約１００ｎｇ、多くとも約１５０ｎｇ、多くとも約２００ｎｇ、多くとも約２５０ｎｇ、多くとも約３００ｎｇ、多くとも約４００ｎｇ、または多くとも約５００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、５×１０^９のウイルスの用量中に約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約１５ｎｇ、約２０ｎｇ、約２５ｎｇ、約２８ｎｇ、約３０ｎｇ、約３３ｎｇ、約３５ｎｇ、約４０ｎｇ、約４５ｎｇ、約５０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１５０ｎｇ、約２００ｎｇ、約２５０ｎｇ、約３００ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約１μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約３μｇ、または約５μｇの宿主細胞ＤＮＡを含んでいてもよい。本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、１×１０^９のウイルスの用量中に多くとも約１ｎｇ、多くとも約２ｎｇ、多くとも約３ｎｇ、多くとも約４ｎｇ、多くとも約５ｎｇ、多くとも約５．６ｎｇ、多くとも約６ｎｇ、多くとも約６．６ｎｇ、多くとも約７ｎｇ、多くとも約８ｎｇ、多くとも約９ｎｇ、多くとも約１０ｎｇ、多くとも約１６ｎｇ、多くとも約２０ｎｇ、多くとも約３０ｎｇ、多くとも約４０ｎｇ、多くとも約５０ｎｇ、多くとも約６０ｎｇ、多くとも約８０ｎｇ、または多くとも約１００ｎｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、または約１μｇの宿主細胞ＤＮＡを含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、１×１０^９のウイルスの用量中に約５１ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含んでいてもよい。

【0068】

本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、ウイルスの単位用量中に多くとも約０．１μｇ、多くとも約０．２μｇ、多くとも約０．３μｇ、多くとも約０．４μｇ、多くとも約０．５μｇ、多くとも約０．６μｇ、多くとも約０．７μｇ、多くとも約０．８μｇ、多くとも約０．９μｇ、多くとも約１μｇ、多くとも約１．１μｇ、多くとも約１．２μｇ、多くとも約１．３μｇ、多くとも約１．４μｇ、多くとも約１．５μｇ、多くとも約２μｇ、多くとも約５μｇ、多くとも約７．５μｇ、多くとも約１０μｇ、多くとも約２０μｇ、多くとも約３０μｇ、多くとも約５０μｇ、または多くとも約１００μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、ウイルスの単位用量中に約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約７．５μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、または約３０μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約０．１μｇから約７．５μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。一部の場合では、宿主細胞タンパク質の含有量は、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質を標的とするＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着アッセイ）によって判定される。

【0069】

一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、５×１０^９のウイルスの用量中に多くとも約０．１μｇ、多くとも約０．５μｇ、多くとも約１μｇ、多くとも約１．５μｇ、多くとも約２μｇ、多くとも約２．５μｇ、多くとも約３μｇ、多くとも約３．５μｇ、多くとも約４μｇ、多くとも約４．５μｇ、多くとも約５μｇ、多くとも約５．５μｇ、多くとも約６μｇ、多くとも約６．５μｇ、多くとも約７μｇ、多くとも約７．５μｇ、多くとも約１０μｇ、または多くとも約２０μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、５×１０^９のウイルスの用量中に約０．１μｇ、約０．５μｇ、約１μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約２．５μｇ、約３μｇ、約３．５μｇ、約４μｇ、約４．５μｇ、約５μｇ、約５．５μｇ、約６μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約１０μｇ、または約２０μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、１×１０^９のウイルスの用量中に約０．０２μｇ、多くとも約０．１μｇ、多くとも約０．２μｇ、多くとも約０．３μｇ、多くとも約０．４μｇ、多くとも約０．５μｇ、多くとも約０．６μｇ、多くとも約０．７μｇ、多くとも約０．８μｇ、多くとも約０．９μｇ、多くとも約１μｇ、多くとも約１．１μｇ、多くとも約１．２μｇ、多くとも約１．３μｇ、多くとも約１．４μｇ、多くとも約１．５μｇ、多くとも約２μｇ、または多くとも約４μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法に従って生成されたウイルスの精製調製物は、５×１０^９のウイルスの用量中に約０．０２μｇ、約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、または約４μｇの宿主細胞タンパク質を含んでいてもよい。

【0070】

ウイルス

【0071】

本明細書において提供する方法およびシステムは、さまざまな異なるウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスの製造に適用可能であり得る。一部の場合では、本明細書において提供する方法およびシステムは、ワクシニアウイルス、例えば、組換えワクシニアウイルスの製造に適用可能であり得る。

【0072】

本明細書において提供する方法およびシステムが適用可能である例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水胞性口内炎ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル疾患ウイルス、セネカウイルス、レンチウイルス、メンゴウイルス、および粘液腫ウイルスがある。ある特定の例では、腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスであってもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法およびシステムは、ワクシニアウイルスの異なる株のバリアント、例えば、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｄｒｙｖａｘ、ＥＭ６３、ＡＣＡＭ２０００、改変ワクシニアアンカラ（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ）、ＬＣ１６ｍ８、ＣＶ－１、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、コントーノラボラトリー（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）、ＮＹＣＢＨ、ＷＲΔＥ３Ｌ、および大連Ｉ（Ｄａｉｒｅｎ Ｉ）に適用可能であり得る。本明細書において提供する方法が適用可能であるウイルスは、遺伝的改変、例えば、１つもしくは複数のウイルス性内因性遺伝子の欠失もしくは突然変異、または外因性ウイルスの導入を含んでいてもよい。一部の例では、ウイルスは組換えワクシニアウイルスであってもよい。一部の場合では、組換えワクシニアウイルスは、ウイルスのゲノム中に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０個の、または更にそれを超える改変を含んでいてもよい。ウイルス遺伝子の欠失としては、ウイルス遺伝子の部分的なまたは完全な欠失があり得る。本明細書で使用される場合、「部分的な欠失」または「突然変異」は、内因性ウイルス遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕでの部分的な欠失または突然変異をそれぞれ指す場合がある点に留意するべきである。あるいは、それらは、内因性ウイルス遺伝子を、遺伝子の一部を欠いている（「部分的な欠失」）または遺伝子に１つまたは複数のヌクレオチドの変化を有する（「突然変異」）他の同一の外因性核酸で置き換えることを指す場合がある。

【0073】

一部の場合では、本明細書において開示される方法によって製造することができるウイルスは、１つまたは複数の遺伝的改変を含むワクシニアウイルスであってもよい。一部の場合では、ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼ陰性、Ｃ１２Ｌ（ＩＬ１８結合タンパク質）ウイルス遺伝子欠失、ＴＲＩＦ遺伝子挿入、ＨＰＧＤ遺伝子挿入であるように、および表面グリコシル化が減少するように、ＴＫ（チミジンキナーゼ）ウイルス遺伝子突然変異を含んでいてもよい。一部の場合では、ワクシニアウイルスは、以下の遺伝子操作された改変：（ｉ）Ｃ１２Ｌ（ＩＬ１８結合タンパク質）ウイルス遺伝子欠失；（ｉｉ）ＴＲＩＦ遺伝子挿入；または（ｉｉｉ）ＨＰＧＤ遺伝子挿入のうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。一部の場合では、ワクシニアウイルスは、表面グリコシル化の減少を含んでいてもよい。一部の場合では、表面グリコシル化の減少は、ウイルス表面のシアリル化の減少であってもよい。一部の場合では、ワクシニアウイルスは、改変ワクシニアウイルスと比較してグリコシル化レベルが減少していてもよい。一部の場合では、ワクシニアウイルスは、本明細書において記載する製造プロセス中または後に、ただし宿主に投与する前に、グリコシル化（例えば、シアリル化）の量を減少させる薬剤で処理してもよい。一部の場合では、ワクシニアウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｌｙｓｌ５１からＧｌｕの突然変異；Ｂ５Ｒの完全なまたは部分的な欠失；Ａ３６Ｒの突然変異／欠失、および／またはＡ５６Ｒの突然変異／欠失の群から選択される１つまたは複数の改変を更に含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒの完全なまたは部分的な欠失を含む脱グリコシル化ＶＶであってもよい。

【0074】

任意の好適な宿主細胞を、本開示に従ってウイルスを製造するために選択してもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法において使用する宿主細胞は、付着細胞であってもよい。他の場合では、宿主細胞は懸濁液中で培養してもよい。一部の場合では、宿主細胞は、確立された細胞系、例えばこれらに限定されないが、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、アフリカミドリサル腎臓（ＡＧＭＫ）細胞、例えばベロ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、およびＨｅｌａ細胞からサブ培養してもよい。一部の場合では、宿主細胞はＨｅｌａ細胞であってもよい。一部の場合では、宿主（ｈｏｔｓ）細胞は、遺伝子改変細胞、例えば、１つもしくは複数の外因性遺伝子の導入、または１つもしくは複数の内因性遺伝子の欠失もしくは突然変異によって遺伝子改変することができるＨｅｌａ細胞であってもよい。一部の場合では、宿主細胞は、生物、例えばヒトから得られた初代細胞であってもよい。一部の場合では、宿主細胞は、無制限に継代培養（またはサブ培養）することができる不死化細胞であってもよい。

【0075】

一部の例では、本明細書において提供する方法は、宿主細胞をウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスに直接感染させることを含んでいてもよい。例えば、宿主細胞はウイルスに直接接触させて、感染させてもよい。一部の場合では、ウイルスは宿主細胞の培養培地に添加して、接種してもよい。一部の場合では、宿主細胞は、少なくとも約０．０００５、少なくとも約０．０００７５、少なくとも約０．００１、少なくとも約０．００１５、少なくとも約０．００２、少なくとも約０．００３、少なくとも約０．００５、少なくとも約０．００７５、少なくとも約０．０１、少なくとも約０．０１５、少なくとも約０．０２、少なくとも約０．０２５、少なくとも約０．０３、少なくとも約０．０３５、少なくとも約０．０４、少なくとも約０．０４５、少なくとも約０．０５、少なくとも約０．０７５、少なくとも約０．１、少なくとも約０．１５、少なくとも約０．２、少なくとも約０．２５、少なくとも約０．３、少なくとも約０．３５、少なくとも約０．４、少なくとも約０．４５、または少なくとも約０．５ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスによって感染させてもよい。一部の場合では、感染多重度は、感染のために使用したウイルスのプラーク形成単位を宿主細胞の数で割ったものとして計算してもよい。一部の場合では、宿主細胞は、多くとも約０．０００５、多くとも約０．０００７５、多くとも約０．００１、多くとも約０．００１５、多くとも約０．００２、多くとも約０．００３、多くとも約０．００５、多くとも約０．００７５、多くとも約０．０１、多くとも約０．０１５、多くとも約０．０２、多くとも約０．０２５、多くとも約０．０３、多くとも約０．０３５、多くとも約０．０４、多くとも約０．０４５、多くとも約０．０５、多くとも約０．０７５、多くとも約０．１、多くとも約０．１５、多くとも約０．２、多くとも約０．２５、多くとも約０．３、多くとも約０．３５、多くとも約０．４、多くとも約０．４５、または多くとも約０．５ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でウイルスによって感染されてもよい。一部の場合では、約０．０００５、約０．０００７５、約０．００１、約０．００１５、約０．００２、約０．００３、約０．００５、約０．００７５、約０．０１、約０．０１５、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０３５、約０．０４、約０．０４５、約０．０５、約０．０７５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、または約０．５ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でウイルスによって感染させてもよい。一部の場合では、宿主細胞は、約０．００１から約０．０２ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でウイルスによって感染させてもよい。

【0076】

ウイルス感染細胞の培養

【0077】

本明細書において提供する方法は、バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させることを含んでいてもよい。本明細書において提供する方法は、上述のように高力価でウイルスを生産することができる。本明細書において提供する方法において使用するバイオリアクターは、培養培地の均一な分布を提供する一体化された混合システムであってもよい。一部の場合では、バイオリアクターは、高密度で細胞を培養することが可能であり得、高い生産収率をもたらす。一部の場合では、バイオリアクターは線形スケーラビリティを有していてもよく、例えば、バイオリアクターの立体配置は、必要に応じてベンチ規模と産業規模の両方の生産に適合し得る。

【0078】

一部の場合では、バイオリアクターは、固定床反応器を含んでいてもよい。本明細書において提供する方法およびシステムは、細胞を固定化するための支持体として使用することができる担体材料が充填またはパックされた容器を含む固定床反応器を含んでいてもよい。固定床反応器は、培養培地を含むコンディショニング容器も含んでいてもよい。一部の場合では、担体材料およびコンディショニング容器を備えた容器は、循環システムを介して結合してもよい。循環システムは循環ループであってもよい。循環システムは、固定床を介してコンディショニング容器からポンプで送り返すことができる酸素富化培地を含んでいてもよい。一部の場合では、酸素は、固定床に直接供給してもよい。固定床反応器では、細胞は固定床に保持することができる。コンディショニング容器中の培地は、バッチ式でまたは連続的に交換することができるため、消耗し、生成物を含む培地を新鮮な培地と交換することができる。一部の場合では、培地は、連続的に交換してもよい。固定床反応器は軸流ベースの固定床システムであってもよく、固定床を介した培地の軸方向のポンプ輸送を使用して、細胞に新鮮な培地および酸素を提供することができる。一部の場合では、固定床反応器は半径方向流ベースの固定床システムであってもよく、培地の半径方向ポンプ輸送は固定床を通過し、例えば培地は固定床を介して中心点から固定床の周囲に向かって半径方向にポンプで送ってもよい。固定床は、マイクロキャリアを含んでいてもよい。マイクロキャリアは適切な材料で作製することができる。一部の場合では、マイクロキャリアはＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）で作製することができる。一部の場合では、マイクロキャリアは、合成材料、天然材料、またはその両方で作製することができる。合成材料としては、これらに限定されないが、ガラス（例えば、ナトロン、ボロシリケート）、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリプロピレン、ポリウレタン、セラミック、アクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリスチレン、およびポリアクリルアミドがある。天然材料としては、これらに限定されないが、コラーゲン、セルロース、ゼラチン、フィブリン、キチンおよびその誘導体、キトサン、アルギネート、ポリサッカライド、ならびにポリグリカンがある。

【0079】

一部の場合では、ウイルス感染宿主細胞を含む細胞培養物は、固定床バイオリアクター中で成長させてもよい。固定床バイオリアクターは、比較的大きな表面対体積比を提供することができるマイクロキャリアを含んでいてもよく、細胞を十分な酸素および栄養に曝露する。固定床バイオリアクターは、排出時間、例えばバイオリアクター中の培養培地を最大限に排出するのに必要な時間が短い場合がある。一部の場合では、排出時間は、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１４分未満、約１３分未満、約１２分未満、約１１分未満、または約１０分未満であってもよい。一部の場合では、排出時間は、約８０分、約５０分、約３０分、約１２．５分、約１２分、約１１．５分、約１１分、または約１０．５分であってもよい。固定床バイオリアクターは、培地を最大限に排出することができる場合に、残留体積、例えば培養培地の残留体積を小さくすることができる。一部の場合では、バイオリアクターは、約１５００ｍｌ未満、約１２００ｍｌ未満、約１０００ｍｌ未満、約９００ｍｌ未満、約８００ｍｌ未満、約７００ｍｌ未満、約６００ｍｌ未満、約５００ｍｌ未満、約４００ｍｌ未満、約３００ｍｌ未満、約２００ｍｌ未満、約１５０ｍｌ未満、または約１００ｍｌ未満の残留体積を有していてもよい。一部の場合では、バイオリアクターは、約１１５０ｍｌ、約１１００ｍｌ、約１０５０ｍｌ、約１０００ｍｌ、約９５０ｍｌ、約９００ｍｌ、約８５０ｍｌ、約８００ｍｌ、約７５０ｍｌ、約７００ｍｌ、約６５０ｍｌ、約６００ｍｌ、約５５０ｍｌ、約５００ｍｌ、約４５０ｍｌ、約４００ｍｌ、約３５０ｍｌ、約３００ｍｌ、約２５０ｍｌ、約２００ｍｌ、または約１５０ｍｌの残留体積を有していてもよい。

【0080】

一部の場合では、方法は、約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む固定床中で培養物を成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、少なくとも約０．００５Ｌ、少なくとも約０．０１Ｌ、少なくとも約０．０５Ｌ、少なくとも約０．１Ｌ、少なくとも約０．５Ｌ、少なくとも約１Ｌ、少なくとも約２Ｌ、少なくとも約３Ｌ、少なくとも約４Ｌ、少なくとも約５Ｌ、少なくとも約６Ｌ、少なくとも約７Ｌ、少なくとも約８Ｌ、少なくとも約９Ｌ、少なくとも約１０Ｌ、少なくとも約１２Ｌ、少なくとも約１４Ｌ、少なくとも約１５Ｌ、少なくとも約１６Ｌ、少なくとも約１８Ｌ、少なくとも約２０Ｌ、少なくとも約２１Ｌ、少なくとも約２２Ｌ、少なくとも約２３Ｌ、少なくとも約２４Ｌ、少なくとも約２５Ｌ、少なくとも約２６Ｌ、少なくとも約２７Ｌ、少なくとも約２８Ｌ、少なくとも約２９Ｌ、少なくとも約３０Ｌ、少なくとも約３５Ｌ、少なくとも約４０Ｌ、少なくとも約５０Ｌ、少なくとも約７５Ｌ、または少なくとも約１００Ｌの体積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約０．００５Ｌ、約０．０１Ｌ、約０．０５Ｌ、約０．１Ｌ、約０．５Ｌ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１２Ｌ、約１４Ｌ、約１５Ｌ、約１６Ｌ、約１８Ｌ、約２０Ｌ、約２１Ｌ、約２２Ｌ、約２３Ｌ、約２４Ｌ、約２５Ｌ、約２６Ｌ、約２７Ｌ、約２８Ｌ、約２９Ｌ、約３０Ｌ、約３５Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約６５Ｌ、約７０Ｌ、約７５Ｌ、または約１００Ｌの体積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約１Ｌの体積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約７０Ｌの体積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約０．００５Ｌから約２５Ｌ、約０．０１Ｌから約２５Ｌ、約０．０５Ｌから約２５Ｌ、約０．１Ｌから約２５Ｌ、約０．１５Ｌから約２５Ｌ、約０．２Ｌから約２５Ｌ、約０．５Ｌから約２５Ｌ、約１Ｌから約２５Ｌ、約５Ｌから約２５Ｌ、約１０Ｌから約２５Ｌ、約１５Ｌから約２５Ｌ、約２０Ｌから約２５Ｌ、約０．００５Ｌから約１５Ｌ、約０．０５Ｌから約１５Ｌ、約０．５Ｌから約１５Ｌ、約５Ｌから約１５Ｌ、約１０Ｌから約１５Ｌ、約０．００５Ｌから約５０Ｌ、約０．５Ｌから約５０Ｌ、約５Ｌから約５０Ｌ、約１０Ｌから約５０Ｌ、約１５Ｌから約５０Ｌ、約２５Ｌから約５０Ｌ、約３０Ｌから約５０Ｌ、約１Ｌから約１００Ｌ、約５Ｌから約１００Ｌ、約１０Ｌから約１００Ｌ、約２０Ｌから約１００Ｌ、約５０Ｌから約１００Ｌ、または約７５Ｌから約１００Ｌの体積を含んでいてもよい。

【0081】

一部の場合では、方法は、少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む固定床中で培養物を成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約６０ｇ／Ｌ、少なくとも約７０ｇ／Ｌ、少なくとも約８０ｇ／Ｌ、少なくとも約９０ｇ／Ｌ、少なくとも約９１ｇ／Ｌ、少なくとも約９２ｇ／Ｌ、少なくとも約９３ｇ／Ｌ、少なくとも約９４ｇ／Ｌ、少なくとも約９５ｇ／Ｌ、少なくとも約９６ｇ／Ｌ、少なくとも約９７ｇ／Ｌ、少なくとも約９８ｇ／Ｌ、少なくとも約９９ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１２０ｇ／Ｌ、少なくとも約１３０ｇ／Ｌ、少なくとも約１４０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約１６０ｇ／Ｌの圧縮密度を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、少なくとも約９６ｇ／Ｌの圧縮密度を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、約１４１ｇ／Ｌ、約１４２ｇ／Ｌ、約１４３ｇ／Ｌ、約１４４ｇ／Ｌ、約１４５ｇ／Ｌ、約１４６ｇ／Ｌ、約１４７ｇ／Ｌ、約１４８ｇ／Ｌ、約１４９ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１５５ｇ／Ｌ、または約１６０ｇ／Ｌの圧縮密度を含んでいてもよい。

【0082】

一部の場合では、方法は、バイオリアクター中で宿主細胞を播種して、ウイルスを接種する前にある特定の期間成長させることを含んでいてもよい。他の場合では、方法は、バイオリアクター中でウイルス感染宿主細胞を播種して、培養物を成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、ウイルスを接種する前の宿主細胞は、バイオリアクター中で少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ^２から約５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種してもよい。一部の場合では、ウイルスを接種する前の宿主細胞は、少なくとも約１０，０００細胞／ｃｍ^２から約４００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種してもよい。一部の場合では、ウイルスを接種する前の宿主細胞は、少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１，５００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２，５００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約３，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約３，５００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約４，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約４，５００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約５，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約４０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約５０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約６０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約７０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約８０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約９０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１００，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１１０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１２０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１３０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１４０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１５０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１６０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１７０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１８０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約１９０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２００，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２１０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２２０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２４０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２６０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約２８０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約３００，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約３４０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約３６０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約３８０，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約４００，０００細胞／ｃｍ^２、少なくとも約４５０，０００細胞／ｃｍ^２、または少なくとも約５００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種してもよい。一部の場合では、宿主細胞は、約２，５００細胞／ｃｍ^２の密度で播種してもよい。一部の場合では、ウイルスを接種する前の宿主細胞は、約１，５００細胞／ｃｍ^２、約１，６００細胞／ｃｍ^２、約１，８００細胞／ｃｍ^２、約２，２００細胞／ｃｍ^２、約２，２００細胞／ｃｍ^２、約２，４００細胞／ｃｍ^２、約２，６００細胞／ｃｍ^２、約２，８００細胞／ｃｍ^２、約３，０００細胞／ｃｍ^２、約３，５００細胞／ｃｍ^２、約４，０００細胞／ｃｍ^２、約４，５００細胞／ｃｍ^２、約５，０００細胞／ｃｍ^２、約６，０００細胞／ｃｍ^２、約７，０００細胞／ｃｍ^２、約８，０００細胞／ｃｍ^２、約９，０００細胞／ｃｍ^２、約１０，０００細胞／ｃｍ^２、約１５，０００細胞／ｃｍ^２，約２０，０００細胞／ｃｍ^２、約３０，０００細胞／ｃｍ^２，約４０，０００細胞／ｃｍ^２、約５０，０００細胞／ｃｍ^２、約６０，０００細胞／ｃｍ^２、約７０，０００細胞／ｃｍ^２、約８０，０００細胞／ｃｍ^２、約９０，０００細胞／ｃｍ^２、約１００，０００細胞／ｃｍ^２、約１１０，０００細胞／ｃｍ^２、約１２０，０００細胞／ｃｍ^２、約１３０，０００細胞／ｃｍ^２、約１４０，０００細胞／ｃｍ^２、約１５０，０００細胞／ｃｍ^２、約１６０，０００細胞／ｃｍ^２、約１７０，０００細胞／ｃｍ^２、約１８０，０００細胞／ｃｍ^２、約１９０，０００細胞／ｃｍ^２、約２００，０００細胞／ｃｍ^２、約２１０，０００細胞／ｃｍ^２、約２２０，０００細胞／ｃｍ^２、約２４０，０００細胞／ｃｍ^２、約２６０，０００細胞／ｃｍ^２、約２８０，０００細胞／ｃｍ^２、約３００，０００細胞／ｃｍ^２、約３４０，０００細胞／ｃｍ^２、約３６０，０００細胞／ｃｍ^２、約３８０，０００細胞／ｃｍ^２、約４００，０００細胞／ｃｍ^２、約４５０，０００細胞／ｃｍ^２、または約５００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種してもよい。

【0083】

一部の場合では、本明細書において記載する方法は、バイオリアクター中で宿主細胞を決定された期間成長させること、次いでバイオリアクター中で決定された密度で宿主細胞を感染させることを含んでいてもよい。一部の場合では、宿主細胞は、約５日間から約１５日間、例えば約５日間から約８日間、約７日間から約１０日間、約８日間から約１２日間、または約１０日間から約１５日間バイオリアクター中で成長させてもよい。一部の場合では、宿主細胞は、約５、６、７、８、９、または１０日間バイオリアクター中で成長させてもよい。

【0084】

一部の態様では、本開示は、多数のウイルスを含む宿主細胞の培養物を含むバイオリアクターを提供する。一部の場合では、バイオリアクターは、本明細書において提供する方法に従ってウイルス感染宿主細胞を培養するために使用することができるバイオリアクターであってもよい。例示的なバイオリアクターは、１宿主細胞あたり少なくとも約５０ＰＦＵから約３５０ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む宿主細胞の培養物を含んでいてもよい。別の例示的なバイオリアクターは、少なくとも約１．５×１０^１１から約５×１０^１３ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む宿主細胞の培養物を含んでいてもよい。一部の場合では、バイオリアクターは、固定床を含んでいてもよく、固定床は、宿主細胞の培養物を含んでいてもよい。一部の場合では、宿主細胞の培養物は、固定床内のマイクロキャリア中で増殖させることができる。一部の場合では、培養物は、約２，０００細胞／ｃｍ^２から約１０，０００細胞／ｃｍ^２の宿主細胞密度の固定床を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約０．２ｍ^２から約５００ｍ^２、例えば、約０．２ｍ^２から約０．５ｍ^２、約０．４ｍ^２から約１ｍ^２、約０．８ｍ^２から約１．５ｍ^２、約１ｍ^２から約５ｍ^２、約４ｍ^２から約６ｍ^２、約５ｍ^２から約２０ｍ^２、約２０ｍ^２から約５０ｍ^２、約５０ｍ^２から約１００ｍ^２、約１００ｍ^２から約２００ｍ^２、約２００ｍ^２から約４００ｍ^２、約２５０ｍ^２から約５００ｍ^２の表面積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約４ｍ^２の表面積を含んでいてもよい。一部の場合では、固定床は、約５００ｍ^２の表面積を含んでいてもよい。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ウイルスの生産規模は、本明細書において記載する方法において使用する固定床の表面積に依存する場合がある。例えば、約４ｍ^２の表面積を有する固定床を使用してウイルス感染細胞を培養した場合、４×１０^１１から１×１０^１２ＰＦＵのウイルスを本明細書において提供する方法を使用して生産することができる。一部の場合では、約５００ｍ^２の表面積を有する固定床を使用してウイルス感染細胞を培養した場合、１×１０^１３から２．５×１０^１４ＰＦＵのウイルスを本明細書において提供する方法を使用して生産することができる。

【0085】

本明細書において提供する方法は、ある特定の期間培養物を成長させることを含んでいてもよく、その間にウイルスを複製することができる。本明細書において提供する方法は、十分な期間培養物を成長させて、培養物中で所望のウイルス力価に到達させることを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物は、約２４時間から約９６時間成長させてもよい。一部の場合では、培養物は、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、約４８時間、約５０時間、約５２時間、約５４時間、約５６時間、約５８時間、約６０時間、約６２時間、約６４時間、約６６時間、約６８時間、約７０時間、約７２時間、約７４時間、約７６時間、約７８時間、約８０時間、約８２時間、約８４時間、約８６時間、約８８時間、約９０時間、約９２時間、約９４時間、約９６時間、約１００時間、約１２０時間、約１５０時間、約１６０時間、または約１８０時間成長させてもよい。一部の場合では、培養物は、約７２時間成長させてもよい。一部の場合では、培養物は、少なくとも約２０時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５２時間、少なくとも約５６時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６２時間、少なくとも約６４時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約６８時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約７６時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約８８時間、少なくとも約９２時間、少なくとも約９４時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１００時間、または少なくとも約１２０時間成長させてもよい。一部の場合では、培養物は、多くとも約２４時間、多くとも約２８時間、多くとも約３２時間、多くとも約３６時間、多くとも約４０時間、多くとも約４４時間、多くとも約４８時間、多くとも約５２時間、多くとも約５６時間、多くとも約６０時間、多くとも約６４時間、多くとも約６８時間、多くとも約７２時間、多くとも約７６時間、多くとも約８０時間、多くとも約８４時間、多くとも約８８時間、多くとも約９２時間、多くとも約９６時間、多くとも約１００時間、多くとも約１２０時間、多くとも約１５０時間、多くとも約１６０時間、または多くとも約１８０時間成長させてもよい。一部の場合では、培養物は、約３日間成長させてもよい。

【0086】

本明細書において提供する方法は、少なくとも約２０％から約１００％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルで培養物を成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のＤＯＴレベルを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物は、約２０％、約３０％、約４０％、約４２％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％のＤＯＴレベルを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物は、約５０％のＤＯＴレベルを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物は、多くとも約２５％、多くとも約３０％、多くとも約４０％、多くとも約５０％、多くとも約６０％、多くとも約７０％、多くとも約８０％、多くとも約９０％、多くとも約９５％、または多くとも約１００％のＤＯＴレベルを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物は、約５０％のＤＯＴレベルを含んでいてもよい。

【0087】

本明細書において提供する方法は、ウイルス感染宿主細胞を含む培養物を約３２℃から約３８℃の温度で成長させることを含んでいてもよい。本明細書において提供する方法は、ウイルス感染宿主細胞を含む培養物を維持された温度で成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、維持された温度は、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３６．２℃、約３６．４℃、約３６．６℃、約３６．８℃、約３７℃、約３７．２℃、約３７．４℃、約３７．６℃、約３７．８℃、または約３８℃であってもよい。一部の場合では、培養物の温度は、ウイルスのライフサイクル、宿主細胞の成長段階、またはその両方に応じて、時々、例えば第１の維持された温度で第１の期間および第２の維持された温度で第２の期間変更してもよい。一部の場合では、維持された温度は、非常に正確に、例えば、±１．５℃未満、±１．２℃未満、±１．０℃未満、±０．９℃未満、±０．８℃未満、±０．７℃未満、±０．６℃未満、±０．５℃未満、±０．４℃未満、±０．３℃未満、±０．２℃未満、±０．１℃未満、または±０．０５℃未満の変動で制御することができる。培養物の温度を維持することができる精度は、多数の因子、例えば、ウイルスのライフサイクル、ウイルスおよび宿主細胞の温度感受性、ならびに培養培地に応じて調整してもよい。一部の場合では、培養物は約３７℃で維持してもよい。

【0088】

一部の場合では、本明細書において提供する方法は、ウイルス感染宿主細胞を含む培養物を約７．０から約７．５のｐＨで成長させることを含んでいてもよい。一部の場合では、培養物のｐＨは、ある特定のレベル、例えば、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、または約８．０で維持してもよい。一部の場合では、維持されたｐＨは、宿主細胞およびウイルスのタイプに応じて、少なくとも約８．０、または最大で約７．０であってもよい。一部の場合では、培養物のｐＨは約７．２で維持してもよい。一部の場合では、方法は、約１．２未満、約１．１未満、約１．０未満、約０．９未満、約０．８未満、約０．７未満、約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１未満、約０．０８未満、約０．０６未満、約０．０５未満、約０．０２未満、または約０．０１未満の変動で維持されたｐＨで培養物を成長させることを含んでいてもよい。細胞培養中、ウイルス感染宿主細胞を含む培養物のｐＨは、培地を十分にｐＨ調整することができる新鮮培地と交換することによって調整してもよい。培養物のｐＨはｐＨ緩衝液によって維持してもよい。一部の場合では、ｐＨは、ＣＯ_２ガスを制御することによって、または培養培地に酸もしくはアルカリを補充すること、例えばＨＣｌを添加してｐＨを低下させるかもしくはＮａＯＨを添加してｐＨを増加させることによって調整して、所望のレベルにしてもよい。一部の態様では、ｐＨはまた、ＣＯ_２を添加することによって改変してもよい。

【0089】

ウイルスの回収

【0090】

本開示の一部の態様は、複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物から、ウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、例えば組換え腫瘍溶解性ウイルスを回収する方法を提供する。ウイルスを回収することは、ウイルス感染宿主細胞の溶解し、その結果ウイルスを溶解物に放出すること、および溶解物を収集することを含んでいてもよい。ウイルスを回収することはまた、バイオリアクターの回収前の洗浄を含んでいてもよい。一部の場合では、回収前の洗浄は、溶解物から混入物質（例えば、タンパク質、核酸、消耗した製品、および培養培地中の他の分子）を除去するために行ってもよい。

【0091】

ウイルス感染宿主細胞を上述のようにある特定の期間培養した後、バイオリアクター、例えば担体を、その後ウイルス回収することに備えて適切な洗浄液によって洗浄してもよい。一部の場合では、洗浄液は、緩衝液、例えばトリス緩衝液であってもよい。一部の場合では、洗浄液は、７５ｍＭトリスおよび７．３のｐＨを含んでいてもよい。洗浄ステップは任意の適切な温度で任意の適切な期間行ってもよい。一部の場合では、洗浄ステップのパラメーター、例えば、洗浄液（例えば、イオン濃度、ｐＨ）、温度、洗浄期間は十分に調整してもよく、その結果、宿主細胞をこのステップにおいてほとんど溶解させないようにすることができる。一部の場合では、担体は７５ｍＭトリス溶液（ｐＨ７．３、２５℃）によって３０分間洗浄してもよい。

【0092】

一部の態様では、本開示は、培養物からウイルスを回収するためのｐＨシフト方法を提供する。本開示の一部の態様による回収することは、ウイルス感染宿主細胞をアルカリ性緩衝液中でインキュベートすることを含んでいてもよい。一部の場合では、回収することは、ウイルス感染宿主細胞と細胞デブリを分解するための酵素とをインキュベートすることも含んでいてもよい。一部の場合では、回収することは、ウイルス感染宿主細胞と細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とをインキュベートすることを含んでいてもよい。アルカリ性緩衝液は、少なくとも約８のｐＨを含んでいてもよい。一部の場合では、アルカリ性緩衝液は、少なくとも約８．０、少なくとも約８．２、少なくとも約８．４、少なくとも約８．５、少なくとも約８．６、少なくとも約８．８、少なくとも約９．０、少なくとも約９．１、少なくとも約９．２、少なくとも約９．３、少なくとも約９．４、少なくとも約９．５、少なくとも約９．６、少なくとも約９．７、少なくとも約９．８、少なくとも約９．９、少なくとも約１０．０、少なくとも約１０．４、少なくとも約１０．８、または少なくとも約１１．０のｐＨを含んでいてもよい。一部の場合では、アルカリ性緩衝液は、約８．０、約８．２、約８．４、約８．５、約８．６、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０．０、約１０．２、約１０．４、約１０．６、約１０．８、または約１１．０のｐＨを含んでいてもよい。一部の場合では、アルカリ性緩衝液は、トリスを含んでいてもよい。一部の場合では、アルカリ性緩衝液は、約９．５のｐＨを含んでいてもよい。一部の場合では、アルカリ性緩衝液は、約９．６のｐＨを含んでいてもよい。一部の場合では、アルカリ性緩衝液は、約０．２未満、約０．１未満、約０．０８未満、約０．０６未満、約０．０５未満、約０．０２未満、または約０．０１未満の変動で決定されたｐＨを有していてもよい。１つの例において、アルカリ性緩衝液は、７５ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および９．５のｐＨを含んでいてもよい。別の例では、アルカリ性緩衝液は、９０ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および９．５のｐＨを含んでいてもよい。１つの例において、アルカリ性緩衝液は、７５ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および９．６のｐＨを含んでいてもよい。１つの例において、アルカリ性緩衝液は、７５ｍＭのトリス、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２および９．６のｐＨを含んでいてもよい。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、溶解緩衝液の高いｐＨは、宿主細胞、宿主細胞のエンドソーム、またはその両方の優れた溶解の一因となる可能性があり、その結果、その中に「捕捉された」可能性があるウイルスがより容易に暴露されるようになる場合があり、その結果ウイルスが高収率で得られる。

【0093】

一部の場合では、酵素は、本明細書において提供する方法において細胞デブリを分解するために使用することができる。酵素は、細胞溶解物中で遊離核酸を取り除くためのヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼを含んでいてもよい。一部の場合では、酵素は、プロテアーゼ、例えば、ＴｒｙｐＬＥまたはトリプシンを含んでいてもよい。

【0094】

ヌクレアーゼは、核酸モノマー間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す場合がある。ヌクレアーゼは、その標的分子における一本鎖および二本鎖の切断をもたらすことができる。異なるヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを本明細書において提供する方法において使用することができ、核酸標的の異なる遺伝子座に作用する。エキソヌクレアーゼは、核酸を末端から消化することができ、同時にエンドヌクレアーゼは標的分子の中央の領域に作用することができる。ヌクレアーゼは、本明細書で使用される場合、天然に存在するヌクレアーゼ、またはそのアミノ酸配列が天然に存在するヌクレアーゼに由来する組換え（遺伝子操作された）ヌクレアーゼであってもよい。例えば、遺伝学的に遺伝子操作されたセラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）のヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ（登録商標））をこの目的のために使用することができる。一部の場合では、方法は、ウイルス感染宿主細胞と細胞デブリを分解するための酵素とをインキュベートすることを含んでいてもよく、その酵素は約５０ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬであってもよい。一部の場合では、ウイルス回収のインキュベート中、細胞デブリを分解するための酵素は、約２０ＩＵ／ｍＬ、約３０ＩＵ／ｍＬ、約５０ＩＵ／ｍＬ、約７５ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１３０ＩＵ／ｍＬ、約１４０ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１６０ＩＵ／ｍＬ、約１７０ＩＵ／ｍＬ、約１８０ＩＵ／ｍＬ、約１９０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２０ＩＵ／ｍＬ、約２４０ＩＵ／ｍＬ、約２６０ＩＵ／ｍＬ、約２８０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、または約４００ＩＵ／ｍＬであってもよい。一部の場合では、ウイルス回収のインキュベート中、細胞デブリを分解するための酵素は、少なくとも約２０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約３０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約７５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１２５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１３０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１４０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１６０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１７０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１８０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１９０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約２００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約２２０ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも約２４０ＩＵ／ｍＬであってもよい。一部の場合では、ウイルス回収のインキュベート中、細胞デブリを分解するための酵素は、多くとも約５０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約７５ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１００ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１２５ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１３０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１４０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１５０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１６０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１７０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１８０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約１９０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約２００ＩＵ／ｍＬ、多くとも約２２０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約２４０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約２６０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約２８０ＩＵ／ｍＬ、多くとも約３００ＩＵ／ｍＬ、または多くとも約４００ＩＵ／ｍＬであってもよい。本明細書において提供する方法の一部の実施形態では、ウイルスを回収することは、ウイルス感染宿主細胞とベンゾナーゼ（登録商標）とを約１５０ＩＵ／ｍＬでインキュベートすることを含んでいてもよい。

【0095】

ウイルスを回収するための細胞溶解緩衝液中でのウイルス感染宿主細胞のインキュベートは、適切な時間にわたって持続させてもよい。一部の場合では、インキュベートは、約２時間から約８時間であってもよい。一部の場合では、インキュベートは、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１５時間、または約２０時間であってもよい。一部の場合では、インキュベートは、少なくとも約２時間から少なくとも約８時間であってもよい。一部の場合では、インキュベートは、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約１５時間であってもよい。一部の場合では、インキュベートは約２時間から約８時間であってもよい。一部の場合では、インキュベートは、多くとも約２時間、多くとも約３時間、多くとも約４時間、多くとも約５時間、多くとも約６時間、多くとも約７時間、多くとも約８時間、多くとも約９時間、多くとも約１０時間、多くとも約１２時間、多くとも約１５時間、または多くとも約２０時間であってもよい。本明細書において提供する方法の一部の実施形態では、ウイルスを回収することは、ウイルス感染宿主細胞を細胞溶解緩衝液中で約４時間インキュベートすることを含んでいてもよい。

【0096】

ウイルスを回収するための細胞溶解緩衝液中でのウイルス感染宿主細胞のインキュベートは、任意の適切な温度、例えば約２２℃から約２８℃であってもよい。一部の場合では、ウイルスを回収するためのインキュベートに関する温度は、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、または約３２℃であってもよい。一部の場合では、温度は、ある特定の温度で維持してもよい。一部の場合では、維持された温度は、非常に正確に、例えば、±１．５℃未満、±１．２℃未満、±１．０℃未満、±０．９℃未満、±０．８℃未満、±０．７℃未満、±０．６℃未満、±０．５℃未満、±０．４℃未満、±０．３℃未満、±０．２℃未満、±０．１℃未満、または±０．０５℃未満の変動で制御することができる。本明細書において提供する方法の一部の実施形態では、ウイルスを回収することは、ウイルス感染宿主細胞を約２５℃でインキュベートすることを含んでいてもよい。

【0097】

清澄化

【0098】

一部の場合では、本明細書において提供する方法は、清澄化ステップを行って濾過した溶解物を生成することを更に含んでいてもよい。清澄化のステップは、混入物質を消失または減少させ、ウイルスを精製するために行ってもよい。一部の場合では、本明細書において提供する清澄化のステップは、濾過およびヌクレアーゼ処理を含んでいてもよい。一部の場合では、清澄化のステップは、遠心分離によるウイルスの精製を含んでいてもよい。

【0099】

清澄化のステップは、濾過することを含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法によって回収した溶解物は、フィルターに通して濾過して、濾過した溶解物を生成してもよい。本明細書において提供する場合、フィルターは、孔径よりも大きいサイズの粒子を保持し、孔径よりも小さいサイズの粒子を通過させる孔径を有していてもよい。任意の適切なフィルターを、ウイルスを単離し、精製する目的で濾過ステップを実施するために選択してもよい。一部の場合では、フィルターは、平均的なフィルターサイズを有していてもよく、そのサイズは、少なくとも約０．１５μｍ、少なくとも約０．１８μｍ、少なくとも約０．２μｍ、少なくとも約０．２２μｍ、少なくとも約０．２５μｍ、少なくとも約０．２８μｍ、少なくとも約０．３μｍ、少なくとも約０．３５μｍ、少なくとも約０．４μｍ、少なくとも約０．４５μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約０．５５μｍ、少なくとも約０．６μｍ、少なくとも約０．６５μｍ、少なくとも約０．７μｍ、少なくとも約０．７５μｍ、少なくとも約０．８μｍ、少なくとも約０．８５μｍ、少なくとも約０．９μｍ、少なくとも約０．９５μｍ、または少なくとも約１μｍであってもよい。一部の場合では、フィルターは、平均的なフィルターサイズを有していてもよく、そのサイズは、多くとも約０．１８μｍ、多くとも約０．２μｍ、多くとも約０．２２μｍ、多くとも約０．２５μｍ、多くとも約０．２８μｍ、多くとも約０．３μｍ、多くとも約０．３５μｍ、多くとも約０．４μｍ、多くとも約０．４５μｍ、多くとも約０．５μｍ、多くとも約０．５５μｍ、多くとも約０．６μｍ、多くとも約０．６５μｍ、多くとも約０．７μｍ、多くとも約０．７５μｍ、多くとも約０．８μｍ、多くとも約０．８５μｍ、多くとも約０．９μｍ、多くとも約０．９５μｍ、多くとも約１μｍ、または多くとも約１．５μｍであってもよい。一部の場合では、濾過は１個を超えるフィルター、例えば、２、３、４、５、６個、またはそれを超えるフィルターで行ってもよい。一部の場合では、１個を超えるフィルターは、同じ孔径または異なるサイズを有していてもよく、例えば、一部の例では、溶解物は、約５μｍの平均サイズを有するフィルターで、続いて約１．２μｍの平均サイズを有するフィルターで濾過してもよい。一部の例では、溶解物は、約５μｍの平均サイズを有するフィルターで、続いて約２．４μｍの平均サイズを有するフィルターで、次いで約１μｍのフィルターで濾過してもよい。

【0100】

図１０で例示されたように、清澄化プロセスは、フラッシュ緩衝液を用いてフィルターに通して溶解物をフラッシュすることによって行ってもよい。一部の場合では、清澄化プロセスに関する流速は、約５０から約５００ｍＬ／分、例えば、約５０から約１００ｍＬ／分、約７５から約１２０ｍＬ／分、約１００から約１５０ｍＬ／分、約１２５から約１７５ｍＬ／分、約１５０から約２００ｍＬ／分、約１７５から約２５０ｍＬ／分、約２２５から約３００ｍＬ／分、約２５０から約３２５ｍＬ／分、約２７５から約３５０ｍＬ／分、約３００から約３７５ｍＬ／分、約３２５から約４００ｍＬ／分、約３５０から約４２５ｍＬ／分、約３７５から約４５０ｍＬ／分、約４００から約４７５ｍＬ／分、または約４２５から約５００ｍＬ／分であってもよい。一部の場合では、清澄化プロセスに関する流速は、約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２８０、２９０、３００、または３２０ｍＬ／分であってもよい。流速は、ＬＭＨ（Ｌ／ｍ^２／時間）で記載される場合がある。一部の場合では、清澄化プロセスに関する流速は、約１００から約７５０ＬＭＨ、例えば約１００から約１７５ＬＭＨ、約１２５から約２００ＬＭＨ、約１５０から約２２５ＬＭＨ、約１７５から約２５０ＬＭＨ、約２００から約２７５ＬＭＨ、約２２５から約３００ＬＭＨ、約２５０から約３２５ＬＭＨ、約２７５から約３５０ＬＭＨ、約３００から約３７５ＬＭＨ、約３２５から約４００ＬＭＨ、約３５０から約４２５ＬＭＨ、約３７５から約４５０ＬＭＨ、約４００から約４７５ＬＭＨ、約４２５から約５００ＬＭＨ、約４５０から約５２５ＬＭＨ、約４７５から約５５０ＬＭＨ、約５００から約５７５ＬＭＨ、または約５２５から約６００ＬＭＨであってもよい。一部の場合では、清澄化プロセスに関する流速は約１５０ＬＭＨであってもよい。一部の場合では、清澄化プロセスに関する流速は約４９０ＬＭＨであってもよい。一部の場合では、フラッシュ速度は、異なる孔径のフィルターごとに個別に選択してもよく、例えば、より高い流速をより大きい孔径のフィルターに対して使用することができ、同時により低い流速をより小さい孔径のフィルターに対して使用することができる。一部の場合では、フラッシュ緩衝液は、溶解物と同様の構成要素、例えば、同様のイオンおよびイオン濃度、ならびに同様のｐＨか、または溶解物と異なる構成要素を有していてもよい。一部の場合では、清澄化プロセスは、室温で、または任意の他の適切な温度、例えば、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２８℃、３０℃、３２℃、または３７℃で行ってもよい。

【0101】

濾過ステップ後、濾過した溶解物は、細胞デブリを分解するための酵素、例えばヌクレアーゼ、例えばベンゾナーゼ（登録商標）で更に処理して、混入物質、例えば核酸を消失させて、深層濾過の濾液を生成してもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は、ベンゾナーゼ（登録商標）を含む緩衝液と十分な時間インキュベートしてもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は、少なくとも約１０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約２０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約４０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約５０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約６０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約８０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１２０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１３０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１４０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１５０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１６０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１７０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１８０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約２００Ｕ／ｍｌ、少なくとも約２５０Ｕ／ｍｌ、少なくとも約３００Ｕ／ｍｌ、少なくとも約５００Ｕ／ｍｌ、または少なくとも約１０００Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）を含む緩衝液とインキュベートしてもよい。一部の場合では、細胞デブリを分解するための酵素による濾過した溶解物の処理は、少なくとも約８．０、少なくとも約８．１、少なくとも約８．２、少なくとも約８．３、少なくとも約８．４、少なくとも約８．５、少なくとも約８．６、少なくとも約８．７、少なくとも約８．８、少なくとも約８．９、少なくとも約９．０、少なくとも約９．１、少なくとも約９．２、少なくとも約９．３、少なくとも約９．４、少なくとも約９．５、少なくとも約９．６、少なくとも約９．７、少なくとも約９．８、または少なくとも約１０．０のｐＨで行ってもよい。一部の場合では、細胞デブリを分解するための酵素による濾過した溶解物の処理は、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、または約１０．０のｐＨで行ってもよい。一部の場合では、細胞デブリを分解するための酵素による濾過した溶解物の処理は、約７．５から約９．５、約７．５から約１０．０、約８．０から約１０．０、約８．５から約１０．０、約８．５から約１０．５、約９．０から約１０．５、または約９．０から約１１．０のｐＨで行ってもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は、細胞デブリを分解するための酵素によって少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、または少なくとも約４８時間処理してもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は、細胞デブリを分解するための酵素によって約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３４時間、約３６時間、または約４８時間処理してもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は、細胞デブリを分解するための酵素によって多くとも約３時間、多くとも約５時間、多くとも約７時間、多くとも約９時間、多くとも約１１時間、多くとも約１３時間、多くとも約１５時間、多くとも約１７時間、多くとも約１９時間、多くとも約２１時間、多くとも約２３時間、多くとも約２５時間、多くとも約２７時間、多くとも約２９時間、多くとも約３１時間、多くとも約３５時間、多くとも約４０時間、または多くとも約５０時間処理してもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は、ベンゾナーゼ（登録商標）で室温で約１８時間処理してもよい。一部の場合では、酵素処理は、モノカチオン、例えばＮａ^＋、例えば溶液中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在下で行ってもよい。一部の場合では、酵素処理は、高濃度のモノカチオン、例えばＮａ^＋、例えば溶液中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在下で、例えば少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１２０ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約１８０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、少なくとも約４００ｍＭ、少なくとも約４５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ、少なくとも約５５０ｍＭ、少なくとも約６００ｍＭ、少なくとも約７００ｍＭ、少なくとも約８００ｍＭ、少なくとも約９００ｍＭ、または少なくとも約１０００ｍＭで行ってもよい。一部の場合では、酵素処理は、高濃度のモノカチオン、例えばＮａ^＋、例えば溶液中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在下で、例えば約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、または約１０００ｍＭで行ってもよい。

【0102】

一部の場合では、本明細書において提供する方法の一部の態様によれば、濾過されていないウイルス溶解物も濾過されたウイルス溶解物も、低温で貯蔵してから次のステップを行ってもよい。一部の場合では、濾過した溶解物は低温で保存してから細胞デブリを分解するための酵素によって処理してもよい。例えば、濾過した溶解物は、約２から８℃で、ある特定の期間、例えば、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、または６日間貯蔵してもよい。

【0103】

精製

【0104】

一部の場合では、本明細書において提供する方法は、濾過した溶解物のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を行って、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物を生成することを含んでいてもよい。一部の場合では、タンジェンシャルフロー濾過に続いて、透析濾過を行って、ウイルスを更に精製してもよい。一部の場合では、１巡を超えるＴＦＦまたは透析濾過を行ってもよい。一部の場合では、２巡の透析濾過を行ってもよい。一部の場合では、２、３、４、５巡、またはそれを超えるＴＦＦまたは透析濾過を行ってもよい。他の場合では、他の技術、例えば、限外濾過もしくはサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５またはＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ１０または同等の材料を用いて）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは「逆相」クロマトグラフィーを、本明細書において記載するＴＦＦプロセスの代替としてまたはそれと組み合わせてウイルスを精製するための主題の方法において使用してもよい。

【0105】

タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）は、クロスフロー濾過としても公知であり、濾過プロセスを指す場合があり、一部（透過液）が膜を通過するときに、供給ストリームがフィルター膜面に対して平行に通過し、同時に残り（保持液）は供給リザーバーに再循環することができる。本明細書において提供する場合、ＴＦＦは濾過した溶解物を濃縮するために行ってもよい。一部の場合では、ＴＦＦ後、濾過した溶解物は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１８倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍に濃縮されていてもよい。一部の場合では、ＴＦＦ後、濾過した溶解物は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１５倍、約１８倍、約２０倍、または約３０倍に濃縮されていてもよい。一部の場合では、ＴＦＦ後、濾過した溶解物は約１０倍に濃縮されていてもよい。

【0106】

一部の場合では、ＴＦＦフィルター膜が有する孔径は、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約６５０ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約７５０ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約８５０ｋＤａ、約９００ｋＤａ、または約１０００ｋＤａであってもよい。一部の場合では、ＴＦＦフィルター膜が有する孔径は、多くとも約３００ｋＤａ、多くとも約３５０ｋＤａ、多くとも約４００ｋＤａ、多くとも約４５０ｋＤａ、多くとも約５００ｋＤａ、多くとも約５５０ｋＤａ、多くとも約６００ｋＤａ、多くとも約６５０ｋＤａ、多くとも約７００ｋＤａ、多くとも約７５０ｋＤａ、多くとも約８００ｋＤａ、多くとも約８５０ｋＤａ、多くとも約９００ｋＤａ、または多くとも約１０００ｋＤａであってもよい。

【0107】

適切なＴＦＦフィルターおよび濾過パラメーターは、これらに限定されないが、製造されることになるウイルスのタイプ、宿主細胞のタイプ、細胞培養培地、およびフィルター緩衝液を含む多数のパラメーターに応じて選択し、調整してもよい。一部の場合では、ＴＦＦプロセスは任意の適切な温度で、例えば約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２８℃、３０℃、３２℃、または３７℃で行ってもよい。一部の場合では、ＴＦＦに関する負荷は、少なくとも約１０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約２０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約３０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約４０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約５０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約６０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約７０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約８０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約１００Ｌ／ｍ^２、少なくとも約１２０Ｌ／ｍ^２、少なくとも約１５０Ｌ／ｍ^２、または少なくとも約２００Ｌ／ｍ^２であってもよい。一部の場合では、ＴＦＦに関する負荷は、約１０Ｌ／ｍ^２、約２０Ｌ／ｍ^２、約３０Ｌ／ｍ^２、約４０Ｌ／ｍ^２、約５０Ｌ／ｍ^２、約６０Ｌ／ｍ^２、約７０Ｌ／ｍ^２、約８０Ｌ／ｍ^２、約１００Ｌ／ｍ^２、約１２０Ｌ／ｍ^２、約１５０Ｌ／ｍ^２、または約２００Ｌ／ｍ^２であってもよい。一部の場合では、ＴＦＦプロセスは、約２０００から約６０００ｓ^－１、例えば、約２０００から約３５００ｓ^－１、約２５００から約４０００ｓ^－１、約３０００から約４５００ｓ^－１、約３０００から約５０００ｓ^－１、約３５００から約５０００ｓ^－１、約３５００から約５５００ｓ^－１、約４０００から約６０００ｓ^－１、または約４５００から約６０００ｓ^－１のせん断速度で行ってもよい。一部の場合では、ＴＦＦプロセスは、約２０００ｓ^－１、約２５００ｓ^－１、約３０００ｓ^－１、約３５００、約３５００ｓ^－１、約４０００ｓ^－１、約４５００ｓ^－１、約５０００ｓ^－１、約５５００ｓ^－１、約６０００ｓ^－１のせん断速度で行ってもよい。一部の場合では、ＴＦＦプロセス中、溶解物は、約０．２５から約２．５Ｌ／分、例えば、約０．２５から約０．７５Ｌ／分、約０．５から約１Ｌ／分、約０．７５から約１．２５Ｌ／分、約１から約１．５Ｌ／分、約１．２５から約１．７５Ｌ／分、約１．５から約２．０Ｌ／分、約１．７５から約２．２５Ｌ／分、または約２から約２．５Ｌ／分の速度で流動させてもよい。一部の場合では、流速およびせん断速度は組み合わせて選択してもよく、例えば、溶解物は、約１．５Ｌ／分、５０００ｓ^－１のせん断速度で、または約０．８Ｌ／分、３０００ｓ^－１のせん断速度で流動させてもよい。一部の場合では、透過流束速度は、ＴＦＦプロセス全体にわたって制御してもよい。一部の場合では、透過流束速度は、５から約５０ＬＭＨの間、例えば、５から約１５ＬＭＨの間、１０から約２０ＬＭＨの間、１５から約２５ＬＭＨの間、２０から約３０ＬＭＨの間、２５から約３５ＬＭＨの間、３０から約４０ＬＭＨの間、３５から約４５ＬＭＨの間、または４０から約５０ＬＭＨの間で制御してもよい。一部の場合では、透過流束速度は、約１５から約２０ＬＭＨの間で制御してもよい。一部の場合では、透過流束速度は、約１０から約３０ＬＭＨの間で制御してもよい。一部の場合では、透過流束速度は、約１５から約３０ＬＭＨの間で制御してもよい。一部の場合では、透過流束速度は、約１５ＬＭＨで制御してもよい。一部の場合では、透過流束速度は、約２０ＬＭＨで制御してもよい。

【0108】

一部の場合では、方法は、濾過した溶解物または精製した溶解物を透析濾過することを更に含んでいてもよい。一部の場合では、透析濾過を行って、溶解物から塩または他の混入物質を除去して、精製したウイルス調製物を生成してもよい。本明細書において提供する場合、透析濾過は、膜を通して小さな分子を洗浄し、大きな分子を保持液中に残し、最終的に濃度は変化させない分画プロセスであり得る。

【0109】

連続的透析濾過または不連続的透析濾過のいずれかを本明細書において提供する方法において使用してもよい。連続的透析濾過では、透析濾過緩衝液を、濾液を生成することができるのと同じ速度で供給リザーバーに添加してもよい。このようにして試料リザーバー中の体積は一定に保持することができるが、膜を自由に通過することができる小分子（例えば塩）は洗い流すことができる。結果的に、緩衝液交換の各追加の体積は、塩濃度を更に低下させる場合がある。本明細書において提供する場合、「緩衝液交換の体積」は、透析濾過溶液が添加され得る前の出発溶液の体積に等しいとすることができる。不連続的透析濾過では、出発溶液は最初に希釈し、次いで濃縮して出発体積に戻してもよい。次いでこのプロセスは、リザーバー中に残留する小分子（例えば塩）が望ましい濃度に到達するまで繰り返してもよい。一部の場合では、初期の濃度プロセスに関しては、透析濾過プロセスは同じＴＦＦシステムを使用して行ってもよい。一部の場合では、透析濾過プロセスは異なるシステムを使用して行ってもよい。本明細書において提供する場合、透析濾過は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２５、または少なくとも３０倍体積の緩衝液交換を添加することを含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する透析濾過は、６倍体積の緩衝液交換を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する透析濾過は、１０倍体積の緩衝液交換を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する透析濾過は、２０倍体積の緩衝液交換を含んでいてもよい。一部の場合では、本明細書において提供する方法は、１０倍体積の緩衝液交換を有する１巡目、続いて６倍体積の緩衝液交換を有する２巡目、または２０倍体積の緩衝液交換を有する１巡目、続いて１０倍体積の緩衝液交換を有する２巡目の、２巡の透析濾過を含んでいてもよい。一部の場合では、緩衝液交換の１巡目は、溶解物と同様の構成要素を有する緩衝液を用いて行うことができ、一方２巡目の緩衝液交換は、溶解物中に含まれるイオンをフィルター除去するために使用する緩衝液、例えばスクロースを含む緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、約７．８のｐＨを構成する緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、約７．０のｐＨを構成する緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、約７．０、約７．１、約７．２、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約９．０、または約１０．０のｐＨを構成する緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、少なくとも約７．０、少なくとも約７．１、少なくとも約７．２、少なくとも約７．４、少なくとも約７．５、少なくとも約７．６、少なくとも約７．７、少なくとも約７．８、少なくとも約７．９、少なくとも約８．０、少なくとも約９．０、または少なくとも約１０．０のｐＨを構成する緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、約７または約７．８のｐＨを構成する緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、トリス緩衝液を用いて行ってもよい。トリス緩衝液は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、または約４０ｍＭのトリスを含んでいてもよい。一部の例では、緩衝液交換は、約３０ｍＭ、または約２０ｍＭのトリスを含む緩衝液を用いて行ってもよい。一部の例では、緩衝液交換は、緩衝液を用いて行ってもよい。水が緩衝液の溶媒であってもよい。緩衝液は、サッカライドのような非荷電分子、例えばスクロースまたはグルコース、ヒスチジン、ソルビトールを含んでいてもよい。緩衝液は、一部の場合では、ＭｇＣｌ_２もしくはＮａＣｌのようなイオン構成要素、または他の安定化分子を含んでいてもよい。一部の場合では、透析濾過用の緩衝液は、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１０．５％、約１１％、約１１．５％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、または約３０％のスクロースを含んでいてもよい。一部の場合では、緩衝液交換は、約１０重量／体積％または約８．５重量／体積％のスクロースを含む緩衝液を用いて行ってもよい。一部の場合では、追加の巡の緩衝液交換を行って、所望の濃度を達成してもよい。例えば、標的濃度は、０．５倍、１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または最大約２０倍であってもよい。

【0110】

一部の場合では、追加の清澄化または濾過ステップは、ウイルス製品の純度、濃度、または力価に関する必要性に応じて行ってもよい。一部の場合では、例えば、最終的な濾過ステップを行ってもよく、ＴＦＦ保持液は、最終的な製剤緩衝液を用いてフィルターに通して更に濾過してもよい。製剤緩衝液は、例えば最終的なウイルス製品に関して必要とされるようなイオン構成要素を含んでいてもよい。任意の適切なフローパラメーターを上述のように選択してもよい。比較的小さい孔径、例えば１．２μｍのフィルターを、最終的なステップで使用してもよい。さまざまな孔径のフィルターを本開示の任意の態様において利用してもよい。一部の態様では、フィルターは、約０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍ、１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３．０μｍ、４．０μｍ、または最大約５．０μｍの孔径を有していてもよい。

【0111】

【実施例】

【0112】

以下の例は、説明の目的で与えられており、限定を目的とするものではない。

【0113】

（実施例１）
上流プロセス（Ｉ）

【0114】

この例では、図１のフローチャートに図示するように、ウイルス感染宿主細胞の培養から、回収、細胞溶解までの組換えワクシニアウイルスの製造に関する上流プロセスに関する例示的なプロトコールを記載する。

【0115】

１．宿主Ｈｅｌａ細胞を、ｉＣＥＬＬｉｓナノバイオリアクター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）中、３７℃で５日間培養する。培養培地のｐＨは７．１で維持され、培養培地の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルは５０％である；

【0116】

２．６日目に、培養培地を、冒頭の組換えワクシニアウイルスを含む培養培地と０．０２の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で交換する。感染後、ウイルス感染したＨｅｌａ細胞は、３７℃、ｐＨ７．２、５０％ＤＯＴで３日間培養を継続した；

【0117】

３．９日目に、バイオリアクターをあらかじめ洗浄してから回収し、培養培地を、９０ｍＭトリスを含み、ｐＨ７．５を有する洗浄緩衝液と２５℃で０．５時間交換する；

【0118】

４．あらかじめ洗浄後、洗浄緩衝液を、９０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１５０ｉＵ／ｍＬベンゾナーゼ（登録商標）を含み、ｐＨ９．５を有する溶解培地と交換する。ウイルス感染細胞を溶解培地と２５℃で４～６時間インキュベートし、その後細胞溶解物を含む溶解培地を収集して更なるプロセシングを行う。

【0119】

（実施例２）
上流プロセス（ＩＩ）

【0120】

この例では、図２のフローチャートに図示するように、ウイルス感染宿主細胞の培養から、回収、細胞溶解までの組換えワクシニアウイルスの製造に関する上流プロセスに関する例示的なプロトコールを記載する。

【0121】

１．宿主Ｈｅｌａ細胞を、ｉＣＥＬＬｉｓナノバイオリアクター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）中、３７℃で７日間培養する。培養培地のｐＨは７．２で維持され、培養培地の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルは５０％である；

【0122】

２．８日目に、培養培地を、冒頭の組換えワクシニアウイルスを含む培養培地と０．０２の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で交換する。感染後、ウイルス感染したＨｅｌａ細胞は、３７℃、ｐＨ７．２、５０％ＤＯＴで３日間培養を継続した；

【0123】

３．１１日目に、バイオリアクターをあらかじめ洗浄してから回収し、培養培地を、７５ｍＭトリスを含み、ｐＨ７．３を有する洗浄緩衝液と２５℃で０．５時間交換する；

【0124】

４．あらかじめ洗浄後、洗浄緩衝液を、７５ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１５０ｉＵ／ｍＬベンゾナーゼ（登録商標）を含み、ｐＨ９．５を有する溶解培地と交換する。ウイルス感染細胞を溶解培地と２５℃で４時間インキュベートし、その後細胞溶解物を含む溶解培地を収集して更なるプロセシングを行う。

【0125】

（実施例３）
上流プロセス（ＩＩＩ）

【0126】

この例では、図３のフローチャートに図示するように、ウイルス感染宿主細胞の培養から、回収、細胞溶解までの組換えワクシニアウイルスの製造に関する上流プロセスに関する例示的なプロトコールを記載する。

【0127】

１．宿主Ｈｅｌａ細胞を、ｉＣＥＬＬｉｓナノバイオリアクター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）中、３７℃で７日間培養する。培養培地のｐＨは７．２で維持され、培養培地の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルは５０％である；

【0128】

２．８日目に、培養培地を、冒頭の組換えワクシニアウイルスを含む培養培地と０．００２の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で交換する。感染後、ウイルス感染したＨｅｌａ細胞は、３６℃、ｐＨ７．２、５０％ＤＯＴで３日間培養を継続した；

【0129】

３．１１日目に、バイオリアクターをあらかじめ洗浄してから回収し、培養培地を、７５ｍＭトリスを含み、ｐＨ７．３を有する洗浄緩衝液と２６℃で１０分間交換する；

【0130】

４．あらかじめ洗浄後、洗浄緩衝液を、７５ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１５０ｉＵ／ｍＬベンゾナーゼ（登録商標）を含み、ｐＨ９．５を有する溶解培地と交換する。ウイルス感染細胞を溶解培地と２５℃で４時間インキュベートし、その後細胞溶解物を含む溶解培地を収集して更なるプロセシングを行う。

【0131】

（実施例４）
下流プロセス（Ｉ）

【0132】

この例では、図６に図示するように、例示的なワクシニアウイルスを生産するための下流プロセスに関する例示的なプロトコールを記載する。

【0133】

ウイルス感染した宿主Ｈｅｌａ細胞をｉＣＥＬＬｉｓナノバイオリアクター中で３日間培養した後に、ウイルスを回収する。

【0134】

１．対照試料の収集：対照として、反応器床から１０個の担体をサンプリングし、試料を１５ｍＭトリス、ｐＨ８．０（０．０５ｍｌ／ｃｍ^２）の溶解緩衝液中に３０分間入れる（溶解緩衝液の体積：７ｍｌ）。

【0135】

２．培養培地を排出してあらかじめ洗浄し、ポンプを停止し、手順に従って全ての培地を除去する：

【0136】

（ａ）培地をループの流れから出したままにし、培地のプライムが終わる（ｕｎｐｒｉｍｅｄ）まで反時計回りの方向で流す；

【0137】

（ｂ）培地を止める；

【0138】

（ｃ）再循環ボトル中の培地を廃棄する（開口し、注ぎ出す）；

【0139】

（ｄ）調節を停止する；

【0140】

（ｅ）全てのクランプを閉じる；

【0141】

（ｆ）試料ボトルからの流路（２個のクランプ）を開口し、ガス排出クランプを開口する；

【0142】

（ｇ）ガス排出ラインで巨大注射器（または手動ポンプ）を使用して、圧力ポンプで培地をサンプリングボトルに送る。

【0143】

３．床を洗浄する。

【0144】

（ａ）再循環ループのクランプを外す；

【0145】

（ｂ）９０ｍＭトリスを含み、ｐＨ７．５±０．２を有する２５℃の洗浄緩衝液８００ｍｌを、試料ボトルを介して１ｃｍ／秒の直線流速、２５℃で０．５時間添加する；

【0146】

（ｃ）インキュベート後に洗浄緩衝液を廃棄する。

【0147】

４．洗浄中に、試料を収集してオフラインでｐＨを測定する。必要に応じてｐＨ調整を行う。

【0148】

５．バイオリアクターから洗浄緩衝液を除去する直前に、別の試料を収集し、オフラインｐＨを読み取って、ｉＣＥＬＬｉｓオンラインｐＨが正確に読み取られていることを確認する。

【0149】

６．バイオリアクターのｐＨ制御を９．５±０．２に設定する。

【0150】

７．バイオリアクターの温度制御を２５℃に設定する。

【0151】

８．９０ｍＭトリスおよび１５０Ｕベンゾナーゼ（登録商標）／ｍｌを含み、ｐＨ９．０±０．２を有する溶解緩衝液６００ｍｌを添加し、０．５Ｍ ＭｇＣｌ２ ２．４ｍｌを添加する。

【0152】

９．ｐＨが低下し、安定化するまで待つ。

【0153】

１０．オフラインのｐＨ測定を行い、必要に応じてｉＣＥＬＬｉｓオフセットを調整する：

【0154】

ｐＨ制御をオンにし（設定点９．０±０．２）、直線流速を１．２５ｃｍ／秒に増加させ、２５℃で４．０時間流す。

【0155】

１１．溶解時間は、バイオリアクターが、ｐＨが９．０に到達したことを示した場合に始まる。別のオフラインのｐＨ読み取りを取得して、その読み取りが正確であることを立証する。

【0156】

１２．溶解が始まってから２時間後、試料を採取する。

【0157】

１３．溶解が始まってから４時間後、バイオリアクターを排出させる。

【0158】

１４．ｐＨを測定し、必要に応じて調整する（ｐＨがあまりにも高い場合、１Ｍ ＨＣＬを使用する）。調製した場合は記録する。

【0159】

清澄化

【0160】

１．図１０に図示するように濾過システムをセットアップする。

【0161】

２．蠕動ポンプを２５０ｍｌ／分で使用することによって、プライミング緩衝液（７５ｍＭトリス、ｐＨ９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）７５０ｍＬを用いてフィルターをフラッシュすることにより、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ３（５．０μｍ／１．２μｍ）フィルターをプライミングする：

【0162】

（ａ）両方のフィルターの空気ポートを開口し、緩衝液が出るまでフラッシュし、次いで完全にプライミングされるまで閉口する；

【0163】

（ｂ）全てのプライミング緩衝液がなくなるまでポンプで送り、空気ポートを再び開口する（それ以上の液体は出なくなるはずである）。

【0164】

３．蠕動ポンプを２５０ｍｌ／分で使用して、溶解物をフィルターに通してポンプで送ることによって溶解物全体を濾過する。

【0165】

液体がサイド空気ポートから出てくるまで、ウイルス溶解物をゆっくりとポンプで送るのを開始し、次いでキャップを外し、エタノールで拭く；

【0166】

（ｄ）全ての溶解物（約６００ｍｌ）を２５０ｍｌ／分の速度でフィルターに通してポンプで送る。

【0167】

（ｅ）最後に、空気のみが空気ポートから出てくるまでポンプで通す（開口する）；

【0168】

（ｆ）この容器を分離し、試料を収集する。

【0169】

４．フィルターを等体積のフラッシュ緩衝液（７５ｍＭトリス、ｐＨ９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いて２５０ｍｌ／分で別の容器にフラッシュし、フラッシュ緩衝液をサンプリングする。

【0170】

５．濾過した溶解物およびフラッシュ緩衝液をプールし、別の試料を収集する。

【0171】

６．ステップ４のプールされた溶解物のｐＨを、少量の１Ｍ ＨＣｌを使用してただちに９に調整する。

【0172】

７．ｐＨ９．０のプールされた濾液を２～８℃で（必要に応じて週末にわたり）貯蔵する：週末にわたって貯蔵する場合は、６×２５０μｌの資料を採取してから次のステップに進む。

【0173】

８．更に溶解して深層濾過濾液を生成する：ベンゾナーゼ（登録商標）１５０ｉＵ／ｍｌ（７２０μｌ）および十分な２Ｍ ＮａＣｌ（９０ｍＬ）を添加して、５００ｍＭ ＮａＣｌおよびｐＨ９．０に到達させ、室温で一晩１８±４時間インキュベートする。

【0174】

ＴＦＦおよび透析濾過

【0175】

１．ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）ＴＦＦシステム中の無菌７５０ｋＤ ｍＰＥＳ（改変ポリエーテルスルホン）、７９０ｃｍ２中空繊維フィルター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）をセットアップする。

【0176】

２．全てがプライミングされるまで、プレフラッシュ緩衝液（７５ｍＭトリス、ｐＨ９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）でＴＦＦシステムをあらかじめフラッシュする。システム中の６０～７０ｍｌの保持体積をフラッシュアウトし、プレフラッシュ緩衝液を廃棄する。

【0177】

３．深層濾過濾液をはかりに置き、チューブをＴＦＦシステムの入口および出口ラインに連結する。

【0178】

４．試料を１０分間再循環させ、せん断がおよそ４０００～５０００秒^－１であることを確実にする。

【0179】

５．深層濾過濾液をフィルター膜に通して流し（せん断速度５０００秒－１、ＴＭＰ（膜通過圧）約１．２ｐｓｉｄ前後またはそれ未満を継続することを目的とする）、クロスフローが３０ＬＭＨ（Ｌ／ｍ２／時間）以下になるまで透過ラインをゆっくりと開口する。試料が約１０倍に濃縮されるまで流す。最終的な体積は、リザーバーボトル中で約１００～１２０ｍｌにするべきである。

【0180】

７．ＶＦＢラインを開口し、試料容器中で一定の重量を維持することによって透析濾過の１巡目（ウイルス製剤緩衝液「ＶＦＢ」、ｐＨ７）を開始し（せん断速度５０００秒^－１、最大２５～３０ＬＭＨ、約９６０ｍｌ／分を目的とする）、 ｐＨ７のＶＦＢと１０倍体積の緩衝液交換を行う。

【0181】

８．ＶＦＢラインを開口し、試料容器中で一定の重量を維持することによって透析濾過の最終の巡（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、８．５％スクロース）を開始し（せん断速度５０００秒－１、最大２５ＬＭＨを再び目的とする）、ｐＨ８の２０ｍＭトリス、８．５％スクロースと６倍体積の緩衝液交換を行う。

【0182】

９．リザーバー中に１５～３０ｍＬのみが残されるまで最終濃縮ステップを行い、次いで保持体積がリザーバーに追加されるまでシステムをフラッシュする（６０～７０ｍｌ、最終的に合計７５～１００ｍｌが得られらる）。

【0183】

１０．最終的な保持液を、およそ５ｍｌのアリコートで５０ｍｌのコニカルチューブ中に－８０℃で貯蔵する。

【0184】

（実施例５）
下流プロセス（ＩＩ）

【0185】

この例では、図８に図示するように、例示的なワクシニアウイルスを生産するための下流プロセスに関する例示的なプロトコールを記載する。以下に列挙する記録は、プロトコールの実験を実行したことから取得した記録である。

【0186】

ウイルス感染した宿主Ｈｅｌａ細胞をｉＣＥＬＬｉｓナノバイオリアクター中で３日間培養した後にウイルスを回収する。

【0187】

１．対照試料の収集：対照として、反応器床から１０個の担体をサンプリングし試料を１５ｍＭトリス、ｐＨ８．０（０．０５ｍｌ／ｃｍ^２）の溶解緩衝液に３０分間入れる（溶解緩衝液の体積：７ｍｌ）。

【0188】

２．培養培地を排出してあらかじめ洗浄し、ポンプを停止し、手順に従って全ての培地を除去する：

【0189】

（ａ）培地をループの流れから出したままにし、プライムが終わるまで培地を反時計回りの方向で流す；

【0190】

（ｂ）培地を止める；

【0191】

（ｃ）再循環ボトル中の培地を廃棄する（開口し、注ぎ出す）；

【0192】

（ｄ）調節を停止する；

【0193】

（ｅ）全てのクランプを閉じる；

【0194】

（ｆ）試料ボトルからの流路（２個のクランプ）を開口し、ガス排出クランプを開口する；

【0195】

（ｇ）ガス排出ラインで巨大注射器（または手動ポンプ）を使用して、圧力ポンプで培地をサンプリングボトルに送る。

【0196】

３．床を洗浄する。

【0197】

（ａ）再循環ループのクランプを外す；

【0198】

（ｂ）７５ｍＭトリスを含み、ｐＨ７．３±０．２を有する２５℃の洗浄緩衝液８００ｍｌを試料ボトルを介して１ｃｍ／秒の直線流速、２５℃で０．５時間添加する；

【0199】

（ｃ）インキュベート後に洗浄緩衝液を廃棄する。

【0200】

４．洗浄中に、試料を収集してオフラインでｐＨを測定する。必要に応じてｐＨ調整を行う。

【0201】

５．バイオリアクターから洗浄緩衝液を除去する直前に、別の試料を収集し、オフラインｐＨを読み取って、ｉＣＥＬＬｉｓオンラインｐＨが正確に読み取られていることを確認する。

【0202】

６．バイオリアクターのｐＨ制御を９．５±０．２に設定する。

【0203】

７．バイオリアクターの温度制御を２５℃に設定する。

【0204】

８．７５ｍＭトリスおよび１５０Ｕベンゾナーゼ（登録商標）／ｍｌを含み、９．５±０．２のｐＨを有する溶解緩衝液６００ｍｌを添加し、０．５Ｍ ＭｇＣｌ２ ２．４ｍｌを添加する。

【0205】

９．ｐＨが低下し、安定化するまで待つ。

【0206】

１０．オフラインのｐＨ測定を行い、必要に応じてｉＣＥＬＬｉｓオフセットを調整する：

【0207】

ｐＨ制御をオンにし（設定点９．５±０．２）、直線流速を１．２５ｃｍ／秒に増加させ、２５℃で４．０時間流す。

【0208】

１１．溶解時間は、バイオリアクターが、ｐＨが９．５に到達したことを示した場合に始まる。別のオフラインのｐＨ読み取りを取得して、その読み取りが正確であることを立証する。

【0209】

１２．溶解が始まってから２時間後、試料を採取する。

【0210】

１３．溶解が始まってから４時間後、バイオリアクターを排出させる。

【0211】

１４．ｐＨを測定し、必要に応じて調整する（ｐＨがあまりにも高い場合、１Ｍ ＨＣＬを使用する）。調製した場合は記録する。

【0212】

清澄化

【0213】

１．図１０に図示するようにフィルター清澄化システムをセットアップする。

【0214】

２．蠕動ポンプを２５０ｍｌ／分で使用することによって、プライミング緩衝液（７５ｍＭトリス、ｐＨ９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）７５０ｍＬを用いてフィルターをフラッシュすることにより、オートクレーブされたアセンブル済みのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ３（５．０μｍ／１．２μｍ）フィルターをプライミングする：

【0215】

（ａ）両方のフィルターの空気ポートを開口し、緩衝液が出るまでフラッシュし、次いで完全にプライミングされるまで閉口する；

【0216】

（ｂ）全てのプライミング緩衝液がなくなるまでポンプで送り、空気ポートを再び開口する（それ以上の液体は出なくなるはずである）。

【0217】

３．蠕動ポンプを２５０ｍｌ／分で使用して、溶解物をフィルターに通してポンプで送ることによって溶解物全体を濾過する。

【0218】

（ｃ）液体がサイド空気ポートから出てくるまで、ウイルス溶解物をゆっくりとポンプで送るのを開始し、次いでキャップを外し、エタノールで拭く；

【0219】

（ｄ）全ての溶解物（約６００ｍｌ）を２５０ｍｌ／分の速度でフィルターに通してポンプで送る。

【0220】

（ｅ）最後に、空気のみが空気ポートから出てくるまでポンプで通す（開口する）；

【0221】

（ｆ）この容器を分離し、試料を収集する。

【0222】

４．フィルターを等体積のフラッシュ緩衝液（７５ｍＭトリス、ｐＨ９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いて２５０ｍｌ／分で別の容器にフラッシュし、フラッシュ緩衝液をサンプリングする。

【0223】

５．濾過した溶解物およびフラッシュ緩衝液をプールし、別の試料を収集する。

【0224】

６．ステップ４のプールされた溶解物のｐＨを、少量の１Ｍ ＨＣｌを使用してただちに９に調整する。

【0225】

７．ｐＨ９．０のプールされた濾液を２～８℃で（約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３６時間、約４０時間、約４５時間、約５０時間、約７０時間、または約７２時間）貯蔵する：長期間にわたって、例えば約３６時間貯蔵する場合は、６×２５０μｌの資料を採取してから次のステップに進む。

【0226】

８．更に溶解して深層濾過濾液を生産する：ベンゾナーゼ（登録商標）１５０Ｕ／ｍｌ（７２０μｌ）および十分な２Ｍ ＮａＣｌ（９０ｍＬ）を添加して、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよびｐＨ９．０に到達させ、室温で一晩１８±４時間インキュベートする。

【0227】

ＴＦＦおよび透析濾過

【0228】

１．図１１に図示するように、無菌０．１μｍ中空繊維フィルター（ＧＥ）ＲＴＰ ＨＦカートリッジＴＦＦシステムをセットアップする。

【0229】

２．プレフラッシュ緩衝液（７５ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．００）１ＬでＴＦＦシステムをあらかじめフラッシュする。

【0230】

３．ＴＦＦ－１濃縮：

【0231】

（ａ）保持液リザーバーに約４５ｍＬの濾過した溶解物を充てんする。

【0232】

（ｂ）ポンプを約１００ｍＬ／分で開始して、透過バルブを閉口した状態でチューブに充填する。

【0233】

（ｃ）保持液リザーバーがおよそ５ｍＬに達したら、更に４０ｍＬの体積の濾過した溶解物をリザーバーに添加する。供給流速を規定の流速である１．４７２Ｌ／分に増加させ、透過ラインを５～１０分閉じて再循環させる。

【0234】

（ｄ）膜コンディショニング後、透過バルブをゆっくりと開口して、１５ＬＭＨを超える流束速度におけるスパイクを阻止する。

【0235】

（ｅ）濾過した溶解物をその元の体積の１／２０に濃縮し（２０倍濃度）、透過ラインに制御バルブを適用することによって１５ＬＭＨの標的で透過流束を制御し；温度は制御しない。

【0236】

４．ＴＦＦ－１透析濾過１：７５ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液２０ＤＶ、ｐＨ９．００を用い；透過流束２０リットル／ｍ２／時間（ＬＭＨ）；せん断速度３０００～５０００ｓ－１で制御し；温度は制御せずに第１の透析濾過を実施する。

【0237】

５．ＴＦＦ－１透析濾過２：２０ｍＭトリス、８．５％ｗ／ｖスクロース緩衝液１０ＤＶ、ｐＨ７．８０を用い；透過流束３０ＬＭＨ；せん断速度３０００～５０００ｓ－１で制御し；ＴＭＰは制御せずに第２の透析濾過を実施する。透析濾過後、ＴＦＦシステム（チューブおよびＨＦカートリッジ）から保持液リザーバーに保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を回収し、製品を回収する間にポンプ流速を低下させる。

【0238】

最終的な濾過

【0239】

図１２に図示するように、ＴＦＦ保持液を１．２μｍフィルターに通して、１５０ＬＭＨのポンプ流速で薬物物質ボトルにポンプで送る。

【0240】

（実施例６）
ウイルス生産（Ｉ）

【0241】

この例では、本開示の実施形態によるウイルス生産の例および製造プロセスからの例示的なワクシニアウイルスの例示的な収率を記載する。

【0242】

宿主Ｈｅｌａ細胞を、例示的なワクシニアウイルスに０．０２のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、４ｍ^２の表面積のマイクロキャリア固定床ベースのバイオリアクター中で培養した。感染後７２時間でウイルスを回収し、清澄化、ベンゾナーゼ処理、２０倍濃縮のためのＴＦＦ、ＤＦ－１およびＤＦ－２を行い、次いで得られた精製ウイルス調製物を２～８℃で一晩維持し、続いて最終的に濾過した。表１は、ウイルス力価の測定値、各製造ステップの最後に得られたウイルス調製物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）、およびＢＳＡの量を示す。
表１．生産性および純度の測定値

【表1】

【0243】

（実施例７）
ウイルス生産（ＩＩ）

【0244】

この例では、本開示の実施形態によるウイルス生産の例および製造プロセスからの例示的なワクシニアウイルスの例示的な収率を記載する。

【0245】

宿主Ｈｅｌａ細胞を、例示的なワクシニアウイルスに０．００１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、４ｍ^２の表面積のマイクロキャリア固定床ベースのバイオリアクター中で培養した。感染後７２時間でウイルスを回収し、清澄化、ベンゾナーゼ（登録商標）処理、２０倍濃縮のためのＴＦＦ、ＤＦ－１およびＤＦ－２を行い、次いで得られた精製ウイルス調製物を２～８℃で一晩維持し、続いて最終的に濾過した。表２は、ウイルス力価の測定値、各製造ステップの最後に得られたウイルス調製物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）、およびＢＳＡの量を示す。
表２．生産性および純度の測定値

【表2】

【0246】

（実施例８）
ウイルス回収の比較

【0247】

この例では、本開示の実施形態によるウイルス生産の例および従来の低浸透圧的回収方法を使用した製造と比較した、製造プロセスからの例示的なワクシニアウイルスの例示的な収率を記載する。

【0248】

各一連の実験では、Ｈｅｌａ細胞の２つのバッチを、例示的な改変ワクシニアウイルスに０．０２のＭＯＩで感染させ、マイクロキャリア固定床ベースのバイオリアクター中で４８時間成長させた。ウイルス感染したＨｅｌａ細胞の一方のバッチを、低浸透圧性溶解緩衝液を使用して回収し、他方のバッチを、本開示による例示的な高ｐＨ緩衝液を使用して回収した。以下の表３は、回収ステップにおける平均収率を要約したものである。
表３．異なる回収方法のウイルス収率

【表3】

【0249】

本開示の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載しているが、そのような実施形態はほんの一例として提供される。多くの変形、変更、および置換が本開示から逸脱することなく当業者であれば通常ただちに思いつくであろう。本開示の実施形態に対するさまざまな代替物を、本開示の実施において用いてもよいことは理解するべきである。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内でのその方法および構造ならびにこれらの均等物はそれによってカバーされることが意図される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させて、１宿主細胞あたり少なくとも約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）から約３５０ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む製造方法。
(項目２)
（ｉ）バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させること；および（ｉｉ）前記培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記回収することが、前記培養物を溶解して、組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団を含む溶解物を生産することを含むこと、および（ｉｉｉ）前記溶解物を清澄化して、精製された組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を生産することであって、精製された組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団が、前記溶解物中に組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団の少なくとも約５０％から約９０％を含むことを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む製造方法。
(項目３)
バイオリアクター中で成長させた複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、約１．５×１０ ^１１ から約５×１０ ^１３ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むことを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む製造方法。
(項目４)
バイオリアクター中で成長させた複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、前記培養物１ｍＬあたり約１．５×１０ ^８ から約２×１０ ^１０ ＰＦＵのウイルス力価を含むことを含み、バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む製造方法。
(項目５)
（ｉ）バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させること；および（ｉｉ）前記培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することがアルカリ性条件で行われる製造方法。
(項目６)
バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させて、組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を生産することであって、前記複数のウイルス感染宿主細胞が、約０．０００１から約０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスに感染していることを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む製造方法。
(項目７)
（ｉ）バイオリアクター中で複数のウイルス感染宿主細胞を含む培養物を成長させることであって、前記複数のウイルス感染宿主細胞が、約０．０００１から約０．０１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスに感染していること、および（ｉｉ）前記培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、約１．５×１０ ^１１ から約５×１０ ^１３ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むことを含む製造方法。
(項目８)
前記バイオリアクターが固定床を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記固定床がマイクロキャリアを含む、項目６に記載の方法。
(項目１０)
前記固定床が約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記固定床が少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記固定床が少なくとも約９６ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
前記複数のウイルス感染宿主細胞が、前記バイオリアクター中に少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ ^２ から約１５０，０００細胞／ｃｍ ^２ の密度で播種される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物を約２４時間から約９６時間成長させる、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物を約４８時間から約７２時間成長させる、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物が、少なくとも約２０％から約１００％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物が約３２℃から約３８℃の温度で維持される、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記ウイルス感染宿主細胞を含む前記培養物が約７．０から約７．５のｐＨで維持される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
複数の前記ウイルス感染細胞が、約０．０００５から約０．２の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でウイルスに感染している、項目１から５および８から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
アルカリ性緩衝液中でインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む、項目１および６から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
細胞デブリを分解するための酵素とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む、項目１および６から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを更に含む、項目１および６から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記回収することが、アルカリ性緩衝液中でインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む、項目２から５および８から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４)
前記回収することが、細胞デブリを分解するための酵素とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む、項目２から５および８から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記回収することが、細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む、項目２から５および８から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６)
前記インキュベート中の前記酵素の濃度が約５０ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬである、項目２１、２２、２４、および２５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２７)
前記インキュベートすることが約２時間から約８時間行われる、項目２０から２６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２８)
前記インキュベートすることが約２２℃から約２８℃の温度で行われる、項目２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２９)
細胞デブリを分解するための前記酵素がベンゾナーゼを含む、項目２１から２２および２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記アルカリ性緩衝液が８を超えるｐＨを構成する、項目２０、２２から２４、および２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３１)
前記アルカリ性緩衝液が８．０を超えるｐＨから約１０．０のｐＨを構成する、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記アルカリ性緩衝液が約９．５のｐＨを構成する、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記アルカリ性緩衝液がトリス緩衝液を含む、項目２０から３２のいずれか一項に記載の方法。
(項目３４)
前記インキュベート中のｐＨをモニタリングすることを更に含む、項目２０から３３のいずれか一項に記載の方法。
(項目３５)
濾過を行って、濾過した溶解物を生成することを更に含む、項目２０から３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目３６)
細胞デブリを分解するための酵素で前記濾過した溶解物を処理することを更に含む、項目３５に記載の方法。
(項目３７)
前記処理することがアルカリ性条件で行われる、項目３６に記載の方法。
(項目３８)
前記処理することが約１０時間から約２４時間行われる、項目３７に記載の方法。
(項目３９)
前記処理することに続いて、前記濾過した溶解物のタンジェンシャルフロー濾過が行われて、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物が生成される、項目３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目４０)
前記タンジェンシャルフロー濾過が、前記濾過した溶解物を濃縮することを含み、続いて透析濾過の少なくとも１巡目および２巡目が行われる、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
透析濾過の前記１巡目が約９．０から約９．５のｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
透析濾過の前記１巡目が約２０倍体積の前記緩衝液交換を含む、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
約９．０から約９．５のｐＨを構成する前記緩衝液が約４０ｍＭから約８０ｍＭのトリス濃度を含む、項目４１または４２に記載の方法。
(項目４４)
約９．０のｐＨを構成する前記緩衝液が約７５ｍＭのトリス濃度を含む、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
透析濾過の前記２巡目が、７．５を超えるｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む、項目４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
透析濾過の前記２巡目が、７．５を超えるｐＨを構成する前記緩衝液との約１０倍体積の前記緩衝液交換を含む、項目４５に記載の方法。
(項目４７)
７．５を超えるｐＨを構成する前記緩衝液が約１０ｍＭから約３０ｍＭのトリス濃度を含む、項目４５または４６に記載の方法。
(項目４８)
７．５を超えるｐＨを構成する前記緩衝液が少なくとも約５体積％から少なくとも約１０体積％のスクロースを更に含む、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記タンジェンシャルフロー濾過が、約１５ＬＭＨから約５０ＬＭＨを含む流速で行われる、項目３９から４８のいずれか一項に記載の方法。
(項目５０)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約５ｎｇから約１００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む、項目３９から４９のいずれか一項に記載の方法。
(項目５１)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約０．１μｇから約１０μｇの宿主細胞タンパク質を含む、項目３９から５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記単位用量が約１０ ^９ から約１０ ^１３ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む、項目５０または５１に記載の方法。
(項目５３)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０ ^９ ＰＦＵあたり、最大約４００ｎｇ、約２００ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０ｎｇ、または約４０ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む、項目３９から４９のいずれか一項に記載の方法。
(項目５４)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０ ^９ ＰＦＵあたり、最大約７．５μｇ、約７μｇ、約６μｇ、約５μｇ、または約４μｇの宿主細胞ＤＮＡを含む、項目３９から４９および５３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５５)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０ ^９ ＰＦＵあたり、最大約１００ｎｇ、約６０ｎｇ、約５０ｎｇ、約３０ｎｇ、または約２５ｎｇの、前記培養物中において使用される血清アルブミンを含む、項目３９から４９および５４のいずれか一項に記載の方法。
(項目５６)
前記宿主細胞が、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびベロ細胞からなる群から選択される、項目１から５５のいずれか一項に記載の方法。
(項目５７)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む、項目１から５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目５８)
項目１から５７のいずれか一項に記載の方法によって生産される組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を含む組成物。
(項目５９)
１宿主細胞あたり少なくとも約５０ＰＦＵから約３５０ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む宿主細胞の培養物を含むバイオリアクター。
(項目６０)
固定床を含み、前記固定床が宿主細胞の前記培養物を含む、項目５９に記載のバイオリアクター。
(項目６１)
宿主細胞の前記培養物が前記固定床内のマイクロキャリア中で増殖される、項目６０に記載のバイオリアクター。
(項目６２)
宿主細胞の前記培養物を含み、前記培養物が、約１，０００細胞／ｃｍ ^２ 前記固定床から約１０，０００細胞／ｃｍ ^２ 前記固定床の宿主細胞密度を含む、項目６０または６１に記載のバイオリアクター。
(項目６３)
前記固定床が約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む、項目５９から６２のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
(項目６４)
前記固定床が少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、項目５９から６３のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
(項目６５)
前記固定床が約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む、項目５９から６３のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
(項目６６)
約１．５×１０ ^１１ から約５×１０ ^１３ ＰＦＵの組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むバイオリアクター。
(項目６７)
固定床を含み、前記固定床が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む培養物を含む、項目６６に記載のバイオリアクター。
(項目６８)
前記固定床が約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む、項目５９から６５および６６のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
(項目６９)
前記固定床が少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、項目６８に記載のバイオリアクター。
(項目７０)
前記固定床が約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含む、項目６８または６９に記載のバイオリアクター。
(項目７１)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む、項目５９から７０のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
(項目７２)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約７２時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することであって、前記集団が、約１．５×１０ ^１１ から約５×１０ ^１３ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含むことを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することがアルカリ性条件で行われる方法。
(項目７３)
前記バイオリアクターが固定床を含む、項目７２に記載の方法。
(項目７４)
前記固定床がマイクロキャリアを含む、項目７３に記載の方法。
(項目７５)
前記固定床が約０．０１Ｌから約２５Ｌの体積を含む、項目７３または７４に記載の方法。
(項目７６)
前記固定床が少なくとも約８０ｇ／Ｌから約１４４ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、項目７３から７５のいずれか一項に記載の方法。
(項目７７)
前記固定床が少なくとも約９６ｇ／Ｌの圧縮密度を含む、項目７３から７６のいずれか一項に記載の方法。
(項目７８)
前記宿主細胞が、前記バイオリアクター中に少なくとも約１，０００細胞／ｃｍ ^２ から約１５０，０００細胞／ｃｍ ^２ の密度で播種される、項目７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
(項目７９)
前記更なる培養物が、少なくとも約２０％から約１００％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含む、項目７２から７８のいずれか一項に記載の方法。
(項目８０)
前記更なる培養物が約５０％の溶存酸素圧（ＤＯＴ）レベルを含む、項目７９に記載の方法。
(項目８１)
前記更なる培養物が約３２℃から約３８℃の温度で維持される、項目７２から８０のいずれか一項に記載の方法。
(項目８２)
前記更なる培養物が約３６℃の温度で維持される、項目８１に記載の方法。
(項目８３)
前記更なる培養物が約７．０から約７．５のｐＨで維持される、項目７２から８２のいずれか一項に記載の方法。
(項目８４)
前記更なる培養物が約７．２のｐＨで維持される、項目８３に記載の方法。
(項目８５)
前記回収することが、細胞デブリを分解するための酵素およびアルカリ性緩衝液とインキュベートすることによって前記複数のウイルス感染宿主細胞を溶解することを含む項目７２から８４のいずれか一項に記載の方法。
(項目８６)
前記インキュベート中の細胞デブリを分解するための前記酵素の濃度が約５０ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬである、項目８５に記載の方法。
(項目８７)
前記インキュベートすることが約５時間行われる、項目８６に記載の方法。
(項目８８)
前記インキュベートすることが約２２℃から約２８℃の温度で行われる、項目８６または８７に記載の方法。
(項目８９)
前記インキュベートすることが約２７℃の温度で行われる、項目８８に記載の方法。
(項目９０)
細胞デブリを分解するための前記酵素がベンゾナーゼを含む、項目８５から８９のいずれか一項に記載の方法。
(項目９１)
細胞デブリを分解するための前記酵素がベンゾナーゼを含み、前記インキュベートすることが前記ベンゾナーゼの存在下、約１５０ＩＵ／ｍＬの濃度、約２７℃の温度で約５時間行われる、項目９０に記載の方法。
(項目９２)
前記アルカリ性緩衝液が８を超えるｐＨを構成する、項目８５から９１のいずれか一項に記載の方法。
(項目９３)
前記アルカリ性緩衝液が８．０を超えるｐＨから約１０．０のｐＨを構成する、項目９２に記載の方法。
(項目９４)
前記アルカリ性緩衝液が約９．５のｐＨ含む、項目９３に記載の方法。
(項目９５)
前記アルカリ性緩衝液がトリス緩衝液を含む、項目８５から９４のいずれか一項に記載の方法。
(項目９６)
前記インキュベート中のｐＨをモニタリングすることを更に含む、項目８５から９５のいずれか一項に記載の方法。
(項目９７)
濾過を行って、濾過した溶解物を生成することを更に含む、項目８５から９６のいずれか一項に記載の方法。
(項目９８)
前記濾過した溶解物を細胞溶解酵素で処理することを更に含む、項目９７に記載の方法。
(項目９９)
前記処理することがアルカリ性条件で行われる、項目９８に記載の方法。
(項目１００)
前記処理することが約１０時間から約２４時間行われる、項目９９に記載の方法。
(項目１０１)
前記処理することが約４℃の温度で約１８時間行われる、項目９９に記載の方法。
(項目１０２)
前記処理することに続いて前記濾過した溶解物のタンジェンシャルフロー濾過が行われて、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物が生成される、項目９８から１０１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０３)
前記タンジェンシャルフロー濾過が、前記濾過した溶解物を濃縮することを含み
、続いて透析濾過の少なくとも１巡目および２巡目が行われる、項目１０２に記載の方法。
(項目１０４)
透析濾過の前記１巡目が、約９．０から約９．５のｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む、項目１０３に記載の方法。
(項目１０５)
透析濾過の前記１巡目が約２０倍体積の前記緩衝液交換を含む、項目１０４に記載の方法。
(項目１０６)
約９．０から約９．５のｐＨを構成する前記緩衝液が、約４０ｍＭから約１００ｍＭのトリス濃度を含む、項目１０４または１０５に記載の方法。
(項目１０７)
透析濾過の前記２巡目が、約７．０から約８．０のｐＨを構成する緩衝液との緩衝液交換を含む、項目１０３から１０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０８)
透析濾過の前記２巡目が約１０倍体積の前記緩衝液交換を含む、項目１０７に記載の方法。
(項目１０９)
約７．０から約８．０のｐＨを構成する前記緩衝液が、約１５ｍＭから約３０ｍＭのトリス濃度を含む、項目１０７または１０８に記載の方法。
(項目１１０)
約７．０から約８．０のｐＨを構成する前記緩衝液が、少なくとも約５体積％から少なくとも約２０体積％のスクロースを更に含む、項目１０７から１０９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１１)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約５ｎｇから約１００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む、項目１０２から１１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１２)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの単位用量中に約０．１μｇから約１０μｇの宿主細胞タンパク質を含む、項目１０２から１１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１３)
前記単位用量が約１０ ^９ から約１０ ^１３ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む、項目１１１または１１２に記載の方法。
(項目１１４)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０ ^９ ＰＦＵあたり、最大約４００ｎｇ、約２００ｎｇ、約１００ｎｇ、約５０ｎｇ、または約４０ｎｇの宿主細胞ＤＮＡを含む、項目１０２から１１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１５)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０ ^９ ＰＦＵあたり、最大約７．５μｇ、約７μｇ、約６μｇ、約５μｇ、または約４μｇの宿主細胞ＤＮＡを含む、項目１０２から１１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１６)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、前記組換え腫瘍溶解性ウイルス５×１０ ^９ ＰＦＵあたり、最大約１００ｎｇ、約６０ｎｇ、約５０ｎｇ、約３０ｎｇ、または約２５ｎｇの、前記培養物中において使用される血清アルブミンを含む、項目１０２から１１３および１１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１７)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３６℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約７２時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１１８)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００３ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３５℃の温度および約４５％の溶存酸素圧レベルで約４８時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約８．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１１９)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３２℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約２４時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約８．０のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２０)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約７．８のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２１)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００５ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２２)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３６℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約７２時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０ ^１２ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２３)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００３ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３５℃の温度および約４５％の溶存酸素圧レベルで約４８時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０ ^１２ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約８．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２４)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３２℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約２４時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０ ^１２ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約８．０のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２５)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００２ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０ ^１２ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約７．８のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２６)
組換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための方法であって、（ｉ）バイオリアクター中で宿主細胞の培養物とワクシニアウイルスとを約０．００５ＰＦＵ／細胞の感染多重度で接触させること；（ｉｉ）前記培養物を約３７℃の温度および約５０％の溶存酸素圧レベルで約９６時間成長させて、複数のウイルス感染宿主細胞を含む更なる培養物を生成すること；（ｉｉｉ）前記複数のウイルス感染宿主細胞を含む前記更なる培養物から少なくとも約１０ ^１２ ＰＦＵの前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの集団を回収することを含み、前記バイオリアクターが約０．２ｍ ^２ から約５００ｍ ^２ の表面積を含み、前記回収することが約９．５のｐＨを構成する緩衝液の存在下で行われる方法。
(項目１２７)
ステップ（ｉｉｉ）で回収された組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記集団を精製して、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製調製物を生産することを更に含む、項目１１７から１２６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２８)
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの前記精製調製物が、少なくとも約２×１０ ^１１ から約７×１０ ^１１ ＰＦＵのウイルスを含む、項目１２７に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】