特許 7625589 改変細胞外エンベロープウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-24

(45)【発行日】2025-02-03

(54)【発明の名称】改変細胞外エンベロープウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20250127BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20250127BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20250127BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250127BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250127BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250127BHJP

   C12N 15/39 20060101ALN20250127BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K35/768

A61K38/19

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P35/00

C12N15/12

C12N15/39

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2022522646

(86)(22)【出願日】2020-10-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-15

(86)【国際出願番号】 US2020056107

(87)【国際公開番号】W WO2021076982

(87)【国際公開日】2021-04-22

【審査請求日】2023-08-30

(31)【優先権主張番号】62/916,035

(32)【優先日】2019-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521244488

【氏名又は名称】カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ソーン， スティーブン エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】バード， ダニエル ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ミンルイ

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】JOURNAL OF VIROLOGY，1993年，Vol.67, No.6，pp.3319-3325

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ａ６１Ｋ ３５／７６８

Ａ６１Ｋ ３８／１９

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／３９

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｐＨ５において正に荷電するアミノ酸残基にある、少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、腫瘍溶解性ウイルスであって、前記Ａ３４Ｒタンパク質が、野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中の配列と比較して変異しており、前記少なくとも２つの変異が、野生型ワクシニアウイルスＡ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にあり、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである、腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項2】

前記腫瘍溶解性ウイルスが、前記少なくとも２つの変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、細胞内成熟ウイルス形態よりも多量の細胞外エンベロープウイルス形態を生成させる、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項3】

外来性核酸をさらに含み、前記外来性核酸が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ヒアルロニダーゼ、ＳＯＣＳ３、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＣＬ５、Ｎ１Ｌ、免疫チェックポイントモジュレーター、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つをコードし得る、請求項１または請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項4】

ウイルス遺伝子Ａ５２Ｒの変異または欠失をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項5】

ポックスウイルスである、請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項6】

前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスである、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項7】

癌の処置のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物。

【請求項8】

治療有効量の前記組成物が対象に投与されるものである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

腫瘍内注入、静脈内注入、またはそれらの組み合わせにより投与されるものである、請求項７または８に記載の組成物。

【請求項10】

さらなる療法と組み合わせて投与されるものであり、前記さらなる療法が、化学療法、放射線療法、追加のウイルスによる腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節タンパク質による処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗癌剤、免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記さらなる療法が、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその抗原結合フラグメント、ＣＯＸ２阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、およびＴＬＲアゴニストからなる群から選択される前記免疫調節剤を含む、請求項１０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／９１６，０３５号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
参照による援用

【0002】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、およびＮＣＢＩアクセッション番号は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、それぞれ具体的および個別に参照により援用されるべきものと示されている場合、およびその全体が記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されている用語と、援用される参考文献で規定されている用語に矛盾がある場合、本開示の定義が優先する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

要旨
一実施形態は、少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供し、ここで、前記少なくとも２つの変異は、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、前記位置Ｌｙｓ１１９に対応する位置にある前記変異は、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕである。いくつかの実施形態において、前記位置Ｌｙｓ１５１に対応する位置にある前記変異は、Ｌｙｓ１５１Ｇｌｕである。いくつかの実施形態において、前記野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある前記少なくとも２つの変異は、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである。

【0004】

一実施形態は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のｐＨ５において正に荷電するアミノ酸残基にある、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0005】

別の実施形態は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置１１０位置にない少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0006】

別の実施形態は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のアスパラギン酸残基の位置にない少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0007】

別の実施形態は、独立して、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のアラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン残基にある、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0008】

別の実施形態は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１以外の位置のリジン残基における天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0009】

別の実施形態は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９における天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0010】

別の実施形態は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のｐＨ５において正に荷電するアミノ酸残基にある、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供し、ここで、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記少なくとも２つの天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、ウイルスプラーク形成アッセイにおいて、増大した数のコメットテイル型プラークを生成させる。

【0011】

別の実施形態は、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供し、ここで、前記天然に存在しない変異のいずれかが前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中の位置１１０にある場合、コードされているアミノ酸は、アスパラギン残基ではない。

【0012】

別の実施形態は、腫瘍溶解性ポックスウイルスの野生型株と比較して、中和抗体に対して増大した耐性を示す改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供し、ここで、前記増大した耐性は、抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体または抗ＶＩＧ抗体による処理に続くウイルスプラークアッセイにおける、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたは前記野生型株によって生成されるプラークの数によって測定され、またここで、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、少なくとも約５５，０００プラーク形成単位／ｍＬを生成させる。

【0013】

別の実施形態は、中和抗体による処理に続くウイルスプラークアッセイにおいて、少なくとも約５５，０００プラーク形成単位／ｍＬを生成させる改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0014】

いくつかの実施形態において、前記中和抗体は、抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体または抗ＶＩＧ抗体である。いくつかの実施形態において、前記Ａ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントは、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１における変異をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ５において正に荷電する前記アミノ酸残基は、リジン残基である。いくつかの実施形態において、前記核酸は前記ウイルス遺伝子ＶＡＣＷＲ１５７の中の前記コード配列に対して、少なくとも約８０％相同であるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号３として規定されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記２つの天然に存在しない変異の少なくとも１つは、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９にある。いくつかの実施形態において、前記天然に存在しない変異は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９にある。いくつかの実施形態において、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９における前記変異は、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕである。いくつかの実施形態において、前記２つの天然に存在しない変異の少なくとも１つは、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１にある。いくつかの実施形態において、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１における前記変異は、Ｌｙｓ１５１Ｇｌｕである。

【0015】

一実施形態は、変異Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕを含むＡ３４Ｒタンパク質を発現する改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、配列番号３の位置３０５－３０７は、ヌクレオチドＧＡＡまたはＧＡＧを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３の位置４５１－４５３は、ヌクレオチドＧＡＡまたはＧＡＧを含む。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記少なくとも２つの天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、細胞内成熟ウイルス形態よりも多量の細胞外エンベロープウイルス形態を生成させる。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、細胞内成熟ウイルス形態よりも大量の細胞外エンベロープウイルス形態を生成させる。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、治療的タンパク質または診断的タンパク質の少なくとも１つをコードする外来性核酸をさらにコードする。いくつかの実施形態において、前記外来性核酸は、ケモカイン受容体、膜結合タンパク質、ヒアルロナンを分解する能力がある微生物タンパク質、微生物タンパク質、ＳＯＣＳ３、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＣＬ５、Ｎ１Ｌ、免疫チェックポイントモジュレーター、代謝調節タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、上記のものの任意の組み合わせ（例えば、代謝調節タンパク質とサイトカイン）を含む融合タンパク質の少なくとも１つをコードし得る。いくつかの実施形態において、ケモカイン受容体をコードする前記外来性核酸、ここで、前記ケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、前記膜結合タンパク質をコードする前記外来性核酸。いくつかの実施形態において、前記膜結合タンパク質は、膜結合型ヒアルロニダーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ヒアルロニダーゼ）を含む。いくつかの実施形態において、前記膜結合型ヒアルロニダーゼは、ＰＨ－２０を含む。いくつかの実施形態において、前記ＰＨ－２０は、ＧＰＩアンカー型である。いくつかの実施形態において、ヒアルロナンを分解する能力がある前記微生物タンパク質をコードする前記外来性核酸、ここで、前記微生物タンパク質は、分泌型ヒアルロニダーゼを含む。いくつかの実施形態において、前記分泌型ヒアルロニダーゼは、ＨｙｓＡ、ｌｉｎ、ｓｋｏ、およびｒｖ、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、前記微生物タンパク質をコードする前記外来性核酸。いくつかの実施形態において、前記微生物タンパク質は、ＨｙｓＡを含む。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記ウイルスの前記ゲノム中の改変をさらに含み、ここで、前記改変は、前記Ｂ５Ｒ遺伝子の変異または欠失を含む。いくつかの実施形態において、前記ウイルスの前記ゲノム中の前記改変、ここで、前記改変は、前記Ｂ５Ｒ遺伝子のＳＣＲ領域中の変異または欠失を含み、ここで、前記ＳＣＲ領域は、ＳＣＲ１、ＳＣＲ３、ＳＣＲ４、またはそれらの任意の組み合わせを含み、またここで、前記ＳＣＲ領域は、ＳＣＲ２を含まない。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｋ７Ｒ、Ｃ６Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｆ８Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｆ１０Ｌ、Ｆ１７Ｒ、Ｅ１Ｌ、Ｅ４Ｌ、Ｅ６Ｒ、Ｅ８Ｒ、Ｅ１０Ｒ、Ｅ１１Ｌ、Ｏ２Ｌ、Ｉ１Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ、Ｉ７Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ｇ１Ｌ、Ｇ３Ｌ、Ｇ４Ｌ、Ｇ５．５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｇ９Ｒ、Ｌ１Ｒ、Ｌ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｌ５Ｒ、Ｊ１Ｒ、Ｊ４Ｒ、Ｊ６Ｒ、Ｈ１Ｌ、Ｈ２Ｒ、Ｈ３Ｌ、Ｈ４Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｈ６Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ２Ｌ、Ｄ３Ｒ、Ｄ６Ｒ、Ｄ７Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ａ２．５Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ａ５Ｒ、Ａ６Ｌ、Ａ７Ｌ、Ａ９Ｌ、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｌ、Ａ１５Ｌ、Ａ１６Ｌ、Ａ１７Ｌ、Ａ１８Ｒ、Ａ２１Ｌ、Ａ２４Ｒ、Ａ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ２８Ｌ、Ａ２９Ｌ、Ａ３０Ｌ、Ａ３１Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ４２Ｒ、Ａ４５Ｒ、Ａ４６Ｒ、Ａ５２Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルス遺伝子の変異または欠失をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、ウイルス遺伝子Ａ５２Ｒの前記変異または欠失を含む。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、（ｉ）ケモカイン受容体をコードする前記外来性核酸（ここで、前記ケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２の少なくとも１つを含む）；（ｉｉ）ＰＩＡＳ３をコードする前記外来性核酸；（ｉｉｉ）前記チミジンキナーゼ遺伝子の変異または欠失；（ｉｖ）前記Ａ５２Ｒ遺伝子の前記変異または欠失を含む。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、全身送達に適している。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、免疫回避の能力がある。いくつかの実施形態において、前記全身送達は、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記非経口投与は、静脈内注入を含む。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、腫瘍内送達に適している。いくつかの実施形態において、前記ポックスウイルスは、ワクシニアウイルスである。

【0017】

一実施形態は、（ｉ）腫瘍溶解性ポックスウイルスＤＮＡバックボーンベクターを得ること（前記腫瘍溶解性ポックスウイルスＤＮＡバックボーンベクターは、先行する請求項のいずれか１つに記載の１つまたはそれを超える改変を含む）；（ｉｉ）前記腫瘍溶解性ウイルスＤＮＡベクターをさらに改変して操作されたＤＮＡベクターを生成させること；（ｉｉｉ）哺乳動物細胞を前記操作されたＤＮＡベクターでトランスフェクトすること；（ｉｖ）前記哺乳動物細胞を、ウイルス複製に適した条件下で培養すること；および（ｖ）前記ウイルス粒子を回収すること、を含む、腫瘍溶解性ポックスウイルスを操作するためのプロセスを提供する。

【0018】

いくつかの実施形態において、前記哺乳動物細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはベロ細胞を含む。

【0019】

一実施形態は、前記腫瘍溶解性ポックスウイルス、容器；および病的血管新生に関連する障害を処置するために、前記腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与するための指示、を含むキットを提供する。

【0020】

一実施形態は、腫瘍を処置する方法を提供し、前記方法は、治療有効量の前記腫瘍溶解性ポックスウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）を対象に投与することを含む。

【0021】

一実施形態は、腫瘍を処置する方法を提供し、前記方法は、前記野生型Ａ３４タンパク質（配列番号４）の位置１１９および１５１における変異を含むＡ３４Ｒタンパク質を発現する改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを感染させた患者由来の白血球細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、腫瘍微小環境においてウイルス粒子の集団を生成させる。いくつかの実施形態において、前記患者由来の白血球細胞は、マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、前記患者由来の白血球細胞は、腫瘍標的化Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記ウイルス粒子の集団の少なくとも約１０％～少なくとも約９０％は、ウイルスプラークアッセイで測定したとき、ＥＥＶ粒子である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記腫瘍微小環境から前記ＥＥＶ粒子を回収し、前記ＥＥＶ粒子を前記対象に静脈内投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。

【0022】

一実施形態は、宿主細胞の培養物に、少なくとも約１０％～少なくとも約９０％のＥＥＶ粒子を含む改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの集団を感染させることを含むプロセスを提供し、ここで、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記野生型Ａ３４タンパク質（配列番号４）の位置１１９および１５１における変異を含むＡ３４Ｒタンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。

【0023】

一実施形態は、癌を処置する方法を提供し、前記方法は、少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む改変腫瘍溶解性ウイルスを患者に投与することを含み、ここで、前記少なくとも２つの変異は、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある前記少なくとも２つの変異は、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである。

【0024】

一実施形態は、腫瘍を処置する方法を提供し、前記方法は、少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む改変腫瘍溶解性ウイルスを患者に投与することを含み、ここで、前記少なくとも２つの変異は、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある前記少なくとも２つの変異は、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである。

【0025】

いくつかの実施形態において、前記投与は、腫瘍内注入、静脈内注入、またはそれらの組み合わせによる。いくつかの実施形態において、前記投与は、腫瘍内注入、静脈内注入、またはそれらの組み合わせによる。

【0026】

いくつかの実施形態において、前記方法は、前記腫瘍溶解性ポックスウイルスと組み合わせて、さらなる療法を施すことをさらに含み、ここで、前記さらなる療法は、化学療法、放射線療法、追加のウイルスによる腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節タンパク質による処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗癌剤、免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、前記さらなる療法は、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその抗原結合フラグメント、ＣＯＸ２阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、およびＴＬＲアゴニストからなる群から選択される前記免疫調節剤を含む。

【0028】

図面の簡単な説明
本開示の新たな特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明を参照することによって、本開示の特徴および利点のより一層の理解が得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、組換えウイルスライブラリーを作成するためのＤＮＡを生成するための、例示的なアセンブリースキームを示す。

【0030】

【図2】図２は、異なるワクシニアウイルス株によって形成されたウイルスプラークコメットテイルの比較を示す。

【0031】

【図3-1】図３Ａ～３Ｂは、異なるワクシニアウイルス株を使用して実施された中和アッセイの結果を示す（図３Ａは、抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体による処置の後の結果を示し、図３Ｂは、抗Ｌ１Ｒ抗体および抗ＶＩＧ抗体による処置の後の結果を示す）。

【図3-2】同上。

【0032】

【図4】図４は、異なるワクシニアウイルス株による感染の後の、細胞生存率の結果を示す（上のパネル：ＭＣ３８細胞；下のパネル：ＨＣＴ１１６細胞）。

【0033】

【図5】図５は、異なるワクシニアウイルス株についての、癌細胞におけるウイルス複製アッセイの結果を示す（上のパネル：ＨＣＴ１１６細胞；下のパネル：ＭＣ３８細胞）。

【発明を実施するための形態】

【0034】

詳細な説明
本明細書において、本開示の好ましい実施形態が示され、および記載されているが、そのような実施形態は例示の目的で示されているに過ぎないことが、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および弛緩が、本開示を逸脱することなく、当業者によって直ちに見いだされるであろう。本開示の実施において、本明細書に記載されている本開示の実施形態に対する種々の代替が採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、その特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
ある特定の定義

【0035】

本明細書で使用されている用語は、特定のケースを説明することを目的としているに過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに文脈に反しない限り、複数形も含み得る。さらに、用語「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される場合、これらの用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様な様式で包含的であることが意図されている。

【0036】

用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定の値について許容できる誤差範囲内であることを意味し得、その値がどのようにして測定または決定されるか（例えば、測定システムの制約）に部分的に依存するであろう。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、与えられた値のプラクティスに従って、１標準偏差の範囲内、または１標準偏差超の範囲内を意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が説明されている場合、別段の記載がない限り、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、その特定の値について許容される誤差範囲、例えば、用語「約（ａｂｏｕｔ）」によって修飾されている値の±１０％を意味するとみなすべきである。

【0037】

用語「個体」、「患者」、または「対象」は、互換的に使用され得る。これらの用語は、いずれも、医療従事者（例えば、医師、正看護師、診療看護師、医療補助者、用務員、またはホスピス従業員）の監視（例えば、絶え間ない、または断続的な）によって特徴付けられる状況を必要とせず、またはそのような状況に限定されない。いくつかの実施形態において、患者、対象、または個体は、医療従事者の監視下にあってもよい。

【0038】

特定のウイルスに関して、用語「異種核酸配列」、もしくは「外来性核酸配列」、または「導入遺伝子」は、本明細書で使用される場合、その特定のウイルスとは異なる起源に由来する核酸配列を指し得る。

【0039】

本明細書で使用される場合、用語「変異」は、欠失、異種核酸の挿入、逆位、または置換を指し得る（当該技術分野で一般に理解されているオープンリーディングフレームアブレーティング変異が含まれる）。

【0040】

用語「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、個々のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸のセグメント（「コード配列」または「コード領域」とも呼ばれる）を（必要に応じて、前記コード配列の上流または下流に位置し得る関連する制御領域（例えば、プロモーター、オペレーター、ターミネーターなど）と合わせて）指し得る。

【0041】

用語「変異ウイルス」および「改変ウイルス」は、本明細書において互換的に使用される場合、ゲノム中に１つまたはそれを超える変異（それらに限定されないが、欠失、異種核酸の挿入、逆位、置換、またはそれらの組み合わせを含む）を含むウイルスを指し得る。

【0042】

用語「天然に存在する」は、本明細書においてウイルスに関連して使用される場合、前記ウイルスが天然に見いだすことができること、すなわち、そのウイルスが、天然の供給源から単離することができ、また意図的に改変されていないこと（例えば、野生型ウイルス）を指し得る。

【0043】

用語「天然に存在しない」は、本明細書においてウイルス核酸配列における、またはウイルスタンパク質のアミノ酸配列における１つまたはそれを超える変異に関連して使用される場合、前記１つまたはそれを超える変異を含むウイルス株が、天然に見いだすことができないこと、すなわち、そのウイルス株が、天然の供給源から単離することができず、その代わりに、意図的に改変されていることを指し得る。

【0044】

本明細書において言及される用語「阻害」、「低減させる」、もしくは「予防」、またはこれらの用語の任意の変形は、所望の結果を実現するための、任意の測定可能な減少、または完全な阻害を含み得る。

【0045】

「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、制御配列（転写の開始および速度を制御する核酸配列の領域である）であり得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、調節タンパク質および分子がＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子を結合し得る遺伝因子を含み得る。用語「作動可能に配置された」、「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写調節下」は、プロモーターが、核酸配列に関して、その配列の転写開始および／または発現を制御するための、正しい機能的位置および／または方向にあることを意味し得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、「エンハンサー」（核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を指す）と共に使用してもよく、「エンハンサー」と共に使用しなくてもよい。

【0046】

用語「相同性」は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の、最適な比較の目的でその配列をアライン（例えば、第１の配列の配列中にギャップが挿入され得る）することによって決定され得る「相同性」または「パーセント相同性」の計算値であり得る。次いで、その対応する位置のヌクレオチドが比較され得、その２つの配列の間のパーセント同一性は、それらの配列に共通する、一致する位置の数の関数であり得る（すなわち、％相同性＝一致する位置の数／位置の総数×１００）。例えば、第１の配列におけるある位置は、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められていることがあり得、その場合、これらの分子は、その位置において一致している。２つの配列の間のパーセント相同性は、その２つの配列の最適なアラインメントのために挿入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列に共通する一致する位置の数の関数であり得る。いくつかの実施形態において、比較の目的でアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９５％であり得る。ＢＬＡＳＴ（登録商標）サーチによって、２つの配列の間の相同性が決定され得る。相同性は、２つの配列の全長の間、または２つの配列の全長の部分の間であり得る。前記２つの配列は、遺伝子、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、ペプチド配列、アミノ酸配列、またはそれらのフラグメントであり得る。前記２つの配列の実際の比較は、よく知られている方法によって、例えば、数学的アルゴリズムを使用して実現され得る。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０－５８７３－５８７７（１９９３）に記載されているであろう。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれ得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する場合、各プログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の任意の適切なパラメーターが使用され得る。例えば、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定してもよく、変更してもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムＣＡＢＩＯＳ（１９８９）、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＡがあげられる。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して求めることができる。

【0047】

用語「対象」は、それらに限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ｃｏｗ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ｒａｔ、またはマウスを含む、動物を指し得る。用語「対象」および「患者」は、本明細書において、例えば、哺乳動物対象（例えばヒト対象）について、互換的に使用される。

【0048】

用語「処置する」、「処置する」、および「処置」は、障害、疾患、または症状；または前記障害、疾患、または症状に関連する１つまたはそれを超える徴候を軽減または消失させること；または前記障害、疾患、または症状自体の原因（単数または複数）を軽減または根絶させることを含むことが意図され得る。処置の望ましい効果は、それらに限定されないが、疾患の発症または再発を予防すること、徴候を軽減させること、前記疾患の直接的または間接的な病理学的結果を減少させること、転移を予防すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善を含み得る。

【0049】

用語「治療有効量」は、投与した場合に、処置中の障害、疾患、または症状の１つまたはそれを超える徴候の発生を予防するために、またはある程度軽減させるために十分であり得る化合物の量を指し得る。用語「治療有効量」は、また、研究者、獣医、医師、または臨床家に求められている、細胞、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を引き出すために十分な化合物の量も指し得る。

【0050】

用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「生理学的に許容される担体」、または「生理学的に許容される賦形剤」は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル（例えば、液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料など）を指し得る。あるコンポーネントは、医薬製剤の他の成分と適合性であるという点で、「薬学的に許容される」であり得る。また、合理的なベネフィット／リスク比に見合う毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは併発障害を超えることなく、ヒトおよび動物の組織または器官と接触させて使用するのにも好適であり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｒｏｗｅら編、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００５；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；ＡｓｈおよびＡｓｈ編、Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｓｏｎ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００４）を参照のこと。

【0051】

用語「医薬組成物」は、本明細書に開示されている化合物と、他の化学成分（例えば希釈剤または担体）との混合物を指し得る。前記医薬組成物は、前記化合物の生物への投与を容易にし得る。化合物を投与する多数の技術（それらに限定されないが、経口、注射、エアロゾル、非経口、および局所投与が含まれる）が、当該技術分野に存在する。医薬組成物は、また、化合物を、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または有機酸と反応させることによって得ることもできる。

【0052】

「抗癌剤」は、本明細書で使用される場合、例えば、癌細胞を死滅させることによって（癌細胞におけるアポトーシスを含む）、癌細胞の増殖速度を低下させることによって、転移の頻度または数を低減させることによって、腫瘍サイズを縮小させることによって、腫瘍増殖を阻害することによって、腫瘍または癌細胞への血液供給を減少させることによって、腫瘍または癌細胞に対する免疫応答を促進することによって、癌の進行を阻止または阻害することによって、または癌を有する対象の寿命を延ばすことによって、対象における癌に対してネガティブな影響を与えることが可能な薬剤または療法を指し得る。抗癌剤の非限定的な例としては、生物学的薬剤（生物学的療法）、化学療法剤、および放射線療法剤があげられ得る。

【0053】

用語「腫瘍溶解性」は、本明細書で使用される場合、癌または腫瘍細胞を、薬剤（例えば、腫瘍溶解性ウイルスなど、腫瘍溶解性ポックスウイルスなど、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）によって、例えば、前記細胞の直接的溶解によって、前記細胞に対する免疫応答を刺激すること、アポトーシス、毒性タンパク質の発現、オートファジー、およびタンパク質合成の停止、抗腫瘍免疫の誘導、またはそれらの任意の組み合わせによって、死滅させることを指し得る。薬剤（例えば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）を感染させた前記癌または腫瘍細胞の直接的溶解は、前記細胞内において前記ウイルスが複製した結果であり得る。ある特定の例において、用語「腫瘍溶解性」は、癌または腫瘍細胞を、前記細胞を溶解させずに死滅させることを指し得る。

【0054】

用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞に選択的に感染して死滅させるウイルスを指し得る。ある特定の非限定的な状況下で、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を選択的に死滅させることだけではなく、宿主の抗腫瘍免疫応答を刺激することにも依存する二重のメカニズムによって、抗腫瘍応答を誘導し得ることが理解される。

【0055】

いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、それらに限定されないが、（ｉ）癌細胞内で選択的に自然に複製し、かつヒトにおいて非病原性であるウイルス（多くの場合、生得的な抗ウイルスシグナリング経路に対する感受性が高いこと、または発癌シグナリング経路に対する依存性による）；および（ｉｉ）使用のために遺伝的に操作されたウイルス、を含み得る。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含み得る。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスを含み得る。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスは、レポリポックスウイルスまたはワクシニアウイルスを含み得る。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株（ＷＲ）、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株を含み得る。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｗｙｅｔｈ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、Ｔａｓｈ Ｋｅｎｔ、またはＵＳＳＲ株を含み得る。いくつかの実施形態において、レポリポックスウイルスは、ミクソーマウイルスを含み得る。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、改変され得る。

【0056】

用語「改変腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書で使用される場合、その構成要素に改変、例えば、それらに限定されないが、（例えばウイルス遺伝子の変異または欠失、外来性核酸の導入、ウイルス核酸またはウイルスタンパク質の化学修飾、およびウイルスカプシドへの外来性タンパク質または改変ウイルスタンパク質の導入のような）前記ウイルスの天然ゲノム（「バックボーン」）における改変を含む、腫瘍溶解性ウイルスを指し得る。一般に、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に対する治療効果を改善するために、改変され（「操作され」としても知られる）得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、改変ポックスウイルスであり得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、改変ポックスウイルスであり得る。

【0057】

用語「全身送達」と「全身投与」は、本明細書において互換的に使用され、いくつかのケースにおいて、循環系の中への、医療用薬物、腫瘍溶解性ウイルス、または他の物質の投与経路を指し得る。前記全身投与は、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
細胞外エンベロープウイルス形態の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス

【0058】

ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）は、ＩＭＶ（細胞内成熟ウイルス（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｕｒｅ Ｖｉｒｕｓ）；これは、抗原性は高いが安定であり、ポックスウイルスの宿主間伝播のために重要であり得る）、およびＥＥＶ（細胞外エンベロープウイルス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ Ｖｉｒｕｓ）；これは、宿主の外部では不安定であり得るが、このウイルスを包み隠す宿主細胞由来のアウターエンベロープのおかげで、宿主内における伝播の増進が可能であり得る；そうであるから、このＥＥＶ形態は、前記ワクシニアウイルスの（例えば、宿主内における前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの）全身的伝播のために有用であり得る）を含む、いくつかの形態で存在し得る。

【0059】

異なるワクシニア株は、感受性細胞に感染した後、ＩＭＶ粒子とＥＥＶ粒子を異なる比率で産生することが知られており、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株は、低ＥＥＶ生成株であり、ワクシニアのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（ＩＨＤ）－Ｊ株（ＩＨＤ－Ｊ）は、高ＥＥＶ産生株である。ＩＨＤ－Ｊに存在するが、ＷＲには存在しないワクシニア遺伝子の点変異の一例は、ワクシニアウイルス遺伝子ＶＡＣＷＲ１５７によってコードされている、前記Ａ３４Ｒタンパク質（Ｋ１５１Ｅ）に存在する。この変異を含む、ＷＲに由来する株（ＷＩ株、これは、ＩＨＤ－Ｊ由来の前記Ａ３４Ｒ遺伝子が、前記ＷＲ Ａ３４Ｒ遺伝子の部位に組換えられたＷＲウイルスである）は、ＥＥＶ産生が増加することが示されている（Ｂｌａｓｃｏ，Ｒ．ら、１９９３、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｊｕｎ；６７（６）：３３１９－２５を参照のこと）。

【0060】

本開示のいくつかの実施形態において、前記ウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）形態の細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）形態に対する比率を増大させる改変（ウイルス糖タンパク質（例えば、Ａ３４Ｒタンパク質；ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ２４７６１に示されている野生型配列；配列番号４）における天然に存在しない変異など）を含み得る改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルス株）が提供される。例えば、前記ウイルス糖タンパク質（例えば、Ａ３４Ｒタンパク質）に前記天然に存在しない変異を含む前記改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルス株は、ＩＭＶ粒子と比較して、多量のＥＥＶ粒子を放出し得る。

【0061】

いくつかの実施形態において、ウイルス糖タンパク質（Ａ３４Ｒなど）中に２つまたはそれを超える天然に存在しない変異を含み得る改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルス株が提供される。前記変異Ａ３４Ｒタンパク質（本明細書において「ＷＯ３４」とも呼ばれる）についての例示的なアミノ酸配列を配列番号５に示す。

【0062】

いくつかの実施形態において、前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）またはそのフラグメントの中の正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン）におけるものであり得、ここで、前記正に荷電したアミノ酸残基は、ｐＨ５において正に荷電する。いくつかの実施形態において、前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異の少なくとも１つは、野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）またはそのフラグメントの中の位置１１０におけるものであり得る。いくつかの例において、前記２つまたはそれを超える変異の少なくとも１つが野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置１１０にある場合、その位置にある前記変異したアミノ酸は、アスパラギンではない。

【0063】

いくつかの実施形態において、前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）またはそのフラグメントの中のアスパラギン酸残基におけるものではない。いくつかの実施形態において、前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異は、独立して、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）またはそのフラグメントの中の、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン残基におけるものであり得る。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスによって発現される前記Ａ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントは、リジン残基における天然に存在しない変異を含み得、ここで、前記リジン残基は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）（またはそのフラグメント）の位置Ｌｙｓ１５１以外の位置のものであり得る。いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスによって発現される前記Ａ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントは、位置Ｌｙｓ１１９における天然に存在しない変異を含み得る。

【0064】

いくつかの実施形態において、前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異は、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）またはそのフラグメントの残基１１９および１５１におけるものであり得る。いくつかの実施形態において、位置１１９における前記変異は、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ（Ｋ１１９Ｅ）であり得る。いくつかの実施形態において、位置１５１における前記変異は、Ｌｙｓ１５１Ｇｌｕ（Ｋ１５１Ｅ）であり得る。

【0065】

いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン（ｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ノイラミニダーゼ、Ｓｐｉｋｅ（Ｓ）糖タンパク質、Ｅ１、Ｅ２、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｇｐ１、ｇｐ２、Ｅ（ダイマー）、Ｅ１、またはＥ２などのウイルスタンパク質中に変異を含み得る改変腫瘍溶解性ポックスウイルス株が提供される。

【0066】

いくつかのケースにおいて、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスのＡ３４Ｒタンパク質中の前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異は、前記ウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）形態の細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）に対する比率の増大をもたらし得る。

【0067】

いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスのＡ３４Ｒタンパク質中の前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異は、前記Ａ３４Ｒタンパク質中に前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一のポックスウイルス株と比較して、前記ウイルスのＥＥＶ形態のＩＭＶ形態に対する比率の増大をもたらし得る。

【0068】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される、前記Ａ３４タンパク質中に少なくとも２つの天然に存在しない変異を含む改変ポックスウイルス株は、組織培養中により低レベルのＥＥＶ粒子を放出するポックスウイルス株（例えば、前記Ａ３４Ｒタンパク質中に少なくとも２つの天然に存在しない変異を含まないワクシニアウイルス株）によって形成される、組織培養中の大きくて丸いプラークと比較して、（組織培養中のより多くのコメット形成によって測定されるように）より高レベルのＥＥＶ粒子を放出する。

【0069】

前記Ａ３４Ｒタンパク質中に少なくとも２つの天然に存在しない変異を含む、本開示の改変ポックスウイルスによって放出される前記ＥＥＶ粒子は、いくつかの実施形態において、抗体（中和抗体）による中和および補体毒性に対して抵抗性であるのに対し、前記ＩＭＶ粒子は抵抗性ではない。そうであるから、前記ＥＥＶ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、長期にわたって伝播を媒介し得る。

【0070】

前記ＥＥＶ粒子は、また、ＩＭＶ粒子と比較して、（より低い粒子／ＰＦＵ比によって判定されるように）より高い感染特異性も有し得る。したがって、より高レベルのＥＥＶ粒子を放出する前記改変ポックスウイルス株は、治療用途について改善されたウイルスであり得る。

【0071】

いくつかの実施形態において、ある特定の宿主細胞由来タンパク質は、ＥＥＶプレパレーション（ＥＥＶ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）と共局在し得るが、ＩＭＶと共局在せず、また細胞由来タンパク質の量は、前記宿主細胞株と前記ウイルス株に依存し得る。例えば、研究によって、ＷＲ ＥＥＶは、ＶＶ ＩＨＤ－Ｊ株と比較して、より多くの細胞由来タンパク質を含むことが示されている（ｖａｎ Ｅｉｊｌ Ｈ，Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ ＧＬ．Ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａ３６Ｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａ ｔｙｐｅ ｌｂ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０００；２７１：２６－３６を参照のこと）。いくつかのケースにおいて、宿主細胞由来のタンパク質は、ＥＥＶ粒子の生物学的効果を改変し得る。一例として、前記宿主膜タンパク質ＣＤ５５を、前記Ａ３４Ｒタンパク質中に少なくとも２つの天然に存在しない変異を含む前記ＷＲワクシニアウイルス株によって放出される前記ＥＥＶ粒子の表面に組み込むことによって、補体毒性に対して抵抗性になり得る。

【0072】

ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株に関し、ウイルス粒子の約１％は、通常ＥＥＶであり、前記生産者細胞の腫瘍崩壊前に培養上清中に放出される。いくつかの研究によって、ワクシニアのＩＨＤ－Ｊ株から、５０倍多くのＥＥＶ粒子が放出されることが示されている（Ｂｌａｓｃｏ Ｒ，Ｓｉｓｌｅｒ ＪＲ，Ｍｏｓｓ Ｂ．、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｙ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｃｔｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａ３４Ｒ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９３；６７：３３１９－２５を参照のこと；また、Ｍｃｉｎｔｏｓｈ ＡＡ，Ｓｍｉｔｈ ＧＬ．、Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ３４Ｒ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９６；７０：２７２－８１も参照のこと）。

【0073】

本開示の改変ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）株は、いくつかの例において、少なくとも２つの天然に存在しない変異（例えば、Ｋ１５１ＥおよびＫ１１９Ｅ）を含むＡ３４Ｒタンパク質を含まないがその他の点では同一のポックスウイルス株と比較して、約１０倍～約２００倍高いレベルのＥＥＶ粒子を放出し得る。

【0074】

いくつかの実施形態において、本開示の改変ポックスウイルス株は、少なくとも２つの天然に存在しない変異（例えば、Ｋ１５１ＥおよびＫ１１９Ｅ）を含むＡ３４Ｒタンパク質を含まないがその他の点では同一のポックスウイルス株と比較して、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約２５倍、約２５倍～約３０倍、約３０倍～約３５倍、約３５倍～約４０倍、約４０倍～約４５倍、約４５倍～約５０倍、約５０倍～約５５倍、約５５倍～約６０倍、約６０倍～約６５倍、約６５倍～約７０倍、約７５倍～約８０倍、約８５倍～約９０倍、約９５倍～約１００倍、約１００倍～約１２０倍、約１２０倍～約１４０倍、約１４０倍～約１６０倍、約１６０倍～約１８０倍、約１８０倍～約２００倍多くのＥＥＶ粒子を放出し得る。

【0075】

いくつかの実施形態において、本開示の改変ワクシニアウイルス株は、前記Ａ３４Ｒタンパク質が前記変異Ｋ１１９ＥおよびＫ１５１Ｅを含むＷＲ株であり得、また、前記変異Ｋ１１９ＥおよびＫ１５１Ｅを含むＡ３４Ｒタンパク質を含まないがその他の点では同一のＷＲワクシニアウイルス株と比較して、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約２５倍、約２５倍～約３０倍、約３０倍～約３５倍、約３５倍～約４０倍、約４０倍～約４５倍、約４５倍～約５０倍、約５０倍～約５５倍、約５５倍～約６０倍、約６０倍～約６５倍、約６５倍～約７０倍、約７５倍～約８０倍、約８５倍～約９０倍、約９５倍～約１００倍、約１００倍～約１２０倍、約１２０倍～約１４０倍、約１４０倍～約１６０倍、約１６０倍～約１８０倍、約１８０倍～約２００倍多くのＥＥＶ粒子を放出し得る。

【0076】

いくつかの実施形態において、本開示の改変ワクシニアウイルス株は、前記Ａ３４Ｒタンパク質が前記変異Ｋ１１９ＥおよびＫ１５１Ｅ（ＷＯ３４）を含むＷＲ株であり得、また、ＷＩワクシニアウイルス株と比較して、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約２５倍、約２５倍～約３０倍、約３０倍～約３５倍、約３５倍～約４０倍、約４０倍～約４５倍、約４５倍～約５０倍、約５０倍～約５５倍、約５５倍～約６０倍、約６０倍～約６５倍、約６５倍～約７０倍、約７５倍～約８０倍、約８５倍～約９０倍、約９５倍～約１００倍、約１００倍～約１２０倍、約１２０倍～約１４０倍、約１４０倍～約１６０倍、約１６０倍～約１８０倍、約１８０倍～約２００倍多くのＥＥＶ粒子を放出し得る。

【0077】

いくつかのケースにおいて、本開示の改変ポックスウイルスによる、ＩＭＶ粒子と比較した、ＥＥＶ粒子放出の増加は、ウイルスプラークアッセイを行うことによって決定することができ、ここで、前記Ａ３４Ｒタンパク質中に前記２つまたはそれを超える変異を含まないがその他の点では同一のポックスウイルスと比較して、前記Ａ３４Ｒタンパク質中に前記２つまたはそれを超える天然に存在しない変異を含むポックスウイルスにおいて、増大した数のコメットテイル形成が観察され得る。

【0078】

いくつかのケースにおいて、ＩＭＶ粒子と比較した、ＥＥＶ粒子放出の増加は、中和アッセイを行うことによって決定することができ、ここで、本開示の改変ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス株）を感染させ、中和抗体（例えば、抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体またはＶＩＧ抗体など）に曝露した細胞は、ウイルスプラークアッセイで試験することができ、また、ウイルスプラーク形成（例えば、ＰＦＵ／ｍＬによる）は、適切な対照ウイルス（例えば、前記Ａ３４Ｒタンパク質中に少なくとも２つの天然に存在しない変異を含まないワクシニアウイルス株）と比較することができる。いくつかのケースにおいて、抗Ｌ１は、ＩＭＶ感染を中和およびブロックし得る。いくつかのケースにおいて、ＶＩＧ抗体は、ＶＶ感染をブロックし得る。

【0079】

いくつかのケースにおいて、ＩＭＶ粒子と比較した、ＥＥＶ粒子放出の増加は、コメットテイル形成の増加を観察することによって決定することができる。いくつかのケースにおいて、コメットテイル形成の増加を観察することは、蒔かれた既知量のウイルスから生成される、プレート上のコメットテイルの外観をしたコロニーの数をカウントし、蒔かれた別の同等量のウイルスによる、プレート上のコロニー数と比較することを含み得る。いくつかのケースにおいて、コメット形成の増加は、ウイルス株の、ＩＭＶ形態と比較したＥＥＶ量の増加を示し得る。

【0080】

いくつかのケースにおいて、本開示の改変ポックスウイルス株は、ホスホリパーゼ、キナーゼ、リンタンパク質、ポリメラーゼ、膜タンパク質、ウイルス粒子コアタンパク質、グルタレドキシン、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ＩＭＶタンパク質、プロテイナーゼ、ヘリカーゼ、メタロプロテイナーゼ、ウイルス粒子構造タンパク質、ミリスチルタンパク質、ホスファターゼ、ヘパリン結合タンパク質、糖タンパク質、ＡＴＰアーゼ、キャッピング酵素、転写因子、前駆タンパク質、サブユニットタンパク質、ＤＮＡヘリカーゼ、パルミチルタンパク質、または受容体をコードする前記ウイルスゲノムの領域内に、１つまたはそれを超える追加の変異を含み得る。

【0081】

いくつかのケースにおいて、１つまたはそれを超える追加の変異は、ポックスウイルス遺伝子、例えば、ポックスウイルスのＴＫ（チミジンキナーゼ）、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｋ７Ｒ、Ｃ６Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｆ８Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｆ１０Ｌ、Ｆ１７Ｒ、Ｅ１Ｌ、Ｅ４Ｌ、Ｅ６Ｒ、Ｅ８Ｒ、Ｅ１０Ｒ、Ｅ１１Ｌ、Ｏ２Ｌ、Ｉ１Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ、Ｉ７Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ｇ１Ｌ、Ｇ３Ｌ、Ｇ４Ｌ、Ｇ５．５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｇ９Ｒ、Ｌ１Ｒ、Ｌ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｌ５Ｒ、Ｊ１Ｒ、Ｊ４Ｒ、Ｊ６Ｒ、Ｈ１Ｌ、Ｈ２Ｒ、Ｈ３Ｌ、Ｈ４Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｈ６Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ２Ｌ、Ｄ３Ｒ、Ｄ６Ｒ、Ｄ７Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ａ２．５Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ａ５Ｒ、Ａ６Ｌ、Ａ７Ｌ、Ａ９Ｌ、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｌ、Ａ１５Ｌ、Ａ１６Ｌ、Ａ１７Ｌ、Ａ１８Ｒ、Ａ２１Ｌ、Ａ２４Ｒ、Ａ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ２８Ｌ、Ａ２９Ｌ、Ａ３０Ｌ、Ａ３１Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ４２Ｒ、Ａ４５Ｒ、Ａ４６Ｒ、Ａ５２Ｒ遺伝子など、におけるものであり得る。また、本明細書において、いくつかの実施形態において、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、前記ウイルスの前記ＥＥＶ形態を増加させる天然に存在しない変異を含み得、さらに、非ウイルスタンパク質（例えば、治療的タンパク質または診断的タンパク質など）をコードし得る外来性核酸を含み得るワクシニアウイルス株）も提供される。前記外来性核酸によってコードされるタンパク質の非限定的な例としては、ＳＯＣ３、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＬ５、Ｎ１Ｌ、免疫チェックポイントモジュレーター（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＮＳ、ＥＰＯ、ｅｎｖ、Ｆ８、ＧＣＧ、ＩＦＮＧ、ＩＧＨＧ１、Ｆ９、ＧＨ１、ＩＬ－２、ＣＳＦ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＡＬＢ、ＰＬＡＵ、ＩＦＮＢ１、ＣＳＦ３、ＩＦＮＡ２、ＦＳＨＢ、Ａ型ボツリヌス毒素、アレファセプト、パンクレリパーゼ、アンチトロンビンアルファ、アルシツモマブ、抗アカゲザル（ｒｈ）免疫グロブリンＧ、抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブ、アブシキシマブ、アルグルコシダーゼアルファ、アバタセプト、ペガデマーゼ、アプシチド、ヒト血清アルブミン、ラスブリカーゼ、ベバシズマブ、Ｂ型ボツリヌス毒素、ビバリルジン、絨毛性性腺刺激ホルモンα、ペグフィルグラスチム、コラゲナーゼＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｉｏｌｙｔｉｃｕｍ、フィルグラスチム、ＣｒｏＦａｂ（ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ Ｆａｂ）、サルグラモスチム、ドルナーゼアルファ、デニロイキンジフチトクス、ジゴキシン免疫Ｆａｂ、エポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、エクリズマブ、エンフビルチド、エキセナチド、エファリズマブ、パリフェルミン、凝固第ＩＸ因子、抗血友病因子、サイロトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、組換えヒト凝固因子ＶＩＩａ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ガルスルファーゼ、ペグビソマント、イミグルセラーゼ、ソマトロピン、グルカゴン、アガルシダーゼベータ、アルグルセラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヒストレリン、Ｃ型肝炎抗原、ＨＩＶ抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＰＶワクチン、ヒアルロニダーゼ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンガンマ－１ｂ、インスリン、ラロニダーゼ、イブリツモマブチウキセタン、インスリン、インフリキシマブ、インターフェロンベータ－１ｂ、オプレルベキン、イデュルスルファーゼ、パニツムマブ、ヒト免疫グロブリン、セツキシマブ、アダリムマブ、ペグアスパルガーゼ、ダクリズマブ、アスパラギナーゼ、インターフェロンアルファコン－１、インターフェロンアルファ－ｎ３、ルトロピンアルファ、レピルジン、ラクターゼ、ムロモナブ、メカセルミン、ナタリズマブ、ノフェツモバブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、ネシリチド、オクトレオチド、ｏｓｐＡリポタンパク質、テネクテプラーゼ、プラムリンチド、パパイン、ウロキナーゼ、アニストレプラーゼ、ドロトレコギンアルファ、レテプラーゼ、ベカプレルミン、パリビズマブ、アルテプラーゼ、ラニビズマブ、組換えヒト骨形成因子７（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｅｏｔｅｉｎ ７）（ｒｈＢＭＰ７）、組換え精製タンパク質誘導体（ＤＰＰＤ）、ストレプトキナーゼ、カルシトニン、セルモレリン、セクレチン、α１プロテイナーゼ阻害剤、サツモマブペンデチド、テクネチウムファノレソマブ、テリパラチド、トリプシン、エタネルセプト、およびそれらの機能ドメインもしくはフラグメントもしくはバリアント、またはそれらの任意の組み合わせがあげられ得る。

【0082】

ヒアルロナン（ＨＡ）は、ＥＣＭの重要な構造要素であり、また、反復する二糖単位からなる高分子量の直鎖グリコサミノグリカンである。ヒアルロナン（ＨＡ）は、結合組織、上皮組織、および神経組織にわたって幅広く分布し得、その発現レベルは、多くの種類の腫瘍において著しく上昇し得る。ヒアルロニダーゼは、ＨＡの分解を触媒する酵素のファミリーである。これまでにヒトにおいて同定されている機能性のヒアルロニダーゼは、少なくとも５つ存在し（すなわち、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４、およびＨＹＡＬ５（ＰＨ－２０またはＳＰＡＭ１としても知られる））、これらのうち、比較的中性のｐＨで機能することがこれまでに知られているものは、ＰＨ－２０ただ１つである。本開示のいくつかの実施形態において、ヒアルロニダーゼを他の腫瘍標的化治療剤（例えば、導入遺伝子（本明細書において、外来性核酸ともいう））と組み合わせることによって、少なくとも前記ＥＣＭを減少させ、かつ前記腫瘍内および前記腫瘍間の前記治療剤の移送を促進することによって、前記改変腫瘍溶解性ウイルスの前記治療効果が促進され得る。

【0083】

本明細書のいくつかの実施形態は、ヒアルロナンを分解する能力がある膜結合タンパク質（例えばヒアルロニダーゼなど）をコードする外来性核酸を含み得る改変腫瘍溶解性ウイルスを開示する。用語「ヒアルロニダーゼ」は、本明細書で使用される場合、腫瘍中のＨＡの分解を触媒する任意の酵素またはそのフラグメント（それらに限定されないが、ＰＨ－２０および他の種由来のホモログ、ならびに類似の酵素機能を有する他の操作された／設計のタンパク質を含む）を指し得ることに留意すべきである。本明細書で使用される場合、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素のクラスを指し得る。

【0084】

いくつかの実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、キメラタンパク質であるケモカイン受容体をコードし得る外来性核酸を含む。その細胞外ドメインの少なくとも一部は、前記ウイルスの前記腫瘍標的化送達を促進し得るケモカイン受容体由来であってもよく、また、その細胞内ドメインの少なくとも一部は、前記腫瘍特異的複製を促進、免疫抑制活性を阻害、またはいくつかの他の有益な効果を伝達するケモカイン受容体由来であってもよく、または、この逆であってもよい。例えば、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＣＲ５の細胞内ＧＴＰアーゼドメイン、およびＣＸＣＲ４またはＣＣＲ２の細胞外ケモカイン結合ドメインを有するタンパク質をコードする核酸を含み得る。あるケースにおいて、異なる機能性を有するドメインを組み合わせることによって、前記改変腫瘍溶解性ウイルスの治療能力のさらなる改善が実現され得る。本開示の一実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのケモカイン受容体をコードし得る外来性核酸を含み得る。いくつかのケースにおいて、２つまたはそれを超える異なるケモカイン受容体（これらは、前記ウイルスによって同時に発現され得る）をコードし得る外来性核酸を含み得る。本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ウイルスから同時に発現され得る例示的なケモカイン受容体としては、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２があげられ得る。１つを超えるケモカイン受容体を発現する改変腫瘍溶解性ウイルスにおいて、前記腫瘍溶解性ウイルスの臨床適用に関して、腫瘍細胞に対する組み合わせ効果または相乗的効果が実現され得る。

【0085】

ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、外来性ＣＸＣＲ４発現核酸を含む。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、外来性ＣＣＲ２発現核酸を含む。ある特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４とＣＣＲ２の両方を含む改変腫瘍溶解性ウイルスを開示し、両ケモカインは、同じウイルスから発現される。ある特定の状況において、典型的には前記腫瘍微小環境中で発現されるＣＸＣＬ１２および／またはＣＣＬ２は、前記ＣＸＣＲ４および／またはＣＣＲ２を発現しているリンパ球または前記改変腫瘍溶解性ウイルスが感染した他の遊走性細胞を誘引し、それによって前記改変腫瘍溶解性ウイルスの前記腫瘍標的化送達を増大させ得る。

【0086】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている改変ウイルスは、１つまたはそれを超える外来性核酸配列（あるいは、導入遺伝子と呼ばれる）を含み得、前記外来性核酸配列は、ＳＴＡＴ３の活性を調節し得る薬剤をコードするｍＲＮＡを生成させることができ、またその結果、ＳＴＡＴ３によって制御される遺伝子の活性化も調節し得る。よって、本明細書で提供されるある特定の例は、ＳＴＡＴ－３媒介性遺伝子活性化を調節し得る薬剤をコードし得る外来性核酸配列を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。語句「ＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を調節する」は、本明細書で使用される場合、ＳＴＡＴ３活性が調節され、またその結果、ＳＴＡＴ３によって制御される１つまたはそれを超える遺伝子の活性化もまた調節されるプロセスを指し得る。

【0087】

ある特定の実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を調節し得る前記薬剤は、タンパク質またはそのフラグメントであり得る。ある特定の実施形態において、前記タンパク質または前記そのフラグメントは、ＳＴＡＴ３活性およびＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を阻害、低減、または最小化し得る。ＳＴＡＴ３活性およびＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を阻害、低減、および／または最小化するタンパク質またはそのフラグメントは、例えば、ＳＴＡＴ３応答遺伝子のプロモーター領域内のＤＮＡ結合配列に対するＳＴＡＴ３の結合をブロックし得る。追加の例において、ＳＴＡＴ３活性およびＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を阻害、低減、または最小化する前記タンパク質またはそのフラグメントは、前記ＳＴＡＴ３タンパク質を、例えばＳＨ２ドメインで、直接結合し得る。ある特定の実施形態において、ＳＴＡＴ３活性を阻害、低減、および／または最小化するタンパク質は、ＳＴＡＴ３のリン酸化をブロック、阻害、低減、および／もしくは最小化し、ならびに／またはＳＴＡＴ３を脱リン酸化する。ある特定の非限定的な実施形態において、ＳＴＡＴ３活性を調節する前記タンパク質は、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、活性化ＳＴＡＴのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳ、例えば、ＰＩＡＳ３）、およびサイトカインシグナル抑制因子（ＳＯＣＳ）タンパク質（例えば、ＳＯＣ３）を含み得る。
癌標的

【0088】

本開示の実施形態において、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（ｍｏｄｉｆｉｅｓｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｘｖｉｒｕｓ）の送達による、過剰増殖性疾患（例えば、癌または腫瘍など）のための処置方法が提供される。本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスによって処置され得る癌は、それらに限定されないが、黒色腫、肝細胞癌、乳癌、肺癌、腹膜癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、腎癌、膵臓癌、上皮癌、胃癌、結腸癌、十二指腸癌、膵臓腺癌、中皮腫、多形神経膠芽腫、星細胞腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、肝細胞癌、胆管肉腫、膵臓腺癌、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸癌、腸管型胃腺癌、頸部扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄増殖性新生物、および肉腫を含み得る。

【0089】

本開示の方法によって処置され得る癌細胞は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、ガム、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮由来の細胞を含み得る。さらに、前記癌は、それらに限定されないが、具体的には、以下の組織学的タイプの癌、すなわち、新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨大紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管細胞癌；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸腺腫症；固形癌腫；カルチノイド腫瘍、悪性；気管支肺胞腺癌（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ 腺癌）；乳頭状腺癌；嫌色素性癌腫；好酸性癌；好酸性腺癌；塩基好性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭腺癌および濾胞腺癌；非被嚢性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ 癌腫）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；リピッド細胞腫（ｌｉｐｉｄ 細胞 腫瘍）、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫；アメロブラストーマ、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星細胞腫；アストロブラストーマ；神経膠芽腫；希突起神経膠腫；希突起膠芽腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；傍肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増生性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；およびヘアリーセル白血病であり得る。いくつかのケースにおいて、転移性である固形癌は、本開示の改変腫瘍溶解性ウイルス（例えば、全身送達に有利な改変腫瘍溶解性ポックスウイルスなど）を使用して処置され得る。いくつかのケースにおいて、（例えば治療剤の腫瘍内送達の目的で）アクセスできない、またはアクセスが困難である固形癌は、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（これは、全身送達に有利である）を使用して処置され得る。遊離脂肪酸の発現増加に関連する癌は、いくつかの例において、全身送達に有利であり、かつＥＥＶ形成量が増加する、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを使用して処置され得る。

【0090】

本開示は、また、任意のタイプの原発癌の局所的侵襲もしくは転移、またはその両方を阻害または予防するための方法も意図している。例えば、前記原発癌は、黒色腫、非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝細胞癌、網膜芽細胞腫、星細胞腫、神経膠芽腫、ガム、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）、胃腸、リンパ腫、脳、結腸、または膀胱であり得る。ある特定の実施形態において、前記原発癌は、肺癌であり得る。例えば、前記肺癌は、非小細胞肺癌であり得る。さらに、本開示は、癌を予防するために、または前癌または前悪性細胞（化生、異形成、および過形成を含む）を処置するために使用し得る。また、望ましくないが良性の細胞、例えば、扁平上皮化生、異形成、良性前立腺過形成細胞、過形成病変などを阻害するためにも使用し得る。いくつかの実施形態において、癌、またはより重篤な形態の癌への進行は、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを要する本開示の方法によって、停止、中断、または遅延させ得る。

【0091】

さらに、本明細書に開示されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記腫瘍微小環境において遊離脂肪酸のバイオアベイラビリティーが高い腫瘍の処置のために投与され得る。いくつかの例において、肥満患者における腫瘍中の脂肪細胞によって放出される遊離脂肪酸は、前記腫瘍内の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの複製、および前記ウイルスのＥＥＶ形態の形成に栄養を供給し得、かつそれらを促進し得る。この利点は、非肥満患者（特に腹膜癌を有する患者）においても実現され得る。例えば、いくつかの腹膜癌は、網の壁で成長する傾向があり、かつ脂肪細胞によって栄養を供給されることがあり得、ならびに、上述のように、腫瘍中の脂肪細胞によって放出される遊離脂肪酸は、前記腫瘍内の前記改変腫瘍溶解性ウイルスの複製に栄養を供給し、かつそれを促進し得るため、腹膜癌は、本開示の改変腫瘍溶解性ウイルスを使用した療法の標的であり得る。本明細書で開示されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、遊離脂肪酸のバイオアベイラビリティーが高い腫瘍において、増大した力価の細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）を形成し得る。

【0092】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている改変ポックスウイルスを感染させた細胞を投与することによって腫瘍を処置する方法が提供される。感染細胞は、対象（例えば腫瘍内）に投与することができ、それによって、前記改変ポックスウイルスは、ｉｎ ｓｉｔｕ（例えば、腫瘍または腫瘍微小環境内）で高いパーセンテージのＥＥＶ粒子（例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％超）を含むウイルス粒子の集団を生じさせる。前記ＥＥＶ粒子は、次いで、前記対象から（例えば、前記対象から単離された生物学的サンプルから）回収され、その後の前記対象への全身送達（例えば、静脈内送達）に使用され得る。いくつかのケースにおいて、これによって、前記対象内における前記改変腫瘍溶解性ウイルスの全身的伝播が増強され、治療成績が改善され得る。
処置の方法、および有効性と薬物動態のアッセイ

【0093】

本開示は、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを投与することによって対象を処置するための方法を提供する。

【0094】

治療有効量の上記改変腫瘍溶解性ポックスウイルス、またはそれを含有する医薬組成物を、癌細胞に投与することを含む、前記癌細胞において毒性効果を生じさせる方法が提供される。本開示は、第１の癌細胞がウイルスに感染するように、前記第１の癌細胞に上記の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを投与することを含む、第２の癌細胞の成長または増殖の少なくとも１つを阻害する方法をさらに提供する。よって、ここで開示されている方法のいくつかの実施形態において、有効量の本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルス、またはそれを含有する医薬組成物を投与した際に、あらゆる癌または腫瘍細胞が感染するのではなく、また、非感染細胞の成長が直接的な感染なしで阻害され得ることが意図されている。

【0095】

いくつかの例において、腫瘍崩壊を誘発する、細胞を死滅させる、成長を阻害する、転移を阻害する、腫瘍サイズを低減させる、および腫瘍細胞の悪性の表現型を他のやり方で反転または低減させるために、癌細胞または腫瘍を、本開示の方法および組成物を使用して、治療有効量の本明細書に記載されている例示的な改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたはそれを含有する医薬組成物と接触させ得る。ある特定の実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス、またはその医薬組成物の有効量は、腫瘍崩壊、癌細胞の崩壊もしくは溶解、または癌細胞の成長またはサイズを阻害もしくは低減させるために十分な量を含み得る。癌細胞の成長の低減は、例えば、細胞死、または前記細胞を含む腫瘍のより低い複製速度もしくは増殖速度の低減、または前記癌細胞を含む対象の生存期間の延長によって明らかにされ得る。

【0096】

いくつかの実施形態において、癌または腫瘍を有する対象を処置する方法であって、有効量の上記の改変ウイルスを前記対象に投与することを含む方法が提供される。このような方法における有効量は、前記癌の成長速度もしくは転移を低減させる、または前記対象の生存期間を延長させる量を含み得る。本開示は、腫瘍の成長を低減させる方法を提供し、そのような方法は、前記腫瘍に、有効量の上記の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを投与することを含み得る。ある特定の実施形態において、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス、またはその医薬組成物の有効量は、腫瘍の成長もしくはサイズの減速、阻害、または低減を誘発するために十分な量を含み得、また、前記腫瘍の根絶を誘発するために十分な量を含み得る。腫瘍の成長の低減は、例えば、成長速度の低減、または前記腫瘍を含む対象の生存期間の延長によって明らかにされ得る。

【0097】

本開示は、また、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの感染性もしくは抗腫瘍活性、または腫瘍特異的ウイルス複製の量を決定するための方法も提供し、そのような方法は、（ｉ）対象に、治療有効量の本開示による改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたは医薬組成物（これは、単独で、もしくはさらなる療法と組み合わされて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をさらに発現する）を投与すること；（ｉｉ）前記ウイルスを投与した直後に前記対象から第１の生体試料を収集し、前記第１の生体試料中のルシフェラーゼレポーターのレベルを決定すること；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）における投与に続いて前記対象から第２の生体試料を収集すること、および（ｉｉｉ）前記第２の生体試料中の前記ルシフェラーゼレポーターのレベルを検出すること、を含み得、ここで、ステップ（ｉｉｉ）において、ステップ（ｉｉ）よりもルシフェラーゼのレベルが高い場合、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、感染性である、抗腫瘍活性を示す、腫瘍特異的ウイルス複製を示す、ものと判定される。前記第２の生体試料は、ステップ（ｉ）における投与の、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１５時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１か月、から約２か月後に収集される。いくつかの実施形態において、上記の方法は、ステップ（ｉ）および（ｉｉｉ）において、治療有効量の本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルス）またはそれを含む医薬組成物を投与した後に対象から収集した血漿サンプル中の、１つまたはそれを超えるアッセイサイトカインレベル（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３）を検出することをさらに含み得る。本開示のいくつかの実施形態において、上述したステップ（ｉｉ）と（ｉｖ）の間のルシフェラーゼ生物発光の増加は、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスにおける改変を含まないがその他の点では同一のウイルスと比較して、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの方がより大きい。前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルス投与後のウイルス負荷を検出およびモニタリングするための他の例示的な技術としては、リアルタイム定量的ＰＣＲがあげられる。

【0098】

さらに、本明細書に記載されている、治療有効量の本開示による改変腫瘍溶解性ポックスウイルス、または前記ポックスウイルスを含有する医薬組成物を投与した後に、薬物動態をモニタリングする方法が提供される。薬物動態をモニタリングするための例示的な方法は、以下のステップ、すなわち、（ｉ）前記対象に、治療有効量の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたはそれを含む医薬組成物を（単独で、もしくはさらなる療法と組み合わせて）投与すること；（ｉｉ）前記対象から、ステップ（ｉ）における投与の約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約７５分、約９０分、約１２０分、約１８０分、および約２４０分、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１５時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１か月、から約２か月後から選択される１つまたはそれを超える時点において生物学的サンプルを収集すること；および（ｉｉｉ）上述した時点において収集した前記生物学的サンプル中の、前記ウイルスゲノム（または、前記ウイルスゲノムの中に挿入されたレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ））の量を検出すること、を含み得る。いくつかの例において、ウイルスゲノムコピー／ｍＬは、１５分の時点で収集されたサンプル中で最大であり得、さらに２４０分の時点で採集されたサンプルは、検出可能な量の前記ウイルスゲノムを含まないことがあり得る。したがって、いくつかの例において、ウイルスピークは、投与の約１５分後に観察されることがあり得、また、約２４０分（言い換えれば４時間）後には前記対象の系から前記ウイルスの大部分が排除されていることがあり得る。いくつかの例において、第１のウイルスピークが、投与の約１５分後に観察されることがあり得、また第２のウイルスピークが、その後の時点（例えば、約３０分、約４５分、約６０分、または約９０分の時点）で採集された前記生物学的サンプルにおいて観察されることがあり得る。前記生物学的サンプルは、例示的な実施形態において、血液であり得、またウイルスゲノム／ｍＬの量は、定量的ＰＣＲまたは他の適切な技術によって決定され得る。いくつかの例において、第１のウイルスピークが、投与の約１５分後に観察されることがあり得、また第２のウイルスピークが、本開示の改変腫瘍溶解性ウイルス（例えば、本明細書に記載されている腫瘍溶解性ポックスウイルス）の投与の約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１５時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１か月、から約２か月後に観察されることがあり得る。

【0099】

いくつかの例において、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの腫瘍選択的複製は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を使用することによって測定され得る。いくつかの実施形態において、前記ルシフェラーゼ遺伝子は、ウイルスのゲノムの中に挿入されていてもよく、また、腫瘍細胞には、前記ウイルスが感染していてもよい。感染腫瘍細胞における生物発光は、腫瘍選択的複製をモニターするために測定され得る。いくつかの例は、前記改変腫瘍溶解性ウイルスにおける改変を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ポックスウイルスと比較して、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスにおいて、ルシフェラーゼレポーターの生物発光が増加していることを示す。
改変腫瘍溶解性ウイルスの送達

【0100】

いくつかの実施形態において、対象に投与される本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの量は、約１０^３～１０^１２感染性ウイルス粒子もしくはプラーク形成単位（ＰＦＵ）、または約１０^５～１０^１０ＰＦＵ、または約１０^５～１０^８ＰＦＵ、または約１０^８～１０^１０ＰＦＵであり得る。いくつかの実施形態において、対象に投与される本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの量は、約１０^３～１０^１２ウイルス粒子もしくはプラーク形成単位（ＰＦＵ）、または約１０^５～１０^１０ＰＦＵ、または約１０^５～１０^８ＰＦＵ、または約１０^８～１０^１０ＰＦＵであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約１０^３ＰＦＵ／用量～約１０^４ＰＦＵ／用量、約１０^４ＰＦＵ／用量～約１０^５ＰＦＵ／用量、約１０^５ＰＦＵ／用量～約１０^６ＰＦＵ／用量、約１０^７ＰＦＵ／用量～約１０^８ＰＦＵ／用量、約１０^９ＰＦＵ／用量～約１０^１０ＰＦＵ／用量、約１０^１０ＰＦＵ／用量～約１０^１１ＰＦＵ／用量、約１０^１１ＰＦＵ／用量～約１０^１２ＰＦＵ／用量、約１０^１２ＰＦＵ／用量～約１０^１３ＰＦＵ／用量、約１０^１３ＰＦＵ／用量～約１０^１４ＰＦＵ／用量、または約１０^１４ＰＦＵ／用量～約１０^１５ＰＦＵ／用量含み得る投与量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約２×１０^３ＰＦＵ／用量、３×１０^３ＰＦＵ／用量、４×１０^３ＰＦＵ／用量、５×１０^３ＰＦＵ／用量、６×１０^３ＰＦＵ／用量、７×１０^３ＰＦＵ／用量、８×１０^３ＰＦＵ／用量、９×１０^３ＰＦＵ／用量、約１０^４ＰＦＵ／用量、約２×１０^４ＰＦＵ／用量、約３×１０^４ＰＦＵ／用量、約４×１０^４ＰＦＵ／用量、約５×１０^４ＰＦＵ／用量、約６×１０^４ＰＦＵ／用量、約７×１０^４ＰＦＵ／用量、約８×１０^４ＰＦＵ／用量、約９×１０^４ＰＦＵ／用量、約１０^５ＰＦＵ／用量、２×１０^５ＰＦＵ／用量、３×１０^５ＰＦＵ／用量、４×１０^５ＰＦＵ／用量、５×１０^５ＰＦＵ／用量、６×１０^５ＰＦＵ／用量、７×１０^５ＰＦＵ／用量、８×１０^５ＰＦＵ／用量、９×１０^５ＰＦＵ／用量、約１０^６ＰＦＵ／用量、約２×１０^６ＰＦＵ／用量、約３×１０^６ＰＦＵ／用量、約４×１０^６ＰＦＵ／用量、約５×１０^６ＰＦＵ／用量、約６×１０^６ＰＦＵ／用量、約７×１０^６ＰＦＵ／用量、約８×１０^６ＰＦＵ／用量、約９×１０^６ＰＦＵ／用量、約１０^７ＰＦＵ／用量、約２×１０^７ＰＦＵ／用量、約３×１０^７ＰＦＵ／用量、約４×１０^７ＰＦＵ／用量、約５×１０^７ＰＦＵ／用量、約６×１０^７ＰＦＵ／用量、約７×１０^７ＰＦＵ／用量、約８×１０^７ＰＦＵ／用量、約９×１０^７ＰＦＵ／用量、約１０^８ＰＦＵ／用量、約２×１０^８ＰＦＵ／用量、約３×１０^８ＰＦＵ／用量、約４×１０^８ＰＦＵ／用量、約５×１０^８ＰＦＵ／用量、約６×１０^８ＰＦＵ／用量、約７×１０^８ＰＦＵ／用量、約８×１０^８ＰＦＵ／用量、約９×１０^８ＰＦＵ／用量、約１０^９ＰＦＵ／用量、約２×１０^９ＰＦＵ／用量、約３×１０^９ＰＦＵ／用量、約４×１０^９ＰＦＵ／用量、約５×１０^９ＰＦＵ／用量、約６×１０^９ＰＦＵ／用量、約７×１０^９ＰＦＵ／用量、約８×１０^９ＰＦＵ／用量、約９×１０^９ＰＦＵ／用量、約１０^１０ＰＦＵ／用量、約２×１０^１０ＰＦＵ／用量、約３×１０^１０ＰＦＵ／用量、約４×１０^１０ＰＦＵ／用量、約５×１０^１０ＰＦＵ／用量、約６×１０^１０ＰＦＵ／用量、約７×１０^１０ＰＦＵ／用量、約８×１０^１０ＰＦＵ／用量、約９×１０^１０ＰＦＵ／用量、約１０^１０ＰＦＵ／用量、約２×１０^１０ＰＦＵ／用量、約３×１０^１０ＰＦＵ／用量、約４×１０^１０ＰＦＵ／用量、約５×１０^１０ＰＦＵ／用量、約６×１０^１０ＰＦＵ／用量、約７×１０^１０ＰＦＵ／用量、約８×１０^１０ＰＦＵ／用量、約９×１０^１０ＰＦＵ／用量、約１０^１１ＰＦＵ／用量、約２×１０^１１ＰＦＵ／用量、約３×１０^１１ＰＦＵ／用量、約４×１０^１１ＰＦＵ／用量、約５×１０^１１ＰＦＵ／用量、約６×１０^１１ＰＦＵ／用量、約７×１０^１１ＰＦＵ／用量、約８×１０^１１ＰＦＵ／用量、約９×１０^１１ＰＦＵ／用量、または約１０^１２ＰＦＵ／用量、約１０^１２ＰＦＵ／用量～約１０^１３ＰＦＵ／用量、約１０^１３ＰＦＵ／用量～約１０^１４ＰＦＵ／用量、または約１０^１４ＰＦＵ／用量～約１０^１５ＰＦＵ／用量を含み得る用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、５×１０^９ＰＦＵ／用量を含み得る用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、最大５×１０^９ＰＦＵ／用量を含み得る用量で投与され得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約１０^３ウイルス粒子／用量～約１０^４ウイルス粒子／用量、約１０^４ウイルス粒子／用量～約１０^５ウイルス粒子／用量、約１０^５ウイルス粒子／用量～約１０^６ウイルス粒子／用量、約１０^７ウイルス粒子／用量～約１０^８ウイルス粒子／用量、約１０^９ウイルス粒子／用量～約１０^１０ウイルス粒子／用量、約１０^１０ウイルス粒子／用量～約１０^１１ウイルス粒子／用量、約１０^１１ウイルス粒子／用量～約１０^１２ウイルス粒子／用量、約１０^１２ウイルス粒子／用量～約１０^１３ウイルス粒子／用量、約１０^１３ウイルス粒子／用量～約１０^１４ウイルス粒子／用量、または約１０^１４ウイルス粒子／用量～約１０^１５ウイルス粒子／用量を含み得る用量で投与され得る。

【0102】

いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約１０^３ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^４ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^５ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^７ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^９ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１２ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１２ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１３ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１３ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１４ＰＦＵ／ｋｇ、または約１０^１４ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１５ＰＦＵ／ｋｇを含み得る投与量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約２×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、３×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、４×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、５×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、６×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、７×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、８×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、９×１０^３ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^４ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、２×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、３×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、４×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、５×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、６×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、７×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、８×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、９×１０^５ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^６ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^７ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^８ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^９ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^１０ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約２×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約３×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約４×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約５×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約６×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約７×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約８×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、約９×１０^１１ＰＦＵ／ｋｇ、または約１０^１２ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１２ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１３ＰＦＵ／ｋｇ、約１０^１３ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１４ＰＦＵ／ｋｇ、または約１０^１４ＰＦＵ／ｋｇ～約１０^１５ＰＦＵ／ｋｇを含み得る用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、５×１０^９ＰＦＵ／ｋｇを含み得る用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、最大５×１０^９ＰＦＵ／ｋｇを含み得る用量で投与され得る。

【0103】

いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約１０^３ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^４ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^４ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^５ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^５ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^６ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^７ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^８ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^９ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^１０ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^１０ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^１１ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^１１ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^１２ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^１２ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^１３ウイルス粒子／ｋｇ、約１０^１３ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^１４ウイルス粒子／ｋｇ、または約１０^１４ウイルス粒子／ｋｇ～約１０^１５ウイルス粒子／ｋｇを含み得る用量で投与され得る。

【0104】

本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの液体剤形は、ある特定の実施形態において、約１０^３ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^４ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^５ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^７ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^９ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１２ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１２ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１３ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１３ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１４ＰＦＵ／ｍＬ、または約１０^１４ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１５ＰＦＵ／ｍＬのウイルス用量を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約２×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、３×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、４×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、５×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、６×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、７×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、８×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、９×１０^３ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^４ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、２×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、３×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、４×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、５×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、６×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、７×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、８×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、９×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^９ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約２×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約３×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約４×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約５×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約６×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約７×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約８×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、約９×１０^１１ＰＦＵ／ｍＬ、または約１０^１２ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１２ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１３ＰＦＵ／ｍＬ、約１０^１３ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１４ＰＦＵ／ｍＬ、または約１０^１４ＰＦＵ／ｍＬ～約１０^１５ＰＦＵ／ｍＬを含み得る用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、５×１０^９ＰＦＵ／ｍＬを含み得る用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、最大５×１０^９ＰＦＵ／ｍＬを含み得る用量で投与され得る。

【0105】

前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが注射によって投与され得るいくつかの例において、投薬量は、約１０^３ウイルス粒子／注射、１０^４ウイルス粒子／注射、１０^５ウイルス粒子／注射、１０^６ウイルス粒子／注射、１０^７ウイルス粒子／注射、１０^８ウイルス粒子／注射、１０^９ウイルス粒子／注射、１０^１０ウイルス粒子／注射、１０^１１ウイルス粒子／注射、１０^１２ウイルス粒子／注射、２×１０^１２ウイルス粒子／注射、１０^１３ウイルス粒子／注射、１０^１４ウイルス粒子／注射、または１０^１５ウイルス粒子／注射を含み得る。前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが注射で投与されるさらなる例において、投薬量は、約１０^３感染性ウイルス粒子／注射、１０^４感染性ウイルス粒子／注射、１０^５感染性ウイルス粒子／注射、１０^６感染性ウイルス粒子／注射、１０^７感染性ウイルス粒子／注射、１０^８感染性ウイルス粒子／注射、１０^９感染性ウイルス粒子／注射、１０^１０感染性ウイルス粒子／注射、１０^１１感染性ウイルス粒子／注射、１０^１２感染性ウイルス粒子／注射、２×１０^１２感染性ウイルス粒子／注射、１０^１３感染性ウイルス粒子／注射、１０^１４感染性ウイルス粒子／注射、または１０^１５感染性ウイルス粒子／注射を含み得る。追加の実施形態において、本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、約１０^３組織培養阻害用量（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｄｏｓｅ）５０％（ＴＣＩＤ_５０）／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、３×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、４×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、３×１０^９ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、４×１０^９ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、５×１０^９ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、３×１０^１０ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、４×１０^１０ＴＣＩＤ_５０／ｋｇ、または４×１０^１０ＴＣＩＤ_５０／ｋｇであり得る用量で投与され得る。本明細書において、１０^×は、これに代えて、１ｅＸと表現されることに留意すべきである。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、１つまたはそれを超える用量で投与され得る。ある特定の実施形態において、前記ウイルスは、腫瘍中の少なくとも約２０％の細胞における、腫瘍中の少なくとも約３０％の細胞における、腫瘍中の少なくとも約４０％の細胞における、腫瘍中の少なくとも約５０％の細胞における、腫瘍中の少なくとも約６０％の細胞における、腫瘍中の少なくとも約７０％の細胞における、腫瘍中の少なくとも約８０％の細胞における、または腫瘍中の少なくとも約９０％の細胞における腫瘍崩壊を誘発するために十分な量で投与され得る。ある特定の実施形態において、ウイルスの一用量は、対象または腫瘍に対して、１、２、５、１０、１５、２０、または２４時間の期間にわたって投与される量を指し得る。ある特定の実施形態において、前記用量は、時間をかけて、または別々の注射によって分けられ得る。ある特定の実施形態において、例えば、第２の処置が、第１の処置から１、２、３、４、５、６、７日、または数週間以内に行われ得る場合、多数の用量（例えば、２、３、４、５、６、またはそれを超える用量）の前記ポックスウイルスを対象に投与し得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ｖは、前記対象に対して、１、２、３、４、５、６、７日、または数週間の期間にわたって投与され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａ ｖｉｒｕｓ）または医薬組成物は、約１週間～約２週間、約２週間～約３週間、約３週間～約４週間、約４週間～約５週間、約６週間～約７週間、約７週間～約８週間、約８週間～約９週間、約９週間～約１０週間、約１０週間～約１１週間、約１１週間～約１２週間、約１２週間～約２４週間、約２４週間～約４８週間、約４８週間もしくは約５２週間、またはそれより長い期間にわたって投与され得る。本明細書に記載されている腫瘍溶解性ポックスウイルスまたは医薬組成物の投与頻度は、ある特定の例において、１日１回、１日２回、週に１回、３週に１回、４週に１回（または月１回）、８週に１回（または２か月に１回）、１２週に１回（または３か月に１回）、または２４週に１回（または６か月に１回）であり得る。本明細書に開示されている方法のいくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ポックスウイルスまたは前記医薬組成物は、独立して、初期用量で第１の期間に、中間用量で第２の期間に、および高用量で第３の期間に投与し得る。いくつかの実施形態において、前記初期用量は、中間用量よりも低くてもよく、また前記中間用量は、前記高用量よりも低くてもよい。いくつかの実施形態において、前記第１、第２、および第３の期間は、独立して、約１週間～約２週間、約２週間～約３週間、約３週間～約４週間、約４週間～約５週間、約６週間～約７週間、約７週間～約８週間、約８週間～約９週間、約９週間～約１０週間、約１０週間～約１１週間、約１１週間～約１２週間、約１２週間～約２４週間、約２４週間～約４８週間、約４８週間もしくは約５２週間、またはそれより長い期間であり得る。

【0106】

いくつかの例において、前記対象は、本明細書に記載されている任意の前記処置方法に従って、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを投与する前に、投与するのと同時に、および投与した後に、減糖質食（例えば、ケトン食）を与えられてもよい。ある特定の実施形態において、前記対象は、１日あたり５００グラム未満の炭水化物、１日あたり４５０グラム未満の炭水化物、１日あたり４５０グラム未満の炭水化物、１日あたり４００グラム未満の炭水化物、１日あたり３５０グラム未満の炭水化物、１日あたり３００グラム未満の炭水化物、１日あたり２５０グラム未満の炭水化物、１日あたり２００グラム未満の炭水化物、１日あたり１５０グラム未満の炭水化物、１日あたり１００グラム未満の炭水化物、１日あたり９０グラム未満の炭水化物、１日あたり８０グラム未満の炭水化物、１日あたり７０グラム未満の炭水化物、１日あたり６０グラム未満の炭水化物、１日あたり５０グラム未満の炭水化物、１日あたり４０グラム未満の炭水化物、１日あたり３０グラム未満の炭水化物、１日あたり２０グラム未満の炭水化物、１日あたり１０グラム未満の炭水化物消費を含み得る食事を与えられてもよい。

【0107】

本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたはそれを含む医薬組成物の癌または腫瘍細胞への送達のための例示的な方法は、腫瘍内注入によるものであり得る。しかしながら、代替的な投与方法、例えば、静脈内、インフュージョンにより、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、経皮、直腸、尿道内、腟内、鼻腔内、髄腔内、または腹腔内投与も使用し得る。投与経路は、前記腫瘍の場所および性質によって変わり得る。ある特定の実施形態において、投与経路は、歯内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局所（例えば、（特に、脈管構造を有する）腫瘍の近傍に、または腫瘍の隣接脈管構造に）、経皮、髄腔内、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄（ｌａｖａｇｅ）による、または経口であり得る。前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの投与可能用量は、ボーラス注入として、または低速インフュージョンとして投与され得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、患者に対して、前記患者にインプラントされた供給源から投与され得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの投与は、選択された期間にわたる持続注入によって行われ得る。いくつかの例において、本明細書に記載されている腫瘍溶解性ポックスウイルス、またはそれを含有する医薬組成物は、治療有効用量で、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、約６０分間、約７５分間、約９０分間、約１００分間、もしくは約１２０分間、またはそれより長い期間にわたるインフュージョンによって投与され得る。本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたは医薬組成物は、液体剤形として投与してもよく、ここで、投与の総体積は、約１ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～１０ｍＬ、約１５ｍＬ～約２０ｍＬ、約２５ｍＬ～約３０ｍＬ、約３０ｍＬ～約５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～１５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～５００ｍＬ、約５００ｍＬ～７５０ｍＬ、または約７５０ｍＬ～１０００ｍＬである。
医薬組成物

【0108】

本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを含有する医薬組成物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中のそれらの任意の組み合わせの溶液、分散液として、固体剤形で、吸入可能な剤形として、鼻腔内剤形として、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組み合わせとして、調製され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、安定化剤および緩衝剤を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、可溶化剤（例えば、滅菌水、トリス緩衝液）を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、賦形剤を含み得る。賦形剤は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載されている賦形剤であり得る。適切な賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、保存剤、安定化剤、結合剤、圧縮成形剤、滑沢剤、キレート剤、分散促進剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、着色剤があげられ得る。

【0109】

いくつかの実施形態において、賦形剤は、緩衝剤であり得る。適切な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素カルシウムがあげられる。緩衝剤として、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、および他のカルシウム塩、またはそれらの組み合わせが、医薬製剤において使用され得る。

【0110】

いくつかの実施形態において、賦形剤は、保存剤を含み得る。適切な保存剤の非限定的な例としては、抗酸化剤（例えば、αトコフェロールおよびアスコルビン酸など）および抗菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールなど）があげられ得る。抗酸化剤は、それらに限定されないが、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、パラアミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノール、およびＮ－アセチルシステインをさらに含み得る。いくつかの例において、保存剤は、バリダマイシンＡ、ＴＬ－３、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、Ｎ－α－ｔｏｓｙｌ－Ｐｈｅ－クロロメチルケトン、Ｎ－α－ｔｏｓｙｌ－Ｌｙｓ－クロロメチルケトン、アプロチニン、フェニルメチルスルホニルフルオライド、ジイソプロピルフルオロリン酸、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、グランザイム阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、脂質シグナリング阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗微生物剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤を含み得る。

【0111】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、賦形剤として、結合剤を含み得る。適切な結合剤の非限定的な例としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｏｘｏａｚｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール、Ｃ_１２－Ｃ_１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカライド、オリゴ糖、およびそれらの組み合わせを含み得る。医薬製剤において使用し得る前記結合剤は、デンプン、例えば、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、コムギデンプンなど；糖、例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリンなど；天然ゴムおよび合成ゴム；ゼラチン；セルロース誘導体、例えば、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロースなど；ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；アルコール、例えば、ソルビトール、キシリトール、マンニトールなど、および水、またはそれらの組み合わせから選択され得る。

【0112】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、賦形剤として、滑沢剤を含み得る。適切な滑沢剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ｓｔｅｒｏｔｅｘ、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ナトリウムラウリル硫酸、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽質ミネラルオイルがあげられ得る。医薬製剤において使用され得る滑沢剤は、ステアリン酸金属塩、（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウムなど）、脂肪酸エステル、（例えば、フマル酸ステアリルナトリウムなど）、脂肪酸、（例えば、ステアリン酸など）、脂肪アルコール、ベヘン酸グリセリル、ミネラルオイル、パラフィン、硬化植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラウリル硫酸金属塩、（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムなど）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびタルク、またはそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤として、分散促進剤を含み得る。適切な分散剤の非限定的な例としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、グリコール酸ナトリウムデンプン、イソアモルファスシリケート（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、および高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤としての微結晶セルロースがあげられ得る。

【0113】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、賦形剤として、崩壊剤を含み得る。いくつかの実施形態において、崩壊剤は、非起泡性崩壊剤であり得る。適切な非起泡性崩壊剤の非限定的な例としては、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化加工デンプンなど）、甘味剤、粘土（例えば、ベントナイトなど）、微結晶セルロース、アルギネート、グリコール酸ナトリウムデンプン、ガム（例えば、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、およびトラガカントなど）があげられ得る。いくつかの実施形態において、崩壊剤は、起泡性崩壊剤であり得る。適切な起泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と炭酸水素ナトリウムの組み合わせ、および炭酸水素ナトリウムと酒石酸の組み合わせがあげられ得る。

【0114】

いくつかの実施形態において、賦形剤は、香味剤を含み得る。外層に混和される香味剤は、合成香味油および香料芳香族；天然油；植物、葉、花、および果実からの抽出物；およびそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態において、香味剤は、ケイヒ油；冬緑油；ハッカ油；クローバー油；ヘイ油；アニス油；ユーカリ；バニラ；柑橘油（例えば、レモン油、オレンジ油、ブドウおよびグレープフルーツ油など）；およびフルーツエッセンス（リンゴ、モモ、セイヨウナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、およびアンズを含む）からなる群から選択され得る。

【0115】

いくつかの実施形態において、賦形剤は、甘味剤を含み得る。適切な甘味剤の非限定的な例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、果糖、およびそれらの混合物（担体として使用しない場合）；サッカリンおよびその種々の塩（例えば、ナトリウム塩）；ジペプチド甘味料（例えば、アスパルテームなど）；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ステビオシド）；スクロースの塩素誘導体（例えば、スクラロースなど）；および糖アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）など）があげられ得る。

【0116】

いくつかの例において、本明細書に記載されている医薬組成物は、着色剤を含み得る。切な着色料の非限定的な例としては、食品、医薬品、および化粧品色素（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品および化粧品色素（Ｄ＆Ｃ）、および外用薬および化粧品色素（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）があげられ得る。着色剤は、色素、またはそれらの対応するレーキとして使用され得る。

【0117】

いくつかの例において、本明細書に記載されている医薬組成物は、キレート剤を含み得る。いくつかのケースにおいて、キレート剤は、殺真菌キレート剤であり得る。例としては、それらに限定されないが、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＤＴＡ）；ＥＤＴＡの二ナトリウム塩、三ナトリウム塩、四ナトリウム塩、二カリウム塩、三カリウム塩、二リチウム塩、および二アンモニウム塩；ＥＤＴＡのバリウムキレート、カルシウムキレート、コバルトキレート、銅キレート、ジスプロシウムキレート、ユーロピウムキレート、鉄キレート、インジウムキレート、ランタンキレート、マグネシウムキレート、マンガンキレート、ニッケルキレート、サマリウムキレート、ストロンチウムキレート、または亜鉛キレート；トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸一水和物；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン；１，３－ジアミノ－２－ヒドロキシプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；１，３－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジプロピオン酸二塩酸塩；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（メチレンホスホン酸）半水和物；Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－三酢酸；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（メチレンホスホン酸）（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｏｎｉｃ ａｃｉｄ））；Ｏ，Ｏ’－ビス（２－アミノエチル）エチレングリコール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ－二酢酸；１，６－ヘキサメチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸；イミノ二酢酸；１，２－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；ニトリロ三酢酸；ニトリロトリプロピオン酸；ニトリロトリス（メチレンリン酸）の三ナトリウム塩；７，１９，３０－トリオキサ－１，４，１０，１３，１６，２２，２７，３３－オクタアザビシクロ［１１，１１，１１］ペンタトリアコンタンヘキサヒドロブロミド；またはトリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸があげられ得る。

【0118】

また、本明細書に開示されている１つまたはそれを超える改変腫瘍溶解性ウイルスと、１つまたはそれを超える他の抗微生物剤および抗真菌剤（例えば、ポリエン（例えば、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢ脂質複合体（ＡＢＣＤ）、リポソームアムホテリシンＢ（Ｌ－ＡＭＢ）、およびリポソームナイスタチンなど）、アゾールおよびトリアゾール（例えば、ボリコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、ポザコナゾール（ｐｏｚａｃｏｎａｚｏｌｅ）など）；グルカンシンターゼ阻害剤（例えば、カスポファンギン、ミカファンギン（ＦＫ４６３）、およびＶ－エキノキャンディン（ＬＹ３０３３６６）など）；グリセオフルビン；アリルアミン（例えば、テルビナフィンなど）；フルシトシン、または本明細書に記載されているものを含む他の抗真菌剤）とを含む、組み合わせ製品も意図されている。さらに、ペプチドは、局所抗真菌剤（例えば、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレネート、局所ナイスタチン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、および他の局所薬剤）と組み合わせ得ることが意図されている。いくつかの例において、医薬組成物は、追加の薬剤を含み得る。いくつかのケースにおいて、追加の薬剤は、医薬組成物中に治療有効量で存在し得る。

【0119】

保存および使用の通常の条件下において、本明細書に記載されている医薬組成物は、微生物の成長を阻害するために保存剤を含んでいてもよい。ある特定の例において、本明細書に記載されている医薬組成物は、保存剤を含んでいない場合がある。注射可能用途に適した医薬形態は、無菌の注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含み得る。前記医薬組成物は、溶媒もしくは分散媒（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および／もしくは植物油、またはそれらの任意の組み合わせを含む）である担体を含み得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチン）を使用することによって、要求される粒径を維持することによって（分散液の場合）、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。微生物の活動は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって阻止され得る。多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを配合することが好ましいであろう。注射可能組成物の長期間にわたる吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを使用することによって実現され得る。

【0120】

水溶液における非経口投与のために、例えば、前記液体剤形は、必要に応じて適切に緩衝され、また、前記液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされ得る。前記液体剤形は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、および腹腔内投与に特に適している。この点について、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示を参照すれば、当業者には分かるであろう。例えば、１回の投薬量は、１ｍＬ～２０ｍＬの等張のＮａＣｌ溶液に溶解され、そして、１００ｍＬ～１０００ｍＬの液体（例えば、炭酸水素ナトリウム緩衝生理食塩水に加えられるか、または注入を予定している部位に注射され得る。

【0121】

ある特定の実施形態において、無菌の注射可能溶液は、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｎｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｘｖｉｒｕｓ）またはそれを含有する医薬組成物を、必要とされる量で、適切な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙されている種々の他の成分と共に配合し、続いて、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基礎となる分散媒と、上記に列挙されているうちの必要とされる他の成分とを含有する、滅菌されたビヒクルの中に配合することによって調製される。本明細書に開示されている組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。医薬的に許容され得る塩としては、酸付加塩（前記タンパク質のフリーなアミノ基によって形成される）があげられ、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸などによって形成される。フリーなカルボキシル基によって形成される塩は、また、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来であり得る。製剤化の後、前記医薬組成物は、その投与製剤に適合する様式で、かつ治療に有効な量で投与され得る。

【0122】

ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、有効量の本明細書に開示されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスと、薬学的に許容される担体と組み合わせて含み得る。「薬学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、活性成分の生物活性の有効性を妨害しない、および／または投与を受ける患者に対して有毒ではない任意の担体を含む。適切な医薬担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、種々のタイプの湿潤剤、および滅菌溶液があげられ得る。医薬的に適合性の担体の追加の非限定的な例としては、ゲル、生体吸着性マトリックス材料、前記改変腫瘍溶解性ウイルスを含有するインプラントエレメント、または任意の他の適切なビヒクル、送達もしくは投薬する手段もしくは材料があげられ得る。このような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、前記対象に有効量で投与することができる。
製造方法

【0123】

本開示の改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、当業者に知られている方法によって製造することができる。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、適切な宿主細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、またはベロ細胞）内で増殖させ、宿主細胞から単離し、また、経時的な感染性の喪失を最小化するように、前記ウイルスの安定性およびインテグリティーを助長する条件で保存され得る。いくつかの例において、高いパーセンテージのＥＥＶ粒子を生成させる前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスを製造するためのプロセスにおける改善された接種材料の役割を果たし得る。ある特定の例示的な方法において、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、細胞スタック、ローラーボトル、または潅流バイオリアクターを使用して、宿主細胞内で増殖させる。いくつかの例において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスを精製するための下流の方法は、濾過（例えば、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過、またはそれらの組み合わせ）、超遠心分離、またはクロマトグラフ的捕捉を含み得る。前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、凍結または乾燥（例えば、凍結乾燥によって）保存され得る。ある特定の実施形態において、投与の前に、保存した改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、再構成され（保存のために乾燥させた場合）、また、投与のための薬学的に許容される担体中に希釈され得る。

【0124】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスは、前記改変腫瘍溶解性ウイルスにおける改変を含まないがその他の点では同一のウイルスと比較して、ＨｅＬａ細胞および２９３細胞において、より高い力価を示す。ある特定の例において、ＨｅＬａ細胞および２９３細胞におけるより高い力価は、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスにおいて見られる。
組み合わせ療法

【0125】

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、本明細書に開示されている改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたはそれを含有する医薬組成物を投与することを含み、１つまたはそれを超えるさらなる療法が、それに続くか、先立つか、または組み合わされる。前記さらなる療法の例としては、それらに限定されないが、化学療法、放射線照射、追加のウイルスによる腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節タンパク質による処置、抗癌剤、またはそれらの任意の組み合わせがあげられ得る。前記さらなる療法は、前記改変ポックスウイルス（例えば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）の投与と同時に、またはそれに引き続いて与えられ得る。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、本明細書に開示されている改変腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含み得、１つまたはそれを超える抗癌剤または癌療法が、それに続くか、先立つか、または組み合わされる。抗癌剤は、それらに限定されないが、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、抗癌抗体、および／または抗サイクリン依存性キナーゼ剤を含み得る。ある特定の実施形態において、前記癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、および／または手術、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、本明細書に開示されている改変ウイルスを投与することを含み得、本開示の改変腫瘍溶解性ウイルスが、それに続くか、先立つか、または組み合わされる。前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、前記改変ワクシニアウイルスなど）と化学療法の組み合わせは、前記改変腫瘍溶解性ウイルスにおける前記改変を含まない改変腫瘍溶解性ウイルスにおいては見られない相乗効果を実現する。上記組み合わせの前記相乗効果は、化学療法（例えば、タキソール（登録商標）など）の用量を低下させるために有利に使用され得る。よって、ここで開示されている（前記改変ウイルスによる）処置方法は、化学療法に伴う毒性（例えば、化学療法に反応するが、治療用量において副作用に苦しむ患者）を低減させ得る。前記相乗効果は、ある特定のケースにおいて、化学療法単独または腫瘍溶解性ワクシニアウイルス単独と比較して、腫瘍増殖の低下をもたらし得る。腫瘍増殖の低下は、例えば、約２％～約５０％（例えば、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３５％、約４５％、または約５０％など）であり得る。

【0126】

ある特定の実施形態において、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスなど）を使用した処置は、単独で、または１つまたは免疫調節剤と組み合わせて使用され得る。免疫調節剤は、腫瘍または癌に関連する抗ウイルス免疫性を抑制することが可能な任意の化合物、分子、または物質を含み得る。ある特定の実施形態において、前記免疫調節剤は、前記改変ウイルスに対する自然免疫または適応免疫を抑制することが可能であり得る。免疫調節剤の非限定的な例としては、抗ＣＤ３３抗体またはその可変領域（本明細書において、その抗原結合フラグメントとも呼ばれる）、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその可変領域（本明細書において、その抗原結合フラグメントとも呼ばれる）、ＣＯＸ２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＦＮ３、およびＩＦＮγなど）、およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－８など）があげられる。ある特定の実施形態において、前記免疫調節剤は、免疫チェックポイントモジュレーター、例えば、それらに限定されないが、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、および抗ＰＤ－Ｌ１、ならびにＴＬＲアゴニスト（例えば、ポリＩ：Ｃ）などを含み得る。いくつかの例において、前記免疫調節剤は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１のアンタゴニスト（例えば、ＰＤ－１に結合するアンタゴニスト抗体）、ＰＤ－Ｌ１のアンタゴニスト（例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合するアンタゴニスト抗体）、ＣＴＬＡ－４のアンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ－４に結合するアンタゴニスト抗体）、Ａ２ＡＲのアンタゴニスト（例えば、Ａ２ＡＲに結合するアンタゴニスト抗体）、Ｂ７－Ｈ３のアンタゴニスト（例えば、Ｂ７－Ｈ３に結合するアンタゴニスト抗体）、Ｂ７－Ｈ４のアンタゴニスト（例えば、Ｂ７－Ｈ４に結合するアンタゴニスト抗体）、ＢＴＬＡのアンタゴニスト（例えば、ＢＴＬＡに結合するアンタゴニスト抗体）、ＩＤＯのアンタゴニスト（例えば、ＩＤＯに結合するアンタゴニスト抗体）、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えば、ＫＩＲに結合するアンタゴニスト抗体）、ＬＡＧ３のアンタゴニスト（例えば、ＬＡＧ３に結合するアンタゴニスト抗体）、ＴＩＭ－３のアンタゴニスト（例えば、ＴＩＭ３に結合するアンタゴニスト抗体）などを含み得る。いくつかの実施形態において、前記さらなる療法は、免疫チェックポイントレギュレーターを投与することを含み得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＴＧＮ１４１２であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＮＫＴＲ－２１４であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＥＤＩ０５６２であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＥＤＩ６４６９であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＥＤＩ６３８３であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＪＴＸ－２０１１であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、キイトルーダ（ペンブロリズマブ）であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、オプジーボ（ニボルマブ）であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ヤーボイ（イピリムマブ）であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、トレメリムマブであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、テセントリク（アテゾリズマブ）であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＧＡ２７１であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ｉｎｄｏｘｉｍｏｄであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、エパカドスタットであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ｌｉｒｉｌｕｍａｂであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＢＭＳ－９８６０１６であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＰＤＬ３２８０Ａであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、アベルマブであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、デュルバルマブであり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＥＤＩ４７３６であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＥＤＩ４７３７であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＴＲＸ５１８であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＭＫ－４１６６であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）であり得る。一例において、前記免疫チェックポイントレギュレーターは、ＰＦ－０５０８２５６６（ＰＦ－２５６６）であり得る

【0127】

ある特定の例において、前記さらなる療法が放射線照射である場合、例示的な線量は、５，０００ラド（５０Ｇｙ）～１００，０００ラド（１０００Ｇｙ）、または５０，０００ラド（５００Ｇｙ）、または上記範囲内の他の適切な線量である。あるいは、前記照射量は、約３０～６０Ｇｙ、約４０～約５０Ｇｙ、約４０～４８Ｇｙ、または約４４Ｇｙ、または上記範囲内の他の適切な線量であり得、前記線量は、例えば、上記の線量測定方法によって決定される。本明細書で使用される場合、「Ｇｙ」は、１００ラドに等しい、放射線照射の特定の吸収線量についての単位を指し得る。Ｇｙは、「Ｇｒａｙ」の省略形である。

【0128】

ある特定の例において、前記さらなる療法が化学療法である場合、例示的な化学療法剤としては、それらに限定されないが、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード誘導体、エチレンイミン、アルキルスルホネート、ヒドラジンおよびトリアジン、ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、ならびに金属塩）、植物アルカロイド（例えば、ビンカアルカロイド、タキサン、ポドフィロトキシン、およびカンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）アナログ）、抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン、クロモマイシンなど）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジンアンタゴニスト、プリンアンタゴニスト、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤）、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、および種々の抗新生物薬（例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、副腎皮質ステロイド阻害剤、酵素、微小管阻害剤、およびレチノイド）があげられ得る。例示的な化学療法剤としては、限定されないが、アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、ビカルタミド（カソデックス（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（ミレラン（登録商標））、ブスルファン注射剤（ブスルフェクス（登録商標））、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（ロイスタチン（登録商標））、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（デポサイト（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（ベプシド（登録商標））、リン酸フルダラビン（フルダラ（登録商標））、５－フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｃｉｔｉｄｉｎｅ））、ヒドロキシウレア（ハイドレア（登録商標））、イダルビシン（イダマイシン（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（アルケラン（登録商標））、６－メルカプトプリン（プリネトール（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ｐｈｏｅｎｉｘ（イットリウム９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラント（ギリアデル（登録商標））によるポリフェプロサン２０、クエン酸タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、およびビノレルビン（ナベルビン（登録商標））、イブルチニブ、イデラリシブ、ならびにブレンツキシマブベドチンがあげられ得る。

【0129】

例示的なアルキル化剤としては、限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、およびトリアゼン）、すなわち、ウラシルマスタード（アミノウラシルマスタード（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、ウラシルナイトロジェンマスタード（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、エンドキサン（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（アルケラン（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホルアミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、ミレラン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（ザノサー（登録商標））、ならびにダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））があげられ得る。追加の例示的なアルキル化剤としては、限定されないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびテモダール（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメゲン（登録商標）としても知られる）；メルファラン（Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－メルファラン、およびフェニルアラニンマスタード、アルケラン（登録商標）としても知られる）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても知られる）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（トレアンダ（登録商標））；ブスルファン（ブスルフェクス（登録商標）およびミレラン（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても知られる）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）、およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱとしても知られる）；クロラムブシル（リューケラン（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ、およびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）としても知られる）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても知られる）；イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン、および塩酸メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）としても知られる）；ストレプトゾシン（ザノサー（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ、およびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても知られる）；シクロホスファミド（エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；および塩酸ベンダムスチン（トレアンダ（登録商標））があげられる。

【0130】

例示的なアントラサイクリンとしては、限定されないが、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（Ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン（ｄａｕｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノマイシン、および塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ノバントロン（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（イダマイシン（登録商標）、イダマイシンＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン（ｒａｖｉｄｏｍｙｃｉｎ）；およびデスアセチルラビドマイシンがあげられ得る。

【0131】

例示的なビンカアルカロイドとしては、それらに限定されないが、酒石酸ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、およびビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン、およびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ－ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標）としても知られる）；およびビノレルビン（ナベルビン（登録商標））があげられ得る。

【0132】

例示的なプロテアソーム阻害剤としては、それらに限定されないが、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ－１７１－００７、（Ｓ）－４－メチル－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－４－メチル－１－（（Ｒ）－２－メチルオキシラン－２－イル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）－２－（（Ｓ）－２－（２－モルホリノアセタミド）－４－フェニルブタンアミド）－ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）；クエン酸イキサゾミブ（ＭＬＮ－９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）；およびＯ－メチル－Ｎ－［（２－メチル－５－チアゾリル）カルボニル］－Ｌ－セリル－Ｏ－メチル－Ｎ－［（１Ｓ）－２－［（２Ｒ）－２－メチル－２－オキシランｙｌ］－２－オキソ－１－（フェニルメチル）エチル］－Ｌ－セリンアミド（ＯＮＸ－０９１２）があげられ得る。

【0133】

「と組み合わせて」は、本明細書で使用される場合、前記改変ポックスウイルス（例えば、本明細書に記載されている腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）またはそれを含む医薬組成物と、前記さらなる療法（例えば、１つまたはそれを超える薬剤を含むさらなる療法）が、処理レジメンまたは計画の一部として、対象に与えられることを意味する。ある特定の実施形態において、組み合わせて使用されることは、前記改変腫瘍溶解性ウイルスと前記１つまたはそれを超える薬剤が、投与前に物理的に組み合わされていること、またはそれらが同じ時間帯に投与されることを必要としない。例えば、限定するものではないが、前記改変腫瘍溶解性ウイルスと前記１つまたはそれを超える薬剤は、処置を受けている前記対象に、一緒に投与してもよく、または同時に、もしくは任意の順序で連続的に、もしくは異なる時点に投与してもよい。

【0134】

前記さらなる療法は、種々の実施形態において、液体剤形、固体剤形、座剤、吸入可能な剤形、鼻腔内剤形で、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組み合わせで投与され得る。ある特定の実施形態において、前記さらなる療法は、約１週間～約２週間、約２週間～約３週間、約３週間～約４週間、約４週間～約５週間、約６週間～約７週間、約７週間～約８週間、約８週間～約９週間、約９週間～約１０週間、約１０週間～約１１週間、約１１週間～約１２週間、約１２週間～約２４週間、約２４週間～約４８週間、約４８週間もしくは約５２週間、またはそれより長い期間にわたって投与され得る。前記さらなる療法の投与頻度は、ある特定の例において、１日１回、１日２回、週に１回、３週に１回、４週に１回（または月１回）、８週に１回（または２か月に１回）、１２週に１回（または３か月に１回）、または２４週に１回（または６か月に１回）であり得る。ある特定の実施形態において、癌を有する対象を処置する方法は、前記対象に、有効量の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、本開示の改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）を投与することを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、前記対象に、有効量の１つまたはそれを超える薬剤を投与することをさらに含み得る。例えば、限定するものではないが、前記薬剤は、上記のように、抗癌剤、免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
キット

【0135】

実施形態において、本開示は、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）を投与するためのキットを提供する。ある特定の実施形態において、本開示のキットは、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む医薬組成物など）を含み得る。ある特定の実施形態において、本開示のキットは、１つまたはそれを超えるコンポーネント、例えば、使用のための指示、デバイスおよび追加の試薬、ならびに、例えば、上記で開示されている方法を実施するためのチューブ、容器、およびシリンジなどのコンポーネントをさらに含み得る。ある特定の実施形態において、本開示のキットは、改変ウイルスと組み合わせて投与され得る、１つまたはそれを超える薬剤（例えば、抗癌剤免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つ）をさらに含み得る。

【0136】

ある特定の実施形態において、本開示のキットは、本明細書に開示されている改変ウイルスを含有する、１つまたはそれを超える容器を含み得る。例えば、限定するものではないが、本開示のキットは、本開示の改変腫瘍溶解性ウイルスを含有する１つまたはそれを超える容器を含み得る。

【0137】

ある特定の実施形態において、本開示のキットは、使用のための指示、前記改変腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与するためのデバイス、または追加の薬剤もしくは化合物を対象に投与するためのデバイスを含み得る。例えば、限定するものではないが、前記指示は、前記改変腫瘍溶解性ウイルス、ならびに、必要に応じて、前記キットに含まれる他のコンポーネント、および投与のための方法（前記対象の適切な状態、適切な投薬量、および前記改変ウイルスを投与するための適切な投与方法を決定するための方法を含む）の説明を含み得る。指示は、また、処置の継続期間にわたって、前記対象をモニタリングするためのガイダンスも含み得る。

【0138】

ある特定の実施形態において、本開示のキットは、前記改変腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与するためのデバイスを含み得る。医療用薬物および医薬組成物を投与するための、当該技術分野において知られている種々のデバイスの任意のものが、本明細書に記載されているキットに含められ得る。限定するものではないが、このようなデバイスとしては、例えば、皮下針、静脈内注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー（例えば、点眼器など）があげられる。ある特定の実施形態において、（例えば、静脈内注入、腫瘍内注入、腹腔内注射によって）全身送達される改変腫瘍溶解性ウイルスは、皮下針およびシリンジと共に、キットに含められ得る。

【実施例】

【0139】

以下の実施例は記載されている実施形態をさらに例証するが、本開示の範囲を限定するものではない。

【0140】

実施例１：ＷＯ３４を含む改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの調製および特徴付け

【0141】

本研究によって、ウイルスからのＥＥＶ粒子の放出を増加させるワクシニアウイルスにおける新たな変異（ＷＲ株）が同定および特徴付けされた。前記ＥＥＶ粒子は、前記ウイルスの腫瘍溶解能を（例えば、血流を通した送達および伝播によって）増大させることができ、また、ワクシニアの他の（例えば、ワクチンとしての）治療用途のための利点をもたらし得る。

【0142】

ＷＲ Ａ３４Ｒ遺伝子のランダム変異誘発を行い、それによって生成されたワクシニアウイルス株（前記Ａ３４Ｒ遺伝子に種々の変異を含む）を、高レベルのＥＥＶの生成／放出を増強する変異を含む株を同定するために、ＥＥＶ粒子生成についてスクリーニングした。Ａ３４Ｒにおける追加の点変異（Ｋ１１９Ｅ）と共にＫ１５１Ｅ変異を含む株が同定された。Ａ３４Ｒにおいて二重の変異（Ｋ１１９ＥおよびＫ１５１Ｅ）（前記ＷＯ３４）を含む株のケースにおいて、ＥＥＶ粒子生成レベルの著しい増加が観察された。実施された追加の研究によって、前記ＷＯ３４（Ａ３４Ｒ二重変異Ｋ１１９ＥおよびＫ１５１Ｅ）を含む腫瘍溶解性株は、マウスモデルにおける癌治療において、増強された治療効果を呈することが示された。
ＷＯ３４を同定するためのスクリーニング方法

【0143】

ウイルス遺伝子ＶＡＣＷＲ１５７（本明細書において、Ａ３４Ｒタンパク質をコードするＡ３４Ｒ遺伝子とも呼ばれる）のランダム変異は、ＰＣＲを使用して行った。前記Ａ３４Ｒオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ヌクレオチドアナログ８－ｏｘｏ－ｄＧＴＰとｄＰＴＰの存在下で、Ｔａｑポリメラーゼを使用して増幅させた。ＶＡＣＷＲ１５７の５’領域および３’領域もまた、直接、ＰＣＲによって増幅させた。後者は、同様にＰＣＲによって、ＧＦＰレポーター（５’末端にＧＦＰ）とアセンブルさせた。最後に、前記の５’を変異させたＶＡＣＷＲ１５７と、ＧＦＰ－３’フラグメントを、フラグメント間の短い相補性領域（これは、ＰＣＲプライマーによって付加した）を利用して、全てＰＣＲによってアセンブルした。単純化したアセンブリースキームを、図１に示す（オーバーハングしたプロモーターおよびプライマーは記載せず）。

【0144】

ワクシニアウイルスＤＮＡの５’領域および３’領域が隣接した、変異させたＶＡＣＷＲ１５７とＧＦＰを含む完全にアセンブルしたフラグメントを精製し、１４３Ｂヒト骨肉腫細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクトした細胞に、次いで、ワクシニアウイルスを感染させ、組換えによって誘発して、変異させたＶＡＣＷＲ１５７ウイルスライブラリーを生成させた。ＥＥＶ生成が増強された変異体を優先的に選択するために、前記ウイルスプールが感染したフラスコからの培地を、未感染のフラスコに加えた。クローンプラークを、連続的感染を数回行った後に単離し、ＥＥＶ生成が増強されたＡ３４Ｒ中の変異を、サンガーシークエンシングによって特徴付けした。

【0145】

単離された全てのクローンにおいて、共通して、２つのミスセンス変異、すなわちＫ１１９ＥおよびＫ１５１Ｅと、Ｆ１２９における１つのサイレント変異（配列番号２）が観察された。この変異タンパク質は、ＷＯ３４（配列番号２）と呼ばれ、１つの対応するクローンにＵＩＤ ＷＯ００６４Ｒ．００２が割り当てられている。このクローンの初期コホートにおけるＧＦＰレポーターは、ｌｏｘＰサイトが隣接しておらず、除去することができない。コドンスクランブルした、ＷＯ３４をコードするＯＲＦを合成し、ｌｏｘＰ隣接ＧＦＰを含むトランスファーベクター（ｐＷＲ１５７－ＫＥ．Ｒ）をクローニングするために使用した。ＷＯ３４をコードする新たな組換えウイルスを、蛍光プラークから選択し、次いで、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現細胞に感染させるために使用した。レポーターを欠くクローンを、Ｃｒｅ処理の後に選択した。
表１：Ａ３４Ｒ遺伝子およびタンパク質配列

【表1-1】

【表1-2】

ＷＯ３４を含むＥＥＶ増強ワクシニアウイルスによって形成されるウイルスプラークコメットテイル

【0146】

あらかじめ力価を求めたＥＥＶ増強ワクシニアウイルスを希釈し、６ウェルプレート中のコンフルエントなＢＳ－Ｃ－４０細胞上にのせた。プレートをインキュベートし、４８時間静置しておき、次いで、細胞をクリスタルバイオレットで染色して異常なＥＥＶ生成によるコメットテイル形成の違いを調べた。結果を図２に示す。図２に示されているように、ＷＯ３４を含むワクシニアウイルス株は、ＷＩ株（ＷＲ株におけるＡ３４Ｒ単一の変異）およびＷＲ株（非変異型Ａ３４Ｒ）と比較して、増強されたコメットテイル形成を示した。ＷＯ３４を含むワクシニアウイルス株のコメットテイル形成は、目に見えて増加していた。
ＷＯ３４を含むＥＥＶ増強ワクシニアウイルスの中和

【0147】

異なる株のワクシニアウイルス（ＷＯ３４含有ワクシニアウイルス、ＷＩ株、ＩＨＤ－Ｊ株、およびＷＲ株）を使用した２つの別々の実験において、ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートでコンフルエントになるまで増殖させ、１ＭＯＩ（感染多重度）のワクシニアウイルス株で感染させた。２４時間後、１ｍＬの培養培地を抜き取り、８００ｇで遠心した。次いで、約５００μｌの上清を取り出し、ウイルスプラークアッセイに使用した。段階希釈の間、サンプルを抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体または抗ＶＩＧ抗体で処理し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、希釈物を、プラークアッセイのために、コンフルエントなＢＳ－Ｃ－４０細胞の６ウェルプレートに加えた。１．５時間後、培地を、３％ＣＭＣのＣＭ１０で交換した。４８時間後、図３Ａ～３Ｂに示すように、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、ウイルスプラークをカウントして、前記ＨｅＬａ細胞上清中のウイルスの力価および中和抗体のブロッキング能力を決定した（図３Ａは、ウイルスプラーク力価と、それに続く前記抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体による処理を示し、図３Ｂは、同様に、ウイルスプラーク力価と、それに続く前記抗Ｌ１Ｒ抗体および前記ＶＩＧ抗体による処理を示す）。
ＷＯ３４を含むＥＥＶ増強ワクシニアウイルスによる感染後の細胞生存率

【0148】

９６ウェルプレートにおいて、ＨＣＴ１１６またはＭＣ３８細胞株を播種し、９０％コンフルエントになるまで増殖させた。次いで、細胞に１ＭＯＩの異なるワクシニアウイルス株（ＷＲ株、ＩＨＤ－Ｊ株、ＷＩ株、ＷＯ３４含有株）を感染させた。毎日、２４時間ごとに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞生存率を調べた。全てのウェルからブランク値の平均を差し引き、未感染対照群の平均値を算出し、次いで各感染ウェルの相対値を（Ａ４９０／未感染細胞の平均）として算出することによって、相対的生存率を算出した。結果を図４に示す（上のパネル：ＭＣ３８細胞；下のパネル：ＨＣＴ１１６細胞）。
癌細胞におけるＷＯ３４を含むＥＥＶ増強ワクシニアウイルスのウイルス複製アッセイ

【0149】

別の実験において、ＨＣＴ１１６細胞またはＭＣ３８細胞を１２ウェルプレート上で９０％コンフルエントになるまで増殖させ、３日反復アッセイにおいて、１日ごとに１プレートを使用した。全てのプレートは、同じ日に、１ＭＯＩの異なるワクシニアウイルス株（ＷＲ株、ＩＨＤ－Ｊ株、ＷＩ株、ＷＯ３４含有株）で感染させた。感染後２４時間ごとに、１プレートを－８０℃のフリーザー内で凍結させた。プレートは、細胞を破壊するために、凍結解凍を２回行い、その溶解物ＢＳ－Ｃ－４０細胞上のウイルスプラークアッセイに使用した。プラーク形成単位／ｍｌを図５に示す（上のパネル：ＨＣＴ１１６細胞；下のパネル：ＭＣ３８細胞）。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスであって、前記少なくとも２つの変異が、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２）
前記位置Ｌｙｓ１１９に対応する位置にある前記変異が、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕである、項目１の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３）
前記位置Ｌｙｓ１５１に対応する位置にある前記変異が、Ｌｙｓ１５１Ｇｌｕである、項目１または２の改変腫瘍溶解性ウイルス。
（項目４）
前記野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある前記少なくとも２つの変異が、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである、項目１の改変腫瘍溶解性ウイルス。
（項目５）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のｐＨ５において正に荷電するアミノ酸残基にある、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目６）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置１１０位置にない少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目７）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のアスパラギン酸残基の位置にない少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目８）
独立して、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のアラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン残基にある、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目９）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１以外の位置のリジン残基における天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１０）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９における天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１１）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中のｐＨ５において正に荷電するアミノ酸残基にある、少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスであって、前記少なくとも２つの天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、ウイルスプラーク形成アッセイにおいて、増大した数のコメットテイル型プラークを生成させる、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１２）
少なくとも２つの天然に存在しない変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む、改変腫瘍溶解性ポックスウイルスであって、前記天然に存在しない変異のいずれかが前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の中の位置１１０にある場合、コードされているアミノ酸が、アスパラギン残基ではない、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１３）
腫瘍溶解性ポックスウイルスの野生型株と比較して、中和抗体に対して増大した耐性を示す改変腫瘍溶解性ポックスウイルスであって、前記増大した耐性が、抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体または抗ＶＩＧ抗体による処理に続くウイルスプラークアッセイにおける、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスまたは前記野生型株によって生成されるプラークの数によって測定され、少なくとも約５５，０００プラーク形成単位／ｍＬを生成させる、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１４）
中和抗体による処理に続くウイルスプラークアッセイにおいて、少なくとも約５５，０００プラーク形成単位／ｍＬを生成させる、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１５）
前記中和抗体が、抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体または抗ＶＩＧ抗体である、項目１０の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１６）
前記Ａ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントが、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１における変異をさらに含む、項目９または１０の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１７）
ｐＨ５において正に荷電する前記アミノ酸残基が、リジン残基である、項目１の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１８）
前記核酸が、前記ウイルス遺伝子ＶＡＣＷＲ１５７の中の前記コード配列に対して、少なくとも約８０％相同であるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、項目５～１２および１６～１７のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目１９）
前記核酸が、配列番号３として規定されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％相同であるヌクレオチド配列を含む、項目５～１２および１６～１７のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２０）
前記２つの天然に存在しない変異の少なくとも１つが、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９にある、項目５～８、１１～１２、および１７～１９のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２１）
前記天然に存在しない変異が、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９にある、項目９および１８～１９のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２２）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９における前記変異が、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕである、項目１０または２１の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２３）
前記２つの天然に存在しない変異の少なくとも１つが、前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１にある、項目５～８、１１～１２、１７～１９、および２０～２２のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２４）
前記野生型Ａ３４Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１５１における前記変異が、Ｌｙｓ１５１Ｇｌｕである、項目２３の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２５）
変異Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕを含むＡ３４Ｒタンパク質を発現する、改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２６）
配列番号３の位置３０５－３０７が、ヌクレオチドＧＡＡまたはＧＡＧを含む、項目１９～２３のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２７）
配列番号３の位置４５１－４５３が、ヌクレオチドＧＡＡまたはＧＡＧを含む、項目１９～２３および２６のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２８）
前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが、前記少なくとも２つの天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、細胞内成熟ウイルス形態よりも多量の細胞外エンベロープウイルス形態を生成させる、項目５～８、１１～１２、および１７～２７のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目２９）
前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが、前記天然に存在しない変異を含まないがその他の点では同一の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、細胞内成熟ウイルス形態よりも多量の細胞外エンベロープウイルス形態を生成させる、項目９～１０、１６、および２１～２２のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ウイルス。
（項目３０）
治療的タンパク質または診断的タンパク質の少なくとも１つをコードする外来性核酸をさらに含む、項目１～２９のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３１）
前記外来性核酸が、ケモカイン受容体、膜結合タンパク質、ヒアルロナンを分解する能力がある微生物タンパク質、微生物タンパク質、ＳＯＣＳ３、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＣＬ５、Ｎ１Ｌ、免疫チェックポイントモジュレーター、代謝調節タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つをコードし得る、項目３０の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３２）
ケモカイン受容体をコードする前記外来性核酸を含み、前記ケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２の少なくとも１つを含む、項目３１の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３３）
前記膜結合タンパク質をコードする前記外来性核酸を含む、項目３１または３２の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３４）
前記膜結合タンパク質が、膜結合型ヒアルロニダーゼを含む、項目３３の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３５）
前記膜結合型ヒアルロニダーゼが、ＰＨ－２０を含む、項目３４の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３６）
前記ＰＨ－２０が、ＧＰＩアンカー型である、項目３５の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３７）
ヒアルロナンを分解する能力がある前記微生物タンパク質をコードする前記外来性核酸を含み、前記微生物タンパク質が、分泌型ヒアルロニダーゼを含む、項目３１～３６のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ウイルス。
（項目３８）
前記分泌型ヒアルロニダーゼが、ＨｙｓＡ、ｌｉｎ、ｓｋｏ、およびｒｖ、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む、項目３７の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目３９）
前記微生物タンパク質をコードする前記外来性核酸を含む、項目３１～３８のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４０）
前記微生物タンパク質が、ＨｙｓＡを含む、項目４３の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４１）
前記ウイルスの前記ゲノムにおける改変をさらに含み、前記改変が、Ｂ５Ｒ遺伝子の変異または欠失を含む、項目１～４０のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４２）
前記ウイルスの前記ゲノムにおける前記改変を含み、前記改変が、前記Ｂ５Ｒ遺伝子のＳＣＲ領域における変異または欠失を含み、前記ＳＣＲ領域が、ＳＣＲ１、ＳＣＲ３、ＳＣＲ４、またはそれらの任意の組み合わせを含み、前記ＳＣＲ領域が、ＳＣＲ２を含まない、項目４１の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４３）
チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｋ７Ｒ、Ｃ６Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｆ８Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｆ１０Ｌ、Ｆ１７Ｒ、Ｅ１Ｌ、Ｅ４Ｌ、Ｅ６Ｒ、Ｅ８Ｒ、Ｅ１０Ｒ、Ｅ１１Ｌ、Ｏ２Ｌ、Ｉ１Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ、Ｉ７Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ｇ１Ｌ、Ｇ３Ｌ、Ｇ４Ｌ、Ｇ５．５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｇ９Ｒ、Ｌ１Ｒ、Ｌ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｌ５Ｒ、Ｊ１Ｒ、Ｊ４Ｒ、Ｊ６Ｒ、Ｈ１Ｌ、Ｈ２Ｒ、Ｈ３Ｌ、Ｈ４Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｈ６Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ２Ｌ、Ｄ３Ｒ、Ｄ６Ｒ、Ｄ７Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ａ２．５Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ａ５Ｒ、Ａ６Ｌ、Ａ７Ｌ、Ａ９Ｌ、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｌ、Ａ１５Ｌ、Ａ１６Ｌ、Ａ１７Ｌ、Ａ１８Ｒ、Ａ２１Ｌ、Ａ２４Ｒ、Ａ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ２８Ｌ、Ａ２９Ｌ、Ａ３０Ｌ、Ａ３１Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ４２Ｒ、Ａ４５Ｒ、Ａ４６Ｒ、Ａ５２Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルス遺伝子の変異または欠失をさらに含む、項目１～４２のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４４）
ウイルス遺伝子Ａ５２Ｒの変異または欠失を含む、項目４３の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４５）
（ｉ）ケモカイン受容体をコードする前記外来性核酸であって、前記ケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２の少なくとも１つを含む、外来性核酸；（ｉｉ）ＰＩＡＳ３をコードする前記外来性核酸；（ｉｉｉ）前記チミジンキナーゼ遺伝子の変異または欠失；（ｉｖ）前記Ａ５２Ｒ遺伝子の変異または欠失、を含む、項目３１～４４のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４６）
前記ウイルスが、全身送達に適している、項目１～４５のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４７）
前記ウイルスが、免疫回避の能力がある、項目１～４６のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４８）
前記全身送達が、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目４６または４７の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目４９）
前記非経口投与が、静脈内注入を含む、項目４８の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目５０）
前記ウイルスが、腫瘍内送達に適している、項目１～４９のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目５１）
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスである、項目１～５０のいずれか一項の改変腫瘍溶解性ポックスウイルス。
（項目５２）
（ｉ）腫瘍溶解性ポックスウイルスＤＮＡバックボーンベクターを得ることであって、前記腫瘍溶解性ポックスウイルスＤＮＡバックボーンベクターは、先行する項目のいずれか一項に記載の１つまたはそれを超える改変を含むこと；（ｉｉ）前記腫瘍溶解性ウイルスＤＮＡベクターをさらに改変して操作されたＤＮＡベクターを生成させること；（ｉｉｉ）哺乳動物細胞を前記操作されたＤＮＡベクターでトランスフェクトすること；（ｉｖ）前記哺乳動物細胞を、ウイルス複製に適した条件下で培養すること；および（ｖ）前記ウイルス粒子を回収すること、を含む、腫瘍溶解性ポックスウイルスを操作するためのプロセス。
（項目５３）
前記哺乳動物細胞が、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはベロ細胞を含む、項目５２のプロセス。
（項目５４）
項目１～５３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ポックスウイルス、容器；および病的血管新生に関連する障害を処置するために、前記腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与するための指示、を含むキット。
（項目５５）
腫瘍を処置する方法であって、治療有効量の、項目１～５４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ポックスウイルスを対象に投与することを含む、方法。
（項目５６）
腫瘍を処置する方法であって、前記野生型Ａ３４タンパク質（配列番号４）の位置１１９および１５１における変異を含むＡ３４Ｒタンパク質を発現する改変腫瘍溶解性ポックスウイルスを感染させた患者由来の白血球細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが、腫瘍微小環境においてウイルス粒子の集団を生成させる、方法。
（項目５７）
前記患者由来の白血球細胞が、マクロファージを含む、項目５６の方法。
（項目５８）
前記患者由来の白血球細胞が、腫瘍標的化Ｔ細胞を含む、項目５６の方法。
（項目５９）
前記ウイルス粒子の集団の少なくとも約１０％～少なくとも約９０％が、ウイルスプラークアッセイで測定したとき、ＥＥＶ粒子である、項目５６の方法。
（項目６０）
前記腫瘍微小環境から前記ＥＥＶ粒子を回収し、前記ＥＥＶ粒子を前記対象に静脈内投与することをさらに含む、項目５６～５９のいずれか一項の方法。
（項目６１）
前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが、改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、項目５６～６０のいずれか一項の方法。
（項目６２）
宿主細胞の培養物に、少なくとも約１０％～少なくとも約９０％のＥＥＶ粒子を含む改変腫瘍溶解性ポックスウイルスの集団を感染させることを含むプロセスであって、前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが、前記野生型Ａ３４タンパク質（配列番号４）の位置１１９および１５１における変異を含むＡ３４Ｒタンパク質を発現する、プロセス。
（項目６３）
前記改変腫瘍溶解性ポックスウイルスが、改変腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、項目６２のプロセス。
（項目６４）
癌を処置する方法であって、少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む改変腫瘍溶解性ウイルスを患者に投与することを含み、前記少なくとも２つの変異が、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある、方法。
（項目６５）
野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある前記少なくとも２つの変異が、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである、項目６４の方法。
（項目６６）
腫瘍を処置する方法であって、少なくとも２つの変異を含むＡ３４Ｒタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を含む改変腫瘍溶解性ウイルスを患者に投与することを含み、前記少なくとも２つの変異が、野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある、方法。
（項目６７）
野生型ワクシニアウイルスＡ４３Ｒタンパク質（配列番号４）の位置Ｌｙｓ１１９およびＬｙｓ１５１に対応する位置にある前記少なくとも２つの変異が、それぞれ、Ｌｙｓ１１９ＧｌｕおよびＬｙｓ１５１Ｇｌｕである、項目６６の方法。
（項目６８）
前記投与が、腫瘍内注入、静脈内注入、またはそれらの組み合わせによる、項目６４～６７のいずれか一項の方法。
（項目６９）
前記投与が、腫瘍内注入、静脈内注入、またはそれらの組み合わせによる、項目５５～６１のいずれか一項の方法。
（項目７０）
前記腫瘍溶解性ポックスウイルスと組み合わせて、さらなる療法を施すことを含み、前記さらなる療法が、化学療法、放射線療法、追加のウイルスによる腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節タンパク質による処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗癌剤、免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む、項目６８または６９の方法。
（項目７１）
前記さらなる療法が、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその抗原結合フラグメント、ＣＯＸ２阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、およびＴＬＲアゴニストからなる群から選択される前記免疫調節剤を含む、項目７０の方法。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【配列表】

0007625589000001.app