ホーム > 特許ランキング > ディスラプティブ テクノロジカル アドバンシス イン ライフ サイエンス エッセ．エッレ．エッレ． － ソシエタ’ ベネフィット、イン フォルマ アブレヴィアータ、ディ － テールズ エッセ．エッレ．エッレ．エッセビ
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-29
(45)【発行日】2025-02-06
(54)【発明の名称】がん検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/497 20060101AFI20250130BHJP
G01N 33/00 20060101ALI20250130BHJP
G01N 33/493 20060101ALI20250130BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20250130BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250130BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20250130BHJP
【ＦＩ】
G01N33/497 D
G01N33/00 C
G01N33/493 A
C12Q1/06
C12N1/19
C12M1/34 B
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2023547360
(86)(22)【出願日】2022-02-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(86)【国際出願番号】 IB2022050852
(87)【国際公開番号】W WO2022167924
(87)【国際公開日】2022-08-11
【審査請求日】2023-10-02
(31)【優先権主張番号】102021000002294
(32)【優先日】2021-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(73)【特許権者】
【識別番号】523294308
【氏名又は名称】ディスラプティブ テクノロジカル アドバンシス イン ライフ サイエンス エッセ．エッレ．エッレ． － ソシエタ’ ベネフィット、イン フォルマ アブレヴィアータ、ディ － テールズ エッセ．エッレ．エッレ．エッセビ
(73)【特許権者】
【識別番号】522037470
【氏名又は名称】フォンダツィオーネ インスチトゥート イタリアーノ ディ テクノロジア
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フォッリ、ヴィオラ
(72)【発明者】
【氏名】ランザ、エンリコ
(72)【発明者】
【氏名】リコ、ヴィンチェンツォ
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０８８０３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０８４２４９５１（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００３４６９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００９／０３９２８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０２１－５００５４３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８～３３／９８
Ｃ１２Ｑ １／００～ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
女性においてがんを診断するための指標を提供するためのインビトロ方法であって、前記女性の尿試料の匂いに対する自由生活性土壌線虫の反応を検出することを特徴とし、前記尿試料は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される、方法。
【請求項2】
前記反応が走化性反応である、請求項１に記載のインビトロ方法。
【請求項3】
前記尿試料が１：１０に希釈される、請求項２に記載のインビトロ方法。
【請求項4】
前記自由生活性土壌線虫が前記尿の前記匂いに対して正の走化性応答を示すか否かを検出する、請求項１～３のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項5】
前記反応がＡＷＣＯＮニューロンの反応である、請求項１～４のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項6】
前記尿試料が１：１００～１：１０００００に希釈される、請求項５に記載のインビトロ方法。
【請求項7】
前記自由生活性土壌線虫が前記尿試料の前記匂いに対してＡＷＣＯＮニューロンの活性化を示すか否かを検出する、請求項５または６のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項8】
対象においてがんを診断するための指標を提供するためのマイクロ流体アッセイであって、化学物質を適時に制御された様式で充填することができるマイクロ流体パルスアリーナチップに自由生活性土壌線虫をロードする工程であって、前記線虫は、前記ＡＷＣＯＮニューロンがカルシウムインジケータを発現するトランスジェニック線虫である、工程、前記線虫を前記対象により得られた尿試料と接触させる工程であって、前記対象は、女性であり、前記尿試料は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される、工程、
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かを評価する工程、
ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算する工程であって、
ＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）
ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔであり、
Ｎａｃｔは、前記ＡＷＣＯＮニューロンの前記活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である、工程
を含み、
ＮＡＩ指数が＞０であるか否かかおよび／または前記ＡＲ値が＞０．５であるか否かを決定する、マイクロ流体アッセイ。
【請求項9】
前記対象により得られた尿試料との前記接触させることが、前記アッセイの開始時の最初の期間にわたって、および前記アッセイの終了時の最後の期間にわたって前記アリーナを嗅覚中性溶液で充填し、前記最初および最後の期間の間の中間期間にわたって前記アリーナを前記対象の尿試料で充填することによって行われ、先行する充填は後続するものの導入時に前記アリーナから除去され、前記接触が前記線虫の前記ＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かの前記評価が、前記最後の期間中および前記中間期間中に前記ＡＷＣＯＮニューロンの応答を測定し、前記中間期間中の前記測定の平均値Ｉｏｎ、前記最後の期間中の前記測定の平均値Ｉ ｏｆｆ 、および前記最後の期間中の標準偏差σｏｎを計算することによって行われ；
前記ＡＷＣＯＮニューロンが、
Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＞３σｏｎであるか否かを決定する、
請求項８に記載のマイクロ流体アッセイ。
【請求項10】
前記最初の期間が８～１２秒であり、前記中間期間が１０～２０秒であり、前記最後の期間が少なくとも３０秒である、請求項９に記載のマイクロ流体アッセイ。
【請求項11】
前記Ｉｏｎが、約１０秒間および前記尿試料の導入から少なくとも２秒間後に測定される、請求項１０に記載のマイクロ流体アッセイ。
【請求項12】
前記Ｉｏｆｆが、約１０秒間および嗅覚中性溶液の導入から少なくとも２秒間後に測定される、請求項１０または１１に記載のマイクロ流体アッセイ。
【請求項13】
前記カルシウムインジケータがＧＣａＭＰ３（環状に並べられた緑色蛍光タンパク質－カルモジュリン－Ｍ１３ペプチドバージョン３）である、請求項８～１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体アッセイ。
【請求項14】
前記尿試料が１０－２、１０－３、１０－４または１０－５での希釈物である、請求項８～１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体アッセイ。
【請求項15】
前記自由生活性土壌線虫がＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載のインビトロ方法または請求項８～１４のいずれか一項に記載のマイクロ流体アッセイ。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、線虫または線虫のＧＰＣＲ受容体を使用したがん検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
嗅覚は、多くの動物が環境変化に適応する主要な機構の１つである。すべての動物においてＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する嗅覚受容体は、広範囲の揮発性または可溶性分子を高精度でそれらに直接結合することによって区別する際に重要な役割を果たす。化学的感受性は、特に、聴覚および視覚のような長距離の知覚機構を欠く生物において存在する。線虫カエノラブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノムは、利用可能な化学感覚ニューロンの数が極めて少ないにもかかわらず、哺乳動物と同様の数の臭気物質を検出できるようになるために、化学感覚受容体をコードする顕著な数の遺伝子を保有する。
【0003】
がんの早期検出のための安価で非侵襲的な診断戦略の発見は、緊急の優先事項である。
【0004】
がんは、生物のメタボロームを大きく変化させる疾患であり、生物流体中にそれ自体の特徴的な老廃物を潜在的に導入する。がん組織は揮発性化合物を滲出することが報告されており、イヌおよびマウスの並外れた匂いの感知を利用して、以前の研究は、生体液中のまだ知られていないがん特異的臭気物質の存在を実証することを可能にした。動物は、嗅覚知覚を通じて多種多様な揮発性分子を臭気として知覚する。周囲の世界の任意の化学的変化に対して順応して応答する能力は、ほとんどの動物種の生命および健康にとって極めて重要である。実際、臭気は、動物を環境追跡者として機能させて、営巣のために食物および水源の位置を突き止め、同種（フェロモン）を他の種の個体（アレロケミカル）と識別する。異なる化合物または同じ化合物の異なる比率により、そのような行動を調節し得る特定の臭気フィンガープリントを確定する。
【0005】
臭気感知は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として公知の、タンパク質の大きなファミリーによって媒介される。これらは、それらのリガンドに結合するとＧタンパク質を活性化し、次いで細胞内シグナル伝達カスケードを開始する７回膜貫通ドメインタンパク質である。ＧＰＣＲは、主に嗅覚ニューロン（ＯＲＮ）の繊毛で発現される。現在のところ、いくつかの例外はあるが、哺乳動物では、各嗅覚感覚ニューロンが固有に１種類の嗅覚受容体を発現することが広く受け入れられている。別個の嗅覚細胞上のＧＰＣＲの分別は、機能的に同一のニューロンからのシグナルが嗅球に取り込まれたときに臭気の識別を確実にする。対照的に、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）では、各嗅覚ニューロンはその膜上に複数のタイプのＧＰＣＲを提示する。興味深いことに、嗅覚受容体をコードする多数の遺伝子（味覚受容体を含め１,０００を超える）にもかかわらず、線虫は比較的少数である３２の化学感覚ニューロンを保有し、そのうち３つは揮発性分子を感知することに特化されている。したがって、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の各嗅覚ニューロンは、哺乳動物のものと比較して、広範囲の臭気物質を検出する可能性がある。結果として、臭気物質－受容体ペアの組み合わせの複雑さは、線虫において非常に高い。さらに、同じＧＰＣＲが異なる細胞上で発現され得、同じ臭気物質が、機能的に異なるニューロン上の異なるＧＰＣＲに結合し得得、その濃度に応じて、反対の行動アウトカムを誘発し得る。臭気に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の行動応答は走化性として公知である。正の走化性は、ワームが臭気によって誘引され、したがってそれに向かって移動する場合に観察され、負の走化性は、ワームが臭気を回避し、したがってそれから離れる場合に観察される。
【0006】
現在まで、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で報告された行動嗅覚アッセイの大部分は、単一物質用に設計されており、アルコール、ケトン、アルデヒド、エステル、アミン、スルフヒドリル、有機酸、芳香族および複素環式化合物を含む多種多様な揮発性または可溶性分子に対する応答が評価されている（Ｂａｒｇｍａｎｎら「Ｏｄｏｒａｎｔ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｏｌｆａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ」Ｃｅｌｌ、第７４巻、１９９３年８月１３日、５１５－５２７頁）。誘引を媒介する物質の多くは、線虫の食物源である細菌の天然代謝産物である。しかしながら、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が曝露される環境刺激は、ほとんどが競合的な応答を伴う化合物の複雑な混合物である。混合物の誘引および反発成分の異なる比率は、臭気の感知に関与するニューロンアーキテクチャを非対称に活性化し得る。結果として、２つの臭気の間のＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の選好性は、第３のものの存在下で反転し得る（Ｉｗａｎｉｒ，Ｓ．ら、Ｉｒｒａｔｉｏｎａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ａｒｉｓｅｓ ｆｒｏｍ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔ．ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０、３２０２（２０１９）；Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ら、Ｂｏｕｎｄｅｄ ｒａｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｉｓ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｂｙ ｃｉｒｃｕｉｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔ．ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０、１－１２（２０１９）。
【0007】
これは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の嗅覚的意思決定機構における化学的バックグラウンドの重要性を強調している。
【0008】
最近、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、がんの尿試料に対して誘引的な走化性を示すが、これは、非常に正確な様式で対照試料によって忌避される（Ｈｉｒｏｔｓｕ，Ｔ．ら、Ａ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｕｓｉｎｇ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０、ｅ０１１８６９９（２０１５）；ＷＯ２０１５／０８８０３９）ことが実証された。嗅覚ニューロンの消失およびＧタンパク質α変異体に関する研究は、線虫の応答が揮発性化合物によって誘発されることを示唆している。尿は、特に、化学的および物理的特徴（すなわち、分子量、極性、疎水性）が異なる多数の揮発性化合物を含む複雑な生物流体である。食物、夾雑物、薬物、内因性および細菌性副生成物の代謝分解のシグネチャを含む尿のボラチロームは、個体の健康状態に厳密に関連する。ボラチロームにおける濃度の変化は、がんの生物流体のＧＣ／ＭＳのスペクトルにおいて見出されているが、現在まで、これらの方法による特異的がんバイオマーカーの同定は、以下の２つの主な理由により難しいと思われる：マイクロモル濃度範囲までの感度、およびがん特異的ではない可能性がある濃度が変わる多様な代謝産物。この多数の分子において、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）嗅覚系の高い感度および特異性は、がんの本質的な代謝シグネチャの同定を導き得る。
【0009】
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が、がんに罹患した人々からのがん細胞分泌物、組織および尿試料（１０－１で希釈）に対して正の走化性を、対照群からの試料に対して負の走化性を示すという事実は、Ｈｉｒｏｔｓｕの研究（Ｈｉｒｏｔｓｕら、２０１５およびＷＯ２０１５／０８８０３９）によって既に報告されており、Ｈｉｒｏｔｓｕらはまた、この動物の行動を利用して健康な人々およびがん有する人々の間を識別するという考えも導入した。引用された研究はまた、嗅覚ニューロンが行動応答の駆動において主な役割を果たすという証拠を与える。さらなる研究（Ｕｅｄａ，Ｙｕｊｉら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｅ．」 Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ １０．５２（２０１９）：５４１２）は、マウスの膵臓がんを特異的に標的とする以前の知識を利用する。
【0010】
概して、Ｈｉｒｏｔｓｕは、がんを検出するために、尿試料を用いてＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の小さな集団に対して走化性アッセイを行うことが可能であることを示唆している。正の走化性指数はがんに関連付けられる一方、負のものは健康な状態に関連付けられる。報告された感度は９５．８％であり、特異度は９５．０％である。陽性群の尿試料（合計ｎ＝２４）を、異なる病期（ＵＩＣＣ基準によるＩ～ＩＶ）の異なる種類のがん（結腸、直腸、胃、膵臓、食道、乳房および前立腺）を有する人々から採取した。
【0011】
しかしながら、Ｈｉｒｏｔｓｕ ２０１５およびＷＯ２０１５／０８８０３９の両方は、異なる生物学的がんおよび非がん試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の応答が試料およびその希釈に基づいて変動することを示しており、Ｈｉｒｏｔｓｕ ２０１５の図Ｓ１ならびにＷＯ２０１５／０８８０３９の図１７および図１８に見られ得るように、研究ががん患者（またはがん細胞）に由来する試料を非がん患者（または非がん細胞）に由来する試料と識別することができないいくつかの場合があることを実証している。さらに、場合によっては嗅覚ニューロンが「高」応答でがんの匂いに対して応答することを開示しているが、文献は、ＡＷＣニューロンのみががんおよび非がんの間をおそらく識別することができる応答を提供するようであるが、試験された試料ががんに関連するか否かの判定は、ニューロンの「高」応答の解釈に委ねられることを示している。
【0012】
したがって、臭気物質に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の走化性またはニューロン応答の使用は、がん検出のための興味深い基礎であるように思われるが、Ｈｉｒｏｔｓｕ ２０１５の教示ならびにＷＯ２０１５／０８８０３９にはいくつかの落とし穴があり、著者らによって主張されているような任意のがんおよび任意の試料または任意のニューロンを用いた信頼できるがん検出を可能にせず、文献は、すべての未解決の問題をどのように解決するか、および信頼できるがん検出のためにＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）をどのように効果的に使用するかについての教示を提供していない。
【発明の概要】
【0013】
本発明者らは、健康な人々から採取された尿試料に対してＨｉｒｏｔｓｕら２０１５と同じ行動試験を行い、矛盾する結果を見出した（図１Ｂおよび図１Ｆを参照）：いくつかの対照試料は負の走化性指数をもたらすが、他のものは正のものをもたらす；同じ試料に対する複数の走化性アッセイは、正の指数ならびに負のものをもたらし得る。図１（Ｂ）は、同じ対照試料に対する走化性アッセイが正ならびに負の結果をもたらし得ることを示し、図１（Ｆ）は、いくつかの対照試料が正の走化性指数をもたらすが、他のものが負のものをもたらすことを示す。しかしながら、Ｈｉｒｏｔｓｕの報告によると、それらはすべて負の結果をもたらすはずである。したがって、Ｈｉｒｏｔｓｕによって記載されたプロトコルは不完全であり、再現性がほとんどない。
【0014】
ＡＷＣニューロンに対するカルシウムイメージングに関する結果を報告するにあたり、論文は、ニューロン応答を測定し、陽性または対照試料を伴う走化性アッセイ中でＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）によって示される識別的選好性にそれを関連付けるための統計的に有意な方法を提供していない。
【0015】
カルシウムイメージングを行うことにより、Ｈｉｒｏｔｓｕの研究は、尿中のがんを検出するために、がんを有する人々から採取された尿に対するニューロン応答を使用することができることを示している。この種の分析には限られた数の試料（胃がん患者からの２つの陽性試料および２つの対照試料）が含まれ、乳がんを有する女性から採取された試料は含まれなかった。尿試料を１０－１の希釈で、１０秒のＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）への曝露時間窓の間投与した。これらの条件では、ＡＷＣニューロンは、陽性試料および対照試料の除去時にも活性化するが、その活性化の強度は後者の場合に有意に低い。ＡＷＣニューロンは、誘引剤の除去時に活性化し、誘引の媒介に寄与し得ると報告されている。対照試料の除去に対する応答におけるその活性化は強度が低いが、他の態様では陽性試料の除去に対する応答における活性化と差がなく、したがって、走化性中に観察されるＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の選好的行動を説明することができない。
【0016】
したがって、ＡＷＣニューロンに対するカルシウムイメージング試験におけるＨｉｒｏｔｓｕの実験条件は、２セットの試料に対する走化性アッセイで示されたＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の識別能力を完全に説明することができない。彼の結果によれば、正確な走化性識別に対する主な寄与因子は未同定のままである。
【0017】
本発明者らは、驚くべきことに、がんを有する女性から採取された尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の誘引行動および健康な対象からのそれの回避が女性ホルモン周期によって強く影響を受けることを見出し、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いた尿に対する走化性試験により、健康な対照に由来する尿試料からがんに罹患した女性に由来するそれの検出を確実に可能にすることができる窓を特定し、試験において、試験対象がホルモン周期を変化させる薬物を服用してはならないという要件も導入した。
【0018】
図１Ｃおよび図１Ｄは、６人の対照対象から１ヶ月にわたって採取した尿試料に対して得られた走化性指数を示し、走化性指数がホルモン周期によって影響を受けることを実証している。特に、エストラジオールおよびプロゲステロンのピークの間、指数は正になる。
【0019】
さらに、本発明者らは、がん代謝産物に関与する受容体を同定し、限定された数の代謝産物の特異的変化がＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の非常に正確ながん識別行動に十分であることを示した。本発明者らはまた、本明細書で「ニューロン活性化指数」またはＮＡＩと定義される新しい測定を明らかにし、これにより、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＡＷＣニューロンに対するカルシウムイメージング試験で陽性および陰性試料について得られた応答間の差を統計的に有意な様式で定量することが可能になる。
【0020】
本発明の目的は：
－女性においてがんを検出するためのインビトロ方法であって、前記女性の尿試料の匂いに対する自由生活性土壌線虫の反応を指標として使用してがんを検出することを特徴とし、尿は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される、方法；
－対象においてがんを検出するためのマイクロ流体アッセイであって、化学物質を適時に制御された様式で充填することができるマイクロ流体パルスアリーナチップに自由生活性土壌線虫をロードする工程（前記線虫は、ＡＷＣＯＮニューロンがカルシウムインジケータを発現するトランスジェニック線虫である）、
前記線虫を前記対象により得られた尿試料と接触させる工程；
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かを評価する工程；
ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算する工程であって、
ＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）
ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔであり、
Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である、工程
を含み、
ＮＡＩ指数＞０が得られる場合および／またはＡＲ値が＞０．５である場合、対象はがんを有すると判定され、ＮＡＩ指数＜０が得られる場合および／またはＡＲ値が＜０．５である場合、対象はがんを有しないと判定される、マイクロ流体アッセイ。
－Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＡＷＡおよびＡＷＣ ＧＰＣＲ受容体の活性化が、対象に由来する生体液試料との接触時に分析されるがんを検出する方法であって、分析される受容体が、Ｓｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０を含み、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化される場合、前記対象はがんを有すると判定される、方法：
－ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算するための装置であって、
－マイクロ流体パルスアリーナチップ用のハウジングであって、チップが、Ｎｔｏｔ数の自由生活性土壌線虫および対象により得られた尿試料を受け入れるように適合されている、ハウジング；
－ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数Ｎａｃｔを測定するためのデバイス；および
－前記ニューロン活性化指数ＮＡＩをＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）として計算するようにプログラムされた処理ユニット
（ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔである）
を備える、装置。
－女性においてがんを検出するためのインビトロ方法であって、前記女性の尿試料の匂いに対する自由生活性土壌線虫の反応を指標として使用してがんを検出することを特徴とし、尿は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される、方法；
－対象においてがんを検出するためのマイクロ流体アッセイであって、化学物質を適時に制御された様式で充填することができるマイクロ流体パルスアリーナチップに自由生活性土壌線虫をロードする工程（前記線虫は、ＡＷＣＯＮニューロンがカルシウムインジケータを発現するトランスジェニック線虫である）、
前記線虫を前記対象により得られた尿試料と接触させる工程；
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かを評価する工程；
ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算する工程であって、
ＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）
ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔであり、
Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である、工程
を含み、
ＮＡＩ指数＞０が得られる場合および／またはＡＲ値が＞０．５である場合、対象はがんを有すると判定され、ＮＡＩ指数＜０が得られる場合および／またはＡＲ値が＜０．５である場合、対象はがんを有しないと判定される、マイクロ流体アッセイ。
－Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＡＷＡおよびＡＷＣ ＧＰＣＲ受容体の活性化が、対象に由来する生体液試料との接触時に分析されるがんを検出する方法であって、分析される受容体が、Ｓｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０を含み、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化される場合、前記対象はがんを有すると判定される、方法：
－ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算するための装置であって、
－マイクロ流体パルスアリーナチップ用のハウジングであって、チップが、Ｎｔｏｔ数の自由生活性土壌線虫および対象により得られた尿試料を受け入れるように適合されている、ハウジング；
－ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数Ｎａｃｔを測定するためのデバイス；および
－前記ニューロン活性化指数ＮＡＩをＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）として計算するようにプログラムされた処理ユニット
（ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔである）
を備える、装置。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1A】健康な対象およびがん患者からの尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）走化性アッセイ。集団走化性アッセイプレート設計。直径１０ｃｍのペトリ皿を使用して、走化性アッセイを行った。プレートを４つの四分円、２つの臭気物質領域（＋）および２つの対照領域（－）に分割した。１０－１で希釈したがんまたは対照尿試料のいずれか１マイクロリットルを臭気物質領域（＋）に置いた。線虫をプレートの中央に置き、６０分後、走化性指数（ＣＩ）を、ＣＩ＝（臭気物質領域のワームの数（＋）－対照領域のワームの数（－））をワームの総数で割ったものとして計算した。
【図1B】健康な対象およびがん患者からの尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）走化性アッセイ。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の走化性指数は、女性ホルモンによって影響を受ける。月の異なる日に６人の健康な女性（ｈｄ）から採取された尿に対する走化性アッセイは、走化性指数において変動を示し、女性ホルモンによる影響を示唆した。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを示す。
【図1C】健康な対象およびがん患者からの尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）走化性アッセイ。健康なドナーから採取された尿に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の応答は、月経周期の律動性によって影響を受ける。走化性アッセイを、６人の健康なドナー（ｈｄ）から採取された尿を使用して、期間終了の２日後から開始して次の期間まで、週に３回行った。データは、ＣＩと黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよび排卵前のエストラジオール放出と、黄体期中のプロゲステロンのピークとの間に正の相関関係を示した（Ｄｒａｐｅｒ，Ｃ．ら、Ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｗｏｍｅｎ．Ｓｃｉ．ｒｅｐｏｒｔｓ ８、１４５６８（２０１８））。さらに、女性の２つの群間に曲線の形状の違いが認められた。排卵前曲線は、第２群（図１Ｄ）よりも第１群（図１Ｃ）の方が狭く、それはより大きかった。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを示す。灰色の曲線は、月経周期中のホルモン放出の揺らぎを示す（Ｄｒａｐｅｒ，Ｃ．ら、Ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｗｏｍｅｎ．Ｓｃｉ．ｒｅｐｏｒｔｓ ８、１４５６８（２０１８）から改変された参照グラフ）。
【図1D】健康な対象およびがん患者からの尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）走化性アッセイ。健康なドナーから採取された尿に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の応答は、月経周期の律動性によって影響を受ける。走化性アッセイを、６人の健康なドナー（ｈｄ）から採取された尿を使用して、期間終了の２日後から開始して次の期間まで、週に３回行った。データは、ＣＩと黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよび排卵前のエストラジオール放出と、黄体期中のプロゲステロンのピークとの間に正の相関関係を示した（Ｄｒａｐｅｒ，Ｃ．ら、Ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｗｏｍｅｎ．Ｓｃｉ．ｒｅｐｏｒｔｓ ８、１４５６８（２０１８））。さらに、女性の２つの群間に曲線の形状の違いが認められた。排卵前曲線は、第２群（図１Ｄ）よりも第１群（図１Ｃ）の方が狭く、それはより大きかった。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを示す。灰色の曲線は、月経周期中のホルモン放出の揺らぎを示す（Ｄｒａｐｅｒ，Ｃ．ら、Ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｗｏｍｅｎ．Ｓｃｉ．ｒｅｐｏｒｔｓ ８、１４５６８（２０１８）から改変された参照グラフ）。
【図1E】健康な対象およびがん患者からの尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）走化性アッセイ。対応する標準偏差と共に報告された、対照（青色棒）および陽性群（赤色棒）の各試料に対して得られた走化性指数（ＣＩ）値の棒グラフ。
【図1F】いくつかの対照試料は正の走化性指数をもたらすが、他のものは負のものをもたらす。
【図2A】ＡＷＣは、がん尿試料に対して誘引を媒介する主要な嗅覚ニューロンである。頭部に位置する嫌悪応答（ＡＳＨおよびＡＷＢ）および誘引（ＡＷＣ）を媒介する化学感覚ニューロン。すべてのニューロンは、鼻の先端まで延びる突起を示す。
【図2B】ＡＷＣは、がん尿試料に対して誘引を媒介する主要な嗅覚ニューロンである。嗅覚感覚ニューロン、下流の介在ニューロンおよび運動ニューロン。
【図2C】ＡＷＣは、がん尿試料に対して誘引を媒介する主要な嗅覚ニューロンである。対照試料（反発性）、がん尿試料（誘引性）およびＳＢａｓａｌ（中性）に対して応答する（上から下へ）ＡＳＨ、ＡＷＢおよびＡＷＣニューロンからの標準偏差（Ｎ＝６）に従って正規化した平均カルシウムイメージングトレース。刺激時間は灰色で陰影を付けている。ＡＳＨニューロンは、刺激依存的な活性を示すが、フロースイッチに関連する圧力変化に対して応答する。ＡＷＢニューロンからのトレースは、測定された走化性指数を説明するために、十分に信頼できるとは思われない。ＡＷＣＯＮニューロンは信頼できる応答を示し、ＣＩとの比較のための最良の候補となる。
【図2D】ＡＷＣは、がん尿試料に対して誘引を媒介する主要な嗅覚ニューロンである。ＡＷＣニューロンはがん代謝産物を感知する。集団（上）および単一動物（下）の走化性アッセイは、ＡＷＣが遺伝的に除去されたワームががん代謝産物を感知することができないことを示した。棒グラフは、３つの有益ながん試料（ｂｃ１６、ｂｃ１９、およびｂｃ３９）に対する応答の走化性指数または走化性スコアを示す。集団アッセイで報告されたエラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００２、スチューデントのｔ検定）。単一動物の走化性アッセイのエラーバーは、いくつかの試験動物（ｂｃ１６：Ｎ２＝２５、ＰＹ７５０２＝２８；ｂｃ１９：Ｎ２＝２８、ＰＹ７５０２＝２９；ｂｃ３９：Ｎ２＝３１、ＰＹ７５０２＝２７）のＳＥＭを示す（＊ｐ＜０．０５、マン・ウィニー検定）。
【図2E】ＡＷＣは、がん尿試料に対して誘引を媒介する主要な嗅覚ニューロンである。上のグラフは、濃度が上昇する（１０－５～１０－２）溶液に対して、がん対象の尿試料（ｙ軸）または対照試料の除去に対する応答のＡＷＣＯＮニューロンの活性化率を報告する。下のグラフは、各濃度に対して得られたコントラストを示す。１０－２の濃度は、最高の活性化率（８３．３３％）および対照および陽性試料の間の適度に良好なコントラストをもたらす。
【図2F】１：１０の希釈物が、ＢＣ尿試料および対照の間を識別するための最良の濃度であることが見出された。いくつかの濃度の尿を集団走化性アッセイによって試験した。ＢＣ試料（ｂｃ）に対する最大の誘引、ならびに対照（ｈｄ）に対するより大きな回避は、１：１０の希釈物でピークに達した。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを示す。
【図2G】ＡＷＣにおける対照試料に対する選好性反転は、曝露時間に依存する。刺激時間の長さの関数として同じ対照試料について得られたＡＷＣ活性化率および対応するＮＡＩ（それぞれ上のグラフおよび下のグラフ）。ＮＡＩは、４０秒またはそれより長い時間にわたって提示された刺激が、試験された線虫の過半数において誘引的な応答をどれだけ誘発するかを強調しているが、より短い時間窓は、収集されたＡＷＣトレースの大部分から応答を関連付けられない。
【図3A】化学的刺激時の神経活動の広視野イメージング。スケッチは、電気弁を介した同時の化学的刺激用の実験設定、ならびにＧＣａＭＰの４７０ｎｍ青色励起（青色線）およびその発光（緑色線）、ならびに透過画像のための６６０ｎｍ光（赤色線）による神経応答の記録を示す。
【図3B】化学的刺激時の神経活動の広視野イメージング。２つの異なる条件（緩衝液または臭気充填）におけるパルスアリーナの幾何学的形状を示す上面図。
【図3C】化学的刺激時の神経活動の広視野イメージング。ヒートマップおよび個々のトレースは、１２匹の動物にわたりピーク正規化された神経応答（Ｆ／Ｆ０）およびＡＷＣＯＮニューロンに対して記録された健康なドナーからの時間を表す（写真は、静止ＡＷＣＯＮニューロン（上）および化学的に刺激されたもの（下）を用いた頭部の広視野４Ｘ蛍光画像のクロップを示す）。ボックスプロットは、対応する集団の平均ピークＦ／Ｆ０を示す。中央の印は中央値を示し、ボックスはそれぞれ２５および７５パーセンタイルを示す。ひげは、外れ値と見なされない最も極端なデータ点まで延び、外れ値は「＋」記号を使用して個別にプロットされている。
【図3D】化学的刺激時の神経活動の広視野イメージング。ヒートマップおよび個々のトレースは、１２匹の動物にわたりピーク正規化された神経応答（Ｆ／Ｆ０）およびＡＷＣＯＮニューロンに対して記録されたがん対象からの時間を表す（写真は、静止ＡＷＣＯＮニューロン（上）および化学的に刺激されたもの（下）を用いた頭部の広視野４Ｘ蛍光画像のクロップを示す）。ボックスプロットは、対応する集団の平均ピークＦ／Ｆ０を示す。中央の印は中央値を示し、ボックスはそれぞれ２５および７５パーセンタイルを示す。ひげは、外れ値と見なされない最も極端なデータ点まで延び、外れ値は「＋」記号を使用して個別にプロットされている。
【図4】後処理プロセスのパイプライン。一連のフレーム（１）から開始して、ヘッドが選択され、 ＡＷＣＯＮ同定（２－３）のためにセグメント化される。取得中に線虫が静止している場合、動きチェックに回され、トレースが評価される（４～６）。取得で利用可能なすべての生きたトレースを考慮してＮＡＩを計算する（７）。各実験では、約４つの陽性試料および４つの対照試料を試験した（８）。異なる実験日間の平均化（９）により、最終的に各試料の平均ＮＡＩおよび標準偏差（１０）を得る。さらなる詳細は、方法のセクションに報告されている。
【図5A】変数の二項分布を仮定して計算された、対応する標準偏差と共に報告された対照（青色棒）および陽性群（赤色棒）の各サンプルに対して得られたＮＡＩおよびＣＩ値の棒グラフ。両方の指数は明確な傾向（がん試料に対する正の値、対照群に対する負の値）を示すが、精度およびＮＡＩに関連するコントラストは、ＣＩと比較した場合に明らかに高い。
【図5B】散布図は、ＰＣＡ分析の最初の２つの主成分を示す。テキストボックスは分析のアウトカムを報告し、これは、ＮＡＩが２つの群の点間の分離の大部分に寄与することを示す。
【図5C】ＣＩ（左のグラフ）、ＮＡＩ（中央のグラフ）および主成分分析の第１の成分（右のグラフ）について得られたＲＯＣ曲線。グラフから、カルシウムイメージング測定が陽性群および対照群の間のより良好な識別をもたらすことは明らかである。ＰＣＡの第１の成分は、ＮＡＩの識別力を向上させるが、ＮＡＩとあまり異ならない。
【図5D】対照群および患者の両方に対して測定されたＣＩ、ＮＡＩおよびＰＣ１（上から下）の分布（各行に対してそれぞれ左および右のグラフ）。
【図5E】ｓｒｓｘ－５およびｓｔｒ－１９９遺伝子に欠失を有する変異動物は、対照ワームとして振る舞う。ＳＲＳＸ－５およびＳＴＲ－１９９受容体を欠く動物は、健康な個体（ｈｄ）から採取された尿試料を用いて試験した場合にも対照動物（Ｎ２）として振る舞う。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを表す。
【図6】示された遺伝子についてノックアウトされた動物の走化性指数。そのＣＩがＮ２のそれに対して有意に低い株は、乳がん代謝産物を感知するための強力な候補と考えられる。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのＴ検定を使用して計算した。グラフは、２つの異なる尿試料を使用して行われたアッセイの平均として表されている。エラーバーはＳＥＭ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明者らは、Ｈｉｒｏｔｓｕ，Ｔ．ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０、ｅ０１１８６９９（２０１５）；ＷＯ２０１５／０８８０３９に開示されているもののような、がんを検出するためのアッセイが再現可能ではなかった、すなわち、様々な場合、特に乳がんの同定において信頼性が高く再現可能な結果を提供しなかったことを見出した。
【0023】
本発明者らは、試料が採取された女性ホルモン周期の瞬間に応じて、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が、同じ女性個体から採取された試料に対して異なる様式で反応することを発見した。したがって、本発明者らは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）または土壌自由生活性線虫の尿の匂いに対する反応が使用されるアッセイにおいて、女性におけるがんを検出するための女性ホルモン周期に関する時間窓を特定した。
【0024】
例のセクションでは、発明者らによって行われた研究が報告されている。研究は、具体的には、３６個の陽性試料および３６個の対照試料（年齢および群が一致）に対して、異なる病期（Ｉ～ＩＶ）および両方のタイプ（小葉および乳管）の乳がんを標的とした。同じセットの試料を走化性アッセイならびにカルシウムイメージング実験で試験した。
【0025】
走化性アッセイでは、本発明者らは、Ｈｉｒｏｔｓｕの結果を再現することを可能にする、そうでなければ再現不可能な、尿採取および試験のための新しいプロトコルを見出した。６人の女性から１ヶ月にわたって採取された尿試料を試験した。得られた走化性指数は、尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の走化性行動が女性ホルモン周期によって影響を受けることを示唆した。特に、プロゲステロンおよびエストラジオールのピークは、対象の健康状態にかかわらず、常に誘引的な応答をもたらす。したがって、本発明者らは、走化性アッセイが再現可能な結果をもたらす時間窓を特定した。
【0026】
したがって、本発明は、
女性においてがんを検出するためのインビトロ方法であって、前記女性の尿試料の匂いに対する自由生活性土壌線虫の反応を指標として使用してがんを検出することを特徴とし、前記尿は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される、方法を提供する。
女性においてがんを検出するためのインビトロ方法であって、前記女性の尿試料の匂いに対する自由生活性土壌線虫の反応を指標として使用してがんを検出することを特徴とし、前記尿は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される、方法を提供する。
【0027】
線虫は非常に広い門であり、いくつかの本質的な共通の特徴を共有しているが、回虫は寄生性または非寄生性であり得、寄生性のものは昆虫、哺乳動物、魚、植物などに適応し、非寄生性（自由生活性）のものは土壌、水、例えば、海、湖、川、池などに適応することが当技術分野で公知である。線虫は匂いに給餌および生存を依存しているので、その匂いの感知は高度に発達し、特殊化されている。例えば、寄生性線虫は、土壌自由生活性のものと比較して非常に異なる様式で臭気に応答することが公知である。したがって、本発明のすべての実施形態（方法およびアッセイ）は、自由生活性土壌線虫などの、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）と同様の生活習慣を有する線虫に合理的に適用可能であると考えられる。特に、本発明の方法ならびにアッセイは、細菌フィーダーの自由生活性土壌線虫にさらに合理的に適用可能であると考えられる。本発明の好ましい実施形態では、自由生活性土壌線虫はＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である。
【0028】
本明細書によれば、線虫の尿の匂いに対する反応は、観察中の線虫の走化性反応、ニューロン反応または受容体反応であり得る。本発明のある実施形態では、反応は走化性反応である。
【0029】
好ましくは、試験される尿が女性から採取される本明細書の任意の実施形態に対して、前記試験される女性は、薬物がホルモン比率を変化させ、その結果、線虫の応答を変化させる可能性があるので、採取時に、ホルモン周期を変化させる前記薬物を服用したり、またはホルモン周期を変化させる薬物を最近服用したことがあってはならない。
【0030】
本発明によれば、試験された応答が線虫の走化性応答である場合、尿試料は好ましくは１：１０に希釈される。
【0031】
以下の例のセクションおよび図２Ｆに報告される結果は、実際に、走化性アッセイに使用される１０－１希釈の尿がより正確で信頼できる結果を提供することを示す。
【0032】
これまでに記載された実施形態のいずれかの本発明の方法によれば、上記で定義されたような自由生活性土壌線虫が、前記尿の匂いに対して正の走化性応答を示すか、または換言すれば、前記尿に誘引される場合、女性はがんを有すると判定される。
【0033】
本発明の別の実施形態によれば、上記で定義された土壌自由生活性線虫で実施されるインビトロ方法では、分析される反応はニューロン反応、特にＡＷＣＯＮニューロン反応である。
【0034】
例のセクションで提供される結果によれば、好ましい実施形態では、ＡＷＣＯＮニューロン反応は、尿が１：１００に希釈された尿試料を用いて試験される。図２Ｅに要約された結果は、ＡＷＣＯＮニューロン反応の分析が少なくとも１０－２、１０－３、１０－４、１０－５で信頼できる結果を提供できることを示しているが、１０－２の尿希釈で最良の応答が得られる。
【0035】
本発明者らは、線虫のニューロンの応答を極めて信頼性が高く正確な様式で試験することができる新しいアッセイを特定した。
【0036】
本発明者らは、化学物質を適時に制御された様式で充填することができるアリーナに複数の線虫を閉じ込めるためにマイクロ流体チップを使用して、マイクロ流体中でカルシウムイメージング実験を行った。カルシウムトレースを記録するために使用されるカメラの視野は、複数の頭部を含み、したがって複数のトレースを同時に記録することができる。
【0037】
これらの取得中、中性化学物質（ｓＢａｓａｌ）が実験の最初の１０秒間および最後の少なくとも３０秒間にわたってアリーナを満たした一方、尿試料はこれらの２つの時間窓の間でアリーナを満たした。各線虫に対して、試料除去の２秒後に開始する時間窓で約１０秒間検出された平均蛍光シグナル強度＜Ｉｏｆｆ＞、および試料除去の２秒前に終了する時間窓で約１０秒間検出された平均シグナル強度＜Ｉｏｎ＞、ならびに同じ「オン」時間窓での標準偏差σｏｎを測定した。本発明者らは、ＩｏｆｆおよびＩｏｎの間の差がσｏｎの３倍、すなわち（Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ）＞３σｏｎである場合、応答を試料除去時の活性化として分類できることを見出した。換言すれば、（Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ）＞３σｏｎの場合、線虫によって感知される化学物質は誘引剤として知覚される。
【0038】
この設定で陽性および対照試料の２つの群を研究するために、本発明者らは、「ニューロン活性化指数」またはＮＡＩとして本明細書で定義される新しい測定を特定し、陽性および陰性試料について得られた応答の間の差を統計的に有意な様式で定量化することを可能にした。
【0039】
ＮＡＩを構築するために、以下の工程に従った：
・前の段落に記載された規則に従って、統計的に有意な数の線虫の応答を分類する（Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＞３σｏｎ）
・誘引と分類された応答の数Ｎ＋、およびそれらの分類に関係なく応答の総数Ｎｔｏｔを計数する。
・以下の式ＡＲ＝Ｎ＋／Ｎｔｏｔを用いて活性化率ＡＲを計算する
・以下の式：ＮＡＩ＝２ＡＲ－１を使用してＮＡＩを計算する
・前の段落に記載された規則に従って、統計的に有意な数の線虫の応答を分類する（Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＞３σｏｎ）
・誘引と分類された応答の数Ｎ＋、およびそれらの分類に関係なく応答の総数Ｎｔｏｔを計数する。
・以下の式ＡＲ＝Ｎ＋／Ｎｔｏｔを用いて活性化率ＡＲを計算する
・以下の式：ＮＡＩ＝２ＡＲ－１を使用してＮＡＩを計算する
【0040】
その定義から、ＮＡＩは、走化性指数ＣＩと同様に、－１～＋１の範囲であることになる。正のＮＡＩは、試料除去時に活性化（誘引）が観察される過半数の応答に関連付けられるが、負のＮＡＩは、線虫の過半数が応答しなかった、すなわち、カルシウムイメージングによって測定されたそれらの応答が以下の規則：（Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＞３σｏｎ）を満たさなかった実験に関連付けられるものとする。活性化率を用いて同様の定量化が得られるが、この場合、ＡＲは、ＣＩおよびＮＡＩとは異なり、０から１の範囲であり、０．５を超える値が誘引関連応答に関連付けられるものとなる。
【0041】
ＮＡＩおよびＡＲにより、本発明者らは、カルシウムイメージング実験で使用される試料の最良の希釈値がどのようにして１０－２であるかを示すことができた（図１Ｃおよび図１Ｄを参照）。この値は、対照試料の除去後でさえＡＷＣがわずかな活性化を示した、Ｈｉｒｏｔｓｕのカルシウムイメージング実験で使用されたものとは異なる。これは、臭気物質が空中浮遊化学物質として、または支持する寒天基質を介してＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）によって検出される走化性アッセイにおいて使用される希釈と比較して、アッセイされる線虫と直接接触する液体培地を介して投与された場合、試料がより高い希釈値を有する必要があるという事実と一致する。
【0042】
ＮＡＩおよびＡＲはまた、試料投与のための最良の刺激時間窓を定義することを可能にする（図２Ｇを参照）：本発明者らの実験から、４０秒よりも長い範囲の刺激時間窓が対照試料においてさえ誘引様応答を誘発することが分かる。したがって、本発明者らは、２０秒の時間窓を使用することを提案する。
【0043】
最後に、対象におけるがんの存在を尿試料から予測するために、本発明者らは、１０－１での試料希釈物を用いて走化性指数ＣＩによって測定された行動応答が、尿試料の１０－２希釈物に対して２０秒間曝露したＡＷＣのカルシウムイメージングトレースおよびＮＡＩ定量に基づく評価と比較した場合、精度が低いことを示した（図５Ａを参照）。
【0044】
したがって、本発明者らは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の嗅覚を利用して尿試料中のがんトレースを検出するための、ＡＷＣニューロンを標的とするマイクロ流体チップに基づくカルシウムイメージング実験用の有効な刺激プロトコルを本明細書で提供する。
【0045】
ＡＷＣに対してカルシウムイメージングを行う主な利点は、結果の精度の向上および試験に関与する時間の減少である。これらの利点を得るためには、ＡＷＣニューロンにおいて特異的にカルシウムインジケータを発現するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の株、および落射蛍光顕微鏡設定下でそれを検査することが必要である。試験される試料はまた、２０秒の時間窓にわたって１０－２の希釈値で投与される必要があり、結果はニューロン活性化指数ＮＡＩによって定量される必要がある。これは、ホルモン周期がＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のがんの識別能に干渉するという事実によって引き起こされる偽陽性を排除するための、新しい尿採取プロトコルの導入によってさらに改善される。
【0046】
したがって、本発明のさらなる目的は、対象においてがんを検出するためのマイクロ流体アッセイであって、化学物質を適時に制御された様式で充填することができるマイクロ流体パルスアリーナチップに自由生活性土壌線虫をロードする工程（前記線虫は、ＡＷＣＯＮニューロンがカルシウムインジケータを発現するトランスジェニック線虫である）、
前記線虫を前記対象により得られた尿試料と接触させる工程、
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かを評価する工程；
ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算する工程であって、
ＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）
ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔであり、
Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である、工程
を含み、
ＮＡＩ指数＞０が得られる場合および／またはＡＲ値が＞０．５である場合、対象はがんを有すると判定され、ＮＡＩ指数＜０が得られる場合および／またはＡＲ値が＜０．５である場合、対象はがんを有しないと判定される、マイクロ流体アッセイである。
前記線虫を前記対象により得られた尿試料と接触させる工程、
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かを評価する工程；
ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算する工程であって、
ＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）
ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔであり、
Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である、工程
を含み、
ＮＡＩ指数＞０が得られる場合および／またはＡＲ値が＞０．５である場合、対象はがんを有すると判定され、ＮＡＩ指数＜０が得られる場合および／またはＡＲ値が＜０．５である場合、対象はがんを有しないと判定される、マイクロ流体アッセイである。
【0047】
本発明のアッセイでは、適切な線虫は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）またはＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）と同様の寸法の、好ましくは細菌を食べる他の自由生活性土壌線虫などの、マイクロ流体システムに適した寸法の線虫である。
【0048】
適切なマイクロ流体アリーナは当業者に公知である。行動アリーナは、例として、ＡｌｂｒｅｃｈｔおよびＢａｒｇｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１、「Ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｉｎ ｐｒｅｃｉｓｅ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」に記載されている。特に、アリーナは、「ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｖｅｒｖｉｅｗ」の第１段落に記載されており、論文の図１に図示されている。アリーナに関する詳細は、同じ論文「ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｓｉｇｎｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」の付記２にも提供されている。当業者は、ＡｌｂｒｅｃｔｈおよびＢａｒｇｍａｎｎ ２０１１によって記載されているものを小型化するマイクロ流体アリーナを容易に調製することができる。チップ上の他の適切なマイクロ流体行動アリーナは、当技術分野において、例として、Ａｄｒｉａｎａ Ｓａｎ－Ｍｉｇｕｅｌ ａｎｄ Ｈａｎｇ Ｌｕ，Ｗｏｒｍｂｏｏｋ．ｏｒｇ ２０１３「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ」、３頁、図２、ならびに４、１３および１４頁に詳細に記載されているマイクロ流体チップ（図５）を開示しているＥＰ３６９８１３３Ａ１に記載されている。
【0049】
ワームロードディングチャネルおよび液体の流入および流出のためのチャネルを有する、いくつかのＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の刺激溶液に対する嗅覚応答を同時に分析するのに適した任意のマイクロ流体システム（本明細書では行動アリーナとも定義される）が、本発明のアッセイに適している。本発明によるシステムは、目的の溶液（試料、中性溶液、その他）を適時に正確な様式でＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に投与することを可能にする。行動アリーナは、例えばカメラなどの画像取得のためのデバイスの視野の下に、複数の線虫を閉じ込めるのに適したサイズである。閉じ込めは、バリアを介して容易に得ることができ、その互いの距離は、線虫が逃げるのを妨げるのには十分に小さいが、溶液が依然として流れ得るには十分に高い。線虫が閉じ込められた微小環境は、ピラーのフォレスト（好ましくは、一定の間隔および一貫した幾何学的形状を有する）を必要とする。チップを支えるピラーは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の乱されない遊泳を可能にする間隔で配置される必要がある。任意の落射蛍光顕微鏡を使用して、蛍光チャネルを介したニューロン活性および／または伝達チャネルを介した行動応答を記録し得る。
【0050】
本発明のアッセイによれば、
前記対象により得られた尿試料との前記接触させることは、アッセイの開始時の最初の期間にわたって、およびアッセイの終了時の最後の期間にわたって前記アリーナを嗅覚中性溶液で充填し、前記最初および最後の期間の間の中間期間にわたって前記アリーナを前記対象の尿試料で充填することによって行うことができ、先行する充填は後続するものの導入時にアリーナから除去され；
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かの前記評価は、前記最後の期間中および前記中間期間中にＡＷＣＯＮニューロンの応答を測定し、前記中間期間中の前記測定の平均値Ｉｏｎ、前記最後の期間中の前記測定の平均値Ｉｏｎ、および前記最後の期間中の標準偏差σｏｎを計算することによって行われ；
ＡＷＣＯＮニューロンは、
Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＞３σｏｎの場合に活性化されている、および
Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＜３σｏｎの場合に活性化されていないと考えられる。
前記対象により得られた尿試料との前記接触させることは、アッセイの開始時の最初の期間にわたって、およびアッセイの終了時の最後の期間にわたって前記アリーナを嗅覚中性溶液で充填し、前記最初および最後の期間の間の中間期間にわたって前記アリーナを前記対象の尿試料で充填することによって行うことができ、先行する充填は後続するものの導入時にアリーナから除去され；
前記接触が前記線虫のＡＷＣＯＮニューロンを活性化するか否かの前記評価は、前記最後の期間中および前記中間期間中にＡＷＣＯＮニューロンの応答を測定し、前記中間期間中の前記測定の平均値Ｉｏｎ、前記最後の期間中の前記測定の平均値Ｉｏｎ、および前記最後の期間中の標準偏差σｏｎを計算することによって行われ；
ＡＷＣＯＮニューロンは、
Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＞３σｏｎの場合に活性化されている、および
Ｉｏｆｆ－Ｉｏｎ＜３σｏｎの場合に活性化されていないと考えられる。
【0051】
本発明のある実施形態によれば、前記最初の期間は８～１２秒（例えば１０秒）であり、前記中間期間は１０～２０秒であり、前記最後の期間は少なくとも３０秒である。
【0052】
最後の期間は、ニューロンをベースラインの蛍光に戻すために適用される。３０より長い任意の時間が適切であるが、必要ではない。本発明者らは、ニューロンをベースラインの蛍光に戻すためには３０秒で十分であることを検証した。上記の理由により、この期間の上限値は必要ない。実際には、手順を高速化するために、上限値は最大６０秒、したがって３０～６０秒とすることができるが、原理上、上限値は数時間でもあり得る。
【0053】
本発明のある実施形態によれば、前記Ｉｏｎは、約８～１５秒間、例えば約１０秒間の期間にわたって、好ましくは前記尿試料の導入から少なくとも２秒間後に測定される。
【0054】
さらなる実施形態によれば、前記Ｉｏｆｆは、約８～１５秒間、例えば約１０秒間の期間にわたって、好ましくは前記嗅覚中性溶液の導入から少なくとも２秒間後に測定される。
【0055】
さらなる実施形態によれば、前記Ｉｏｆｆは、約１０秒間の期間、前記嗅覚中性溶液の導入から少なくとも２秒後に測定され、前記Ｉｏｎは、約１０秒間の期間、前記尿試料の導入から少なくとも２秒後に測定される。
【0056】
上述のように、前記尿試料は、例として、１０－２、１０－３、１０－４または１０－５希釈物であり得る。好ましい希釈は１０－２である。
【0057】
上記および下記の例のセクションに開示される知見によれば、本発明のマイクロアレイアッセイにおいても、対象が女性である場合、好ましくは、前記尿試料は、最後の月経周期の少なくとも２日後、同じ月経周期の５日後までに採取される。
【0058】
上述のように、本発明のアッセイでは、アッセイされる線虫のＡＷＣＯＮニューロンがカルシウムインジケータを発現する。これは、目的のニューロン上にカルシウムインジケータを発現する遺伝子をコードするトランスジェニックワームを使用して行うことができる。
【0059】
カルシウムインジケータ遺伝子の例としては、イエローカメレオン（ＹＣ）遺伝子；例として、ＧＣａＭＰ３（環状に並べられた緑色蛍光タンパク質－カルモジュリン－Ｍ１３ペプチドバージョン３）を発現する遺伝子などのＧＣａＭＰ遺伝子が挙げられる。
【0060】
インジケータを目的のニューロン上の受容体にライゲーションするための方法は当技術分野で周知であり、例えば、プロモーターのすぐ下流でインジケータ遺伝子をライゲーションする方法、マイクロインジェクション法などであり、例として、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、または他の実験室マニュアルに記載されている。あるいは、公知の方法に従って、線虫の生殖腺にＤＮＡ溶液を注入することができる（Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，Ｄ．＆Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＥＭＢＯ Ｊ １０，３９５９－３９７０（１９９１））。
【0061】
さらに、本発明者らは、例のセクションおよび図６に開示されるように、がん試料に対する正の走化性応答に関与するＧＰＣＲ Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）受容体を同定した。
【0062】
実験のセクションで報告されているように、受容体ＡＷＡおよびＡＷＣ Ｓｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０受容体は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で観察されるがん試料に対する正の走化性応答に関与するが、Ｓｒｓｘ－５およびＳｔｒ－１９９は関与しない。
【0063】
実際、Ｓｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０受容体の各々の活性を欠損したＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）変異体は、がん患者の尿で刺激した場合、野生型Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）と比較して低い走化性応答（すなわち、より低い走化性指数）を示したが、Ｓｒｓｘ－５およびＳｔｒ－１９９の各々の活性を欠損したＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）変異体に対する同じ刺激後、変異体および野生型の間に走化性応答の差は観察されなかった。
【0064】
したがって、本発明の目的はまた、対象におけるがん検出方法であって、
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＡＷＡおよびＡＷＣ ＧＰＣＲ受容体を対象に由来する生体液試料を用いた臭気物質の刺激に供し、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０の刺激を分析することを含み、ここで、
少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化されると、前記対象はがんを有すると判定される、方法である。
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＡＷＡおよびＡＷＣ ＧＰＣＲ受容体を対象に由来する生体液試料を用いた臭気物質の刺激に供し、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０の刺激を分析することを含み、ここで、
少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化されると、前記対象はがんを有すると判定される、方法である。
【0065】
さらに、方法は、Ｓｒｓｘ－５および／またはＳｔｒ－１９９受容体活性の分析も含み得る。
【0066】
したがって、本発明はまた、対象におけるがん検出方法であって、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＡＷＡおよびＡＷＣ ＧＰＣＲ受容体を対象に由来する生体液試料を用いた臭気物質の刺激に供し、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０の刺激を分析することを含み、
分析される受容体は、Ｓｒｓｘ－５またはＳｔｒ－１９９をさらに含み、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化され、Ｓｒｓｘ－５またはＳｔｒ－１９９が活性化されていない場合、前記対象はがんを有すると判定される；または
分析される受容体は、Ｓｒｓｘ－５およびＳｔｒ－１９９をさらに含み、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化され、Ｓｒｓｘ－５およびＳｔｒ－１９９が活性化されていない場合、前記対象はがんを有すると判定される、方法を包含する。
分析される受容体は、Ｓｒｓｘ－５またはＳｔｒ－１９９をさらに含み、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化され、Ｓｒｓｘ－５またはＳｔｒ－１９９が活性化されていない場合、前記対象はがんを有すると判定される；または
分析される受容体は、Ｓｒｓｘ－５およびＳｔｒ－１９９をさらに含み、少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０が活性化され、Ｓｒｓｘ－５およびＳｔｒ－１９９が活性化されていない場合、前記対象はがんを有すると判定される、方法を包含する。
【0067】
本発明によれば、分析され得るさらなるＧＰＣＲ受容体は、Ｓｒｓｘ－３；Ｓｒｓｘ－３７；Ｓｒｔ－７；Ｓｒｔ－２８；Ｓｒｔ－２９；Ｓｒｔ－４５；Ｓｒｔ－４７；Ｓｒｘ－１；Ｓｒｘ－４７；Ｓｒａｂ－７；Ｓｒａｂ－９；Ｓｒａｂ－１３；Ｓｒａｂ－１６；Ｓｒｖ－３４；Ｓｔｒ－２６１、Ｓｒｄ－１７；Ｓｒｅ－４、Ｓｒｉ－１４；Ｓｒｊ－２１；Ｓｒｊ－２２のうちの１つまたは複数である。ある実施形態では、ＧＰＣＲ受容体活性化の前記評価は、ＧＰＣＲ－Ｇαキメラを発現するようにサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇαサブユニットにカップリングされた前記ＡＷＣおよび／またはＡＷＡ ＧＰＣＲ受容体のうちの１つをコードするＤＮＡをそれぞれ含むサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を使用して行うことができ、前記酵母株の各々は、ＧＰＣＲ－Ｇαキメラの活性化時に、フェロモン応答性蛍光転写レポーター遺伝子が活性化され、蛍光レポータータンパク質が酵母中で発現されるように、フェロモン応答性蛍光転写レポーター遺伝子も含む。
【0068】
適切なサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、ＷＯ２０１４／１６９３３６に記載されているように、または任意の他の組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。例として、ヒトＧＰＣＲの代わりにＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＧＰＣＲを発現するために、ＫａｐｏｌｋａらによってＰＮＡＳ ２０２０、第１１７巻、第２３号、１３１１７－１３１２６頁「ＤＣｙＦＩＲ：ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＣＲＩＳＰＲ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」に記載されているプロトコルを適合させることができる。この場合、ＧＰＣＲは、酵母サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムに直接ＣＲＩＳＰＲ組み込まれ得る。この系では、酵母のＧαの最後の５残基が、線虫のＣ末端の４つのＧα（ＯＤＲ３、ＧＰＡ２、ＧＰＡ３、ＧＰＡ１３）のうちの１つの最後の５残基で置き換えられたＧαＣ末端キメラを使用して、線虫のＧＰＣＲは酵母のＧαサブユニットにカップリングされ得る。各株は、フェロモン応答性蛍光転写レポーターも含む。このようにして得られる株は、がん患者の尿試料を用いて試験され得る。特定のがん代謝産物との相互作用によるＧＰＣＲ－Ｇａペアの活性化は、蛍光遺伝子の転写をもたらす。
【0069】
したがって、本発明によれば、前記評価は、前記試料を、ＧＰＣＲ－Ｇαキメラを発現するようにサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧαサブユニットに連結された前記ＡＷＣおよび／またはＡＷＡ ＧＰＣＲ受容体のうちの１つをコードするＤＮＡをそれぞれ含む異なるサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株と接触させることによって行われ、前記酵母株の各々は、フェロモン応答性蛍光転写レポーター遺伝子も含み、前記ＧＰＣＲ受容体は少なくともＳｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０であり、少なくともＳｒａ－１３－Ｇαを発現するサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；Ｓｔｒ－２－Ｇαを発現するサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；Ｏｄｒ－１０－Ｇαを発現するサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；Ｓｒａ－１７－Ｇαを発現するサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；ならびにＳｔｒ－１３０－Ｇα Ｓｒａ－１３；Ｓｔｒ－２；Ｏｄｒ－１０；Ｓｒａ－１７およびＳｔｒ－１３０を発現するサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株において蛍光の発光が観察される場合、ＧＰＣＲ受容体は活性化されていると定義される。
【0070】
本発明によれば、使用され得るさらなるサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、ＧＰＣＲ－Ｇαキメラを発現するようにサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧαサブユニットにカップリングされた前記ＡＷＣおよび／またはＡＷＡ ＧＰＣＲ受容体のうちの１つをコードするＤＮＡをそれぞれ含む１つまたは複数の異なるサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株であり、前記酵母株の各々は、フェロモン応答性蛍光転写レポーター遺伝子も含み、前記ＡＷＣおよび／またはＡＷＡ ＧＰＣＲ受容体はＳｒｓｘ－３；Ｓｒｓｘ－３７；Ｓｒｔ－７；Ｓｒｔ－２８；Ｓｒｔ－２９；Ｓｒｔ－４５；Ｓｒｔ－４７；Ｓｒｘ－１；Ｓｒｘ－４７；Ｓｒａｂ－７；Ｓｒａｂ－９；Ｓｒａｂ－１３；Ｓｒａｂ－１６；Ｓｒｖ－３４；Ｓｔｒ－２６１、Ｓｒｄ－１７；Ｓｒｅ－４、Ｓｒｉ－１４；Ｓｒｊ－２１；Ｓｒｊ－２２である。
【0071】
最後に、本発明はまた、ニューロン活性化指数ＮＡＩを計算するための装置であって、
－マイクロ流体パルスアリーナチップ用のハウジングであって、チップが、Ｎｔｏｔ数の自由生活性土壌線虫および対象により得られた尿試料を受け入れるように適合されている、ハウジング；
－ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数Ｎａｃｔを測定するためのデバイス；および
－前記ニューロン活性化指数ＮＡＩをＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）として計算するようにプログラムされた処理ユニット
（ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔである）
を備える、装置を提供する。
－マイクロ流体パルスアリーナチップ用のハウジングであって、チップが、Ｎｔｏｔ数の自由生活性土壌線虫および対象により得られた尿試料を受け入れるように適合されている、ハウジング；
－ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数Ｎａｃｔを測定するためのデバイス；および
－前記ニューロン活性化指数ＮＡＩをＮＡＩ＝２（ＡＲ－０．５）として計算するようにプログラムされた処理ユニット
（ここで、ＡＲ＝Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔである）
を備える、装置を提供する。
【0072】
ニューロンの活性化に応答する線虫の数を測定するためのデバイスは、当技術分野で周知である。適切なデバイスは、例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のニューロン応答を自動的に検出するための装置を開示しているＥＰ３６９８１３３Ａ１に詳細に記載されている。デバイスは、文献の図１から図６に詳細に記載されている。ＥＰ３６９８１３３Ａ１に記載されているデバイスは、初期線虫集団から成体段階の線虫を選択し、中間の線虫集団を得るように構成された機械的選択ユニット、中間の集団から成体段階の線虫の最終集団を選択し、卵を産生する成体段階の線虫から若年成体段階の線虫を選択して、臭気物質の刺激に対する最終集団の線虫の応答を検出するように構成された測定ユニットに送るように構成された線虫光学的選択ユニットを備え、機械的選択ユニットは、少なくとも３方向分岐を有する接続チャネルによって光学的選択ユニットに接続され、光学的選択ユニットは、ローディングマイクロチャネルによって測定ユニットに接続されている。選択ユニットは、好ましいが、適切なデバイスの必須の特徴ではない。適切なデバイスの一例が図Ａに開示されており、実験のセクション「ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｍａｇｉｎｇ」に記載されている。
【0073】
以下に報告される研究は、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄによって承認された。試験登録前に、全参加者から書面でインフォームドコンセントを得た。
【0074】
例
乳がん対象の試料採取および臨床的特徴付け
本発明者らは、乳がんを有する女性からｎ＝３６の尿試料、ならびに性別および同年齢の健康なドナーからｎ＝３６の尿試料を採取した。両群とも２５歳から８８歳の間の範囲であった。がんの特徴を表１に報告する。簡潔には、症例の８８．９％は、乳がんの最も一般的な形態である浸潤性乳管癌である。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ががんを早期に検出する能力を試験するために、乳がん患者の過半数（６６．７％）を疾患の初期段階で選択した。
乳がん対象の試料採取および臨床的特徴付け
本発明者らは、乳がんを有する女性からｎ＝３６の尿試料、ならびに性別および同年齢の健康なドナーからｎ＝３６の尿試料を採取した。両群とも２５歳から８８歳の間の範囲であった。がんの特徴を表１に報告する。簡潔には、症例の８８．９％は、乳がんの最も一般的な形態である浸潤性乳管癌である。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ががんを早期に検出する能力を試験するために、乳がん患者の過半数（６６．７％）を疾患の初期段階で選択した。
【0075】
女性の尿試料に対する走化性は、ホルモン周期によって影響を受ける
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が健康なドナーからの尿試料に対して回避を示すことを確認するために、健康な女性からの試料を使用して集団走化性アッセイを最初に行った（図１、パネル（Ａ））。１０人の独立した女性からの試料に対して行われた第１のセットのアッセイは、議論の余地のある結果を示した（図１Ｆ）。驚くべきことに、１ヶ月の期間にわたって異なる日に同じ個体から採取された独立した試料に対して行われた走化性アッセイでも反対のＣＩ値が観察された（図１、パネル（Ｂ））、ここで、採取日は各ドナーに対してランダムに選択された。これらのデータは、線虫の走化性応答の調節において、女性ホルモン周期の主要な役割を示唆した。この仮説を試験するために、６人の健康で受精能力があり、ピルを服用していない女性（そのうち３人は＜３０歳（第１群）、その他＞４０歳であった（第２群））から生物学的試料を週に３回採取した。試料採取は、月経周期の終了の２日後に開始し、次の開始時に終了した。動物の走化性応答と卵胞期および排卵周辺期の両方との間に正の相関が観察された（図１、パネル（Ｃ）～（Ｄ））。エストラジオール放出のピークは前者の段階を特徴付ける一方、卵胞刺激（ＦＳＨ）および黄体形成（ＬＨ）ホルモンのレベルは、後者の間に速やかに上昇する。同様に、正のＣＩは、プロゲステロンピークに関連するエストロゲン放出の第２波を特徴とする、黄体中期に測定された。興味深いことに、加齢に伴うホルモン放出の十分に確立された変化と一致して、排卵前ピークの形状は、第２群（高齢女性）と比較して第１群（若年女性）内でより狭かった。
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が健康なドナーからの尿試料に対して回避を示すことを確認するために、健康な女性からの試料を使用して集団走化性アッセイを最初に行った（図１、パネル（Ａ））。１０人の独立した女性からの試料に対して行われた第１のセットのアッセイは、議論の余地のある結果を示した（図１Ｆ）。驚くべきことに、１ヶ月の期間にわたって異なる日に同じ個体から採取された独立した試料に対して行われた走化性アッセイでも反対のＣＩ値が観察された（図１、パネル（Ｂ））、ここで、採取日は各ドナーに対してランダムに選択された。これらのデータは、線虫の走化性応答の調節において、女性ホルモン周期の主要な役割を示唆した。この仮説を試験するために、６人の健康で受精能力があり、ピルを服用していない女性（そのうち３人は＜３０歳（第１群）、その他＞４０歳であった（第２群））から生物学的試料を週に３回採取した。試料採取は、月経周期の終了の２日後に開始し、次の開始時に終了した。動物の走化性応答と卵胞期および排卵周辺期の両方との間に正の相関が観察された（図１、パネル（Ｃ）～（Ｄ））。エストラジオール放出のピークは前者の段階を特徴付ける一方、卵胞刺激（ＦＳＨ）および黄体形成（ＬＨ）ホルモンのレベルは、後者の間に速やかに上昇する。同様に、正のＣＩは、プロゲステロンピークに関連するエストロゲン放出の第２波を特徴とする、黄体中期に測定された。興味深いことに、加齢に伴うホルモン放出の十分に確立された変化と一致して、排卵前ピークの形状は、第２群（高齢女性）と比較して第１群（若年女性）内でより狭かった。
【0076】
これらの所見は、対照尿試料に対するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の回避行動が月経周期によってどのように強く影響を受けるかを実証している。このようなホルモン依存的行動は以前に報告されておらず、データの解釈を非常に複雑にしている。後続の分析では、偽陽性の結果を回避するために、２つの比較的狭くかつ特定の時間窓の間、すなわち、期間終了の数日後または卵胞期および黄体期の間に生殖可能な女性の試料を採取した。
【表1】
【0077】
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、乳がんを有する女性からの尿試料によって誘引されるが、対照試料は回避する
３つのコホートをこの試験に登録した：第１群は、表１に報告されるように、原発性乳がん（ｂｃ）と診断された３８～９２歳の３６人の女性を含んだ；第２群は、３６人の見かけ上健康で同年齢の女性（ｈｄ）によって構成された；第３の小規模コホートは、非定型乳管過形成（ａｔ）を有する５人の対象を含んだ。前述の考察に基づいて、受精能力のある女性からの試料を月経期の終了の２日後に採取した。
３つのコホートをこの試験に登録した：第１群は、表１に報告されるように、原発性乳がん（ｂｃ）と診断された３８～９２歳の３６人の女性を含んだ；第２群は、３６人の見かけ上健康で同年齢の女性（ｈｄ）によって構成された；第３の小規模コホートは、非定型乳管過形成（ａｔ）を有する５人の対象を含んだ。前述の考察に基づいて、受精能力のある女性からの試料を月経期の終了の２日後に採取した。
【0078】
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の走化性行動に対するがん由来の生物学的試料の用量依存的効果を示す以前のデータと一致させて、本発明者らはいくつかの濃度の尿を試験し、乳がん試料に対する最大の誘引、ならびに対照に対するより大きな回避が、１０－１の希釈でピークに達したことを見出した（図２Ｆ）。集団アッセイは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が、乳がんを有する女性から採取された試料に対して有意な選好性を示す一方、対照尿は回避応答を与える化学忌避剤として振る舞うことを示した（＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ、事後テューキーのＨＳＤ）（図１Ｅおよび図２Ｆ）。個体を「罹患」（すなわち、感度）または「非罹患」（すなわち、特異度）として分類する試験の能力は、それぞれ７８％および９５％であった。非定型乳管過形成試料に対して得られたＣＩはまた、この群の試料サイズがいかなる統計分析も可能にしないものであるけれども、平均して正であった。２人の喫煙者では、１週間の禁煙後にも分析を行ったが、全体的な応答に変化はなく、これは喫煙によって影響を受けないことを示している。これらのデータは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の雌雄同体が乳がん尿を検出し、それらを比較的高い特異度および感度で対照試料と識別することができることを示す以前の知見を裏付け、拡張する。
【0079】
ＡＷＣニューロンの活性の分析は、がんスクリーニングにおける精度を大きく改善する
走化性は、いくつかの化学感覚ニューロンからの上流シグナルの統合の下流での結果である。走化性アッセイの結果は、例えば、温度、湿度および／または機械的誘惑に由来し得る、任意の性質の干渉刺激の存在によって変化し得る。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ががん代謝産物を知覚するか否か、およびどの精度で知覚するかを効果的に決定するために、カルシウムイメージングは、他のニューロンによって感知される同時のキューの存在に関係なく、リガンドによって活性化された上流の嗅覚ニューロンの活性を直接記録することを可能にするので、強力なツールであることが判明している。アブレーション、行動アッセイ、カルシウムイメージング、および電子顕微鏡写真によるＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の神経嗅覚回路の解剖図は、ＡＷＡ、ＡＷＢ、およびＡＷＣと呼ばれる翼毛を有する嗅覚感覚ニューロンの３つの主要ペアの存在を示す。ＡＷＡおよびＡＷＣは揮発性臭気物質に対する誘引を媒介するが、ＡＷＢは反発性化合物に対して主に応答する。２つのＡＷＣニューロンは、構造的に類似しているが機能的に異なる：ＡＷＣＯＮニューロンは、化学受容体コード遺伝子ｓｔｒ－２を発現し、それを欠くＡＷＣＯＦＦは、代わりに代替の化学受容体遺伝子ｓｒｓｘ－３を発現する。結果として、ＡＷＣＯＮニューロンは２－ブタノンおよびアセトンを感知する一方、ＡＷＣＯＦＦニューロンは２－３ペンタンジオンを感知する。この遺伝的および機能的非対称性は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の臭気識別において基本的であり、がん感知において極めて重要な役割を果たす可能性がある。ＡＷＣ嗅覚ニューロンは、臭気除去によって活性化され、誘引剤の持続的存在下で阻害される。臭気物質への３０分間の曝露後、適応が起こり、走化性応答が抑止される。別のニューロンの結果は、健康な対象から採取された尿試料に対する回避行動を媒介するための良好な候補である：ＡＳＨ、嫌悪刺激に関連すると報告されているポリモーダルニューロン。これらのニューロンはすべて、線虫の頭部に位置する（図２Ａの３Ｄ再構成を参照）。嗅覚ニューロンは、刺激源に向かうまたは刺激源から離れる動きを開始する運動ニューロンに作用するいくつかの介在ニューロンにシナプス結合する（図２、パネルＢ）。
走化性は、いくつかの化学感覚ニューロンからの上流シグナルの統合の下流での結果である。走化性アッセイの結果は、例えば、温度、湿度および／または機械的誘惑に由来し得る、任意の性質の干渉刺激の存在によって変化し得る。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ががん代謝産物を知覚するか否か、およびどの精度で知覚するかを効果的に決定するために、カルシウムイメージングは、他のニューロンによって感知される同時のキューの存在に関係なく、リガンドによって活性化された上流の嗅覚ニューロンの活性を直接記録することを可能にするので、強力なツールであることが判明している。アブレーション、行動アッセイ、カルシウムイメージング、および電子顕微鏡写真によるＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の神経嗅覚回路の解剖図は、ＡＷＡ、ＡＷＢ、およびＡＷＣと呼ばれる翼毛を有する嗅覚感覚ニューロンの３つの主要ペアの存在を示す。ＡＷＡおよびＡＷＣは揮発性臭気物質に対する誘引を媒介するが、ＡＷＢは反発性化合物に対して主に応答する。２つのＡＷＣニューロンは、構造的に類似しているが機能的に異なる：ＡＷＣＯＮニューロンは、化学受容体コード遺伝子ｓｔｒ－２を発現し、それを欠くＡＷＣＯＦＦは、代わりに代替の化学受容体遺伝子ｓｒｓｘ－３を発現する。結果として、ＡＷＣＯＮニューロンは２－ブタノンおよびアセトンを感知する一方、ＡＷＣＯＦＦニューロンは２－３ペンタンジオンを感知する。この遺伝的および機能的非対称性は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の臭気識別において基本的であり、がん感知において極めて重要な役割を果たす可能性がある。ＡＷＣ嗅覚ニューロンは、臭気除去によって活性化され、誘引剤の持続的存在下で阻害される。臭気物質への３０分間の曝露後、適応が起こり、走化性応答が抑止される。別のニューロンの結果は、健康な対象から採取された尿試料に対する回避行動を媒介するための良好な候補である：ＡＳＨ、嫌悪刺激に関連すると報告されているポリモーダルニューロン。これらのニューロンはすべて、線虫の頭部に位置する（図２Ａの３Ｄ再構成を参照）。嗅覚ニューロンは、刺激源に向かうまたは刺激源から離れる動きを開始する運動ニューロンに作用するいくつかの介在ニューロンにシナプス結合する（図２、パネルＢ）。
【0080】
異なるタイプの固形腫瘍からの多様な生物学的試料に対して誘引を媒介する際のＡＷＣＯＮの主要な役割およびＡＷＡのマイナーなものが近年示されている。どのニューロンが尿試料に対する走化性行動に関与するかをよりよく理解するために、がんおよび対照試料を用いた刺激に対する応答におけるＡＷＡ、ＡＷＢ、ＡＷＣおよびＡＳＨの活性を記録した。これを行うために、目的のニューロン上にカルシウムインジケータ、具体的にはＧＣａＭＰ３（環状に並べられた緑色蛍光タンパク質－カルモジュリン－Ｍ１３ペプチドバージョン３）を発現するトランスジェニックワームを使用した。これらの動物を、野生型Ｎ２株との機能的同等性を実証するために、周知の誘引性臭気物質の選択されたパネルに対してチャレンジする（データは示さず）。次いで、強い負の走化性指数（ニューロンが嫌悪刺激を感知する場合）または強い正の走化性指数（ニューロンが誘引剤を感知する場合）のいずれかに関連付けられる化学物質に対する前述のニューロンの応答を試験した。走化性アッセイにおいて複数回陰性と試験された尿試料を、ＡＷＢおよびＡＳＨニューロンの応答を評価する間、強い反発の基準として使用した。アッセイにおいて複数回陽性と試験された尿試料を、ＡＷＣおよびＡＷＡニューロンの誘引の基準として使用した。図２のパネルＣは、４つの候補ニューロンのうちの３つからの典型的な応答を示す。ＡＷＣニューロンと比較した場合、その役割が二次的であり、信頼性が低く、冗長であるＡＷＡニューロンを除外した。さらに、ＡＷＡニューロンは、ＡＷＣと共通の２つの受容体を有するＡＷＣニューロン上のもの（２２）と比較すると、より少ない数（９）の化学受容体を発現する：これにより、それは、一連の化学物質に対してより少ない感受性になる。ＡＷＢニューロンからの応答は、誘引剤または忌避剤の添加または除去のいずれとも相関しないようであるが（実験中にカルシウム関連の動態を示すが）、ＡＳＨニューロンは誘引剤または忌避剤の除去／添加のいずれに対しても応答しない。ＡＷＣＯＮニューロンは、代わりに、がん尿の添加中に強い過分極を示し、その除去時にステレオタイプな様式で強い脱分極を示すが、健康な対照試料ではサイレントであることが多い。乳がん代謝産物の認識におけるＡＷＣの役割をさらに実証するために、両方のＡＷＣニューロンを遺伝的に除去したＰＹ７５０２株に対して走化性アッセイを行った。走化性応答は、アッセイプレート上の集団密度によって影響を受けることが公知であるので、ＡＷＣ除去された動物の臭気選好性を、最も有益ながん尿試料のうちの３つ（すなわち、より高いＣＩに関連付けられるもの）を使用することによって、集団および単一ワームアッセイの両方で試験する。予想されるように、かつ以前の知見と一致して、得られたデータは、ＡＷＣ除去された線虫ががん代謝産物を感知する能力が低下していることを示しており（＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）、この行動を媒介する際のＡＷＣアンフィドニューロンの必須の役割を示している（図２、パネルＤ）。まとめると、これらの結果は、ＡＷＣＯＮニューロンががんの生物流体に対する誘引を駆動する際に決定的な役割を果たすことを示唆している。しかしながら、このニューロンは誘引に関連付けられるため、線虫によって感知される反発を説明することができない。特定の化学物質を差し引いたときにＡＷＣＯＮニューロンの活性化を介して応答するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の全体的な傾向を測定するために、ニューロン活性化指数（ＮＡＩ）として示される新しい指数が本発明者らによって定義された：
ＮＡＩ＝２（Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔ－０．５）（１）
ここで、Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である。この定義は、指数を強制的に－１～１の範囲にし、走化性指数との直接的な比較を可能にする（詳細については方法を参照）。
ＮＡＩ＝２（Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔ－０．５）（１）
ここで、Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である。この定義は、指数を強制的に－１～１の範囲にし、走化性指数との直接的な比較を可能にする（詳細については方法を参照）。
【0081】
線虫の感受性が最大化される尿希釈の最適範囲を定義するために、走化性アッセイにおいて高い正および負の指数の両方を誘発する、様々な濃度の試料サブセット（１０－１～１０－５、純粋な試料は、尿ｐＨが線虫の選好性を干渉し得るので、廃棄される）を試験した。除去時の活性化率を最大化する値は１０－２（陽性試料に対して８３．３３％の活性化率）である。この値では、陽性および対照試料の活性化率の間のコントラストも、考慮された範囲に対して最良のものである（図２、パネルＥ）。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ががん尿試料を対照試料からどのように認識するかを決定するために、対照試料に対する刺激時間の長さの関数としてのＡＷＣのニューロン活性化指数を調べた。ＡＷＣ活性化率および対照試料に対する対応するＮＡＩの測定を、刺激時間の長さの関数として記録した（図２Ｇ）。ＮＡＩ値は、より長い時間にわたって提示された刺激が試験された線虫の過半数において誘引的な応答をどのように誘発するかを強調するが、より短い時間窓は、収集されたＡＷＣトレースの大部分からの応答がないことに関連付けられる。これは、ＡＷＣニューロンの活性化を誘発する代謝産物が、がん患者からの試料よりもむしろ対照試料中であまり濃縮されていないことを示唆している。カルシウムイメージングのハイスループット実験のために、複数の線虫からのニューロン活性を同時に記録した。（図３（Ａ～Ｂ））のパルスアリーナに基づく設計を用いた全液体環境を有するカスタム設計のマイクロ流体デバイスに線虫をロードした。結果を、乳がんを有する３６人の女性および３６人の健康な対象に対して取得した。各試料は、最低２５匹のワームが臭気物質に曝露された、少なくとも２つの異なるセッションで試験されている。これは、最低５０匹の線虫を検討して、各々の患者に対して報告されるＮＡＩが得られることを意味する。図３のパネル（Ｃ～Ｄ）は、両方の群の１つの試料に対して得られた典型的なトレースを示す。ＮＡＩを計算するために、ＡＷＣＯＮニューロンにおける有意な活性化事象の体系的特定のための規則も定義された。これを行うために、ビデオから蛍光トレースを抽出し、それらを評価するカスタムスクリプトを用いた。図４は、例示的な画像の後処理プロセスのパイプラインを示す。さらなる詳細は、方法の関連するセクションに報告されている。
【0082】
図５のパネルＡは、各試料に対して得られたＮＡＩ（左）およびＣＩ（右）を報告する棒グラフを示す。予想されるように、カルシウムイメージングにより得られたＮＡＩには明らかな傾向がある：がん試料は正のＮＡＩに関連付けられるが、健康な対象は負のＮＡＩを有し、これは第１の群が第２の群とは対照的にＡＷＣＯＮニューロンの活性化を誘発し、これがニューロンにおいて化学的応答を同じ頻度で誘因しないことを意味する。さらに、測定されたＮＡＩは、走化性アッセイで得られた結果、およびＡＷＣＯＮニューロンが化学的誘引を媒介し、正のＣＩに寄与するという仮定と一致する。両方の指数を考慮したＰＣＡ分析（パネルＢ）は、総分散の９０．９７％を説明する第１の成分を示す。さらに、ＮＡＩは、第１の成分の９７．３１％超に寄与し、識別器としてのその有意性を強調している。ＣＩ、ＮＡＩおよびＰＣ１（パネルＣ、それぞれ上から下へ）の分布を見ると、２つの指数（ＰＣ１として）の線形結合の使用は、ＮＡＩの指数の０を中心とする値のみの除去に寄与する。これはおそらく、ＮＡＩがＣＩの忌避された線虫を説明する対応するＮ－項を欠いているという事実に起因する。これは、誘引の検出をより敏感にする一方で、応答の欠如および反発の間を区別することができない。ＮＡＩを反発も考慮に入れた量と線形結合することにより、ＮＡＩ分布に現れる０を中心とする値を、０に近いが正の値に移動させることができる。カルシウムイメージング実験に関連する精度（９７．１８％）は、走化性によって得られたもの（８５．９２％）よりも有意に高い。精度は、検査された症例の総数の中の真陽性および真陰性の割合として定義される。ＲＯＣ曲線も同様に、ＮＡＩ指数がＣＩよりも試料の２つの群間（パネルＤ）を識別するために、どれだけより良い記述子であるかを示している。さらに、ＮＡＩ指数は、がん群の尿試料を健康なものと識別する際に、より高い精度を伴う。ＡＷＣＯＮニューロンに対してのみ評価されるＮＡＩの精度が走化性指数に関連付けられるものよりも高いという事実は、このニューロンが尿試料に対して誘引を媒介するのに主な役割を果たすという仮説を支持する。これが真であるためには、誘引を誘発する尿試料は、ＡＷＣ上の受容体と相互作用することを可能にする濃度で化学物質を含有しなければならない。これは、その受容体ががん関連代謝産物の結合基質としての良好な候補であることを意味し、相互作用する代謝産物およびそれらの相対的存在量に対して物理化学的制約をもたらす。一方、ＡＷＣＯＮニューロンに関連する高い精度はまた、健康な試料および陽性のものの間を識別するために化学的回避が必要でないことを証明している。しかしながら、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、単にそれらに対する誘引を示さないのではなく、陰性試料から遠ざかる。これは、測定された走化性指数に寄与し、相補的な様式で作用する、同時に起こる機構（まだ特定されていない）が存在することを示唆している。
【0083】
がん試料に対する誘引に関与するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＧＰＣＲの同定。
ＡＷＡおよびＡＷＣニューロンペアが揮発性臭気物質に対して正の走化性応答を媒介することは十分に確立されており、がん尿に対する優勢な応答は正の走化性であるので、本発明者らは、少なくとも１つのがん代謝産物の受容体がＡＷＡおよび／またはＡＷＣニューロンで発現されると仮定した。この仮説を試験し、がん尿代謝産物の感知に関与する推定ＧＰＣＲを同定するために、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＡＷＣ／ＡＷＡ－ＧＰＣＲ変異体の小規模パイロットスクリーニングを走化性アッセイによって行った（表２）。変異株を２つのがん尿試料に曝露した。両方の試料に対して野生型動物のＣＩと比較して有意に減少したＣＩを示すものは、推定上のがん感知ＧＰＣＲと考えられるべきである。ＡＷＣニューロンで発現される個々のＧＰＣＲを欠失した変異株を観察した。５つの変異株を試験した。それらのうちの３つ、ｓｒａ－１３（ｚｈ１３）、ｓｔｒ－２（ｏｋ３１４８）およびｓｔｒ－１３０（ｇｋ９４８５９９）は、Ｎ２と比較して有意に低いＣＩをもたらし、乳がん尿試料に対する応答におけるこれらの受容体の関与を示唆した（図６）。これらの遺伝子の中で、ｓｔｒ－２およびｓｔｒ－１３０はＡＷＣニューロンで排他的に発現される一方、ｓｒａ－１３はＡＷＡおよびＡＷＣニューロンの両方で発現される（表２）。変異株ｓｒｓｘ－５（ｇｋ９６０５７８）およびｓｔｒ－１９９（ｇｋ９４９５４２）は、野生型のものと同様のＣＩをもたらしたので、乳がん代謝産物の受容体の可能性として考慮されなかった（図６）。元の変異誘発スクリーニング中に挿入されたオフターゲット変異の存在の可能性を排除するために、これらの２つの変異株も対照試料を用いて試験した。得られたデータは、これらのＫＯワームが対照動物として振る舞うことを実証し、ＳＲＳＸ－５およびＳＴＲ－１９９がＢＣ臭気物質の感知に関与しないことを確認した（図５Ｅ）。ｓｒｔ－２６（ｇｋ９４７９４０）およびｓｒｉ－１４（ｏｋ２８６５）の２つの株は、前者については、ＷｏｒｍＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ＷＳ２７３に記載されているように、欠失領域が偽遺伝子を包含し、後者は、スラッシングアッセイ（詳細はセクションを参照）で運動障害を呈し、正常な運動性が行われる必要がある走化性アッセイの適切な遂行を妨げるため、試験することができなかった。元の変異誘発スクリーニング中に生じたオフターゲット効果を排除することはできないが、この知見は、運動を制御するニューロンにおけるｓｒｉ－１４遺伝子の予想外の発現を強調し得ることに注目する価値がある。第２の例では、尿試料に対する応答におけるＡＷＡニューロンのより低い性能にもかかわらず、ｓｒａ－１３（ｚｈ１３）変異体で観察された結果は、そのようなニューロンの推定上の寄与を示唆しており、したがって、ＡＷＡ－ＧＰＣＲ欠失変異体のさらなる分析を含めた。本発明者らは、２つの市販の株、すなわちｓｒａ－１７ｖｅ５１１［ＬｏｘＰ＋ｍｙｏ－２：：ＧＦＰ＋ＮｅｏＲ＋ＬｏｘＰ）］およびｏｄｒ－１０（ｋｙ２２５）を試験した。興味深いことに、両方の株は、Ｎ２と比較してがんの尿に対して有意に減少したＣＩを示した（図６）。この結果は、ＡＷＡニューロンのカルシウム応答がそれほど強力ではないにもかかわらず、そのようなニューロン上の受容体が乳がん代謝産物の認識において役割を有する可能性があり、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の嗅覚系の根底にある複雑さを裏付けていることを示唆している。本明細書で分析された受容体をコードする遺伝子に関する主な情報を表２に要約する。
ＡＷＡおよびＡＷＣニューロンペアが揮発性臭気物質に対して正の走化性応答を媒介することは十分に確立されており、がん尿に対する優勢な応答は正の走化性であるので、本発明者らは、少なくとも１つのがん代謝産物の受容体がＡＷＡおよび／またはＡＷＣニューロンで発現されると仮定した。この仮説を試験し、がん尿代謝産物の感知に関与する推定ＧＰＣＲを同定するために、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＡＷＣ／ＡＷＡ－ＧＰＣＲ変異体の小規模パイロットスクリーニングを走化性アッセイによって行った（表２）。変異株を２つのがん尿試料に曝露した。両方の試料に対して野生型動物のＣＩと比較して有意に減少したＣＩを示すものは、推定上のがん感知ＧＰＣＲと考えられるべきである。ＡＷＣニューロンで発現される個々のＧＰＣＲを欠失した変異株を観察した。５つの変異株を試験した。それらのうちの３つ、ｓｒａ－１３（ｚｈ１３）、ｓｔｒ－２（ｏｋ３１４８）およびｓｔｒ－１３０（ｇｋ９４８５９９）は、Ｎ２と比較して有意に低いＣＩをもたらし、乳がん尿試料に対する応答におけるこれらの受容体の関与を示唆した（図６）。これらの遺伝子の中で、ｓｔｒ－２およびｓｔｒ－１３０はＡＷＣニューロンで排他的に発現される一方、ｓｒａ－１３はＡＷＡおよびＡＷＣニューロンの両方で発現される（表２）。変異株ｓｒｓｘ－５（ｇｋ９６０５７８）およびｓｔｒ－１９９（ｇｋ９４９５４２）は、野生型のものと同様のＣＩをもたらしたので、乳がん代謝産物の受容体の可能性として考慮されなかった（図６）。元の変異誘発スクリーニング中に挿入されたオフターゲット変異の存在の可能性を排除するために、これらの２つの変異株も対照試料を用いて試験した。得られたデータは、これらのＫＯワームが対照動物として振る舞うことを実証し、ＳＲＳＸ－５およびＳＴＲ－１９９がＢＣ臭気物質の感知に関与しないことを確認した（図５Ｅ）。ｓｒｔ－２６（ｇｋ９４７９４０）およびｓｒｉ－１４（ｏｋ２８６５）の２つの株は、前者については、ＷｏｒｍＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ＷＳ２７３に記載されているように、欠失領域が偽遺伝子を包含し、後者は、スラッシングアッセイ（詳細はセクションを参照）で運動障害を呈し、正常な運動性が行われる必要がある走化性アッセイの適切な遂行を妨げるため、試験することができなかった。元の変異誘発スクリーニング中に生じたオフターゲット効果を排除することはできないが、この知見は、運動を制御するニューロンにおけるｓｒｉ－１４遺伝子の予想外の発現を強調し得ることに注目する価値がある。第２の例では、尿試料に対する応答におけるＡＷＡニューロンのより低い性能にもかかわらず、ｓｒａ－１３（ｚｈ１３）変異体で観察された結果は、そのようなニューロンの推定上の寄与を示唆しており、したがって、ＡＷＡ－ＧＰＣＲ欠失変異体のさらなる分析を含めた。本発明者らは、２つの市販の株、すなわちｓｒａ－１７ｖｅ５１１［ＬｏｘＰ＋ｍｙｏ－２：：ＧＦＰ＋ＮｅｏＲ＋ＬｏｘＰ）］およびｏｄｒ－１０（ｋｙ２２５）を試験した。興味深いことに、両方の株は、Ｎ２と比較してがんの尿に対して有意に減少したＣＩを示した（図６）。この結果は、ＡＷＡニューロンのカルシウム応答がそれほど強力ではないにもかかわらず、そのようなニューロン上の受容体が乳がん代謝産物の認識において役割を有する可能性があり、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の嗅覚系の根底にある複雑さを裏付けていることを示唆している。本明細書で分析された受容体をコードする遺伝子に関する主な情報を表２に要約する。
【表2】
【0084】
考察
がん特異的な臭気シグネチャを有する生物流体である尿に対して応答することによって、乳がんと診断された対象および健康な対照の間を効率的に識別するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の能力が本明細書で報告されている。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が尿中でがんの匂いを検出することを示す最も強い証拠は、走化性アッセイおよびカルシウムイメージング分析で観察される線虫の二成分行動にある。実際、本発明者らは、がん対象からの尿が誘引を誘導する一方で、回避が対照試料に対して観察されたことを離散精度（～９７．１８％）で測定した。本明細書のデータは、線虫の応答が女性ホルモン周期に依存することを示しており、以前に報告されていない現象である。これらの知見によれば、診断の状況という文脈において、偽陽性の結果を回避するために、受精能力のある女性からの尿試料の採取のための２つの好ましい特定の時間窓、すなわち、期間の終了の数日後または卵胞期および黄体期の間の時間窓が本明細書で特定された。遺伝的分析により、この行動に関与する感覚ニューロン、ならびにがん代謝産物の結合に関与する個々のＧＰＣＲを同定することが可能になった。ＡＷＣニューロンを欠く変異株（ＡＷＣ破壊株）を用いた走化性アッセイは、がん尿試料に対する誘引におけるＡＷＣ嗅覚ニューロンの関与を暗示した。ｃｅｈ－３６の変異は第２の化学感覚ニューロンであるＡＳＥに影響を及ぼすが、ＡＳＥは水溶性代謝産物に対する味覚応答に関与するため、がん尿の感知におけるその寄与を確認できなかった。この種類の分子に対する応答を測定するために、異なる走化性アッセイプロトコルが必要とされる。実験を１時間の期間にわたって行ったが、これは、水溶性分子がプレート上に拡散し、ワームによって検出されるのに十分な時間ではない。１時間の長さの走化性アッセイは、揮発性成分が拡散し、感知されるのに十分である。これらの状況下で、本発明者らは、がん尿の感知におけるＡＳＥニューロンの役割を定義することができなかった。それにもかかわらず、ｃｅｈ－３６変異体は、がん尿および対照試料の間を識別するいくらかの能力を保持し、ＡＷＣががんの匂いを検出する唯一のニューロンではないことを示唆した。可能な寄与は、揮発性分子に対する誘引にも関与する別の嗅覚ニューロンＡＷＡに由来する可能性がある。しかしながら、カルシウムイメージング分析は、尿試料に対する応答において、ＡＷＣに対してこのニューロンの低いロバスト性および正確性が低い活性を示した。この応答の分子的基礎をさらに調査するために、臭気感知に関与するＧタンパク質共役受容体の役割を調べた。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の感覚ニューロンは、１つのニューロンが１種類の受容体のみを発現する哺乳動物ニューロンとは対照的に、いくつかのＧタンパク質共役受容体を発現する。ＡＷＣニューロンは、未知の機能を有する２０を超える異なる種類のＧタンパク質共役受容体を発現する。ＡＷＣ特異的ＧＰＣＲノックアウト変異体を使用する走化性アッセイは、これらのＧＰＣＲのうちの３つ、すなわちｓｔｒ－２、ｓｔｒ－１３０およびｓｒａ－１３の関与を示し、がん関連分子の認識におけるこれらの受容体の役割を示唆した。ＡＷＡニューロンは、ＡＷＣで発現される嗅覚受容体のおよそ半分の量を発現する。これにより、結合候補分子の数が少なくなり、ニューロンが尿に対して応答する確率が低くなり得る。しかしながら、どちらもＡＷＡで発現されるｏｄｒ－１０およびｓｒａ－１７の欠失を有するワームは、がん尿に対する誘引に欠陥があり、ＡＷＡ嗅覚ニューロンもがんの匂いの誘引に関与していることを暗示している。注目すべきことに、がん代謝産物に対する走化性の根底にある分子機構は、複数の分子によって発揮される可能性のある相乗効果のために、より複雑であると予測される。さらに、分析は、ノックアウト変異体がＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ）で既に入手可能なＧＰＣＲに限定した。さらなる受容体の寄与を調査するために、今後の研究は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を介してＡＷＣおよび／またはＡＷＡ感覚ニューロンで発現されるＧＰＣＲをコードする遺伝子の新規ヌル変異体を生成することが対象となるであろう。尿回避行動の制御はまた、Ｇタンパク質シグナル伝達経路を必要とするはずである。しかしながら、揮発性分子に対する反発を媒介する主要なニューロンである、ＡＳＨおよびＡＷＢニューロンは、対照の尿からの回避を誘導するようには見えない。実際、動物を対照試料に曝露した場合、それらのニューロン動態は信頼できない。対照試料からの回避応答は、いくつかの感覚ニューロンを含む複雑なニューロン相互作用の結果であり得、ＧＰＣＲの可能性のある共発現およびヘテロ二量体化に関連する高度なシグナル伝達装置であり得、がん誘引行動に関してより状況依存的であり得る。化学受容体発現における生化学的複雑さは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）神経系の神経解剖学的単純さおよびその低い可塑性を釣り合わせる進化的適応機構であり得る。結果として、この複雑さは、単一の嗅覚ニューロンの役割に取り組み、対応するニューロンの全体的な機能における受容体コンプレックスおよびそれらの機構を完全に同定することをより困難にする。それにもかかわらず、ＡＷＣニューロンの目覚ましい精度（～９７．１８％）は、がん尿ブレンドが、これらのニューロン上の嗅覚受容体に強く結合する特有の相対的存在量で存在するいくつかの成分／代謝産物を含むことを示唆している。結論として、本明細書に開示される結果は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が、乳がんを有する女性から採取された尿試料中のがん関連代謝産物を感知することができることを確認する。この能力はホルモン周期に強く依存し、本発明者らはスクリーニング有効性の時間窓を特定する。応答は腫瘍の病期と相関しているようには見えない：早期段階でも検出精度は高い。本発明者らは、嗅覚ニューロンに対するカルシウムイメージングが、時間がかからないことを除けば、走化性アッセイ（８５．９％）に関してより信頼性の高い結果（９７．１８％の精度）をもたらすことを実証する。本発明者らは、カルシウムイメージングを通して、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のがん識別行動の主な要因はＡＷＣＯＮ化学感覚ニューロンであることを立証し、遺伝的スクリーニングによって関連ＧＰＣＲ受容体のセットを見出した。プロセスにおける複数のＧＰＣＲの関与は、複数の代謝産物がＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）によって感知されることを示唆している。まとめると、本発明者らの結果は、尿試料中に存在するがんの代謝トレースを調べるために、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）化学感覚回路の驚くべき精度を利用した原理証明研究を提示する。このような研究は、生物流体の単純な採取に基づいて、高い信頼性で、
乳がんの迅速かつ費用効果の高い診断スクリーニング試験を設計するのに役立ち得る。
がん特異的な臭気シグネチャを有する生物流体である尿に対して応答することによって、乳がんと診断された対象および健康な対照の間を効率的に識別するＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の能力が本明細書で報告されている。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が尿中でがんの匂いを検出することを示す最も強い証拠は、走化性アッセイおよびカルシウムイメージング分析で観察される線虫の二成分行動にある。実際、本発明者らは、がん対象からの尿が誘引を誘導する一方で、回避が対照試料に対して観察されたことを離散精度（～９７．１８％）で測定した。本明細書のデータは、線虫の応答が女性ホルモン周期に依存することを示しており、以前に報告されていない現象である。これらの知見によれば、診断の状況という文脈において、偽陽性の結果を回避するために、受精能力のある女性からの尿試料の採取のための２つの好ましい特定の時間窓、すなわち、期間の終了の数日後または卵胞期および黄体期の間の時間窓が本明細書で特定された。遺伝的分析により、この行動に関与する感覚ニューロン、ならびにがん代謝産物の結合に関与する個々のＧＰＣＲを同定することが可能になった。ＡＷＣニューロンを欠く変異株（ＡＷＣ破壊株）を用いた走化性アッセイは、がん尿試料に対する誘引におけるＡＷＣ嗅覚ニューロンの関与を暗示した。ｃｅｈ－３６の変異は第２の化学感覚ニューロンであるＡＳＥに影響を及ぼすが、ＡＳＥは水溶性代謝産物に対する味覚応答に関与するため、がん尿の感知におけるその寄与を確認できなかった。この種類の分子に対する応答を測定するために、異なる走化性アッセイプロトコルが必要とされる。実験を１時間の期間にわたって行ったが、これは、水溶性分子がプレート上に拡散し、ワームによって検出されるのに十分な時間ではない。１時間の長さの走化性アッセイは、揮発性成分が拡散し、感知されるのに十分である。これらの状況下で、本発明者らは、がん尿の感知におけるＡＳＥニューロンの役割を定義することができなかった。それにもかかわらず、ｃｅｈ－３６変異体は、がん尿および対照試料の間を識別するいくらかの能力を保持し、ＡＷＣががんの匂いを検出する唯一のニューロンではないことを示唆した。可能な寄与は、揮発性分子に対する誘引にも関与する別の嗅覚ニューロンＡＷＡに由来する可能性がある。しかしながら、カルシウムイメージング分析は、尿試料に対する応答において、ＡＷＣに対してこのニューロンの低いロバスト性および正確性が低い活性を示した。この応答の分子的基礎をさらに調査するために、臭気感知に関与するＧタンパク質共役受容体の役割を調べた。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の感覚ニューロンは、１つのニューロンが１種類の受容体のみを発現する哺乳動物ニューロンとは対照的に、いくつかのＧタンパク質共役受容体を発現する。ＡＷＣニューロンは、未知の機能を有する２０を超える異なる種類のＧタンパク質共役受容体を発現する。ＡＷＣ特異的ＧＰＣＲノックアウト変異体を使用する走化性アッセイは、これらのＧＰＣＲのうちの３つ、すなわちｓｔｒ－２、ｓｔｒ－１３０およびｓｒａ－１３の関与を示し、がん関連分子の認識におけるこれらの受容体の役割を示唆した。ＡＷＡニューロンは、ＡＷＣで発現される嗅覚受容体のおよそ半分の量を発現する。これにより、結合候補分子の数が少なくなり、ニューロンが尿に対して応答する確率が低くなり得る。しかしながら、どちらもＡＷＡで発現されるｏｄｒ－１０およびｓｒａ－１７の欠失を有するワームは、がん尿に対する誘引に欠陥があり、ＡＷＡ嗅覚ニューロンもがんの匂いの誘引に関与していることを暗示している。注目すべきことに、がん代謝産物に対する走化性の根底にある分子機構は、複数の分子によって発揮される可能性のある相乗効果のために、より複雑であると予測される。さらに、分析は、ノックアウト変異体がＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ）で既に入手可能なＧＰＣＲに限定した。さらなる受容体の寄与を調査するために、今後の研究は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を介してＡＷＣおよび／またはＡＷＡ感覚ニューロンで発現されるＧＰＣＲをコードする遺伝子の新規ヌル変異体を生成することが対象となるであろう。尿回避行動の制御はまた、Ｇタンパク質シグナル伝達経路を必要とするはずである。しかしながら、揮発性分子に対する反発を媒介する主要なニューロンである、ＡＳＨおよびＡＷＢニューロンは、対照の尿からの回避を誘導するようには見えない。実際、動物を対照試料に曝露した場合、それらのニューロン動態は信頼できない。対照試料からの回避応答は、いくつかの感覚ニューロンを含む複雑なニューロン相互作用の結果であり得、ＧＰＣＲの可能性のある共発現およびヘテロ二量体化に関連する高度なシグナル伝達装置であり得、がん誘引行動に関してより状況依存的であり得る。化学受容体発現における生化学的複雑さは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）神経系の神経解剖学的単純さおよびその低い可塑性を釣り合わせる進化的適応機構であり得る。結果として、この複雑さは、単一の嗅覚ニューロンの役割に取り組み、対応するニューロンの全体的な機能における受容体コンプレックスおよびそれらの機構を完全に同定することをより困難にする。それにもかかわらず、ＡＷＣニューロンの目覚ましい精度（～９７．１８％）は、がん尿ブレンドが、これらのニューロン上の嗅覚受容体に強く結合する特有の相対的存在量で存在するいくつかの成分／代謝産物を含むことを示唆している。結論として、本明細書に開示される結果は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が、乳がんを有する女性から採取された尿試料中のがん関連代謝産物を感知することができることを確認する。この能力はホルモン周期に強く依存し、本発明者らはスクリーニング有効性の時間窓を特定する。応答は腫瘍の病期と相関しているようには見えない：早期段階でも検出精度は高い。本発明者らは、嗅覚ニューロンに対するカルシウムイメージングが、時間がかからないことを除けば、走化性アッセイ（８５．９％）に関してより信頼性の高い結果（９７．１８％の精度）をもたらすことを実証する。本発明者らは、カルシウムイメージングを通して、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のがん識別行動の主な要因はＡＷＣＯＮ化学感覚ニューロンであることを立証し、遺伝的スクリーニングによって関連ＧＰＣＲ受容体のセットを見出した。プロセスにおける複数のＧＰＣＲの関与は、複数の代謝産物がＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）によって感知されることを示唆している。まとめると、本発明者らの結果は、尿試料中に存在するがんの代謝トレースを調べるために、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）化学感覚回路の驚くべき精度を利用した原理証明研究を提示する。このような研究は、生物流体の単純な採取に基づいて、高い信頼性で、
乳がんの迅速かつ費用効果の高い診断スクリーニング試験を設計するのに役立ち得る。
【0085】
方法
研究設計および試料採取
この研究は、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄによって承認された。試験登録前に、全参加者から書面でインフォームドコンセントを得た。中間尿試料を、ローマのＭ．Ｇ．Ｖａｎｎｉｎｉ病院での外科手術前に原発性乳がんと診断された対象（ｎ＝３６）から採取した。すべての症例が組織学的所見と相関していた。対照（ｎ＝３６）は、悪性腫瘍の申告歴のない健康な同年齢のボランティアであった。避妊薬を服用しているか、または制御されていない細菌、ウイルス、もしくは真菌感染症を有する女性と同様に、妊娠中の女性を試験登録から除外した。到着後、すべての尿試料を１５分間４℃で遠心分離し、単回使用試料として０．２ｍｌチューブに分注し、測定および分析まで－８０℃で保存した。実験の当日に、尿試料をカルシウムイメージング用のＳ－Ｂａｓａｌまたは走化性アッセイ用の水のいずれかに希釈した。１：１００希釈物をカルシウムイメージング測定に使用する一方、１：１０希釈物を臭気スクリーニング走化性アッセイに利用した。すべての希釈物を濾過した後、動物に提示した。
研究設計および試料採取
この研究は、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄによって承認された。試験登録前に、全参加者から書面でインフォームドコンセントを得た。中間尿試料を、ローマのＭ．Ｇ．Ｖａｎｎｉｎｉ病院での外科手術前に原発性乳がんと診断された対象（ｎ＝３６）から採取した。すべての症例が組織学的所見と相関していた。対照（ｎ＝３６）は、悪性腫瘍の申告歴のない健康な同年齢のボランティアであった。避妊薬を服用しているか、または制御されていない細菌、ウイルス、もしくは真菌感染症を有する女性と同様に、妊娠中の女性を試験登録から除外した。到着後、すべての尿試料を１５分間４℃で遠心分離し、単回使用試料として０．２ｍｌチューブに分注し、測定および分析まで－８０℃で保存した。実験の当日に、尿試料をカルシウムイメージング用のＳ－Ｂａｓａｌまたは走化性アッセイ用の水のいずれかに希釈した。１：１００希釈物をカルシウムイメージング測定に使用する一方、１：１０希釈物を臭気スクリーニング走化性アッセイに利用した。すべての希釈物を濾過した後、動物に提示した。
【0086】
ワーム培養および株
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＯＰ５０を食物源として播種した線虫増殖培地（ＮＧＭ）プレート上で、カエノラブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）株を２０℃で培養した（Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９７４）。この研究のために使用した野生型動物は、ＶＣ２１２３：ｓｒｉ－１４（ｏｋ２８６５）、ＣＸ３４１０：ｏｄｒ－１０（ｋｙ２２５）、ＡＨ１５９：ｓｒａ－１３（ｚｈ１３）、ＲＧ３０１１：ｓｒａ－１７（ｖｅ５１１［ＬｏｘＰ＋ｍｙｏ－２：：ＧＦＰ＋ＮｅｏＲ＋ＬｏｘＰ）］ＩＩ、ＶＣ２０４３５：ｓｒｔ－２６（ｇｋ９４７９４０）、ＶＣ３０１５１：ｓｒｓｘ－５（ｇｋ９６０５７８）、ＶＣ１０１２９：ｓｔｒ－１９９（ｇｋ９４９５４２）、ＶＣ４０３８９：ｓｔｒ－１３０（ｇｋ９４８５９９）、ＲＢ２３１６：ｓｔｒ－２（ｏｋ３１４８）を含むいくつかの欠失変異株と共にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手したＢｒｉｓｔｏｌ Ｎ２株であった。ＡＷＣＯＮニューロンにＧＣａＭＰを有する株は、ＰＳ６３７４：ＡＷＣＯＮ－ＧＣａＭＰ ｓｙＥｘ１２４０［ｓｔｒ－２：：ＧＣａＭＰ３＋ｐｈａ－１］；ｐｈａ－１（ｅ２１２３ｔｓ）；ｈｉｍ－５（ｅ１４９０）であり、Ｄｒ Ａｌｏｎ Ｚａｓｌａｖｅｒ（Ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌのご厚意により提供された。ＡＷＣ破壊株：ＰＹ７５０２、ｏｙＩｓ８５［ｃｅｈ－３６ｐ：：ＴＵ８１３
＋ｃｅｈ－３６ｐ：：ＴＵ８１４＋ｓｒｔｘ－１ｐ：：ＧＦＰ＋ｕｎｃ－１２２ｐ：：ＤｓＲｅｄ］）は、Ｄｒ Ａｒａｎｔｚａ Ｂａｒｒｉｏｓ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ）のご厚意により提供された。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＯＰ５０を食物源として播種した線虫増殖培地（ＮＧＭ）プレート上で、カエノラブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）株を２０℃で培養した（Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９７４）。この研究のために使用した野生型動物は、ＶＣ２１２３：ｓｒｉ－１４（ｏｋ２８６５）、ＣＸ３４１０：ｏｄｒ－１０（ｋｙ２２５）、ＡＨ１５９：ｓｒａ－１３（ｚｈ１３）、ＲＧ３０１１：ｓｒａ－１７（ｖｅ５１１［ＬｏｘＰ＋ｍｙｏ－２：：ＧＦＰ＋ＮｅｏＲ＋ＬｏｘＰ）］ＩＩ、ＶＣ２０４３５：ｓｒｔ－２６（ｇｋ９４７９４０）、ＶＣ３０１５１：ｓｒｓｘ－５（ｇｋ９６０５７８）、ＶＣ１０１２９：ｓｔｒ－１９９（ｇｋ９４９５４２）、ＶＣ４０３８９：ｓｔｒ－１３０（ｇｋ９４８５９９）、ＲＢ２３１６：ｓｔｒ－２（ｏｋ３１４８）を含むいくつかの欠失変異株と共にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手したＢｒｉｓｔｏｌ Ｎ２株であった。ＡＷＣＯＮニューロンにＧＣａＭＰを有する株は、ＰＳ６３７４：ＡＷＣＯＮ－ＧＣａＭＰ ｓｙＥｘ１２４０［ｓｔｒ－２：：ＧＣａＭＰ３＋ｐｈａ－１］；ｐｈａ－１（ｅ２１２３ｔｓ）；ｈｉｍ－５（ｅ１４９０）であり、Ｄｒ Ａｌｏｎ Ｚａｓｌａｖｅｒ（Ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌのご厚意により提供された。ＡＷＣ破壊株：ＰＹ７５０２、ｏｙＩｓ８５［ｃｅｈ－３６ｐ：：ＴＵ８１３
＋ｃｅｈ－３６ｐ：：ＴＵ８１４＋ｓｒｔｘ－１ｐ：：ＧＦＰ＋ｕｎｃ－１２２ｐ：：ＤｓＲｅｄ］）は、Ｄｒ Ａｒａｎｔｚａ Ｂａｒｒｉｏｓ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ）のご厚意により提供された。
【0087】
行動アッセイ
走化性アッセイのために、１０匹の成体雌雄同体を、ＯＰ５０ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を播種した新鮮なＮＧＭプレート上にピックした。ワームを５時間放置して卵を産ませ、次いでプレートから取り出した。卵を２０℃でインキュベートし、４日後に成体を試験のために使用した。走化性アッセイを、わずかな修正を加えて、以前に記載されたように（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９９３）行った。簡潔には、１１ｍｌの改変ＮＧＭ（２％寒天、５ｍＭ ＫＰＯ４［ｐＨ６］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）を含有する１０ｃｍペトリ皿を使用してアッセイプレートを調製した。成体ワームをＳ－ｂａｓａｌで２回、蒸留水中で１回洗浄し、アッセイを開始する直前におよそ５０～１００匹のワームをプレートの中央に置いた。プレートを対照および臭気物質領域と称される４つの四分円に分割した（図１Ａ）。対照領域は１μｌの中性緩衝液を含有した一方、
臭気物質領域は、ｍｉｌｌｉＱ水に１：１０で希釈した１μｌの対照またはがんの尿試料のいずれかを含んだ。ワームが領域に到達したら固定化するために、１マイクロリットルの１Ｍ ＮａＮ３を各スポットに適用した。６０分後、動物を計数し、走化性指数（ＣＩ）を以下のように計算した：（臭気物質領域の動物の数）－（対照領域の動物の数）／試験した動物の総数。アッセイ再現性を確実にするために、別々の走化性プレート上、３連で走化性アッセイを行った。
走化性アッセイのために、１０匹の成体雌雄同体を、ＯＰ５０ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を播種した新鮮なＮＧＭプレート上にピックした。ワームを５時間放置して卵を産ませ、次いでプレートから取り出した。卵を２０℃でインキュベートし、４日後に成体を試験のために使用した。走化性アッセイを、わずかな修正を加えて、以前に記載されたように（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９９３）行った。簡潔には、１１ｍｌの改変ＮＧＭ（２％寒天、５ｍＭ ＫＰＯ４［ｐＨ６］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）を含有する１０ｃｍペトリ皿を使用してアッセイプレートを調製した。成体ワームをＳ－ｂａｓａｌで２回、蒸留水中で１回洗浄し、アッセイを開始する直前におよそ５０～１００匹のワームをプレートの中央に置いた。プレートを対照および臭気物質領域と称される４つの四分円に分割した（図１Ａ）。対照領域は１μｌの中性緩衝液を含有した一方、
臭気物質領域は、ｍｉｌｌｉＱ水に１：１０で希釈した１μｌの対照またはがんの尿試料のいずれかを含んだ。ワームが領域に到達したら固定化するために、１マイクロリットルの１Ｍ ＮａＮ３を各スポットに適用した。６０分後、動物を計数し、走化性指数（ＣＩ）を以下のように計算した：（臭気物質領域の動物の数）－（対照領域の動物の数）／試験した動物の総数。アッセイ再現性を確実にするために、別々の走化性プレート上、３連で走化性アッセイを行った。
【0088】
単一ワームの走化性アッセイ
単一動物の走化性アッセイを、いくつかの修正を加えて以前に記載されたように行った。アッセイプレートを、４ｍｌの改変ＮＧＭ（２％寒天、５ｍＭ ＫＰＯ４［ｐＨ６］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）を含有する５ｃｍペトリ皿を使用して調製した。ワームのトレースを視覚化するために、寒天表面を２時間乾燥させた直後、換気フード内でプレートの蓋を開くことによって動物を置いた。動物を細菌を含まないＮＧＭプレート上にアッセイ前の１時間にわたって置いた後、尿試料の供給源から２ｃｍ離れたアッセイプレートの中央に置いた。１つの寒天プラグをプレートの蓋上に置き、１μｌの希釈した試料を、ワームの直後にプラグに添加した。２０分後、ワームが残した軌跡を可視化し、走化性スコアを、動物が移動したセクターのスコアの合計として計算した。
単一動物の走化性アッセイを、いくつかの修正を加えて以前に記載されたように行った。アッセイプレートを、４ｍｌの改変ＮＧＭ（２％寒天、５ｍＭ ＫＰＯ４［ｐＨ６］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）を含有する５ｃｍペトリ皿を使用して調製した。ワームのトレースを視覚化するために、寒天表面を２時間乾燥させた直後、換気フード内でプレートの蓋を開くことによって動物を置いた。動物を細菌を含まないＮＧＭプレート上にアッセイ前の１時間にわたって置いた後、尿試料の供給源から２ｃｍ離れたアッセイプレートの中央に置いた。１つの寒天プラグをプレートの蓋上に置き、１μｌの希釈した試料を、ワームの直後にプラグに添加した。２０分後、ワームが残した軌跡を可視化し、走化性スコアを、動物が移動したセクターのスコアの合計として計算した。
【0089】
スラッシングアッセイ
運動行動を、野生型ワーム（Ｎ２、Ｂｒｉｓｔｏｌ）およびｓｒｉ－１４
（ｏｋ２８６５）変異動物に対して行ったスラッシングアッセイによって評価した。アッセイは、１ｍｌのＭ９緩衝液（６ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．１２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４）で充填した３５ｍｍのＯＰ５０不含プレート上、２０℃で行った。同期させた若齢成体を含むプレートから、１匹ずつ動物を食物を含まないＮＧＭ寒天プレートに２分間移して細菌を除去し、次いで、順化の１分後にアッセイした。スラッシュを２０秒間計数し、３倍して１分当たりの推定値を得た。１回のスラッシュを
ミッドボディにおける曲げ方向の完全な変化として定義した。遺伝子型ごとに少なくとも１０匹の動物をアッセイした。
運動行動を、野生型ワーム（Ｎ２、Ｂｒｉｓｔｏｌ）およびｓｒｉ－１４
（ｏｋ２８６５）変異動物に対して行ったスラッシングアッセイによって評価した。アッセイは、１ｍｌのＭ９緩衝液（６ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．１２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４）で充填した３５ｍｍのＯＰ５０不含プレート上、２０℃で行った。同期させた若齢成体を含むプレートから、１匹ずつ動物を食物を含まないＮＧＭ寒天プレートに２分間移して細菌を除去し、次いで、順化の１分後にアッセイした。スラッシュを２０秒間計数し、３倍して１分当たりの推定値を得た。１回のスラッシュを
ミッドボディにおける曲げ方向の完全な変化として定義した。遺伝子型ごとに少なくとも１０匹の動物をアッセイした。
【0090】
ニューロンイメージングのためのマイクロ流体デバイス設計。
カルシウムイメージング実験のために、設計時にいくつかの変形が導入されたパルスアリーナに基づく幾何学的形状を有するマイクロ流体デバイスを使用することによって臭気パルスを送達した：線虫のローディングを容易にするためのローディングチャネルの平滑化、非常に遅い流れの場合にもチップの流出側での線虫のパイルアップを回避するために、ピラーの層および流入／流出チャネルの間の自由空間の除去、ＣＭＯＳカメラの倍率４倍で３．２５×３．２５ｍｍ２の視野内でおよそ２０匹の動物からのニューロン蛍光シグナルを一度に記録できるようにするためのアリーナの全体寸法の小型化。ＸＹ顕微鏡ステージ上に置かれたチップは、チップの入口で液体を直接駆動するタイゴンチューブを介して２つの加圧ボトルに連結される。ボトルは、１００ｍＢａｒの圧力で固定されたガス調整可能レギュレータで制御されたガスラインによって供給される。圧力値は、アリーナにおける速い臭気の切り替え（２秒未満）および線虫に対する望ましくない強い機械的摂動の回避の間の正しい妥協点を確保するために検証される。臭気および緩衝液の間の流れの切り替えは、ソフトウェアによって直接制御される電動バルブによってゆっくりと（約２秒）作動し、従来のソレノイドバルブの急速な詰まりによって通常発生する、チューブ内を伝播する危険な衝撃波の発生を防止する。電動バルブに送信される電気コマンドは、チューブに過度の応力を加えることなく、それらをゆっくりと閉じることを可能にするＰＷＭシグナルである。
カルシウムイメージング実験のために、設計時にいくつかの変形が導入されたパルスアリーナに基づく幾何学的形状を有するマイクロ流体デバイスを使用することによって臭気パルスを送達した：線虫のローディングを容易にするためのローディングチャネルの平滑化、非常に遅い流れの場合にもチップの流出側での線虫のパイルアップを回避するために、ピラーの層および流入／流出チャネルの間の自由空間の除去、ＣＭＯＳカメラの倍率４倍で３．２５×３．２５ｍｍ２の視野内でおよそ２０匹の動物からのニューロン蛍光シグナルを一度に記録できるようにするためのアリーナの全体寸法の小型化。ＸＹ顕微鏡ステージ上に置かれたチップは、チップの入口で液体を直接駆動するタイゴンチューブを介して２つの加圧ボトルに連結される。ボトルは、１００ｍＢａｒの圧力で固定されたガス調整可能レギュレータで制御されたガスラインによって供給される。圧力値は、アリーナにおける速い臭気の切り替え（２秒未満）および線虫に対する望ましくない強い機械的摂動の回避の間の正しい妥協点を確保するために検証される。臭気および緩衝液の間の流れの切り替えは、ソフトウェアによって直接制御される電動バルブによってゆっくりと（約２秒）作動し、従来のソレノイドバルブの急速な詰まりによって通常発生する、チューブ内を伝播する危険な衝撃波の発生を防止する。電動バルブに送信される電気コマンドは、チューブに過度の応力を加えることなく、それらをゆっくりと閉じることを可能にするＰＷＭシグナルである。
【0091】
マイクロ流体デバイスの製造
マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィープロセス（Ｃｉｔａｚｉｏｎｅ ｗｉｔｈｅｓｉｄｅ）を使用することによって調製される。ＳＵ－８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ ３０００シリーズ）構造は、厚さ５０ミクロンの単層マイクロ流体ネットワークを得るために、従来のフォトリソグラフィーによってガラス基板上に製造される。高解像度フォトマスクは、１００００ｄｐｉより高い解像度を確保するために、レーザライタを用いてマイクロ流体ネットワーク上に直接印刷されている。次いで、１：１０ ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサンＳｉｌｇａｒｄ１８４）鋳型レプリカをキャスティングプロセス後に硬化させ、入口／出口用の穴を０．６ｍｍパンチャーで作製し、続いて外部のタイゴン（Ｔｙｇｏｎ）チューブと接続する。ＰＤＭＳ層は、空気プラズマ処理（ＨＡＲＲＩＫ ＰＬＡＳＭＡ）およびホットプレートによる熱回収を使用することによって顕微鏡ガラススライド上に結合される。本発明者らは、最初にＣＡＤソフトウェアを用いてマイクロ流体ネットワークを設計し、次いで高解像度ガラスフォトマスクのレーザー描画を生成する。
マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィープロセス（Ｃｉｔａｚｉｏｎｅ ｗｉｔｈｅｓｉｄｅ）を使用することによって調製される。ＳＵ－８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ ３０００シリーズ）構造は、厚さ５０ミクロンの単層マイクロ流体ネットワークを得るために、従来のフォトリソグラフィーによってガラス基板上に製造される。高解像度フォトマスクは、１００００ｄｐｉより高い解像度を確保するために、レーザライタを用いてマイクロ流体ネットワーク上に直接印刷されている。次いで、１：１０ ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサンＳｉｌｇａｒｄ１８４）鋳型レプリカをキャスティングプロセス後に硬化させ、入口／出口用の穴を０．６ｍｍパンチャーで作製し、続いて外部のタイゴン（Ｔｙｇｏｎ）チューブと接続する。ＰＤＭＳ層は、空気プラズマ処理（ＨＡＲＲＩＫ ＰＬＡＳＭＡ）およびホットプレートによる熱回収を使用することによって顕微鏡ガラススライド上に結合される。本発明者らは、最初にＣＡＤソフトウェアを用いてマイクロ流体ネットワークを設計し、次いで高解像度ガラスフォトマスクのレーザー描画を生成する。
【0092】
カルシウムイメージングの実験設定
カスタム設計の倒立顕微鏡を使用して、カルシウムイメージングの記録を行った。高ＮＡ（４×／０．２８Ｎ．Ａ．）を有する低倍率対物レンズおよび大きなセンサ面積（１３×１３ｍｍ２）を有する高感度低ノイズＣＭＯＳカメラは、およそ３．２５×３．２５ｍｍ２の視野内でおよそ１５～２０匹の線虫からの蛍光シグナルを一度に収集することを可能にする。励起光は、ダイクロイックミラー（ＭＤ４９８、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を使用して、ＦＩＴＣ励起フィルタ（ＭＦ４７５－３５、ＣＷＬ＝４７５ｎｍ、ＢＷ＝３５ｎｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）およびコンデンサ（ＡＣＬ２５２０Ｕ－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えた高出力ＬＥＤ（４７０ｎｍ－Ｍ４７０Ｌ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から試料上で反射された。０．２８の開口数を有する２０倍対物レンズ（ＸＬＦＬＵＯＲ４Ｘ／３４０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、通過帯域ＦＩＴＣ／ＴＲＩＣフィルタ（５９００４ｘ、Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ、Ｖｅｒｍｏｎｔ）を備えるダイクロイックミラーを介したデジタルＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ Ｃ１１４４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｉｔｙ、Ｊａｐａｎ）によってシグナルを収集した。記録を開始する前に、伝送チャネル（高出力ＬＥＤ、Ｍ６６０Ｌ４、Ｔｈｏｒｌａｂｓによる６６０ｎｍでの照明）は、電動ステージ（ＭＬＳ２０３－１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を介してアリーナの可視化された領域を選択することを可能にした。光毒性を低減し、光退色を防止するために、励起ＬＥＤおよびカメラシャッタを同期させて、露光時間（１００ｍｓ）の間のみアリーナが照明されるようにした。取得中、緩衝液は最初の１０秒間および最後の３０秒間流れ、尿試料はこれらの時間窓の間に２０秒間流れる。ＬＥＤ、電気弁およびカメラを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のコントローラー（ＰＣＩ－６２２１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を介してＰＣ（Ｗｉｎｄｏｗｓ １０、６４ビット、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に接続した。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の特注ソフトウェアを、同期照明、画像取得、流体送達制御およびデータ記録のために使用した。
カスタム設計の倒立顕微鏡を使用して、カルシウムイメージングの記録を行った。高ＮＡ（４×／０．２８Ｎ．Ａ．）を有する低倍率対物レンズおよび大きなセンサ面積（１３×１３ｍｍ２）を有する高感度低ノイズＣＭＯＳカメラは、およそ３．２５×３．２５ｍｍ２の視野内でおよそ１５～２０匹の線虫からの蛍光シグナルを一度に収集することを可能にする。励起光は、ダイクロイックミラー（ＭＤ４９８、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を使用して、ＦＩＴＣ励起フィルタ（ＭＦ４７５－３５、ＣＷＬ＝４７５ｎｍ、ＢＷ＝３５ｎｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）およびコンデンサ（ＡＣＬ２５２０Ｕ－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えた高出力ＬＥＤ（４７０ｎｍ－Ｍ４７０Ｌ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から試料上で反射された。０．２８の開口数を有する２０倍対物レンズ（ＸＬＦＬＵＯＲ４Ｘ／３４０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、通過帯域ＦＩＴＣ／ＴＲＩＣフィルタ（５９００４ｘ、Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ、Ｖｅｒｍｏｎｔ）を備えるダイクロイックミラーを介したデジタルＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ Ｃ１１４４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｉｔｙ、Ｊａｐａｎ）によってシグナルを収集した。記録を開始する前に、伝送チャネル（高出力ＬＥＤ、Ｍ６６０Ｌ４、Ｔｈｏｒｌａｂｓによる６６０ｎｍでの照明）は、電動ステージ（ＭＬＳ２０３－１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を介してアリーナの可視化された領域を選択することを可能にした。光毒性を低減し、光退色を防止するために、励起ＬＥＤおよびカメラシャッタを同期させて、露光時間（１００ｍｓ）の間のみアリーナが照明されるようにした。取得中、緩衝液は最初の１０秒間および最後の３０秒間流れ、尿試料はこれらの時間窓の間に２０秒間流れる。ＬＥＤ、電気弁およびカメラを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のコントローラー（ＰＣＩ－６２２１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を介してＰＣ（Ｗｉｎｄｏｗｓ １０、６４ビット、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に接続した。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の特注ソフトウェアを、同期照明、画像取得、流体送達制御およびデータ記録のために使用した。
【0093】
Ｃａ２＋イメージングデータ分析
カルシウムイメージングデータ分析のすべての工程は、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを介して行われる。取得された画像は、取得の前後に均等に記録された２０個のバックグラウンドフレームにわたって平均化された平均バックグラウンドを差し引くことによって、およびノイズ低減のための平均化フィルタを適用することによって前処理される。特注のＧＵＩは、化学刺激の除去の２秒後に取得されたフレームにおいて生存している線虫頭部を含むＲＯＩをユーザが選択することを可能にし、視覚的に活性なニューロンを有する確率がより高い。周囲の化学物質へのアクセスが制限されているように見える線虫は破棄される。各ＲＯＩにおいて、ユーザは、ＡＷＣニューロンの位置を選択する必要がある。この情報に基づいて、スクリプトは、事前に処理されたフレームで割り当てられたニューロン位置から３０ピクセル以下離れていてもよい５×５ピクセル領域にわたって平均化された最大強度を探すことによって、ビデオ全体のニューロン位置を両方の時間方向に追跡する。フレームｉで得られたシグナル強度Ｉｉは、Ｉｉ＝ΔＦｉ／Ｆ０として計算され、ここで、ΔＦｉ＝Ｆｉ－Ｆ０である。Ｆｉは、ニューロンを表すセグメント化されたオブジェクトの平均強度である。Ｆ０は、ニューロンが静止している、刺激のない時間窓である、ｉ＝１、２、．．．１０についてのＦｉの平均として評価される蛍光のベースライン値である。ニューロンがフレームｉからその次のフレーム（ｉ＋１）でＲＯＩにおける位置が変化する場合、２つのフレームのＲＯＩ間の強度差ＩＤｉ，ｉ＋１の要素ごとの和は、静止映像と比較した場合にはるかに大きく変動し得る。したがって、生きたトレースは、前述の差が以下の条件：ＩＤｉ，ｉ＋１＜
を満たすものとして特定され、ここで
およびσＩＤｉは、ｉ－２０からｉ＋２０までの範囲で利用可能なフレームのすべてのＩＤにわたって計算された、それぞれ平均値および標準偏差である。これにより、評価がアーチファクトによって影響を受ける可能性がある移動ニューロンのシグナルを除外することができる。検出されたすべての生きたシグナルは、ユーザによって視覚的に検証される。
カルシウムイメージングデータ分析のすべての工程は、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを介して行われる。取得された画像は、取得の前後に均等に記録された２０個のバックグラウンドフレームにわたって平均化された平均バックグラウンドを差し引くことによって、およびノイズ低減のための平均化フィルタを適用することによって前処理される。特注のＧＵＩは、化学刺激の除去の２秒後に取得されたフレームにおいて生存している線虫頭部を含むＲＯＩをユーザが選択することを可能にし、視覚的に活性なニューロンを有する確率がより高い。周囲の化学物質へのアクセスが制限されているように見える線虫は破棄される。各ＲＯＩにおいて、ユーザは、ＡＷＣニューロンの位置を選択する必要がある。この情報に基づいて、スクリプトは、事前に処理されたフレームで割り当てられたニューロン位置から３０ピクセル以下離れていてもよい５×５ピクセル領域にわたって平均化された最大強度を探すことによって、ビデオ全体のニューロン位置を両方の時間方向に追跡する。フレームｉで得られたシグナル強度Ｉｉは、Ｉｉ＝ΔＦｉ／Ｆ０として計算され、ここで、ΔＦｉ＝Ｆｉ－Ｆ０である。Ｆｉは、ニューロンを表すセグメント化されたオブジェクトの平均強度である。Ｆ０は、ニューロンが静止している、刺激のない時間窓である、ｉ＝１、２、．．．１０についてのＦｉの平均として評価される蛍光のベースライン値である。ニューロンがフレームｉからその次のフレーム（ｉ＋１）でＲＯＩにおける位置が変化する場合、２つのフレームのＲＯＩ間の強度差ＩＤｉ，ｉ＋１の要素ごとの和は、静止映像と比較した場合にはるかに大きく変動し得る。したがって、生きたトレースは、前述の差が以下の条件：ＩＤｉ，ｉ＋１＜
【数1】
を満たすものとして特定され、ここで
【数2】
およびσＩＤｉは、ｉ－２０からｉ＋２０までの範囲で利用可能なフレームのすべてのＩＤにわたって計算された、それぞれ平均値および標準偏差である。これにより、評価がアーチファクトによって影響を受ける可能性がある移動ニューロンのシグナルを除外することができる。検出されたすべての生きたシグナルは、ユーザによって視覚的に検証される。
【0094】
Ｃａ２＋データの定量化
カルシウムイメージングトレースから化学刺激の除去時のＡＷＣＯＮニューロンの活性化率を定量化するために、本発明者らはニューロン活性化指数（ＮＡＩ）を、ＮＡＩ＝２（Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔ－０．５）として定義し、ここで、Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である。１／２の減算は、０を中心とした対称性を強いるが、プレファクタ２は、｜ＮＡＩ｜≦１を与え、量を範囲［－１，１］内に投影する。その定義から、ＮＡＩ＞０の場合、試験した線虫の過半数はＡＷＣＯＮ活性化を経験したが、そのうちの少数では負の値が活性化に関連付けられることになる。ＡＷＣＯＮニューロンにおける有意な活性化事象の系統的同定のために、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトは、各ニューロンに対してカルシウムイメージングシグナル強度Ｉを評価する。刺激後の１０秒の長さの時間窓における平均シグナル強度Ｉｏｆｆ、および刺激オン中の１０秒の長さの時間窓における平均シグナル強度Ｉｏｎの間の差が、刺激オン中の時間窓におけるシグナルの標準偏差σｏｎよりも３倍大きい場合、応答は活性化に関連付けられる。そうでなければ、それは、
応答の欠如と関連付けられる。次いで、すべての関連付けが視覚的に検証される。
カルシウムイメージングトレースから化学刺激の除去時のＡＷＣＯＮニューロンの活性化率を定量化するために、本発明者らはニューロン活性化指数（ＮＡＩ）を、ＮＡＩ＝２（Ｎａｃｔ／Ｎｔｏｔ－０．５）として定義し、ここで、Ｎａｃｔは、ＡＷＣＯＮニューロンの活性化に応答する線虫の数であり、Ｎｔｏｔは、同じ化学刺激に対して試験された生存線虫の数である。１／２の減算は、０を中心とした対称性を強いるが、プレファクタ２は、｜ＮＡＩ｜≦１を与え、量を範囲［－１，１］内に投影する。その定義から、ＮＡＩ＞０の場合、試験した線虫の過半数はＡＷＣＯＮ活性化を経験したが、そのうちの少数では負の値が活性化に関連付けられることになる。ＡＷＣＯＮニューロンにおける有意な活性化事象の系統的同定のために、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトは、各ニューロンに対してカルシウムイメージングシグナル強度Ｉを評価する。刺激後の１０秒の長さの時間窓における平均シグナル強度Ｉｏｆｆ、および刺激オン中の１０秒の長さの時間窓における平均シグナル強度Ｉｏｎの間の差が、刺激オン中の時間窓におけるシグナルの標準偏差σｏｎよりも３倍大きい場合、応答は活性化に関連付けられる。そうでなければ、それは、
応答の欠如と関連付けられる。次いで、すべての関連付けが視覚的に検証される。
【図1A-B】
【図1C-D】
【図1E】
【図1F】
【図2A-B】
【図2C】
【図2D-E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5A】
【図5B-C】
【図5D】
【図5E】
【図6】
