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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-29
(45)【発行日】2025-02-06
(54)【発明の名称】神経系退行性疾患診断用マーカーおよび治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20250130BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20250130BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250130BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20250130BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20250130BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250130BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20250130BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20250130BHJP
C12N 5/0793 20100101ALN20250130BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20250130BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088 ZNA
A61K38/02
A61K48/00
A61P21/00
A61P25/02
A61P43/00 105
C12N9/10
C12N15/54
C12N5/0793
C12N5/10
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2023061939
(22)【出願日】2023-04-06
(62)【分割の表示】P 2021525188の分割
【原出願日】2018-11-13
(65)【公開番号】P2023085481
(43)【公開日】2023-06-20
【審査請求日】2023-04-17
(31)【優先権主張番号】10-2018-0137289
(32)【優先日】2018-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2018-0137404
(32)【優先日】2018-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】515059120
【氏名又は名称】スンチョニャン ユニヴァーシティ インダストリー アカデミー コーペレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】キム， ギ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】チャ， ソン ジュ
【審査官】新留 素子
(56)【参考文献】
【文献】Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2017年，Vol.2017，Article ID 5049532
【文献】Homo sapiens glutathione transferase omega (GSTO1) mRNA complete cds，Database: GenBank，[online]，2000年08月07日，Accession number: AF212303.1，[retrieved on 2024.06.24], Retrieved from the Internet: <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF212303>
【文献】Drosophila melanogaster glutathione S transferase O2 transcript variant A (GstO2)，Database: NCBI Reference Sequence，[online]，2018年05月31日，Accession number: NM_168277.2，[retrieved on 2024.06.24], Retrieved from the Internet: <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/442631056?sat=46&satkey=145604130>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ１２Ｎ １５／５４
Ｃ１２Ｎ ９／１０
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ５／０７９３
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子または前記遺伝子が暗号化するタンパク質を有効成分として含む、筋萎縮性側索硬化症の予防または治療用薬学的組成物であって、
前記ＧＳＴＯ１遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列または配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基配列からなり、
前記ＧｓｔＯ２遺伝子は、配列番号４で表される塩基配列または配列番号４で表される塩基配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる、治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記ＧＳＴＯ１遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記ＧＳＴＯ１タンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記ＧｓｔＯ２遺伝子は、配列番号４で表される塩基配列からなることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記ＧｓｔＯ２タンパク質は、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記組成物は、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を抑制させることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化は、前記ＦＵＳのＣｙｓ－４４７残基でグルタチオニル化したものであることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経系退行性疾患診断用マーカーおよびその用途に関し、より具体的には、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質を含む神経系退行性疾患診断用マーカー組成物、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定する製剤を含む神経系退行性疾患診断用組成物、該組成物を含む神経系退行性疾患診断用キットおよびこれを利用した神経系退行性疾患を診断するための情報提供方法に関する。
【0002】
また、本発明は、ＧｓｔＯ２を含む神経系退行性疾患治療用組成物に関し、より具体的に、ＦＵＳタンパク質の脱グルタチオニル化を誘導するＧｓｔＯ２を有効成分として含む神経系退行性疾患予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）は、運動神経細胞の漸進的な退行を特徴とする致命的な成人発病性神経系退行性疾患である。筋萎縮性側索硬化症は、漸進的筋力弱化を招いて、結局、致命的な筋肉萎縮およびマヒにつながり、病気の発病後３年内～５年内に死亡する。筋萎縮性側索硬化症は、病因不明の散発性筋萎縮性側索硬化症と、ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１（ＳＯＤ１）、ｔｒａｎｓａｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－４３（ＴＤＰ－４３）、Ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子１５（ＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ１５，ＴＡＦ１５）など病理学と直接的に関連したタンパク質の遺伝的欠陥による家族性筋萎縮性側索硬化症とに分類することができる。突然変異形態のＴＤＰ－４３は、ニューロンで毒性を有し、前記タンパク質の細胞質で誤った局在化（ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、筋萎縮性側索硬化症の発病と関連があることが明らかにされた。
【0004】
また、タンパク質凝集体は、年齢に関連した神経退行性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ＮＤ）、例えば、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ、別名ルー・ゲーリック病）で特徴的に発見される。
【0005】
ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ）は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質であって、ＦＵＳタンパク質のＮ－末端は、転写活性と関連があり、Ｃ－末端は、タンパク質およびＲＮＡ結合に関与することが知られている。ＦＵＳタンパク質は、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であるＡＰ２、ＧＣＦ、Ｓｐ１に対する認識部位を含み、最近の研究で筋萎縮性側索硬化症患者や前頭側頭型認知症患者において多様な形態の突然変異ＦＵＳタンパク質が確認されたことがある。このような突然変異ＦＵＳタンパク質は、核内の本来位置から外れて核の外に出た後、ストレス顆粒（ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅ）に位置して凝集体を成すことが明らかにされた。
【0006】
なお、筋萎縮性側索硬化症患者の大部分からＦＵＳ突然変異が確認されており（非特許文献１）、ＦＵＳＰ５２５Ｌ突然変異は、細胞質で誤った局在化を示し、急性ＦＵＳ誘発の筋萎縮性側索硬化症と関連があり（非特許文献２）、ＦＵＳ野生型およびこれの変種であるＦＵＳＰ５２５Ｌは、ショウジョウバエで荒い眼、運動性減少などの同じ表現型を示すことが知られている（非特許文献３；非特許文献４）。
【0007】
筋萎縮性側索硬化症は、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）や血液検査で診断が不可能で、患者の症状に基づく身体検査および経験の多い医療スタッフによる身体検査を通じて診断が可能である。ＭＡＲＣＨ５およびＭＦＮ２遺伝子の発現量またはタンパク質の活性を測定して筋萎縮性側索硬化症を診断する方法に関する研究は試みられたが（特許文献１）、未だＦＵＳタンパク質およびＦＵＳタンパク質の凝集体と関連した筋萎縮性側索硬化症診断用マーカーや診断用組成物に対する研究は不十分であるのが現状である。
【0008】
また、筋萎縮性側索硬化症患者や前頭側頭型認知症患者において発見されるこれらＦＵＳ突然変異タンパク質の異常な位置と凝集体蓄積に関連したメカニズム研究は、ほとんど知られておらず、これに基づく治療法も皆無である。上記のようにＦＵＳ凝集体形成およびこれの作用機序を確認して治療薬物を開発するために多様な研究が試みられたが（特許文献２）、未だ不十分であるのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】韓国登録特許第１０－１６７４９２０号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１５７６６０２号公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０
【文献】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１
【文献】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６
【文献】Ｊａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
これにより、本発明者らは、神経系退行性疾患診断用新規マーカーを探索していたところ、主に核内に位置すべきＦＵＳタンパク質が細胞質でグルタチオニル化したＦＵＳタンパク質凝集体の形態で位置することを知見し、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質が神経系退行性疾患を診断できる新規マーカーになり得ることを確認して、本発明を完成した。
【0012】
また、本発明は、上記の問題点を解決するために案出されたものであって、本発明者らは、多様な研究を進めた結果、筋萎縮性側索硬化症誘発タンパク質と知られたＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）によるタンパク質凝集体の形成およびこれの脳神経細胞の細胞質沈着が筋萎縮性側索硬化症の発病原因であることを確認し、ＧＳＴＯ（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化抑制活性を確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【0013】
本発明は、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質を含む、神経系退行性疾患診断用マーカー組成物を提供することを目的とする。
【0014】
また、本発明は、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定する製剤を含む、神経系退行性疾患診断用組成物および前記組成物を含む神経系退行性疾患診断用キットを提供することを目的とする。
【0015】
また、本発明は、被検者由来の生物学的試料でＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定して正常ヒトと比較する段階を含む、神経系退行性疾患診断のための情報提供方法を提供することを他の目的とする。
【0016】
また、本発明のさらに他の目的は、ＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子または前記遺伝子が暗号化するタンパク質を有効成分として含む、神経系退行性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【0017】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【0018】
上記のような目的を達成するために、本発明は、
グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質を含む、神経系退行性疾患診断用マーカー組成物を提供する。
グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質を含む、神経系退行性疾患診断用マーカー組成物を提供する。
【0019】
本発明の一具現例において、前記神経系退行性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）でありうる。
【0020】
本発明の他の具現例において、前記ＦＵＳタンパク質は、Ｃｙｓ－４４７残基にグルタチオニル化したものでありうる。
【0021】
また、本発明は、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定する製剤を含む、神経系退行性疾患診断用組成物を提供する。
【0022】
本発明の一具現例において、前記ＦＵＳタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり得る。
【0023】
本発明の一具現例において、前記神経系退行性疾患は、筋萎縮性側索硬化症でありうる。
【0024】
また、本発明は、前記組成物を含む、神経系退行性疾患診断用キットを提供する。
【0025】
また、本発明は、ａ）被検者由来の生物学的試料からＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定する段階；およびｂ）前記水準を正常対照群試料の当該タンパク質のグルタチオニル化水準と比較する段階；を含む、神経系退行性疾患診断のための情報提供方法を提供する。
【0026】
また、本発明は、ＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子または前記遺伝子が暗号化するタンパク質を有効成分として含む、神経系退行性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0027】
本発明の一具現例において、前記ＧＳＴＯ１遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなり得る。
【0028】
本発明の他の具現例において、前記ＧＳＴＯ１タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり得る。
【0029】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＧｓｔＯ２遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列からなり得る。
【0030】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＧｓｔＯ２タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり得る。
【0031】
本発明のさらに他の具現例において、前記神経性退行性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）でありうる。
【0032】
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を抑制させることができる。
【0033】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化は、前記ＦＵＳのＣｙｓ－４４７残基でグルタチオニル化したものであり得る。
【0034】
また、本発明は、前記組成物を個体に投与する段階を含む、神経系退行性疾患の予防または治療方法を提供する。
【0035】
また、本発明は、前記組成物の神経系退行性疾患の予防または治療用途を提供する。
【発明の効果】
【0036】
本発明者は、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質が神経系退行性疾患診断マーカー（ｍａｒｋｅｒ）としての機能を有することを明らかにしたところ、本発明による神経系退行性疾患診断用組成物は、神経系退行性疾患の早期診断に寄与する。
【0037】
また、本発明者は、筋萎縮性側索硬化症誘発タンパク質と知られたＦＵＳのグルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）が細胞質内凝集および神経毒性を増加させる筋萎縮性側索硬化症の発病機序であることを明らかにし、これにより、本発明の神経系退行性疾患の予防または治療用組成物は、ＦＵＳタンパク質の脱グルタチオニル化（ｄｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）を誘導するＧＳＴＯ１またはＧｓｔＯ２を含むことによって、脳細胞質の凝集および神経細胞毒性の抑制効果を確認したところ、神経系退行性疾患の予防、治療または改善用途に有用に利用され得るものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1a】ヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化の有無を確認するためのものであって、酸化形態グルタチオン（ＧＳＳＧ）の濃度に依存的にグルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離した結果を示したものである。
【図1b】ヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を定量的に分析するためのものであって、前記分離したタンパク質を酸化形態グルタチオン（ＧＳＳＧ）の濃度を基準として定量分析した結果を示したものである。
【図2a】ヒトＦＵＳタンパク質の細胞内位置を確認するためのものであって、過発現したヒトＦＵＳタンパク質凝集体がショウジョウバエ脳のニューロンの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図2b】ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化により生成された還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）がショウジョウバエ脳のニューロンの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図2c】ヒトＦＵＳタンパク質凝集体と還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）の細胞内位置を確認するためのものであって、ヒトＦＵＳタンパク質凝集体と還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）がショウジョウバエ脳のニューロンの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図3a】ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体の細胞内位置を確認するためのものであって、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体がＮ２ａの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図3b】ヒト野生型ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化により生成された還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）がＮ２ａの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図3c】ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体と還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）の細胞内位置を確認するためのものであって、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体と還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）がＮ２ａの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図4a】ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質凝集体の細胞内位置を確認するためのものであって、ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質凝集体がＮ２ａの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図4b】ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質のグルタチオニル化により生成された還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）がＮ２ａの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図4c】ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質の凝集体と還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）の細胞内位置を確認するためのものであって、ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質の凝集体と還元形態グルタチオン（ＧＳＨ）がＮ２ａの細胞質に位置することをイメージで示したものである。
【図5】ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化の具体的な位置を確認するためのものであって、ＭＡＬＤＩ－質量分析結果を示したものである。
【図6】ＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインのシステイン配列の種間保存の可否を確認するためのものであって、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの配列を分析した結果を示したものである。
【図7】ＦＵＳタンパク質の凝集体を形成するための実験を概略的に示したものである。
【図8】グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質の凝集体とグルタチオニル化しないＦＵＳタンパク質の溶解度を比較するためのものであって、前記タンパク質の溶解度をウェスタンブロット分析で比較して示したものである。
【図9】ＦＵＳタンパク質のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの３次元相同モデルとＣｙｓ－４４７の相対的位置を示すものである。
【図10a】ＧＳＳＧの存在下にＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化の有無を確認した結果である。
【図10b】グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質のショウジョウバエ脳のニューロンの細胞質に位置することを確認した結果を示したものである。
【図10c】Ｎ２ａの細胞質でＦＵＳおよびヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質の凝集体を確認した結果を示したものである。
【図11a】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエの眼の表現型を確認した結果を示したものである。
【図11b】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエの幼虫クローリング活動を確認した結果を示したものである。
【図11c】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのＮＭＪ（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）でシナプスボタン（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｂｏｕｔｏｎ）の数を確認した結果である。
【図11d】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエの寿命を確認した結果を示したものである。
【図11e】ＧｓｔＯ２－ノックダウンによるＦＵＳ発現ハエの寿命を確認した結果を示したものである。
【図11f】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのクライミング活性を確認した結果である。
【図12a】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのミトコンドリアのサイズを確認した結果を示したものである。
【図12b】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのミトコンドリア形態を確認した結果を示したものである。
【図12c】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのＭａｒｆ発現を確認した結果を示したものである。
【図12d】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのミトコンドリア複合体含量を確認した結果を示したものである。
【図12e】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのＢＮ－ＰＡＧＥ実行結果を示したものである。
【図12f】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのＲＯＳ生産を確認した結果を示したものである。
【図12g】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのＡＴＰ水準を確認した結果を示したものである。
【図12h】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ－発現ハエで細胞質内酸化したタンパク質量を測定した結果を示したものである。
【図13a】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエの脳抽出物の免疫ブロッティング結果である。
【図13b】ＧｓｔＯ２－ノックダウンによるＦＵＳ発現ハエの脳抽出物の免疫ブロッティング結果である。
【図13c】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエの核／細胞質画分分析結果を示したものである。
【図13d】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのＦＵＳ凝集体を確認するための溶解度分析結果を示したものである。
【図13e】ＧＳＴＯ１またはＧｓｔＯ３のノックダウンによるＦＵＳ凝集体を確認するための溶解度分析結果を示したものである。
【図13f】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエのミトコンドリアでのＦＵＳ水準を確認した結果を示したものである。
【図14a】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ発現ハエの神経細胞でＦＵＳのグルタチオニル化調節を確認するための二重免疫蛍光分析結果を示したものである。
【図14b】内因性ＧｓｔＯ２によるグルタチオニル化を確認した結果を示したものである。
【図15a】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳＰ５２５Ｌ発現ハエの幼虫クローリング活動を確認した結果を示したものである。
【図15b】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳＰ５２５Ｌ発現ハエの脳抽出物の免疫ブロッティング結果を示したものである。
【図15c】ＧｓｔＯ２によるＦＵＳＰ５２５Ｌ発現ハエのＦＵＳ凝集体を確認するための溶解度分析結果を示したものである。
【図16a】ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１のＦＵＳ誘導神経毒性調節を確認するためにＭｙｃ－ＤＤＫ－ＧＳＴＯ１融合タンパク質を発現する安定Ｎ２ａ細胞株のＧＳＴＯ１発現を確認した結果を示したものである。
【図16b】ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１によるＦＵＳ凝集体を確認するための溶解度分析結果を示したものである。
【図16c】ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１による神経細胞死滅回復効果を確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0039】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0040】
本発明者らは、神経系退行性疾患と関連して多様な研究を進めた結果、筋萎縮性側索硬化症の誘発原因の一つと知られたＦＵＳタンパク質がグルタチオニル化すると、ＦＵＳタンパク質凝集体が形成されることを知見し、これを研究して、筋萎縮性側索硬化症の診断用マーカーとして本発明を完成した。
【0041】
これにより、本発明は、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質を含む神経系退行性疾患診断用マーカー組成物、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定する製剤を含む神経系退行性疾患診断用組成物、および該組成物を含む神経系退行性疾患診断用キットを提供する。
【0042】
本発明によるＦＵＳタンパク質を暗号化する遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなり得、または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものでありうる。この際、前記配列番号１で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列も含むことができる。
【0043】
本発明の対象疾患である「神経系退行性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」とは、神経系の一部分または様々な部分で神経細胞の死滅が進行される病気を総称する。神経細胞死滅の形態としては、細胞壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）または細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）がある。好ましくは、アルツハイマー病、軽度認知障害、脳卒中、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、外傷性頭部損傷、梅毒、後天性免疫不全症候群、その他ウイルス感染、脳膿瘍、脳腫瘍、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、虚血および中風などを含むことができ、より好ましくは、筋萎縮性側索硬化症でありうるが、これに制限されるものではない。
【0044】
本発明において神経系退行性疾患の発病原因の一つと知られた「ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ）タンパク質」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質であって、ＦＵＳのＮ－末端は、転写活性と関連していて、Ｃ－末端は、タンパク質およびＲＮＡ結合に関与することが知られている。
【0045】
本発明において使用する用語「グルタチオニル化（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）」とは、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）と還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）との間のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が形成されることをいう。タンパク質のグルタチオニル化は、タンパク質の構造および機能の変化を誘発する。
【0046】
筋萎縮性側索硬化症誘発タンパク質と知られたＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）によるＦＵＳタンパク質凝集体の形成および前記凝集体の細胞質への沈着が筋萎縮性側索硬化症の発病原因であることを前述したところ、本発明の一実施例では、抗－ＧＳＨ抗体および抗－ｍｙｃ抗体を利用したウェスタンブロット分析実験を行って、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）の濃度に依存的にＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こることを確認し（実施例２参照）、体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こるか否かを確認するための実験を行って、ニューロンの細胞質でグルタチオニル化したＦＵＳタンパク質凝集体を確認した（実施例３参照）。
【0047】
本発明の他の一実施例では、Ｎｅｕｒｏｎ２ａ（Ｎ２ａ）でヒトＦＵＳタンパク質と突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質を発現する実験を行って、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質および突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質のグルタチオニル化が哺乳類システムでも同一に起こることを確認した（実施例４参照）。
【0048】
本発明のさらに他の一実施例では、ＭＡＬＤＩ－質量分析およびＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの配列分析を行って、ＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインのＣｙｓ－４４７で酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）によるグルタチオニル化が起こることを確認した（実施例５参照）。
【0049】
本発明のさらに他の一実施例では、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質の溶解度分析およびＦＵＳタンパク質のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの３次元相同モデル分析実験を行って、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が前記タンパク質の凝集体形成を誘導することを確認した（実施例６参照）。
【0050】
上記の結果は、ＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインのＣｙｓ－４４７にグルタチオニル化が起こり、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質の凝集体が形成されることを示し、上記の凝集体は、可溶性が低くて、細胞質で沈着されることを図２～図４を通じて確認することができた。
【0051】
本発明において使用される用語「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」とは、広い意味では、患者の病の実態をすべての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病床の詳細な様態および合併症の有無などである。本発明において診断は、神経系退行性疾患の発病の有無および進行段階水準などを判断することである。
【0052】
本発明の他の様態として、被検者由来の生物学的試料からＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化水準を測定する段階および前記水準を正常対照群試料の当該タンパク質のグルタチオニル化水準と比較する段階を含む、神経系退行性疾患診断のための情報提供方法を提供する。
【0053】
本発明において使用される用語「神経系退行性疾患診断のための情報提供方法」とは、診断または予後予測のための予備的段階として神経系退行性疾患診断のために必要な客観的な基礎情報を提供することであり、医師の臨床学的判断または所見は除外される。前記被検者由来の生物学的試料は、これに制限されるものではないが、例えば、組織、細胞などでありうる。
【0054】
また、本発明者らは、神経系退行性疾患治療と関連して多様な研究を進めた結果、筋萎縮性側索硬化症誘発タンパク質と知られたＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）によるタンパク質凝集体の形成およびこれの脳神経細胞の細胞質沈着が筋萎縮性側索硬化症の発病原因であることを確認し、ＧＳＴＯ（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化抑制活性を確認することによって、本発明を完成した。
【0055】
これにより、本発明は、ＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子または前記遺伝子が暗号化するタンパク質を有効成分として含む、神経系退行性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0056】
本発明によるＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列（Ｈｕｍａｎ ＧＳＴＯ１ ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００４８３２．２）からなり得、または配列番号３で表されるアミノ酸配列（Ｈｕｍａｎ ＧＳＴＯ１ ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００４８２３．１）からなるものでありうる。この際、前記配列番号２で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【0057】
また、本発明によるＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子は、配列番号４で表される塩基配列（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＧｓｔＯ２ ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１６８２７７．２）からなり得、または配列番号５で表されるアミノ酸配列（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＧｓｔＯ２ ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿７２９３８８．１）からなるものでありうる。この際、前記配列番号４で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【0058】
本発明において使用される用語「グルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）」は、システインと還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）との間のジスルフィド結合の結果であって、これによって、タンパク質構造および機能の変化をもたらすことができることが知られている。
【0059】
本発明では、前述したように、筋萎縮性側索硬化症誘発タンパク質と知られたＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）によるタンパク質凝集体の形成およびこれの脳神経細胞の細胞質沈着が筋萎縮性側索硬化症の発病原因であることを確認した。これにより、本発明の一実施例では、ＦＵＳをＧＳＳＧの存在下に培養した結果、ＧＳＨの含量が増加するにつれて、グルタチオニル化したＦＵＳ含量が増加することを確認しただけでなく、ＦＵＳのＣｙｓ－４４７でグルタチオニル化することを確認し（実施例７参照）、ＦＵＳのグルタチオニル化によって、ＦＵＳの凝集体形成を具体的に確認した（実施例８参照）。
【0060】
本発明の他の一実施例では、グルタチオニル化したＦＵＳによる病理を調節できるタンパク質として、ＧｓｔＯを同定し、ＧｓｔＯ２のショウジョウバエでＦＵＳの過発現による表現型欠損およびミトコンドリア分裂および機能障害に対する緩和効果を確認した（実施例９および１０参照）。
【0061】
本発明のさらに他の一実施例では、ＧｓｔＯ２によりショウジョウバエ神経細胞でのＦＵＳの凝集体形成抑制効果を確認しただけでなく、ＧｓｔＯ２によってショウジョウバエ神経細胞でＦＵＳのグルタチオニル化を調節するかを具体的に確認し（実施例１１および１２参照）、また、ＦＵＳ突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌの発現によるＡＬＳ表現型を示すハエに対してもＧｓｔＯ２の過発現ＦＵＳと同じ効果を示すことを確認することができた（実施例１３参照）。最終的に、本発明者は、ＦＵＳ誘導神経細胞毒性に対するＧｓｔＯ２の回復効果が哺乳類システムにも適用されるかを確認するために、ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１に対して神経細胞毒性抑制効果を確認した結果、ＡＬＳの哺乳類神経細胞モデルでもＦＵＳ不溶性およびＦＵＳ誘導細胞死を改善させる効果を具体的に確認した（実施例１４参照）。
【0062】
上記経過は、ＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）がＦＵＳの脱グルタチオニル化を誘導して、ＦＵＳ細胞質内凝集および神経毒性の抑制効果を示すところ、神経系退行性疾患の治療剤として有用に利用され得ることを示唆する。
【0063】
本発明による薬学的組成物は、ＧＳＴＯ１（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＧｓｔＯ２（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子または前記遺伝子が暗号化するタンパク質を有効成分として含み、また、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤で製剤化することができる。適合した薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を利用して各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などで製剤化することができる。
【0064】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。
【0065】
本発明による組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【0066】
具体的に、本発明による組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得るものであり、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは、０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日に１～３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、神経系退行性疾患の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【0067】
なお、本発明の他の様態として、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、神経系退行性疾患の予防、調節または治療方法を提供する。
【0068】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により神経系退行性疾患を抑制したり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0069】
本発明において使用される 用語「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により神経系退行性疾患に対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【0070】
本発明において「個体」とは、病気の予防、調節または治療方法を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬および牛などの哺乳類を意味する。
【0071】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【0072】
［実施例］
実施例１．実験準備および実験方法
１－１．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）準備
すべてのショウジョウバエのストック（ｓｔｏｃｋ）は、標準飼料条件（ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｏｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、常温条件（ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（２５℃）および正常湿度条件（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）（６０％）の下で保管し、ショウジョウバエの交配（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）は、標準手続きにより行い、すべての子孫は、２５℃の条件で飼育した。
実施例１．実験準備および実験方法
１－１．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）準備
すべてのショウジョウバエのストック（ｓｔｏｃｋ）は、標準飼料条件（ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｏｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、常温条件（ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（２５℃）および正常湿度条件（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）（６０％）の下で保管し、ショウジョウバエの交配（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）は、標準手続きにより行い、すべての子孫は、２５℃の条件で飼育した。
【0073】
１－２．細胞培養（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）
マウス神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）であるＮｅｕｒｏ２ａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）（ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）（ｇｉｂｃｏ）溶液を含有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３７℃、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの条件で培養した。
マウス神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）であるＮｅｕｒｏ２ａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）（ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）（ｇｉｂｃｏ）溶液を含有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３７℃、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの条件で培養した。
【0074】
１－３．ｉｎ ｖｉｔｒｏグルタチオニル化分析（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ＨＥＫ２９３（ＯｒｉＧｅｎｅ）細胞から精製されたｍｙｃ－タグヒトＦＵＳ（０．５１μｇ）の組み換え全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）タンパク質を酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＧ）の多様な濃度の存在下の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２５℃の温度条件で培養し、培養１時間後、サンプルをアイス（ｉｃｅ）上に載置し、３×非還元性ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。その後、前記サンプルを１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離してマウス抗－ＧＳＨ（１：１，０００；ＶｉｒｏＧｅｎ Ｃｏｒｐ．）およびマウス抗－ｍｙｃ（１：１，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体を利用してウェスタンブロット分析を行った。
ＨＥＫ２９３（ＯｒｉＧｅｎｅ）細胞から精製されたｍｙｃ－タグヒトＦＵＳ（０．５１μｇ）の組み換え全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）タンパク質を酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＧ）の多様な濃度の存在下の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２５℃の温度条件で培養し、培養１時間後、サンプルをアイス（ｉｃｅ）上に載置し、３×非還元性ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。その後、前記サンプルを１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離してマウス抗－ＧＳＨ（１：１，０００；ＶｉｒｏＧｅｎ Ｃｏｒｐ．）およびマウス抗－ｍｙｃ（１：１，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体を利用してウェスタンブロット分析を行った。
【0075】
１－４．形質転換ハエ
ＵＡＳ－ＦＵＳ、ＵＡＳ－ＦＵＳＰ５２５Ｌ細胞株は、Ｎａｎｃｙ Ｍ．Ｂｏｎｉｎｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から収得し、ＵＡＳ－ＧｓｔＯ２細胞株は、以前に記述されている文献（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｙｉｍ、２０１３）によって収得した。また、ＵＡＳ－ＧＳＴＯ１ ＲＮＡｉ（ＢＬ３４７２７，ｖ２６７１１）、ＵＡＳ－ＧｓｔＯ２ ＲＮＡｉ（ｖ１０９２５５）、およびＵＡＳ－ＧｓｔＯ３ ＲＮＡｉ（ｖ１０５２７４）細胞株は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒおよびＶｉｅｎｎａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＲＮＡｉ ｃｅｎｔｅｒから収得し、ＵＡＳ－ｍｉｔｏＧＦＰ細胞株は、Ｈ．Ｊ．Ｂｅｌｌｅｎ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から収得し、ｐａｎ－ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｒｉｖｅｒ、ｅｌａｖ－Ｇａｌ４、ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｒｉｖｅｒ、ｍｈｃ－Ｇａｌ４、ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｒｉｖｅｒおよびＤ４２－Ｇａｌ４細胞株も、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒおよびＶｉｅｎｎａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＲＮＡｉ ｃｅｎｔｅｒから収得した。この際、遺伝的背景技術によってＷ１１１８ハエを対照群として使用した。
ＵＡＳ－ＦＵＳ、ＵＡＳ－ＦＵＳＰ５２５Ｌ細胞株は、Ｎａｎｃｙ Ｍ．Ｂｏｎｉｎｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から収得し、ＵＡＳ－ＧｓｔＯ２細胞株は、以前に記述されている文献（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｙｉｍ、２０１３）によって収得した。また、ＵＡＳ－ＧＳＴＯ１ ＲＮＡｉ（ＢＬ３４７２７，ｖ２６７１１）、ＵＡＳ－ＧｓｔＯ２ ＲＮＡｉ（ｖ１０９２５５）、およびＵＡＳ－ＧｓｔＯ３ ＲＮＡｉ（ｖ１０５２７４）細胞株は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒおよびＶｉｅｎｎａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＲＮＡｉ ｃｅｎｔｅｒから収得し、ＵＡＳ－ｍｉｔｏＧＦＰ細胞株は、Ｈ．Ｊ．Ｂｅｌｌｅｎ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から収得し、ｐａｎ－ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｒｉｖｅｒ、ｅｌａｖ－Ｇａｌ４、ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｒｉｖｅｒ、ｍｈｃ－Ｇａｌ４、ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｒｉｖｅｒおよびＤ４２－Ｇａｌ４細胞株も、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒおよびＶｉｅｎｎａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＲＮＡｉ ｃｅｎｔｅｒから収得した。この際、遺伝的背景技術によってＷ１１１８ハエを対照群として使用した。
【0076】
１－５．形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
Ｎ２ａ細胞を６ウェルプレートに分注し、各ウェルに４μｇのｐＣＭＶ６－ＦＵＳ－ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、緑色蛍光タンパク質）が標識されたヒト野生型ＦＵＳおよびｐＣＭＶ６－ＦＵＳＰ５２５Ｌ－ＧＦＰが標識された突然変異ＦＵＳＰ５２５ＬをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造社のマニュアルによって形質感染させた。この際、ブランクのｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰプラスミドを陰性対照群として使用した。
Ｎ２ａ細胞を６ウェルプレートに分注し、各ウェルに４μｇのｐＣＭＶ６－ＦＵＳ－ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、緑色蛍光タンパク質）が標識されたヒト野生型ＦＵＳおよびｐＣＭＶ６－ＦＵＳＰ５２５Ｌ－ＧＦＰが標識された突然変異ＦＵＳＰ５２５ＬをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造社のマニュアルによって形質感染させた。この際、ブランクのｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰプラスミドを陰性対照群として使用した。
【0077】
１－６．Ｓｔａｂｌｅ細胞株生成
２４－ウェルプレートのＮ２ａ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１μｇのヒトＧＳＴＯ１ ｃＤＮＡで形質感染させ、形質感染させた後、２日間Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）の存在下に安定形質転換体を選別した。この際、安定形質転換体においてＧＳＴＯ１タンパク質の過発現は、免疫ブロット分析を通じて確認した。
２４－ウェルプレートのＮ２ａ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１μｇのヒトＧＳＴＯ１ ｃＤＮＡで形質感染させ、形質感染させた後、２日間Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）の存在下に安定形質転換体を選別した。この際、安定形質転換体においてＧＳＴＯ１タンパク質の過発現は、免疫ブロット分析を通じて確認した。
【0078】
１－７．全体脳免疫染色（ｂｒａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）
７日齢の雄ハエの成体脳を固定緩衝液（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．９）で４％ホルムアルデヒドで固定させた後、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する洗浄バッファー液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ６．８）で遮断させた後、遮断緩衝液で希釈した１次抗体と共に４℃で１２時間の間培養し、この際、使用した抗体は、次の通りである：
ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１００、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウス抗－ＦＵＳ（１：５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗－ＧｓｔＯ２（１：２０）、およびマウス抗－ＧＳＨ。
７日齢の雄ハエの成体脳を固定緩衝液（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．９）で４％ホルムアルデヒドで固定させた後、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する洗浄バッファー液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ６．８）で遮断させた後、遮断緩衝液で希釈した１次抗体と共に４℃で１２時間の間培養し、この際、使用した抗体は、次の通りである：
ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１００、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウス抗－ＦＵＳ（１：５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗－ＧｓｔＯ２（１：２０）、およびマウス抗－ＧＳＨ。
【0079】
以後、サンプルをＡｌｅｘａ ４８８接合２次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ３接合２次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＤＡＰＩ（１：５００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に培養した後、脳を洗浄緩衝液で１０分ずつ３回洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理して固定した。この際、すべてのイメージは、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）を通じて確保した。
【0080】
１－８．免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定させた後、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで１０分ずつ３回洗浄した。その後、細胞を遮断緩衝液（５％ＮＧＳ（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）を含有するＰＢＳＴ）と共に２５℃で１時間の間培養した後、４℃で１２時間の間遮断緩衝液で希釈した１次抗体と共に培養し、この際、使用された抗体は、次の通りである：
マウス抗－ＧＳＨ（１：１００；ＶｉｒｏＧｅｎ Ｃｏｒｐ．）、ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１００；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウス抗－ＧＦＰ（１：２００；Ｒｏｃｈｅ）およびウサギ抗－切断型カスパーゼ３（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定させた後、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで１０分ずつ３回洗浄した。その後、細胞を遮断緩衝液（５％ＮＧＳ（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）を含有するＰＢＳＴ）と共に２５℃で１時間の間培養した後、４℃で１２時間の間遮断緩衝液で希釈した１次抗体と共に培養し、この際、使用された抗体は、次の通りである：
マウス抗－ＧＳＨ（１：１００；ＶｉｒｏＧｅｎ Ｃｏｒｐ．）、ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１００；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウス抗－ＧＦＰ（１：２００；Ｒｏｃｈｅ）およびウサギ抗－切断型カスパーゼ３（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【0081】
１次抗体と共に培養した後、細胞をＰＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、ＰＢＳＴで１：２０００で希釈した２次抗体と共に２５℃で１時間の間培養を実施し、この際、使用された２次抗体は、次の通りである：
Ａｌｅｘａ－５９４接合ヤギ抗－ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ－４８８接合ヤギ抗－ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ ５９４接合ヤギ抗－マウスＩｇＭおよびＡｌｅｘａ－４８８接合ヤギ抗－マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ実験室）。
Ａｌｅｘａ－５９４接合ヤギ抗－ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ－４８８接合ヤギ抗－ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ ５９４接合ヤギ抗－マウスＩｇＭおよびＡｌｅｘａ－４８８接合ヤギ抗－マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ実験室）。
【0082】
以後、サンプルをＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡を利用して観察した。
【0083】
次に、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）でＮＭＪ（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）分析のために３期齢の幼虫（３ｒｄ ｉｎｓｔａｒ ｌａｒｖａｅ）を解剖した後、１５分間ＰＢＳで４％ホルムアルデヒドで固定した。その後、サンプルを０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで１０分ずつ３回洗浄し、ＰＢＳＴから５％ＢＳＡに遮断させた後、１次抗体と共に４℃で１２時間の間培養した。この際、ＦＩＴＣ－接合抗－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１：１５０で使用し、ＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理して固定し、すべてのイメージは、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡で獲得した。
【0084】
１－９．相同性モデリング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）
Ｍｏｌｅｇｒｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｅｗｅｒ ２．５．０（Ｍｏｌｅｇｒｏ ＡｐＳ、オーフスＣ、デンマーク）を基盤としてＩ－ＴＡＳＳＥＲ ｓｅｒｖｅｒを利用してタンパク質構造および機能予測のためのＦＵＳ ＺｎＦドメイン（３２アミノ酸残基、４２２－ＲＡＧＤＷＫＣＰＮＰＴＣＥＮＭＮＦＳＷＲＮＥＣＮＱＣＫＡＰＫＰＤ－４５３）の３Ｄ構造を予測して生成した。
Ｍｏｌｅｇｒｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｅｗｅｒ ２．５．０（Ｍｏｌｅｇｒｏ ＡｐＳ、オーフスＣ、デンマーク）を基盤としてＩ－ＴＡＳＳＥＲ ｓｅｒｖｅｒを利用してタンパク質構造および機能予測のためのＦＵＳ ＺｎＦドメイン（３２アミノ酸残基、４２２－ＲＡＧＤＷＫＣＰＮＰＴＣＥＮＭＮＦＳＷＲＮＥＣＮＱＣＫＡＰＫＰＤ－４５３）の３Ｄ構造を予測して生成した。
【0085】
１－１０．Ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質凝集分析（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏグルタチオニル化後、サンプルを３７℃で熱ブロックをさせた後、サンプルを４℃で３０分間２０，０００×ｇの条件で遠心分離して上澄み液とペレット画分とに分けて、ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０分ずつ５回洗浄した後、還元剤と共にＬＤＳサンプル緩衝液（２％ＳＤＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解させた。両画分においてＦＵＳは、ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１０００；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）抗体でウェスタンブロット分析により検出した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏグルタチオニル化後、サンプルを３７℃で熱ブロックをさせた後、サンプルを４℃で３０分間２０，０００×ｇの条件で遠心分離して上澄み液とペレット画分とに分けて、ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０分ずつ５回洗浄した後、還元剤と共にＬＤＳサンプル緩衝液（２％ＳＤＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解させた。両画分においてＦＵＳは、ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１０００；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）抗体でウェスタンブロット分析により検出した。
【0086】
１－１１．Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅｙｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ショウジョウバエ成虫の眼イメージの場合、頭をスライドグラスに固定後、デジタルカメラでイメージを撮影し、この際、５日齢の雄ショウジョウバエを実験に使用した。なお、イメージ撮影は、Ｌｅｉｃａ ＭＺ１０ Ｆ立体顕微鏡とＬｅｉｃａ ＤＦＣ４５０カメラシステムを使用して撮影した。
ショウジョウバエ成虫の眼イメージの場合、頭をスライドグラスに固定後、デジタルカメラでイメージを撮影し、この際、５日齢の雄ショウジョウバエを実験に使用した。なお、イメージ撮影は、Ｌｅｉｃａ ＭＺ１０ Ｆ立体顕微鏡とＬｅｉｃａ ＤＦＣ４５０カメラシステムを使用して撮影した。
【0087】
１－１２．運動性および寿命分析（Ｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｓｓａｙｓ）
幼虫クローリング（ｃｒａｗｌｉｎｇ）分析のために、３期齢の幼虫（３ｒｄ ｉｎｓｔａｒ ｌａｒｖａｅ）に残っている食べ滓などを除去するためにＰＢＳを利用して洗浄し、きれいな濾過紙で乾燥させた後、２％ブドウ汁－寒天ペットリ皿に位置させ、幼虫は、９０秒間クローリングするようにした。この際、幼虫のクローリング動作を定量化するために、イメージＪソフトウェアを使用して幼虫を追跡し、距離を測定し、少なくとも１０匹の幼虫に対する結果をそれぞれのトランスジェニックラインに対して平均化した。
幼虫クローリング（ｃｒａｗｌｉｎｇ）分析のために、３期齢の幼虫（３ｒｄ ｉｎｓｔａｒ ｌａｒｖａｅ）に残っている食べ滓などを除去するためにＰＢＳを利用して洗浄し、きれいな濾過紙で乾燥させた後、２％ブドウ汁－寒天ペットリ皿に位置させ、幼虫は、９０秒間クローリングするようにした。この際、幼虫のクローリング動作を定量化するために、イメージＪソフトウェアを使用して幼虫を追跡し、距離を測定し、少なくとも１０匹の幼虫に対する結果をそれぞれのトランスジェニックラインに対して平均化した。
【0088】
次に、クライミング（ｃｌｉｍｂｉｎｇ）分析のために、各年齢グループの１０匹の雄ショウジョウバエを二酸化炭素で麻酔させた後、カラムバイアル（ｃｏｌｕｍｎ ｖｉａｌ）に位置させた後、前記ショウジョウバエを空のバイアルに移して室温で１時間の間培養して環境に順応させ、１０秒内にバイアルの頂部までクライミングしたショウジョウバエの数を計数した。この際、実験は、５分間隔で各トランスジェニックラインに対して独立して４回繰り返し、すべてのクライミング実験は、２５℃で行った。
【0089】
最終的に、寿命分析のために、各遺伝子型（＞１５０ショウジョウバエ）の雄ショウジョウバエ２０匹をそれぞれ異なるバイアルに入れ、２５℃を維持した後、翌日、すべてのグループを新しいバイアルに移した後、死んだショウジョウバエの数を記録した。
【0090】
１－１３．免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ウェスタンブロット分析のためのタンパク質抽出物は、ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ）で１０匹の１４日齢の雄ショウジョウバエの頭を均質化して製造し、総タンパク質抽出物を４％～１２％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、メンブレンを４％脱脂粉乳または４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴｒｉｓ－緩衝食塩水（ＴＢＳ）で１時間の間ブロッキングし、１次抗体と共に４℃で１２時間の間培養した。
ウェスタンブロット分析のためのタンパク質抽出物は、ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ）で１０匹の１４日齢の雄ショウジョウバエの頭を均質化して製造し、総タンパク質抽出物を４％～１２％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、メンブレンを４％脱脂粉乳または４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴｒｉｓ－緩衝食塩水（ＴＢＳ）で１時間の間ブロッキングし、１次抗体と共に４℃で１２時間の間培養した。
【0091】
この際、使用した１次抗体は、次の通りである：
ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１０００、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウサギ抗－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍａｒｆ（１：１０００、Ｌｅｏ Ｐａｌｌａｎｃｋ、ワシントン大学からのプレゼント）、マウス抗－Ｏｐａ１（１：１０００；マウス抗－ＵＱＣＲＣ２（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ＡＴＰ５Ａ（１：１００００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＧｓｔＯ２（１：１０００）、ウサギ抗－ラミンＣ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ Ｂａｎｋ、ＤＳＨＢ）、ウサギ抗－α－チューブリン（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）およびウサギ抗β－アクチン（１：４０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
ウサギ抗－ＦＵＳ（１：１０００、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウサギ抗－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍａｒｆ（１：１０００、Ｌｅｏ Ｐａｌｌａｎｃｋ、ワシントン大学からのプレゼント）、マウス抗－Ｏｐａ１（１：１０００；マウス抗－ＵＱＣＲＣ２（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ＡＴＰ５Ａ（１：１００００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＧｓｔＯ２（１：１０００）、ウサギ抗－ラミンＣ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ Ｂａｎｋ、ＤＳＨＢ）、ウサギ抗－α－チューブリン（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）およびウサギ抗β－アクチン（１：４０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【0092】
ブロットを０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴＢＳで洗浄し、２次抗体と共に培養し、ヤギ抗－ウサギＩｇＧ ＨＲＰ接合体およびヤギ抗－マウスＩｇＧ ＨＲＰ接合体（１：２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１次抗体をＨＲＰ－接合２次抗体で検出した。この際、検出は、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して行った。
【0093】
次に、タンパク質抽出物をｐｒｏｔｅａｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ （Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で均質化させた後、還元剤と共にＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。以後、タンパク質サンプルを４％～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離して、ＰＶＤＦメンブレン（Ｎｏｖｅｘ）に移した後、ウサギ抗－ＴｕｒｂｏＧＦＰ（１：２０００、ＯｒｉＧｅｎｅ）、マウス抗－ＧＳＴＯ１（１：１０００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ウサギ抗－ＤＤＫ（１：１０００、ＯｒｉＧｅｎｅ）、ウサギ抗－α－チューブリン（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）１次抗体を使用してウェスタンブロット分析に使用した。
【0094】
１－１４．ミトコンドリアイメージおよび形態
胸部の筋肉組織でミトコンドリアのイメージを確認するために、７日齢の成虫雄ショウジョウバエをＰＢＳで解剖し、固定緩衝液（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および２ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．９）で３％ホルムアルデヒドで２５分間固定させた後、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ６．８）で洗浄した。以後、ＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で固定し、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）で撮影してイメージを獲得した。
胸部の筋肉組織でミトコンドリアのイメージを確認するために、７日齢の成虫雄ショウジョウバエをＰＢＳで解剖し、固定緩衝液（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および２ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．９）で３％ホルムアルデヒドで２５分間固定させた後、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ６．８）で洗浄した。以後、ＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で固定し、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）で撮影してイメージを獲得した。
【0095】
次に、足の運動ニューロンでミトコンドリアのイメージを確認するために、７日齢の成虫雄ショウジョウバエをＰＢＳで解剖し、前足を固定緩衝液（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および２ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．９）で４％ホルムアルデヒドで２５分間固定させた後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で固定し、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）で撮影してイメージを獲得した。
【0096】
１－１５．ＢＮ－ＰＡＧＥ（Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ミトコンドリアは、製造社のプロトコルによってｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１４日齢の雄成虫ショウジョウバエから分離した後、精製されたミトコンドリア抽出物を２％ ｎ－ｄｏｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（ＤＤＭ）、１％ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎおよびｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｈａｌｔ）を含有する６０μＬの１×Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁させた。次に、サンプルをアイス上で１５分の間培養し、１２，０００×ｇで遠心分離した後、上澄み液でミトコンドリアタンパク質の濃度を測定し、前記上澄み液（２０μｇ）を０．５％ Ｇ－２５０サンプル添加剤と混合した後、４℃で３％～１２％ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＢＮ－ＰＡＧＥ（Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。この際、正極ランニング緩衝液（Ａｎｏｄｅ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）をゲル外部で使用して、負極ランニング緩衝液（ｃａｔｈｏｄｅ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）をゲル内部で使用し、ＰＡＧＥ後、マウス抗－ＮＤＵＦＳ３（１：５０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ＵＱＣＲＣ２（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ＡＴＰ５Ａ（１：１００００、Ａｂｃａｍ）抗体でウェスタンブロット分析を行った。
ミトコンドリアは、製造社のプロトコルによってｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１４日齢の雄成虫ショウジョウバエから分離した後、精製されたミトコンドリア抽出物を２％ ｎ－ｄｏｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（ＤＤＭ）、１％ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎおよびｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｈａｌｔ）を含有する６０μＬの１×Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁させた。次に、サンプルをアイス上で１５分の間培養し、１２，０００×ｇで遠心分離した後、上澄み液でミトコンドリアタンパク質の濃度を測定し、前記上澄み液（２０μｇ）を０．５％ Ｇ－２５０サンプル添加剤と混合した後、４℃で３％～１２％ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＢＮ－ＰＡＧＥ（Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。この際、正極ランニング緩衝液（Ａｎｏｄｅ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）をゲル外部で使用して、負極ランニング緩衝液（ｃａｔｈｏｄｅ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）をゲル内部で使用し、ＰＡＧＥ後、マウス抗－ＮＤＵＦＳ３（１：５０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ＵＱＣＲＣ２（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ＡＴＰ５Ａ（１：１００００、Ａｂｃａｍ）抗体でウェスタンブロット分析を行った。
【0097】
１－１６．ミトコンドリアスーパーオキシド測定
ショウジョウバエでのミトコンドリアＲＯＳ生成は、製造社のプロトコルによってミトコンドリア酸素自由ラジカル（ｏｘｙｇｅｎ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）表示器ｍｉｔｏＳＯＸ－Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。より具体的に、１１日齢のショウジョウバエの胸部から冷たいＰＢＳで切開した筋肉組織をＤＭＳＯ中５μＭ ＭｉｔｏＳＯＸ－Ｒｅｄと共に２５℃で２０分間培養した後、冷たいＰＢＳで３回洗浄した後、筋肉組織サンプルを迅速にＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬で処理して固定させた後、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）で１５分以内に観察し、この際、蛍光強度は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量した。
ショウジョウバエでのミトコンドリアＲＯＳ生成は、製造社のプロトコルによってミトコンドリア酸素自由ラジカル（ｏｘｙｇｅｎ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）表示器ｍｉｔｏＳＯＸ－Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。より具体的に、１１日齢のショウジョウバエの胸部から冷たいＰＢＳで切開した筋肉組織をＤＭＳＯ中５μＭ ＭｉｔｏＳＯＸ－Ｒｅｄと共に２５℃で２０分間培養した後、冷たいＰＢＳで３回洗浄した後、筋肉組織サンプルを迅速にＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬で処理して固定させた後、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）で１５分以内に観察し、この際、蛍光強度は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量した。
【0098】
１－１７．ＡＴＰ分析（ＡＴＰ ａｓｓａｙ）
２８日齢のショウジョウバエの胸部をＡＴＰａｓｅ酵素活性を阻害するために、１００μｌの抽出緩衝液（６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ－ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）で均質化させた後、抽出物を液体窒素で直ちに凍結させた後、加熱してＡＴＰ生成酵素（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を変性させた。以後、サンプルを２０，０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を新しいチューブに移した後、抽出緩衝液（１／１００）で希釈した後、９６－ウェルプレート各ウェルにサンプルを入れ、Ｅｎｌｉｔｅｎ ＡＴＰ分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光溶液と混合させ、Ｇｌｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して１０秒間隔で発光を測定した。次に、上澄み液を抽出緩衝液（１／２）で希釈してＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を測定した。以後、総タンパク質濃度で割って標準と比較した相対的なＡＴＰ水準を計算した。
２８日齢のショウジョウバエの胸部をＡＴＰａｓｅ酵素活性を阻害するために、１００μｌの抽出緩衝液（６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ－ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）で均質化させた後、抽出物を液体窒素で直ちに凍結させた後、加熱してＡＴＰ生成酵素（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を変性させた。以後、サンプルを２０，０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を新しいチューブに移した後、抽出緩衝液（１／１００）で希釈した後、９６－ウェルプレート各ウェルにサンプルを入れ、Ｅｎｌｉｔｅｎ ＡＴＰ分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光溶液と混合させ、Ｇｌｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して１０秒間隔で発光を測定した。次に、上澄み液を抽出緩衝液（１／２）で希釈してＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を測定した。以後、総タンパク質濃度で割って標準と比較した相対的なＡＴＰ水準を計算した。
【0099】
１－１８．タンパク質酸化分析（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
タンパク質酸化検出は、製造社のプロトコルによってＯｘｙＢｌｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。具体的に、２８日齢のショウジョウバエの胸部を６％ＳＤＳを含有する２％β－メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液で均質化させた後、均質液を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離してペレット破片は捨てた後、変性されたタンパク質を２５℃でＤＮＰＨ（２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ）で誘導体化した後、中和溶液で利用して中和させた。以後、ＤＮＰＨで標識されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、前記メンブレンを抗－ＤＮＰ抗体（１：１５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した後、ヤギ抗－ウサギＩｇＧ ＨＲＰ接合２次抗体（１：３００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して信号を検出し、この際、検出は、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して行い、バンド密度は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを通じて測定した。
タンパク質酸化検出は、製造社のプロトコルによってＯｘｙＢｌｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。具体的に、２８日齢のショウジョウバエの胸部を６％ＳＤＳを含有する２％β－メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液で均質化させた後、均質液を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離してペレット破片は捨てた後、変性されたタンパク質を２５℃でＤＮＰＨ（２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ）で誘導体化した後、中和溶液で利用して中和させた。以後、ＤＮＰＨで標識されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、前記メンブレンを抗－ＤＮＰ抗体（１：１５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した後、ヤギ抗－ウサギＩｇＧ ＨＲＰ接合２次抗体（１：３００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して信号を検出し、この際、検出は、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して行い、バンド密度は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを通じて測定した。
【0100】
１－１９．核／細胞質画分分析（Ｎｕｃｌｅａｒ／ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
雄ショウジョウバエの頭２０個を製造社のプロトコルによってｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）試薬で溶解させた後、異なる細胞画分でのタンパク質抽出物は、ＳＤＳローディング緩衝液と混合させた後、加熱してウェスタンブロット分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用させた。
雄ショウジョウバエの頭２０個を製造社のプロトコルによってｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）試薬で溶解させた後、異なる細胞画分でのタンパク質抽出物は、ＳＤＳローディング緩衝液と混合させた後、加熱してウェスタンブロット分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用させた。
【0101】
１－２０．タンパク質溶解度分析（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）
総タンパク質は、以前に記述された数種類を修正したプロトコル（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を使用して溶解度によって画分させ、７日または１４日齢のショウジョウバエの頭２０個をＳＤＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ－４０、および１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ７．５）なしに溶解緩衝液で均質化させた。以後、均質サンプルを１００，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して上澄み液を可溶性画分として収得した。また、残ったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を２％ＳＤＳを含む５０μｌ ２×緩衝液で追加で抽出して超音波処理後、９５℃で１０分間加熱した。前記過程での上澄み液は、不溶性画分として収得した。
総タンパク質は、以前に記述された数種類を修正したプロトコル（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を使用して溶解度によって画分させ、７日または１４日齢のショウジョウバエの頭２０個をＳＤＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ－４０、および１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ７．５）なしに溶解緩衝液で均質化させた。以後、均質サンプルを１００，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して上澄み液を可溶性画分として収得した。また、残ったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を２％ＳＤＳを含む５０μｌ ２×緩衝液で追加で抽出して超音波処理後、９５℃で１０分間加熱した。前記過程での上澄み液は、不溶性画分として収得した。
【0102】
１－２１．ＧＳＨ／ＧＳＳＧ含量
酸化形態（グルタチオンスルフィド、ＧＳＳＧ）および還元形態のグルタチオン（ＧＳＨ）の測定のための方法は、製造社のプロトコルによってグルタチオン分析キット（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を利用して測定し、より具体的に、１０日齢のショウジョウバエ頭１０個の総グルタチオンを５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液５０μｌで均質化させた後、サンプルを１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移した。以後、サンプルに同じ量のＭＰＡ試薬を添加し、室温で５分間放置し、前記混合物を２，０００×ｇで２分間遠心分離させた後、２．５μｌのＴＥＡＭ試薬を追加した即後に、サンプルをボルテキシングした。次に、サンプルを９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、ＭＥＳ緩衝液、補助因子混合物（Ｃｏｆａｃｔｏｒ ｍｉｘｔｕｒｅ）、酵素混合物（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）およびＤＴＮＢの混合物を添加した。以後、Ｇｌｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して４０５ｎｍ吸光度を測定し、２．５μｌのＴＥＡＭ試薬を添加した後、全体グルタチオン分析法と同じ方法を使用して酸化形態グルタチオン（ＧＳＳＧ）を測定した。また、２－ビニルピリジン（２－ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）を追加で添加して、２５℃で１時間の間培養を進めた後、全体グルタチオン分析法と同じ過程を進めて、上澄み液を抽出緩衝液（１／１０）で希釈してＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を測定した。標準のレベルと比較した酸化形態グルタチオン（ＧＳＳＧ）および還元形態のグルタチオン（ＧＳＨ）のレベルの計算値を得るために、全体タンパク質の濃度で割る。
酸化形態（グルタチオンスルフィド、ＧＳＳＧ）および還元形態のグルタチオン（ＧＳＨ）の測定のための方法は、製造社のプロトコルによってグルタチオン分析キット（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を利用して測定し、より具体的に、１０日齢のショウジョウバエ頭１０個の総グルタチオンを５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液５０μｌで均質化させた後、サンプルを１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移した。以後、サンプルに同じ量のＭＰＡ試薬を添加し、室温で５分間放置し、前記混合物を２，０００×ｇで２分間遠心分離させた後、２．５μｌのＴＥＡＭ試薬を追加した即後に、サンプルをボルテキシングした。次に、サンプルを９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、ＭＥＳ緩衝液、補助因子混合物（Ｃｏｆａｃｔｏｒ ｍｉｘｔｕｒｅ）、酵素混合物（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）およびＤＴＮＢの混合物を添加した。以後、Ｇｌｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して４０５ｎｍ吸光度を測定し、２．５μｌのＴＥＡＭ試薬を添加した後、全体グルタチオン分析法と同じ方法を使用して酸化形態グルタチオン（ＧＳＳＧ）を測定した。また、２－ビニルピリジン（２－ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）を追加で添加して、２５℃で１時間の間培養を進めた後、全体グルタチオン分析法と同じ過程を進めて、上澄み液を抽出緩衝液（１／１０）で希釈してＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を測定した。標準のレベルと比較した酸化形態グルタチオン（ＧＳＳＧ）および還元形態のグルタチオン（ＧＳＨ）のレベルの計算値を得るために、全体タンパク質の濃度で割る。
【0103】
実施例２．ＦＵＳタンパク質の体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）グルタチオニル化確認
本実施例では、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こるか否かを確認するために、ｍｙｃ－標識されたヒトＦＵＳ組み換え全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）タンパク質に酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）を加えて培養した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離してマウス抗－ＧＳＨ抗体およびマウス抗－ｍｙｃ抗体を利用してウェスタンブロット分析を行った。
本実施例では、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こるか否かを確認するために、ｍｙｃ－標識されたヒトＦＵＳ組み換え全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）タンパク質に酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）を加えて培養した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離してマウス抗－ＧＳＨ抗体およびマウス抗－ｍｙｃ抗体を利用してウェスタンブロット分析を行った。
【0104】
その結果、図１のａおよび図１のｂが示すように、酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）の濃度が増加するほど（０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．０５ｍＭ、１ｍＭ）、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質が多量検出されることを確認した。上記の結果から推察するとき、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）の濃度に依存的にＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こることを確認した。
【0105】
実施例３．ＦＵＳタンパク質の体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）グルタチオニル化確認
本実施例では、体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こるか否かを確認するために、ニューロンで特異的に発現するヒトＦＵＳタンパク質をｅｌａｖ－Ｇａｌ４ ｄｒｉｖｅｒを使用してショウジョウバエのニューロンで発現した。具体的に、ｐＣＭＶ６－ＦＵＳ－ＧＦＰが標識されたヒト野生型ＦＵＳタンパク質をショウジョウバエに形質感染させる。ＤＡＰＩで染色された部分は、核の位置を示す。
本実施例では、体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こるか否かを確認するために、ニューロンで特異的に発現するヒトＦＵＳタンパク質をｅｌａｖ－Ｇａｌ４ ｄｒｉｖｅｒを使用してショウジョウバエのニューロンで発現した。具体的に、ｐＣＭＶ６－ＦＵＳ－ＧＦＰが標識されたヒト野生型ＦＵＳタンパク質をショウジョウバエに形質感染させる。ＤＡＰＩで染色された部分は、核の位置を示す。
【0106】
その結果、ショウジョウバエ脳のニューロンでヒト野生型ＦＵＳタンパク質は、主に核に位置するが、図２ａの矢印が示すように、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質が過発現した場合、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体が細胞質で多量観察されることを確認した（緑色）。また、図２ｂの矢印が示すように、還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）が細胞質で観察されることを確認した（赤色）。また、図２ａと図２ｂを併合した図２ｄの矢印が示すように、脳のニューロン細胞質のＦＵＳタンパク質凝集体は、還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）と同じ位置で観察されることを確認した。上記の結果は、体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）によりグルタチオニル化したヒト野生型ＦＵＳタンパク質と前記グルタチオニル化により生成された還元形態のグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）が細胞質で一緒に存在することを意味する。
【0107】
実施例４．哺乳類システムでＦＵＳタンパク質の体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）グルタチオニル化
本実施例では、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質およびヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質のグルタチオニル化が哺乳類システムでも起こるか否かを確認するために、マウスの神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株であるＮｅｕｒｏｎ２ａ（Ｎ２ａ）でヒト野生型ＦＵＳタンパク質とヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質を発現（形質感染）した。ＤＡＰＩで染色された部分は、核の位置を示す。
本実施例では、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質およびヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質のグルタチオニル化が哺乳類システムでも起こるか否かを確認するために、マウスの神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株であるＮｅｕｒｏｎ２ａ（Ｎ２ａ）でヒト野生型ＦＵＳタンパク質とヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質を発現（形質感染）した。ＤＡＰＩで染色された部分は、核の位置を示す。
【0108】
その結果、図３ａの矢印が示すように、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体が細胞質で多量観察されることを確認した（緑色）。また、図３ｂの矢印が示すように、還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）が細胞質で観察されることを確認した（赤色）。図３ａと図３ｂを併合した図３ｄの矢印が示すように、還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）の陽性信号は、ヒト野生型ＦＵＳタンパク質凝集体が存在する細胞質で主に検出されることを確認した。また、図４ａの矢印が示すように、ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌタンパク質凝集体が細胞質で多量観察されることを確認した（緑色）。また、図４ｂの矢印が示すように還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）が細胞質で観察されることを確認した（赤色）。図４ａと図４ｂを併合した図４ｄの矢印が示すように還元形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）の陽性信号は、ヒト突然変異ＦＵＳＰ５２５Ｌ凝集体が存在する細胞質で主に検出されることを確認した。上記の結果に鑑みると、ショウジョウバエ体内で起こるヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が哺乳類システムでも起こることを確認した。
【0109】
実施例５．ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化の位置確認
５－１．質量分析法を利用したＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化の位置確認
本実施例では、ヒトＦＵＳタンパク質私のグルタチオニル化が起こる部位を確認するために、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｍｙｃ－標識されたヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を誘導し、グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質をクマシー染色ゲル（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｇｅｌ）を使用して検出した。次に、前記ヒトＦＵＳタンパク質バンドをゲルで切除し、トリプシンで分解した後、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＭＡＬＤＩ）－質量分析を行った。
５－１．質量分析法を利用したＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化の位置確認
本実施例では、ヒトＦＵＳタンパク質私のグルタチオニル化が起こる部位を確認するために、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｍｙｃ－標識されたヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を誘導し、グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質をクマシー染色ゲル（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｇｅｌ）を使用して検出した。次に、前記ヒトＦＵＳタンパク質バンドをゲルで切除し、トリプシンで分解した後、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＭＡＬＤＩ）－質量分析を行った。
【0110】
その結果、図５に示すように、質量分析により３０５Ｄａの質量差異を有するアミノ酸重合体（ｐｅｐｔｉｄｅ）が検出された。これは、一つの還元形態グルタチオン（ＧＳＨ ｍｏｉｅｔｙ）に該当する質量であり、図５のＭＡＬＤＩ－質量分析グラフを総合してみるとき、図６の矢印が示すように、ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメイン（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）のＣｙｓ－４４７部位でヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こることを確認した。
【0111】
５－２．種間ＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメイン配列の保存の可否の確認
ＦＵＳタンパク質のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインは、４個のシステインを含む。真核生物でＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの配列のうち前記システインの配列が保存されているかを確認するために、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの配列を分析した。
ＦＵＳタンパク質のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインは、４個のシステインを含む。真核生物でＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの配列のうち前記システインの配列が保存されているかを確認するために、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの配列を分析した。
【0112】
その結果、図１２に示すように、ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの前記４個のシステイン全部がキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）で保存されていることを確認した。
【0113】
実施例６．ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化による凝集体形成の確認
６－１．グルタチオニル化したＦＵＳの溶解度分析
実施例１～３で確認したように、グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質凝集体がショウジョウバエ脳ニューロンの細胞質で観察され、実施例５で確認したように、ＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメイン、Ｃｙｓ－４４７でグルタチオニル化が起こる。上記の実施例に基づいて、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化がＦＵＳタンパク質凝集体形成に影響を与えるか否かを確認するために、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質の溶解度を測定する実験を行った。具体的に、図７に示すように、ＨＥＫ２９３細胞で精製したｍｙｃ－標識されたヒトＦＵＳタンパク質に酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）を添加してヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を誘導した後、タンパク質毒性ストレスである熱－ストレス（ｈｅａｔ－ｓｔｒｅｓｓ）に露出させた。グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質の溶解度は、各サンプルの上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）およびペレット（ｐｅｌｌｅｔ）の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）で前記ヒトＦＵＳタンパク質を定量化して、ウェスタンブロット分析を通じて異なる時点に測定した。
６－１．グルタチオニル化したＦＵＳの溶解度分析
実施例１～３で確認したように、グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質凝集体がショウジョウバエ脳ニューロンの細胞質で観察され、実施例５で確認したように、ＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメイン、Ｃｙｓ－４４７でグルタチオニル化が起こる。上記の実施例に基づいて、ＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化がＦＵＳタンパク質凝集体形成に影響を与えるか否かを確認するために、グルタチオニル化したＦＵＳタンパク質の溶解度を測定する実験を行った。具体的に、図７に示すように、ＨＥＫ２９３細胞で精製したｍｙｃ－標識されたヒトＦＵＳタンパク質に酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）を添加してヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化を誘導した後、タンパク質毒性ストレスである熱－ストレス（ｈｅａｔ－ｓｔｒｅｓｓ）に露出させた。グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質の溶解度は、各サンプルの上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）およびペレット（ｐｅｌｌｅｔ）の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）で前記ヒトＦＵＳタンパク質を定量化して、ウェスタンブロット分析を通じて異なる時点に測定した。
【0114】
その結果、図８に示すように、酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）の添加がないヒトＦＵＳタンパク質の可溶性画分は、高い水準の可溶性を３７℃の条件で２時間の間維持することを確認した。
【0115】
また、酸化形態グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＧＳＳＨ）を添加して、グルタチオニル化したヒトＦＵＳタンパク質の可溶性画分の可溶性を上記のような条件で測定した結果、可溶性の程度が９０％の水準から２０％の水準に急激に減少することを確認した。
【0116】
上記の結果および実施例５の結果を総合してＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化がＦＵＳタンパク質凝集体の形成を誘導することを確認した。
【0117】
６－２．ＦＵＳのＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの３次元相同モデル分析
Ｃｙｓ－４４７残基の相対的位置の構造的根拠を獲得するために、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ ｓｅｒｖｅｒを使用してヒトＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの３次元相同モデルを生成し、前記ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインモデルは、ＰＤＢ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｂａｎｋ）で構造相同性領域を有するタンパク質を探索するのに使用された。
Ｃｙｓ－４４７残基の相対的位置の構造的根拠を獲得するために、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ ｓｅｒｖｅｒを使用してヒトＦＵＳタンパク質内ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインの３次元相同モデルを生成し、前記ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメインモデルは、ＰＤＢ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｂａｎｋ）で構造相同性領域を有するタンパク質を探索するのに使用された。
【0118】
その結果、図９に示すように、ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメイン内Ｃｙｓ－４４７残基が酸化的変形のために表面に露出していることを確認した。このようにエツクトェン３次元相同モデルの構造に基づいて、ヒトＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化においてＣｙｓ－４４７の高い感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を提示し、ＲａｎＢＰ２亜鉛－フィンガードメイン内で構造変化の可能性を証明した。
【0119】
実施例７．ＦＵＳのグルタチオニル化確認
グルタチオニル化は、システインと還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）との間のジスルフィド結合の結果であって、これによって、タンパク質構造および機能の変化をもたらすことができることが知られている。
グルタチオニル化は、システインと還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）との間のジスルフィド結合の結果であって、これによって、タンパク質構造および機能の変化をもたらすことができることが知られている。
【0120】
これにより、ＦＵＳのグルタチオニル化が起こるか否かを確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏグルタチオニル化分析を行った結果、図１０ａに示されたように、野生ＦＵＳタンパク質は、多様な濃度の酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の存在下にグルタチオニル化することを確認し、また、ＦＵＳのグルタチオニル化を抗－ＧＳＨおよび抗－ｍｙｃ抗体でウェスタンブロット分析を行った結果、グルタチオニル化したＦＵＳは、混合ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合を切断する２－メルカプトエタノール（２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）またはジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）のような還元剤を処理する場合、ＦＵＳに還元されることを確認した。すなわち、ＧＳＳＧの濃度に依存的にＦＵＳタンパク質のグルタチオニル化が起こることを確認することができた。
【0121】
また、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＵＳのグルタチオニル化を確認するために、ニューロンで特異的に発現するヒトＦＵＳをｅｌａｖ－Ｇａｌ４ ｄｒｉｖｅｒを使用してショウジョウバエのニューロンで発現した。
【0122】
その結果、図１０ｂの白色矢印に示されたように、ＦＵＳタンパク質は、主にニューロンの核に限定されたが、ＦＵＳが過発現したハエ頭脳のニューロンで細胞質のＦＵＳ凝集体が多く観察されたことを確認することができた。また、興味深くにも、細胞質および誤って局在した（ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚｅｄ）ＦＵＳは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に示された結果と同様に、脳組織でＧＳＨと共に共通配置されることを確認することができた。
【0123】
次に、ＦＵＳおよびこれの突然変異であるＦＵＳＰ２５２Ｌのグルタチオニル化が哺乳類システムでも上記のような結果を示すかを確認してみるために、マウス神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株であるＮｅｕｒｏｎ２ａ（Ｎ２ａ）でｈｕｍａｎ ＦＵＳとＦＵＳＰ５２５Ｌを発現させてみた結果、図１０ｃに示されたように、ＧＳＨ－陽性信号がＦＵＳまたはＦＵＳＰ５２５Ｌ凝集体に限定されて示されることを確認できた。
【0124】
したがって、ＦＵＳとＦＵＳＰ５２５Ｌがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でグルタチオニル化することを確認することができた。
【0125】
最終的に、グルタチオニル化部位を同定するために、ｍｙｃ－タグヒトＦＵＳをｉｎ ｖｉｔｒｏでグルタチオニル化を誘導し、クマシー染色ゲル（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｇｅｌ）を通じてバンドを検出した後、ＦＵＳタンパク質バンドをゲルから摘出し、トリプシン消化させた後、ＭＡＬＤＩ－質量分析法で分析を進めた。
【0126】
その結果、図５に示されたように、一つのＧＳＨ ｍｏｉｅｔｙを示す３０５ Ｄａの質量差異を有するペプチドが質量分析により検出された。ＦＵＳのＲａｎＢＰ２ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ（ＺｎＦ）ドメインは、４個のシステインを有していて、生体内酸化ストレスに敏感でありうる。
【0127】
また、真核生物のうちシステイン保存に対するＦＵＳ配列を調査し、４個のシステインが全部ハエからヒトまでよく保存されることを確認でき、このうち、ＲａｎＢＰ２型ＺｎＦドメイン、Ｃｙｓ－４４７（図７、矢印）でグルタチオニル化する部位を確認した。
【0128】
したがって、ヒトＦＵＳがＣｙｓ－４４７残基で特異的にグルタチオニル化することを確認することができた。
【0129】
実施例８．ＦＵＳのグルタチオニル化による凝集体形成の確認
翻訳後変形（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ＡＬＳ（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を含む様々な神経退行性疾患で病因性タンパク質凝集に重要なメディエータとして知られてきた。本発明者らは、図１ｂに示されたように、すでに細胞質または間違って配置されたＦＵＳタンパク質は、ショウジョウバエ頭脳でＧＳＨと共に共通配置されることを確認することができた。上記実験的背景は、ＦＵＳのＺｎＦドメインでＣｙｓ－４７７のグルタチオニル化がＦＵＳ凝集体の発生可能性を示す。したがって、細胞質内ＦＵＳ凝集がＦＵＳグルタチオニル化により調節され得ると予測した。
翻訳後変形（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ＡＬＳ（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を含む様々な神経退行性疾患で病因性タンパク質凝集に重要なメディエータとして知られてきた。本発明者らは、図１ｂに示されたように、すでに細胞質または間違って配置されたＦＵＳタンパク質は、ショウジョウバエ頭脳でＧＳＨと共に共通配置されることを確認することができた。上記実験的背景は、ＦＵＳのＺｎＦドメインでＣｙｓ－４７７のグルタチオニル化がＦＵＳ凝集体の発生可能性を示す。したがって、細胞質内ＦＵＳ凝集がＦＵＳグルタチオニル化により調節され得ると予測した。
【0130】
これにより、Ｃｙｓ－４７７の残基でのＦＵＳグルタチオニル化がＦＵＳタンパク質の凝集を調節するか否かを確認するために、ＦＵＳに対する溶解度試験を行った。
【0131】
より具体的に、ＨＥＫ２９３細胞で精製されたｍｙｃ－タグヒトＦＵＳタンパク質をＧＳＳＧと共に添加して培養することによって、グルタチオニル化を誘導し、タンパク質毒性ストレスを与えるために熱衝撃に露出させた（図７参照）。
【0132】
ＦＵＳ溶解度は、ウェスタンブロット分析で各サンプルの上澄み液およびペレット画分でＦＵＳタンパク質を異なる時点で定量化して評価した。
【0133】
その結果、図８に示されたように、ＧＳＳＧ処理がないＦＵＳタンパク質は、３７℃で２時間の間高い可溶性で残ることができるが、ＧＳＳＧを処理してグルタチオニル化を誘導した後、可溶性画分のＦＵＳタンパク質は、２時間後からＧＳＳＧを処理しないＦＵＳタンパク質と比較して溶解度が９０％から２０％に急激に減少することを確認することができた。
【0134】
これは、ＦＵＳのグルタチオニル化は、凝集体の形成を有意に誘導することを示すものであり、Ｃｙｓ－４４７残基のＦＵＳグルタチオニル化がタンパク質凝集を誘導し、ＦＵＳ凝集体形成の重要な決定因子として、システイングルタチオニル化を支持できる仮説を証明することができた。
【0135】
また、Ｃｙｓ－４４７残基の相対的位置に対する構造的根拠をさらに評価するために、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲサーバーを使用してヒトＦＵＳ ＺｎＦドメインの３次元相同モデルを生成し、前記ＦＵＳ ＺｎＦドメインモデルは、ＰＤＢ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｂａｎｋ）で構造相同性領域を有するタンパク質を探索するのに使用された。
【0136】
その結果、図９に示されたように、ＺｎＦドメイン内のＣｙｓ－４４７残基が酸化的変形のために表面に露出していることを確認でき、これは、グルタチオニル化に対するＣｙｓ－４４７の高い感受性を立証することができることを提示し、ＺｎＦドメイン内で構造変化の可能性を示した。
【0137】
実施例９．ＧｓｔＯ２のＦＵＳによる神経細胞毒性抑制効果の確認
グルタチオニル化したＦＵＳによる病理を減らすために、グルタチオニル化過程を調節できる正確な分子メカニズムおよびタンパク質を確認しようとし、ＧＳＴＯ（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を潜在的な候補物質として選定した。
グルタチオニル化したＦＵＳによる病理を減らすために、グルタチオニル化過程を調節できる正確な分子メカニズムおよびタンパク質を確認しようとし、ＧＳＴＯ（ｏｍｅｇａ ｃｌａｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を潜在的な候補物質として選定した。
【0138】
ヒトＧＳＴＯ１は、以前の報告によれば、脱グルタチオニル化酵素として作用することができることが知られており、また、本発明者らは、以前にヒトＧＳＴＯ１のショウジョウバエ相同染色体であるＧｓｔＯ２がショウジョウバエＰＤモデル（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）でＡＴＰ合成酵素β ｓｕｂｕｎｉｔのグルタチオニル化を調節することによって、神経毒性を抑制することを報告したことがある。
【0139】
上記背景知識を基に、本発明者らは、ＦＵＳにより誘発されたＡＬＳ発病機序でグルタチオニル化の新しい役割と調節因子を確認するために、ショウジョウバエを遺伝ツールとして利用した。まず、ＧｓｔＯ２の増加がショウジョウバエでヒトＦＵＳの過発現による表現型を緩和させることができるか否かを確認しようとした。
【0140】
より具体的に、ショウジョウバエでＧｓｔＯ２およびＦＵＳ間の機能的関係を評価するために、ＧｓｔＯ２の過発現および眼に特異的な（ｅｙｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｇａｌ４、ＧＭＲ－Ｇａｌ４により誘導されたＦＵＳが発現した形質転換ショウジョウバエを生成した。
【0141】
なお、ショウジョウバエ遺伝接近法を使用した最近の研究によれば、成虫の眼でＦＵＳ発現は、荒い眼の表現型を示すことが知られているが、以前の報告と同様に、ＦＵＳ発現が荒い眼の表現型を示し、ｏｍｍａｔｉｄｉａｌ組織を破裂させることを確認した。
【0142】
しかし、ＦＵＳとＧｓｔＯ２の同時発現は、荒い眼の表現型を顕著に回復させることを確認でき、単独ＧｓｔＯ２発現ハエで破裂した眼の変化も発見されなかった（図１１ａ）。上記結果は、ＧｓｔＯ２がショウジョウバエでＦＵＳと遺伝的に相互作用することを示す。
【0143】
次に、ｐａｎ－ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｇａｌ４、ｅｌａｖ－Ｇｌａ４を使用してＦＵＳ発現による運動性欠陥機序を確認するために、ニューロンでＦＵＳを発現する幼虫の運動性を調査するｌａｒｖａｌ ｃｒａｗｌｉｎｇ実験を行った。
【0144】
その結果、図１１ｂに示されたように、ニューロンでＦＵＳを発現するショウジョウバエは、対照群と比較して運動性が大きく減少することを確認できたが、ＧｓｔＯ２と同時発現させた場合、幼虫のクローリング活動を向上させることを確認した。他方で、ＧｓｔＯ２－ノックダウンＦＵＳを発現する幼虫の場合には、クローリング活動を失うことを確認することができた。なお、単独ＧｓｔＯ２の過発現またはノックダウンは、幼虫のクローリング活動に何の影響を及ぼさないことを確認することができた。
【0145】
上記結果から、本発明の発明者らは、幼虫の運動性欠陥がＮＭＪ（ｎｅｕｒｏｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）で欠陥から引き起こされるか否かを確認するために、ＮＭＪでシナプスボタン（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｂｏｕｔｏｎ）の数を調査した。
【0146】
その結果、図１１ｃに示されたように、ｅｌａｖ－Ｇａｌ４の調節下にＦＵＳを発現させたハエのＮＭＪで総ボタン数が顕著に減少することを確認したが、この表現型は、ＧｓｔＯ２の同時発現により顕著に回復され、ただし、ＧｓｔＯ２自体だけでは、ボタン数の減少を抑制する効果はなかったが、ＧｓｔＯ２－ノックダウンＦＵＳを発現するハエは、ＮＭＪでボタン数が減少しないことを確認することができた。
【0147】
また、図１１ｄに示されたように、ニューロンでＦＵＳの発現は、寿命を大きく短縮させるが、ＧｓｔＯ２の同時発現により寿命を回復させることを確認することができた。しかし、図１１ｅに示されたように、ＦＵＳを発現するハエでＧｓｔＯ２－ノックダウンは、部分的に寿命を短縮させるだけでなく、ＧｓｔＯ２ ＲＮＡｉにより影響を受けなかった。
【0148】
なお、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｇｅｏｔａｘｉｓ分析は、ＡＬＳを含む多様な神経退行性疾患研究で神経システムの機能障害を評価する分析であって、本発明によるショウジョウバエモデルシステムに適用した結果、図１１ｆに示されたように、以前の研究と一致するが如く、ＦＵＳ－発現ハエは、年齢－マッチング対照群と比較して顕著に減少したクライミング活性を示すことを確認したが、ニューロンでＧｓｔＯ２の同時発現したＦＵＳ－発現ハエの場合には、クライミング欠損を顕著に抑制させることができることを確認した。この際、単独ＧｓｔＯ２過発現は、クライミング能力に影響を及ぼさないことを確認することができた。
【0149】
したがって、上記データから、ＧｓｔＯ２発現調節を通じてＦＵＳで誘導された神経毒性を顕著に抑制または強化させることができることを確認することができた。
【0150】
実施例１０．ＧｓｔＯ２によるＦＵＳで誘導されたミトコンドリア力学およびＯＸＰＨＯＳ機能障害抑制の確認
異常なミトコンドリアがＡＬＳの動物モデルで一貫して観察されることが知られている（Ｄａｌ Ｃａｎｔｏ ａｎｄ Ｇｕｒｎｅｙ、１９９４；Ｍａｇｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。また、運動ニューロンで突然変異ＦＵＳの過発現は、ミトコンドリアの分裂を起こし（Ｔｒａｄｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞に野生型および突然変異形態のＦＵＳの発現は、ミトコンドリアＡＴＰ生産を減少させた（Ｓｔｏｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。たとえ多様な以前の研究でミトコンドリア機能障害がＡＬＳの共通した特徴として残っているが、ＦＵＳ誘導によるタンパク質病症でミトコンドリア力学およびＯＸＰＨＯＳ（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）システムの機能障害がＡＬＳ発病機序に主要な原因であることは未だ立証されていない。これにより、本発明者らは、以前の研究でミトコンドリア分裂がＦＵＳ－発現ハエの筋肉または運動ニューロンで強化されることを確認し、ミトコンドリア融合タンパク質によるＭａｒｆ不安定性によりミトコンドリア力学の不均衡を引き起こすことを確認した（Ａｌｔａｎｂｙｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
異常なミトコンドリアがＡＬＳの動物モデルで一貫して観察されることが知られている（Ｄａｌ Ｃａｎｔｏ ａｎｄ Ｇｕｒｎｅｙ、１９９４；Ｍａｇｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。また、運動ニューロンで突然変異ＦＵＳの過発現は、ミトコンドリアの分裂を起こし（Ｔｒａｄｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞に野生型および突然変異形態のＦＵＳの発現は、ミトコンドリアＡＴＰ生産を減少させた（Ｓｔｏｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。たとえ多様な以前の研究でミトコンドリア機能障害がＡＬＳの共通した特徴として残っているが、ＦＵＳ誘導によるタンパク質病症でミトコンドリア力学およびＯＸＰＨＯＳ（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）システムの機能障害がＡＬＳ発病機序に主要な原因であることは未だ立証されていない。これにより、本発明者らは、以前の研究でミトコンドリア分裂がＦＵＳ－発現ハエの筋肉または運動ニューロンで強化されることを確認し、ミトコンドリア融合タンパク質によるＭａｒｆ不安定性によりミトコンドリア力学の不均衡を引き起こすことを確認した（Ａｌｔａｎｂｙｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0151】
前記研究結果を基に、ＧｓｔＯ２発現がＦＵＳ発現ハエのミトコンドリア分裂を抑制するか否かを確認しようとし、このために、胸部の筋肉でＦＵＳを発現するハエのＧｓｔＯ２の影響を特性化した。
【0152】
前記ＧｓｔＯ２の影響を特性化するために、ＦＵＳ発現ショウジョウバエラインを筋肉特異的Ｇａｌ４、Ｍｈｃ－Ｇａｌ４と交差させた後、ミトコンドリアは、ミトコンドリア－標的ＧＦＰ（ｍｉｔｏＧＦＰ）を発現させることによって視覚化した。
【0153】
その結果、図１２ａに示されたように、ＦＵＳ－発現ハエの場合、ミトコンドリアのサイズが対照群と比較してひどく小さく、断片的なミトコンドリアを確認でき、単独ＧｓｔＯ２の過発現群は、ミトコンドリア形態の検出可能な変化を発見することはできなかった。しかし、ＦＵＳ－発現ハエでＧｓｔＯ２を同時発現させた場合、ミトコンドリアのサイズが劇的に回復されることを確認することができた。
【0154】
次に、ＧｓｔＯ２が運動ニューロンでミトコンドリアの形態を回復させるか否かを確認するために、ｍｉｔｏＧＦＰと共に運動神経特異的Ｇａｌ４、Ｄ４２－Ｇａｌ４を使用してＧｓｔＯ２を過発現させた。
【0155】
その結果、図１２ｂに示されたように、ＦＵＳ－発現ハエの筋肉で分裂したミトコンドリアに対するＧｓｔＯ２の回復効果と一致するが如く、成虫ハエの足の運動ニューロンでＦＵＳの発現は、ミトコンドリア分裂を増加させることを確認することができた。しかし、このような表現型も、ＧｓｔＯ２の同時発現により抑制されることを確認することができた。
【0156】
また、ミトコンドリア分裂がミトコンドリア力学を調節するタンパク質の機能障害によるものであるかを調査した。本発明者らは、以前の研究でＦＵＳ－発現ハエで減少したＭａｒｆ発現がミトコンドリアの過度な分裂を誘導することを確認したところ（Ａｌｔａｎｂｙｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、Ｍａｒｆ発現がＧｓｔＯ２により変化するか否かを評価した。
【0157】
その結果、図１２ｃに示されたように、ＧｓｔＯ２と同時発現したＦＵＳハエのＭａｒｆ発現が豊富に増加することを確認できたが、Ｏｐａ１水準は、そのまま残っていることを確認することができた。
【0158】
次に、ＦＵＳ過発現でミトコンドリアの形態学的変化がＯＸＰＨＯＳシステムに影響を及ぼすかを確認するために、ＦＵＳ－誘導ＡＬＳで不均衡なミトコンドリア力学の機能的関連性を評価した。より具体的に、ＦＵＳ－発現ハエの様々な複合サブユニットの水準を分析して、間接的に測定されたＥＴＣ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ）でミトコンドリア複合体の含量を測定した。
【0159】
その結果、図１２ｄに示されたように、ＦＵＳ－発現ハエは、複合体ＩサブユニットであるＮＤＵＦＳ３および複合体ＩＩＩサブユニットであるＵＱＣＲＣ２を顕著に減少させたが、複合体ＶであるＡＴＰ５Ａのα－サブユニットはほとんど変化しないことを確認することができた。なお、ショウジョウバエの複合体ＩＩおよびＩＶサブユニットのうちいずれか一つと交差反応する抗体を探すことができなかったので、これらの含量を測定することができなかった。この際、ＦＵＳを利用したＧｓｔＯ２の過発現は、ＮＵＤＦＳ３およびＵＱＣＲＣ２の濃度を対照群と類似の水準に回復させることを確認することができた。
【0160】
複合体アセンブリーをさらに研究するために、成虫ハエの胸部の組織から精製されたミトコンドリアに対するＢＮ－ＰＡＧＥ（ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。
【0161】
その結果、図１２ｅに示されたように、ＦＵＳ発現ハエで複合体ＩおよびＩＩＩサブユニットの発現減少効果と一致するように組み立て複合体ＩおよびＩＩＩの水準は、ＦＵＳ発現ハエでＢＮ－ＰＡＧＥで減少することを確認することができた。特に、ＦＵＳ誘導複合体ＩおよびＩＩＩの解体は、また、ＧｓｔＯ２の過発現により緩和され得るが、複合体Ｖアセンブリーの状態は、すべての突然変異ラインでも変わらないことを確認した。
【0162】
次に、ＧｓｔＯ２がミトコンドリア機能性を回復させることができるか否かを確認するために、ｍｉｔｏＳＯＸを使用してＦＵＳ発現ハエで活性酸素種（ＲＯＳ）のミトコンドリア生産を測定した。
【0163】
その結果、図１２ｆに示されたように、ＲＯＳ生産がＦＵＳ－発現ハエで増加することを確認し、ＧｓｔＯ２発現により回復することを確認することができた。
【0164】
また、ミトコンドリアは、ＡＴＰの形態で細胞エネルギーを生産するが、ＦＵＳ－発現ハエでＡＴＰ水準が対照群に比べて顕著に減少することを確認することができた（図１２ｇ）。
【0165】
ＧｓｔＯ２が細胞質内部酸化ストレスの増加を減少させることができるか否かを細胞質内酸化したタンパク質の量を測定した。
【0166】
その結果、図１２ｈに示されたように、酸化したタンパク質がＦＵＳ－発現ハエで増加することを観察し、ＧｓｔＯ２発現により回復することを確認することができた。
【0167】
したがって、ＦＵＳにより誘導された細胞質内部酸化ストレスとミトコンドリア力学不均衡および機能障害をＧｓｔＯ２により顕著に予防できることを確認することができた。
【0168】
実施例１１．ＧｓｔＯ２によるショウジョウバエ神経細胞でＦＵＳの凝集体形成抑制効果の確認
ＧｓｔＯ２過発現がショウジョウバエでＦＵＳ発現により引き起こされたすべての欠陥表現型の抑制を確認する上記結果は、ＧｓｔＯ２が神経細胞で病因因子であるＦＵＳの減少を促進させることができることを示唆する。
ＧｓｔＯ２過発現がショウジョウバエでＦＵＳ発現により引き起こされたすべての欠陥表現型の抑制を確認する上記結果は、ＧｓｔＯ２が神経細胞で病因因子であるＦＵＳの減少を促進させることができることを示唆する。
【0169】
これにより、ＧｓｔＯ２によるショウジョウバエ神経細胞でのＦＵＳの凝集体形成抑制効果を確認するために、ＦＵＳ－発現成虫ハエの脳抽出物の免疫ブロッティングを進めた結果、ＧｓｔＯ２の同時発現は、ＦＵＳ水準に影響を及ぼさないことを確認できたが（図１３ａ参照）、図１３ｂに示されたように、ＦＵＳ－発現ハエでＧｓｔＯ２のノックダウンは、ＦＵＳタンパク質を増加させることを確認することができた。
【0170】
次に、ＧｓｔＯ２の発現が脳組織でＦＵＳのｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを抑制するか否かを確認するために、細胞質および核でＦＵＳ水準を測定するための核／細胞質画分分析を行った。
【0171】
その結果、図１３ｃに示されたように、ＧｓｔＯ２－ＦＵＳの同時発現でＦＵＳタンパク質水準が細胞質画分では減少したが、核画分では減少しないことを確認することができた。したがって、ＧｓｔＯ２が細胞質でＦＵＳタンパク質水準を減少させることによって、ＦＵＳ毒性抑制子として作用する可能性があることを確認することができた。
【0172】
トランスジェニックハエでＦＵＳ凝集に対するＧｓｔＯ２の影響をさらに調べてみるために、多様な遺伝子型のハエ頭を収集し、変形された溶解緩衝液で溶解させた後、洗剤可溶性および不溶性画分に分離した。
【0173】
その結果、図１３ｄに示されたように、ＧｓｔＯ２およびＦＵＳを同時発現ハエは、可溶性画分でＦＵＳ量を有意的に増加させ、不溶性画分では、ＦＵＳ量を減少させることを確認することができた。他方で、ＧｓｔＯ２の神経細胞特異的ノックダウンは、可溶性画分から不溶性画分にＦＵＳ転換を誘導することを確認することができた。また、ＦＵＳ－発現ハエと比較してＧｓｔＯ２同時発現ハエで不溶性／可溶性ＦＵＳの比率が＞４０％に減少したのに対し、ＧｓｔＯ２ノックダウンＦＵＳ－発現ハエでは、不溶性／可溶性ＦＵＳの比率が大きく増加することを可溶性および不溶性ＦＵＳの定量化を通じて知ることができた。
【0174】
他方で、図１３ｅに示されたように、ＧＳＴＯ１またはＧｓｔＯ３のうちいずれか一つのノックダウンは、免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりＦＵＳ凝集を向上させるには十分でなかった。
【0175】
したがって、ＧｓｔＯファミリーのうちＧｓｔＯ２が細胞質でＦＵＳ凝集体形成を調節することによって、ＦＵＳで誘導されたＡＬＳで保護機能を有することを示す。
【0176】
細胞質で増加したＦＵＳ発現は、ＦＵＳとミトコンドリアの結合を促進し、ミトコンドリア機能障害を誘導することが知られているが（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ＧｓｔＯ２がミトコンドリアのＦＵＳ水準を調節するかを確認するために、ハエ筋肉組織でＦＵＳとＧｓｔＯ２を同時発現させた後、精製されたミトコンドリアからＦＵＳ水準をウェスタンブロッティングで調査した。
【0177】
その結果、図１３ｆに示されたように、ミトコンドリアＦＵＳ水準がＧｓｔＯ２同時発現ハエで顕著に減少することを確認することができた。
【0178】
実施例１２．ＧｓｔＯ２によるショウジョウバエ神経細胞でＦＵＳのグルタチオニル化調節の確認
ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ－発現ハエの表現型の回復は、ＦＵＳのグルタチオニル化と関連することができ、これにより、本発明者らは、ＧｓｔＯ２がショウジョウバエ脳でＦＵＳグルタチオニル化および凝集を調節できるという仮説をたて、これを確認するために、次のような実験を行った。
ＧｓｔＯ２によるＦＵＳ－発現ハエの表現型の回復は、ＦＵＳのグルタチオニル化と関連することができ、これにより、本発明者らは、ＧｓｔＯ２がショウジョウバエ脳でＦＵＳグルタチオニル化および凝集を調節できるという仮説をたて、これを確認するために、次のような実験を行った。
【0179】
まず、ＦＵＳ－発現成虫ハエ脳組織に対する二重免疫蛍光分析結果、図５ａに示されたように、ＦＵＳ凝集体が細胞質でＧＳＨと共に同時局所化されることを確認できたが、ＧｓｔＯ２同時発現は、ＦＵＳ凝集体形成の増加を抑制し、ＦＵＳのグルタチオンソンを減少させることを確認することができた。次に、ＲＮＡｉを利用してＧｓｔＯ２が下向き調節された細胞質ＦＵＳのグルタチオニル化誘導凝集を分析した。その結果、ＧｓｔＯ２ノックダウンは、細胞質ＦＵＳ凝集体およびグルタチオン性を増加させることを確認することができた。
【0180】
上記からＦＵＳのＧｓｔＯ２によるｄｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎが神経細胞の細胞質でＦＵＳ凝集体形成を抑制し、ＦＵＳによる神経毒性を遅延させるのに有用に使用され得ることが予測される。
【0181】
次に、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＧｓｔＯ２が神経細胞でＦＵＳと相互作用するか否かの確認を調査した。その結果、図５ｂに示されたように、内因性ＧｓｔＯ２局所化は、ショウジョウバエ神経細胞細胞質に分散しており、内因性ＧｓｔＯ２は、ＦＵＳ－発現ハエで細胞質ＦＵＳ凝集体と同時位置していることを確認したところ、ＧｓｔＯ２とＦＵＳが相互作用していることを裏付け、ＧｓｔＯ２がＦＵＳ誘導性ＡＬＳで役割を果たすことができることを類推することができた。
【0182】
実施例１３．ＧｓｔＯ２によるショウジョウバエでＦＵＳ
Ｐ５２５Ｌ
誘導神経毒性および不溶性抑制の確認
以前の研究によれば、ＡＬＳ患者大部分からＦＵＳ突然変異が確認されており（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＦＵＳＰ５２５Ｌ変種は、細胞質ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを示し、急性ＦＵＳ誘発－ＡＬＳと関連があり（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＦＵＳ野生型およびこれの変種であるＦＵＳＰ５２５Ｌは、ショウジョウバエで荒い眼、運動性減少などの同じ表現型を示すことが知られている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｊａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
以前の研究によれば、ＡＬＳ患者大部分からＦＵＳ突然変異が確認されており（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＦＵＳＰ５２５Ｌ変種は、細胞質ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを示し、急性ＦＵＳ誘発－ＡＬＳと関連があり（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＦＵＳ野生型およびこれの変種であるＦＵＳＰ５２５Ｌは、ショウジョウバエで荒い眼、運動性減少などの同じ表現型を示すことが知られている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｊａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0183】
本発明の一実施例の図１０ｃでのＦＵＳＰ５２５Ｌがｎｅｕｒｏ２ａの細胞質でグルタチオニル化を確認した結果を基礎としてＧｓｔＯ２がショウジョウバエ脳でＦＵＳＰ５２５Ｌ発現による表現型に寄与できるものと予想し、下記のような実験を行った。
【0184】
より具体的に、ＧｓｔＯ２発現がＦＵＳＰ５２５Ｌ誘発運動欠損を抑制することができるか否かを確認するために、ｅｌａｖ－Ｇａｌ４を使用して神経細胞にＦＵＳの突然変異形態であるＦＵＳＰ５２５Ｌを発現させ、幼虫運動性の確認実験を行った。この際、ＦＵＳＰ５２５Ｌ突然変異は、野生型ＦＵＳより毒性を示さなかった。
【0185】
その結果、図１５ａに示されたように、ＦＵＳ発現ハエと類似に、幼虫のクローリング活性が約４０％減少することを確認でき、ＧｓｔＯ２の同時発現により、クローリングを反対に活性化させることを確認し、図１５ｂに示されたように、ＧｓｔＯ２発現は、成虫ハエ脳の全体抽出物でＦＵＳＰ５２５Ｌ水準に影響を及ぼさなかった。
【0186】
次に、ＦＵＳＰ５２５Ｌ溶解度に対するＧｓｔＯ２の影響を確認しようとした。その結果、図１５ｃに示されたように、ＦＵＳＰ５２５Ｌ－単独発現ハエと比較してＧｓｔＯ２同時発現ハエでの不溶性／可溶性ＦＵＳＰ５２５Ｌの比率が５０％以上減少することを可溶性および不溶性ＦＵＳＰ５２５Ｌの定量化を通じて立証した。
【0187】
総合的に、ＧｓｔＯ２がタンパク質凝集体形成を通したＦＵＳＰ５２５Ｌの毒性を調節することを確認することができた。
【0188】
実施例１４．哺乳類でのＦＵＳ誘導神経毒性調節の確認
ＦＵＳ誘導神経細胞毒性に対するＧｓｔＯ２の回復効果が哺乳類システムにも適用されるかを確認するために、ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１に対するＭｙｃ－ＤＤＫ－ＧＳＴＯ１融合タンパク質を発現する安定Ｎ２ａ細胞株を開発し（図１６ａ参照）、これを利用してＧＦＰ－タグＦＵＳを前記ＧＳＴＯ１安定細胞株に形質感染させた後、ＦＵＳに対するＧＳＴＯ１の影響を調査した。
ＦＵＳ誘導神経細胞毒性に対するＧｓｔＯ２の回復効果が哺乳類システムにも適用されるかを確認するために、ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１に対するＭｙｃ－ＤＤＫ－ＧＳＴＯ１融合タンパク質を発現する安定Ｎ２ａ細胞株を開発し（図１６ａ参照）、これを利用してＧＦＰ－タグＦＵＳを前記ＧＳＴＯ１安定細胞株に形質感染させた後、ＦＵＳに対するＧＳＴＯ１の影響を調査した。
【0189】
その結果、図１６ｂに示されたように、ＦＵＳ－発現ハエと比較してＧＳＴＯ１同時発現ハエで不溶性／可溶性ＦＵＳの比率が５０％以上減少することを可溶性および不溶性ＦＵＳ定量化を通じて確認した。
【0190】
次に、ＦＵＳの増加した発現が哺乳類神経細胞での細胞死滅を促進するという以前の研究結果（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を基礎としてＦＵＳ－誘導細胞死に対するＧＳＴＯ１の影響を調査するために、Ｎ２ａ細胞を抗－切断型カスパーゼ３抗体と共に染色を通じて確認した。
【0191】
その結果、図１６ｃに示されたように、切断型カスパーゼ３信号が対照群細胞と比較してＦＵＳ－ＧＦＰを発現するＮ２ａ細胞で有意に増加することを確認できたが、ＦＵＳがＧＳＴＯ１と同時発現するとき、切断型カスパーゼ３信号が減少して神経細胞死滅表現型が回復することを確認した。
【0192】
したがって、ＧｓｔＯ２のヒト相同染色体であるＧＳＴＯ１の発現も、ＡＬＳの哺乳類神経細胞モデルでＦＵＳ不溶性およびＦＵＳ誘導細胞死を改善させることを確認することができた。
【0193】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0194】
本発明のグルタチオニル化したＦＵＳタンパク質を含む、神経系退行性疾患診断用マーカー組成物を通じて筋萎縮性側索硬化症の早期診断が可能であり、ＧＳＴＯ遺伝子または前記遺伝子が暗号化するタンパク質を有効成分として含む、神経系退行性疾患の予防または治療用薬学的組成物を適用して筋萎縮性側索硬化症の治療に利用することができる。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図11f】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図12e】
【図12f】
【図12g】
【図12h】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図13d】
【図13e】
【図13f】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【配列表】