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▶ ブリス バイオファーマシューティカル（ハンゾウ）カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-29
(45)【発行日】2025-02-06
(54)【発明の名称】操作された抗体、抗体薬物複合体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20250130BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20250130BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250130BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250130BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250130BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20250130BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20250130BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20250130BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20250130BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C07K16/30
A61P35/00
A61K47/68
A61K39/395 C
A61K39/395 T
A61K38/07
A61K31/537
A61K31/357
C12N15/13
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2023530653
(86)(22)【出願日】2021-11-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 CN2021131757
(87)【国際公開番号】W WO2022105873
(87)【国際公開日】2022-05-27
【審査請求日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/130409
(32)【優先日】2020-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523173379
【氏名又は名称】ブリス バイオファーマシューティカル（ハンゾウ）カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】シァ，ビン
(72)【発明者】
【氏名】ゾウ，ユホン
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ，ジピン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジアンフェン
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５０９６７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１１１７１１５５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１６２５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０７６４９２（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ０７Ｋ １６／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
二つの全く同一の重鎖を含む、単離されたＩｇＧ抗体であって、
各重鎖は、
（ａ）ヒンジ領域であって、前記ヒンジ領域に含まれるアミノ酸配列が、
（ｉ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号７）；
（ｉｉ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号９）；
（ｉｉｉ）ＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１０）；
（ｉｖ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１１）；
（ｖ）ＥＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２）；
（ｖｉ）ＥＰＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）；及び
（ｖｉｉ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２８）；
からなる群より選択されるヒンジ領域と、
（ｂ）前記ヒンジ領域の上流に位置し、前記ヒンジ領域に接続されたＣＨ１ドメインと、
を含み、
前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインは、Ｓ１４２Ｃ突然変異を有する天然ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインの配列を有するか、または、
前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインは、天然ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス抗体のＣＨ１ドメインと同一の配列を有する、単離されたＩｇＧ抗体。
【請求項2】
前記ＩｇＧ抗体は、二つの全く同一のｋａｐｐａ軽鎖をさらに含む、請求項１に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項3】
各前記重鎖は、天然ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス抗体の前記ヒンジ領域の下流に位置し、前記ヒンジ領域に接続されたＣＨ２－ＣＨ３ドメインをさらに含み、前記ＣＨ２－ＣＨ３は、任意選択的に一つ又は複数の突然変異を含む、請求項１に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項4】
前記ヒンジ領域に含まれるアミノ酸配列が、ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２８）である、請求項１に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項5】
前記ヒンジ領域における二つの重鎖のＮ末端からＣ末端に向かって最初のシステイン残基の間にジスルフィド結合を形成している、請求項１に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項6】
前記ＩｇＧ抗体は、抗原に特異的に結合したＦａｂドメインをさらに含み、前記抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃ－ＭＥＴ、葉酸受容体、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４８、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１３８、ＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２）、コラーゲンＩＶ、エンドセリン受容体ＥＴＢ、ＥＮＰＰ３、フィブロネクチンエクストラドメインＢ、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、ＬＩＶ－１（ＺＩＰ６）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、メソテリン、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ｐ－カドヘリン、ペリオスチン、ＰＳＭＡ、ＳＣ－１６（抗－Ｆｙｎ３）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、テネイシンｃ、組織因子、Ｔｒｏｐ２及び５Ｔ４（ＴＰＢＧ）からなる群より選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項7】
（ａ）それぞれが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；（ｂ）それぞれが配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｃ）それぞれが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｄ）それぞれが配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｅ）それぞれが配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；並びに
（ｆ）それぞれが配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
中の一つを含む単離されたＩｇＧ抗体。
【請求項8】
化学リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートした請求項１～７のいずれか一項に記載のＩｇＧ抗体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
前記細胞傷害性薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、メイタンシンＤＭ１とＤＭ４、メイタンシノール、サンドラマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、アントラサイクリン系、カリケアマイシン、ドラスタチン１０、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、タイランスタチンＡ、ウンシアラマイシン、アマニチン、リシン、ジフテリア毒素、エリブリン、１３１Ｉ、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、イリノテカン（ＳＮ３８）、エキサテカン及びエキサテカン誘導体からなる群より選択される、請求項８に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項10】
前記化学リンカーに含まれる部分は、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、Ｍａｌ－ＰＥＧｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｎ＝１～２０）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＰＡＢ、Ａｌｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ－ＰＡＢ－ＰＮＰ及びパーフルオロフェニル ３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエートからなる群より選択される、請求項８に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項11】
前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ここで、前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項12】
前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ここで、前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項13】
前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ここで、前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項14】
前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ここで、前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項15】
前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ここで、前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項16】
ＡＤＣの少なくとも８０％は、抗体の重鎖上のシステインを介して化学リンカーにコンジュゲートされる、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩の製剤。
【請求項17】
薬物抗体比（ＤＡＲ）が２であるＡＤＣ分子は、ＡＤＣ分子の総量の６０％以上を占める、請求項８～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩の製剤。
【請求項18】
抗体のヒンジ領域における対応するシステイン間の少なくともいくつかのＨ－Ｈジスルフィド結合が遊離スルフヒドリルに還元されるように、少なくとも部分的な還元を受けた請求項１～７のいずれか一項に記載のＩｇＧ抗体と、細胞傷害性薬物分子に結合した末端チオール反応基を含む化学リンカーと、の反応生成物を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩。
【請求項19】
請求項１～７のいずれか一項に記載のＩｇＧ抗体のヒンジ領域における二つの重鎖のＮ末端からＣ末端に向かって最初のシステイン残基の間のＨ－Ｈジスルフィド結合を還元し、これにより、遊離スルフヒドリルを得ることと、末端チオール反応基を含む化学リンカーを反応させて、これにより、抗体の二つの重鎖のそれぞれを化学リンカーを介して一つの細胞傷害性薬物分子にコンジュゲートさせることとを含む、ＤＡＲ２の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は出願日が２０２０年１１月２０日である国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３０４０９の優先権を主張する。本出願には引用により上記特許出願に開示された全文が組み込まれる。
本出願は出願日が２０２０年１１月２０日である国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３０４０９の優先権を主張する。本出願には引用により上記特許出願に開示された全文が組み込まれる。
【0002】
〔背景技術〕
抗体は、外来病原体に対する重要な免疫分子である。モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）技術の発展により、モノクローナル抗体が疾患の研究、診断、及び治療に広く使用されるようになっている。第一世代ｍＡｂ（主に単一特異性的な二価ｍＡｂ）の治療的使用は、がん、自己免疫疾患、及び感染症を含むさまざまな疾患の治療に成功した。しかし、固形腫瘍などの多くの疾患は、抗体ベースの治療法に対して非常に強い抵抗力を示している。
抗体は、外来病原体に対する重要な免疫分子である。モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）技術の発展により、モノクローナル抗体が疾患の研究、診断、及び治療に広く使用されるようになっている。第一世代ｍＡｂ（主に単一特異性的な二価ｍＡｂ）の治療的使用は、がん、自己免疫疾患、及び感染症を含むさまざまな疾患の治療に成功した。しかし、固形腫瘍などの多くの疾患は、抗体ベースの治療法に対して非常に強い抵抗力を示している。
【0003】
抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、活性傷害性薬物と化学的に結合したｍＡｂであるため、ｍＡｂの標的特異性と細胞傷害性薬物のがん殺傷能力を備えている。特定のｍＡｂ－傷害性薬物の組み合わせを選択する能力、及びｍＡｂと薬物の結合の進歩は、健康な組織の曝露を最小限に抑えながら、がんを標的とする新しい可能性を提供した。２０１９年の時点で、Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、ＫａｄｃｙｌａＴＭ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭ）、イノツズマブオゾガマイシン（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ、ＢｅｓｐｏｎｓａＴＭ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ、ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ）、ポラツズマブベドチン－ｐｉｉｑ（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ－ｐｉｉｑ、ＰｏｌｉｖｙＴＭ）、エンホルツマブベドチン（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、ＰａｄｃｅｖＴＭ）、及びトラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ、ＥｎｈｅｒｔｕＴＭ）という合計七つのＡＤＣがＦＤＡによって承認されている。現在、市販が承認されたこれらの七つのＡＤＣ薬物に加えて、多数のＡＤＣが臨床開発中である。
【0004】
薬物を抗体に結合させる従来の方法では、通常、ＡＤＣの不均一な混合物が生じることがある。例えば、細胞傷害性薬物は、通常、表面に露出したリジン又はシステイン（鎖間ジスルフィド結合を還元することにより得られる）を介して抗体にコンジュゲートされ、抗体上に異なる結合部位及び異なる薬物抗体比（ｄｒｕｇ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を有する異なる種類のＡＤＣを生成する。非特異的コンジュゲートは、ＡＤＣ製品のコンジュゲーションプロセス制御、製品の特性評価、及び品質管理という点で課題をもたらす。さらに、ＡＤＣの種類が異なれば、安全性と有効性のプロファイルも大きく異なる可能性がある。ＩｇＧ１抗体の重鎖とその対になる軽鎖との間のジスルフィド結合は、コンジュゲーションプロセスにおける還元される好ましい結合である可能性があるため、これにより産生される軽鎖薬物複合体を有するＡＤＣの種類は安定性が低く、生体内循環中にそれらの軽鎖を失いやすい可能性がある。
【0005】
近年、より均質なＡＤＣを得るために、いくつかの部位特異的なＡＤＣ技術が開発されている。例えば、特定のアミノ酸（例えば、システイン）、非天然アミノ酸残基（例えば、ｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ））、及び酵素によって認識と修飾され得る短いペプチドタグを、抗体のアミノ酸配列の選択部位に操作した。抗体の重鎖に結合したグリカンを使用してグリカンを介したコンジュゲーションを試みた人もいる。
【0006】
〔発明の概要〕
本発明の一態様は、二つの全く同一の重鎖を含み、各重鎖は、（ａ）アミノ酸配列－（Ｘ１）－Ｃ－（Ｘ２）－ＣＰＰＣＰ－を含み、ここで、Ｘ１は、それぞれ独立して非システイン残基の任意のアミノ酸残基から選択される０～７個のアミノ酸残基を有するポリペプチド断片であり、Ｘ２は、それぞれ独立して非システイン残基の任意のアミノ酸残基から選択される２～７個のアミノ酸残基を有するポリペプチド断片である、ヒンジ領域と、（ｂ）前記ヒンジ領域の上流に位置し前記ヒンジ領域に接続され、ＩＭＧＴのナンバリングスキームにより１４２位にシステインを含む、ＣＨ１ドメインとを含む単離されたＩｇＧ抗体を提供する。前記抗体はさらに、それぞれが重鎖と対になる二つの全く同一のｋａｐｐａ軽鎖を含んでもよい。
本発明の一態様は、二つの全く同一の重鎖を含み、各重鎖は、（ａ）アミノ酸配列－（Ｘ１）－Ｃ－（Ｘ２）－ＣＰＰＣＰ－を含み、ここで、Ｘ１は、それぞれ独立して非システイン残基の任意のアミノ酸残基から選択される０～７個のアミノ酸残基を有するポリペプチド断片であり、Ｘ２は、それぞれ独立して非システイン残基の任意のアミノ酸残基から選択される２～７個のアミノ酸残基を有するポリペプチド断片である、ヒンジ領域と、（ｂ）前記ヒンジ領域の上流に位置し前記ヒンジ領域に接続され、ＩＭＧＴのナンバリングスキームにより１４２位にシステインを含む、ＣＨ１ドメインとを含む単離されたＩｇＧ抗体を提供する。前記抗体はさらに、それぞれが重鎖と対になる二つの全く同一のｋａｐｐａ軽鎖を含んでもよい。
【0007】
前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインは、天然ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス抗体のＣＨ１ドメインと同一の配列を有してもよい。或いは、前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインの配列は、Ｓ１４２Ｃ突然変異を有する天然ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインの配列と同一であってもよい。
【0008】
各前記重鎖は、天然ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス抗体の前記ヒンジ領域の下流に位置し前記ヒンジ領域に接続されたＣＨ２－ＣＨ３ドメインをさらに含んでもよい。前記ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、任意選択的に一つ又は複数の突然変異を含んでもよい。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（ａ）ＣＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１）、（ｂ）ＤＫＴＣＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２）、
（ｃ）ＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号３）、（ｄ）ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４）、（ｅ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）、（ｆ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号６）、（ｇ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号７）、（ｈ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号８）、（ｉ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号９）、（ｊ）ＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１０）、
（ｋ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１１）、（ｌ）ＥＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２）、及び（ｍ）ＥＰＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）、及び（ｎ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２８）からなる群より選択される。
（ｃ）ＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号３）、（ｄ）ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４）、（ｅ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）、（ｆ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号６）、（ｇ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号７）、（ｈ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号８）、（ｉ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号９）、（ｊ）ＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１０）、
（ｋ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１１）、（ｌ）ＥＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２）、及び（ｍ）ＥＰＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）、及び（ｎ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２８）からなる群より選択される。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記ＩｇＧ抗体は、抗原に特異的に結合したＦａｂドメインをさらに含み、前記抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃ－ＭＥＴ、葉酸受容体（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４８、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１３８、ＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２）、コラーゲンＩＶ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ）、エンドセリン受容体ＥＴＢ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＴＢ）、ＥＮＰＰ３、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｅｘｔｒａ－ｄｏｍａｉｎ Ｂ）、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、ＬＩＶ－１（ＺＩＰ６）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４（ｎｅｃｔｉｎ ４）、ｐ－カドヘリン（ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ペリオスチン（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）、ＰＳＭＡ、ＳＣ－１６（抗－Ｆｙｎ３）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、テネイシンｃ（ｔｅｎａｓｃｉｎ ｃ）、組織因子（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、Ｔｒｏｐ２及び５Ｔ４（ＴＰＢＧ）からなる群より選択される。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記ＩｇＧ抗体は、
（ａ）それぞれが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｂ）それぞれが配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｃ）それぞれが配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｄ）それぞれが配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｅ）それぞれが配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｆ）それぞれが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｇ）それぞれが配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｈ）それぞれが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（Ｉ）それぞれが配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｊ）それぞれが配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；並びに
（ｋ）それぞれが配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
である構造のうちの一つを有する。
（ａ）それぞれが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｂ）それぞれが配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｃ）それぞれが配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｄ）それぞれが配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｅ）それぞれが配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｆ）それぞれが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｇ）それぞれが配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｈ）それぞれが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（Ｉ）それぞれが配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｊ）それぞれが配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；並びに
（ｋ）それぞれが配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
である構造のうちの一つを有する。
【0012】
本開示は、さらなる態様において、化学リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた本発明に記載の抗体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩をさらに提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ、ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）ＤＭ１とＤＭ４、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏ）、サンドラマイシン（ｓａｎｄｒａｍｙｃｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｄｉｍｅｒ）、アントラサイクリン系（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、タイランスタチンＡ（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ Ａ）、ウンシアラマイシン（ｕｎｃｉａｌａｍｙｃｉｎ）、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ（ＣＡＳ））、１３１Ｉ、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ＳＮ３８）、エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）、エキサテカン誘導体及びナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群より選択される。
【0013】
前記抗体部分と前記細胞傷害性薬物とを連結する化学リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、ｎが１～２０である（即ち、１～２０の繰り返し単位を有する（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ））ＰＥＧｎスペーサー領域を含む。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、前記ＰＥＧｎスペーサー領域に接続されたリンカー断片をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域を含まないリンカー断片を含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー断片は、６－マレイミドカプロイル（６－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ、ＭＰ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＰＡＢ）、６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、Ｍａｌ－ＰＥＧｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｎ＝１～２０）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＰＡＢ、Ａｌｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ－ＰＡＢ－ＰＮＰ及びパーフルオロフェニル ３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ３－（ｐｙｒｉｄｉｎｅ－２－ｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）、又はそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
【0014】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0015】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0016】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0017】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0018】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0019】
前記ＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩の製剤において、ＡＤＣの少なくとも８０％は、抗体の重鎖上のシステインを介して化学リンカーにコンジュゲートされる。前記製剤のいくつかの実施形態において、薬物抗体比（ＤＡＲ）が２であるＡＤＣ分子は、ＡＤＣ分子の総量の６０％以上を占める。
【0020】
本開示のさらなる態様は、抗体のヒンジ領域における対応するシステイン間の少なくともいくつかのＨ－Ｈジスルフィド結合が遊離スルフヒドリルに還元されるように、少なくとも部分的な還元を受けた本発明に記載のＩｇＧ抗体と、細胞傷害性薬物分子に結合した末端チオール反応基を含む化学リンカーと、の反応生成物を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0021】
本開示のさらなる態様は、本発明に記載のＩｇＧ抗体のヒンジ領域における対応するシステイン間のＨ－Ｈジスルフィド結合を少なくとも部分的に還元し、これにより遊離スルフヒドリルを得ることと、ヒンジ領域におけるシステインのスルフヒドリルと末端チオール反応基を含む化学リンカーとを反応させ、これにより抗体を化学リンカーを介して一つ又は複数の細胞傷害性薬物分子にコンジュゲートさせることとを含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩の製造方法を提供する。
【0022】
〔図面の説明〕
〔図１〕本出願で使用される抗体のアミノ酸ナンバリングシステムの模式図を示す。（ａ）ヒトＩｇＧ１（κ）のＩＭＧＴベースのアミノ酸ナンバリングシステムである。（ｂ）突然変異体（ＩｇＧ１ヒンジ領域の場合）のナンバリングシステムである。
〔図１〕本出願で使用される抗体のアミノ酸ナンバリングシステムの模式図を示す。（ａ）ヒトＩｇＧ１（κ）のＩＭＧＴベースのアミノ酸ナンバリングシステムである。（ｂ）突然変異体（ＩｇＧ１ヒンジ領域の場合）のナンバリングシステムである。
【0023】
〔図２〕Ａ部分は、本発明の実施形態による操作された抗体の模式図を示す。Ｂ部分は、本発明の実施形態によるＩｇＧ抗体におけるジスルフィド結合を示す。
【0024】
〔図３〕本発明の実施例の抗体の特徴を示す。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞で産生された抗体の純度と収量である。（ｂ）還元（Ｒ）抗体及び非還元（ＮＲ）抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（ｃ）精製抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析である。
【0025】
〔図４〕天然ヒトＩｇＧ１（κ）、ＩｇＧ２（κ）及び本発明の実施例の操作された抗体から製造したＡＤＣのＨＩＣプロファイルを示す。ａ：ＩｇＧ１（κ）－ＭＭＡＥ、ｂ：ＩｇＧ２（κ）－ＭＭＡＥ、ｃ：ＢＢ０５００－２ａ－ＭＭＡＥ、ｄ：ＢＢ０５００－２ｂ－ＭＭＡＥ、ｅ：ＢＢ０５００－２ｇ－ＭＭＡＥ、ｆ：ＢＢ０５００－２ｎ－ＭＭＡＥ、ｇ：ＢＲ０３０１－ＭＭＡＥ及びｈ：ＢＲ０３０２－ＭＭＡＥ。
【0026】
〔図５〕本発明の特定の実施例のＡＤＣのＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示す。ａ：ＩｇＧ１（κ）－ＭＭＡＥ、ｂ：ＩｇＧ２（κ）－ＭＭＡＥ、ｃ：ＢＢ０５００－２ａ－ＭＭＡＥ及びｄ：ＢＢ０５００－２ｇ－ＭＭＡＥ。
【0027】
〔図６〕タンパク質ＥＧＦＲ（ａ）、ＨＥＲ３（ｂ）、及びＨＥＲ２（ｃ）に対する本発明の実施形態による異なる操作された抗体と対照（ｗｔ）抗体の結合曲線を示す。
【0028】
〔図７〕ＥＧＦＲ発現がん細胞（ａ：Ａ４３１細胞、ｂ：ＮＵＧＣ３細胞）に対する本発明の実施形態による操作されたＡＤＣの細胞傷害性曲線と、ＨＥＲ２発現がん細胞（ｃ：ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２高発現）、及びｄ：Ａ４３１（ＨＥＲ２低発現））に対する本発明の実施形態による他の操作されたＡＤＣの細胞傷害性曲線とを示す。
【0029】
〔具体的な実施形態〕
本開示の一態様は、重鎖が１４２位のアミノ酸又はその近傍にシステイン残基を有するＣＨ１ドメインを含み、ヒンジ領域がヒトＩｇＧ１ヒンジ領域における二つの固有のシステインの上流に位置する第３又は追加のシステイン残基を含む配列と見なすことができる３つのシステインのパターンに配置された配列を含む、新規の操作された抗体を提供する。当該第３のシステイン残基は本明細書では「ＨＧ３システイン」と呼ばれる。
本開示の一態様は、重鎖が１４２位のアミノ酸又はその近傍にシステイン残基を有するＣＨ１ドメインを含み、ヒンジ領域がヒトＩｇＧ１ヒンジ領域における二つの固有のシステインの上流に位置する第３又は追加のシステイン残基を含む配列と見なすことができる３つのシステインのパターンに配置された配列を含む、新規の操作された抗体を提供する。当該第３のシステイン残基は本明細書では「ＨＧ３システイン」と呼ばれる。
【0030】
この形態の重鎖を含む抗体は、好ましくは、ＣＨ１ドメインのＣ１４２（又は１４２位近傍のシステイン、部位が以下にさらに記載されたＩＭＧＴナンバリングシステムのように定義される）と軽鎖の最後のシステイン残基との間にＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合を形成する。天然ＣＰＰＣＰ配列の上流のヒンジ領域のシステイン残基は、第３のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合を形成する。ＣＨ１ドメインの１４２位又は近傍のアミノ酸のシステインは、ＩｇＧ１サブタイプの単一アミノ酸の突然変異又は挿入によって導入されてもよく、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプのＣＨ１ドメインに由来する天然システイン残基であってもよい。ＩｇＧ１における天然Ｈ－Ｌジスルフィド結合（ＩｇＧ１抗体重鎖のヒンジ領域のシステインと対になる軽鎖の末端との間に位置する）と比較して、この形態のＨ－Ｌジスルフィド結合がより安定であり、抗体への薬物コンジュゲートプロセスで還元条件下で完全な状態を保つことができる。これにより、軽鎖薬物複合体を含むＡＤＣが得られる可能性は大きく減少した。
【0031】
ヒンジ領域における第３のシステインの正確な位置及びその周囲のアミノ酸配列は異なる場合がある。第３のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合は、固有のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合又はＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合よりも還元されやすい。当該ジスルフィド結合の還元しやすい特性は、部位特異的な薬物コンジュゲートを促進することができる。選択された還元と薬物コンジュゲート条件は、主に第３のシステイン「ＨＧ３システイン」への部位特異的な薬物コンジュゲートを得るために使用することができる。
【0032】
免疫グロブリンスーパーファミリーのＩＭＧＴナンバリングシステムは、本明細書において、ナンバリングシステムを簡略化するために使用され、ここで、ＶＨ又はＶＬドメインは、それぞれアミノ酸残基１～１２８位を含む。したがって、ＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸番号はａａ １２９－２２６であり、ｋａｐｐａドメインはａａ １２９－２３５であり、ヒンジ領域はａａ ２２７－２４１（ＩｇＧ１による）であり、ＣＨ２はａａ ２４２－３５１であり、ＣＨ３はａａ ３５２－４５６である（図１のａ部分参照）。このナンバリングシステムに基づいて、野生型ＩｇＧ１（κ）におけるＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合はＨ（Ｃ２３１）－Ｌ（Ｃ２３５）間に形成されるのに対し、ＩｇＧ２（κ）（又はＩｇＧ３（κ）又はＩｇＧ４（κ））では、Ｈ（Ｃ１４２）－Ｌ（Ｃ２３５）間に形成されてもよい。重鎖の２３０位のセリンがシステインに変化したＩｇＧ１突然変異体はＩｇＧ１（Ｓ２３０Ｃ）と命名され、Ｃ２３１が欠損したＩｇＧ１突然変異体はＩｇＧ１（Δ２３１）と命名される。Ｃ２３１の後に一つのリジンが挿入されたＩｇＧ１突然変異体はＫ２３１．１と命名され、Ｃ２３１の後にＫＬの二つのアミノ酸が挿入されたＩｇＧ１突然変異体はＫ２３１．１Ｌ２３１．２と命名される（ＩｇＧ１のヒンジ領域に突然変異を導入したいくつかの記号例を示す図１のｂ部分参照）。
【0033】
本明細書で使用される用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。抗原に特異的に結合する単離された抗体は、その抗原に結合しない抗体を実質的に含まない。
【0034】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な分子からなる抗体分子の集団を有する製剤を指し、ここで、抗体分子の集団中の個々の抗体は、ごくわずかな量で存在する可能性のある天然に発生する突然変異を除いて、同一である。
【0035】
いくつかの実施形態において、本開示は、二つの全く同一の重鎖を含み、各重鎖は、（ａ）アミノ酸配列－（Ｘ１）－Ｃ－（Ｘ２）－ＣＰＰＣＰ－を含み、Ｘ１は、それぞれ独立して非システイン残基の任意のアミノ酸残基から選択される０～７個のアミノ酸残基を有するポリペプチド断片であり、Ｘ２は、それぞれ独立して非システイン残基の任意のアミノ酸残基から選択される２～７個のアミノ酸残基を有するポリペプチド断片である、ヒンジ領域と、（ｂ）前記ヒンジ領域の上流に位置し前記ヒンジ領域に接続され、ＩＭＧＴのナンバリングスキームにより１４２位にシステインを含む、ＣＨ１ドメインとを含む単離されたＩｇＧ抗体を提供する。
【0036】
前記ＩｇＧ抗体は、二つの全く同一のｋａｐｐａ軽鎖をさらに含んでもよい。前記ｋａｐｐａ軽鎖のＣ末端のシステインは、ＣＨ１ Ｃ１４２とジスルフィド結合を形成することができる。
【0037】
前記ＩｇＧ抗体のいくつかの実施形態において、前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインは、天然ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス抗体のＣＨ１ドメインと同一の配列を有する。
【0038】
前記ＩｇＧ抗体のいくつかの実施形態において、前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインの配列は、Ｓ１４２Ｃ突然変異を有する天然ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインの配列と同一である。
【0039】
前記ＩｇＧ抗体のいくつかの実施形態において、各前記重鎖は、天然ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス抗体の前記ヒンジ領域の下流に位置し前記ヒンジ領域に接続されたＣＨ２－ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
【0040】
いくつかの実施形態において、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（ａ）ＣＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１）、（ｂ）ＤＫＴＣＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２）、（ｃ）ＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号３）、（ｄ）ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４）、（ｅ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）、（ｆ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号６）、（ｇ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号７）、（ｈ）ＥＰＫＳＤＣＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号８）、（ｉ）ＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号９）、（ｊ）ＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１０）、（ｋ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１１）、（ｌ）ＥＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２）、（ｍ）ＥＰＰＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）、及び（ｎ）ＥＰＰＫＳＤＣＫＴＫＴＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２８）からなる群より選択される。
【0041】
前記抗体は、抗原に特異的に結合したＦａｂドメインをさらに含んでもよく、前記抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃ－ＭＥＴ、葉酸受容体（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４８、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１３８、ＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２）、コラーゲンＩＶ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ）、エンドセリン受容体ＥＴＢ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＴＢ）、ＥＮＰＰ３、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｅｘｔｒａ－ｄｏｍａｉｎ Ｂ）、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、ＬＩＶ－１（ＺＩＰ６）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４（ｎｅｃｔｉｎ ４）、ｐ－カドヘリン（ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ペリオスチン（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）、ＰＳＭＡ、ＳＣ－１６（抗－Ｆｙｎ３）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、テネイシンｃ（ｔｅｎａｓｃｉｎ ｃ）、組織因子（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、Ｔｒｏｐ２及び５Ｔ４（ＴＰＢＧ）からなる群より選択される。
【0042】
前記ＩｇＧ抗体の配列の例としては、
（ａ）それぞれが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｂ）それぞれが配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｃ）それぞれが配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｄ）それぞれが配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｅ）それぞれが配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｆ）それぞれが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｇ）それぞれが配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｈ）それぞれが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（Ｉ）それぞれが配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｊ）それぞれが配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；並びに
（ｋ）それぞれが配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
が含まれる。
（ａ）それぞれが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｂ）それぞれが配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｃ）それぞれが配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｄ）それぞれが配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｅ）それぞれが配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｆ）それぞれが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｇ）それぞれが配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｈ）それぞれが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（Ｉ）それぞれが配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
（ｊ）それぞれが配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；並びに
（ｋ）それぞれが配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む二つの同一の重鎖、及びそれぞれが配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む二つの軽鎖；
が含まれる。
【0043】
出発ポリペプチドのアミノ酸配列突然変異体をコードするＤＮＡは、当該分野で知られている様々な方法によって製造することができる。これらの製造方法には、初期に製造されたポリペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的（又はオリゴヌクレオチド媒介の）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。組換え抗体の突然変異体は、制限断片操作によって、又は合成オリゴヌクレオチドとのオーバーラップ伸長ＰＣＲによっても構築することができる。突然変異原性プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な突然変異誘発技術を採用して、そのような突然変異操作された抗体をコードするＤＮＡを生成することができる。
【0044】
本開示のなおさらなる態様は、本発明に記載の抗体又は任意の前記抗体の抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。前記核酸分子を含む発現ベクターを含む、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、ヒト胚性腎細胞又は微生物（例えば大腸菌、及び酵母などの真菌）であって、本開示の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を製造するために使用することができる。一実施形態において、本開示の部分的又は完全長抗体をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように一つ又は複数の発現ベクターに挿入される標準的な分子生物学的手法によって得ることができる。「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することを意図する。「制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）にこのような制御配列が記載されている。哺乳動物宿主細胞発現の好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０、ＳＶ４０）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ）に由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用することができる。さらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端リピートからの配列を含むＳＲαプロモーターシステムなどの異なる供給源からの配列から構成されている（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４６６－４７２）。使用される発現宿主細胞と適合性がある発現ベクター及び発現制御配列を選択する。
【0045】
抗体をコードするＤＮＡを前記発現ベクターに挿入することができる。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体をコードするＤＮＡは、シグナルペプチドが抗体のアミノ末端をコードするＤＮＡにインフレームで連結されるようにベクターにクローニングすることができる。前記シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリン由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【0046】
本開示は、さらなる態様において、化学リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた本発明に記載の抗体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩をさらに提供する。前記細胞傷害性薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ、ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）ＤＭ１とＤＭ４、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏ）、サンドラマイシン（ｓａｎｄｒａｍｙｃｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｄｉｍｅｒ）、アントラサイクリン系（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、タイランスタチンＡ（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ Ａ）、ウンシアラマイシン（ｕｎｃｉａｌａｍｙｃｉｎ）、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、１３１Ｉ、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ＳＮ３８）、エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）、エキサテカン誘導体及びナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群より選択され得る。
【0047】
前記抗体部分と前記細胞傷害性薬物とを連結する化学リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、ｎが１～２０である（即ち、１～２０の繰り返し単位を有する（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ））ＰＥＧｎスペーサー領域を含む。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、前記ＰＥＧｎスペーサー領域に接続されたリンカー断片をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域を含まないリンカー断片を含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー断片は、６－マレイミドカプロイル（６－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ、ＭＰ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＰＡＢ）、６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、Ｍａｌ－ＰＥＧｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｎ＝１～２０）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＰＡＢ、Ａｌｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ－ＰＡＢ－ＰＮＰ及びパーフルオロフェニル ３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ３－（ｐｙｒｉｄｉｎｅ－２－ｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）、又はそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
【0048】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0049】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0050】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0051】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0052】
ＡＤＣの特定の実施形態において、前記抗体の二つの重鎖はそれぞれ配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の二つの軽鎖はそれぞれ配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記細胞傷害性薬物はエリブリン又はＭＭＡＥである。
【0053】
本開示において、ＡＤＣの薬学的に許容される塩には、無機酸、カルボン酸及びスルホン酸の酸付加塩、例えば、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸及び安息香酸の塩が含まれる。
【0054】
本開示の抗体薬物複合体の薬学的に許容される塩には、従来の塩基の塩、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩及びマグネシウム塩）及びアンモニア又は１～１６個の炭素原子を含む有機アミンから誘導されるアンモニウム塩がさらに含まれ、ここで、有機アミンとしては、例えば、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、プロカイン、ジアミン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、アルギニン、リジン及び１，２－エチレンジアミンが挙げられる。
【0055】
本明細書で使用されるＡＤＣは、薬物分子と抗体（又はその抗原結合部分）の両方を含む分子を指し、薬物と抗体（又はその抗原結合部分）はリンカーによって共有結合されていると理解されるべきである。本明細書における「ＡＤＣ製剤」とは、抗体（又はその抗原結合部分）に対する化学リンカーのおそらく異なる付着部位のために構造が異なり得るＡＤＣ分子の集合又は集団を指す。いくつかの実施形態において、化学リンカーは、主に又は大部分的に（例えば、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、又は≧９８％）重鎖上のシステインとコンジュゲートされ、軽鎖のコンジュゲートの実質的にないＡＤＣ製剤をもたらす。いくつかの実施形態において、化学リンカーは、主に抗体重鎖のヒンジ領域におけるシステインを介して抗体とコンジュゲートされる。特定の実施形態において、薬物抗体比（ＤＡＲ）が２であるＡＤＣ分子は、ＡＤＣ分子の総量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％を占める。
【0056】
さらなる態様において、前記ＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩は、抗体のヒンジ領域における対応するシステイン間の少なくともいくつかのＨ－Ｈジスルフィド結合が遊離スルフヒドリルに還元されるように、少なくとも部分的な還元を受けた本発明に記載の抗体と、細胞傷害性薬物分子に結合した末端チオール反応基を含む化学リンカーとの反応生成物であるか、又はそれらを含む。
【0057】
本開示のさらなる態様は、本発明に記載の抗体のヒンジ領域における対応するシステイン間のＨ－Ｈジスルフィド結合を少なくとも部分的に還元し、これにより遊離スルフヒドリルを得ることと、ヒンジ領域におけるシステインのスルフヒドリルと末端チオール反応基を含む化学リンカーとを反応させ、これにより抗体を化学リンカーを介して一つ又は複数の細胞傷害性薬物分子にコンジュゲートさせることとを含む、前記ＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩の製造方法を提供する。
【0058】
本開示のさらなる態様において、本発明の一つ又は複数の抗体、一つ又は複数のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を含む。これらには、生理学的に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散又は懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香料、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、防腐剤及び等張剤などが含まれるが、これらに限定されない。適切な担体の選択は、当業者の知識の範囲内である。
【0059】
組成物は、一つ又は複数の追加の薬物活性成分、例えば別の抗体及び薬物（例えば、細胞毒性剤又は抗腫瘍剤）を含むことができる。本発明の医薬組成物はまた、例えば別の抗がん剤及び別の抗炎症剤等との併用療法で投与することができる。
【0060】
前記医薬組成物は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ）、及び他の投与経路に適用することができる。投与経路によっては、活性成分を材料にコーティングするか、或いは他の方法で材料又は構造に担持して、それを不活性化する可能性のある酸及び他の自然条件の作用から保護することができる。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、経腸及び局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与以外の投与様式を指し、通常は注射による、且つ静脈内、筋肉内、動脈内（ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内（ｉｎｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）、心臓内（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、経気管（ｔｒａｎｓｔｒａｃｈｅａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、被膜下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）、くも膜下（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ）、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。或いは、本発明の組成物は、非経口以外の経路、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路（例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下又は局所投与）により投与することができる。
【0061】
実施例
１．操作された抗体の設計
表１の抗体を設計及び製造し、ここで、これらの抗体のＣＨ１ドメインはアミノ酸１４２位にシステイン残基を含む。いくつかの抗体では、ＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸１４２位のシステインは、単一のアミノ酸の突然変異又は挿入（表１のＳ１４２Ｃはセリン１４２位に代わるシステイン）によって導入され、他の抗体では、Ｃ１４２はＩｇＧ２サブタイプ（表１ではＧ２ＣＨ１と表記）のＣＨ１ドメインにおける天然のシステイン残基に由来する。各抗体は、天然ヒンジ領域の代わりに、ＣＰＰＣＰ配列の上流に第３のシステイン残基（ＨＧ３システイン）を含む人工ヒンジ配列を含む。ＨＧ３システイン残基周辺のアミノ酸配列は、操作された抗体によって異なる可能性がある。操作された抗体のＣＨ１の１４２位にシステイン残基を導入することにより、ＣＨ１ドメインのＣ１４２と軽鎖のＣ２３５の間にＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。ＨＧ３システインは、他のＨ鎖の同じ位置のシステインと対になることができ、固有のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合に加えて、余分なＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合を形成する（図２）。
１．操作された抗体の設計
表１の抗体を設計及び製造し、ここで、これらの抗体のＣＨ１ドメインはアミノ酸１４２位にシステイン残基を含む。いくつかの抗体では、ＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸１４２位のシステインは、単一のアミノ酸の突然変異又は挿入（表１のＳ１４２Ｃはセリン１４２位に代わるシステイン）によって導入され、他の抗体では、Ｃ１４２はＩｇＧ２サブタイプ（表１ではＧ２ＣＨ１と表記）のＣＨ１ドメインにおける天然のシステイン残基に由来する。各抗体は、天然ヒンジ領域の代わりに、ＣＰＰＣＰ配列の上流に第３のシステイン残基（ＨＧ３システイン）を含む人工ヒンジ配列を含む。ＨＧ３システイン残基周辺のアミノ酸配列は、操作された抗体によって異なる可能性がある。操作された抗体のＣＨ１の１４２位にシステイン残基を導入することにより、ＣＨ１ドメインのＣ１４２と軽鎖のＣ２３５の間にＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。ＨＧ３システインは、他のＨ鎖の同じ位置のシステインと対になることができ、固有のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合に加えて、余分なＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合を形成する（図２）。
【0062】
【表1】
【0063】
実施例における操作された抗体の構造及び配列は、以下のように記載される：
１．ＢＢ０５００－３はＩｇＧ２κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号３）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ２）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－３の重鎖の配列は配列番号１４に示される。ＢＢ０５００－３の軽鎖の配列は配列番号２３に示される。
１．ＢＢ０５００－３はＩｇＧ２κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号３）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ２）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－３の重鎖の配列は配列番号１４に示される。ＢＢ０５００－３の軽鎖の配列は配列番号２３に示される。
【0064】
２．ＢＢ０５００－５はＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（Ｓ１４２Ｃ）－ヒンジ（配列番号４）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－５の重鎖の配列は配列番号１５に示される。ＢＢ０５００－５の軽鎖の配列は配列番号２３に示される。
【0065】
３．ＢＢ０５００－２ａはＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号４）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－２ａの重鎖の配列は配列番号１６に示される。ＢＢ０５００－２ａの軽鎖の配列は配列番号２３に示される。
【0066】
４．ＢＢ０５００－２ｂはＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号５）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－２ｂの重鎖の配列は配列番号１７に示される。ＢＢ０５００－２ｂの軽鎖の配列は配列番号２３に示される。
【0067】
５．ＢＢ０５００－６ａはＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号６）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－６ａの重鎖の配列は配列番号１８に示される。ＢＢ０５００－６ａの軽鎖の配列は配列番号２４に示される。
【0068】
６．ＢＢ０５００－２ｆはＩｇＧ２κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号９）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ２）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－２ｆの重鎖の配列は配列番号１９に示される。ＢＢ０５００－２ｆの軽鎖の配列は配列番号２５に示される。
【0069】
７．ＢＢ０５００－２ｇはＩｇＧ２κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号１０）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ２）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－２ｇの重鎖の配列は配列番号２０に示される。ＢＢ０５００－２ｇの軽鎖の配列は配列番号２６に示される。
【0070】
８．ＢＢ０５００－２ｎはＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号１１）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０５００－２ｎの重鎖の配列は配列番号２１に示される。ＢＢ０５００－２ｎの軽鎖の配列は配列番号２５に示される。
【0071】
９．ＢＢ０８０２はＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１（Ｓ１４２Ｃ）－ヒンジ（配列番号１２）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＢ０８０２の重鎖の配列は配列番号２２に示される。ＢＢ０８０２の軽鎖の配列は配列番号２７に示される。
【0072】
１０．ＢＲ０３０１はＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖には、ＶＨ（抗ＨＥＲ２）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号２８）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＲ０３０１の重鎖の配列は配列番号２９に示される。ＢＲ０３０１の軽鎖の配列は配列番号３１に示される。
【0073】
１１．ＢＲ０３０２はＩｇＧ１κアイソタイプの形で製造され、その重鎖にはＶＨ（抗ＨＥＲ２）－ＣＨ１（ＩｇＧ２）－ヒンジ（配列番号２８）－ＣＨ２ＣＨ３（ＩｇＧ１）が含まれ、及びその軽鎖には、ＶＬ－ＣＬ（κ）が含まれる。ＢＲ０３０２の重鎖の配列は配列番号３０に示される。ＢＲ０３０２の軽鎖の配列は配列番号３２に示される。
【0074】
２．操作された抗体の発現と精製
操作された抗体の発現のために、コドン最適化及び遺伝子合成を行った。特定の完全長重鎖及び完全長軽鎖ＤＮＡをそれぞれ別々のｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングした。ペアプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクションし、ワンステッププロテインＡ精製を行って検出に十分なタンパク質を製造した。このような形で製造された抗体は発現が良好で、収率が高く、ワンステッププロテインＡ精製プロセスで高純度の精製を行うことができる（図３のａ、ｂ、ｃ部分）。
操作された抗体の発現のために、コドン最適化及び遺伝子合成を行った。特定の完全長重鎖及び完全長軽鎖ＤＮＡをそれぞれ別々のｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングした。ペアプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクションし、ワンステッププロテインＡ精製を行って検出に十分なタンパク質を製造した。このような形で製造された抗体は発現が良好で、収率が高く、ワンステッププロテインＡ精製プロセスで高純度の精製を行うことができる（図３のａ、ｂ、ｃ部分）。
【0075】
３．天然ＩｇＧ１（κ）及びＩｇＧ２（κ）で製造された抗体薬物複合体のプロファイル
穏やかな還元条件下（トリス（２－クロロエチル）ホスフェート（ｔｒｉｓ（２－ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＴＣＥＰ）：ｍＡｂ＝１～３、中性ｐＨ、室温下＜２４０分間）で、ＩｇＧ抗体の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元し、薬物‐リンカーにコンジュゲートしてＡＤＣを形成することができる。精製抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートした（例えば、ＭＭＡＥ、ＤＭ１、又はエリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ））。中性ｐＨのリン酸緩衝液中の精製抗体にＴＣＥＰを加えて部分的に還元し、薬物複合体を生成した。薬物‐リンカー（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ又はＭａｌ－ＰＥＧ２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－エリブリン）をＤＭＡに加え、抗体と反応させて所望の薬物抗体比（ｄｒｕｇ－ｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を得た。抗体とＡＤＣの特性評価のために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＣ）を使用してＡＤＣにおける薬物分布及び薬物と抗体のモル比を評価した。非還元型ＡＤＣにＣＥ－ＳＤＳも実施し、遊離軽鎖（Ｌ）、遊離重鎖（Ｈ）、半抗体（ＨＬ）、インタクト抗体（ＬＨＨＬ）、及び一つ又は二つの軽鎖を欠く抗体（ＨＨＬ又はＨＨ）など、ＡＤＣ製品中の非共有結合成分の割合を評価した。
穏やかな還元条件下（トリス（２－クロロエチル）ホスフェート（ｔｒｉｓ（２－ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＴＣＥＰ）：ｍＡｂ＝１～３、中性ｐＨ、室温下＜２４０分間）で、ＩｇＧ抗体の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元し、薬物‐リンカーにコンジュゲートしてＡＤＣを形成することができる。精製抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートした（例えば、ＭＭＡＥ、ＤＭ１、又はエリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ））。中性ｐＨのリン酸緩衝液中の精製抗体にＴＣＥＰを加えて部分的に還元し、薬物複合体を生成した。薬物‐リンカー（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ又はＭａｌ－ＰＥＧ２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－エリブリン）をＤＭＡに加え、抗体と反応させて所望の薬物抗体比（ｄｒｕｇ－ｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を得た。抗体とＡＤＣの特性評価のために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＣ）を使用してＡＤＣにおける薬物分布及び薬物と抗体のモル比を評価した。非還元型ＡＤＣにＣＥ－ＳＤＳも実施し、遊離軽鎖（Ｌ）、遊離重鎖（Ｈ）、半抗体（ＨＬ）、インタクト抗体（ＬＨＨＬ）、及び一つ又は二つの軽鎖を欠く抗体（ＨＨＬ又はＨＨ）など、ＡＤＣ製品中の非共有結合成分の割合を評価した。
【0076】
ＩｇＧ１（κ）ＡＤＣのＨＩＣプロファイルは、反応期間終了時に残存する裸抗（ＤＡＲ０）が非常に少なく、得られたＡＤＣ生成物がＤＡＲ２－８種の混合物であることを示している（図４のａ部分）。非還元型ＡＤＣ生成物のＣＥ－ＳＤＳの結果は、高いパーセンテージの遊離軽鎖（Ｌ、１８％）、及び一つ又は二つの軽鎖を欠く構造（２０％＋１８％）が存在し、Ｈ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基で発生するコンジュゲートが高いパーセンテージを占めることを示している（図５のａ部分）。
【0077】
逆に、同様の還元とコンジュゲート条件下では、ＩｇＧ２（κ）は反応に対してより耐性がある。Ｈ－Ｌ又はＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合の開放率は非常に低く、反応期間終了時にＩｇＧ２分子の大部分はＤＡＲ０のままである（図４のｂ部分）。ＣＥ－ＳＤＳプロファイルは、ＩｇＧ２（κ）ＡＤＣ生成物中に高いパーセンテージのインタクト抗体（ＬＨＨＬ、８９％）が存在し、遊離軽鎖（Ｌ、～１％、軽鎖薬物複合体を表す）のレベルが非常に低いことを示している（図５のｂ部分）。これらの結果は、ＩｇＧ２（κ）分子のジスルフィド結合がＩｇＧ１抗体のジスルフィド結合よりもはるかに安定であることを示唆している。
【0078】
４．薬物と操作された抗体とのコンジュゲート
ＨＩＣプロファイルは、操作された抗体に基づくＡＤＣ生成物（例えば、図４のｃとｄ部分のＢＢ０５００－２ａと２ｂ）がＤＡＲ０－１０種の混合物で構成され、ここで、ＤＡＲ２種が最も高いパーセンテージ（３５～５０％）を占め、次にＤＡＲ０（ＤＡＲ０は、コンジュゲートプロセスでＡＤＣに変換されない抗体（又はその一部）であることに注意）、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６種（１０～２５％の範囲）が続くことを示している。ＤＡＲ８－１０種は、混合物中で非常に小さなパーセンテージを占めている（＜５％）（図４のｃとｄ部分）。ＣＥ－ＳＤＳの結果は、ＩｇＧ１（κ）と比較して、操作された抗体の全体的な還元耐性、特に～２％しか占めない遊離軽鎖（結合軽鎖を表す）のＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合を検証した（図５のｃ部分）。したがって、得られたＡＤＣ生成物は、主に重鎖のみを含む複合物からなる。
ＨＩＣプロファイルは、操作された抗体に基づくＡＤＣ生成物（例えば、図４のｃとｄ部分のＢＢ０５００－２ａと２ｂ）がＤＡＲ０－１０種の混合物で構成され、ここで、ＤＡＲ２種が最も高いパーセンテージ（３５～５０％）を占め、次にＤＡＲ０（ＤＡＲ０は、コンジュゲートプロセスでＡＤＣに変換されない抗体（又はその一部）であることに注意）、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６種（１０～２５％の範囲）が続くことを示している。ＤＡＲ８－１０種は、混合物中で非常に小さなパーセンテージを占めている（＜５％）（図４のｃとｄ部分）。ＣＥ－ＳＤＳの結果は、ＩｇＧ１（κ）と比較して、操作された抗体の全体的な還元耐性、特に～２％しか占めない遊離軽鎖（結合軽鎖を表す）のＨ－Ｌ鎖間ジスルフィド結合を検証した（図５のｃ部分）。したがって、得られたＡＤＣ生成物は、主に重鎖のみを含む複合物からなる。
【0079】
５．部位選択的薬物コンジュゲート
本開示の特定の操作された抗体から製造されたＡＤＣは、主にＤＡＲ２ ＡＤＣ種である（図４のｅ部分及び図４のｆ部分に示されるように、約６０～７０％であり、ここで、ＡＤＣ中の抗体はそれぞれＢＢ０５００－２ｇ及びＢＢ０５００－２ｎであり、図４のｇ部分及び図４のｈ部分に示されるように、約７０～８０％であり、ここで、ＡＤＣ中の抗体はそれぞれＢＲ０３０１及びＢＲ０３０２である）。これらのクローンのヒンジ領域の配列は、ＨＧ３システイン間のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合を残りの鎖間ジスルフィド結合よりも還元しやすくし、ＨＧ３システインを好ましい又は主要な薬物コンジュゲート部位にすると考えられている。ＨＧ３システインを取り囲む異なるヒンジアミノ酸配列を含む抗体は、ＤＡＲ２を主とするＡＤＣ生成物を得るために、異なる還元及びコンジュゲート条件を必要とする。ＣＥ－ＳＤＳプロファイルは、これらのＡＤＣ製品に非常に低いレベル（～１％）の遊離軽鎖（軽鎖薬物複合体を表す）が存在することを示している（図５のｄ部分）。
本開示の特定の操作された抗体から製造されたＡＤＣは、主にＤＡＲ２ ＡＤＣ種である（図４のｅ部分及び図４のｆ部分に示されるように、約６０～７０％であり、ここで、ＡＤＣ中の抗体はそれぞれＢＢ０５００－２ｇ及びＢＢ０５００－２ｎであり、図４のｇ部分及び図４のｈ部分に示されるように、約７０～８０％であり、ここで、ＡＤＣ中の抗体はそれぞれＢＲ０３０１及びＢＲ０３０２である）。これらのクローンのヒンジ領域の配列は、ＨＧ３システイン間のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合を残りの鎖間ジスルフィド結合よりも還元しやすくし、ＨＧ３システインを好ましい又は主要な薬物コンジュゲート部位にすると考えられている。ＨＧ３システインを取り囲む異なるヒンジアミノ酸配列を含む抗体は、ＤＡＲ２を主とするＡＤＣ生成物を得るために、異なる還元及びコンジュゲート条件を必要とする。ＣＥ－ＳＤＳプロファイルは、これらのＡＤＣ製品に非常に低いレベル（～１％）の遊離軽鎖（軽鎖薬物複合体を表す）が存在することを示している（図５のｄ部分）。
【0080】
ＬＣ－ＭＳ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、非還元条件下でトリプシン消化で操作された抗体のジスルフィド結合パターンを評価した。全てのジスルフィド結合連結ペプチドは、それらの分子量及び配列によって同定された。ＬＣ－ＵＶ検出とＬＣ－ＭＳ検出を組み合わせた場合、全シーケンスカバレッジは１００％であった。Ｃｙｓ１４２を含む軽鎖と重鎖の間のジスルフィド結合、及び二つの重鎖の間の余分なジスルフィド結合（ヒンジ領域のＣＰＰＣＰ配列の上流の追加のＣｙｓに由来する）が検証された。他の１４個のジスルフィド結合連結は、典型的なＩｇＧ１型ジスルフィド結合連結と一致している。
【0081】
コンジュゲート後、コンジュゲート部位は、ペプチドマッピングにおける後期溶出ピークの特徴によって決定された。ピークの分布は、観察されたコンジュゲートペプチドの質量とＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいている。主要なコンジュゲート部位は、重鎖ヒンジ領域のＣＰＰＣＰ配列の上流にある追加のＣｙｓ残基であると決定された。ヒンジ領域におけるＣＰＰＣＰ配列中のＣｙｓ残基の低レベルのコンジュゲートも検出された。これは、ヒンジ領域における二つの重鎖間の鎖間ジスルフィド結合で予想される結合部位と一致している。
【0082】
６．タンパク質ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３に対する異なる操作された抗体の結合活性
ＥＬＩＳＡ法を使用して、操作された抗体と対照野生型（ｗｔ）抗体との間のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３結合能力を検出・比較した。ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３タンパク質を９６ウェルプレートにコーティングし、プレートを一晩インキュベートした。操作された抗体サンプル又は対応する対照抗体を希釈した。その後、希釈したサンプルをタンパク質でコーティングされたプレートに移し、室温でインキュベートした。検出試薬としてＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、ＴＭＢを用いて比色反応を行い、４５０／６５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０）を用いて酵素標識プレート上の吸光度を読み取り、用量反応曲線形式の４つのパラメータロジスティックモデルを用いてデータ解析を行った。
ＥＬＩＳＡ法を使用して、操作された抗体と対照野生型（ｗｔ）抗体との間のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３結合能力を検出・比較した。ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３タンパク質を９６ウェルプレートにコーティングし、プレートを一晩インキュベートした。操作された抗体サンプル又は対応する対照抗体を希釈した。その後、希釈したサンプルをタンパク質でコーティングされたプレートに移し、室温でインキュベートした。検出試薬としてＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、ＴＭＢを用いて比色反応を行い、４５０／６５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０）を用いて酵素標識プレート上の吸光度を読み取り、用量反応曲線形式の４つのパラメータロジスティックモデルを用いてデータ解析を行った。
【0083】
図６の結果は、対応する対照と比較して、異なるターゲットの操作された抗体が類似した結合活性を有することを示し、新規の操作された抗体が、標的タンパク質に対する操作された抗体の活性に影響しないことを示唆している。
【0084】
７．ＥＧＦＲ高／低発現細胞に対する操作された抗体から製造されたＡＤＣの細胞毒性
操作された抗体に由来するＡＤＣの細胞毒性を調べるために、標的発現がん細胞に対するインビトロ細胞毒性を比色ベースの細胞毒性アッセイで評価した。アッセイを行うために、標的細胞を細胞株ごとに最適化された細胞密度で９６ウェル平底組織培養プレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。連続的に希釈したＡＤＣサンプルを細胞プレートに移し、最適な殺傷効果を達成するために、アッセイプレートを特定の期間（細胞株により、３～５日間とする）インキュベートした。データ解析は、用量反応曲線の４つのパラメータロジスティックモデルを用いて行った。図７の結果は、ＢＢ０５００－２ｆ、２ｇ又は２ｎの操作された抗体部分から製造されたエリブリン含有ＥＧＦＲ標的ＡＤＣが、ＥＧＦＲ高発現細胞（Ａ４３１細胞、図７のａ部分）及びＥＧＦＲ低発現細胞（ＮＵＧＣ３細胞、図７のｂ部分）に対して有効な細胞傷害性を発揮することを示している。同様に、ＢＢ０３０１又はＢＢ０３０２の抗体部分を含むＭＭＡＥ含有ＨＥＲ２標的ＡＤＣの結果は、ＨＥＲ２高発現細胞（ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、図７のｃ部分）及びＨＥＲ２低発現細胞（Ａ４３１細胞、図７のｄ部分）に対して有効な細胞傷害性を発揮することを示している。
操作された抗体に由来するＡＤＣの細胞毒性を調べるために、標的発現がん細胞に対するインビトロ細胞毒性を比色ベースの細胞毒性アッセイで評価した。アッセイを行うために、標的細胞を細胞株ごとに最適化された細胞密度で９６ウェル平底組織培養プレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。連続的に希釈したＡＤＣサンプルを細胞プレートに移し、最適な殺傷効果を達成するために、アッセイプレートを特定の期間（細胞株により、３～５日間とする）インキュベートした。データ解析は、用量反応曲線の４つのパラメータロジスティックモデルを用いて行った。図７の結果は、ＢＢ０５００－２ｆ、２ｇ又は２ｎの操作された抗体部分から製造されたエリブリン含有ＥＧＦＲ標的ＡＤＣが、ＥＧＦＲ高発現細胞（Ａ４３１細胞、図７のａ部分）及びＥＧＦＲ低発現細胞（ＮＵＧＣ３細胞、図７のｂ部分）に対して有効な細胞傷害性を発揮することを示している。同様に、ＢＢ０３０１又はＢＢ０３０２の抗体部分を含むＭＭＡＥ含有ＨＥＲ２標的ＡＤＣの結果は、ＨＥＲ２高発現細胞（ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、図７のｃ部分）及びＨＥＲ２低発現細胞（Ａ４３１細胞、図７のｄ部分）に対して有効な細胞傷害性を発揮することを示している。
【0085】
シーケンスリスト
配列番号１～１３及び２８は表１に提供される。
配列番号１～１３及び２８は表１に提供される。
【0086】
配列番号１４（ＢＢ０５００－３重鎖）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１５（ＢＢ０５００－５重鎖）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１６（ＢＢ０５００－２ａ重鎖）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１７（ＢＢ０５００－２ｂ重鎖）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１８（ＢＢ０５００－６ａ重鎖）：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＤＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１９（ＢＢ０５００－２ｆ重鎖）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０（ＢＢ０５００－２ｇ重鎖）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＡＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２１（ＢＢ０５００－２ｎ重鎖）：
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配列番号２２（ＢＢ０８０２重鎖）：
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配列番号２３（軽鎖）：
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配列番号２４（軽鎖）：
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配列番号２５（軽鎖）：
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配列番号２６（軽鎖）：
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配列番号２７（軽鎖）：
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配列番号２９（ＢＲ０３０１重鎖）：
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配列番号３０（ＢＲ０３０２重鎖）：
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配列番号３１（ＢＲ０３０１軽鎖）：
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配列番号３２（ＢＲ０３０２軽鎖）：
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配列番号１５（ＢＢ０５００－５重鎖）：
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配列番号１６（ＢＢ０５００－２ａ重鎖）：
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配列番号１７（ＢＢ０５００－２ｂ重鎖）：
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配列番号１８（ＢＢ０５００－６ａ重鎖）：
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配列番号１９（ＢＢ０５００－２ｆ重鎖）：
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配列番号２０（ＢＢ０５００－２ｇ重鎖）：
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配列番号２１（ＢＢ０５００－２ｎ重鎖）：
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配列番号２５（軽鎖）：
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配列番号２６（軽鎖）：
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配列番号２７（軽鎖）：
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配列番号２９（ＢＲ０３０１重鎖）：
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配列番号３０（ＢＲ０３０２重鎖）：
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配列番号３１（ＢＲ０３０１軽鎖）：
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配列番号３２（ＢＲ０３０２軽鎖）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【図面の簡単な説明】
【0087】
【図1】本出願で使用される抗体のアミノ酸ナンバリングシステムの模式図を示す。（ａ）ヒトＩｇＧ１（κ）のＩＭＧＴベースのアミノ酸ナンバリングシステムである。（ｂ）突然変異体（ＩｇＧ１ヒンジ領域の場合）のナンバリングシステムである。
【図2】Ａ部分は、本発明の実施形態による操作された抗体の模式図を示す。Ｂ部分は、本発明の実施形態によるＩｇＧ抗体におけるジスルフィド結合を示す。
【図3】本発明の実施例の抗体の特徴を示す。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞で産生された抗体の純度と収量である。（ｂ）還元（Ｒ）抗体及び非還元（ＮＲ）抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（ｃ）精製抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析である。
【図4】天然ヒトＩｇＧ１（κ）、ＩｇＧ２（κ）及び本発明の実施例の操作された抗体から製造したＡＤＣのＨＩＣプロファイルを示す。ａ：ＩｇＧ１（κ）－ＭＭＡＥ、ｂ：ＩｇＧ２（κ）－ＭＭＡＥ、ｃ：ＢＢ０５００－２ａ－ＭＭＡＥ、ｄ：ＢＢ０５００－２ｂ－ＭＭＡＥ、ｅ：ＢＢ０５００－２ｇ－ＭＭＡＥ、ｆ：ＢＢ０５００－２ｎ－ＭＭＡＥ、ｇ：ＢＲ０３０１－ＭＭＡＥ及びｈ：ＢＲ０３０２－ＭＭＡＥ。
【図5】本発明の特定の実施例のＡＤＣのＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示す。ａ：ＩｇＧ１（κ）－ＭＭＡＥ、ｂ：ＩｇＧ２（κ）－ＭＭＡＥ、ｃ：ＢＢ０５００－２ａ－ＭＭＡＥ及びｄ：ＢＢ０５００－２ｇ－ＭＭＡＥ。
【図6】タンパク質ＥＧＦＲ（ａ）、ＨＥＲ３（ｂ）、及びＨＥＲ２（ｃ）に対する本発明の実施形態による異なる操作された抗体と対照（ｗｔ）抗体の結合曲線を示す。
【図7】ＥＧＦＲ発現がん細胞（ａ：Ａ４３１細胞、ｂ：ＮＵＧＣ３細胞）に対する本発明の実施形態による操作されたＡＤＣの細胞傷害性曲線と、ＨＥＲ２発現がん細胞（ｃ：ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２高発現）、及びｄ：Ａ４３１（ＨＥＲ２低発現））に対する本発明の実施形態による他の操作されたＡＤＣの細胞傷害性曲線とを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6】
【図7】
【配列表】