特許 7628237 自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-31

(45)【発行日】2025-02-10

(54)【発明の名称】自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/519 20060101AFI20250203BHJP

   A61K 31/197 20060101ALI20250203BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250203BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250203BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20250203BHJP

   A61K 33/26 20060101ALI20250203BHJP

【ＦＩ】

A61K31/519

A61K31/197

A61P29/00 101

A61P37/06

A61P19/02

A61K33/26

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2024504640

(86)(22)【出願日】2023-02-22

(86)【国際出願番号】 JP2023006410

(87)【国際公開番号】W WO2023167066

(87)【国際公開日】2023-09-07

【審査請求日】2024-11-01

(31)【優先権主張番号】P 2022030907

(32)【優先日】2022-03-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】510136312

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】508123858

【氏名又は名称】ＳＢＩファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】梨井 康

【審査官】池田 百合香

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０１０２０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】WANG, Yixuan et al.，Chitosan/hyaluronan nanogels co-delivering methotrexate and 5-aminolevulinic acid: A combined chemo-，Carbohydrate Polymers，2021年10月27日，Vol.277, 118819，p.1-11

【文献】メトトレキサート錠 2mg「日医工」，医療用医薬品 添付文書，日医工株式会社，2019年06月

【文献】ITO, Hidenori et al.，Oral administration of 5-aminolevulinic acid induces heme oxygenase-1 expression in peripheral blood，European Journal of Pharmacology，2018年05月10日，Vol.833，p.25-33

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００ ～ ３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リウマチ性関節炎の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、
（Ａ）５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩、及び、
（Ｂ）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
を含むことを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項2】

リウマチ性関節炎の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、
５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩、を含み、
メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩と併用されることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項3】

リウマチ性関節炎の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩を含み、
５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩、と併用されることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項4】

リウマチ性関節炎の予防及び／又は治療のための、同時又は異時に対象に適用される、組み合わせ医薬であって、
（Ａ）５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩と
（Ｂ）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩との、
組み合わせ医薬。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物または医薬であって、
さらに鉄化合物を含む、又は、さらに鉄化合物と併用されることを特徴とする、
医薬組成物または医薬。

【請求項6】

請求項５に記載の医薬組成物または医薬であって、
前記鉄化合物がクエン酸第一鉄ナトリウムであることを特徴とする、
医薬組成物または医薬。

【請求項7】

リウマチ性関節炎の予防及び／又は治療のためのキットであって、
（Ａ）５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩、及び、
（Ｂ）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
を含むことを特徴とする、
キット。

【請求項8】

リウマチ性関節炎の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための、
（Ａ）５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩、及び、
（Ｂ）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
の使用。

【請求項9】

リウマチ性関節炎を治療するための方法であって、
リウマチ性関節炎を患う非ヒト対象に対して、
（Ａ）５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、又はこれらのいずれかの薬理学的に許容される塩、及び、
（Ｂ）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
を、同時又は異時に適用するステップ、を含むことを特徴とする、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

自己免疫疾患は、免疫系の異常により、免疫系が自己の正常な細胞や組織を攻撃することに起因する疾患であり、攻撃の対象となる細胞や組織の種類によって様々な病態が存在する。自己免疫疾患の治療においては、特に炎症を抑えることが重要であり、一般的に、免疫抑制剤、抗炎症剤、緩和療法等が用いられている。

【0003】

自己免疫疾患の中でも、特にリウマチ性関節炎（ＲＡ）の患者数は多く、日本では約７０万～８０万人、世界では約２３００万人と推定されている。リウマチ性関節炎の多くは自己免疫に関連していることが知られているが、その病因は詳細には解明されておらず、不明な部分も多い（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Lancet. 2017 Jun 10;389(10086):2328-2337

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、新規な自己免疫疾患の治療薬または治療方法を探索することを課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らはメトトレキサート（ＭＴＸ）と５－ＡＬＡ類とを併用することにより、細胞レベル（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体レベル（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）において抗炎症性のタンパク質（例えば、ＨＯ－１）の発現が顕著に増加することを見出した。この新たな作用機序の発見を基礎として、本発明者らはメトトレキサート（ＭＴＸ）と５－ＡＬＡ類とを併用することにより、自己免疫疾患の治療効果が相乗的に高められ得ることを見出し、本発明を完成させるに到った。

【0007】

すなわち本発明は、一実施形態において、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化1】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステル、及び、
（B）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
を含むことを特徴とする、医薬組成物に関する。

【0008】

本発明の他の実施形態は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化2】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステル、を含み、
メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩と併用されることを特徴とする、
医薬組成物に関する。

【0009】

本発明の他の実施形態は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩を含み、
下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化3】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステル、と併用されることを特徴とする、
医薬組成物に関する。

【0010】

本発明の他の実施形態は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための、同時又は異時に対象に適用される、組み合わせ医薬であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化4】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステルと
（B）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩との、
組み合わせ医薬に関する。

【0011】

本発明の一実施形態においては、式（I）中、Ｒ^１が、水素原子、炭素数１～８のアルカノイル基、及び、炭素数７～１４のアロイル基からなる群から選択され、Ｒ^２が、水素原子、直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルキル基、炭素数３～８のシクロアルキル基、炭素数６～１４のアリール基、及び、炭素数７～１５のアラルキル基からなる群から選択される、ことを特徴とする。

【0012】

本発明の一実施形態においては、式（I）中、Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子であることを特徴とする。

【0013】

本発明の一実施形態においては、前記医薬組成物又は医薬が、さらに鉄化合物を含む、又は、さらに鉄化合物と併用されることを特徴とする。

【0014】

本発明の一実施形態においては、前記鉄化合物がクエン酸第一鉄ナトリウムであることを特徴とする。

【0015】

本発明の一実施形態においては、前記自己免疫が、リウマチ性関節炎又は乾癬であることを特徴とする。

【0016】

本発明の他の実施形態は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のためのキットであって、（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化5】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステル、及び、
（B）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
を含むことを特徴とする、キットに関する。

【0017】

本発明の一実施形態においては、前記キットが、前記式（Ｉ）で示される化合物、及びメトトレキサートの投与量及び投与方法の指示を含む説明書をさらに含むことを特徴とする。

【0018】

本発明の一実施形態においては、前記キットが、前記式（Ｉ）で示される化合物、メトトレキサート、及び鉄化合物の投与量及び投与方法の指示を含む説明書をさらに含むことを特徴とする。

【0019】

本発明の他の実施形態は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための、（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化6】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステル、及び、
（B）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
の使用に関する。

【0020】

本発明の他の実施態様は、自己免疫疾患を治療するための方法であって、
自己免疫疾患を患う対象に対して、
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：

【化7】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその薬理学的に許容される塩若しくはエステル、及び、
（B）メトトレキサート又はその薬理学的に許容される塩、
を、同時又は異時に適用するステップ、を含むことを特徴とする、
方法に関する。

【0021】

なお、上記に述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、実施した実験の概要を示す。

【図2】図２は、ＭＴＸ及び／又は５－ＡＬＡ／ＳＦＣの適用による、各遺伝子の発現量の変化を示す。

【図3】図３は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＴＸ及び／又は５－ＡＬＡ／ＳＦＣの適用によるＨＯ－１の発現量の変化を示す。

【図4】図４は、実施例３における足容積測定の結果を示す。

【図5】図５は、実施例３における関節炎スコア測定の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための、メトトレキサート（ＭＴＸ）と５－ＡＬＡ類との組み合わせに関する。本開示における自己免疫疾患とは、免疫系の異常により、免疫系が自己の正常な細胞や組織を攻撃することに起因する疾患を意味してよい。例示的な自己免疫疾患としては、リウマチ性関節炎又は乾癬を挙げることができる。

【0024】

一般的に、メトトレキサートのＩＵＰＡＣ名は、（Ｓ）－２－（４－（（（２，４－ｄｉａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄであり、下記の式（ＩＩ）で表される。

【化8】

【0025】

対象へのメトトレキサートの投与量、投与経路は限定されないが、自己免疫疾患の治療（例えば、リウマチ性関節炎又は乾癬の治療）において一般的に使用されるメトトレキサートの投与量、投与経路が採用されてよい。非限定的な例として、対象の病態に応じて、１～２５ｍｇ／週が経口または注射にて投与されてよい。なお、投与量が多い場合は、上記の量を週２～５回に分割して対象に投与してもよい。

【0026】

本開示において、５－ＡＬＡ類とは、５－ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩をいう。

【0027】

本開示において、５－ＡＬＡは、５－アミノレブリン酸を意味する。５－ＡＬＡは、δ－アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。

【0028】

５－ＡＬＡの誘導体としては、下記式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。式（Ｉ）において、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。なお、式（Ｉ）において、５－ＡＬＡは、Ｒ^１及びＲ^２が水素原子の場合に相当する。

【化9】

【0029】

５－ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）の５－ＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することもできる。

【0030】

式（Ｉ）のＲ^１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１－ナフトイル、２－ナフトイル基等の炭素数７～１４のアロイル基を挙げることができる。

【0031】

式（Ｉ）のＲ^２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルキル基を挙げることができる。

【0032】

式（Ｉ）のＲ^２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１－シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３～８のシクロアルキル基を挙げることができる。

【0033】

式（Ｉ）のＲ^２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６～１４のアリール基を挙げることができる。

【0034】

式（Ｉ）のＲ^２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７～１５のアラルキル基を挙げることができる。

【0035】

好ましい５－ＡＬＡ誘導体としては、Ｒ^１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物が挙げられる。また、好ましい５－ＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ^２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が挙げられる。また、好ましい５－ＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ^１とＲ^２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。

【0036】

５－ＡＬＡ類のうち、５－ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。

【0037】

以上の５－ＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、５－ＡＬＡ、及び、５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル、５－ＡＬＡヘキシルエステル、５－ＡＬＡヘプチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、５－ＡＬＡ塩酸塩、５－ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。

【0038】

上記５－ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記５－ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、また５－ＡＬＡ類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。

【0039】

上記５－ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、５－ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。

【0040】

５－ＡＬＡ類は安全性の高い物質であるため、対象への投与経路は限定されず、様々な投与経路を選択することができる。例えば、舌下投与を含む経口投与、吸入投与、カテーテルによる標的組織又は臓器への直接投与、注射や点滴を含む静脈内投与、シリンジによる皮下投与、貼付剤等による経皮投与、座薬、又は、経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ若しくは腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。最も単純な投与方法としては、経口投与を挙げることができる。

【0041】

５－ＡＬＡ類の対象への投与量は、投与目的に応じて当業者（例えば、医師）が最適な量を決定してよい。具体的には、５－ＡＬＡ換算で対象の体重１ｋｇあたり、０．１ｍｇ～１０００ｍｇ／日、０．２ｍｇ～５００ｍｇ／日、０．３ｍｇ～２５０ｍｇ／日、０．４ｍｇ～１００ｍｇ／日、０．５ｍｇ～４０ｍｇ／日、または、０．５ｍｇ～２０ｍｇ／日の投与量であってよい。

【0042】

本開示において、メトトレキサートと５－ＡＬＡ類とは、対象に同時に投与されてもよいし、異時に投与されてもよい。すなわち、対象へのメトトレキサートの投与と実質的に同じタイミングで５－ＡＬＡ類が投与されてもよいし、対象へのメトトレキサートの投与に先立って５－ＡＬＡ類が投与されてもよいし、対象へのメトトレキサートの投与の後に５－ＡＬＡ類が投与されてもよい。なお、メトトレキサートの対象への投与経路と５－ＡＬＡ類の対象への投与経路は同じであってもよいし、異なってもよい。例えば、メトトレキサートと５－ＡＬＡ類とを合剤として調製する場合は、必然的に両薬剤の投与経路は同じになるし、メトトレキサートと５－ＡＬＡ類とをそれぞれ単独に投与する場合は、対象の病態や治療の方針に応じて両薬剤の投与経路を適宜選択することができる。

【0043】

５－ＡＬＡ類は生体内で代謝されてポルフィリン（主にプロトポルフィリンＩＸ：ＰｐＩＸ）となる。ＰｐＩＸは腫瘍等の組織に集積する性質と、所定の波長の光線を照射されると励起される性質とを兼ね備えており、この性質を利用した光線力学的治療（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤＴ）や光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：ＰＤＤ）に利用可能であることが知られている。しかし、実施例において示されるように、本発明はその効果を発揮するために光線の照射を必要としない。すなわち、本発明はＰＤＴやＰＤＤとは明確に異なる作用機序に基づく発明である。

【0044】

本開示において、５－ＡＬＡ類は鉄化合物とともに対象に適用されてよい。生体内において５－ＡＬＡ類と鉄化合物とは協働して、様々な効果を発揮することが知られている。ただし、鉄は生体内において通常存在する物質であるため、対象の生体において貯蔵鉄が十分に存在する場合や、対象が食事やサプリメントの摂取によって鉄を補給する場合には、本発明の所望の効果を得るために必ずしも鉄化合物を併用する必要はない。鉄化合物の非限定的な例としては、クエン酸第一鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム（ＳＦＣ）、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、ヘム鉄、デキストラン鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ＤＴＰＡ鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン五酢酸鉄アンモニウム、トリエチレンテトラアミン鉄、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸アンモニウム鉄アンモニウム、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、塩化第二鉄、三二酸化鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、フマル酸第一鉄、ピロリン酸第一鉄、含糖酸化鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、硫酸鉄、硫化グリシン鉄を挙げることができる。

【0045】

対象への鉄化合物の投与量は、対象への５－ＡＬＡ類の投与量に対してモル比で０～１００倍であればよく、０．０１倍～１０倍が望ましく、０．０５倍～５倍がより望ましい。

【0046】

本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

【0047】

また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

【0048】

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

【0049】

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

【実施例】

【0050】

実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実験
８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ（Ｂ６／Ｎ）マウスに対し、４％チオグリコレート（７０１５７－１００Ｇ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌ腹腔内投与した。７２時間後に腹膜マクロファージを回収し、１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭα培地を用いて、５％ＣＯ_２、９５％空気の条件下、３７℃で２４時間培養した。異なる濃度のＭＴＸ（Ｍ８４０７－１００ＭＧ／Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）（１００ｎＭ）及び／又は５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣ（小松屋株式会社）（１ｍＭ／０．５ｍＭ）による刺激を２４時間で行った。これらは２ｍｌの６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に５×１０^６細胞／ウェルでプレーティングした（図１）。

【0051】

次いで、培養した細胞からＲＮＡサンプルを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーとＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｑＲＴ－ＰＣＲにより、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＰＲＩＳＭ７７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＴａｑＭａｎシステム（１８Ｓ及びＡｒｇ１）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシステム（１８ｓ，ＨＯ－１，ＣＤ２０６，ＩＬ－１０）を用いて遺伝子発現を解析した。標的遺伝子の閾値サイクル（Ｃｔ）値を１８Ｓ ｒＲＮＡのＣｔ値で標準化した。最終結果は△△Ｃｔ法で解析した。標的特異的プライマー及びプローブの配列を表１及び表２に示す。

【表1】

【表2】

【0052】

実験結果の統計解析方法
結果は平均値及び標準偏差（平均値±ＳＤ）で表した。統計解析については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン ７．０， ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて分析した。対応のない２つのグループの比較は片側のスチューデントのｔ検定を使用した。複数群の比較には，Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いた。
図中の＊，＊＊，＊＊＊，＊＊＊＊はそれぞれ以下を意味する。
＊：ｐ＜０．０５
＊＊：ｐ＜０．０１
＊＊＊：ｐ＜０．００１
＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１

【0053】

結果
ｑＲＴ－ＰＣＲ遺伝子解析の結果を図２に示す。ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣの両方を適用することで、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現量が対照群／５－ＡＬＡ／ＳＦＣ単独投与群／ＭＴＸ単独投与群に比べて有意に増加していた。

【0054】

ＨＯ－１は、ヘム分解の最初の律速段階を触媒する酵素であり、ほとんどの組織では、通常の状態ではこの酵素の発現は低いか、あるいは発現していない。しかし、炎症を起こした組織ではＨＯ－１が高レベルで発現し、強い抗炎症作用を示すことが知られている。したがって、本実験の結果から、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとを組み合わせることによって、相乗的な抗炎症作用が奏されることが示唆される。

【0055】

さらに、図２に示すとおり、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣの両方を適用することで、Ｍ２マクロファージ関連因子であるＩＬ－１０、ＣＤ２０６、Ａｒｇ１の発現も有意に増加していた。Ｍ２マクロファージは主に炎症の制御に働く因子であることが知られている。したがって、本結果から、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとを組み合わせることによって、相乗的な抗炎症作用が奏されることがさらに裏付けられた。

【0056】

実施例２：ｉｎ ｖｉｖｏにおける実験
８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ（Ｂ６／Ｎ）マウスに対し、４％チオグリコレート（７０１５７－１００Ｇ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍｌを腹腔内投与した。その後、マウスをコントロール群、５－ＡＬＡ／ＳＦＣ群、ＭＴＸ群、５－ＡＬＡ／ＳＦＣ＋ＭＴＸ群に分けた。コンロトール群には何も投与しなかった。５－ＡＬＡ／ＳＦＣ群には、４％チオグリコレートを投与した直後、２４時間後、４８時間後に５－ＡＬＡ塩酸塩１００ｍｇ／ｋｇとＳＦＣ（小松屋株式会社）１５７ｍｇ／ｋｇの経口投与を行った。ＭＴＸ群には、４％チオグリコレートを投与した直後にＭＴＸ（Ｍ８４０７－１００ＭＧ／Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）１０ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。５－ＡＬＡ／ＳＦＣ＋ＭＴＸ群には、前記５－ＡＬＡ／ＳＦＣの経口投与と前記ＭＴＸの皮下注射を両方行った。なお、チオグリコレート、５－ＡＬＡ塩酸塩、ＳＦＣ、ＭＴＸのいずれも投与していない群をＮａiｖｅ群とした。

【0057】

４％チオグリコレートの投与から７２時間後に腹水中細胞を回収後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ^TM Ａ３； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ （Ｌ３４９５７， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び抗ＨＯ－１－ＰＥ抗体（ａｂ８３２１４； Ａｂｃａｍ）で染色し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．０； ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて解析した。死細胞をゲートアウト後、各群のＨＯ－１発現を比較した。実験結果の統計解析方法は、実施例１で用いた統計解析方法と同じである。

【0058】

結果
フローサイトメーターによるＭｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ （ＭＦＩ）の結果を図３に示す。この結果から、ＭＴＸと５－ＡＬＡ及びＳＦＣの使用により、ＨＯ－１の発現が、４％チオグリコレートのみを投与した対象群に比べて有意に増加したことが分かる。驚くべきことに、ＭＴＸと５－ＡＬＡ及びＳＦＣの併用は、相加的な程度を超えるＨＯ－１の発現量増加をもたらした。このことから、ＭＴＸと５－ＡＬＡ及びＳＦＣの併用は、相乗的にＨＯ－１の発現量を増加させることが示された。したがって、本結果から、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとを組み合わせることによって、相乗的な抗炎症作用が奏されることがさらに裏付けられた。

【0059】

考察
ＭＴＸは葉酸代謝拮抗機序をもつ免疫抑制剤であり、自己免疫疾患（特に、リウマチ性関節炎や乾癬）の治療薬として世界で広く使用されている薬剤である。ここで、本実施例の結果に示されるとおり、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとの組み合わせにより、相乗的な抗炎症作用が奏されることが示された。すなわち、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとの組み合わせにより、自己免疫疾患に対して相乗的に高められた治療効果が見込まれる。

【0060】

実施例３：コラーゲン関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）モデルを用いた実験
９週齢の雌のＤＡ／Ｓｌｃラットに対し、動物用簡易吸入麻酔装置（型式：ＮＡＲＣＯＢＩＴ－Ｅ（ＩＩ型）、株式会社夏目製作所）を用いたイソフルラン麻酔下で、投与部位である尾根部をバリカンで毛刈りし、シリンジ（テルモ株式会社）及び注射針（テルモ株式会社）を用いて、全ての動物の尾根部左右にそれぞれ０．０５ｍＬずつ、計０．１ｍＬの症状惹起物質投与液を皮内投与した。症状惹起物質投与液は、インターチェンジャブル注射筒（株式会社トップ）にウシＩＩ型コラーゲン及び等量のＡｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄを添加した後、よく混合することで調製した。

【0061】

症状惹起物質はＤａｙ０のみ投与し、初日は各被験物質を症状惹起物質投与前に投与した。ＭＴＸは０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース４００溶液（ＭＣ）で懸濁した。ＡＬＡはアミノレブリン酸塩酸塩を用いており、以下で示す重量はアミノレブリン酸塩酸塩としての重量である。

【0062】

ラットを群１～群５（各群ｎ＝１０）に分け、各被験物質を経口ゾンデ（有限会社フチガミ器械）及びシリンジ（テルモ株式会社）を用いて毎日１回、１８日間連続して経口投与した。1日の投与量は以下に示すとおり。
［群１］ＭＴＸ：０．０２ｍｇ／ｋｇ
［群２］ＭＴＸ：０．０２ｍｇ／ｋｇ＋ＡＬＡ：１００ｍｇ／ｋｇ＋ＳＦＣ：１５７ｍｇ／ｋｇ
［群３］ＡＬＡ：１００ｍｇ／ｋｇ＋ＳＦＣ：１５７ｍｇ／ｋｇ
［群４］ＡＬＡ：１００ｍｇ／ｋｇ
［群５（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）］ＭＣ：１０ｍｌ／ｋｇ

【0063】

症状の評価として、足容積の増加と肉眼的な関節炎の程度のスコアリングの２つを用いた。

【0064】

足容積の測定はＤａｙ０（群分け前）、４、７、１１、１４、１８にＰｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ（型式：ＭＫ－１０１Ｐ、室町機械株式会社）を用いて後肢の足容積を左右それぞれ測定した。片足につき３回ずつ足容積を測定し、３回の平均値を算出した。もう片方の足も同様に足容積を測定した。１個体の足容積測定値は、以下の数式で算出した。
［足容積測定値＝（右足の平均値＋左足の平均値）／２］
群分け前の測定値をＰｒｅ値、群分け後の各測定ポイントでの測定値をＰｏｓｔ値とし、各個体について足容積増大値（ΔｍＬ）をＰｏｓｔ値－Ｐｒｅ値で求めた。

【0065】

関節炎スコア測定はＤａｙ０（群分け前）、４、７、１１、１４、１８にそれぞれ測定した。後肢及び前肢の状態を左右それぞれ観察し、症状なしはスコア０点、指など小関節１箇所の腫脹が見られるときはスコア１点、小関節２か所以上、あるいは大きな関節の腫脹が見られるときはスコア２点、１肢の腫脹が見られるときはスコア３点、１肢の全体において最大限に腫脹が見られるときはスコア４点として評価した。なお、左右の関節炎スコアの総和を、その個体のスコアとして算出した。

【0066】

また、足容積及びスコアについて、表計算ソフトＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により群平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ）を算出し、統計学的処理を行った。有意水準片側５％でスチューデントのｔ検定による群間比較を行った。また、相乗効果の判定には、群１と群５の平均値の群間差が群１と群５の群間差と群３と群５の群間差の合算値を上回るか否か、また、コルビーの式（理論値Ｅ＝Ａ＋Ｂ－（Ａ×Ｂ）／１００）を用い、群２と群５の平均値の群間差割合が群１と群５の群間差割合Ａと群３と群５の群間差割合Ｂから求められた理論値Ｅを上回るかを用いた。

【0067】

結果
（１）足容積の増大値
足容積測定の結果を図４に示す。測定最終日のＤａｙ１８において、群２と群５の群間差０．４２ｍＬは、群１と群５の群間差０．１６ｍＬと群３と群５の群間差０．０９ｍＬの合算値である０．２５ｍＬよりも大きかった。また、群５に対する群２の減少割合である４０．８％はコルビーの式より求められた理論値２４．２％よりも大きかった。また、Ｄａｙ１８において群２と群５、群２と群３を比較した結果、いずれも有意に群２が低かった。また、群１と群２の群間差はｐ＝０．０８で群２が低い傾向にあった。すなわち、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとの組み合わせにより、各薬剤の単独の効果から予測される相加効果を越えた、驚くべき相乗的な症状抑制効果が見られた。

【0068】

（２）関節炎スコア
関節炎スコア測定の結果を図５に示す。測定最終日のＤａｙ１８において、群２と群５の群間差３．６は、群１と群５の群間差１．５と群３と群５の群間差０．０（コントロールより悪化）の合算値である１．５よりも大きかった。また、群５に対する群２の減少割合である３０．５％はコルビーの式より求められた理論値１２．７％よりも大きかった。また、Ｄａｙ１８において群２と群５、群１と群２、群２と群３を比較した結果、いずれも有意に群２が低かった。すなわち、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとの組み合わせにより、各薬剤の単独の効果から予測される相加効果を越えた、驚くべき相乗的な関節炎スコア減少効果が見られた。

【0069】

考察
本実施例においては、コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）モデルラットを用いた実験においても、ＭＴＸと５－ＡＬＡ／ＳＦＣとの組み合わせにより、相乗的な抗炎症作用が奏されることが確認された。なお、前述のとおり、ＭＴＸは葉酸代謝拮抗機序をもつ免疫抑制剤であり、自己免疫疾患（特に、リウマチ性関節炎や乾癬）の治療薬として世界で広く使用されている薬剤である。本実施例においても、ＭＴＸのみを投与した群（群１）においては一定の抗炎症作用が見られており、この結果は本実験系が適切な実験系であることを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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