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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-31
(45)【発行日】2025-02-10
(54)【発明の名称】食肉中のヘム色素の測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/12 20060101AFI20250203BHJP
G01N 21/27 20060101ALI20250203BHJP
A23L 13/00 20160101ALN20250203BHJP
【ＦＩ】
G01N33/12
G01N21/27 Z
A23L13/00 Z
A23L13/00 A
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2024162594
(22)【出願日】2024-09-19
【審査請求日】2024-10-02
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】516147981
【氏名又は名称】伊藤ハム米久ホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】和賀 正洋
【審査官】草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００２／０２１１４２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００３－０８３８８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】井ノ原康太、他２名，魚類筋肉ミオグロビンのメト化率測定方法の検討，日本水産學會誌，日本，2015年05月05日，Vol.81,No.3，Page.456-464
【文献】和賀正洋，６．豚枝肉中のヘム色素構成割合の評価－残血評価手法の確立－，第１０６回 日本養豚学会大会講演要旨，日本，2017年，第１０６回，第６頁
【文献】和賀正洋，食肉中のヘム色素の同時定量法の検討，第１０６回 日本養豚学会大会講演要旨，2017年，第１０６回，第２９頁
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／１２
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ｇ０１Ｎ ２１／２７
Ａ２３Ｌ １３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ｉ）～（ｖ）の工程を備え、
（ｉ）食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程；
（ｉｉ）抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程；
（ｉｉｉ）前記抽出液を酸化する工程；
（ｉｖ）所定波長における前記第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び前記第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程；
（ｖ）前記第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のミオグロビン濃度又はヘモグロビン濃度を算出する工程；
工程（ｉｖ）の前記所定波長がメトヘモグロビンの等吸収率点であり、工程（ｖ）はミオグロビン濃度を算出する工程であるか、
工程（ｉｖ）の前記所定波長がメトミオグロビンの等吸収率点であり、工程（ｖ）はヘモグロビン濃度を算出する工程であり、
前記所定波長は、シトクロムｃの極大吸収波長ではない、
食肉中のミオグロビン濃度又はヘモグロビン濃度の測定方法。
【請求項2】
工程（ｉｉｉ）が、抽出液に酸化剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記酸化剤が、亜硝酸ナトリウム及びフェリシアン化カリウムから選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｉｉｉ）が、抽出液を２０～４０℃の好気的条件下で１２～２４時間静置することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
請求項１に記載の方法に使用するためのキットであって、
少なくとも１つのｐＨ調整剤と、少なくとも１つの酸化剤とを含む、食肉中のミオグロビン濃度又はヘモグロビン濃度を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、食肉中のヘム色素を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
畜肉の流通において、枝肉の筋出血（血斑）の発生や残血は、食肉の外観の低下や臭みを生じさせ、その品質を低下させる要因であり、より低減させることが求められる。血斑や残血は、と畜方法や放血条件により生じることが知られているが（非特許文献１）、その評価は、多くは目視によって行われてきた。
【0003】
非特許文献１では、筋肉内残留血液量を測定するために、豚の横隔膜脚筋抽出液から、ゲルろ過を用いてヘモグロビンを分離し、その５７８ｎｍの吸光度を測定する方法が報告されている。非特許文献２では、豚肉の抽出液を、一酸化炭素を通気して処理した後、吸光度測定を行うことで、豚肉のミオグロビン、ヘモグロビン、シトクロムｃを測定する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】大鹿博英ら、食品衛生研究、Vol. 41, No.5, pp. 79-86 (1991)
【文献】和賀正洋ら、日豚会誌、Vol. 53, No. 1, pp. 10-15 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記非特許文献１に記載の方法は、ゲルろ過による分離処理に時間がかかり、煩雑な操作を要する、という問題があった。また、非特許文献２の記載の方法は、一酸化炭素を用いるため、局所排気装置を要し、日常的な検査には向かない方法であった。
【0006】
本発明の目的は、特殊な設備を用いることなく、従来よりも簡便に食肉中のヘム色素を測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下を提供するものである。
（１）以下の（ｉ）～（ｖ）の工程を備える、食肉中のヘム色素の測定方法。
（ｉ）食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程；
（ｉｉ）抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程；
（ｉｉｉ）前記抽出液を酸化する工程；
（ｉｖ）所定波長における前記第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び前記第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程；
（ｖ）前記第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のミオグロビン濃度又はヘモグロビン濃度を算出する工程。
（２）工程（ｉｖ）の前記所定波長が５２０ｎｍ及び５５０ｎｍではない、（１）に記載の方法。
（３）工程（ｉｖ）の前記所定波長が、メトヘモグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長であり、工程（ｖ）で算出するのが食肉中のミオグロビン濃度である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）工程（ｉｖ）の前記所定波長が、メトミオグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長であり、工程（ｖ）で算出するのが食肉中のヘモグロビン濃度である、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）工程（ｉｉｉ）が、抽出液に酸化剤を添加することを含む、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記酸化剤が、亜硝酸ナトリウム及びフェリシアン化カリウムから選択される少なくとも１つである、（５）に記載の方法。
（７）工程（ｉｉｉ）が、抽出液を２０～４０℃の好気的条件下で１２～２４時間静置することを含む、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）工程（ｉｉｉ）の後、吸光度測定前に各抽出液をろ過することを含む、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）少なくとも１つのｐＨ調整剤と、少なくとも１つの酸化剤とを含む、食肉中のヘム色素を測定するためのキット。
（１０）さらに、ろ紙、ろ過フィルター、及び／又は測定波長及びミオグロビン又はヘモグロビンの濃度の算出式を記載した説明書、を含む、（９）に記載のキット。
（１）以下の（ｉ）～（ｖ）の工程を備える、食肉中のヘム色素の測定方法。
（ｉ）食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程；
（ｉｉ）抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程；
（ｉｉｉ）前記抽出液を酸化する工程；
（ｉｖ）所定波長における前記第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び前記第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程；
（ｖ）前記第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のミオグロビン濃度又はヘモグロビン濃度を算出する工程。
（２）工程（ｉｖ）の前記所定波長が５２０ｎｍ及び５５０ｎｍではない、（１）に記載の方法。
（３）工程（ｉｖ）の前記所定波長が、メトヘモグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長であり、工程（ｖ）で算出するのが食肉中のミオグロビン濃度である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）工程（ｉｖ）の前記所定波長が、メトミオグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長であり、工程（ｖ）で算出するのが食肉中のヘモグロビン濃度である、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）工程（ｉｉｉ）が、抽出液に酸化剤を添加することを含む、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記酸化剤が、亜硝酸ナトリウム及びフェリシアン化カリウムから選択される少なくとも１つである、（５）に記載の方法。
（７）工程（ｉｉｉ）が、抽出液を２０～４０℃の好気的条件下で１２～２４時間静置することを含む、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）工程（ｉｉｉ）の後、吸光度測定前に各抽出液をろ過することを含む、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）少なくとも１つのｐＨ調整剤と、少なくとも１つの酸化剤とを含む、食肉中のヘム色素を測定するためのキット。
（１０）さらに、ろ紙、ろ過フィルター、及び／又は測定波長及びミオグロビン又はヘモグロビンの濃度の算出式を記載した説明書、を含む、（９）に記載のキット。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、特殊な設備を用いることなく、簡便な方法で食肉中のヘム色素を測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明の食肉中のヘム色素の測定方法の工程を示すフロー図である。
【図2】ウマのメトヘモグロビンとメトミオグロビンの各ｐＨにおける吸光スペクトルである。（Ａ）は、メトヘモグロビンの吸光スペクトル、（Ｂ）は、メトミオグロビンの吸光スペクトルを示す。
【図3】ウマのメトミオグロビンのｐＨと６００ｎｍ／５２２ｎｍの吸光度のプロット図である。このプロット図より、ウマのメトミオグロビンのｐＫａ値は、９．０２でることが確認された。
【図4】実施例３、比較例１、比較例２における、牛肉中のヘム色素濃度の測定値を示すグラフである。
【図5】実施例４、比較例１、比較例２における、豚肉中のヘム色素濃度の測定値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
１ 構成及び定義
本明細書における「食肉」は、畜肉、家禽肉、鯨肉、及び魚肉を指す。本明細書において、畜肉は、牛肉、豚肉、馬肉、綿羊肉及び山羊肉等を指す。本明細書において、家禽肉は、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等の鶏類の肉を指す。本明細書において、魚肉は、マグロ、カツオ、ブリ等の赤身を有する魚類の肉を指す。本発明の方法は、畜肉、家禽肉、魚肉のいずれにも適用可能であるが、特に畜肉に適用することができる。以下、特に記載のない限り、食肉は畜肉を指すものとする。
本明細書における「食肉」は、畜肉、家禽肉、鯨肉、及び魚肉を指す。本明細書において、畜肉は、牛肉、豚肉、馬肉、綿羊肉及び山羊肉等を指す。本明細書において、家禽肉は、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等の鶏類の肉を指す。本明細書において、魚肉は、マグロ、カツオ、ブリ等の赤身を有する魚類の肉を指す。本発明の方法は、畜肉、家禽肉、魚肉のいずれにも適用可能であるが、特に畜肉に適用することができる。以下、特に記載のない限り、食肉は畜肉を指すものとする。
【0011】
と畜場における食肉の生産は家畜のスタニング（打額失神）後、ステッキングにより放血し、剥皮、内臓摘出、背割と進む。このうち、遺伝的要因や、放血までの処置が適切ではない場合に、血斑や残血が生じる。食肉において、血液の残存は食味や保存性等、品質上忌避すべきものである。なお、血斑とは毛細血管の破裂を示し、残血とは血管内に血液が残留している状態を指す。
【0012】
食肉に含まれる残血量の指標として、食肉中のヘム色素量が知られる。食肉に含まれるヘム色素としては、ミオグロビン（Ｍｂ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）及びシトクロムｃが知られる。ミオグロビンは、オキシミオグロビン、デオキシミオグロビン、メトミオグロビン（ＯＨ型）又はメトミオグロビン（Ｈ２Ｏ型）の形態で存在する。ヘモグロビンは、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン（ＯＨ型）又はメトヘモグロビン（Ｈ２Ｏ型）の形態で存在する。シトクロムｃは、酸化型シトクロムｃ又は還元型シトクロムｃの形態で存在する。すなわち、食肉中には、１０種類の性状の異なる形態のヘム色素が存在する。これらの色素のそれぞれを測定するには、非常に煩雑な作業を要する。また、吸光度等からそれぞれの濃度を算出するとしても、その計算式が非常に複雑となり、正確な算出が困難となる、という問題が残る。
【0013】
本発明者は、食肉の抽出液を還元し、一酸化炭素を通気することで、Ｍｂをすべてカルボキシミオグロビンに、Ｈｂをすべてカルボキシヘモグロビンに、シトクロムｃをすべて還元型シトクロムｃに変換し、これらの３種のヘム色素を測定する方法を見出したが（非特許文献２）、この方法は一酸化炭素を使用するため、局所排気装置等の特殊な設備を要するという課題があった。
【0014】
酸化により、食肉に含まれるＭｂをすべてｍｅｔＭｂに、ＨｂをすべてｍｅｔＨｂに変換することができる。ｍｅｔＭｂ、ｍｅｔＨｂは、それぞれがｐＨによってＯＨ型（アルカリ性型）又はＨ２Ｏ型（酸性型）となり、その吸光度に変化が生じることが知られる。本発明は、ｐＨによるこれらの吸光度差を利用して、食肉に含まれる全Ｍｂ量、全Ｈｂ量を測定することを特徴とする。食肉のヘム色素中に占めるシトクロムｃ量は通常１％未満であり、Ｍｂ量、Ｈｂ量と比較して非常に少ないことから、食肉の残血評価に影響を与えないものとして、測定対象から除外した。なお、吸光度測定において、シトクロムｃの吸光度ピークである５２０ｎｍ及び５５０ｎｍの吸光度測定を避けることで、シトクロムｃの干渉を回避することが可能である（後述）。
【0015】
ｍｅｔＭｂ及びｍｅｔＨｂは、ｐＨに応じてＯＨ型とＨ２Ｏ型の２つの形態をとり得、それぞれ吸光スペクトルが異なる。このｐＨの変化に伴う吸光変化において、変化しない点＝等吸収率点が存在する。この等吸収率点が発生する波長は、ｍｅｔＭｂとｍｅｔＨｂとで異なる。したがってｍｅｔＨｂの等吸収率点においてｐＨの変化に伴う変化が生じたとすれば、それはｍｅｔＭｂ由来の変化といえる。図２に、ウシのｍｅｔＨｂ（Ａ）、ウマのｍｅｔＭｂ（Ｂ）の各ｐＨの吸光スペクトルを示す。図２Ａの吸光スペクトルから明らかなように、波長が４８９ｎｍ、５２１ｎｍ及び６１７ｎｍのとき、ｐＨによる吸光度変化が生じない。図２Ｂの吸光スペクトルから明らかなように、波長が４９５ｎｍ、５２２ｎｍ及び６２６ｎｍのとき、ｐＨによる吸光度変化が生じない。そのため、異なるｐＨで４８０ｎｍ、５２０ｎｍ又は６１７ｎｍの吸光度に変化が生じた場合、その変化はｍｅｔＭｂに由来するものといえる。一方、異なるｐＨで４９０ｎｍ、５３０ｎｍ又は６２６ｎｍの変化が生じた場合、その変化はｍｅｔＨｂに由来するものといえる。以上のように、ｍｅｔＭｂ、ｍｅｔＨｂは、測定波長を適切に選択することにより、互いに干渉せずに定量することが可能である。
【0016】
２ 食肉中のヘム色素の測定方法
本発明の第１の実施形態は、食肉中のヘム色素の測定方法である。本実施形態の食肉中のヘム色素の測定方法は、以下の（ｉ）～（ｖ）の工程を備えることを特徴とする。
（ｉ）食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程；
（ｉｉ）抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程；
（ｉｉｉ）前記抽出液を酸化する工程；
（ｉｖ）所定波長における前記第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び前記第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程；
（ｖ）前記第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のＭｂ濃度又はＨｂ濃度を算出する工程。
本発明の第１の実施形態は、食肉中のヘム色素の測定方法である。本実施形態の食肉中のヘム色素の測定方法は、以下の（ｉ）～（ｖ）の工程を備えることを特徴とする。
（ｉ）食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程；
（ｉｉ）抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程；
（ｉｉｉ）前記抽出液を酸化する工程；
（ｉｖ）所定波長における前記第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び前記第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程；
（ｖ）前記第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のＭｂ濃度又はＨｂ濃度を算出する工程。
【0017】
本実施形態の方法によれば、特殊な設備や煩雑な操作を要することなく、食肉中のヘム色素を測定することが可能である。
【0018】
以下、本実施形態の方法を、工程ごとに説明する。本実施形態の方法のフロー図を図１に示す。本実施形態の方法は、工程（ｉ）抽出工程、工程（ｉｉ）ｐＨ調整工程、工程（ｉｉｉ）酸化工程、工程（ｉｖ）吸光度測定工程、（ｖ）ヘム色素量算出工程を少なくとも含む。工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）－工程（ｉｉｉ）の順に実施してもよく、また、工程（ｉｉｉ）－工程（ｉｉ）の順に実施してもよい。特に工程（ｉｉ）－工程（ｉｉｉ）の順に実施することが好ましい。工程（ｉｉｉ）－工程（ｉｉ）の順に実施する場合は、工程（ｉｖ）の前にｐＨを測定する工程を含むことが好ましい。また、いずれの場合も、工程（ｉｖ）の前に、ろ過工程を実施することが好ましい。
【0019】
２－１ 工程（ｉ） 抽出工程
本実施形態の方法は、工程（ｉ）として、食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程を含む。具体的には、食肉を溶媒と接触させ、溶媒にヘム色素を移行させる工程を含む。ここで使用される溶媒は、ヘム色素を溶解する溶媒であれば特に限定されないが、例えば、水及びその溶液から選択することができる。水溶液を使用する場合、例えば、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の緩衝液を好適に使用できる。
本実施形態の方法は、工程（ｉ）として、食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得る工程を含む。具体的には、食肉を溶媒と接触させ、溶媒にヘム色素を移行させる工程を含む。ここで使用される溶媒は、ヘム色素を溶解する溶媒であれば特に限定されないが、例えば、水及びその溶液から選択することができる。水溶液を使用する場合、例えば、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の緩衝液を好適に使用できる。
【0020】
抽出工程において、食肉はブロック状であってもよいが、細かく裁断されていること、例えばミンチ状とされることが好ましい。細かく裁断された食肉は、さらに、溶媒中でホモジナイズされることが好ましい。浸漬、ホモジナイズの食肉は、遠心分離や、ろ紙、ガーゼ等によるろ過により、溶媒から除去することができる。得られた溶媒を、抽出液として、後段の測定に使用することができる。
【0021】
２－２ 工程（ｉｉ） ｐＨ調整工程
本実施形態の方法は、工程（ｉｉ）として、工程（ｉ）で得られた抽出液を少なくとも２つに分注して、第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程を含む。工程（ｉｉ）は、後述する工程（ｉｉｉ）の前に行われてもよく、工程（ｉｉｉ）の後に行われてもよい。
本実施形態の方法は、工程（ｉｉ）として、工程（ｉ）で得られた抽出液を少なくとも２つに分注して、第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整する工程を含む。工程（ｉｉ）は、後述する工程（ｉｉｉ）の前に行われてもよく、工程（ｉｉｉ）の後に行われてもよい。
【0022】
第１抽出液及び第２抽出液のｐＨの調整手法は特に限定されないが、ｐＨを下げるためには、希塩酸、有機酸液（酢酸、クエン酸等）等を使用することができ、一方、ｐＨを上げるためには水酸化ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、炭酸カリウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、炭酸水素カリウム溶液等を使用することができる。なお、ｐＨ調整前の抽出液は、通常は弱酸性であることから、多くの場合はｐＨを下げることを要しない。この場合、第２抽出液にｐＨを上げるために添加した水溶液と同量の水を第１抽出液に加え、ヘム色素の濃度を揃えることが好ましい。
【0023】
第１抽出液のｐＨは、５．０～７．５、好ましくは５．５～７．０、より好ましくは、５．８～６．８とすることができる。第２抽出液のｐＨは、８．０～１０．０、好ましくは、８．５～１０．０、より好ましくは、８．５～９．５とすることができる。ここで、第１抽出液のｐＨと第２抽出液のｐＨは、１．０以上、特に１．５以上、さらに２．０以上離れていることが好ましい。
【0024】
２－３ 工程（ｉｉｉ） 酸化工程
本実施形態の方法は、工程（ｉｉｉ）として、抽出液を酸化する工程を含む。ここでいう「抽出液」は、工程（ｉｉ）でｐＨを調整後の各抽出液であってもよく、工程（ｉ）で得られた抽出液であってもよい。工程（ｉ）で得られた抽出液を酸化工程に付した場合、その後、工程（ｉｉ）のｐＨ調整工程が実施される。
本実施形態の方法は、工程（ｉｉｉ）として、抽出液を酸化する工程を含む。ここでいう「抽出液」は、工程（ｉｉ）でｐＨを調整後の各抽出液であってもよく、工程（ｉ）で得られた抽出液であってもよい。工程（ｉ）で得られた抽出液を酸化工程に付した場合、その後、工程（ｉｉ）のｐＨ調整工程が実施される。
【0025】
酸化手法は、Ｍｂ及びＨｂが十分にメト化する条件であれば、特に限定されないが、例えば、酸化剤を用いる手法、又は、２０～４０℃の好気的条件下で１２～２４時間静置する手法をとり得る。
【0026】
酸化剤を用いる手法は、短時間でヘム色素のメト化を生じさせることができる。酸化剤としては、例えば、亜硝酸ナトリウム、フェリシアン化カリウム等を用いることができる。酸化剤の濃度、反応時間は、使用する酸化剤の種類によって異なるが、例えば、亜硝酸ナトリウムの場合は、濃度は０．００５～０．１重量％程度、反応時間は３０～６０分間程度とすることができる。
【0027】
抽出液を２０～４０℃の好気的条件で１２～２４時間静置する方法は、時間はかかるものの、使用後の試液の廃棄等が容易であるため、廃棄手段を有しない施設で工程に使用できる。本明細書において、好気的条件とは、酸素濃度が少なくとも１％存在する条件を指す。抽出液の静置温度は、３０～４０℃、特に３５～３８℃とすることが好ましい。
【0028】
酸化反応が十分に進行したかは、例えば、目視で抽出液の色調変化（赤色から茶色への変化）を観察することで確認できる。また、より好ましくは分光光度計での吸光スペクトルから判断することもできる。
【0029】
２－４ ろ過工程
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）を実施した後の抽出液について、ろ過を行ってもよい。例えばフィルターろ過を行うことで、ｐＨ調整、酸化反応で生じた沈殿が、後段の吸光度測定に与える影響を回避することができる。使用するフィルターの材料は、特に限定されないが、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、ポリエーテルサルフォン、親水性ＰＴＦＥ等のメンブレンフィルターとすることができる。フィルターの孔径は、特に限定されないが、例えば、０．４５μｍ、０．２２μｍ等とすることができる。また、ろ紙を用いても良い。例えば粒子保持径φ３μｍの定量ろ紙であれば好適に用いることができる。ろ過工程は、ｐＨ調整工程、酸化工程において沈殿が生じた場合に実施することが好ましい。また、ろ過工程は、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の後のみでなく、沈殿が生じるタイミングで適宜実施してもよい。
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）を実施した後の抽出液について、ろ過を行ってもよい。例えばフィルターろ過を行うことで、ｐＨ調整、酸化反応で生じた沈殿が、後段の吸光度測定に与える影響を回避することができる。使用するフィルターの材料は、特に限定されないが、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、ポリエーテルサルフォン、親水性ＰＴＦＥ等のメンブレンフィルターとすることができる。フィルターの孔径は、特に限定されないが、例えば、０．４５μｍ、０．２２μｍ等とすることができる。また、ろ紙を用いても良い。例えば粒子保持径φ３μｍの定量ろ紙であれば好適に用いることができる。ろ過工程は、ｐＨ調整工程、酸化工程において沈殿が生じた場合に実施することが好ましい。また、ろ過工程は、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の後のみでなく、沈殿が生じるタイミングで適宜実施してもよい。
【0030】
２－５ 工程（ｉｖ） 吸光度測定工程
本実施形態の方法は、工程（ｉｖ）として、所定波長における第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程を含む。
本実施形態の方法は、工程（ｉｖ）として、所定波長における第１抽出液の吸光度である第１吸光度、及び第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する工程を含む。
【0031】
ここでいう所定波長は、後段の工程（ｖ）でＭｂ量を算出する場合は、メトヘモグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長とすることが好ましい。一方、後段の工程（ｖ）でＨｂ量を算出する場合は、メトミオグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長とすることが好ましい。
【0032】
「メトヘモグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長」（以下、「ｍｅｔＨｂ等吸収率点」とも称する）及び「メトミオグロビンの吸光度がｐＨの影響を受けない波長」（以下、「ｍｅｔＭｂ等吸収率点」とも称する）は、動物種によって異なるため、予めｍｅｔＨｂ又はｍｅｔＭｂの標品を用いて試験することで決定することができる。図２に、ウマのｍｅｔＨｂ（図２Ａ）及びｍｅｔＭｂ（図２Ｂ）の各ｐＨの吸光スペクトルを示す。図２Ａに示す結果より、ｍｅｔＨｂ等吸収率点は、４８０ｎｍ、５２５ｎｍ及び６１７ｎｍであり、したがって、Ｍｂ量を算出する場合は、所定波長は、４８０ｎｍ、５２５ｎｍ又は６１７ｎｍとすることができる。図２Ｂに示す結果より、ｍｅｔＭｂ等吸収率点は、４９０ｎｍ、５３０ｎｍ及び６２６ｎｍであり、したがって、Ｈｂ量を算出する場合、所定波長は、４９０ｎｍ、５３０ｎｍ又は６２６ｎｍとすることができる。
【0033】
所定波長は、５２０ｎｍ又は５５０ｎｍに設定しないことが望ましい。ヘム色素にはシトクロムｃが含まれ、その極大吸収波長は５２０ｎｍ及び５５０ｎｍである、この波長で吸光度を測定することで、試料中のシトクロムｃに由来する吸光度の上昇が見られることから、Ｍｂ量またはＨｂ量を正確に測れない可能性がある。
【0034】
吸光度の測定は、例えば、光路長１０ｍｍの吸光度測定用のセルに抽出液を入れて、分光光度計を用いて実施することができる。あるいは、例えば、マイクロプレート（２４ウェル、９６ウェル等）に複数の抽出液を分注し、マイクロプレートリーダーを用いて測定してもよい。ここで使用する分光光度計又はマイクロプレートリーダーは、特に限定されず、通常試液の吸光度を測定するために使用されるものをいずれも使用できる。
【0035】
２－６ 工程（ｖ） ヘム色素量算出工程
本実施形態の方法は、工程（ｖ）として、第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のＭｂ濃度又はＨｂ濃度を算出する工程を含む。
本実施形態の方法は、工程（ｖ）として、第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のＭｂ濃度又はＨｂ濃度を算出する工程を含む。
【0036】
上記した通り、ｍｅｔＭｂ及びｍｅｔＨｂは、ｐＨに応じてＯＨ型とＨ２Ｏ型の２つの形態をとり得、それぞれ吸光スペクトルが異なる。このｐＨの変化に伴う吸光変化において、変化しない点＝等吸収率点が存在する。この点（波長）の吸光度の変化量は濃度依存的であるから、予め濃度あたり変化量を割り出しておくことで、変化量からヘム色素の濃度を算出できる（下記式（Ｉ））。
【数1】
【0037】
濃度あたり変化量は、任意の２点のｐＨにおいて推定された単位濃度のｍｅｔＭｂあるいはｍｅｔＨｂの吸光度の差分による。任意のｐＨにおけるｍｅｔＭｂおよびｍｅｔＨｂの吸光度を推定するためには、それぞれのＯＨ結合型あるいはＨ２Ｏ結合型の割合を求める必要がある。ｍｅｔＭｂあるいはｍｅｔＨｂの、ＯＨあるいはＨ２Ｏ結合型の割合は酸の電離挙動とよく似ており、ｍｅｔＭｂおよびｍｅｔＨｂの濃度酸解離定数（ｐＫａ）とｐＨから求めることができる。
ｐＨとｐＫａには次のような関係がある（下記式（ＩＩ））。
（ここで、［ＨＡ］は非解離型の酸であるＨＡの濃度、すなわち、ｍｅｔＭｂ（ｍｅｔＨｂ）ではＨ２Ｏ型の濃度を指す）
上記式（ＩＩ）より、下記式（ＩＩＩ）が導き出される。
さらにｌｏｇをとると、下記式（ＩＶ）が導き出される。
ｍｅｔＭｂ（ｍｅｔＨｂ）の結合子の変化は１分子あたり収量が１分子であるから、［Ａ－］＝１－［ＨＡ］となるため、下記式（Ｖ）が導き出される。
さらに両辺に１（［ＨＡ］／［ＨＡ］）を足すと、下記式（ＶＩ）が導き出される。
これを整理すると下記式（VII）が導き出される。
以上より、ＨＡの濃度は下記式（VIII）で表すことができる。
ｐＨとｐＫａには次のような関係がある（下記式（ＩＩ））。
【数2】
上記式（ＩＩ）より、下記式（ＩＩＩ）が導き出される。
【数3】
【数4】
【数5】
【数6】
【数7】
【数8】
【0038】
ｐＨの増大に伴い（［ＨＡ］の減少に伴い）吸光度が増大する場合（波長が６１７ｎｍの場合のＭｂがこれに該当）、特定の波長における吸光度Ａｂｓが特定のｐＨで取る値Ａｂｓ（ｐＨ）は下記式（ＩＸ）で表すことができる。なお、ＨＡ濃度が最も低いときに示す単位濃度あたり最小吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）、ＨＡ濃度が最も高いときに示す単位濃度あたり最大吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）とする。
【数9】
【0039】
ｐＨの増大に伴い（［ＨＡ］の減少に伴い）吸光度が減少する場合（波長が６２６ｎｍの場合のＨｂがこれに該当）、特定の波長における吸光度Ａｂｓが特定ｐＨで取る値Ａｂｓ（ｐＨ）は下記式（Ｘ）で表すことができる。
【数10】
【0040】
ここで、式（ＩＸ）及び式（Ｘ）に、式（ＶＩＩＩ）を代入すると、それぞれ、下記式（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）で示すことができる。
【数11】
【数12】
【0041】
式（ＸＩ）及び式（ＸＩＩ）をそれぞれ式（Ｉ）の概念式にあてはめると、Ｍｂ濃度［Ｍｂ］及びＨｂ濃度［Ｈｂ］は、下記式（ＸＩＩＩ）及び下記式（ＸＩＶ）で示すことができる。
（ここで、ｐＨａは任意のｐＨ（酸性側）、ｐＨｂは任意のｐＨ（アルカリ性側）、ＡｂｓＨ（ａ）はｐＨａでのｍｅｔＨｂ等吸収率点における吸光度（Ｍｂ第１吸光度）、ＡｂｓＨ（ｂ）はｐＨｂでのｍｅｔＨｂ等吸収率点における吸光度（Ｍｂ第２吸光度）、ＡｂｓＭ（ａ）はｐＨａでのｍｅｔＭｂ等吸収率点における吸光度（Ｈｂ第１吸光度）、ＡｂｓＭ（ｂ）はｐＨｂでのｍｅｔＭｂ等吸収率点における吸光度（Ｈｂ第２吸光度）を指す。）
【数13】
【数14】
【0042】
上記式（ＸＩＩＩ）に、ｐＨａ、ｐＨｂ、予め測定しておいたＡｂｓ（ＭＡＸ）、Ａｂｓ（ＭＩＮ）を入力し、さらに工程（ｉｖ）で測定したＡｂｓＨ（ａ）（Ｍｂ第１吸光度）、ＡｂｓＨ（ｂ）（Ｍｂ第２吸光度）の値を入力することで、抽出液のＭｂ濃度を算出することができる。また、上記式（ＸＩＶ）に、ｐＨａ、ｐＨｂ、予め測定しておいたＡｂｓ（ＭＡＸ）、Ａｂｓ（ＭＩＮ）を入力し、さらに工程（ｉｖ）で測定したＡｂｓＭ（ａ）（Ｈｂ第１吸光度）、ＡｂｓＭ（ｂ）（Ｈｂ第２吸光度）の値を入力することで、抽出液のＨｂ濃度を算出することができる。ここで算出したＭｂ濃度又はＨｂ濃度と、工程（ｉ）で使用した食肉重量から、単位重量あたりの食肉に含まれるＭｂ量、Ｈｂ量を算出することができる。
【0043】
２－７ その他の工程
本実施形態の方法は、上記工程（ｉ）～（ｖ）及びろ過工程とは別に、他の工程を含んでいてもよい。他の工程の一例としては、工程（ｉｖ）の測定波長を決定する工程が挙げられる。工程（ｉｖ）において、測定波長は、ｍｅｔＨｂ等吸収率点又はｍｅｔＭｂ等吸収率点とすることが求められる。ｍｅｔＨｂの等吸収率点、ｍｅｔＭｂの等吸収率点は、由来動物種によって異なるが、予め分かっている場合はその波長を使用することができる。一方、その動物種のｍｅｔＨｂの等吸収率点、ｍｅｔＭｂの等吸収率点が不明の場合は、予め試験により決定する必要がある。具体的には、複数のｐＨ条件下でｍｅｔＨｂ又はｍｅｔＭｂの吸光スペクトルを取得し、ｐＨにより吸光度が変化しない点を割り出すことで決定できる。
本実施形態の方法は、上記工程（ｉ）～（ｖ）及びろ過工程とは別に、他の工程を含んでいてもよい。他の工程の一例としては、工程（ｉｖ）の測定波長を決定する工程が挙げられる。工程（ｉｖ）において、測定波長は、ｍｅｔＨｂ等吸収率点又はｍｅｔＭｂ等吸収率点とすることが求められる。ｍｅｔＨｂの等吸収率点、ｍｅｔＭｂの等吸収率点は、由来動物種によって異なるが、予め分かっている場合はその波長を使用することができる。一方、その動物種のｍｅｔＨｂの等吸収率点、ｍｅｔＭｂの等吸収率点が不明の場合は、予め試験により決定する必要がある。具体的には、複数のｐＨ条件下でｍｅｔＨｂ又はｍｅｔＭｂの吸光スペクトルを取得し、ｐＨにより吸光度が変化しない点を割り出すことで決定できる。
【0044】
他の工程の別の例としては、工程（ｖ）の算出に必要な値を予め決定する工程が挙げられる。工程（ｖ）では、食肉中のＭｂ量、Ｈｂ量を算出するために、Ａｂｓ（ＭＡＸ）、Ａｂｓ（ＭＩＮ）の値が必要となる。これらの値は、動物種によって異なるが、予め分かっていれば、その値を使用することができる。一方、その動物種のＡｂｓ（ＭＡＸ）、Ａｂｓ（ＭＩＮ）が分からない場合は、予め試験によりその値を決定することを要する。具体的には、単位濃度のＭｂ又はＨｂを含む溶液を、ｐＫａと比較して十分に高いｐＨ及び十分に低いｐＨに調整し、所定の測定波長でのそれぞれの吸光度を測定することで決定できる。
【0045】
本実施形態の方法によれば、特殊な設備や煩雑な手法を用いることなく、ｐＨの調製、必要に応じて酸化剤の添加、及び吸光度の測定のみで、食肉のヘム色素を測定することが可能である。
【0046】
３ 食肉中のヘム色素を測定するためのキット
本発明の第２の実施形態は、食肉中のヘム色素を測定するためのキットである。本実施形態のキットは、少なくとも１つのｐＨ調整剤と、少なくとも１つの酸化剤とを含む、ことを特徴とする。本実施形態のキットは、より具体的には、「２ 食肉中のヘム色素の測定方法」の節に記載の方法に使用するためのキットである。本実施形態において、特に記載のない限り、また、特に矛盾のない限り、使用される用語の定義等は、「２ 食肉中のヘム色素の測定方法」の記載と同様である。
本発明の第２の実施形態は、食肉中のヘム色素を測定するためのキットである。本実施形態のキットは、少なくとも１つのｐＨ調整剤と、少なくとも１つの酸化剤とを含む、ことを特徴とする。本実施形態のキットは、より具体的には、「２ 食肉中のヘム色素の測定方法」の節に記載の方法に使用するためのキットである。本実施形態において、特に記載のない限り、また、特に矛盾のない限り、使用される用語の定義等は、「２ 食肉中のヘム色素の測定方法」の記載と同様である。
【0047】
本実施形態のキットに含まれるｐＨ調整剤としては、ｐＨを下げるものとして、希塩酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、酢酸、乳酸等、ｐＨを上げるものとして、水酸化ナトリウム溶液、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。
【0048】
本実施形態のキットにおいて、酸化剤は、ヘム色素を酸化できる薬剤であればいずれも使用可能であるが、例えば、亜硝酸ナトリウム、フェリシアン化カリウム等を好適に使用できる。
【0049】
本実施形態のキットは、さらに、ろ紙を含んでいてもよい。ろ紙は、食肉を裁断、ホモジナイズした後の残渣を除くために使用することができる。ろ紙に代えてガーゼを用いてもよい。
【0050】
本実施形態のキットは、ろ過フィルターを含んでいてもよい。ろ過フィルターは、食肉からのヘム色素抽出液に、ｐＨ調整剤、酸化剤を加えたときに生じ得る沈殿を除去するために使用できる。
【0051】
本実施形態のキットは、測定波長及びミオグロビン又はヘモグロビンの濃度の算出式を記載した説明書を含んでいてもよい。食肉のヘム色素抽出液の吸光度するに際し、食肉の由来動物種によって、適した測定波長が異なる。そのため、使用者に、適用する食肉ごとに、適した測定波長を教示することを要する。また、得られたｐＨ、吸光度のデータから、食肉中のＭｂ量、Ｈｂ量を算出する式も、食肉の由来動物種によって異なる。そのため、適用する食肉ごとに、適した算出式を教示することを要する。前記説明書には、測定波長、算出式の具体的な説明が記載されていることが好ましい。あるいは、前記説明書には、動物種から適した測定波長を指示する機能、得られたｐＨ、吸光度のデータから、食肉中のＭｂ量、Ｈｂ量を自動的に算出するアプリに接続するためのＱＲコード（登録商標）が表示されていてもよい。
【実施例】
【0052】
以下に本発明の実施例を掲載して、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0053】
＜実施例１：ヘム色素の各ｐＨにおける吸光スペクトル測定＞
標品のｍｅｔＨｂ（ウシ由来）、ｍｅｔＭｂ（ウマ由来）の吸光スペクトルを以下の手法で取得した。試薬のＨｂ（ウシ由来）とＭｂ（ウマ由来）はいずれも酸化型として扱った。これらを１ｍｇ／ｍＬとなるよう各種ｐＨ緩衝液に加え入れ、０．４５μｍのフィルターでろ過した溶液をｍｅｔＨｂおよびｍｅｔＭｂの各ｐＨの検体とした。これらの検体を光路長１０ｍｍのセルで、紫外可視分光光度計ＵＶ－２７００（島津製作所）を用いて４５０～７５０ｎｍの吸光スペクトルを測定した。
標品のｍｅｔＨｂ（ウシ由来）、ｍｅｔＭｂ（ウマ由来）の吸光スペクトルを以下の手法で取得した。試薬のＨｂ（ウシ由来）とＭｂ（ウマ由来）はいずれも酸化型として扱った。これらを１ｍｇ／ｍＬとなるよう各種ｐＨ緩衝液に加え入れ、０．４５μｍのフィルターでろ過した溶液をｍｅｔＨｂおよびｍｅｔＭｂの各ｐＨの検体とした。これらの検体を光路長１０ｍｍのセルで、紫外可視分光光度計ＵＶ－２７００（島津製作所）を用いて４５０～７５０ｎｍの吸光スペクトルを測定した。
【0054】
各種ｐＨ緩衝液の組成は、以下の通りとした。
０．１Ｍ 酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．５）
０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）
０．１Ｍ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．６）
０．１Ｍ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ８．６）
０．１Ｍ 炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．６）
０．１Ｍ 炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ１０．４）
０．１Ｍ 酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．５）
０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）
０．１Ｍ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．６）
０．１Ｍ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ８．６）
０．１Ｍ 炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．６）
０．１Ｍ 炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ１０．４）
【0055】
図２に、ｍｅｔＨｂ（Ａ）、ｍｅｔＭｂ（Ｂ）の各ｐＨの吸光スペクトルを示す。図２Ａの吸光スペクトルより、波長が４８０ｎｍ、５２５ｎｍ及び６２０ｎｍのとき、ｐＨによる吸光度変化が生じないことが明らかとなった。図２Ｂの吸光スペクトルより、波長が４９０ｎｍ、５３０ｎｍ及び６３０ｎｍのとき、ｐＨによる吸光度変化が生じないことが明らかとなった。
【0056】
＜実施例２：ｍｅｔＭｂのｐＫａ値の決定＞
ウマｍｅｔＭｂのｐＫａ値を、以下の手法によって求めた。ウマのｍｅｔＭｂを調製し（和賀正洋著 麻布大学博士論文（2017））、ｐＨ４～１２．０の同濃度のｍｅｔＭｂ水溶液を調製し、それぞれの６００ｎｍ／５２２ｎｍの吸光度を測定した（光路長１０ｍｍ）。各ｐＨの溶液について、独立して２回の測定を行った。図３に、各ｐＨのｍｅｔＭｂの６００ｎｍ／５２２ｎｍの吸光度のプロット図を示す。プロット図より、ウマｍｅｔＭｂのｐＫａ値は９．０２であることが確認できた。
ウマｍｅｔＭｂのｐＫａ値を、以下の手法によって求めた。ウマのｍｅｔＭｂを調製し（和賀正洋著 麻布大学博士論文（2017））、ｐＨ４～１２．０の同濃度のｍｅｔＭｂ水溶液を調製し、それぞれの６００ｎｍ／５２２ｎｍの吸光度を測定した（光路長１０ｍｍ）。各ｐＨの溶液について、独立して２回の測定を行った。図３に、各ｐＨのｍｅｔＭｂの６００ｎｍ／５２２ｎｍの吸光度のプロット図を示す。プロット図より、ウマｍｅｔＭｂのｐＫａ値は９．０２であることが確認できた。
【0057】
＜実施例３：牛肉のヘム色素測定＞
（１）ウシＭｂの調製
牛肉を３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水１重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、２０分間遠心分離し、上清を得た。上清を飽和度６０～９０％で硫安分画して得られたペレットを疎水性クロマトグラフィーの検体とした。ＦＰＬＣを用いて、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ ５ｍＬカラムで、４０％硫安飽和度で溶出する画分をＭｂとして採取した。
（１）ウシＭｂの調製
牛肉を３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水１重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、２０分間遠心分離し、上清を得た。上清を飽和度６０～９０％で硫安分画して得られたペレットを疎水性クロマトグラフィーの検体とした。ＦＰＬＣを用いて、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ ５ｍＬカラムで、４０％硫安飽和度で溶出する画分をＭｂとして採取した。
【0058】
（２）ウシＨｂ
ウシＨｂは、市販の標品（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ＦｒｅｅｚｅＤｒｉｅｄ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＯＨ，ＵＳＡ））を使用した。
ウシＨｂは、市販の標品（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ＦｒｅｅｚｅＤｒｉｅｄ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＯＨ，ＵＳＡ））を使用した。
【0059】
（３）ウシｍｅｔＨｂ及びウシｍｅｔＭｂの等吸収率点の決定
上記（１）、（２）で得られたウシＨｂ及びＭｂから、ｍｅｔＨｂ及びｍｅｔＭｂを調製し（和賀ら、２０１７）、各ｐＨにおける吸光スペクトルを、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、ウシｍｅｔＨｂの等吸収率点が、４８９ｎｍ、５２１ｎｍ及び６１７ｎｍ、ウシｍｅｔＭｂの等吸収率点が４９４ｎｍ、５２３ｎｍ及び６２６ｎｍであることが確認できた。
上記（１）、（２）で得られたウシＨｂ及びＭｂから、ｍｅｔＨｂ及びｍｅｔＭｂを調製し（和賀ら、２０１７）、各ｐＨにおける吸光スペクトルを、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、ウシｍｅｔＨｂの等吸収率点が、４８９ｎｍ、５２１ｎｍ及び６１７ｎｍ、ウシｍｅｔＭｂの等吸収率点が４９４ｎｍ、５２３ｎｍ及び６２６ｎｍであることが確認できた。
【0060】
（４）ウシｍｅｔＭｂ及びウシｍｅｔＨｂのｐＫａの決定
ウマｍｅｔＭｂに代えてウシｍｅｔＭｂ又はウシｍｅｔＨｂを使用した以外は、実施例２と同様の方法でそれぞれのｐＫａ値を求めた。ウシｍｅｔＭｂのｐＫａ値は９．０２、ウシｍｅｔＨｂのｐＫａ値は８．２２であった。
ウマｍｅｔＭｂに代えてウシｍｅｔＭｂ又はウシｍｅｔＨｂを使用した以外は、実施例２と同様の方法でそれぞれのｐＫａ値を求めた。ウシｍｅｔＭｂのｐＫａ値は９．０２、ウシｍｅｔＨｂのｐＫａ値は８．２２であった。
【0061】
（５）Ａｂｓ（ＭＡＸ）、Ａｂｓ（ＭＩＮ）の決定
ウシｍｅｔＭｂ、ウシｍｅｔＨｂのｐＨ４～１２の１ｍｇ／ｍＬ溶液をそれぞれ調製した。ウシｍｅｔＭｂについては、６１７ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）とした。一方、ウシｍｅｔＨｂについては、６２６ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）とした。各値は、表１に示す通りとなった。
ウシｍｅｔＭｂ、ウシｍｅｔＨｂのｐＨ４～１２の１ｍｇ／ｍＬ溶液をそれぞれ調製した。ウシｍｅｔＭｂについては、６１７ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）とした。一方、ウシｍｅｔＨｂについては、６２６ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）とした。各値は、表１に示す通りとなった。
【0062】
【表1】
【0063】
（６）牛肉中のヘム色素の測定
牛肉を３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水３重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、１５分間遠心分離し、上清を得た。ろ紙（ＡＤＡＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．１）でろ過し、脂を除去し、ろ液を得た（ヘム色素抽出液）。ろ液を３ｍＬ×２本に分注し、１本に蒸留水、もう１本に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍＬ加えて混合した。両方に１０ｍｇ亜硝酸ナトリウムを添加して混合した。０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）にろ液を通過させ、得られた各ろ液のｐＨ及び６１７ｎｍ、６２６ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は、ろ液を１０ｍｍ光路長の石英セルに入れ、紫外可視分光光度計（ＵＶ－２７００、島津製作所）を用いて測定した。測定は光路長１０ｍｍの石英ガラスセルを用い、常温で実施した。
牛肉を３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水３重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、１５分間遠心分離し、上清を得た。ろ紙（ＡＤＡＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．１）でろ過し、脂を除去し、ろ液を得た（ヘム色素抽出液）。ろ液を３ｍＬ×２本に分注し、１本に蒸留水、もう１本に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍＬ加えて混合した。両方に１０ｍｇ亜硝酸ナトリウムを添加して混合した。０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）にろ液を通過させ、得られた各ろ液のｐＨ及び６１７ｎｍ、６２６ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は、ろ液を１０ｍｍ光路長の石英セルに入れ、紫外可視分光光度計（ＵＶ－２７００、島津製作所）を用いて測定した。測定は光路長１０ｍｍの石英ガラスセルを用い、常温で実施した。
【0064】
測定したｐＨ及び吸光度を、下記式（ＸＶ）、（ＸＶＩ）にそれぞれに代入して各ろ液中のＭｂ濃度、Ｈｂ濃度を算出した。
（式中、Ａ６１７ａはＭｂ第１吸光度、Ａ６１７ｂはＭｂ第２吸光度、ｐＨａは酸性側のｐＨ、ｐＨｂはアルカリ性側のｐＨを示す。）
（式中、Ａ６２６ａはＨｂ第１吸光度、Ａ６２６ｂはＨｂ第２吸光度、ｐＨａは酸性側のｐＨ、ｐＨｂはアルカリ性側のｐＨを示す。）
Ｍｂ濃度及びＨｂ濃度を、後段の比較例１、２の結果と共に図４に示す。
【数15】
【数16】
Ｍｂ濃度及びＨｂ濃度を、後段の比較例１、２の結果と共に図４に示す。
【0065】
＜比較例１：牛肉のヘム色素の測定（Ｍｂ当量）＞
実施例３（６）と同様の方法で、牛肉からヘム色素抽出液を得た。ヘム色素が全てＭｂであると仮定して、抽出液中の５２５ｎｍの吸光度を測定した、濃度既知のＭｂを含む複数の溶液について、５２５ｎｍの吸光度を測定し、検量線を作成した後、抽出液中のＭｂ濃度を算出した。ここでは、ＭｂとＨｂを分けて測定することはできず、ヘム色素のＭｂ当量として算出することができる。図４に、ヘム色素量（Ｍｂ当量）を、実施例３及び後段の比較例２の結果と共に示す。
実施例３（６）と同様の方法で、牛肉からヘム色素抽出液を得た。ヘム色素が全てＭｂであると仮定して、抽出液中の５２５ｎｍの吸光度を測定した、濃度既知のＭｂを含む複数の溶液について、５２５ｎｍの吸光度を測定し、検量線を作成した後、抽出液中のＭｂ濃度を算出した。ここでは、ＭｂとＨｂを分けて測定することはできず、ヘム色素のＭｂ当量として算出することができる。図４に、ヘム色素量（Ｍｂ当量）を、実施例３及び後段の比較例２の結果と共に示す。
【0066】
＜比較例２：牛肉のヘム色素の測定（一酸化炭素法）＞
非特許文献２の記載に準拠した方法を用いて、牛肉のヘム色素を測定した。実施例３（６）と同様の方法で、牛肉からヘム色素抽出液を得た。ヘム色素抽出液３ｍＬを水３ｍＬで希釈し、１０ｍｇのハイドロサルファイトＮａ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を加えてボルテックスミキサーで撹拌した。攪拌後のろ液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）でろ過した後、吸光度を計測した。
非特許文献２の記載に準拠した方法を用いて、牛肉のヘム色素を測定した。実施例３（６）と同様の方法で、牛肉からヘム色素抽出液を得た。ヘム色素抽出液３ｍＬを水３ｍＬで希釈し、１０ｍｇのハイドロサルファイトＮａ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を加えてボルテックスミキサーで撹拌した。攪拌後のろ液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）でろ過した後、吸光度を計測した。
【0067】
三角フラスコに注いだ濃硫酸１５ｍＬに対しギ酸５ｍＬを滴下して、一酸化炭素（ＣＯ）の気泡を生じさせた。この気体を局所排気装置内で水上置換によってガス収集袋に捕集した。ヘム色素抽出液あるいはヘム色素溶液を還元した後、ＣＯガス約１０ｍＬを通気し密栓して転倒混和後５分間静置した。
【0068】
各種濃度に希釈したヘム色素溶液を同様にＣＯ処理した後、分光光度計で３５０～７５０ｎｍの吸光スペクトルを測定し各波長における吸光度と測定溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）から濃度あたりの吸光係数を得た。測定は光路長１０ｍｍの石英ガラスセルを用い、常温で実施した。ヘム色素抽出液の吸光スペクトルと上記各波長の吸光係数から、Ｍｂ濃度、量、Ｈｂ濃度、シトクロムｃ濃度を算出した。図４に、Ｍｂ濃度、量、Ｈｂ濃度及びシトクロムｃ濃度を、実施例３、比較例１の結果と共に示す。
【0069】
図４に示す通り、実施例３で測定したヘム色素（Ｍｂ＋Ｈｂ）量は、従来法であるヘム色素のＭｂ当量、一酸化炭素法で測定したヘム色素量と比較して大差はなかった。実施例３の方法は、牛肉中のヘム色素を測定可能であることが実証できた。
【0070】
＜実施例４：豚肉のヘム色素測定＞
（１）ブタＭｂの調製
豚肉（豚ウデ肉）を３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水１重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、２０分間遠心分離し、上清を得た。上清を飽和度６０～９０％で硫安分画して得られたペレットを疎水性クロマトグラフィーの検体とした。ＦＰＬＣを用いて、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ ５ｍＬカラムで、４０％硫安飽和度で溶出する画分をＭｂとして採取した。
（１）ブタＭｂの調製
豚肉（豚ウデ肉）を３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水１重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、２０分間遠心分離し、上清を得た。上清を飽和度６０～９０％で硫安分画して得られたペレットを疎水性クロマトグラフィーの検体とした。ＦＰＬＣを用いて、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ ５ｍＬカラムで、４０％硫安飽和度で溶出する画分をＭｂとして採取した。
【0071】
（２）ブタＨｂの調製
ブタ血液に対して３倍容量の蒸留水を加えて攪拌し、１８０００×ｇ、１℃で、２０分間遠心分離し、上清を得、これをヘモグロビンとして使用した。
ブタ血液に対して３倍容量の蒸留水を加えて攪拌し、１８０００×ｇ、１℃で、２０分間遠心分離し、上清を得、これをヘモグロビンとして使用した。
【0072】
（３）ブタｍｅｔＨｂ及びブタｍｅｔＭｂの等吸収率点の決定
実施例３（３）に記載補の方法と同様にして、ブタｍｅｔＨｂ及びブタｍｅｔＭｂの等吸収率点を決定した。その結果、ブタｍｅｔＨｂの等吸収率点が、４９９ｎｍ、５２３ｎｍ及び６１７ｎｍ、ブタｍｅｔＭｂの等吸収率点が４９４ｎｍ、５２２ｎｍ及び６２６ｎｍであることが確認できた。
実施例３（３）に記載補の方法と同様にして、ブタｍｅｔＨｂ及びブタｍｅｔＭｂの等吸収率点を決定した。その結果、ブタｍｅｔＨｂの等吸収率点が、４９９ｎｍ、５２３ｎｍ及び６１７ｎｍ、ブタｍｅｔＭｂの等吸収率点が４９４ｎｍ、５２２ｎｍ及び６２６ｎｍであることが確認できた。
【0073】
（４）ブタｍｅｔＭｂ及びブタｍｅｔＨｂのｐＫａの決定
ウマｍｅｔＭｂに代えてブタｍｅｔＭｂ又はブタｍｅｔＨｂを使用した以外は、実施例２と同様の方法でそれぞれのｐＫａ値を求めた。ブタｍｅｔＭｂのｐＫａ値は８．７６、ウシｍｅｔＨｂのｐＫａ値は８．３１であった。
ウマｍｅｔＭｂに代えてブタｍｅｔＭｂ又はブタｍｅｔＨｂを使用した以外は、実施例２と同様の方法でそれぞれのｐＫａ値を求めた。ブタｍｅｔＭｂのｐＫａ値は８．７６、ウシｍｅｔＨｂのｐＫａ値は８．３１であった。
【0074】
（５）Ａｂｓ（ＭＡＸ）、Ａｂｓ（ＭＩＮ）の決定
ブタｍｅｔＭｂ、ブタｍｅｔＨｂのｐＨ４～１２の１ｍｇ／ｍＬ溶液をそれぞれ調製した。ブタｍｅｔＭｂについては、６１７ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）とした。一方、ブタｍｅｔＨｂについては、６２６ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）とした。各値は、表２に示す通りとなった。
ブタｍｅｔＭｂ、ブタｍｅｔＨｂのｐＨ４～１２の１ｍｇ／ｍＬ溶液をそれぞれ調製した。ブタｍｅｔＭｂについては、６１７ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）とした。一方、ブタｍｅｔＨｂについては、６２６ｎｍの吸光度を測定し、最も高い吸光度をＡｂｓ（ＭＩＮ）、最も低い吸光度をＡｂｓ（ＭＡＸ）とした。各値は、表２に示す通りとなった。
【0075】
【表2】
【0076】
（６）豚肉中のヘム色素の測定
豚肉３検体（検体Ａ～Ｃ）をそれぞれ３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水３重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、１５分間遠心分離し、上清を得た。ろ紙（ＡＤＡＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．１）でろ過し、脂を除去し、ろ液を得た（ヘム色素抽出液）。ろ液を３ｍＬ×２本に分注し、１本に蒸留水、もう１本に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍＬ加えて混合した。両方に１０ｍｇ亜硝酸ナトリウムを添加して混合した。０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）にろ液を通過させ、得られた各ろ液のｐＨ及び６１７ｎｍ、６２６ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は、ろ液を１０ｍｍ光路長の石英セルに入れ、分光光度計（ＵＶ－２７００、島津製作所）を用いて測定した。測定は光路長１０ｍｍの石英ガラスセルを用い、常温で実施した。
豚肉３検体（検体Ａ～Ｃ）をそれぞれ３ｍｍでミンチ後、肉１重量部に対して蒸留水３重量部を加え、ＡＣＥホモジナイザーを用いて１００００ｒｐｍで１分間ホモジネートした。得られたホモジネート液を１８０００×ｇ、１℃で、１５分間遠心分離し、上清を得た。ろ紙（ＡＤＡＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．１）でろ過し、脂を除去し、ろ液を得た（ヘム色素抽出液）。ろ液を３ｍＬ×２本に分注し、１本に蒸留水、もう１本に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍＬ加えて混合した。両方に１０ｍｇ亜硝酸ナトリウムを添加して混合した。０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）にろ液を通過させ、得られた各ろ液のｐＨ及び６１７ｎｍ、６２６ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は、ろ液を１０ｍｍ光路長の石英セルに入れ、分光光度計（ＵＶ－２７００、島津製作所）を用いて測定した。測定は光路長１０ｍｍの石英ガラスセルを用い、常温で実施した。
【0077】
測定したｐＨ及び吸光度を、下記式（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）にそれぞれに代入して各ろ液中のＭｂ濃度、Ｈｂ濃度を算出した。
（式中、Ａ６１７ａはＭｂ第１吸光度、Ａ６１７ｂはＭｂ第２吸光度、ｐＨａは酸性側のｐＨ、ｐＨｂはアルカリ性側のｐＨを示す。）
（式中、Ａ６２６ａはＨｂ第１吸光度、Ａ６２６ｂはＨｂ第２吸光度、ｐＨａは酸性側のｐＨ、ｐＨｂはアルカリ性側のｐＨを示す。）
Ｍｂ濃度及びＨｂ濃度を、後段の比較例３の結果と共に図５に示す。
【数17】
【数18】
Ｍｂ濃度及びＨｂ濃度を、後段の比較例３の結果と共に図５に示す。
【0078】
＜比較例３：豚肉のヘム色素の測定（一酸化炭素法）＞
非特許文献２の記載に準拠した方法を用いて、牛肉のヘム色素を測定した。実施例４（６）と同様の方法で、豚肉からヘム色素抽出液を得た。ヘム色素抽出液３ｍＬを水３ｍＬで希釈し、１０ｍｇのハイドロサルファイトＮａ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を加えてボルテックスミキサーで撹拌した。攪拌後のろ液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）でろ過した後、吸光度を計測した。
非特許文献２の記載に準拠した方法を用いて、牛肉のヘム色素を測定した。実施例４（６）と同様の方法で、豚肉からヘム色素抽出液を得た。ヘム色素抽出液３ｍＬを水３ｍＬで希釈し、１０ｍｇのハイドロサルファイトＮａ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を加えてボルテックスミキサーで撹拌した。攪拌後のろ液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＮ、東洋ろ紙）でろ過した後、吸光度を計測した。
【0079】
三角フラスコに注いだ濃硫酸１５ｍＬに対しギ酸５ｍＬを滴下して、一酸化炭素（ＣＯ）の気泡が生じさせた。この気体を局所排気装置内で水上置換によってガス収集袋に捕集した。ヘム色素抽出液あるいはヘム色素溶液を還元した後、ＣＯガス約１０ｍＬを通気し密栓して転倒混和後５分間静置した。
【0080】
各種濃度に希釈したヘム色素溶液を同様にＣＯ処理した後、分光光度計で３５０～７５０ｎｍの吸光スペクトルを測定し各波長における吸光度と測定溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）から濃度あたりの吸光係数を得た。測定は光路長１０ｍｍの石英ガラスセルを用い、常温で実施した。ヘム色素抽出液の吸光スペクトルと上記各波長の吸光係数から、Ｍｂ濃度、量及びＨｂ濃度を算出した。図５に、Ｍｂ濃度及びＨｂ濃度を、実施例４の結果と共に示す。
【0081】
図５に示す通り、実施例４で測定したヘム色素（Ｍｂ＋Ｈｂ）量は、従来法である一酸化炭素法で測定したヘム色素（Ｍｂ＋Ｈｂ）量とほぼ同等の値が得られることが示された。実施例４の方法は、豚肉中のヘム色素を測定可能であることが実証できた。
【要約】
【課題】特殊な設備を用いることなく、従来よりも簡便に食肉中のヘム色素を測定する方法を提供する。
【解決手段】食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得て、酸化後の抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整し、前記抽出液を酸化し、所定波長における前記第1抽出液の吸光度である第１吸光度、及び第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する。測定した第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のミオグロビン濃度及びヘモグロビン濃度を算出することで、食肉中のヘム色素を測定する。
【選択図】なし
【解決手段】食肉からヘム色素を抽出して抽出液を得て、酸化後の抽出液を分注して第１抽出液及び第２抽出液として、前記第１抽出液のｐＨを５．０～７．５に、前記第２抽出液のｐＨを８．０～１０．０に調整し、前記抽出液を酸化し、所定波長における前記第1抽出液の吸光度である第１吸光度、及び第２抽出液の吸光度である第２吸光度を測定する。測定した第１吸光度と第２吸光度の差から、食肉中のミオグロビン濃度及びヘモグロビン濃度を算出することで、食肉中のヘム色素を測定する。
【選択図】なし
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】