特許 7628998 乾癬を治療するための製剤として又はその製剤の調製におけるＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-03

(45)【発行日】2025-02-12

(54)【発明の名称】乾癬を治療するための製剤として又はその製剤の調製におけるＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/403 20060101AFI20250204BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20250204BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250204BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20250204BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20250204BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20250204BHJP

【ＦＩ】

A61K31/403

A61P17/06

A61P43/00 111

A61K9/06

A61K9/14

A61K9/08

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2022204249

(22)【出願日】2022-12-21

(65)【公開番号】P2024049277

(43)【公開日】2024-04-09

【審査請求日】2022-12-21

(31)【優先権主張番号】202211189318.X

(32)【優先日】2022-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】521557687

【氏名又は名称】孫 良丹

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮ Ｌｉａｎｇｄａｎ

【住所又は居所原語表記】２１８ Ｊｉｘｉ Ｒｏａｄ， Ｓｈｕｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈｅｆｅｉ Ｃｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ２３００２２， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】孫 良丹

(72)【発明者】

【氏名】陳 微微

(72)【発明者】

【氏名】甄 ▲ち▼

(72)【発明者】

【氏名】李 卓

(72)【発明者】

【氏名】王 義睿

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０２２／０２８０５２６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２１／０７３５３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表平１０－５０４３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Molecular Medicine Reports，2013年，Vol.8，pp.434-438

【文献】Expert Opinion on Investigational Drugs，2016年，Vol.25, No.4，pp.455-462

【文献】Journal of Molecular Graphics and Modelling，2012年，Vol.32，pp.39-48

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乾癬を治療するための製剤の調製におけるＶＥＧＦＲ阻害剤の使用であって、前記ＶＥＧＦＲ阻害剤は、ＳＵ５２０５であり、
前記製剤は塗布によりＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ細胞及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞を低下させることを特徴とする使用。

【請求項2】

前記製剤は化学製剤又は生物学的製剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記製剤はペースト剤、粉剤又は水剤を含むことを特徴とする請求項２に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚疾患用医薬の技術分野に属し、具体的には、乾癬を治療するための製剤として又はその製剤の調製におけるＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

乾癬は、慢性免疫炎症性の皮膚病であり、表皮角質形成細胞の過増殖と異常分化、リンパ球（ほとんどはＴ細胞）の浸潤、血管新生、拡張、蛇行、高内皮細静脈の形成などの真皮血管の変化が特徴であり、臨床で最もよく見られるのは尋常乾癬である。乾癬の病因は広く、発病は複雑で、免疫経路は乾癬の発病機序で重要な役割を果たし、乾癬の発病はＴ細胞の異常活性化が媒介する慢性炎症と密接に関連している。研究によれば、乾癬は、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、インターロイキンＩＬ－１７Ａやインターフェロンγなど、炎症誘発性サイトカインの分泌に関連するＴ細胞の活性化によって駆動される。Ｔ細胞の存在と蓄積は乾癬プラークの進化過程における初期イベントの１つであり、Ｔ細胞の異常活性化は皮膚免疫と全身サイトカインの産生に影響し、それによって、より多くの炎症細胞の動員を刺激し、乾癬特有の表皮の変化を引き起こす。

【0003】

現在、ＩＬ１７Ａ／Ｆを標的とする生物学的製剤の臨床使用は、乾癬に対して比較的良好な治療効果を示しているが、関連する生物学的製剤は価格が高く、しかも、後期に継続的に使用する必要があり、治療費が高く、根絶することもできない。

【0004】

そのため、乾癬の治療に安全で効果的な製剤が必要である。

【発明の概要】

【0005】

上記の課題に対して、本発明の目的の１つは、乾癬を治療するための製剤として又はその製剤の調製におけるＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤の使用を提供することである。具体的には、本発明では、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害することにより、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を効果的に阻害し、乾癬を効果的に治療することができる。なお、本発明では、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤は、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害することにより乾癬の表現型を軽減又は除去する機序に基づいて、当該技術分野においてＶＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害することができる既知のすべての試薬である。

【0006】

本発明の別の目的は、乾癬を治療するための製剤として又はその製剤の調製におけるＲａｓｇｒｐ１遺伝子発現阻害剤の使用を提供することである。具体的には、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子を阻害することにより、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を効果的に阻害し、乾癬を効果的に治療することができる。同様に、上記したように、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子発現を阻害することにより、乾癬の表現型を軽減又は除去することができるという機序に基づいている。

【0007】

さらに、上記の使用において、製剤は、化学製剤又は生物学的製剤を含む。例えば、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤は、ＶＥＧＦＲ低分子阻害剤のような化学製剤であってもよいし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ試薬、ＴＡＬＥＮ試薬やＺＦＮ試薬など、ＶＥＧＦＲ遺伝子をノックダウン又はノックアウトする遺伝子編集試薬であってもよく、同様に、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子発現阻害剤は、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子発現を阻害する低分子化学製剤であってもよいし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ試薬、ＴＡＬＥＮ試薬やＺＦＮ試薬など、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンするための試薬であってもよい。

【0008】

さらに、上記の使用において、製剤はペースト剤、粉剤又は水剤を含む。なお、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤やＲａｓｇｒｐ１遺伝子発現阻害剤は、補助剤を添加して臨床使用に適した各種剤型とすることができ、また、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現阻害剤やＲａｓｇｒｐ１遺伝子発現阻害剤は、乾癬を治療する他の試薬と併用して乾癬を共同治療することも可能である。

【0009】

本発明の更なる目的は、ＶＥＧＦ遺伝子発現阻害におけるＮＢＵＶＢ照射の使用を提供することである。

【0010】

本発明の更なる目的は、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子発現阻害におけるＮＢＵＶＢ照射の使用を提供することである。

【0011】

本発明の更なる目的は、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生の阻害におけるＮＢＵＶＢ照射の使用を提供することである。

【0012】

なお、ＮＢＵＶＢ照射は、生体のＶＥＧＦ遺伝子発現を阻害することによって、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子発現を阻害することができ、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子発現を阻害することは下流のＴ細胞が分泌するＩＬ－１７を効果的に阻害することができ、それによって、乾癬を効果的に治療し、乾癬に対する正確な治療の目的を達成する。また、本発明では、構築に成功したＮＢＵＶＢ治療乾癬マウスモデルを用いて、ＲＮＡ－Ｓｅｑパスウェイエンリッチメント解析を行った結果、ＮＢＵＶＢはＲＡＳ経路を有意に阻害できることを発見し、ＮＢＵＶＢによる乾癬治療の病理機序を多様化するのに役立ち、乾癬の遺伝子診断、標的治療及び新薬の研究開発に理論的な基礎を提供する。

【0013】

本発明の更なる目的は、ＮＢＵＶＢを照射すること、ＶＥＧＦ遺伝子をノックアウト又はノックダウンすること、又は、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることを含むことを特徴とするＴ細胞によるＩＬ－１７産生の阻害方法を提供することである。具体的には、上記したように、本発明では、ＮＢＵＶＢ照射によりＴ細胞によるＩＬ－１７産生を効果的に阻害してもよく、ＶＥＧＦ遺伝子発現を阻害することによりＴ細胞によるＩＬ－１７産生を阻害してもよく、Ｒａｓｇｒｐ１遺伝子を阻害することによりＴ細胞によるＩＬ－１７産生を阻害してもよい。

【0014】

また、乾癬は複雑な疾患であり、単一の要素が影響するのではなく、疾患の内在的な発生と制御の機序及び各種の影響要素の疾患における重みを探すのは将来疾患のターゲットを効率的に特定するための基礎と前提条件である。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は重要な血管新生促進因子であり、血管透過性の増加を促進し、血管新生を誘導する作用を有する。本発明において、ＮＢＵＶＢは乾癬マウスの皮膚組織におけるＶＥＧＦの発現を有意に阻害することができる。

【0015】

また、ＲａｓＧＲＰ１は、ＲＡＳグアニンヌクレオチド交換因子であり、リンパ球受容体シグナル伝達の重要な調節因子であり、また、Ｒａｓｇｒｐ１は血管内皮成長因子ＶＥＧＦの下流標的遺伝子の１つであり、Ｒａｓｇｒｐ１はＴ細胞の成長と発育に重要な作用を有し、Ｔリンパ球／Ｂリンパ球抗原受容体とＲＡＳを結合することによってＴ細胞／Ｂ細胞の発育、定常状態及び分化を調節する。Ｔ細胞の異常活性化に必要なシグナルはＴ細胞受容体ＴＣＲの認識シグナルであり、Ｔ細胞が刺激を受けてＴＣＲを活性化すると、Ｒａｓｇｒｐ１は発現量が増加し、Ｔ細胞で高発現し、ＴＣＲシグナルの活性化と伝達に対して非常に重要な作用を果たし、橋梁としてシグナルを下流に伝達してＴ細胞の増殖と活性化を促進し、活性化したＴ細胞は各種のサイトカインと炎症性媒体を分泌し、乾癬の発生と発展を媒介する。

【発明の効果】

【0016】

本発明の有益な効果は以下のとおりである。本発明では、ＮＢＵＶＢ照射により皮膚Ｔ細胞内のＲａｓｇｒｐ１の異常発現を効果的に阻害し、Ｔ細胞からのＩＬ－１７の分泌を阻害することで、乾癬の皮膚部位におけるＩＬ－１７を介した免疫反応を効果的に軽減し、乾癬を治療する効果を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの皮膚病理表現型である。

【図2】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスのＰＡＳＩスコアリングである。

【図3】遺伝子トランスクリプトームの配列決定におけるパスウェイエンリッチメントの結果、ＮＢＵＶＢ照射がＲＡＳ経路を阻害することが見出された。

【図4】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの皮膚のＲＡＳ経路のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図5】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの皮膚のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図6】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスのＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図7】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスのＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【図8】イミキモド乾癬マウスモデルの皮膚病理表現型である。

【図9】乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１発現及び局在である。

【図10】乾癬マウスの皮膚のＲＡＳ経路のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図11】乾癬マウスの皮膚のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図12】乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ、Ｒａｓｇｒｐ１＋Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、Ｒａｓｇｒｐ１＋Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図13】乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ、Ｒａｓｇｒｐ１＋Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、Ｒａｓｇｒｐ１＋Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【図14】乾癬マウスの皮膚組織のＴ細胞とＲａｓｇｒｐ１の共標識を免疫蛍光で検出したものである。

【図15】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの皮膚ＶＥＧＦｍＲＮＡリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図16】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの皮膚組織のＶＥＧＦの発現及び局在である。

【図17】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの表皮ＶＥＧＦｍＲＮＡリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図18】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの表皮ＶＥＧＦのタンパク質発現である。

【図19】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの真皮ＶＥＧＦｍＲＮＡリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図20】ＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの真皮ＶＥＧＦのタンパク質発現である。

【図21】ヒト乾癬の皮膚損傷単細胞の配列決定の結果によるＶＥＧＦＡを発現させる主な細胞群である。

【図22】ＨＡＣＡＴ細胞にＮＢＵＶＢを照射し、各照射量勾配、各照射時間勾配に細胞上清についてＶＥＧＦの濃度変化を検出したものである。

【図23】ＩＬ－１７Ａ及びＴＮＦ－αサイトカインを用いてＨＡＣＡＴ細胞を刺激し、ＮＢＵＶＢ未照射細胞とＮＢＵＶＢ照射群の細胞上清のＶＥＧＦ濃度をＥｌｉｓａで検出したものである。

【図24】ＶＥＧＦ刺激因子を皮下注射した乾癬マウスの皮膚病理表現型である。

【図25】ＶＥＧＦ刺激因子を皮下注射した乾癬マウスの皮膚のＰＡＳＩスコアリングである。

【図26】ＶＥＧＦ刺激因子を皮下注射した乾癬マウスの皮膚のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図27】ＶＥＧＦ刺激因子を皮下注射した乾癬マウスの皮膚のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図28】ＶＥＧＦ刺激因子を皮下注射した乾癬マウスの皮膚のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【図29】ＶＥＧＦＲ低分子阻害剤ＳＵ５２０５を皮膚に塗布した乾癬マウスの皮膚病理表現型である。

【図30】ＶＥＧＦＲ低分子阻害剤ＳＵ５２０５を皮膚に塗布した乾癬マウスのＰＡＳＩスコアリングである。

【図31】ＶＥＧＦＲ低分子阻害剤ＳＵ５２０５を皮膚に塗布した乾癬マウスの皮膚のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図32】ＶＥＧＦＲ低分子阻害剤ＳＵ５２０５を皮膚に塗布した乾癬マウスの皮膚のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図33】ＶＥＧＦＲ低分子阻害剤ＳＵ５２０５を皮膚に塗布した乾癬マウスの皮膚のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【図34】ＶＥＧＦサイトカイン刺激によるＲａｓｇｒｐ１を過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞のＩＬ１ｂ、ＩＬ１７のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図35】ＶＥＧＦサイトカイン刺激によるＲａｓｇｒｐ１を過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞の上清のＩＬ１ｂ、ＩＬ１７の濃度である。

【図36】ＶＥＧＦサイトカイン刺激によるＲａｓｇｒｐ１を過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図37】ＶＥＧＦサイトカイン刺激によるＲａｓｇｒｐ１をノックダウンしたＪｕｒｋａｔ細胞のＩＬ１ｂ、ＩＬ１７のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図38】ＶＥＧＦサイトカイン刺激によるＲａｓｇｒｐ１をノックダウンしたＪｕｒｋａｔ細胞上清のＩＬ１ｂ、ＩＬ１７の濃度である。

【図39】ＶＥＧＦサイトカイン刺激によるＲａｓｇｒｐ１をノックダウンしたＪｕｒｋａｔ細胞のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図40】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ随伴ウイルスを皮下注射した乾癬マウスの皮膚病理表現型である。

【図41】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ随伴ウイルスを皮下注射した乾癬マウスのＰＡＳＩスコアリングである。

【図42】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ随伴ウイルスを皮下注射した乾癬マウスの皮膚組織におけるＩＬ－１βの濃度である。

【図43】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ関連ウイルスを皮下注射した乾癬マウスの皮膚組織のＲＡＳ経路のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図44】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ随伴ウイルスを皮下注射した乾癬マウスの皮膚組織のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図45】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ関連ウイルスを皮下注射した乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図46】Ｒａｓｇｒｐ１を過剰発現させたアデノ関連ウイルスを皮下注射した乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【図47】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚病理表現型である。

【図48】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚ＰＡＳＩスコアリングである。

【図49】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織のＩＬ－１β濃度である。

【図50】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織のＲＡＳ経路のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図51】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図52】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図53】ＮＢＵＶＢ照射Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【図54】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚病理表現型である。

【図55】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚ＰＡＳＩスコアリングである。

【図56】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚組織におけるＩＬ－１βの濃度である。

【図57】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚組織のＲＡＳ経路のｍＲＮＡのリアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出結果である。

【図58】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚組織のＲＡＳ経路のタンパク質発現である。

【図59】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚組織のＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図60】Ｒａｓｇｒｐ１－／－乾癬マウスの皮膚組織のＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果のヒストグラム統計図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

例示される実施例は、本発明をより良く説明するためのものであるが、本発明の内容は例示される実施例のみに限定されるものではない。したがって、当業者が上記の発明の内容に基づいて実施態様に対して本質的でない改良及び調整を行っても、本発明の保護範囲に属する。

【0019】

本明細書で使用される用語は、特定の実施例を説明するためにのみ使用され、本開示を制限することを意図しない。単数形の表現は、文脈において明らかに異なる意味を有する場合を除き、複素形の表現を含む。本明細書で使用されるように、「含む」、「有する」、「包含」などの用語は、特徴、数字、操作、アセンブリ、部品、要素、材料、又はそれら組み合わせの存在を示すことを意図していることが理解されるべきである。本発明の用語は、本明細書において開示されており、１つ又は複数の他の特徴、数字、操作、アセンブリ、部品、要素、材料、又はそれらの組み合わせが存在する可能性、又は追加される可能性を排除することを意図していない。ここで使用する場合、「／」は、場合によっては「及び」又は「又は」と解釈することができる。

【0020】

本発明をより良く理解するために、以下、具体例を用いて本発明の内容をさらに説明するが、本発明の内容は以下の例に限定されるものではない。

【0021】

以下の実施例において、具体的に説明されていない実験操作方法は、いずれも当該分野の通常の実験操作方法である。

【0022】

実施例１ ＮＢＵＶＢ照射による乾癬マウスの皮膚組織の下流Ｒａｓ経路の活性化阻害及びマウスの表現型の軽減
本発明の実施例では、乾癬マウスにＮＢＵＶＢ照射療法を行ったところ、ＮＢＵＶＢ照射療法により乾癬マウスの皮膚の炎症反応を軽減し、ＨＥ染色により皮膚表皮の有意な薄化と炎症性細胞浸潤の減少が認められ、炎症反応の軽減が示唆された（図１）。

【0023】

さらに、マウスの皮膚についてＰＡＳＩスコアリングも行ったところ、背中の皮膚の厚さの減少、紅斑や鱗屑の軽減として認められた（図２）。

【0024】

さらに、ＲＮＡ－Ｓｅｑ配列決定パスウェイエンリッチメント解析も行い、その結果、ＮＢＵＶＢ照射後にＲＡＳ経路が有意に阻害されることを示した（図３）。

【0025】

さらに、Ｒａｓｇｒｐ１及びその下流のサイトカインであるＩＬ１ｂ、ＩＬ１７ａなどをＲＴ－ｑＰＣＲで検出した結果、ＮＢＵＶＢ照射で治療した乾癬マウスの皮膚組織におけるＲａｓｇｒｐ１及びその下流のＩＬ１ｂ、ＩＬ１７ａなどの炎症性遺伝子発現レベルはいずれも有意に低下した（図４）。

【0026】

さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、ＮＢＵＶＢ照射で治療した乾癬マウスの皮膚におけるＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルはいずれも対照群より低く、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より低かった（図５）。

【0027】

さらに、ＮＢＵＶＢ照射後の乾癬マウスの皮膚では、Ｒａｓｇｒｐ１＋Ｔ細胞及びＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞は全て有意に低下した（図６及び図７）。

【0028】

以上より、ＮＢＵＶＢはＲａｓ経路を阻害することによりＴ細胞によるＩＬ－１７産生を阻害し、乾癬様皮膚炎症を軽減することが示唆された。

【0029】

実施例２ Ｒａｓｇｒｐ１は主に皮膚Ｔ細胞に発現し、乾癬ではＲａｓ経路が活性化される
本発明の実施例では、乾癬と正常対照マウスの皮膚組織をＨＥ染色し、乾癬マウスの皮膚損傷の炎症反応を観察したところ、ＨＥ染色は皮膚毛細血管の拡張、表皮の肥厚化、皮下組織、毛包や毛幹などの皮膚付属部に炎症性細胞の浸潤を示し、炎症反応の存在を示唆した（図８）。

【0030】

さらに、乾癬におけるＲａｓｇｒｐ１の発現と局在を検出するために、免疫組織化学実験による観察では、Ｒａｓｇｒｐ１は主に免疫細胞に発現すると同時に、乾癬マウスの皮膚組織において発現が強い陽性であることが認められた（図９）。

【0031】

さらに、Ｒａｓｇｒｐ１下流のサイトカインであるＩＬ１ｂやＩＬ１７ａなどをＲＴ－ｑＰＣＲで検出した結果、乾癬マウスモデルでは、皮膚組織の炎症性因子発現レベルは正常対照群より有意に高いことが認められた（図１０）。

【0032】

さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、乾癬マウスの皮膚におけるＮＦ－κＢ及びＡＫＴの総タンパク質レベルとリン酸化活性タンパク質レベルは全て対照群より高く、乾癬マウスの皮膚におけるＩＬ－１βの活性タンパク質レベルは対照群より高かった（図１１）。

【0033】

さらに、正常対照マウスと乾癬マウスの皮膚からリンパ球を抽出し、単離されたマウス皮膚免疫細胞を特異的な標識抗体を用いてグループ分けしたところ、Ｔ細胞という細胞集団に局在化した場合、正常対照マウスと乾癬マウスの皮膚におけるＲａｓｇｒｐ１発現量に有意な差が見られたが、単球と好中球は統計学的に有意ではなかった（図１２及び図１３）。

【0034】

さらに、正常対照マウスと乾癬マウスの皮膚組織におけるＴ細胞とＲａｓｇｒｐ１の共標識を免疫蛍光で検出した結果、Ｔ細胞にＲａｓｇｒｐ１の発現が認められた（図１４）。

【0035】

実施例３ ＮＢＵＶＢ照射による、主に表皮細胞から分泌される乾癬マウスの皮膚組織のＶＥＧＦの阻害
本発明の実施例では、乾癬マウスとＮＢＵＶＢ照射乾癬マウスの背部皮膚のＶＥＧＦＡの遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲで検出した結果、ＮＢＵＶＢ照射は乾癬マウスの皮膚組織におけるＶＥＧＦ因子の発現を阻害し（図１５）、免疫組織化学の結果、ＶＥＧＦは主に皮膚の表皮細胞に発現するとともに、ＮＢＵＶＢ照射により表皮ＶＥＧＦの発現が減少し（図１６）、マウス皮膚に対して表皮と真皮の分離を行い、マウス表皮組織のＶＥＧＦ発現をＲＴ－ｑＰＣＲで検出したところ、ＮＢＵＶＢ照射によりマウス表皮組織のＶＥＧＦ遺伝子発現が阻害されたことが示された（図１７）。

【0036】

さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出の結果、ＮＢＵＶＢ照射により乾癬マウスの背部表皮組織におけるＶＥＧＦＡのタンパク質発現が阻害されたことが示された（図１８）。ＲＴ－ｑＰＣＲ検出の結果、ＮＢＵＶＢ照射はマウスの真皮組織のＶＥＧＦ遺伝子発現に影響を及ぼさないことが示され（図１９）、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出の結果、ＮＢＵＶＢ照射は乾癬マウスの背部表皮組織のＶＥＧＦＡのタンパク質発現に影響を及ぼさないことが示された（図２０）。

【0037】

さらに、ヒト乾癬皮膚損傷単細胞の配列決定の結果、ＶＥＧＦＡは主に表皮細胞から分泌され、皮膚顆粒層では、乾癬皮膚損傷組織のＶＥＧＦＡ発現量が正常組織より有意に高いことが示された（図２１）。

【0038】

さらに、ＨＡＣＡＴ細胞にＮＢＵＶＢを照射し、照射線量勾配をそれぞれ０ｍｊ／ｃｍ２、２００ｍｊ／ｃｍ２、４００ｍｊ／ｃｍ２、８００ｍｊ／ｃｍ２とし、照射時間勾配をそれぞれ照射後８ｈ、１２ｈ、２４ｈとし、細胞上清を採取してＶＥＧＦ濃度の変化を検出したところ、照射線量４００ｍｊ／ｃｍ２でＨＡＣＡＴ細胞に８ｈ照射すると、上清中のＶＥＧＦ濃度が有意に低下することが示された（図２２）。

【0039】

さらに、ＩＬ－１７Ａ及びＴＮＦ－αサイトカインを用いてＨＡＣＡＴ細胞を刺激し、また、細胞に４００ｍｊ／ｃｍ２のＮＢＵＶＢを照射し、ＮＢＵＶＢ未照射細胞とＮＢＵＶＢ照射群の細胞の上清のＶＥＧＦＡ濃度をＥｌｉｓａにより検出したところ、ＮＢＵＶＢ照射群の細胞からのＶＥＧＦＡ分泌濃度は未照射群より有意に低かった（図２３）。

【0040】

実施例４ ＶＥＧＦ皮下注射による乾癬マウスの表現型の悪化、ＶＥＧＦＲ阻害剤による乾癬マウスの表現型の軽減
本発明の実施例では、ＶＥＧＦＲ阻害剤ＳＵ５２０５をＤＭＳＯ溶液に溶解して原液を調製し、シクロデキストリンで原液を希釈し、７～８週齢の野生型マウスの背毛を剃り、露出皮膚面積を２ｃｍ×２ｃｍとし、マウス塗布濃度１０ｋｇ／ｋｇ／ｄで皮膚表面に調製したばかりのＶＥＧＦ阻害剤溶液１５０μｌを塗布し、これにより、ＶＥＧＦＲ阻害剤を塗布したマウス乾癬モデルを構築し、対照群動物は対照剤（ＤＭＳＯ＋シクロデキストリン１５０μｌ）を塗布した。塗布４ｈ後、マウスの露出皮膚にＩＭＱクリーム又は対照剤ＶＡＳを均一に塗布した。

【0041】

本発明の実施例では、ＶＥＧＦ１６５タンパク質をＤＭＳＯ溶液に溶解して原液を調製し、シクロデキストリンで原液を希釈し、７～８週齢の野生型マウスの背毛を剃り、皮膚露出面積を２ｃｍ×２ｃｍとし、マウス注射濃度１０ｋｇ／ｋｇ／ｄで調製したばかりのＶＥＧＦ１６５溶液１００μｌを皮下注射し、これにより、ＶＥＧＦ皮下注射乾癬モデルを構築し、対照群動物は対照剤（ＤＭＳＯ＋シクロデキストリン１００μｌ）を皮下注射した。塗布４ｈ後、マウスの露出皮膚にＩＭＱクリーム又は対照剤ＶＡＳを均一に塗布した。

【0042】

本発明の実施例では、上記の方法に従って、ＶＥＧＦ過剰発現に基づくＩＭＱ誘導乾癬マウスモデルが作成された。皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及びＰＡＳＩスコアリングの結果から、ＶＥＧＦ１６５皮下注射マウスの乾癬様表現型はＩＭＱ誘導対照マウスと比較して有意に悪化し、背中の皮膚の厚さの増加、紅斑や鱗屑の悪化が認められた（図２４及び図２５）。

【0043】

さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、ＶＥＧＦ過剰発現乾癬マウスの皮膚におけるＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルは全て有意に向上し、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より有意に高かった（図２６）。

【0044】

さらに、ＶＥＧＦ過剰発現乾癬マウスでは、皮膚におけるＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ細胞、ＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞は有意に増加しており（図２７及び図２８）、皮膚組織におけるＶＥＧＦの過剰発現はＲａｓｇｒｐ１及び下流の炎症性因子の分泌を活性化し、それによって、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を調節し、乾癬様皮膚炎症に影響を及ぼすことが示唆された。

【0045】

さらに、乾癬におけるＶＥＧＦの作用機序をさらに明らかにするため、マウスの皮膚にＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５２０５を塗布し、皮膚のＶＥＧＦＲを阻害する乾癬マウスモデルを作成した。皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及びＰＡＳＩスコアリングの結果、ＳＵ５２０５を塗布したマウスの乾癬様表現型はＩＭＱ誘導対照マウスと比較して有意に軽減され、背中の皮膚の厚さの減少、紅斑や鱗屑の軽減が認められた（図２９及び図３０）。

【0046】

さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、ＳＵ５２０５を塗布した乾癬マウスの皮膚中のＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルはいずれも有意に低下し、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より有意に低かった（図３１）。

【0047】

さらに、ＳＵ５２０５を塗布した乾癬マウスでは、皮膚におけるＲａｓｇｒｐ１＋Ｔ細胞、ＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞は有意に低下した（図３２及び図３３）。

【0048】

以上より、皮膚組織におけるＶＥＧＦＲの阻害はＲａｓｇｒｐ１及び下流の炎症性因子の分泌を減少させ、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を調節し、乾癬様皮膚炎症を軽減することが示唆された。

【0049】

実施例５ ＶＥＧＦによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化促進、Ｒａｓｇｒｐ１の過剰発現とノックダウンによるＲａｓ経路下流の炎症性因子の分泌変化
本発明の実施例では、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＲａｓｇｒｐ１レンチウイルスのトランスフェクションを行い、安定な過剰発現及びノックダウン細胞モデルを構築し、ＶＥＧＦサイトカインを用いてＪｕｒｋａｔ細胞を刺激し、ＶＥＧＦがＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を促進できるか否かを検出し、Ｒａｓｇｒｐ１の過剰発現及びノックダウンがＲａｓ経路下流の炎症性因子の分泌変化を引き起こすか否かを検出した。

【0050】

さらに、ＲＴ－ｑＰＣＲ実験の結果、ＶＥＧＦ刺激を受けたＪｕｒｋａｔ細胞では、Ｒａｓｇｒｐ１及びその下流の炎症性因子分泌は有意に増加し、ＶＥＧＦ刺激下では、Ｒａｓｇｒｐ１の過剰発現はＲＡＳ経路下流の炎症性因子分泌を有意に増加させることが示された（図３４）。

【0051】

さらに、Ｅｌｉｓａの結果、ＶＥＧＦ刺激を受けたＲａｓｇｒｐ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の上清におけるＩＬ－１β及びＩＬ－１７の分泌濃度は対照群と比較して有意に上昇した（図３５）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果、ＶＥＧＦの刺激によりＪｕｒｋａｔ細胞のＲａｓｇｒｐ１及びその下流経路のＮＦκｂ、ＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルは有意に向上し、ＶＥＧＦの刺激では、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現細胞のＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルは全て有意に向上し、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より有意に高かった（図３６）。

【0052】

さらに、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果、ＶＥＧＦ刺激を受けたＲａｓｇｒｐ１ノックダウンＪｕｒｋａｔ細胞では、ＩＬ１ｂ及びＩＬ１７トランスクリプトームレベルは、ノックダウンしていない細胞と比較して、有意に発現が低下していた（図３７）。

【0053】

さらに、Ｅｌｉｓａの結果、ＶＥＧＦ刺激を受けたＲａｓｇｒｐ１ノックダウン細胞の上清中のＩＬ－１β及びＩＬ－１７の分泌濃度は対照群と比較して有意に低下した（図３８）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果、ＶＥＧＦ刺激では、Ｒａｓｇｒｐ１ノックダウン細胞のＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルは有意に低下し、その中でＩＬ－１β活性タンパク質レベルも対照群より有意に低かった（図３９）。

【0054】

以上より、ＶＥＧＦはＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を促進し、Ｒａｓｇｒｐ１の過剰発現とノックダウンはＲＡＳ経路下流の炎症性因子の分泌変化を引き起こすことが示唆された。

【0055】

実施例６ 皮膚におけるＲａｓｇｒｐ１の過剰発現による乾癬マウスの皮膚表現型の悪化
本発明の実施例では、マウスにＲａｓｇｒｐ１のアデノウイルスを皮下注射することによりＲａｓｇｒｐ１アデノ随伴ウイルス皮下注射乾癬モデルを構築し、１匹当たりのウイルス量は５×１０１１ Ｖ．Ｇ．／ｍｏｕｓｅとし、ＰＢＳを用いてアデノウイルスを希釈し、マウスを、４群の対照群及び４つの時点の注射群の８群に分け、対照群はＰＢＳを注射し、注射後それぞれ７日、１４日、２１日、２８日にマウスを殺し、皮膚組織を用いて蛍光定量ｑｐｃｒ実験を行い、マウス皮膚組織のＲａｓｇｒｐ１濃度を検出した。

【0056】

本発明の実施例では、乾癬におけるＲａｓｇｒｐ１の作用機序をさらに明らかにするために、上記の方法に従って、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現に基づくＩＭＱ誘導乾癬マウスモデルを作成し、皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及びＰＡＳＩスコアリングの結果、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現マウスは、ＩＭＱ誘導野生型（ＷＴ）マウスと比較して乾癬様表現型が有意に悪化し、背中の皮膚の厚みの増加、紅斑や鱗屑の悪化として認められた（図４０及び図４１）。

【0057】

さらに、Ｅｌｉｓａの結果、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織では、ＩＬ－１β濃度が対照群と比較して有意に上昇した（図４２）。

【0058】

さらに、Ｒａｓｇｒｐ１及びその下流サイトカインをＲＴ－ｑＰＣＲで検出した結果、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織では、Ｒａｓｇｒｐ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１７ａ及び関連する炎症性遺伝子発現レベルは有意に向上した（図４３）。さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚では、ＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルは全て有意に向上し、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より有意に高かった（図４４）。

【0059】

さらに、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚では、ＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞が有意に増加した（図４５及び図４６）。

【0060】

以上より、皮膚組織におけるＲａｓｇｒｐ１の過剰発現は下流の炎症性因子の分泌を活性化し、それによって、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を調節し、乾癬様皮膚炎症に影響を及ぼすことが示唆された。

【0061】

実施例７ ＮＢＵＶＢ照射によるＲａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚表現型の軽減
本発明の実施例では、乾癬におけるＮＢＵＶＢの作用機序をさらに明らかにするために、ＮＢＵＶＢ照射治療Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスモデルを作成し、皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及びＰＡＳＩスコアリングの結果、ＮＢＵＶＢ照射治療後のＲａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスは、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスと比較して乾癬様表現型が明らかに軽減され、背中の皮膚の厚さの減少、紅斑や鱗屑の軽減として認められた（図４７及び図４８）。

【0062】

さらに、Ｅｌｉｓａの結果、ＮＢＵＶＢ照射によりＲａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織では、ＩＬ－１β濃度は対照群に比べ有意に低下した（図４９）。

【0063】

さらに、Ｒａｓｇｒｐ１及びその下流のサイトカインであるＩＬ１ｂ、ＩＬ１７ａをＲＴ－ｑＰＣＲで検出した結果、ＮＢＵＶＢ照射後のＲａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚組織では、Ｒａｓｇｒｐ１、ＩＬ１ｂ及びＩＬ１７ａの遺伝子発現レベルはいずれも有意に低下した（図５０）。

【0064】

さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、ＮＢＵＶＢ照射後のＲａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚では、ＮＦ－κＢ及びＡＫＴの総タンパク質レベル、リン酸化活性タンパク質レベルは全て明らかに低下し、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より明らかに低かった（図５１）。

【0065】

さらに、ＮＢＵＶＢ照射は、Ｒａｓｇｒｐ１過剰発現乾癬マウスの皮膚におけるＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞を有意に低下させた（図５２及び図５３）。

【0066】

以上より、ＮＢＵＶＢ照射は皮膚組織に過剰発現するＲａｓ経路を阻害し、下流の炎症性因子を阻害し、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を阻害し、乾癬様皮膚炎症を軽減することが示唆された。

【0067】

実施例８ Ｒａｓｇｒｐ１のノックアウトによる乾癬マウスの表現型の軽減
本発明の実施例では、乾癬におけるＲａｓｇｒｐ１の作用機序をさらに明らかにするために、Ｒａｓｇｒｐ１ノックアウトマウスを構築し、Ｒａｓｇｒｐ１のノックアウトが乾癬マウスの表現型に影響を及ぼすか否かを観察し、皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及びＰＡＳＩスコアリングの結果、Ｒａｓｇｒｐ１ノックアウトマウスの乾癬様表現型は、ＩＭＱ誘導野生型（ＷＴ）マウスと比較して明らかに軽減され、背中の皮膚の厚さの減少、紅斑や鱗屑の軽減として認められた（図５４及び図５５）。

【0068】

さらに、Ｅｌｉｓａの結果、Ｒａｓｇｒｐ１ノックアウト乾癬マウスの皮膚組織では、ＩＬ－１βの濃度が対照群と比較して有意に低下した（図５６）。Ｒａｓｇｒｐ１下流サイトカインをＲＴ－ｑＰＣＲで検出した結果、Ｒａｓｇｒｐ１ノックアウト乾癬マウスの皮膚組織では、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１７ａ及び関連する炎症性遺伝子発現レベルはいずれも有意に低下した（図５７）。さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてＲａｓｇｒｐ１下流経路遺伝子のタンパク質発現を検出した結果、Ｒａｓｇｒｐ１ノックアウト乾癬マウスの皮膚では、ＮＦ－κＢ及びＡＫＴのリン酸化活性タンパク質レベルは全て有意に低下し、その中でＩＬ－１βの活性タンパク質レベルも対照群より有意に低かった（図５８）。

【0069】

さらに、Ｒａｓｇｒｐ１ノックアウト乾癬マウスの皮膚では、ＩＬ－１７Ａ＋Ｔ細胞が有意に減少した（図５９及び図６０）。

【0070】

以上より、皮膚組織におけるＲａｓｇｒｐ１のノックアウトは下流の炎症性因子の分泌を阻害し、Ｔ細胞によるＩＬ－１７産生を阻害し、乾癬様皮膚炎症を軽減することが示唆された。

【0071】

なお、上記の実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためにのみ使用され、限定されるものではなく、本発明は好適な実施例を参照して詳細に説明されたが、当業者であれば、本発明の技術的解決手段は、本発明の技術的解決手段の趣旨及び範囲を逸脱することなく、修正又は同等の置換を行うことができ、これらはいずれも本発明の特許請求の範囲に含まれるものであることを理解できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】