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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-05
(45)【発行日】2025-02-14
(54)【発明の名称】マルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体
(51)【国際特許分類】
C08G 65/333 20060101AFI20250206BHJP
C08G 81/00 20060101ALI20250206BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20250206BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20250206BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20250206BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20250206BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250206BHJP
C08L 101/16 20060101ALN20250206BHJP
【ＦＩ】
C08G65/333
C08G81/00
A61K47/65
A61K38/19
A61K38/22
A61K38/43
A61K39/395 A
A61K39/395 M
C08L101/16
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2020160391
(22)【出願日】2020-09-25
(65)【公開番号】P2021055079
(43)【公開日】2021-04-08
【審査請求日】2023-08-08
(31)【優先権主張番号】P 2019176230
(32)【優先日】2019-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的バイオ医薬品創出基盤技術開発事業、「高分子ナノテクノロジーを基盤とした革新的核酸医薬シーズ送達システムの創出」産業技術力強化法第１７条の適用を受ける出願
(73)【特許権者】
【識別番号】000004341
【氏名又は名称】日油株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京科学大学
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】吉岡 宏樹
(72)【発明者】
【氏名】羽村 健
(72)【発明者】
【氏名】大坂間 順規
(72)【発明者】
【氏名】西山 伸宏
【審査官】中落 臣諭
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１４２８８６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２２９５２８（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｇ６５／００－６７／０４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下式（１）：【化1】
【請求項2】
Ｗ１及びＷ２のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである請求項１記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項3】
下式（２）：【化2】
【請求項4】
Ｗ３及びＷ４のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである請求項３記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項5】
下式（３）：【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【請求項6】
Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項５記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項7】
Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである請求項５または６記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項8】
総分子量が２０，０００以上である請求項１～７のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項9】
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基よりなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項10】
下式（８）：【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【請求項11】
Ｌ１１及びＬ１２がそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び基を含んでいてもよいアルキレン基である請求項１０記載の生体関連物質。
【請求項12】
Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、請求項１０または１１記載の生体関連物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体関連物質を修飾する用途に使用される細胞内で分解するマルチアーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体に関する発明である。
【背景技術】
【0002】
ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体関連物質を糖鎖やポリエチレングリコールなどの親水性高分子やアルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
【0003】
ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合で形成される水和層で覆われ、分子サイズが大きくなることから、腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや各組織を構成する細胞表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。ポリエチレングリコールは生体関連物質の血中半減期を延長させる優れた素材であり、その性能は分子量が大きいほど効果が高いことが分っている。これまで、分子量４万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれており、有意にその血中半減期を延長できる結果が得られている。
【0004】
ポリエチレングリコールは生体関連物質の性能改善に用いられる修飾剤の中で至適基準とされており、現在ではポリエチレングリコール修飾製剤が複数上市され、医療現場で使用されている。一方で、2012年に欧州医薬品庁(EMA)から、分子量４万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質を一定の投与量以上で長期間動物に投与すると、一部の組織の細胞内に空胞が発生するとの現象が報告された(非特許文献１)。現時点において、空胞の発生自体が人体に悪影響を与えるとの報告はなく、また、先のEMAの報告において用いられた投与量は、医療現場において一般的に適用される投与量と比べて極めて高用量であること等を考慮すれば、現在製造販売されている分子量が４万以上のポリエチレングリコールで修飾された治療製剤の安全性は問題ないといえる。しかしながら、非常に特殊な疾患（例えば、小人症など）の治療においては、ポリエチレングリコール修飾製剤を高用量、且つ、長期間に患者へ投与する治療プロトコルが採用されることも想定され得る。従って、かかる特殊な状況においても適用可能な、細胞に空胞を発生させないポリエチレングリコール修飾製剤の開発には潜在的な需要があると予想される。
【0005】
非特許文献２においては、通常のポリエチレングリコール修飾製剤の投与量に比べ、大過剰量のポリエチレングリコールを単独で動物に長期間投与したところ、分子量２万では空胞は見られず、分子量４万において空胞の発生が確認されている。空胞を抑制する手段の一つとして、ポリエチレングリコールの分子量を小さくすることが考えられるが、分子量を小さくすると生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないという問題が生じる。
【0006】
高分子量のポリエチレングリコールを体内で低分子量のポリエチレングリコールに分解し、腎臓からの排出を促進する技術については報告例がある。特許文献１には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
【0007】
特許文献２には、生体内の低pH環境下において加水分解可能なアセタール部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的に腎臓からの排出が促進されたというデータは無く、さらに細胞の空胞に関する記載もない。また、これら加水分解が可能なアセタール部位は血中でも徐々に分解することが知られており、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないと予想される。
【0008】
一方で、薬物を効果的にリリースするために分解性のオリゴペプチドを導入したポリエチレングリコール誘導体や体内で分解するハイドロゲルなどの報告例はある。
【0009】
非特許文献３には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは抗癌剤とポリエチレングリコールの間のリンカーとして導入されており、腫瘍周辺に特異的に発現している酵素によってオリゴペプチドが分解し、効率よく抗癌剤をリリースすることが報告されている。目的は抗癌剤のリリースであり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
【0010】
非特許文献４には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有した架橋分子と多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルに関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を繋ぎ合わせる架橋分子として用いられ、さらに酵素による分解性をハイドロゲルに付与することができる。目的は分解性のハイドロゲルの調製であり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
【0011】
特許文献３には、オリゴペプチドを骨格とした分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドはポリエチレングリコール誘導体の基本骨格として用いられており、酵素による分解性を付与するものではない。また、オリゴペプチドにリジンやアスパラギン酸など、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を有したアミノ酸を含むことが特徴であり、それらを反応に利用した分岐型のポリエチレングリコール誘導体を合成することが目的である。細胞の空胞を抑制する目的のポリエチレングリコール誘導体ではない。
【0012】
さらに生体関連物質を修飾する用途に用いられるポリエチレングリコール誘導体においては、マルチアーム型があり、非特許文献５と非特許文献６に記載があるように、マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体の1分子中に複数の生体関連物質を結合させるこ
とができ、有意に生体関連物質の溶解性の改善や血中半減期を延長させるとの記載がある。マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体は、多くの薬物を搭載できるため薬物の活性を高めることができることが知られており、多くの研究に用いられているが、これまで細胞の空胞を抑制するマルチアーム型のポリエチレングリコール誘導体に関する報告はない。
とができ、有意に生体関連物質の溶解性の改善や血中半減期を延長させるとの記載がある。マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体は、多くの薬物を搭載できるため薬物の活性を高めることができることが知られており、多くの研究に用いられているが、これまで細胞の空胞を抑制するマルチアーム型のポリエチレングリコール誘導体に関する報告はない。
【0013】
以上のように、血中では安定で、修飾した生体関連物質の血中半減期を改善し、細胞に取り込まれた際に細胞内で特異的に分解して、細胞の空胞の発生を抑制することができる多官能のマルチアーム型の高分子量ポリエチレングリコール誘導体が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【文献】特表２００９－５２７５８１号公報
【文献】ＷＯ２００５／１０８４６３
【文献】ＷＯ２００６／０８８２４８
【非特許文献】
【0015】
【文献】EMA/CHMP/SWP/647258/2012
【文献】Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970－983(2013)
【文献】Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775－784(2005)
【文献】Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445－454(2010)
【文献】Lin Dai, et al., Scientific Reports, 29 July (2014)
【文献】M. Eugenia Giorgi, et al., Glycobiology, 22(10), 1363－1373(2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明の課題は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のマルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体を提供することにある。より具体的には、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解されるマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体を、工業的に生産可能な製法にて提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞内にて分解するオリゴペプチドを有したマルチアーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を発明した。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］下式（１）：
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］下式（１）：
【0018】
【化1】
【0019】
（式中、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立して２～４７残基のオリゴペプチドであり、a１及びa２はそれぞれ独立して１～８であり、Ｑは２～１２の炭素原子を有した酸素原子及び／又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［２］Ｗ１及びＷ２のオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［１］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［３］Ｗ１及びＷ２のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである［１］～［２］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［４］下式（２）：
［２］Ｗ１及びＷ２のオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［１］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［３］Ｗ１及びＷ２のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである［１］～［２］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［４］下式（２）：
【0020】
【化2】
【0021】
（式中、ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立して１１０～９５０であり、Ｗ３及びＷ４はそれぞれ独立して２～５残基のオリゴペプチドであり、Ｑは２～１２の炭素原子を有した酸素原子及び／又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［５］Ｗ３及びＷ４のオリゴペプチドが、中性アミノ酸のみで構成され、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［４］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［６］Ｗ３及びＷ４のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［４］～［５］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［７］下式（３）：
［５］Ｗ３及びＷ４のオリゴペプチドが、中性アミノ酸のみで構成され、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［４］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［６］Ｗ３及びＷ４のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［４］～［５］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［７］下式（３）：
【0022】
【化3】
【0023】
（式中、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｗ５及びＷ６はそれぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の５～４７残基のオリゴペプチドであり、ｂ１及びｂ２はそれぞれ独立して２～８であり、Ｑは２～１２の炭素原子を有した酸素原子及び／又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［８］Ｗ５及びＷ６のグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のｖ１またはｖ２またはｖ３の構造を有するオリゴペプチドである［７］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［８］Ｗ５及びＷ６のグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のｖ１またはｖ２またはｖ３の構造を有するオリゴペプチドである［７］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【0024】
【化4】
【0025】
【化5】
【0026】
【化6】
【0027】
（式中、Ｇｌｕはグルタミン酸の残基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基の分解性オリゴペプチドである。）
［９］Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［８］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１０］Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［７］～［９］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１１］総分子量が２０，０００以上である［１］～［１０］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１２］Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基よりなる群から選択される、［１］～［１１］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１３］下式（４）：
［９］Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［８］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１０］Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［７］～［９］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１１］総分子量が２０，０００以上である［１］～［１０］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１２］Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基よりなる群から選択される、［１］～［１１］のいずれか１項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［１３］下式（４）：
【0028】
【化7】
【0029】
（式中、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立して２～４７残基のオリゴペプチドであり、a１及びa２はそれぞれ独立して１～８であり、Ｑは２～１２の炭素原子を有した酸素原子、窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、Ｄ１及びＤ２はそれぞれ独立して生体関連物質であり、Ｌ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６及びＬ１１及びＬ１２はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［１４］Ｌ１１及びＬ１２がそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び基を含んでいてもよいアルキレン基である［１３］記載の生体関連物質。
［１５］Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［１３］～［１４］のいずれか１項記載の生体関連物質。
［１４］Ｌ１１及びＬ１２がそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び基を含んでいてもよいアルキレン基である［１３］記載の生体関連物質。
［１５］Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［１３］～［１４］のいずれか１項記載の生体関連物質。
【発明の効果】
【0030】
本発明のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体は、生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドを構造内に有している。そのため、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができる。さらに、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内に取り込まれた場合、オリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。また、当該ポリエチレングリコール誘導体は官能基を複数有することから1分子中に複数の生体関連物質を導入することができ、その薬理活性を増強させることができる特徴を有する。また、オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸としてグリシンを用いることで、製造工程中で発生する不純物を低減させることができ、それにより、本発明のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体を工業的に製造することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0031】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式（１）で示される。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式（１）で示される。
【0032】
【化8】
【0033】
（式中、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立して２～４７残基のオリゴペプチドであり、a１及びa２はそれぞれ独立して１～８であり、Ｑは２～１２の炭素原子を有した酸素原子、窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）
【0034】
本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは２０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は２０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
【0035】
式（１）中のｎ１及びｎ２は、それぞれポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常はそれぞれ独立して４５～９５０であり、好ましくはそれぞれ独立して１１０～６９０であり、更に好ましくはそれぞれ独立して２２０～４６０である。
【0036】
式（１）中のa１及びa２は、それぞれＷ１及びＷ２で示されるオリゴペプチドと結合しているポリエチレングリコール鎖の本数であり、通常はそれぞれ独立して１～８であり、好ましくはそれぞれ独立して１または２または４または８であり、更に好ましくはそれぞれ独立して１または２または４である。
【0037】
式（１）中のＷ１及びＷ２は、それぞれ独立して２～４７残基、好ましくは２～２３残基、より好ましくは２～１９残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、分解性ペプチドとイオン性アミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン)または分岐骨格を有するデンドリマー様のオリゴペプチドを組み合わせることが好ましい。オリゴペプチドにポリエチレングリコール鎖を導入する際に、オリゴペプチドを構成するアミノ酸由来のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基などが混在すると、反応を制御できないため、アミノ基またはカルボキシル基のどちらかを保護でき、かつシステイン、セリンを有さないオリゴペプチドを用いることが好ましい。
【0038】
式（１）中のＱは、２～１２、好ましくは２～８、より好ましくは２～４の炭素原子を有した酸素原子及び／又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であれば特に制限はないが、好ましくはエーテル結合を含んでも良いアルキレン基であり、アルキレン基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基が好ましく、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基がさらに好ましい。
【0039】
Ｑの特に好ましい態様は、下記の群（Ｉ）に示されるものである。
【0040】
群（Ｉ）：
【0041】
【化9】
【0042】
（ｑ１）～（ｑ３）において、式中のｆは２～１２の整数を示し、好ましくは２～８の整数を示し、更に好ましくは２～４の整数を示す。また、（ｑ２）～（ｑ３）において、式中のｆは同一でも、異なっていてもよい。
【0043】
式（１）中のＬ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は、それぞれ独立して、２価のスペーサーであり、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無い。
Ｌ１及びＬ２は、ポリエチレングリコール鎖と官能基をつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び／または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
Ｌ３及びＬ４は、ポリエチレングリコール鎖とオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくはアルキレン基；またはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、もしくはウレア結合から選択される少なくとも一つの結合及び／または基を含むアルキレン基である。Ｌ３及びＬ４は、ポリエチレングリコールの繰り返しユニットに炭素原子で結合しているものが好ましい。
Ｌ５及びＬ６は、炭化水素鎖Ｑとオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び／または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６の特に好ましい態様は、下記の群（ＩＩ）に示されるものである。また、群（ＩＩ）のスペーサーを２つから４つ組み合わせても良い。２価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
Ｌ１及びＬ２は、ポリエチレングリコール鎖と官能基をつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び／または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
Ｌ３及びＬ４は、ポリエチレングリコール鎖とオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくはアルキレン基；またはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、もしくはウレア結合から選択される少なくとも一つの結合及び／または基を含むアルキレン基である。Ｌ３及びＬ４は、ポリエチレングリコールの繰り返しユニットに炭素原子で結合しているものが好ましい。
Ｌ５及びＬ６は、炭化水素鎖Ｑとオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び／または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６の特に好ましい態様は、下記の群（ＩＩ）に示されるものである。また、群（ＩＩ）のスペーサーを２つから４つ組み合わせても良い。２価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
【0044】
群（ＩＩ）：
【0045】
【化10】
【0046】
（ｚ１）～（ｚ１１）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、好ましくは０～６の整数を示し、更に好ましくは０～３の整数を示す。また、（ｚ２）～（ｚ１１）において、式中のｓは同一でも、異なっていてもよい。
【0047】
式（１）中のＬ１及びＬ２は、群（ＩＩ）の（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）、（ｚ１０）または（ｚ２）と（ｚ４）との組み合わせが好ましく、（ｚ３）、（ｚ６）、（ｚ９）、（ｚ１０）または（ｚ２）と（ｚ４）との組み合わせがより好ましい。
【0048】
式（１）中のＬ３及びＬ４は、群（ＩＩ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）または（ｚ１１）で示される基が好ましく、（ｚ３）、（ｚ５）または（ｚ１１）で示される基がより好ましい。
【0049】
式（１）中のＬ５及びＬ６は、群（ＩＩ）の（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）または（ｚ１０）で示される基が好ましく、（ｚ３）、（ｚ６）、（ｚ９）または（ｚ１０）で示される基がより好ましい。
【0050】
式（１）中のＸ１及びＸ２は、化学修飾の対象となる生理活性タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、抗癌剤などの生体関連物質に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基であれば特に制限されない。例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」及び「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている官能基が挙げられる。
【0051】
式（１）中のＸ１及びＸ２で示される「生体関連物質と反応可能な官能基」は、生体関連物質が有するアミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、カルボキシル基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と化学結合可能な官能基であれば特に制限されない。
具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホニル基、アミノ基、オキシアミノ基（Ｈ２Ｎ－Ｏ－基）、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基（例えば、アリル基、ビニル基）、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１～５の炭化水素基で置換されたアルキニル基）、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、アルキルスルホニルオキシ基）、α－ハロアセチル基などが挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、炭素数１～５のアルキル－スルホニルオキシ基）、置換スルホネート基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１～５の炭化水素基で置換された炭素数２～５のアルキニル基）、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基、オキシアミノ基及びアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基及びオキシアミノ基である。
具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホニル基、アミノ基、オキシアミノ基（Ｈ２Ｎ－Ｏ－基）、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基（例えば、アリル基、ビニル基）、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１～５の炭化水素基で置換されたアルキニル基）、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、アルキルスルホニルオキシ基）、α－ハロアセチル基などが挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、炭素数１～５のアルキル－スルホニルオキシ基）、置換スルホネート基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１～５の炭化水素基で置換された炭素数２～５のアルキニル基）、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基、オキシアミノ基及びアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基及びオキシアミノ基である。
【0052】
別の好適な実施形態において、かかる官能基Ｘ１及びＸ２は、下記の群（ＩＩＩ）、群（ＩＶ）、群（Ｖ）、群（ＶＩ）、群（ＶＩＩ）及び群（ＶＩＩＩ）に分類することができる。
【0053】
群（ＩＩＩ）：生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、または(k)で示される基が挙げられる。
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、または(k)で示される基が挙げられる。
【0054】
群（ＩＶ）：生体関連物質が有するメルカプト基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、または(l)で示される基が挙げられる。
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、または(l)で示される基が挙げられる。
【0055】
群（Ｖ））：生体関連物質が有するアルデヒド基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
【0056】
群（ＶＩ）：生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
【0057】
群（ＶＩＩ）：生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、または(o)で示される基が挙げられる。
下記の(h)、(m)、または(o)で示される基が挙げられる。
【0058】
群（ＶＩＩＩ）：生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
下記の(l)で示される基が挙げられる。
下記の(l)で示される基が挙げられる。
【0059】
【化11】
【0060】
官能基(j)において、式中のＵ１は塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）またはヨウ素原子（Ｉ）などのハロゲン原子を示し、好ましくはＢｒ、またはＩ、より好ましくはＩである。
【0061】
また、官能基(e)及び官能基(l)において、式中のＹ１、Ｙ３は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１～５の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数１～５の炭化水素基である。炭素数１～５の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
【0062】
また、官能基(k)において、式中のＹ２はフッ素原子を含んでいてもよい炭素数が１～１０の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基である。
【0063】
活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基は、好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したエステル基である。
【0064】
活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基は、好ましくはニトロフェノールまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したカーボネート基である。
【0065】
置換マレイミド基とは、マレイミド基の二重結合の片方の炭素原子に炭化水素基が結合しているマレイミド基である。炭化水素基は、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
【0066】
置換スルホネート基とは、スルホネート基の硫黄原子にフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基が結合しているスルホネート基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基である。
【0067】
以下、本発明の好適な態様を示す分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式（２）で示される。
【0068】
下式（２）：
【化12】
【0069】
（式中、ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立して１１０～９５０であり、Ｗ３及びＷ４はそれぞれ独立して２～５残基のオリゴペプチドであり、Ｑ、Ｘ１及びＸ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0070】
本発明の式（２）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは２０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（２）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は２０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
【0071】
式（２）中のｎ３及びｎ４は、それぞれポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常はそれぞれ独立して１１０～９５０であり、好ましくはそれぞれ独立して２２０～６９０であり、更に好ましくはそれぞれ独立して２２０～４６０である。
【0072】
式（２）中のＷ３及びＷ４は、それぞれ独立して２～５残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式（２）の分解性ポリエチレングリコール誘導体の合成においては、原料であるポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドを反応にて結合させる際、オリゴペプチドのＣ末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との縮合反応に利用する。しかし、当該オリゴペプチドが側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸を有する場合、縮合反応にてオリゴペプチド同士の副反応や、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるＣ末端のカルボキシル基ではなく、側鎖のカルボキシル基にも導入した不純物が発生する。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Ｗ３及びＷ４を構成するアミノ酸は、α－アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Ｗ３及びＷ４を構成するアミノ酸は、α－アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
【0073】
中性アミノ酸であるシステインはメルカプト基を有しており、他のメルカプト基とジスルフィド結合を形成するため、Ｗ３及びＷ４は、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが好ましい。
【0074】
加えて、Ｗ３及びＷ４は、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。Ｃ末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にＣ末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
【0075】
さらに、Ｗ３及びＷ４は、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも１つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す（Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105－132.）。
【0076】
Ｗ３及びＷ４は、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンなどであり、好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、またはフェニルアラニン－グリシンであり、より好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、またはフェニルアラニン－グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、またはフェニルアラニン－グリシンである。
【0077】
以下、本発明の好適な態様を示す分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式（３）で示される。
【0078】
下式（３）：
【化13】
【0079】
（式中、Ｗ５及びＷ６は、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の５～４７残基のオリゴペプチドであり、ｂ１及びｂ２はそれぞれ独立して２～８であり、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｘ１及びＸ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0080】
式（３）中のｂ１及びｂ２は、それぞれＷ５及びＷ６で示されるオリゴペプチドと結合しているポリエチレングリコール鎖の本数であり、通常はそれぞれ独立して２～８であり、好ましくはそれぞれ独立して２または４または８であり、更に好ましくはそれぞれ独立して２または４である。
【0081】
式（３）中のＷ５及びＷ６は、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の５～４７残基、好ましくは５～２３残基、より好ましくは５～１９残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、オリゴペプチドを構成するアミノ酸としては、中心部分を構成するグルタミン酸以外は、システインを除く中性アミノ酸からなることが好ましい。ここでいうグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドとは、グルタミン酸のα位のカルボキシル基とγ位のカルボキシル基に同一のペプチドが結合した化合物を意味し、グルタミン酸を中心に対となるペプチドが対称構造をとるオリゴペプチドである。当該オリゴペプチド中の中性アミノ酸とグルタミン酸の数の構成比（中性アミノ酸の数／グルタミン酸の数）としては、通常は２～１０であり、好ましくは２～８であり、更に好ましくは２～６である。Ｗ５及びＷ６を構成するアミノ酸は基本的にはＬ型である。
【0082】
Ｗ５及びＷ６の特に好ましい態様は、下記の群（ＩＸ）に示されるものである。
【0083】
群（ＩＸ）：
【0084】
【化14】
【0085】
【化15】
【0086】
【化16】
【0087】
（式中、Ｇｌｕはグルタミン酸の残基であり、及びＺはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基の分解性オリゴペプチドである。）
【0088】
（ｖ１）～（ｖ３）中のＺは、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式（３）のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体の合成においては、原料であるポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドを反応にて結合させる際、オリゴペプチドのＣ末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との縮合反応に利用する。しかし、当該オリゴペプチドが側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸を有する場合、縮合反応にてオリゴペプチド同士の副反応や、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるＣ末端のカルボキシル基ではなく、側鎖のカルボキシル基にも導入した不純物が発生する。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Ｚを構成するアミノ酸は、α－アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Ｚを構成するアミノ酸は、α－アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
【0089】
中性アミノ酸であるシステインはメルカプト基を有しており、他のメルカプト基とジスルフィド結合を形成するため、（ｖ１）～（ｖ３）中のＺは、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが好ましい。
【0090】
加えて、（ｖ１）～（ｖ３）中のＺは、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。Ｃ末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にＣ末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
【0091】
さらに、（ｖ１）～（ｖ３）中のＺは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す（Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105－132.）。
【0092】
（ｖ１）～（ｖ３）中のＺは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンなどであり、好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、またはフェニルアラニン－グリシンであり、より好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、またはフェニルアラニン－グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、またはフェニルアラニン－グリシンである。
【0093】
式（３）の好ましい態様の１つは、Ｗ５及びＷ６がｖ１であり、及びｂ１＝２、ｂ２＝２の下式（５）で示される４アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
【0094】
【化17】
【0095】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｘ１及びＸ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0096】
式（３）の好ましい態様の１つは、Ｗ５及びＷ６がｖ２であり、及びｂ１＝４、ｂ２＝４の下式（６）で示される８アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
【0097】
【化18】
【0098】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｘ１及びＸ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0099】
式（３）の好ましい態様の１つは、Ｗ５及びＷ６がｖ３であり、及びｂ１＝８、ｂ２＝８の下式（７）で示される１６アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
【0100】
【化19】
【0101】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｘ１及びＸ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0102】
以下、本発明の好適な態様を示す分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式（４）で示される。
【0103】
下式（４）：
【化20】
【0104】
（式中、Ｌ１１及びＬ１２はそれぞれ独立して２価のスペーサーであり、Ｄ１及びＤ２はそれぞれ独立して生体関連物質であり、ｎ１及びｎ２、a１及びa２、Ｑ、Ｗ１及びＷ２、Ｌ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0105】
式（４）中のＬ１１及びＬ１２は、それぞれ独立して、２価のスペーサーであり、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、好ましくはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び／または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
Ｌ１１及びＬ１２の特に好ましい態様は、下記の群（Ｘ）に示されるものである。また、群（Ｘ）のスペーサーを２つから５つ組み合わせても良い。２価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
Ｌ１１及びＬ１２の特に好ましい態様は、下記の群（Ｘ）に示されるものである。また、群（Ｘ）のスペーサーを２つから５つ組み合わせても良い。２価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
【0106】
群（Ｘ）：
【0107】
【化21】
【0108】
（ｚ１）～（ｚ２０）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、好ましくは０～６の整数、更に好ましくは０～３の整数を示す。また、（ｚ２）～（ｚ２０）において、式中のｓは同一でも、異なっていてもよい。
【0109】
式（４）中のＬ１１及びＬ１２としては、群（Ｉ）の（ｚ３）、（ｚ６）、（ｚ７）～（ｚ２０）で示される基が好ましく、（ｚ６）、（ｚ９）、（ｚ１０）、（ｚ１２）、（ｚ１４）、（ｚ１６）、（ｚ１８）または（ｚ２０）で示される基がより好ましく、（ｚ１０）、（ｚ１２）、（ｚ１６）または（ｚ２０）で示される基が更に好ましい。
【0110】
式（４）中のＤは、生体関連物質であり、特に制限はないが、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防に関わる物質である。具体的にはタンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルスなどを含み、好適なタンパク質またはペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマー、酵素などが挙げられる。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）などが挙げられ、血液凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセナチド、ＧＬＰ－１、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、完全長抗体、また抗体フラグメントとして、ＦａｂやｓｖＦＶなどが挙げられ、アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。遺伝子工学的にアミノ酸配列を変化させ、改質したこれらタンパク質も含む。上述したタンパク質は、血中での安定性が低く、ポリエチレングリコールで修飾し、血中半減期を延長させることが望ましい。
好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、ＧＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントなどが挙げられ、より好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、ＧＣＳＦ、エリスロポエチン、または抗体フラグメント（特にＦａｂ）が挙げられ、さらに好ましくは、ヒト成長ホルモン、またはＧＣＳＦが挙げられる。
好適なペプチドとしては、インスリン、ビバリルジン、テリパラチド、エキセナチド、エンフビルチド、デガレリクス、ミファムルチド、ネシリチド、ゴセレリン、グラチラマー、オクトレオチド、ランレオチド、イカチバント、ジコチニド、プラムリンチド、ロミプロスチム、カルシトニン、オキシトシン、リュープロレリン、グルカゴンが挙げられ、より好ましくは、インスリン、エキセナチド、カルシトニン（特にサーモンカルシトニン）が挙げられる。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）などが挙げられ、血液凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセナチド、ＧＬＰ－１、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、完全長抗体、また抗体フラグメントとして、ＦａｂやｓｖＦＶなどが挙げられ、アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。遺伝子工学的にアミノ酸配列を変化させ、改質したこれらタンパク質も含む。上述したタンパク質は、血中での安定性が低く、ポリエチレングリコールで修飾し、血中半減期を延長させることが望ましい。
好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、ＧＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントなどが挙げられ、より好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、ＧＣＳＦ、エリスロポエチン、または抗体フラグメント（特にＦａｂ）が挙げられ、さらに好ましくは、ヒト成長ホルモン、またはＧＣＳＦが挙げられる。
好適なペプチドとしては、インスリン、ビバリルジン、テリパラチド、エキセナチド、エンフビルチド、デガレリクス、ミファムルチド、ネシリチド、ゴセレリン、グラチラマー、オクトレオチド、ランレオチド、イカチバント、ジコチニド、プラムリンチド、ロミプロスチム、カルシトニン、オキシトシン、リュープロレリン、グルカゴンが挙げられ、より好ましくは、インスリン、エキセナチド、カルシトニン（特にサーモンカルシトニン）が挙げられる。
【0111】
式（４）で示される生体関連物質の好ましい態様の１つは、下式（８）で示される生体関連物質である。
【0112】
【化22】
【0113】
（式中、Ｄ１及びＤ２、ｎ３及びｎ４、Ｑ、Ｗ３及びＷ４、Ｌ１１及びＬ１２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0114】
式（４）で示される生体関連物質の別の好ましい態様の１つは、下式（９）で示される生体関連物質である。
【0115】
【化23】
【0116】
（式中、Ｄ１及びＤ２、ｎ１及びｎ２、ｂ１及びｂ２、Ｑ、Ｗ５及びＷ６、Ｌ１１及びＬ１２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0117】
式（９）の好ましい態様の１つは、Ｗ５及びＷ６がｖ１であり、及びｂ１＝２、ｂ２＝２の下式（１０）で示される４アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
【0118】
【化24】
【0119】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｄ１及びＤ２、Ｌ１１及びＬ１２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0120】
式（９）の好ましい態様の１つは、Ｗ５及びＷ６がｖ２であり、及びｂ１＝４、ｂ２＝４の下式（１１）で示される８アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
【0121】
【化25】
【0122】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｄ１及びＤ２、Ｌ１１及びＬ１２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0123】
式（９）の好ましい態様の１つは、Ｗ５及びＷ６がｖ３であり、及びｂ１＝８、ｂ２＝８の下式（１２）で示される１６アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
【0124】
【化26】
【0125】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ１及びｎ２、Ｑ、Ｄ１及びＤ２、Ｌ１１及びＬ１２及びＬ３及びＬ４及びＬ５及びＬ６は前記と同義である。）
【0126】
本発明の式（１）の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
［分解性ポリエチレングリコール誘導体（１－１）］
ｎ１及びｎ２が、それぞれ独立して２２０～４６０であり；
Ｗ１及びＷ２が、それぞれ独立して２～９残基のオリゴペプチド（例、フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン－グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン）であり；
a１及びa２が、それぞれ独立して１、２または４であり；
Ｑが、アルキレン基（例、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性カーボネート基（例、Ｎ－スクシンイミジルカーボネート基）、マレイミド基、カルボキシル基及びアミノ基よりなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、あるいはアミド結合またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｌ３及びＬ４が、２級アミノ基を含むアルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｌ５及びＬ６が、カルボニル基である；
式（１）の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［分解性ポリエチレングリコール誘導体（１－１）］
ｎ１及びｎ２が、それぞれ独立して２２０～４６０であり；
Ｗ１及びＷ２が、それぞれ独立して２～９残基のオリゴペプチド（例、フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン－グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン）であり；
a１及びa２が、それぞれ独立して１、２または４であり；
Ｑが、アルキレン基（例、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性カーボネート基（例、Ｎ－スクシンイミジルカーボネート基）、マレイミド基、カルボキシル基及びアミノ基よりなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、あるいはアミド結合またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｌ３及びＬ４が、２級アミノ基を含むアルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｌ５及びＬ６が、カルボニル基である；
式（１）の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【0127】
本発明の式（２）の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
［分解性ポリエチレングリコール誘導体（２－１）］
ｎ３及びｎ４が、それぞれ独立して２２０～４６０であり；
Ｗ３及びＷ４が、それぞれ独立して２～５残基のオリゴペプチド（例、フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン）であり；
Ｑが、アルキレン基（例、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性カーボネート基（例、Ｎ－スクシンイミジルカーボネート基）及びマレイミド基よりなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、エチレン基、プロレン基）であり；
Ｌ３及びＬ４が、２級アミノ基を含むアルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｌ５及びＬ６が、カルボニル基である；
式（２）の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［分解性ポリエチレングリコール誘導体（２－１）］
ｎ３及びｎ４が、それぞれ独立して２２０～４６０であり；
Ｗ３及びＷ４が、それぞれ独立して２～５残基のオリゴペプチド（例、フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン）であり；
Ｑが、アルキレン基（例、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、活性カーボネート基（例、Ｎ－スクシンイミジルカーボネート基）及びマレイミド基よりなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、エチレン基、プロレン基）であり；
Ｌ３及びＬ４が、２級アミノ基を含むアルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｌ５及びＬ６が、カルボニル基である；
式（２）の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【0128】
本発明の式（３）の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
［分解性ポリエチレングリコール誘導体（３－１）］
ｎ１及びｎ２が、それぞれ独立して２２０～４６０であり；
Ｗ５及びＷ６が、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の５～９残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン－グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン）であり；
ｂ１及びｂ２が、それぞれ独立して２または４または８であり；
Ｑが、アルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、カルボキシル基、アミノ基及びオキシアミノ基よりなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
Ｌ３及びＬ４が、２級アミノ基を含むアルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｌ５及びＬ６が、カルボニル基である；
式（３）の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［分解性ポリエチレングリコール誘導体（３－１）］
ｎ１及びｎ２が、それぞれ独立して２２０～４６０であり；
Ｗ５及びＷ６が、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の５～９残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－フェニルアラニン－グリシン－グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン）であり；
ｂ１及びｂ２が、それぞれ独立して２または４または８であり；
Ｑが、アルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立して、カルボキシル基、アミノ基及びオキシアミノ基よりなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
Ｌ３及びＬ４が、２級アミノ基を含むアルキレン基（例、プロピレン基）であり；
Ｌ５及びＬ６が、カルボニル基である；
式（３）の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【0129】
本発明のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、次のような工程を経て製造することができる。
【0130】
反応Ａ
【0131】
【化27】
【0132】
（工程中のＰＥＧはポリエチレングリコール鎖であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２は保護基であり、Ｌ７は２価のスペーサーであり、Ｌ１及びＸ１は前記と同義である。）
【0133】
工程中のＰＥＧは、ポリエチレングリコール鎖であり、分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるｎ１及びｎ２で定義したとおりであり、つまりｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して４５～９５０であることから、その分子量の範囲は、２０００～４２０００である。
【0134】
工程中のＰｅｐｔｉｄｅは、前記Ｗ３及びＷ４と同義のオリゴペプチドである。本工程ではＮ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
【0135】
工程中のＰｒｏ１及びＰｒｏ２は、保護基であり、ここで保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件及び分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley－Interscience: New York, 2007」に記載されている。また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件を用いて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
【0136】
工程中のＬ７は、前記Ｌ３及びＬ４と同義の２価のスペーサーである。
【0137】
反応Ａは、Ｎ末端のアミノ基が保護基Ｐｒｏ１で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、官能基Ｘ１が保護基Ｐｒｏ２で保護されたポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（１）を得る工程である。
オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基の保護基Ｐｒｏ１は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体の官能基Ｘ１の保護基Ｐｒｏ２は、Ｘ１がアミノ基の場合は、トリフルオロアセチル基、Ｆｍｏｃ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられ、水酸基の場合は、テトラヒドロピラニル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などが挙げられ、カルボキシル基の場合は、メチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などが挙げられる。ただし、保護基Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２は、それぞれ異なる保護基である。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などの試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いＨＡＴＵやＨＢＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）などの縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基の保護基Ｐｒｏ１は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体の官能基Ｘ１の保護基Ｐｒｏ２は、Ｘ１がアミノ基の場合は、トリフルオロアセチル基、Ｆｍｏｃ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられ、水酸基の場合は、テトラヒドロピラニル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などが挙げられ、カルボキシル基の場合は、メチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などが挙げられる。ただし、保護基Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２は、それぞれ異なる保護基である。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などの試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いＨＡＴＵやＨＢＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）などの縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0138】
脱保護Ｂ
【0139】
【化28】
【0140】
脱保護Ｂは、反応Ａで得られたポリエチレングリコール誘導体（１）の保護基Ｐｒｏ１を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基Ｐｒｏ２、オリゴペプチドやＬ１及びＬ７の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ａの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0141】
反応Ｃ
【0142】
【化29】
【0143】
反応Ｃは、脱保護Ｂで得られたポリエチレングリコール誘導体（２）のアミノ基と、グルタル酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である２アーム型のポリエチレングリコール誘導体（３）を得る工程である。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0144】
脱保護Ｄ
【0145】
【化30】
【0146】
脱保護Ｄは、反応Ｃで得られたポリエチレングリコール誘導体（３）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（４）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ１及びＬ７の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｃの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基Ｘ１を二つ有した２アーム型のポリエチレングリコール誘導体(４)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基Ｘ１を二つ有した２アーム型のポリエチレングリコール誘導体(４)を得ることができる。
【0147】
反応Ｅ
【0148】
【化31】
【0149】
（工程中のＰｒｏ３は保護基であり、Ｌ８は２価のスペーサーであり、ＰＥＧ、Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｐｒｏ１、Ｌ２及びＸ２は前記と同義である。）
【0150】
工程中のＰｒｏ３は、前記Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２と同義の保護基である。
【0151】
工程中のＬ８は、前記Ｌ３及びＬ４と同義の２価のスペーサーである。
【0152】
反応Ｅは、Ｎ末端のアミノ基が保護基Ｐｒｏ１で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、官能基Ｘ２が保護基Ｐｒｏ３で保護されたポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（５）を得る工程である。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
【0153】
脱保護Ｆ
【0154】
【化32】
【0155】
脱保護Ｆは、反応Ｅで得られたポリエチレングリコール誘導体（５）の保護基Ｐｒｏ１を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（６）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基Ｐｒｏ３、オリゴペプチドやＬ２及びＬ８の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｅの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0156】
反応Ｇ
【0157】
【化33】
【0158】
反応Ｇは、脱保護Ｆで得られたポリエチレングリコール誘導体（６）と無水グルタル酸を反応させ、カルボキシル基を有したポリエチレングリコール誘導体（７）を得る。さらに脱保護Ｂで得られたポリエチレングリコール誘導体（２）のアミノ基と（７）のカルボキシル基を縮合反応で結合させ、異なる２種類の２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である２アーム型のポリエチレングリコール誘導体（８）を得る工程である。
反応Ｇでは無水グルタル酸や無水コハク酸などの二塩基酸の無水物を用いることが好ましいが、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸などの二塩基酸の片方のカルボキシル基が、メチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。また、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基の片方がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートなどで活性化され、もう片方の水酸基がテトラヒドロピラニル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。
（２）との反応では、前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応Ｇでは無水グルタル酸や無水コハク酸などの二塩基酸の無水物を用いることが好ましいが、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸などの二塩基酸の片方のカルボキシル基が、メチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。また、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基の片方がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートなどで活性化され、もう片方の水酸基がテトラヒドロピラニル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。
（２）との反応では、前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0159】
脱保護Ｈ
【0160】
【化34】
【0161】
脱保護Ｈは、反応Ｇで得られたポリエチレングリコール誘導体（８）の保護基Ｐｒｏ２及びＰｒｏ３を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（９）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ１及びＬ２及びＬ７及びＬ８の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、保護基Ｐｒｏ２及びＰｒｏ３を同条件で脱保護しても良く、またそれぞれ別工程で脱保護しても良い。さらに反応Ｇの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした異なる二つの官能基Ｘ１とＸ２を有した２アーム型のポリエチレングリコール誘導体(９)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした異なる二つの官能基Ｘ１とＸ２を有した２アーム型のポリエチレングリコール誘導体(９)を得ることができる。
【0162】
反応Ｉ
【0163】
【化35】
【0164】
（工程中のＬ９及びＬ１０は２価のスペーサーであり、ＰＥＧ、Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｐｒｏ１は前記と同義である。）
【0165】
工程中のＬ９は、前記Ｌ３及びＬ４と同義の２価のスペーサーであり、Ｌ１０は、前記Ｌ１及びＬ２と同義の２価のスペーサーである。
【0166】
反応Ｉは、Ｎ末端のアミノ基が保護基Ｐｒｏ１で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端に水酸基を有したポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（１０）を得る工程である。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤ＤＭＴ－ＭＭなどを用いた反応が好ましい。反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤ＤＭＴ－ＭＭなどを用いた反応が好ましい。反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
【0167】
脱保護Ｊ
【0168】
【化36】
【0169】
脱保護Ｊは、反応Ｉで得られたポリエチレングリコール誘導体（１０）の保護基Ｐｒｏ１を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１１）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ９及びＬ１０の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｉの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0170】
反応Ｋ
【0171】
【化37】
【0172】
反応Ｋは、脱保護Ｊで得られたポリエチレングリコール誘導体（１１）のアミノ基と、アジピン酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がアジピン酸で繋がれた構造である２アーム型のポリエチレングリコール誘導体（１２）を得る工程である。
ここでコア分子として使用するアジピン酸は、コハク酸、グルタル酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤ＤＭＴ－ＭＭなどを用いた反応が好ましい。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するアジピン酸は、コハク酸、グルタル酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤ＤＭＴ－ＭＭなどを用いた反応が好ましい。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0173】
反応Ｌ
【0174】
【化38】
【0175】
反応Ｌは、反応Ｋで得られたポリエチレングリコール誘導体（１２）の２つの水酸基を官能基Ｘ１に変換し、ポリエチレングリコール誘導体（１３）を得る工程である。
水酸基を他の官能基に変換する反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」及び「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている方法を用いることで種々の官能基に変換できる。
例えば、パラ－ニトロフェニルクロロホルメートやジスクシンイミジルカーボネートなどの反応試薬を、トリエチルアミンなどの塩基を用いて反応させることで、（１２）の水酸基を活性化カーボネート基に変換できる。また、特許第５４１８３６０号に記載されている方法で（１２）の水酸基をアミノ基、オキシアミノ基に変換できる。
反応Ｌで使用する反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、アジピン酸をコア分子とした官能基Ｘ１を二つ有した２アーム型のポリエチレングリコール誘導体(１３)を得ることができる。
水酸基を他の官能基に変換する反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」及び「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている方法を用いることで種々の官能基に変換できる。
例えば、パラ－ニトロフェニルクロロホルメートやジスクシンイミジルカーボネートなどの反応試薬を、トリエチルアミンなどの塩基を用いて反応させることで、（１２）の水酸基を活性化カーボネート基に変換できる。また、特許第５４１８３６０号に記載されている方法で（１２）の水酸基をアミノ基、オキシアミノ基に変換できる。
反応Ｌで使用する反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、アジピン酸をコア分子とした官能基Ｘ１を二つ有した２アーム型のポリエチレングリコール誘導体(１３)を得ることができる。
【0176】
反応Ｍ
【0177】
【化39】
【0178】
反応Ｍは、脱保護Ｂで得られたポリエチレングリコール誘導体（２）のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体（１４）を得る工程である。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
グルタミン酸のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
グルタミン酸のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0179】
脱保護Ｎ
【0180】
【化40】
【0181】
脱保護Ｎは、反応Ｍで得られたポリエチレングリコール誘導体（１４）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１５）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ１及びＬ７の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｍの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0182】
反応Ｏ
【0183】
【化41】
【0184】
反応Ｏは、脱保護Ｎで得られたポリエチレングリコール誘導体（１５）のアミノ基と、グルタル酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、４本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である４アーム型のポリエチレングリコール誘導体（１６）を得る工程である。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0185】
脱保護Ｐ
【0186】
【化42】
【0187】
脱保護Ｐは、反応Ｏで得られたポリエチレングリコール誘導体（１６）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１７）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ１及びＬ７の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｏの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基Ｘ１を４つ有した４アーム型のポリエチレングリコール誘導体(１７)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基Ｘ１を４つ有した４アーム型のポリエチレングリコール誘導体(１７)を得ることができる。
【0188】
反応Ｑ
【0189】
【化43】
【0190】
反応Ｑは、脱保護Ｎで得られたポリエチレングリコール誘導体（１５）のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、４本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体（１８）を得る工程である。
前記反応Ｍと同条件で反応と精製が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体（１８）の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４－２０８７８６号公報、または特開２０１１－７９９３４号公報に記載の精製技術を用いることができる。
前記反応Ｍと同条件で反応と精製が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体（１８）の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４－２０８７８６号公報、または特開２０１１－７９９３４号公報に記載の精製技術を用いることができる。
【0191】
脱保護Ｒ
【0192】
【化44】
【0193】
脱保護Ｒは、反応Ｑで得られたポリエチレングリコール誘導体（１８）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１９）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ１及びＬ７の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｎと同条件で反応と精製が可能である。また、本工程は、反応Ｑの工程の一環として実施することも可能である。
【0194】
反応Ｓ
【0195】
【化45】
【0196】
反応Ｓは、脱保護Ｒで得られたポリエチレングリコール誘導体（１９）のアミノ基と、グルタル酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、８本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である８アーム型のポリエチレングリコール誘導体（２０）を得る工程である。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【0197】
脱保護Ｔ
【0198】
【化46】
【0199】
脱保護Ｔは、反応Ｓで得られたポリエチレングリコール誘導体（２０）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２１）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ１及びＬ７の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｓの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基Ｘ１を８つ有した８アーム型のポリエチレングリコール誘導体(２１)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基Ｘ１を８つ有した８アーム型のポリエチレングリコール誘導体(２１)を得ることができる。
【0200】
脱保護Ｄ、脱保護Ｈ、脱保護Ｐ及び脱保護Ｔで得られたポリエチレングリコール誘導体（４）、（９）、（１７）及び（２１）は、官能基Ｘ１及びＸ２を有しており、これら官能基を利用して様々な官能基に変換が可能である。
【0201】
例えば、官能基Ｘ１及びＸ２がアミノ基の場合、特に制限は無いが、基本的には、アミノ基と反応可能な活性エステル基を有した化合物、または酸無水物、酸クロライドなどの一般的な反応試薬を用いることで、様々な官能基に容易に変換することが出来る。
【0202】
具体的には、アミノ基をマレイミド基に変換したい場合は、以下のような試薬と反応させることで、目的物を得ることができる。
【0203】
【化47】
【0204】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をカルボキシル基に変換したい場合は、無水コハク酸や無水グルタル酸と反応させることで、目的物を得ることができる。
【0205】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を水酸基に変換したい場合は、カプロラクトンなどの環状エステルの開環物と縮合反応させることで、目的物を得ることができる。
【0206】
これら反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。
【0207】
以上のような工程を経て、得られた分解性ポリエチレングリコールは、血中で安定であり、細胞内でのみ分解する性能を有することが求められる。その性能を適切に評価するため、例えば、以下に示すような試験を実施し、分解性ポリエチレングリコールの血中での安定性、そして細胞内での分解性を評価することができる。
なお、これらの評価においてポリエチレングリコール誘導体が有する官能基の種類による影響を考慮し、評価試料はすべて、アミノ基を１つ有したポリエチレングリコール誘導体に統一して試験を実施した。
なお、これらの評価においてポリエチレングリコール誘導体が有する官能基の種類による影響を考慮し、評価試料はすべて、アミノ基を１つ有したポリエチレングリコール誘導体に統一して試験を実施した。
【0208】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中での安定性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの血清を用いた試験などが挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように血清に溶解し、３７℃で９６時間インキュベート後、血清中に含まれるポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験前のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％と、安定性試験後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％から算出する。具体的には以下の式を用いる。
分解率 ＝ （試験前のピーク面積％ － 試験後のピーク面積％） ÷ 試験前のピーク面積％ × １００
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９０％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 ＝ （９５－９０）÷９５×１００ ＝ ５．２６（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、９６時間後の分解率は、１０％以下が好ましく、５％以下がさらに好ましい。
分解率 ＝ （試験前のピーク面積％ － 試験後のピーク面積％） ÷ 試験前のピーク面積％ × １００
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９０％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 ＝ （９５－９０）÷９５×１００ ＝ ５．２６（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、９６時間後の分解率は、１０％以下が好ましく、５％以下がさらに好ましい。
【0209】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞内での分解性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、分解性ポリエチレングリコール誘導体を含有した培地を用いて、細胞を培養させる試験などが挙げられる。ここで使用する細胞や培地については、特に制限は無いが、具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１～２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように培地であるＲＰＭＩ－１６４０に溶解し、この培地を用いて、マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を３７℃で９６時間培養後、細胞中のポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験と同様に、試験前後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％を用いて算出する。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が５％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 ＝ （９５－５）÷９５×１００ ＝ ９４．７（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、９６時間後の分解率は、９０％以上が好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が５％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 ＝ （９５－５）÷９５×１００ ＝ ９４．７（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、９６時間後の分解率は、９０％以上が好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【0210】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中半減期や体内分布を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、放射性同位体や蛍光物質をラベル化し、マウスやラットに投与して、モニタリングする試験などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期及び、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期及び、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
【0211】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞の空胞抑制を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、非特許文献２に記載があるように、長期間、高頻度、及び高投与量でマウスやラットに投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている臓器や器官の切片画像を確認する試験などが挙げられる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１０～２５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週３回、４週間以上、２０～１００μＬ投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１０～２５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週３回、４週間以上、２０～１００μＬ投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
【0212】
非特許文献２では、高分子量のポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの組織への蓄積と関係があるとの記載がある。分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞への蓄積性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、上記の空胞の評価と同じ方法で作成した切片画像より評価することができる。ポリエチレングリコールが蓄積しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などの染色した切片画像を病理学的手法により確認し、ポリエチレングリコールの蓄積性の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
【実施例】
【0213】
下記実施例で得られた１Ｈ－ＮＭＲは、日本電子データム（株）製ＪＮＭ－ＥＣＰ４００またはＪＮＭ－ＥＣＡ６００から得た。測定にはφ５ｍｍチューブを用い、重水素化溶媒には、Ｄ２Ｏまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有するＣＤＣｌ３及びｄ６－ＤＭＳＯを用いた。得られたポリエチレングリコール誘導体の分子量及びアミン純度は、液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ及びＨＰＬＣ）を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、ＧＰＣには東ソー（株）製「ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ ＥｃｏＳＥＣ」を用い、ＨＰＬＣにはＷＡＴＥＲＳ製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」を用いた。以下、ＧＰＣ及びＨＰＬＣの分析条件を示す。
ＧＰＣ分析（分子量測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ５００及びｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ２５０（ＷＡＴＥＲＳ製）
移動相：１００ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ＋０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．２）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：３０℃
ＨＰＬＣ分析（アミン純度測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ（東ソー（株）製）
移動相：１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：４０℃
ＧＰＣ分析（分子量測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ５００及びｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ２５０（ＷＡＴＥＲＳ製）
移動相：１００ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ＋０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．２）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：３０℃
ＨＰＬＣ分析（アミン純度測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ（東ソー（株）製）
移動相：１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：４０℃
【0214】
［実施例１］
化合物（ｐ３）の合成
化合物（ｐ３）の合成
【0215】
【化48】
【0216】
［実施例１－１］
化合物（ｐ１）の合成
化合物（ｐ１）の合成
【0217】
【化49】
【0218】
Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－フェニルアラニル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）（４００ｍｇ）と平均分子量＝２０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＨＯ－２００ＰＡ」（１５ｇ）にアセトニトリル（６０ｇ）を添加して溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（２３３ｍｇ）と４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）（３１１ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、ピペリジン（６３９ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（５００ｇ）で希釈した後、ヘキサン（３００ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（３００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１５０ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾ－ル（ＢＨＴ）（２０ｍｇ）を含有したヘキサン（１００ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１）を得た。収量１３ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【0219】
［実施例１－２］
化合物（ｐ２）の合成
化合物（ｐ２）の合成
【0220】
【化50】
【0221】
実施例１－１で得られた化合物（ｐ１）（１．０ｇ）、グルタル酸（３．２ｍｇ）をアセトニトリル（４．０ｇ）に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（８．４ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（２２ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル（６０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（４０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、酢酸エチル（６０ｇ）に溶解し、ヘキサン（３０ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）を含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２）を得た。収量７３４ｍｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
【0222】
［実施例１－３］
化合物（ｐ３）の合成
化合物（ｐ３）の合成
【0223】
【化51】
【0224】
実施例１－２で得られた化合物（ｐ２）（５００ｍｇ）、をジクロロメタン（３．５ｇ）に溶解し、その後、炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（２６ｍｇ）とピリジン（１０ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で８時間反応させた。反応終了後、５％食塩水（５ｇ）で反応液を洗浄し、硫酸マグネシウム（１００ｍｇ）を加えて、室温にて３０分撹拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮後、濃縮物にＢＨＴ（６ｍｇ）含有の酢酸エチル（３０ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（１５ｇ）を加えて室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）含有のヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ３）を得た。収量３７８ｍｇ。スクシンイミジルカーボネート化率は９４％（１Ｈ－ＮＭＲ）であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８３ｐｐｍ（ｓ、８Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８３ｐｐｍ（ｓ、８Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
【0225】
［実施例２］
化合物（ｐ８）の合成
化合物（ｐ８）の合成
【0226】
【化52】
【0227】
［実施例２－１］
化合物（ｐ４）の合成
化合物（ｐ４）の合成
【0228】
【化53】
【0229】
平均分子量＝２０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＥ－２００ＰＡ」（２０ｇ）をトルエン（８０ｇ）に溶解し、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（１０７ｍｇ）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、トルエン（１００ｇ）を添加し、攪拌して均一にした後、ヘキサン（１００ｇ）を加えて室温にて３０分間攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、生成物を真空乾燥した。その後、生成物をイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、回収した水溶液にクロロホルム（５００ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。得られた有機層に硫酸ナトリウム（１０ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を濃縮し、トルエン（２００ｇ）に再溶解し、ヘキサン（１００ｇ）を添加し、室温で３０分攪拌して結晶を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、ヘキサン（１００ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ４）を得た。収量９．１ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９８％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【0230】
［実施例２－２］
化合物（ｐ５）の合成
化合物（ｐ５）の合成
【0231】
【化54】
【0232】
Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－グリシル－ロイシル－フェニルアラニル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）（３１３ｍｇ）と実施例２－１で得られた化合物（ｐ４）（８．５ｇ）にアセトニトリル（３４ｇ）を添加して溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１３２ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（３５３ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、ピペリジン（３６１ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（４００ｇ）で希釈した後、ヘキサン（２５０ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（４００ｇ）に溶解し、ヘキサン（２００ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（２００ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ５）を得た。収量７．６ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＮＨ－）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．７０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＮＨ－）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．７０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【0233】
［実施例２－３］
化合物（ｐ６）の合成
化合物（ｐ６）の合成
【0234】
【化55】
【0235】
実施例２－２で得られた化合物（ｐ５）（１．３ｇ）、コハク酸（３．８ｍｇ）をアセトニトリル（５．２ｇ）に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（１１ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（２９ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル（１００ｇ）で希釈した後、ヘキサン（６０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（２０ｍｇ）を含有した酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ６）を得た。収量８８９ｍｇ。１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ
３
）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ
３
）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ
３
）
３
）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．３４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ
２
－）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ
２
－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ
６
Ｈ
５
）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ
６
Ｈ
５
）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
【0236】
［実施例２－４］
化合物（ｐ７）の合成
化合物（ｐ７）の合成
【0237】
【化56】
【0238】
実施例２－３で得られた化合物（ｐ６）（８００ｍｇ）をイオン交換水（３．３ｇ）に溶解し、６Ｎ塩酸（０．７ｇ）を添加して、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、塩化ナトリウム（１．０ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを７．１０に調整した後、ＢＨＴ（２ｍｇ）含有のクロロホルム（１０ｇ）を添加して室温にて２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度ＢＨＴ（２ｍｇ）含有のクロロホルム（１０ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を合わせて４０℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン（５０ｇ）に溶解し、硫酸ナトリウム（１．０ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌して脱水した。その後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、ろ液にヘキサン（３０ｇ）を加えて室温にて３０分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）を含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ７）を得た。収量６７５ｍｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９１％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．３４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．３４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
【0239】
［実施例２－５］
化合物（ｐ８）の合成
化合物（ｐ８）の合成
【0240】
【化57】
【0241】
実施例２－４で得られた化合物（ｐ７）（４００ｍｇ）をアセトニトリル（３２０ｍｇ）及びトルエン（２．１ｇ）に溶解した。その後、Ｎ－メチルモルホリン（１０ｍｇ）と３－マレイミドプロピオン酸 Ｎ－スクシンイミジル（２７ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下及び遮光下で６時間反応させた。反応終了後、反応液をＢＨＴ（１０ｍｇ）含有の酢酸エチル（５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（３０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）含有のヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ８）を得た。収量２２７ｍｇ。マレイミド化率は９６％（１Ｈ－ＮＭＲ）であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．３４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．７６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．３４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．７６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
【0242】
［実施例３］
化合物（ｐ１３）の合成
化合物（ｐ１３）の合成
【0243】
【化58】
【0244】
［実施例３－１］
化合物（ｐ９）の合成
化合物（ｐ９）の合成
【0245】
【化59】
【0246】
実施例１－１で得られた化合物（ｐ１）（２．０ｇ）、酢酸ナトリウム（８２ｍｇ）、無水グルタル酸（１３２ｍｇ）をトルエン（６．０ｇ）に溶解し、窒素雰囲気下で４０℃にて７時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（１００ｇ）で希釈し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液にヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した。得られた析出物を酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて３０分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、ヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ９）を得た。収量１．８ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯＯＨ）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯＯＨ）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【0247】
［実施例３－２］
化合物（ｐ１０）の合成
化合物（ｐ１０）の合成
【0248】
【化60】
【0249】
実施例３－１で得られた化合物（ｐ９）（１．６ｇ）と実施例２－２で得られた化合物（ｐ５）（１．６ｇ）をアセトニトリル（１０ｇ）に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（２５ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（６６ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル（１５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（８０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１６ｍｇ）を含有したヘキサン（８０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１０）を得た。収量２．６ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
【0250】
［実施例３－３］
化合物（ｐ１１）の合成
化合物（ｐ１１）の合成
【0251】
【化61】
【0252】
実施例３－２で得られた化合物（ｐ１０）（２．３ｇ）をイオン交換水（９．４ｇ）に溶解し、６Ｎ塩酸（２．１ｇ）を添加して、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、塩化ナトリウム（２．５ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを７．１０に調整した後、ＢＨＴ（４ｍｇ）含有のクロロホルム（２０ｇ）を添加して室温にて２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度ＢＨＴ（４ｍｇ）含有のクロロホルム（２０ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を合わせて４０℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン（１５０ｇ）に溶解し、硫酸ナトリウム（５．０ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。ろ液にヘキサン（８０ｇ）を加えて室温にて３０分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１１）を得た。収量１．７ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９０％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、ＮＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、ＮＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
【0253】
［実施例３－４］
化合物（ｐ１２）の合成
化合物（ｐ１２）の合成
【0254】
【化62】
【0255】
実施例３－３で得られた化合物（ｐ１１）（１．５ｇ）をアセトニトリル（１．２ｇ）及びトルエン（７．８ｇ）に溶解した。その後、Ｎ－メチルモルホリン（１９ｍｇ）と３－マレイミドプロピオン酸 Ｎ－スクシンイミジル（２１ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下及び遮光下で３時間反応させた。反応終了後、反応液をＢＨＴ（１０ｍｇ）含有の酢酸エチル（５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（３０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（４ｍｇ）含有のヘキサン（２０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１２）を得た。収量１．３ｇ。マレイミド化率は９２％（１Ｈ－ＮＭＲ）であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ｃ４ＮＯ２Ｈ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ｃ４ＮＯ２Ｈ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
【0256】
［実施例３－５］
化合物（ｐ１３）の合成
化合物（ｐ１３）の合成
【0257】
【化63】
【0258】
実施例３－４で得られた化合物（ｐ１２）（８００ｍｇ）をジクロロメタン（５．６ｇ）に溶解し、その後、炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（２０ｍｇ）とピリジン（８ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で８時間反応させた。反応終了後、５％食塩水（５ｇ）で反応液を洗浄し、硫酸マグネシウム（１００ｍｇ）を加えて、２５℃で３０分撹拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮後、濃縮物にトルエン（１００ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（５０ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）含有のヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１３）を得た。収量６５３ｍｇ。スクシンイミジルカーボネート化率は９３％（１Ｈ－ＮＭＲ）であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ｃ４ＮＯ２Ｈ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、２．８３ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ｃ４ＮＯ２Ｈ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、２．８３ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）
【0259】
［実施例４］
化合物（ｐ１７）の合成
化合物（ｐ１７）の合成
【0260】
【化64】
【0261】
［実施例４－１］
化合物（ｐ１４）の合成
化合物（ｐ１４）の合成
【0262】
【化65】
【0263】
実施例１－１と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－フェニルアラニル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）（４００ｍｇ）と平均分子量＝１０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＨＯ－１００ＰＡ」（７．５ｇ）を原料として用いて、上記化合物（ｐ１４）を得た。収量６．５ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９８％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約９５０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約９５０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【0264】
［実施例４－２］
化合物（ｐ１５）の合成
化合物（ｐ１５）の合成
【0265】
【化66】
【0266】
Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－グルタミン酸（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ）（９３ｍｇ）と実施例４－１で得られた化合物（ｐ１４）（５．５ｇ）にアセトニトリル（２４ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（８６ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（２３２ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、ピペリジン（１．１ｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（１５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（８０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（１５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（８０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１５）を得た。収量４．６ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９２％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【0267】
［実施例４－３］
化合物（ｐ１６）の合成
化合物（ｐ１６）の合成
【0268】
【化67】
【0269】
実施例４－２で得られた化合物（ｐ１５）（１．０ｇ）、グルタル酸（３．３ｍｇ）をアセトニトリル（８．０ｇ）に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（８．４ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（２２．６ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（１００ｇ）で希釈した後、ヘキサン（６０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、トルエン（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１６）を得た。収量６８３ｍｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、２２Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、２２Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
【0270】
［実施例４－４］
化合物（ｐ１７）の合成
化合物（ｐ１７）の合成
【0271】
【化68】
【0272】
実施例４－３で得られた化合物（ｐ１６）（５００ｍｇ）をトルエン（１０ｇ）に３０℃で加温溶解し、減圧にて共沸脱水した。その後、濃縮物をクロロホルム（３．０ｇ）に溶解し、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド（７．２ｍｇ）とトリフェニルホスフィン（３６ｍｇ）とアゾジカルボン酸ジイソプロピル（２４ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で４時間反応させた。反応終了後、反応液にメタノール（１０ｍｇ）を添加し２５℃で３０分撹拌した後、エチレンジアミン一水和物（２０ｍｇ）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（３０ｇ）を加えて室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（４ｍｇ）を含有したヘキサン（２０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１７）を得た。収量２６３ｍｇ。ＨＰＬＣ：オキシアミン純度は９０％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、２２Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＮＨ２）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、２２Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＮＨ２）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
【0273】
［実施例５］
化合物（ｐ２３）の合成
化合物（ｐ２３）の合成
【0274】
【化69】
【0275】
［実施例５－１］
化合物（ｐ１８）の合成
化合物（ｐ１８）の合成
【0276】
【化70】
【0277】
Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－グルタミン酸（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ）（１８ｍｇ）と実施例２－２で得られた化合物（ｐ５）（４．０ｇ）にアセトニトリル（１６ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１７ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（３６ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、ピペリジン（２１２ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（１５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（９０ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（４０ｍｇ）を含有したトルエン（２００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１００ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（３０ｍｇ）を含有したヘキサン（１５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１８）を得た。収量２．７ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９１％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、８Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．７０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、８Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．９２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．７０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）
【0278】
［実施例５－２］
化合物（ｐ１９）の合成
化合物（ｐ１９）の合成
【0279】
【化71】
【0280】
実施例４－２と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－グルタミン酸（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ）（１８ｍｇ）と実施例１－１で得られた化合物（ｐ１）（４．０ｇ）を原料として用いて、上記化合物（ｐ１９）を得た。収量３．２ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は９０％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【0281】
［実施例５－３］
化合物（ｐ２０）の合成
化合物（ｐ２０）の合成
【0282】
【化72】
【0283】
実施例５－２で得られた化合物（ｐ１９）（３．０ｇ）、酢酸ナトリウム（６０ｍｇ）、無水グルタル酸（８６ｍｇ）をトルエン（１０ｇ）に溶解し、窒素雰囲気下で４０℃にて６時間反応させた。反応終了後、トルエン（１５０ｇ）で希釈し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液にヘキサン（１００ｇ）を添加して室温にて３０分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した。得られた析出物をトルエン（２００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１００ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、ＢＨＴ（３０ｍｇ）を含有したヘキサン（１５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２０）を得た。収量２．３ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．０２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．０２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、２．３０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－ＯＨ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【0284】
［実施例５－４］
化合物（ｐ２１）の合成
化合物（ｐ２１）の合成
【0285】
【化73】
【0286】
実施例５－１で得られた化合物（ｐ１８）（１．８ｇ）と実施例５－３で得られた化合物（ｐ２０）（１．８ｇ）をアセトニトリルに溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン（１４ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（３７３ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（２００ｇ）で希釈した後、ヘキサン（１００ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（４０ｍｇ）を含有したトルエン（２００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１００ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（２０ｍｇ）を含有したヘキサン（１００ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２１）を得た。収量２．４ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１６Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約７，６００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、８Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、６Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１６Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約７，６００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、８Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、６Ｈ）
【0287】
［実施例５－５］
化合物（ｐ２２）の合成
化合物（ｐ２２）の合成
【0288】
【化74】
【0289】
実施例５－４で得られた化合物（ｐ２０）（２．０ｇ）をアセトニトリル（２０ｇ）に溶解し、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（２０ｍｇ）、Ｎ－フェニルモルホリン（２０ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。その後、イオン交換水（７ｍｇ）、Ｎ－フェニルモルホリン（４１ｍｇ）を添加し、攪拌した後、３－アミノプロパン酸水溶液（３６ｍｇ）、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２．５ｍＬ）を添加して室温にて３時間反応させた。反応終了後、トルエン（１００ｇ）を添加した後、濃縮して共沸脱水した。その後、濃縮液をトルエン（３０ｇ）で希釈し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、ろ液にヘキサン（３０ｇ）を添加して室温にて３０分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したトルエン（５０ｇ）に再溶解し、ヘキサン（３０ｇ）を添加して室温にて３０分攪拌した。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）を含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２２）を得た。収量１．３ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１６Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、２．４９ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）３．６４ｐｐｍ（ｍ、約７，６００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、８Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、６Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、１８Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１６Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、２．４９ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）３．６４ｐｐｍ（ｍ、約７，６００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、８Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、６Ｈ）
【0290】
［実施例５－６］
化合物（ｐ２３）の合成
化合物（ｐ２３）の合成
【0291】
【化75】
【0292】
実施例５－５で得られた化合物（ｐ２２）（１．０ｇ）をイオン交換水（４．５ｇ）に溶解し、６Ｎ塩酸（０．４６ｇ）を添加して、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、塩化ナトリウム（１．０ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを７．１０に調整した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）含有のクロロホルム（３０ｇ）を添加して室温にて２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度ＢＨＴ（６ｍｇ）含有のクロロホルム（３０ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を合わせて４０℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２３）を得た。収量５３２ｍｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度は８４％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１６Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、２．４９ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約７，６００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、８Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、６Ｈ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１６Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、２．４９ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．６８ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約７，６００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．０９ｐｐｍ（ｓ、１２Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、４Ｈ）、８．３２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、８Ｈ）、９．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、６Ｈ）
【0293】
【表1】
【0294】
［実施例６］
血清中での安定性試験
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清１ｍＬを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。３７℃で９６時間インキュベ－ション後、２００μＬをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、ＧＰＣ分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 ＝ (試験前のメインフラクションのピーク面積％ － 試験後のメインフラクションのピーク面積％) ÷ (試験前メインフラクションのピーク面積％) × １００
結果を以下の表２に示す。
血清中での安定性試験
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清１ｍＬを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。３７℃で９６時間インキュベ－ション後、２００μＬをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、ＧＰＣ分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 ＝ (試験前のメインフラクションのピーク面積％ － 試験後のメインフラクションのピーク面積％) ÷ (試験前メインフラクションのピーク面積％) × １００
結果を以下の表２に示す。
【0295】
【表2】
【0296】
表２によれば、分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ２）、（ｐ１６）は、非分解性のポリエチレングリコール誘導体であるメトキシＰＥＧ４０ｋＤａと同様に、血清中において分解はみられなかった。つまり、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体が血中では安定であることが示された。
【0297】
［実施例７］
細胞を用いた分解性試験
培地ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳ Ｐｎ／Ｓｔ）１０ｍＬを用いて、１００ｍｍディッシュにＲＡＷ２６４．７を１０×１０６ｃｅｌｌ播種し、３７℃で２４時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地に交換し、３７℃で９６時間培養した。培養後、細胞を１％ＳＤＳ溶液にて溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地のみで３７℃で９６時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣ分析を行い、実施例７と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表３に示す。
細胞を用いた分解性試験
培地ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳ Ｐｎ／Ｓｔ）１０ｍＬを用いて、１００ｍｍディッシュにＲＡＷ２６４．７を１０×１０６ｃｅｌｌ播種し、３７℃で２４時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地に交換し、３７℃で９６時間培養した。培養後、細胞を１％ＳＤＳ溶液にて溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地のみで３７℃で９６時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣ分析を行い、実施例７と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表３に示す。
【0298】
【表3】
【0299】
表３によれば、分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ２）及び（ｐ１６）は、細胞内にて効果的に分解し（分解率９９％）、（ｐ２）においては分子量４万から２万に、（ｐ１６）においては分子量４万から１万に分解することが確認できた。これら分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞培養で用いた培地では分解しないことから、細胞内で特異的に分解されたことが確認できた。一方で、非分解性のポリエチレングリコール誘導体であるメトキシＰＥＧ４０ｋＤａにおいては、いずれも細胞内での分解はみられなかった。
【0300】
［実施例８］
サーモンカルシトニン（ｓＣＴ）のＰＥＧ化
アミノ酸配列：
ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧ ＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱ ＴＹＰＲＴＮＴＧＳＧ ＴＰ（配列番号：１）
であるサーモンカルシトニン（ｓＣＴ）（０．５ｍｇ、１．５×１０－7モル、株式会社ピーエイチジャパン製）に１００ｍＭほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を添加して、ｓＣＴ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬに調整し、実施例１で得られた化合物（ｐ３）（０．６ｍｇ、１．５×１０－８モル）を加え、４℃にて２４時間反応させた。その後、反応液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて透析し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（５ｍＬ、ＧＥヘルスケア製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製することにより、ＰＥＧ化ｓＣＴを得た。モル収率は３９％であった。
サーモンカルシトニン（ｓＣＴ）のＰＥＧ化
アミノ酸配列：
ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧ ＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱ ＴＹＰＲＴＮＴＧＳＧ ＴＰ（配列番号：１）
であるサーモンカルシトニン（ｓＣＴ）（０．５ｍｇ、１．５×１０－7モル、株式会社ピーエイチジャパン製）に１００ｍＭほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を添加して、ｓＣＴ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬに調整し、実施例１で得られた化合物（ｐ３）（０．６ｍｇ、１．５×１０－８モル）を加え、４℃にて２４時間反応させた。その後、反応液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて透析し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（５ｍＬ、ＧＥヘルスケア製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製することにより、ＰＥＧ化ｓＣＴを得た。モル収率は３９％であった。
【0301】
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析
装置：ＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」
検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８（ＧＬサイエンス）
移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡ－ＡＣＮ
グラジエント：Ｂ３０％（０ｍｉｎ）、Ｂ４０％（５ｍｉｎ）、Ｂ５０％（１５ｍｉｎ）、Ｂ１００％（１６ｍｉｎ）、Ｂ１００％（２０ｍｉｎ）の順に変更
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
上記ＲＰ－ＨＰＬＣ分析条件にて、ＰＥＧ化ｓＣＴの純度を算出した。
ＰＥＧ化ｓＣＴのＲＰＬＣ純度：９８％
装置：ＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」
検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８（ＧＬサイエンス）
移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡ－ＡＣＮ
グラジエント：Ｂ３０％（０ｍｉｎ）、Ｂ４０％（５ｍｉｎ）、Ｂ５０％（１５ｍｉｎ）、Ｂ１００％（１６ｍｉｎ）、Ｂ１００％（２０ｍｉｎ）の順に変更
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
上記ＲＰ－ＨＰＬＣ分析条件にて、ＰＥＧ化ｓＣＴの純度を算出した。
ＰＥＧ化ｓＣＴのＲＰＬＣ純度：９８％
【0302】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析
装置：Ｂｒｕｋｅｒ社製「ａｕｔｏｆｌｅｘ３」
サンプル：０．５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液
マトリクス：α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）飽和溶液（０．０１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ＝２：１）
サンプル（１μＬ）とマトリクス（１９μＬ）を混合し、１μＬをターゲットにスポット
上記ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析条件にて、ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量を測定した。
ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量：４８，５８５
マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）は２つの活性カーボネート基を有していることから、２分子のｓＣＴを結合することができる。ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量は、原料である化合物（ｐ３）の分子量に比べ、おおよそｓＣＴの２分子の分子量の分だけ増加していることが確認できた。
装置：Ｂｒｕｋｅｒ社製「ａｕｔｏｆｌｅｘ３」
サンプル：０．５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液
マトリクス：α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）飽和溶液（０．０１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ＝２：１）
サンプル（１μＬ）とマトリクス（１９μＬ）を混合し、１μＬをターゲットにスポット
上記ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析条件にて、ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量を測定した。
ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量：４８，５８５
マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）は２つの活性カーボネート基を有していることから、２分子のｓＣＴを結合することができる。ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量は、原料である化合物（ｐ３）の分子量に比べ、おおよそｓＣＴの２分子の分子量の分だけ増加していることが確認できた。
【0303】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
キット：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ゲル濃度４－１２％）
染色液：クマシーブリリアントブルー溶液（ＣＢＢ溶液）またはヨウ素染色溶液（ＢａＣｌ２＋Ｉ２溶液）
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥキットの推奨測定条件に従い、ＰＥＧ化ｓＣＴの評価を行った。ＰＥＧ化ｓＣＴにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるＣＢＢ染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられたことから、ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）がｓＣＴに結合していることを確認できた。
キット：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ゲル濃度４－１２％）
染色液：クマシーブリリアントブルー溶液（ＣＢＢ溶液）またはヨウ素染色溶液（ＢａＣｌ２＋Ｉ２溶液）
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥキットの推奨測定条件に従い、ＰＥＧ化ｓＣＴの評価を行った。ＰＥＧ化ｓＣＴにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるＣＢＢ染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられたことから、ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）がｓＣＴに結合していることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【0304】
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体であり、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される。
【配列表】