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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-07
(45)【発行日】2025-02-18
(54)【発明の名称】Ｎｒ４ａ１拮抗薬を用いた鎮痛薬
(51)【国際特許分類】
C07D 239/91 20060101AFI20250210BHJP
A61K 31/517 20060101ALI20250210BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250210BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20250210BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250210BHJP
【ＦＩ】
C07D239/91 CSP
A61K31/517
A61P29/00
A61P25/04
A61P35/00
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022536292
(86)(22)【出願日】2021-07-07
(86)【国際出願番号】 JP2021025590
(87)【国際公開番号】W WO2022014433
(87)【国際公開日】2022-01-20
【審査請求日】2024-04-01
(31)【優先権主張番号】P 2020120069
(32)【優先日】2020-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３１年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）、橋渡し研究戦略推進プログラム、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】305060567
【氏名又は名称】国立大学法人富山大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504258527
【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学
(73)【特許権者】
【識別番号】592019213
【氏名又は名称】学校法人昭和大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼▲崎▼ 一朗
(72)【発明者】
【氏名】豊岡 尚樹
(72)【発明者】
【氏名】岡田 卓哉
(72)【発明者】
【氏名】栗原 崇
(72)【発明者】
【氏名】合田 浩明
【審査官】宮田 透
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２１２７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５１４６３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５０４１４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５０８３８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０３２９０２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】REGISTRY[online]，2015年07月05日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1795010-99-9
【文献】REGISTRY[online]，2011年09月09日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1330600-74-2
【文献】REGISTRY[online]，2011年09月01日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1326463-27-7
【文献】REGISTRY[online]，2007年03月01日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号924105-05-5
【文献】REGISTRY[online]，2009年02月25日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1111451-36-5
【文献】REGISTRY[online]，2008年06月27日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1031169-80-8
【文献】REGISTRY[online]，2008年04月10日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1013582-50-7
【文献】REGISTRY[online]，2011年04月27日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1286441-93-7
【文献】REGISTRY[online]，2008年04月10日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1013308-53-6
【文献】REGISTRY[online]，2008年04月10日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1013582-58-5
【文献】REGISTRY[online]，2018年03月04日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号2184216-83-7
【文献】REGISTRY[online]，2008年04月10日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1013494-30-8
【文献】REGISTRY[online]，2009年01月26日，[retrieved on 2021.08.04], Retrieved from:STN, CAS登録番号1095838-76-8
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
次式（Ｉ）：【化1】
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項2】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水酸基である請求項１記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項3】
前記式（Ｉ）において、Ｒ４が置換又は無置換のＣ３－１２－アルキル基、又は置換又は無置換のＣ７－１２－アラルキル基である請求項１又は２記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
【請求項5】
がん患者に適用される請求項４記載の鎮痛薬。
【請求項6】
次式（II）：【化2】
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
【請求項7】
がん患者に適用される請求項６記載の鎮痛薬。
【請求項8】
次式（Ｉ）：
【化3】
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
【請求項9】
次式（Ｉ）：
【化4】
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗がん薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｎｒ４ａ１拮抗薬を用いた鎮痛薬に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは１９８１年以来、日本人の死亡原因の第１位を占める。がん患者は年齢とともに増加し、７０歳以上では３～４人に１人はがん患者であるといわれている。
【0003】
抗がん薬の投与による共通の副作用としての骨髄抑制や嘔吐、脱毛などはがん患者を苦しませる結果となっている。抗がん薬の中には、例えばパクリタキセルなどのタキサン類、オキサリプラチンなどの白金類のように、手足唇の痛み・しびれ・冷感など末梢神経障害性疼痛を生じるものもある。更に、がん患者においては精神的や社会的な痛みに加えて、身体的痛み、いわゆる「がん性疼痛」が大きな問題となっている。ここでいうがん性疼痛とは、がん原発巣の痛み、骨転移による痛み、がん細胞の神経への浸潤に伴う神経障害性疼痛などである。
【0004】
がん患者の実に７０％近くが痛みを経験する。がん性疼痛緩和はＷＨＯが定める３段階除痛ラダーにしたがい、主として、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）やアセトアミノフェンのような非オピオイド系鎮痛薬とコデイン、モルヒネ、フェンタニルなどのオピオイド系鎮痛薬を組み合わせて治療が行われる。がん性疼痛の８０％は、適切な鎮痛薬の使用により、多くの患者で除痛効果が得られている一方で、がん細胞の神経への浸潤による神経障害性疼痛、骨転移痛、消化管閉塞にはオピオイドが効きにくいとされる。また、オピオイドによる便秘・嘔吐・依存性・耐性などの副作用は更に患者を苦しめる。したがって、これら疼痛に有効な鎮痛薬の開発が望まれている。
【0005】
このように、現状において、がん及びがん性疼痛に対する抗がん薬及びオピオイド系鎮痛薬の２種類の薬剤の投与とそれに伴う強い副作用は、がん患者を苦しめる結果となっている。したがって、１つの薬で鎮痛作用と抗がん作用を併せ持ち、かつ従来の鎮痛薬・抗がん薬と比較して副作用の少ない、「制がん鎮痛薬」の開発は、がん患者にとってのクオリティ・オブ・ライフを大いに高める画期的な治療薬になる可能性がある。しかしながら現在のところ、１つの薬で鎮痛作用と抗がん作用を併せ持つ薬は存在しない。
【0006】
一方、核内受容体のひとつである「Nuclear receptor subfamily 4、 group A member 1、 Ｎｒ４ａ１」について、特許文献１には、Ｎｒ４ａ１の活性や発現を調節する作用物質を同定する方法が開示されている。特許文献１には、がん細胞の成長を阻害することは記載されているが、鎮痛効果については何ら記載されていない。
【0007】
本発明者らは、先にＮｒ４ａ１拮抗薬の獲得を目指し、Ｎｒ４ａ１タンパクと既知アンタゴニストＴＭＰＡの複合体構造（ＰＤＢ；３Ｖ３Ｑ）を基に、「３次元ファーマコホアベースの絞り込み」、「分子ドッキングシミュレーションによる絞り込み」、及び「化学特性に基づいた分子類似性解析」からなる多段階イン・シリコスクリーニングを行い、既存の化合物データベースより、１０化合物を新規Ｎｒ４ａ１アンタゴニスト候補化合物として同定し、そのうちの１化合物であるＮＲＡ－８がＰＡＣＡＰによる疼痛を抑制することを報告した（非特許文献１）。しかしながら、非特許文献１には、いずれの化合物についても構造は開示されておらず、抗がん作用については何ら言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特表２０１８－５３６３８４号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】磯 芹奈、高原理行、合田浩明、宮田篤郎、栗原 崇、豊岡尚樹、▲高▼▲崎▼一朗（ポスター発表）；新規鎮痛薬の開発を目指した核内受容体Nr4a1アンタゴニストの創製；第90回日本薬理学会年会、2017年3月15-17日、長崎（長崎ブリックホールほか）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、ＮＳＡＩＤｓやオピオイドとは異なる作用機序をもち、１つの薬で鎮痛作用と抗がん作用を併せ持つ疼痛治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、標的分子の選定のため、慢性疼痛とがん細胞の増殖・浸潤に共通する分子を探索したところ、候補分子として核内受容体のひとつであるＮｒ４ａ１を同定した。すなわち、神経障害性疼痛モデルマウスの脊髄後角における遺伝子発現と、種々のがん細胞株における遺伝子発現を、GeneChipマイクロアレイ法を用いて網羅的に解析したところ、疼痛モデルマウスとがん細胞において共通して発現が上昇する遺伝子としてＮｒ４ａ１ ｍＲＮＡを同定することができた。
【0012】
そこで、本発明者らは、次式：
で示されるＮＲＡ－８のＮｒ４ａ１阻害効果が、すでに報告されているＮｒ４ａ１拮抗薬であるＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨと比較して同等あるいはそれよりも強力であることから、ＮＲＡ－８より強い活性を示す化合物の獲得を目指し、ＮＲＡ－８の構造をもとに構造展開を行った。ＮＢＲＥ－Ｌｕｃレポーターベクター（ＮＢＲＥ；Ｎｒ４ａ１結合ＤＮＡドメイン）を用いたスクリーニングにおいて、元化合物である化合物ＮＲＡ－８と同等以上の効力を示す化合物として、多くの１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン誘導体の獲得に成功し、本発明を完成させるに至った。
【化1】
【0013】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水酸基、メルカプト基、Ｃ１－６－アルコキシ基、Ｃ１－６－ハロアルコキシ基、アミノ基、Ｃ１－６－アルキルアミノ基又はジＣ１－６－アルキルアミノ基であり；Ｒ２は水酸基、メルカプト基、Ｃ１－６－アルコキシ基、Ｃ１－６－ハロアルコキシ基、アミノ基、Ｃ１－６－アルキルアミノ基又はジＣ１－６－アルキルアミノ基であり；Ｒ３はハロゲン原子、ニトロ基、カルボキシル基、Ｃ１－６－アルコキシ－カルボニル基又はカルボキシ－Ｃ１－６－アルキル基であり；Ｒ４は置換又は無置換のＣ３－１２－炭化水素基である。）
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
（２）前記式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水酸基である前記（１）に記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
（３）前記式（Ｉ）において、Ｒ４が置換又は無置換のＣ３－１２－アルキル基、又は置換又は無置換のＣ７－１２－アラルキル基である前記（１）又は（２）に記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
（４）前記（１）～（３）のいずれかに記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
（５）がん患者に適用される前記（４）に記載の鎮痛薬。
（６）次式（II）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は請求項１に記載の前記式（Ｉ）と同義であり；Ｒ４’は置換又は無置換のＣ２－１２－炭化水素基である。）
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
（７）がん患者に適用される前記（６）に記載の鎮痛薬。
（１）次式（Ｉ）：
【化2】
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
（２）前記式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水酸基である前記（１）に記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
（３）前記式（Ｉ）において、Ｒ４が置換又は無置換のＣ３－１２－アルキル基、又は置換又は無置換のＣ７－１２－アラルキル基である前記（１）又は（２）に記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物。
（４）前記（１）～（３）のいずれかに記載の化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
（５）がん患者に適用される前記（４）に記載の鎮痛薬。
（６）次式（II）：
【化3】
で示される化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する鎮痛薬。
（７）がん患者に適用される前記（６）に記載の鎮痛薬。
【発明の効果】
【0014】
本発明の化合物は、１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン骨格の２位にハロゲン原子で置換されたフェニル基を、３位に置換又は無置換の炭化水素基を有する化合物であり、鎮痛薬として有用であり、当該鎮痛薬はＮＳＡＩＤｓやオピオイドとは異なる作用機序をもつ新しい疼痛治療薬である。
【0015】
また、本発明の化合物は、鎮痛作用と抗がん作用を併せ持つので、従来の抗がん薬による骨髄抑制などの副作用を回避できるがん治療が可能となる。また、ＮＳＡＩＤｓに見られる消化性潰瘍、オピオイドに見られる便秘などの有害作用を回避した疼痛治療が可能となる。がんと疼痛の双方において治療効果が期待できるため、多剤併用の必要性が少なくなることから、予期しない有害作用の出現を回避することができ、更に、難治性がん性疼痛患者のクオリティ・オブ・ライフの改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0018】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ１又はＲ２で表されるＣ１－６－アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基が挙げられる。
【0019】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ１又はＲ２で表されるＣ１－６－ハロアルコキシ基としては、例えばトリフルオロメトキシ基が挙げられる。
【0020】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ１又はＲ２で表されるＣ１－６－アルキルアミノ基としては、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ－ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、シクロプロピルアミノ基、シクロブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基が挙げられる。
【0021】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ１又はＲ２で表されるジＣ１－６－アルキルアミノ基としては、例えばジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、メチルエチルアミノ基が挙げられる。
【0022】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ３で表されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【0023】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ３で表されるＣ１－６－アルコキシ－カルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、シクロプロピルオキシカルボニル基、シクロブチルオキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基が挙げられる。
【0024】
前記式（Ｉ）及び（II）においてＲ３で表されるカルボキシ－Ｃ１－６－アルキル基としては、例えばカルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基が挙げられる。
【0025】
前記式（Ｉ）においてＲ４で表されるＣ３－１２－炭化水素基としては、例えば、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等の直鎖状又は分岐状のＣ３－１２－アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等のＣ３－１２－シクロアルキル基；１－プロペニル基、アリル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オレイル基等のＣ３－１２－アルケニル基；１－プロピニル基、２－プロピニル（プロパルギル）基、３－ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等のＣ３－１２－アルキニル基；Ｃ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ－（ここで、ｎ＝１～６の整数である。）、ナフチルメチル基、ナフチルエチル基等のＣ７－１２－アラルキル基；フェニル基、ナフチル基等の芳香族炭化水素基；アダマンチル基等の橋かけ環炭化水素基；スピロ炭化水素基等が挙げられる。
【0026】
前記式（II）においてＲ４’で表されるＣ２－１２－炭化水素基としては、前記のＣ３－１２－炭化水素基の他にエチル基を加えたものが挙げられる。
【0027】
前記のＣ３－１２－炭化水素基及びＣ２－１２－炭化水素基は、例えば、Ｃ１－６－アルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基）、メチレンジオキシ基、Ｃ２－６－アルケニルオキシ基、アラルキルオキシ基（例えばベンジルオキシ基、４－メチルベンジルオキシ基、３－メチルベンジルオキシ基、２－メチルベンジルオキシ基、４－フルオロベンジルオキシ基、３－フルオロベンジルオキシ基、４－クロロベンジルオキシ基、３－クロロベンジルオキシ基）、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、Ｃ１－６－ハロアルキル基、Ｃ１－６－ハロアルコキシ基、アシル基（例えばホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基等のＣ１－６－脂肪族アシル基；ベンゾイル基、トルオイル基等のアロイル基）、アシルオキシ基（例えばホルミルオキシ基、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基等のＣ１－６－脂肪族アシルオキシ基；ベンゾイルオキシ基、トルオイルオキシ基等のアロイルオキシ基）、水酸基、カルボキシル基、アセトアミド基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基等から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。
【0028】
前記式（Ｉ）又は（II）においてＲ４又はＲ４’で表される置換された炭化水素基としては、２－ヒドロキシエチル基、２－メトキシエチル基、３－ヒドロキシプロピル基、３－メトキシプロピル基、４－ヒドロキシブチル基、４－メトキシブチル基、３－（ｐ－メトキシフェニル）プロピル基、３－（ｐ－フルオロフェニル）プロピル基、３－（ｐ－クロロフェニル）プロピル基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【0029】
前記式（Ｉ）又は（II）で示される化合物としては、Ｒ１及びＲ２が水酸基、Ｒ３がハロゲン原子、例えば塩素原子、Ｒ４が置換又は無置換のＣ３－８－アルキル基、又は置換又は無置換のＣ７－１１－アラルキル基である化合物が好ましい。
【0030】
前記式（Ｉ）で示される化合物は新規化合物であり、前記式（II）で示される化合物は、前記式（Ｉ）で示される新規化合物の他に公知化合物を包含する。
【0031】
前記式（Ｉ）又は（II）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。
【0032】
前記式（Ｉ）又は（II）で示される化合物又はその塩の溶媒和物としては、例えば水和物が挙げられる。
【0033】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水酸基、Ｒ３がハロゲン原子、例えば塩素原子である化合物は、例えば、以下に示すようにして製造することができる。
（式中、Ｒ４は前記式（Ｉ）と同義である。）
【化4】
【0034】
すなわち、アミン体（Ｒ４－ＮＨ２）とｏ－ニトロ安息香酸を縮合させて、ｏ－ニトロ安息香酸アミドに変換後、還元し、３，４－ジ（ベンジルオキシ）－５－クロロベンズアルデヒドと反応させてベンジル体を得た後、脱ベンジル化して目的物を得ることができる。
【0035】
Ｒ１及びＲ２がＣ１－６－アルコキシ基又はＣ１－６－ハロアルコキシ基のように、ベンジル基で保護する必要がない場合には、３，４－ジ（ベンジルオキシ）－５－クロロベンズアルデヒドの代わりに、３，４－ジ（Ｃ１－６－アルコキシ又はＣ１－６－ハロアルコキシ）－５－クロロベンズアルデヒドを用いることにより直接目的物を得ることができる。
【0036】
前記式（II）で示される化合物も前記と同様にして得ることができる。
【0037】
前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ｎ－ヘキサン－酢酸エチル、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。
【0038】
前記の化合物は、鎮痛薬及び／又は抗がん薬として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【0039】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。
【0040】
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【0041】
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【0042】
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。
【0043】
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【0044】
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【0045】
注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。前記式（Ｉ）又は（II）の化合物の注射剤中における割合は、５～５０重量％の間で変動させ得るが、これに限定されるものではない。
【0046】
その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【0047】
製剤化した鎮痛薬及び／又は抗がん薬は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１～４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。
【0048】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）又は（II）の化合物の重量として、例えば０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～５００ｍｇを、１日数回に分けて服用することが適当である。
【0049】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）又は（II）の化合物の重量として、例えば０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。
【0050】
本発明の化合物は、鎮痛作用と抗がん作用を併せ持ち、鎮痛作用と抗がん作用に必要な用量の乖離は小さいので、がん患者に適用すると、多剤併用の必要性が少なくなることから、予期しない有害作用の出現を回避することができ、更に、難治性がん性疼痛患者のクオリティ・オブ・ライフの改善が期待できる。本発明の化合物は、神経障害性疼痛モデル及び骨がん性疼痛モデルに対し鎮痛作用を示し、また種々がん細胞の増殖・生存・遊走を抑制したことから、難治性の慢性疼痛に対し鎮痛薬として、種々のがんに対して抗がん薬としてそれぞれ単独でも治療効果が期待できる。特に骨がん性疼痛モデルマウスの疼痛反応に対して良好な鎮痛効果を示した（図８）。本モデルマウスの疼痛反応に対してオピオイドが効きにくいことは既に報告されており（Minami et al.、J Pharmacol Sci.、111(1)、60-72、2009）、臨床においてもがん細胞の骨転移痛にはオピオイドが効きにくいとされる。したがって本発明の化合物は、オピオイドが効きにくい転移性骨腫瘍に伴う疼痛に対しての治療効果が期待できる。
【0051】
がんと診断されてからの５年生存率は、すい臓がん８．９％、肺がん２９．５％、脳・中枢神経系３４．１％であり、これらは他の腫瘍と比較して著しく低い（国立がん研究センター統計による）。外科的手術において取りきれていなかった腫瘍が再増殖する「再発」又は別の部位でがんが見つかる「転移」によるものであるが、５年生存率の低さは、これら腫瘍の再発・転移に対する薬物治療が現状において完全でないことを示す。本発明の化合物は、すい臓がん細胞Ｐａｎｃ１、肺がん細胞株Ａ５４９、及び脳腫瘍（グリオーマ）細胞Ｕ８７、Ｕ２５１をはじめとする種々がん細胞において増殖・生存・遊走を強く抑制することができた（図５及び図９）。また、Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいても、本発明の化合物は、経口投与で腫瘍増殖抑制効果を示した（図１０）。以上のことから、外科的手術において腫瘍を取り除いた後のがん再発・転移を予防するために用いることが期待でき、５年生存率の改善につながることが期待できる。
【0052】
近年、本発明のターゲット分子である核内受容体Ｎｒ４ａ１は、「ＰＤ－Ｌ１の発現」（Karki et al.、Cancer Res 80(5)、1011-1023、2020）及び「Ｔ細胞の疲弊化」（Liu et al.、Nature 567、525-529、2019; Chen et al.、Nature 567、530-534、2019）に関与するという報告がされており、本発明の化合物によりＮｒ４ａ１を阻害すると、「がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現減少」及び「Ｔ細胞の活性化」を介して、がん免疫療法を増強する可能性が期待できる。
【0053】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０２０－１２００６９の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
【実施例】
【0054】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【0055】
［実施例１］３－置換－２－フェニル－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン誘導体の合成
【化5】
【0056】
Ａｒ雰囲気下、市販のｏ－ニトロ安息香酸（１００ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に市販のアミン２ａ－ｉ（０．６０ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１４９ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（９２ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０８ｍＬ，０．６０ｍｍｏｌ）を氷冷下、順次加えた後、室温で２４時間撹拌した。その後、１０％ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（１ｍＬ×３回）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：アセトン＝３：１～１：１）により精製することでアミド３ａ－ｉを得た。
【0057】
アミド３ａ－ｉ（０．４８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液（３ｍＬ）に１０％パラジウム活性炭素（５ｍｇ）を室温にて加えた後、水素置換を行い、室温で２時間撹拌した。その後、セライト濾過により触媒を取り除き、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去することでアニリンを得た。得られたアニリンは精製を行うことなく次の反応に用いた。Ａｒ雰囲気下、得られたアニリンのアセトニトリル溶液（３ｍＬ）に５－クロロ－３，４－ジベンジルオキシベンズアルデヒド（１６８ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）、シアヌル酸クロリド（１８ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を室温にて順次加えた後、室温で２４時間撹拌した。その後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：アセトン＝２：１～１：１）により精製することで１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン誘導体４ａ－ｉを得た。
【0058】
１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン誘導体４ａ－ｉのメタノール溶液（３ｍＬ）に２０％水酸化パラジウム活性炭素（３ｍｇ）を室温にて加えた後、水素置換を行い、室温で４時間撹拌した。その後、セライト濾過により触媒を取り除き、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝５０：１～１０：１）により精製することで目的とするＮＲＡ－８０７～ＮＲＡ－８１５を得た。
【0059】
３－ブチル－２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８０７）
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 0.87 (3H、 t、 J = 7.4 Hz)、 1.32 (2H、 sext、 J = 7.4 Hz)、1.46-1.64 (2H、 m)、 2.75-2.82 (1H、 m)、 3.94-4.04 (1H、 m)、 5.78 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.41 (1H、 s)、 6.65 (1H、 d、 J = 7.6 Hz)、 6.70 (1H、 td、 J = 7.6、 1.3 Hz)、6.82 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.90 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、7.19 (1H、 td、 J = 7.6、 1.3 Hz)、 7.75 (1H、dd、 J = 7.6、 1.3 Hz)、 8.49 (1H、s)
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 0.87 (3H、 t、 J = 7.4 Hz)、 1.32 (2H、 sext、 J = 7.4 Hz)、1.46-1.64 (2H、 m)、 2.75-2.82 (1H、 m)、 3.94-4.04 (1H、 m)、 5.78 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.41 (1H、 s)、 6.65 (1H、 d、 J = 7.6 Hz)、 6.70 (1H、 td、 J = 7.6、 1.3 Hz)、6.82 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.90 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、7.19 (1H、 td、 J = 7.6、 1.3 Hz)、 7.75 (1H、dd、 J = 7.6、 1.3 Hz)、 8.49 (1H、s)
【0060】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－イソプロピル－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８０８）
1H-NMR (400 MHz、DMSO-d6) δ: 1.00 (3H、 d、 J = 6.9 Hz)、 1.26 (3H、 d、 J = 6.9 Hz)、4.73 (1H、 sept、 J = 6.9 Hz)、5.82 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、 6.40 (1H、 s)、 6.58 (1H、 d、 J = 7.6 Hz)、 6.73 (1H、 t、 J = 7.6 Hz)、 6.81 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、6.89 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、7.14 (1H、 td、 J = 7.6、 2.0 Hz)、 7.43 (1H、dd、 J = 7.6、 2.0 Hz)、 8.43 (1H、 br)
３－ベンジル－２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８０９）
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 3.78 (1H、 d、 J = 15.6 Hz)、 5.48 (1H、 d、 J = 15.6 Hz)、5.63 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、 6.37 (1H、 s)、 6.67 (1H、 d、 J = 7.2 Hz)、 6.75 (1H、 t、 J = 7.2 Hz)、 6.79 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、 6.83 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、7.20-7.32 (6H、 m)、 7.84 (1H、 dd、 J = 7.2、 1.8 Hz)、 8.48 (1H、 br)
1H-NMR (400 MHz、DMSO-d6) δ: 1.00 (3H、 d、 J = 6.9 Hz)、 1.26 (3H、 d、 J = 6.9 Hz)、4.73 (1H、 sept、 J = 6.9 Hz)、5.82 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、 6.40 (1H、 s)、 6.58 (1H、 d、 J = 7.6 Hz)、 6.73 (1H、 t、 J = 7.6 Hz)、 6.81 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、6.89 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、7.14 (1H、 td、 J = 7.6、 2.0 Hz)、 7.43 (1H、dd、 J = 7.6、 2.0 Hz)、 8.43 (1H、 br)
３－ベンジル－２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８０９）
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 3.78 (1H、 d、 J = 15.6 Hz)、 5.48 (1H、 d、 J = 15.6 Hz)、5.63 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、 6.37 (1H、 s)、 6.67 (1H、 d、 J = 7.2 Hz)、 6.75 (1H、 t、 J = 7.2 Hz)、 6.79 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、 6.83 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、7.20-7.32 (6H、 m)、 7.84 (1H、 dd、 J = 7.2、 1.8 Hz)、 8.48 (1H、 br)
【0061】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－フェネチル－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８１０）
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 2.76-2.79 (1H、 m)、 2.92-3.07 (2H、 m)、4.05-4.11 (1H、 m)、 5.71 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、6.34 (1H、 s)、 6.66 (1H、 d、 J = 7.5 Hz)、6.72 (1H、 t、 J = 7.5 Hz)、6.82 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、 6.89 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、 7.15-7.28 (6H、 m)、 7.79 (1H、 dd、 J = 7.5、 2.0 Hz)、8.54 (1H、 br)
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 2.76-2.79 (1H、 m)、 2.92-3.07 (2H、 m)、4.05-4.11 (1H、 m)、 5.71 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、6.34 (1H、 s)、 6.66 (1H、 d、 J = 7.5 Hz)、6.72 (1H、 t、 J = 7.5 Hz)、6.82 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、 6.89 (1H、 d、 J = 2.0 Hz)、 7.15-7.28 (6H、 m)、 7.79 (1H、 dd、 J = 7.5、 2.0 Hz)、8.54 (1H、 br)
【0062】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－（３－フェニルプロピル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８１１）
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 1.81-2.00 (2H、 m)、 2.62 (2H、 t、 J = 7.6 Hz)、 2.84-2.91 (2H、 m)、3.92-3.99 (1H、 m)、5.78 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、6.66 (1H、 d、 J = 7.7 Hz)、 6.71 (1H、 t、 J = 7.7 Hz)、 7.13 (1H、 t、 J = 7.7 Hz)、7.17-7.26 (5H、 m)、 7.78 (1H、 d、 J = 7.7 Hz)、8.56 (1H、 br)
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 1.81-2.00 (2H、 m)、 2.62 (2H、 t、 J = 7.6 Hz)、 2.84-2.91 (2H、 m)、3.92-3.99 (1H、 m)、5.78 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、6.66 (1H、 d、 J = 7.7 Hz)、 6.71 (1H、 t、 J = 7.7 Hz)、 7.13 (1H、 t、 J = 7.7 Hz)、7.17-7.26 (5H、 m)、 7.78 (1H、 d、 J = 7.7 Hz)、8.56 (1H、 br)
【0063】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－（４－フェニルブチル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８１２）
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 1.62-1.65 (5H、 m)、 2.03-2.08 (1H、 m)、2.60-2.61 (1H、 m)、 3.98-4.05 (1H、 m)、 5.75 (1H、 J = 2.7 Hz)、 6.64 (1H、 J = 7.7 Hz)、 6.79 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、6.87 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、 7.10-7.25 (6H、 m)、7.77 (1H、 dd、 J = 7.7、 1.8 Hz)、8.52 (2H、br)
1H-NMR (400 MHz、 DMSO-d6) δ: 1.62-1.65 (5H、 m)、 2.03-2.08 (1H、 m)、2.60-2.61 (1H、 m)、 3.98-4.05 (1H、 m)、 5.75 (1H、 J = 2.7 Hz)、 6.64 (1H、 J = 7.7 Hz)、 6.79 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、6.87 (1H、 d、 J = 1.8 Hz)、 7.10-7.25 (6H、 m)、7.77 (1H、 dd、 J = 7.7、 1.8 Hz)、8.52 (2H、br)
【0064】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－（３－（ｐ－メトキシフェニル）プロピル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８１３）
1H-NMR (400 MHz、Acetone-d6) δ: 1.79-1.98 (2H、m)、 2.55 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、 2.82-2.90 (1H、 m)、 3.73 (3H、 s)、3.88-3.96 (1H、 m)、5.77 (1H、 d、 J = 1.6 Hz)、6.66 (1H、 d、 J = 8.0 Hz)、 6.70 (1H、 t、 J = 8.0 Hz)、 6.78-6.82 (3H、 m)、 6.87 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 7.08 (1H、 d、 J = 8.0 Hz)、7.20 (1H、 td、 J = 1.6 Hz)、7.77 (1H、 dd、 J = 8.0、 1.6 Hz)
1H-NMR (400 MHz、Acetone-d6) δ: 1.79-1.98 (2H、m)、 2.55 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、 2.82-2.90 (1H、 m)、 3.73 (3H、 s)、3.88-3.96 (1H、 m)、5.77 (1H、 d、 J = 1.6 Hz)、6.66 (1H、 d、 J = 8.0 Hz)、 6.70 (1H、 t、 J = 8.0 Hz)、 6.78-6.82 (3H、 m)、 6.87 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 7.08 (1H、 d、 J = 8.0 Hz)、7.20 (1H、 td、 J = 1.6 Hz)、7.77 (1H、 dd、 J = 8.0、 1.6 Hz)
【0065】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－（３－（ｐ－フルオロフェニル）プロピル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８１４）
1H-NMR (400 MHz、Acetone-d6) δ: 1.80-2.00 (2H、m)、 2.63 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、 2.82-2.92 (1H、 m)、 3.91-3.98 (1H、m)、5.78 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.66 (1H、 d、 J = 8.0 Hz)、6.72 (1H、 t、 J = 8.0 Hz)、 6.81 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、6.88 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 7.00 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、7.19-7.24 (3H、 m)、 7.79 (1H、 dd、 J = 8.0、 1.2 Hz)、 8.12 (1H、 s)、 8.76 (1H、 s)
1H-NMR (400 MHz、Acetone-d6) δ: 1.80-2.00 (2H、m)、 2.63 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、 2.82-2.92 (1H、 m)、 3.91-3.98 (1H、m)、5.78 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.66 (1H、 d、 J = 8.0 Hz)、6.72 (1H、 t、 J = 8.0 Hz)、 6.81 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、6.88 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 7.00 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、7.19-7.24 (3H、 m)、 7.79 (1H、 dd、 J = 8.0、 1.2 Hz)、 8.12 (1H、 s)、 8.76 (1H、 s)
【0066】
２－（５－クロロ－３，４－ジヒドロキシフェニル）－３－（３－（ｐ－クロロフェニル）プロピル）－１，２，３，４－テトラヒドロキナゾリン－４－オン（ＮＲＡ－８１５）1H-NMR (400 MHz、Acetone-d6) δ: 1.80-2.00 (2H、 m)、 2.63 (2H、 t、 J = 8.0 Hz)、 2.83-2.94 (1H、 m)、 3.88-3.96 (1H、 m)、5.79 (1H、 d、 J = 1.6 Hz)、 6.40 (1H、 s)、 6.67 (1H、 t、 J = 8.0 Hz)、 6.72 (1H、 t、 J = 8.0 Hz)、 6.82 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、 6.88 (1H、 d、 J = 2.4 Hz)、7.18-7.28 (5H、 m)、 7.78 (1H、 dd、 J = 8.0、 1.2 Hz)、 8.56 (1H、 br)
【0067】
［実施例２］新規Ｎｒ４ａ１アンタゴニスト候補化合物の同定
本発明者らは新規Ｎｒ４ａ１拮抗薬の獲得を目指し、Ｎｒ４ａ１タンパクと既知アンタゴニストＴＭＰＡの複合体構造（ＰＤＢ；３Ｖ３Ｑ）を基に、「３次元ファーマコホアベースの絞り込み」、「分子ドッキングシミュレーションによる絞り込み」、及び「化学特性に基づいた分子類似性解析」からなる多段階イン・シリコスクリーニングを行い、既存の化合物データベースより、１０化合物（ナミキ商事株式会社から購入）を新規Ｎｒ４ａ１アンタゴニスト候補化合物として同定した。その後、ＮＢＲＥ－Ｌｕｃレポーターベクター（ＮＢＲＥ；Ｎｒ４ａ１結合ＤＮＡドメイン）を用いた一次スクリーニングを行った。すなわちＣＨＯ細胞を９６wellプレートに１×１０５個播種し、２４時間インキュベートした。ＮＢＲＥ－ＬｕｃレポーターベクターとＮｒ４ａ１発現ベクターをトランスフェクションし６時間インキュベートした。培地交換後、候補化合物（１０化合物）、及びすでに報告されているＮｒ４ａ１拮抗薬であるＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨを２０μＭとなるよう加え、１８時間インキュベートした。その後、ルシフェリンを加え、マイクロプレートリーダーにて発光を測定した。このようなレポーターアッセイにおいて、拮抗薬としての特性を持つ化合物として１種同定することができた（ＮＲＡ－８と命名）。ＮＲＡ－８のＮｒ４ａ１阻害効果は、すでに報告されているＮｒ４ａ１拮抗薬であるＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨと比較して同等あるいはそれよりも強力であった。レポーターアッセイの結果及びＮＲＡ－８の構造を図１に示す。
本発明者らは新規Ｎｒ４ａ１拮抗薬の獲得を目指し、Ｎｒ４ａ１タンパクと既知アンタゴニストＴＭＰＡの複合体構造（ＰＤＢ；３Ｖ３Ｑ）を基に、「３次元ファーマコホアベースの絞り込み」、「分子ドッキングシミュレーションによる絞り込み」、及び「化学特性に基づいた分子類似性解析」からなる多段階イン・シリコスクリーニングを行い、既存の化合物データベースより、１０化合物（ナミキ商事株式会社から購入）を新規Ｎｒ４ａ１アンタゴニスト候補化合物として同定した。その後、ＮＢＲＥ－Ｌｕｃレポーターベクター（ＮＢＲＥ；Ｎｒ４ａ１結合ＤＮＡドメイン）を用いた一次スクリーニングを行った。すなわちＣＨＯ細胞を９６wellプレートに１×１０５個播種し、２４時間インキュベートした。ＮＢＲＥ－ＬｕｃレポーターベクターとＮｒ４ａ１発現ベクターをトランスフェクションし６時間インキュベートした。培地交換後、候補化合物（１０化合物）、及びすでに報告されているＮｒ４ａ１拮抗薬であるＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨを２０μＭとなるよう加え、１８時間インキュベートした。その後、ルシフェリンを加え、マイクロプレートリーダーにて発光を測定した。このようなレポーターアッセイにおいて、拮抗薬としての特性を持つ化合物として１種同定することができた（ＮＲＡ－８と命名）。ＮＲＡ－８のＮｒ４ａ１阻害効果は、すでに報告されているＮｒ４ａ１拮抗薬であるＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨと比較して同等あるいはそれよりも強力であった。レポーターアッセイの結果及びＮＲＡ－８の構造を図１に示す。
【0068】
［実施例３］マウス疼痛モデルを用いた薬効評価１（ＰＡＣＡＰ髄腔内投与により誘発される機械的アロディニア）
ＰＡＣＡＰ（１００ｐｍｏｌ／５μＬ）をマウスに単回脊髄くも膜下腔内（ｉ．ｔ）投与すると、機械刺激に対する過敏現象（機械的アロディニア）を長期（投与後少なくとも３か月間）に渡って生じた（Yokai et al. Mol. Pain 2016. 12、 1-13.）。このＰＡＣＡＰ誘発長期機械的過敏現象の発症は、ＮＲＡ－８（１ｎｍｏｌ）の同時投与によってほぼ完全に抑制された（図２）。コントロールとして用いた既知Ｎｒ４ａ１拮抗薬ＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨも同様に発症を抑制したが、その効果はＮＲＡ－８が最も強力であった（図２）。前記化合物に代えて溶媒（ＶＥＨ：０．２％ＤＭＳＯ含有人工脳脊髄液）を使用した例では、ＰＡＣＡＰ誘発機械的過敏現象を抑制しなかった。
ＰＡＣＡＰ（１００ｐｍｏｌ／５μＬ）をマウスに単回脊髄くも膜下腔内（ｉ．ｔ）投与すると、機械刺激に対する過敏現象（機械的アロディニア）を長期（投与後少なくとも３か月間）に渡って生じた（Yokai et al. Mol. Pain 2016. 12、 1-13.）。このＰＡＣＡＰ誘発長期機械的過敏現象の発症は、ＮＲＡ－８（１ｎｍｏｌ）の同時投与によってほぼ完全に抑制された（図２）。コントロールとして用いた既知Ｎｒ４ａ１拮抗薬ＴＭＰＡ及びＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈＯＨも同様に発症を抑制したが、その効果はＮＲＡ－８が最も強力であった（図２）。前記化合物に代えて溶媒（ＶＥＨ：０．２％ＤＭＳＯ含有人工脳脊髄液）を使用した例では、ＰＡＣＡＰ誘発機械的過敏現象を抑制しなかった。
【0069】
マウスは雄性ｄｄＹ（６～１２週齢）を使用し、機械刺激に対する閾値は、ｖｏｎＦｒｅｙテストにより評価した。すなわち、Chaplanらの方法に従い、５０％逃避反射閾値（Threshold）を算出した（Chaplan et al.、 J. Neurosci. Meth. 53、 55-63、 1994）。化合物は、９９．７％ＤＭＳＯに溶解した後、人工脳脊髄液で希釈して調製した（ＤＭＳＯの最終濃度は０．２％）。
【0070】
［実施例４］マウス疼痛モデルを用いた薬効評価２（末梢神経障害性疼痛モデル：脊髄神経損傷により誘発される機械的アロディニア）
雄性ｄｄＹ（６～１２週齢）の第４腰髄脊髄神経を絹糸で結紮するspinal nerve ligation（ＳＮＬ）モデルを使用した。薬効評価は、神経結紮の１４日後に行った。ＮＲＡ－８（１００ｐｍｏｌ及び１ｎｍｏｌ）のｉ．ｔ．投与は、神経結紮によって誘発される機械的アロディニアを用量依存的に抑制した（図３）。一方で、溶媒（ＶＥＨ：０．２％ＤＭＳＯ含有人工脳脊髄液）を使用した例では、機械的アロディニアを抑制しなかった。
雄性ｄｄＹ（６～１２週齢）の第４腰髄脊髄神経を絹糸で結紮するspinal nerve ligation（ＳＮＬ）モデルを使用した。薬効評価は、神経結紮の１４日後に行った。ＮＲＡ－８（１００ｐｍｏｌ及び１ｎｍｏｌ）のｉ．ｔ．投与は、神経結紮によって誘発される機械的アロディニアを用量依存的に抑制した（図３）。一方で、溶媒（ＶＥＨ：０．２％ＤＭＳＯ含有人工脳脊髄液）を使用した例では、機械的アロディニアを抑制しなかった。
【0071】
［実施例５］マウス疼痛モデルを用いた薬効評価３（骨がん性疼痛モデル：大腿骨へのがん細胞の移植により誘発される機械的アロディニア）
雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６～１２週齢）の大腿骨骨髄（膝関節部位より）にＮＣＴＣ２４７２細胞を移植することによって惹起される機械的アロディニアに対する薬物の効果を検討した。ＮＲＡ－８はがん細胞移植の１０日目に経口投与した。ＮＲＡ－８（１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、がん細胞移植によって誘発される機械的アロディニアを用量依存的に抑制した（図４）。一方で、溶媒（ＶＥＨ：０．１％ＤＭＳＯ含有蒸留水）を使用した例では、機械的アロディニアを抑制しなかった。
雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６～１２週齢）の大腿骨骨髄（膝関節部位より）にＮＣＴＣ２４７２細胞を移植することによって惹起される機械的アロディニアに対する薬物の効果を検討した。ＮＲＡ－８はがん細胞移植の１０日目に経口投与した。ＮＲＡ－８（１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、がん細胞移植によって誘発される機械的アロディニアを用量依存的に抑制した（図４）。一方で、溶媒（ＶＥＨ：０．１％ＤＭＳＯ含有蒸留水）を使用した例では、機械的アロディニアを抑制しなかった。
【0072】
［実施例６］ヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１に対する抗がん活性
ヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１に対する抗がん活性を調べたところ、新規Ｎｒ４ａ１拮抗薬ＮＲＡ－８は、Ｐａｎｃ１細胞の増殖・生存・遊走を抑制した（図５）。一方で、既存の鎮痛薬（アスピリン（アセチルサリチル酸）、ジクロフェナク、プレガバリン）に抗がん活性（細胞増殖の抑制効果）は認められなかった（図６）。また、ＮＲＡ－８は、Ａ５４９細胞（ヒト肺がん）、Ｕ８７及びＵ２５１（ヒト脳腫瘍）、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺がん）、ＭＣＦ７（ヒト乳がん）などの種々のがん細胞株においても同様の抗がん活性を示した。
ヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１に対する抗がん活性を調べたところ、新規Ｎｒ４ａ１拮抗薬ＮＲＡ－８は、Ｐａｎｃ１細胞の増殖・生存・遊走を抑制した（図５）。一方で、既存の鎮痛薬（アスピリン（アセチルサリチル酸）、ジクロフェナク、プレガバリン）に抗がん活性（細胞増殖の抑制効果）は認められなかった（図６）。また、ＮＲＡ－８は、Ａ５４９細胞（ヒト肺がん）、Ｕ８７及びＵ２５１（ヒト脳腫瘍）、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺がん）、ＭＣＦ７（ヒト乳がん）などの種々のがん細胞株においても同様の抗がん活性を示した。
【0073】
更に、本発明者らはＮＲＡ－８より強い活性を示す化合物の獲得を目指し、ＮＲＡ－８の構造をもとに構造展開を行った。ＮＢＲＥ－Ｌｕｃレポーターベクター（ＮＢＲＥ；Ｎｒ４ａ１結合ＤＮＡドメイン）を用いたスクリーニングにおいて、元化合物である化合物ＮＲＡ－８と同等以上の効力を示す化合物として、ＮＲＡ－８１１の獲得に成功した。また、ＮＲＡ－８１１の構造をもとに更に強い活性を持つ化合物の構造展開を行い、レポーターアッセイを行ったところ、ＮＲＡ－８１１よりも強力な活性を持つ化合物ＮＲＡ－８１３、８１４及び８１５の獲得に成功した。
【0074】
レポーターアッセイによる本発明の化合物の評価を図７に示す。
【0075】
ＰＡＣＡＰ誘発長期疼痛モデル、坐骨神経結紮神経障害性疼痛モデル、及び骨がん性疼痛モデルに対し、ＮＲＡ－８よりも強い鎮痛作用を示した（図８）。
【0076】
また、ＮＲＡ－８１１及び８１５は、ヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１において、細胞増殖・生存・遊走の抑制を示し、その効果は元化合物（ＮＲＡ－８）よりも強力であった（図９）。また、ＮＲＡ－８１１及び８１５は、Ａ５４９細胞（ヒト肺がん）、Ｕ８７及びＵ２５１（ヒト脳腫瘍）、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺がん）、ＭＣＦ７（ヒト乳がん）などの種々のがん細胞株においても同様の抗がん活性を示した。
【0077】
［実施例７］Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデル（がん細胞移植モデル）における抗がん活性
雄性ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ，６週齢）を使用し、右脇腹皮下にヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１（１×１０６個）を移植した。ＮＲＡ化合物は０．３％メチルセルロース含有水に懸濁し、がん細胞移植７日目から一日１回７日間、経口投与した。腫瘍の大きさは、ノギスを用いて、腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）を計測し、体積を長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）として算出した。
雄性ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ，６週齢）を使用し、右脇腹皮下にヒトすい臓がん細胞株Ｐａｎｃ１（１×１０６個）を移植した。ＮＲＡ化合物は０．３％メチルセルロース含有水に懸濁し、がん細胞移植７日目から一日１回７日間、経口投与した。腫瘍の大きさは、ノギスを用いて、腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）を計測し、体積を長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）として算出した。
【0078】
ＮＲＡ－８の腫瘍増殖抑制効果はＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいては強いものではなかったが、本発明の化合物であるＮＲＡ－８１１及び８１５はＮＲＡ－８よりも強い腫瘍増殖抑制効果を示した（図１０）。
【0079】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】