特許 7631351 アルテルナンオリゴ糖を製造するためのプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-07

(45)【発行日】2025-02-18

(54)【発明の名称】アルテルナンオリゴ糖を製造するためのプロセス

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/04 20060101AFI20250210BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20250210BHJP

   C12P 1/00 20060101ALI20250210BHJP

【ＦＩ】

C12P19/04 Z

C12N9/24

C12P1/00 A

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022542403

(86)(22)【出願日】2021-01-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-15

(86)【国際出願番号】 EP2021050287

(87)【国際公開番号】W WO2021140208

(87)【国際公開日】2021-07-15

【審査請求日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】20150977.5

(32)【優先日】2020-01-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】590002013

【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(72)【発明者】

【氏名】ドミニク テルフェール

(72)【発明者】

【氏名】ラウフ フェルトマン

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャエル プルス

【審査官】▲高▼ 美葉子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００３－５２２５２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５３－０２９９９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５２９５３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Food Sci. Technol.Res.，2001年，Vol.7,No.1，p.39-44

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

攪拌槽式反応器（１１）において、スクロース（９）を、触媒有効量のアルテルナンスクラーゼ酵素（１３）及びアクセプター分子（１２）と攪拌を伴いながら接触させることであって、
前記アルテルナンスクラーゼ酵素（１３）及び前記アクセプター分子（１２）が、前記反応器（１１）内の水性液体（４）中に存在し、前記アルテルナンスクラーゼ酵素は前記水性液体に溶解、乳化、又は懸濁されており、前記スクロース（９）が、前記反応器（１１）に連続的又は半連続的に供給され、
前記スクロース（９）及び前記アクセプター分子（１２）は、アルテルナンオリゴ糖（８）に変換され、フルクトース（６）が副産物として生成されることと、
膜濾過（１７）により、前記反応器（１１）から前記フルクトース（６）の少なくとも一部を連続的又は半連続的に除去することであって、
前記フルクトース（６）の少なくとも一部を除去することが、前記反応器（１１）の内容物を、膜を含む装置（１６）を通して連続的又は半連続的に循環させ、かつ、前記反応器（１１）の前記内容物を前記膜に接触させることを含み、少なくとも前記フルクトース（６）の一部及び水性液体（４´´）の一部が、前記膜を通過するとともに、残りが前記反応器に戻され、
使用されるアクセプター分子（１２）の総量に対して、供給されるスクロース（９）の総量である、スクロース（９）：アクセプター分子（１２）のモル比が、１０：１～３０：１であることとを含み、
アルテルナンオリゴ糖の平均重合度ＤＰｗが１４より大きい、アルテルナンオリゴ糖（８）を製造するための方法。

【請求項2】

前記膜濾過（１７）が、ダイアフィルトレーションである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記反応器に、更なる水性液体を連続的又は半連続的に供給することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記反応器（１１）と、膜を含む前記装置（１６）と、を含む反応器システムに、更なる水性液体を連続的又は半連続的に供給することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

更なる副産物として生成されるアルテルナン多糖類（１４）の少なくとも一部、及び前記アルテルナンスクラーゼ酵素（１３）の少なくとも一部を、好ましくは更なる膜濾過（３）により除去すること（Ｓ２）を更に含み、前記更なる膜濾過（３）において、前記アルテルナンオリゴ糖（８）が透過液に含まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記アルテルナンオリゴ糖（８）を濃縮すること（Ｓ３）を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記アルテルナンオリゴ糖（８）の平均重合度ＤＰｗ又はＤＰｎが、前記反応器（１１）に供給される前記スクロース（９）の量によって調節される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記アルテルナンオリゴ糖（８）の所望の平均重合度ＤＰｗ又はＤＰｎに達したときに、前記スクロース（９）の供給を停止する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記アルテルナンオリゴ糖（８）の前記平均重合度ＤＰｗが、ＧＰＣ－ＲＩで測定して５～３０の範囲内である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記アルテルナンオリゴ糖（８）の前記平均重合度ＤＰｗが、ＧＰＣ－ＲＩで測定して１０～２０の範囲内である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記アクセプター分子（１２）が、マルトース分子である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記スクロース（９）が連続的に供給され、時間当たりのスクロースのモル量でのスクロース（９）の供給速度が、時間当たりのフルクトースのモル量でのフルクトース（６）の連続除去速度に等しい又は実質的に等しい、又はスクロース（９）の前記供給速度とフルクトース（６）の前記除去速度との比率が、１．２：１～１：１の範囲内であることを特徴とする請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

更なるアルテルナンスクラーゼ酵素を、好ましくは連続的又は半連続的に前記反応器（１１）へ供給する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

アルテルナンスクラーゼ酵素：供給されるスクロース（９）の総量であるスクロース（９）の比率が、１０００～１００００単位（酵素活性）：１０００ｇのスクロース（９）である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

アルテルナンオリゴ糖の平均重合度ＤＰｗが１４～３２の範囲内である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アルテルナンオリゴ糖を製造するためのプロセスに関する。

【背景技術】

【0002】

アルテルナンオリゴ糖（ａｌｔｅｒｎａｎ－ｏｌｉｇｏｓｃｃｈａｒｉｄｅ）は、プレバイオティクス成分（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）として記載されている。特許文献１は、スクロースと様々なアクセプター糖とのアルテルナンスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎｓｕｃｒａｓｅ）酵素触媒反応によって生成されるオリゴ糖が、腸内細菌病原体（ｅｎｔｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）を制御するためのプレバイオティクスとして有効であることを開示している。腸内病原性細菌（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ）の集団は、有益な細菌（例えば、乳酸菌、ビフィズス菌等）の増殖を促進するのに有効な量のこれらのオリゴ糖の１つ又は複数を含む組成物で、動物を処理することによって、実質的に減少又は阻害することができる。

【0003】

特許文献２によれば、アルテルナンスクラーゼをコードする核酸分子が提供される。また、記載された核酸分子によって形質転換されたベクター、宿主細胞、植物細胞、及びそれらを含む植物が提供される。更に、アルテルナンスクラーゼをコードする核酸分子の挿入により、炭水化物アルテルナン（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｌｔｅｒｎａｎ）を合成するトランスジェニック植物を調製するための方法が記載されている。更に、アルテルナンの調製方法及びそこから得られる生成物が提供される。

【0004】

特許文献３は、酸性食品の成分としてのアルテルナン多糖類及びアルテルナンオリゴ糖の使用、及び成分としてアルテルナンを含む酸性食品を対象としている。また、開示内容は、食品配合物中の熱安定性成分としてのアルテルナンの使用、及び食品がその製造中に加熱工程に供された、アルテルナンを成分として含む食品も対象としている。

【0005】

特許文献２及び特許文献３において、アルテルナンオリゴ糖の製造方法が提案されており、当該製造方法では、
ａ）スクロース含有溶液を、スクロースのアルテルナンオリゴ糖及びフルクトースへの変換を可能にする条件下で、触媒有効量のアルテルナンスクラーゼ酵素及びアクセプター分子と接触させ、
ｂ）当該溶液からアルテルナンオリゴ糖とフルクトースを分離する。

【0006】

反応は、全ての抽出物を含むバッチ式反応器の内部で行われ、室温～３７℃の範囲内、ｐＨを約４．７～７の範囲内で行うことができ、スクロースがほぼ消費されるまで進行させることができる。得られた生成物は、通常、シロップとして得られるが、これは更に、精製（すなわち膜濾過によって）されることや、乾燥されることがある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】米国特許第７１８２９５４号（特許請求の範囲等）

【文献】国際公開第２０００／４７７２７号（特許請求の範囲等）

【文献】国際公開第２００９／０９５２７８号（特許請求の範囲等）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

このプロセスでは、副産物の蓄積が問題となっていた。更に言えば、より長鎖のマルトースアルテルナンオリゴ糖の調製においては、所望の平均鎖長が全く得られない、或いはほとんど得られないため、これまで用いられてきたプロセスは用いることができない。

【0009】

そこで、本発明の目的は、アルテルナンオリゴ糖を製造するための代替プロセスを提供することである。好ましくは、このプロセスによれば、副産物の生成を最小限に抑えることができ、及び／又は、副産物をより効率的に除去することができるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、請求項１に記載のプロセスを提供する。本発明は、アルテルナンオリゴ糖を製造するためのプロセスであって、反応器において、スクロースを、触媒有効量のアルテルナンスクラーゼ酵素及びアクセプター分子と接触させることを含み、アルテルナンスクラーゼ酵素及びアクセプター分子が、反応器内の水性液体中に存在し、スクロースが、反応器に連続的又は半連続的に供給され、スクロース及びアクセプター分子は、アルテルナンオリゴ糖に変換され、フルクトースが副産物として生成され、更に、膜濾過により、反応器からフルクトースの少なくとも一部を連続的又は半連続的に除去することを含むことを特徴とするプロセスを提供する。

【0011】

本発明によって、その一般的な形態又は特定の実施形態において、以下の利点のうちの１つ又は複数を達成することができる。
一定の低いフルクトース濃度を達成しうる。
アルテルナンポリマー又はロイクロース等、更なる不要な副産物の生成を低減し、又は、最小化することができる。
副産物は、必ずしもフルクトースだけではなく、ほかに考えられるものとして、アルテルナンポリマー又はロイクロースが挙げられ、以下に説明するように、それらを除去することも可能である。
従来のプロセスよりも長鎖のアルテルナンオリゴ糖を製造することができる。スクロースの添加量により、鎖長を調整することができる。
本発明は、このプロセスで得られたアルテルナンオリゴ糖を提供する。
更なる利点は、詳細な説明の特定の実施形態に記載されている。

【0012】

［アルテルナンオリゴ糖］
重合度ＤＰ、又は重量平均重合度ＤＰｗである平均重合度は、代替法として、ＧＰＣ－ＲＩ（屈折率検出によるゲル浸透クロマトグラフィー）、又はＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ（パルスアンペロメトリック検出による高速アニオン交換クロマトグラフィー）を用いて測定される。

【0013】

アルテルナンは、グルコース単位から構成される糖、或いはグルコース又はグルコース単位以外の構造からなるアクセプター分子が存在する場合には実質的にグルコース単位から構成される糖である。グルコース単位は、α－１－３－及びα－１－６－グリコシド結合（リンケージと称する場合もある。）を介して互いに結合しており、これら２種類の結合は主に交互に現れる。マルトース等のグルコース（単位）を含むアクセプター分子が存在する場合、これらは別の方法で結合している場合がある。アルテルナンは、分岐を含んでいる場合がある（Ｓｅｙｍｏｕｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４、（１９７９）、４１－６２）。アルテルナン多糖類とアルテルナンオリゴ糖は、重合度によって区別されるアルテルナンの一種である。アルテルナン多糖類分子は、アクセプター分子を含む場合と、含まない場合があるが、アクセプター分子を含んでいることが好ましい。

【0014】

本発明におけるアルテルナン、特に、アルテルナンオリゴ糖は、グルコースベース糖（ｇｌｕｃｏｓｅ－ｂａｓｅｄ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と定義することができ、当該糖は、還元末端とα－１－６及びα－１－３のグリコシドリンケージを交互に有するＤ－グルコースモノマーを有している。そして、「アクセプター分子単位」とも呼ばれるアクセプター分子、特にマルトース単位が、還元末端に存在するか、言い換えれば還元末端に結合されている。

【0015】

アルテルナンオリゴ糖分子は、少なくとも一つのアクセプター分子を含んでいることが好ましい。

【0016】

本発明の方法によって製造される本発明のアルテルナンオリゴ糖は、好ましくは重量平均重合度ＤＰｗが５～３０の範囲にあり、好ましくは５～２５の範囲にあり、より好ましくは１０～３０、又は１０～２０の範囲にあり、さらに好ましくは１０～１８、又は１２～１８の範囲にある。更に好ましいＤＰｗの範囲は、１８～３０、又は２０～３０である。これらの値は、ＧＰＣ－ＲＩで測定される。より詳細な方法については、後述の実施例の項に記載する。

【0017】

本発明の方法により製造された本発明のアルテルナンオリゴ糖は、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで測定した平均重合度ＤＰｗが、７～３２、１２～３０、１２～２０、又は１２～１８の範囲内であることが好ましい。詳細な方法は、後述の実施例の項において記載する。平均重合度は、１３、１４、１５、又は１６より大きくてもよい（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）。いくつかの実施形態では、平均重合度は、１７より大きい（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）。平均重合度は、２０未満、１９未満、又は１８未満（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）であってもよい。

【0018】

上記のＧＰＣ－ＲＩ値とＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ値は、それぞれ独立して検討されるべきである。これは、異なる方法を比較する場合、上記の値や範囲が互いに対応していないことを意味する。異なるＤＰｗを持つ生成物を製造したり、ＤＰｗを操作したり、異なる生成物のＤＰｗを異なる方法で測定したりすることが可能である。

【0019】

本発明において、単数形用語である「アルテルナンオリゴ糖」は、重合度（ＤＰ）が１つのみの分子を有する単分散アルテルナンオリゴ糖と、重合度が異なる分子を有する多分散アルテルナンオリゴ糖の両方を意味する。

【0020】

本発明のアルテルナンオリゴ糖は、重合度（ＤＰ）が３～３０の範囲にあるアルテルナン分子からなることが好ましく、又は実質的に重合度（ＤＰ）が３～３０の範囲にあるアルテルナン分子を含むか、或いは、実質的に重合度（ＤＰ）が３～３０の範囲にあるアルテルナン分子からなることが好ましい。これらＤＰの範囲の端点は、平均値ではなく、単一の値を意味するものである。

【0021】

「実質的に……含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）か、或いは、実質的に……からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」という用語は、３～３０の範囲の重合度（ＤＰ）を有するアルテルナン分子の、アルテルナンオリゴ糖の総重量に基づいて、特に乾燥ベースで９０．０重量％以上の量、好ましくは９５．０重量％以上又は９７．０重量％以上、より好ましくは９８．０重量％以上、更に好ましくは９９．０重量％以上、最も好ましくは９９．５重量％以上の量を意味する。アルテルナンオリゴ糖には、３０より高いＤＰを持つアルテルナン分子が少量含まれることがある。ここで、「少量」という用語は、アルテルナンオリゴ糖の総重量に基づいて１０．０重量％未満、又は５．０重量％未満の量、好ましくは３．０重量％未満、より好ましくは２．０重量％未満、更に好ましくは１．０重量％未満、最も好ましくは０．５重量％未満の量を意味している。

【0022】

アルテルナンオリゴ糖の重合度（ＤＰ）は、アクセプター分子に直接又は間接的に結合したＤ－グルコシル単位の数に、アルテルナンオリゴ糖に残存するアクセプター分子の単糖単位の数を加えたものとして定義される。

【0023】

本発明の定義によるアルテルナン多糖類は、３０より高いＤＰを有する。このＤＰは、平均値ではなく、単一の数値を意味するものである。本発明では、単数形用語である「アルテルナン多糖類」は、重合度（ＤＰ）が１つのみの分子を有する単分散アルテルナン多糖類と、重合度が異なる分子を有する多分散アルテルナン多糖類の両方を意味する。

【0024】

本発明の定義によるアルテルナン多糖類は、５０００ｇ／ｍｏｌ以上の重量平均分子量（Ｍｗ）(ＧＰＣ ＲＩ又はＧＰＣ ＭＡＬＬＳで測定)を有していてもよい。別の実施形態によれば、アルテルナン多糖類は、重量平均分子量（Ｍｗ）が１０００００００ｇ／ｍｏｌ～６０００００００ｇ／ｍｏｌ（ＧＰＣ ＭＡＬＬＳで測定）の範囲内であり、より好ましくは１２００００００ｇ／ｍｏｌ～５０００００００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。

【0025】

［アルテルナンスクラーゼ酵素］
本明細書で使用するためのアルテルナンスクラーゼは、例えば、特許文献２に開示されているように、種々の微生物、好ましくはロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の株（ｓｔｒａｉｎｓ）、特にＬ．メセンテロイデス属（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の株から得ることができる。一実施形態によれば、当該酵素は、Ｌｅａｔｈｅｒｓらの米国特許第５７０２９４２号に記載されているような、デキストラスクラーゼ（ｄｅｘｔｒａｎｓｕｃｒａｓｅ）に対して高い割合のアルテルナンスクラーゼを分泌する株）によって生産される。別の実施形態によれば、アルテルナンオリゴ糖を生成するために使用することができるアルテルナンスクラーゼ酵素には、ロイコノストックメセンテロイデス属の株であるＮＲＲＬ Ｂ １３５５、２３１８５、２３１８６、２３１８８、２３３１１、２１２９７、３０８２１、３０８９４が含まれる。これらの酵素は、Ｇｉｌｌｅｓ Ｊｏｕｃｌａの博士論文（Ｉｎｇｅｎｉｅｒ ＩＮＳＡ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ、２００３）に記載されているように、更にクローニングして、組換え発現させることができる。また、アルテルナンスクラーゼ酵素は、Ｌ．メセンテロイデス属以外の生物で生産することができ、その生物はアルテルナンスクラーゼ酵素をコードする組換え核酸を含む。好ましい生物として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。

【0026】

アルテルナンスクラーゼの生産は、従来技術を用いて、かつ、Ｌｅａｔｈｅｒｓらの文献に記載されているような酵素の増殖及び生産を促進するのに有効な好気性条件下で、上記の微生物のいずれかを、培養することにより行うことができる。培養後、酵素は、例えば遠心分離又は濾過等の従来技術を用いて、微生物から単離又は分離することができる。

【0027】

一実施形態において、「アルテルナンスクラーゼ酵素が反応器内の水性液体中に存在する」という用語は、アルテルナンスクラーゼ酵素が水性液体に溶解、乳化、又は懸濁されていること、好ましくは溶解されていることを意味する。一実施形態において、アルテルナンスクラーゼ酵素は、キャリア材料に固定化されていない。

【0028】

［アクセプター分子］
アクセプター分子とは、アルテルナンスクラーゼが鎖延長反応（ｃｈａｉｎ－ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を触媒することができる分子を意味すると理解される。アルテルナンオリゴ糖分子は、アクセプター分子を含み、好ましくは１つのアクセプター分子を含む。アルテルナン多糖類分子は、好ましくはアクセプター分子を含み、より好ましくは１つのアクセプター分子を含む。分子という単数形の用語が用いられる場合でも、本発明では複数のアクセプター分子が用いられ、これらは化学的に同一であっても、或いは、異なっていてもよい。

【0029】

アルテルナン、特にアルテルナンオリゴ糖は、アクセプター分子とスクロースを、スクロースからアクセプター分子へとグルコース単位を転移させ、フルクトースとアルテルナン、特にアルテルナンオリゴ糖を放出する、１つ又は複数のアルテルナンスクラーゼ酵素と反応させて、生成することができる。アクセプター分子は、スクロースからグルコース単位を受け入れることができる。

【0030】

反応混合物に加えることができるアクセプター分子は、炭水化物又は炭水化物誘導体であることが好ましい。外部アクセプターを使用すると、低分子アルテルナンオリゴ糖が生成される。アクセプター分子は、スクロースからグルコース単位を受け入れることができる、炭素位置番号で２、３及び６の１つ又は複数に遊離ヒドロキシル基を有する糖又は糖アルコールから選択することができる。炭水化物アクセプターは、マルトース、イソマルトース、マルチトール、（イソ）マルトトリオース及びメチル－α－Ｄ－グルカンからなる群より選択される糖であることが好ましい。他の好ましいアクセプター分子は、グルコース、ゲンチオビオース、ラフィノース、メリビオース、イソマルチトール、イソマルトオリゴ糖、テアンデロース（ｔｈｅａｎｄｅｒｏｓｅ）、コジビオース、グルコシルトレハロース、セロビオース、マルトテトラオス、ニゲロース、ラクトース、パノース、又はこれらの混合物である。アクセプター分子は、マルトースであることが好ましい。

【0031】

選択された特定のアクセプターに応じて、グルコシル単位は一般的に、α（１，６）結合を介して、或いはα（１，６）結合がすでに存在する場合にはα（１，３）結合を介して付加される。この反応により、典型的には、異なる重合度（ＤＰ）を有するオリゴ糖の混合物が生成される。

【0032】

一実施形態において、「アクセプター分子が反応器内の水性液体中に存在する」という用語は、アクセプター分子が水性液体に溶解、乳化、又は懸濁されている、好ましくは溶解されていることを意味する。

【0033】

［水性液体］
本発明における「水性液体」という用語は、少なくとも８０ｖｏｌ％の水、好ましくは、少なくとも９０ｖｏｌ％の水、又は少なくとも９５ｖｏｌ％の水を含む液体を意味し、上限は１００ｖｏｌ％である。水性液体は水であることが好ましい。

【0034】

［反応器］
反応器は、タンク反応器であってよい。
反応は、攪拌、例えばかき混ぜることによって行われてもよい。一実施形態において、反応器は、攪拌槽式反応器である。前述の実施形態と組み合わせることができる、別の実施形態において、撹拌は、反応器の内容物を移動させることによって行われる。これは、好ましくはポンプを使用して行われ、好ましくはこの明細書の他の箇所に記載されているように、ポンプによって反応器の内容物を循環させることによって行われる。
撹拌、特に、かき混ぜを行う際、
「反応器において、スクロースを、触媒有効量のアルテルナンスクラーゼ酵素及びアクセプター分子と接触させることを含み、アルテルナンスクラーゼ酵素及びアクセプター分子が、反応器内の水性液体中に存在し、スクロースが、反応器に連続的又は半連続的に供給され」ることは、撹拌、特にかき混ぜることによって行われる。
別の実施形態において、フルクトースの除去及び／又はスクロースの添加により、反応器の内部に乱流が生じ、成分が混合される。
かかるスクロース（基質）は、連続的又は半連続的に添加される。

【0035】

スクロースの供給に関して「半連続的に」という用語は、スクロースの供給が１回又は複数回、好ましくは２回以上中断されることを意味する。すなわち、「半連続的に」という用語は、少なくとも２つの供給期間、好ましくは、少なくとも３つの供給期間、又は少なくとも４つの供給期間があり、各供給期間は、供給の中断期間によって次の供給期間と区切られていることを意味する。スクロースの供給期間は、一定の期間であってもよく、非一定の期間であってもよい（すなわち、期間の長さが互いに異なっていてもよい）。供給の中断期間は、一定の期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。スクロースの供給期間及び供給の中断期間は、同じ長さの期間であってもよく、異なる長さの期間であってもよい。

【0036】

フルクトースの除去に関して「半連続的に」という用語は、フルクトースの除去が１回又は複数回、好ましくは複数回（２回以上）中断されることを意味する。すなわち、「半連続的に」という用語は、少なくとも２つの除去（ｒｅｍｏｖａｌ）（又は除去する（ｒｅｍｏｖｉｎｇ））期間、好ましくは、少なくとも３つの除去期間、又は少なくとも４つの除去期間があり、各除去期間は、除去の中断期間によって次の除去期間と区切られていることを意味する。フルクトースの除去期間は、一定の期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。フルクトースの除去中断期間は、一定の期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。フルクトースの除去期間とフルクトースの除去中断期間とは、同じ長さの期間であってもよく、異なる長さの期間であってもよい。

【0037】

半連続運転では、スクロースが供給される期間とフルクトースが除去される期間とは、同一であってもよく、重複しても重複しなくてもよい。半連続運転の一実施形態において、フルクトースの除去が中断されたときにスクロースの供給が行われ、フルクトースの除去が行われるときにスクロースの供給が中断される。これは特に、スクロース供給とフルクトース除去が交互に行われることを意味する。

【0038】

反応器へのスクロースの供給は、直接又は間接的に行うことができる。直接供給は、例えば、スクロース又はスクロース溶液が、反応器のところで又は反応器の内部でじかに終わる供給管を介して添加される場合に行われる。一方、間接供給は、例えば、スクロース又はスクロース溶液が、反応器と、流体連通している別の装置、例えば更なるパイプ、又は更なる装置、例えば本明細書で後述する膜を含む装置、で終わる供給パイプを介して添加される場合に行われる。又は、供給は、反応器及び本明細書で後述する膜を含む装置からなる反応器システムに対して行われてもよい。スクロースの供給（又は配給）は、膜を介して行われない。すなわち、スクロースの供給において、スクロースは膜を貫通しない。スクロースが、膜を含む上記装置に供給される場合、スクロースの供給は装置の膜を介して行われない。すなわち、スクロースは装置の膜を貫通しない。フルクトースを除去するための膜濾過に使用される上述の膜は、フルクトース及び水性液体の一部を貫通させるが、スクロースを貫通させない膜である。

【0039】

触媒有効量のアルテルナンスクラーゼ酵素及びアクセプター分子は、スクロースが添加される前に反応器の内部に存在している。スクロースは、固体として添加されてもよく、好ましくは溶液又は懸濁液として、好ましくは水性液体中に添加される。供給されたスクロースは、アルテルナンスクラーゼによって直接変換されることができる。

【0040】

本プロセスにおいて、生物変換、すなわち酵素によるアルテルナンオリゴ糖の生成は、連続的又は半連続的なフルクトースの除去の下で行われる。除去は、アルテルナンオリゴ糖の生成が始まった後、副産物としてフルクトースが生成された時点で行われる。

【0041】

一実施形態において、フルクトースの除去は、スクロースが反応器に供給されると同時に行われる。ここで、同時とは、スクロースを添加する１つの期間又は複数の期間とフルクトースを除去する１つの期間又は複数の期間とが少なくとも部分的に重なることを意味する。フルクトースは、スクロースが添加される少なくとも全期間において除去されることが好ましい。フルクトースの除去は、スクロースの添加を停止した後、又はスクロースの添加を終了したとき、継続されてもよい。

【0042】

フルクトースの少なくとも一部を除去することは、プロセスにおいて、（副産物として）生成されたフルクトースの全量に関連するものである。フルクトースの少なくとも一部を除去することは、生成される全フルクトースの好ましくは７０ｍｏｌ％以上、好ましくは８０ｍｏｌ％以上、より好ましくは９０ｍｏｌ％以上であることを意味する。除去の上限は１００ｍｏｌ％であり、生成されたフルクトースの全量（１００ｍｏｌ％）又は実質的に全量が除去されることが好ましい。ここで、実質的に全量とは、９５ｍｏｌ％以上を意味する。

【0043】

フルクトースの除去は、低減（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）とも呼ばれる。

【0044】

フルクトースの除去は、一実施形態において、ダイアフィルトレーション
によって行われる。すなわち、かかる膜濾過は、ダイアフィルトレーションであるか、又はダイアフィルトレーションとして実行される。

【0045】

本発明の一実施形態において、フルクトースの少なくとも一部を除去することは、反応器の内容物を、膜を含む装置を通して連続的又は半連続的に循環させ、かつ、反応器の内容物を膜に接触させることを含み、少なくともフルクトースの一部と水性液体の一部は、（透過液として）膜を通過し、残り（保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ））は、反応器に戻される。

【0046】

循環に関して「半連続的に」という用語は、循環が１回又は複数回、好ましくは複数回（２回以上）中断されることを意味する。すなわち、「半連続的に」とは、少なくとも２つの循環期間、好ましくは、少なくとも３つの循環期間、又は少なくとも４つの循環期間があり、各循環期間は、循環の中断期間によって次の循環期間と区切られていることを意味する。循環の期間は、一定の期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。循環の中断期間は、一定の期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。循環の期間と循環の中断期間は、同じ長さの期間であってもよく、異なる長さの期間であってもよい。

【0047】

反応器の内部における温度は、特定の実施形態において、３０～４５℃、又は３０～４０℃の範囲内である。

【0048】

膜を含む装置は、膜セル（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｅｌｌ）、膜モジュール、又は、膜を含む濾過セル（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ）であってもよい。

【0049】

膜を含む装置は、反応器と流体連通している。反応器の内容物は、装置に送られ、その装置から反応器へ戻される。しかしながら、フルクトースの一部と水性液体の一部は、（透過液として）膜を通過し、反応器に戻されることはない。

【0050】

膜を含む装置は、チューブ、パイプ、又はパイプライン等の液体の輸送に適した接続部によって反応器と接続されていてもよい。第１の接続部は、反応器の出口と装置の入口との間に存在していてもよい。第２の接続部は、装置の出口と反応器の入口との間に存在していてもよい。反応器の内容物を循環させるためのポンプが存在していてもよい。反応器の内容物を循環させることは、反応器自体及び膜装置を介して行われる。両者は、「反応器システム」とも呼ばれ、反応器と、膜を含む装置と、を含むシステムである。反応器の内容物の循環流は、特に乱流において、液相での成分の混合を引き起こす場合がある。

【0051】

一実施形態において、反応器からフルクトースの少なくとも一部を連続的又は半連続的に除去することは、ナノ濾過によって行われる。膜は、ナノ濾過膜であることが好ましい。

【0052】

膜を含む装置を通る連続的又は半連続的な循環によって、フルクトース及び水性液体が連続的又は半連続的に除去される。

【0053】

一実施形態において、フルクトースを除去するための膜濾過に適用される圧力は、５～３０ｂａｒの範囲内である。温度は、３０～４０℃であってよい。

【0054】

更なる実施形態において、本プロセスは、反応器、又は、反応器と、膜を含む装置と、を含む反応器システムに、更なる水性液体を連続的又は半連続的に供給することを含む。この処置により、透過液の一部として反応器又は反応器システムから出る水性液体を交換することができる。「更なる水性液体」とは、プロセスの過程で反応器に添加される水性液体を意味する。すなわち、更なる水性液体とは、請求項１に記載の水性液体に加えて添加される水性液体を意味する。更なる水性液体の供給に関して「半連続的に」という用語は、更なる水性液体の供給が１回又は複数回、好ましくは複数回（２回以上）、中断されることを意味する。すなわち、「半連続的に」とは、少なくとも２つの供給期間、好ましくは、少なくとも３つの供給期間、又は少なくとも４つの供給期間があり、各供給の期間は、給供の中断期間によって次の供給期間と区切られていることを意味する。更なる水性液体を供給する期間は、一定の時間期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。更なる水性液体の供給を中断する期間は、一定の時間期間であってもよく、非一定の期間であってもよい。更なる水性液体を供給する期間と、更なる水性液体の供給を中断する期間とは、同じ長さの時間期間であってもよく、異なる長さの期間であってもよい。

【0055】

一実施形態において、本プロセスは、副産物として生成されるアルテルナン多糖類の少なくとも一部、及びアルテルナンスクラーゼ酵素の少なくとも一部を、好ましくは更なる膜濾過により除去することを更に含む。本プロセスの副産物であるフルクトースに加えて、アルテルナン多糖類は、更なる副産物として生成される。このステップは、副産物を分離するために任意で実行される。膜濾過の場合、アルテルナンオリゴ糖は透過液で得られる。一方、アルテルナン多糖類とアルテルナンスクラーゼは保持液に含まれる。一実施形態において、この膜濾過は限外濾過である。膜は、限外濾過膜であることが好ましい。一実施形態において、このような膜濾過、特に限外濾過に適用される圧力は、２～１５ｂａｒの範囲内である。この更なる膜濾過における温度は、３０～６０℃の範囲内であってよい。

【0056】

（アルテルナン多糖類の少なくとも一部及びアルテルナンスクラーゼ酵素の少なくとも一部を除去するための）更なる膜濾過は、更なる膜である膜を含む更なる装置で行われてもよい。

【0057】

一実施形態において、本プロセスは、アルテルナン多糖類の少なくとも一部を除去した後、及びアルテルナンスクラーゼ酵素の少なくとも一部を除去した後に得られる生成物を濃縮することを更に含み、かかる生成物は、アルテルナンオリゴ糖を含む。特に、このプロセスは、好ましくは前述の更なる膜濾過で得られる透過液において、アルテルナンオリゴ糖を濃縮することを更に含んでもよい。

【0058】

フルクトースを除去するための膜濾過、又は、（アルテルナン多糖類の少なくとも一部及びアルテルナンスクラーゼ酵素の少なくとも一部を除去するための）任意選択の更なる膜濾過において、任意の公知又は通常の材料の膜を使用することができる。非限定的な例として、ポリアミド、ポリサルフォン、又はポリ（ビニリデン）フルオライド等が挙げられる。

【0059】

一実施形態において、本プロセスは、得られた生成物を乾燥させることを更に含む。前述したように、濃縮とは、生成物が液相のままであることを意図している。乾燥とは、固形の生成物を得ることを意味している。

【0060】

副産物として生成されるアルテルナン多糖類の少なくとも一部と、アルテルナンスクラーゼ酵素の少なくとも一部を除去した後に得られる生成物を乾燥させることが好ましい。なお、前述の濃縮と乾燥は、連続して行うことができる。

【0061】

乾燥生成物は、乾燥ベースで少なくとも６５％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも７５％（ｗ／ｗ）又は少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のアルテルナンオリゴ糖を含んでもよく、更に具体的には少なくとも８５％（ｗ／ｗ）又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のアルテルナンオリゴ糖を含んでもよい。各下限値と組み合わせることができる上限値は、９９．０％又は９９．９％（ｗ／ｗ）であることが好ましい。

【0062】

乾燥生成物は、乾燥ベースでフルクトース等価物を、０．１～１５％（ｗ／ｗ）、又は０．１～１０％（ｗ／ｗ）、又は０．１～９％（ｗ／ｗ）、又は０．１～８％（ｗ／ｗ）、又は０．１～７％（ｗ／ｗ）、又は０．１～６％（ｗ／ｗ）、又は０．１～５％（ｗ／ｗ）、又は０．１～３％（ｗ／ｗ）、又は０．１～２％（ｗ／ｗ）、又は０．１～１％（ｗ／ｗ）、又は０．１～０．５％（ｗ／ｗ）含んでもよい。いくつかの実施形態において、乾燥生成物は、乾燥ベースでフルクトース等価物を、１０％（ｗ／ｗ）未満含んでいる。かかる組成物は、乾燥ベースでフルクトース等価物を、９％未満（ｗ／ｗ）、８％未満（ｗ／ｗ）、７％未満（ｗ／ｗ）、６％未満（ｗ／ｗ）、５％未満（ｗ／ｗ）３％未満（ｗ／ｗ）、２％未満（ｗ／ｗ）、１％未満（ｗ／ｗ）、又は０．５％未満（ｗ／ｗ）含むことが好ましい。

【0063】

いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、ロイクロース、フルクトース、及び／又は、スクロースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、ロイクロースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、フルクトースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、スクロースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、ロイクロース及びフルクトースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、ロイクロース及びスクロースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、フルクトース及びスクロースである。いくつかの実施形態において、前述のフルクトース等価物は、ロイクロース、フルクトース、及びスクロースである。

【0064】

本プロセスの副産物であるフルクトース等価物は、本プロセスにおいて除去することができる。このことは、フルクトースに関しては既に説明した。一実施形態において、本プロセスは、副産物として生成されたロイクロースの少なくとも一部を、膜濾過によって反応器から連続的又は半連続的に除去することを含んでいる。かかる膜濾過は、フルクトースの除去に使用されるものと同じであることが好ましい。そのため、フルクトースとロイクロースを同じ膜濾過のステップで除去することができる。

【0065】

本プロセスの抽出物に属するフルクトース等価物は、本プロセスにおいて除去することができる。一実施形態において、本プロセスは、膜濾過によって、未反応の抽出物として、スクロースの少なくとも一部を反応器から連続的又は半連続的に除去することを含んでいる。かかる膜濾過は、フルクトースの除去のために使用されるものと同じであってよい。そのため、フルクトースとスクロースを同じ膜濾過のステップで除去することができる。

【0066】

本プロセスの一実施形態において、アルテルナンオリゴ糖の平均重合度ＤＰｗ又はＤＰｎは、反応器に供給されるスクロースの量によって調節される。

【0067】

更なる実施形態において、アルテルナンオリゴ糖の所望の平均重合度ＤＰｗ又はＤＰｎに達したとき、又は、達していたときに、スクロースの供給を停止する。

【0068】

スクロースの添加を停止した後、所望のフルクトース濃度に達するまで、又は、達していたときまで、フルクトースの除去を継続してもよい。

【0069】

スクロースの添加量によって、生成される鎖の長さを調整することができる。重合度の程度は、スクロースとアクセプター分子の濃度や相対比率によって変化することがある。反応生成物は、一般的に、異なる重合度を有するアルテルナンオリゴ糖の混合物から構成されている。スクロース：アクセプター比率が比較的高い場合には、より多くのグルコシル単位がグルカンに転移され、より重合度の高い生成物が得られる（すなわち、生成物中の高ＤＰオリゴ糖の相対量が増加する）。一方、スクロース：アクセプター比率が低い場合には、アクセプターへの単一のグルコシル単位の転移による反応生成物が主要なものとなる。

【0070】

従って、スクロース：アクセプター比率（スクロース対アクセプター比率と称する場合がある。）を変えることによって、所望の重合度を有するオリゴ糖の収率を最適化することができる。

【0071】

スクロース：アクセプター分子の比率とは、本プロセスで使用されるアクセプター分子の総量に対する、当該プロセス中に添加されるスクロースの総量を意味する。この比率は質量比又はモル比で示すことができる。

【0072】

スクロースが一度に供給されるのではなく、連続的又は半連続的に供給され、供給されたスクロースが消費されるため、反応器内の実際の比率は前述の比率より低くなる。

【0073】

スクロース：アクセプター分子の比率は、質量比（例えば、ｋｇスクロース：ｋｇアクセプター分子）で、１０：１～３０：１の範囲内であることが好ましく、１５：１～２３：１の範囲内であることがより好ましい。かかるアクセプター分子は、マルトースであることが好ましいが、この範囲で他のアクセプターを適用することもできる。

【0074】

スクロース：アクセプター分子の比率は、モル比（例えば、Ｍｏｌスクロース分子：Ｍｏｌアクセプター分子）で、１０：１～３０：１の範囲内であることが好ましく、１５：１～２３：１の範囲内であることがより好ましい。かかるアクセプター分子は、マルトースであることが好ましいが、この範囲で他のアクセプターを適用することもできる。

【0075】

スクロースの供給速度又は供給方式（例えば、連続的又は半連続的）は、反応器内のフルクトースの濃度が、本プロセス中に増加しないように、又はフルクトースが蓄積されないように選択することが好ましい。

【0076】

スクロースの供給速度は、反応器内のスクロースの濃度が、本プロセス中に増加しないように、又はスクロースが蓄積されないように選択されることが好ましい。かかるスクロースの供給速度は、供給されたスクロースが反応において直接消費されるように選択されることが好ましい。

【0077】

スクロースの供給速度は、５０～１５００ｇ／ｈｒ、又は５０～１０００ｇ／ｈｒ、又は５０～８００ｇ／ｈｒ、又は５０～５００ｇ／ｈｒ、又は５０～２５０ｇ／ｈｒ、又は５０～２００ｇ／ｈｒ、又はそれぞれの速度を、ｍｏｌ／ｈｒ（スクロースのモル質量３４２．３０ｇ／ｍｏｌ）で表したときの速度であることが好ましい。スクロースが溶液又は懸濁液に添加されている場合、この速度は、スクロースの重量のみを意味し、溶液又は懸濁液全体の重量を意味するものではない。

【0078】

本プロセスの一実施形態において、更なるアルテルナンスクラーゼ酵素が、好ましくは連続的又は半連続的に、反応器に供給される。つまり、反応器の内部にすでに存在していたアルテルナンスクラーゼ酵素（請求項１に記載のアルテルナンスクラーゼ酵素）に、更なるアルテルナンスクラーゼ酵素が添加される。この処置により、より高い総単位のアルテルナンスクラーゼ酵素活性を達成することができ、反応時間を短縮することができる。スクロース量も増加させることにより、スクロース量をより高い酵素の総単位に適合させることが好ましい。

【0079】

アルテルナンスクラーゼ酵素の供給に関して、「半連続的に」という用語は、酵素の供給が１回又は複数回、好ましくは２回以上中断されることを意味する。すなわち、「半連続的に」という用語は、少なくとも２つの供給期間、好ましくは、少なくとも３つの供給期間、又は少なくとも４つの供給期間があり、各供給期間は、中断期間によって次の供給期間と区切られていることを意味する。酵素の供給期間は、一定の期間でああってもよく、非一定の期間であってもよい（すなわち、期間の長さが互いに異なっていてもよい）。供給の中断期間は、一定の期間でああってもよく、非一定の期間であってもよい。酵素の供給期間と供給の中断期間は、同じ長さの期間であってもよく、異なる長さの期間であってもよい。

【0080】

好ましいアルテルナンスクラーゼ酵素：スクロース（供給されたスクロースの総量）の比率は、１０００～１００００単位（酵素活性）：１０００ｇのスクロース、又は１０００～７０００単位（酵素活性）：１０００ｇのスクロース、又は１０００～５０００ユニット（酵素活性）：スクロース１０００ｇ、又は１０００～２５００単位（酵素活性）：スクロース１０００ｇであり、１２００～２３００単位（酵素活性）：スクロース１０００ｇであることが好ましく、１５００～２０００単位（酵素活性）：スクロース１０００ｇであることがより好ましい。これらの比率は、アルテルナンスクラーゼの酵素活性の総単位に関連するものである。かかる単位（酵素活性）は、本プロセスで使用されるアルテルナンスクラーゼ酵素の総単位を意味する。例えば、更なるアルテルナンスクラーゼ酵素を反応器に供給する場合、（ｉ）最初に存在するアルテルナンスクラーゼ酵素と（ｉｉ）更に反応器に供給される全てのアルテルナンスクラーゼ酵素との合計が、総単位を意味する。

【0081】

上記のパラメータを用いると、オリゴ糖の好ましいＤＰｗ又はＤＰｎに達することが特に可能であり、その一部はこの明細書において言及されている。

【0082】

請求項１のプロセスに関連する反応時間は、選択したスクロース：アクセプターの比率、選択したスクロースの供給速度、選択した酵素活性、及び／又は選択したスクロースの総量に依存しうる。典型的な反応時間は、１０～１５０時間、又は１０～３０時間、又は１０～２４時間、又は１０～２０時間の範囲内である。副産物として生成されるアルテルナン多糖類、及びアルテルナンスクラーゼ酵素を、更なる膜濾過によって除去する、又は更なる膜濾過で得られる保持液を濃縮する、といった本明細書の別の箇所で言及される更なるプロセスのステップは、含まれない。

【0083】

請求項１のプロセスに関連する反応温度は、３０～６０℃の範囲内とすることが好ましい。特定の温度範囲又は異なる温度が、異なるプロセスの段階又はステップで適用されてもよい。

【0084】

一実施形態において、スクロースは連続的に供給され、時間当たりのスクロースのモル量でのスクロースの供給速度が、時間当たりのフルクトースのモル量でのフルクトースの連続除去速度に等しいか、実質的に等しく、又はスクロースの供給速度とフルクトースの除去速度との比率が、１：２～１：１の範囲内である。アルテルナンオリゴ糖の生成に消費されるスクロース１モル量あたり、同モル量のフルクトースが生成され、当該モル量を連続的に除去することが好ましい。

【0085】

以下、本発明を実施例によって例示するが、これらの実施例は、前述に、及び、特許請求の範囲に記載された本発明の一般的な思想を限定するものとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0086】

【図1】図１（ａ）は、先行技術に基づくプロセスの概略を示している。図１（ｂ）は、本発明のプロセスの概略を示している。

【図2】図２（ａ）は、先行技術のプロセスの設計を示している。図２（ｂ）は、本発明のプロセスの設計を示している。

【図3】図３は、スクロースの供給量を一定にした場合の、プロセス時間に対する、分子量の増加を示すチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0087】

［方法］
（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤによるＤＰの測定）
ＤＰの値は、グルコースベース糖類を還元及び加水分解した後、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを用いて測定された。６ｇ／ｍＬの消化性炭水化物組成物を含む２ミリリットルの溶液を、０．５Ｍのアンモニア中の０．２ｍＬのＮａＢＨ_４溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）で、４０℃、３０分間処理した。還元された試料を、１２１℃で１時間加熱した０．５ｍＬの２Ｍのトリフルオロ酢酸を用いて加水分解し、モノマーを放出させた。放出されたモノマーは、ＣａｒｂｏＰａｃ（商標） ＭＡ１を搭載したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標） Ｄｉｏｎｅｘ（商標） ＩＣＳ－６０００イオンクロマトグラフシステムに対して、試料溶液を注入し、溶離液（水と１０００ｍＭのＮａＯＨ）を０．４ｍＬ／ｍｉｎで供給して定量化された。ＤＰ値は、下記式で算出される。

【0088】

【数1】

【0089】

（ＧＰＣ－ＲＩによるＤＰの測定）
ＤＰ値はＧＰＣ－ＲＩで代替測定した。試料は水で希釈し、直列に連結した２本の東ソーのＴＳＫ ＧＥＬ Ｇ２５００ ＰＷＸＬカラムを使用し、水中（０．５ｍＬ／ｍｉｎ）でゲル浸透クロマトグラフィーにかけた。オリゴ糖は透過中に相対分子量により分離され、屈折率検出（ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を用いて定量される。分子量の定量化は、３４２～５０００Ｄａの範囲の標準物質（ＰＳＳ－Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を用いた外部標準法に基づいて行われた。キャリブレーションと計算のために、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐａｃｋ Ｖ２．０を、Ｄｉｏｎｅｘ社の使用説明書に従って使用した。

【実施例】

【0090】

［実施例１］
先行技術のプロセスは、例えば特許文献２及び３から知られており、図１（ａ）に示すように以下の４つのステップＰ１～Ｐ４を含む。

【0091】

ステップＰ１では、スクロースとマルトースの生物変換２が、バッチ式反応器１において、Ｔ＝３７℃で、約２０時間行われる。スクロース：マルトースの比率は、７：１（ｗ／ｗ又はｍｏｌ／ｍｏｌ）が選択される。ステップＰ１は、図２（ａ）に示す生物変換２のためのバッチ式反応器１において行われる。

【0092】

ステップＰ２は、アルテルナンポリマー（アルテルナン多糖類）及びアルテルナンスクラーゼ酵素（ＡｌＳｕ）を除去するための限外濾過３のステップである。このステップは、図２（ａ）に示す限外濾過装置３´で行われる。

【0093】

ステップＰ３では、ナノ濾過５によってフルクトースが除去される。このステップは、図２（ａ）に示すナノ濾過装置５´で行われる。ここでは、水４´が加えられ、水４´´ととフルクトース６との混合物が除去される。

【0094】

最終ステップＰ４では、ステップＰ３からの生成物が蒸発脱水７で濃縮される。これは図２（ａ）の蒸発脱水装置７´で行われ、マルトースアルテルナンオリゴ糖（ＭＡＯＳ）８が得られる。

【0095】

本発明のプロセスは、特定の実施形態において、図１（ｂ）に示す３つのステップＳ１～Ｓ３を含む。

【0096】

図１（ａ）の先行技術のプロセスと比較して、ステップＳ１における生物変換２は、スクロース９の連続的な供給１０とフルクトース６の連続除去からなる。半連続的な供給と除去も可能である。スクロース９（総添加量）とマルトース１２の質量比は、１９：１（１ｋｇのマルトースに対して１９ｋｇのスクロース）であり、期間は約７２時間である。ステップＳ１で既にフルクトース６を除去しているので、先行技術におけるステップＰ３は省略することができる。フルクトース６を除去することにより、マルトース１２に対してより高い比率のスクロース９を使用すること、及びマルトースアルテルナンオリゴ糖８の重合度をより高めることが可能となる。

【0097】

生物変換であるステップＳ１は、図２（ｂ）の反応器１１で行われ、マルトース１２とアルテルナンスクラーゼ酵素（ＡｌＳｕ）１３は、水４の中に存在する。上述のように、生物変換は、スクロース９の連続的な供給１０、フルクトース６の連続除去、期間約７２ｈ（可変）、Ｔ＝３７℃、スクロースとマルトースとの比１９：１（ｗ／ｗ又はｍｏｌ／ｍｏｌ）で行われる。スクロース９を、(水に溶解された)供給物１０として添加し、反応器１１の内容物を攪拌する。反応器１１での生物変換において、マルトースアルテルナンオリゴ糖８（ＭＡＯＳ）とも呼ばれる、アクセプター分子であるマルトースを含むアルテルナンオリゴ糖が主生成物として生成され、アルテルナンポリマー１４、フルクトース６及びロイクロース１５が副産物として生成される。反応器１１からの内容物は、膜セル（ダイアフィルトレーションセル）１６を通って連続的に循環され、この実施例では、ナノ濾過であり、定容積ダイアフィルトレーションとして行われる膜濾過１７において、水４´´、フルクトース６、及びロイクロース１５が、除去される。。ロイクロース１５の含有量は、先行技術と比較して、約３０％から１０％未満へと低減される。除去された水４´´は、水４´の供給流に置き換えられる。

【0098】

反応器１１と膜セル１６は、生物変換とナノ濾過を組み合わせた装置を構成しており、反応器システムとも呼ばれる。

【0099】

本実施形態におけるプロセスのステップＳ２は、先行技術のステップＰ２に相当する。ここでは、副産物としてのアルテルナン多糖類（アルテルナンポリマー）１４、及びアルテルナンスクラーゼ酵素（ＡｌＳｕ）１３が、装置３´における限外濾過３によって除去される。このステップは、所望されるより多くのアルテルナンポリマー１４が生成された場合や、残存するアルテルナン種の所望のＤＰｗを操作するために有益である。

【0100】

本実施形態におけるプロセスのステップＳ３は、先行技術のステップＰ４に相当する。ここでは、生成物は、装置７´における蒸発脱水７によって濃縮される。

【0101】

製造時に使用した反応液の組成を表１に示す。２．１Ｌの溶液は、システム内の水（デッドボリューム）と合わせて約５．６Ｌとなる。プロセスは、膜を通過するマルトースの潜在的な損失を最小限に抑えるために、最初の１時間は、低減させることなく実行される。その後、ナノ濾過膜Ｆｉｌｍｔｅｃ ＮＦ２７０－２５４０（ＤＯＷ社製）を介してフルクトースを常時低減させる。鎖延長の完了後、ナノ濾過モジュールをＴＲＩＳＥＰ ２５４０－ＵＥ５０－ＱＸＦ限外濾過モジュール（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ Ｎａｄｉｒ社製）に交換した。これにより、マルトースアルテルナンオリゴ糖（ＭＡＯＳ）画分が、より長い老化鎖及び酵素から分離された。このプロセスで使用した膜と使用したプロセスパラメータを表２にまとめる。濾液は最終的に乾物含量が７２％を超えるまで濃縮された。

【0102】

【表1】

【0103】

【表2】

【0104】

図３は、プロセスの進行に伴う鎖長の増加を示している。値は、ＧＰＣ－ＲＩ測定により記録された。図３のＭｗ値からＤＰｗを計算するための関係式は、以下の通りである。

【0105】

【数2】

【0106】

従って、プロセスの終盤では、約１５．４のＤＰｗに達していることが理解される（２５００／１６２）。

【0107】

ＤＰｗが約１５である平均鎖長になるように、マルトース１ｋｇに対してスクロース１９ｋｇ（合計）が使用された。

【0108】

［比較例］
図１（ａ）に示すプロセスに従ってアルテルナンオリゴ糖を製造した。２１：１の比率（ｋｇスクロース：ｋｇマルトース）を使用し、９．９のＤＰｗを得た。ＤＰｗの測定には、ＧＰＣ－ＲＩを用いたが、上述の方法の項で述べた方法のプロトコルに完全には従わなかった。それにもかかわらず、図３の結果と比較して、本発明によれば、より高いＤＰｗを有するアルテルナンが得られることが示されている。

【0109】

本発明の方法で得られた２つの試料について、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法で分析したＤＰｗ値を以下の表３にまとめた。

【0110】

【表3】

【0111】

試料ＤＣＣ－２及びＤＣＣ－３は、本発明のプロセスによって製造されたものである。

【0112】

グルコースベースのオリゴ糖のグリコシド結合プロファイルは、部分的にメチル化したアルジトールアセテートを用いてＧＣ－ＭＳにより測定した。簡単に説明すると、試料を無水ＤＭＳＯに溶解し、ｎ－ブチルリチウム（Ｓｉｇｍａ ２３０７０７）を添加して脱プロトン化し、ヨウ化メチル（Ｓｉｇｍａ ２８９５６６）でメチル化した。次いで、メチル化した試料を２Ｎ ＴＦＡで加水分解した（１２１℃ で６０分間）。加水分解した試料を窒素エアドラフト下で蒸発させ、１Ｍ水酸化アンモニウムに再溶解し、重水素化ほう素ナトリウム（２０ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＳＯ溶液でアルデヒド基を還元した。氷酢酸を滴下して反応を停止させ、１－メチルイミダゾールと無水酢酸を加えてアセチル化した。アセトン中の部分的にメチル化されたアルジトールアセテートは、Ｓｕｐｅｌｃｏ ２４１１１－Ｕ ＳＰ－２３８０ キャピラリーカラム（インジェクター容量：０．５μｌ、インジェクター温度：２５０℃、検出器温度：２５０℃、キャリアガス：ヘリウム３０ｍＬ／ｍｉｎ、スプリット比：４０対１、温度プログラム：１００℃で３分、４℃／ｍｉｎから２７０℃で２０分）を用いたＧＣ－ＭＳ（７８９０Ａ－５９７５Ｃ ＭＳＤ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で定量化された。電子衝撃スペクトルは、５０～５５０Ｄａの質量範囲にわたって、６９．９ｅＶで取得された。

【0113】

【表4】

【0114】

１，６－グリコシド結合のより高い値は、観察される１，５，６－トリ－Ｏ－アセチル－１－デウテリオ－２，３，４－トリ－Ｏ－メチル－Ｄ－グルシトールの量に寄与する消化性炭水化物組成物中のロイクロース含有量によって説明される。更に、ロイクロースは、単量体グルコースと同様に、消化性炭水化物組成物中の末端Ｇｌｃ量に寄与する。

【0115】

［実施例２］
この実施例において、パラメータを以下の表に示すように変化させ、アルテルナンスクラーゼを４等分して反応器に与え、最初の供給分は、スクロースが反応器に供給される前に存在するようにした。

【0116】

【表5】

【0117】

本発明のプロセスにおける反応時間は（ここでは更なる膜濾過によってアルテルナン多糖類及びアルテルナンスクラーゼ酵素を除去する、或いは更なる膜濾過で得られる保持液を濃縮する等の更なるステップは含まれていない）、スクロース量の増加、スクロース供給速度の増加、酵素活性の増加及び温度の上昇によって短縮できる。

【符号の説明】

【0118】

Ｐ１：バッチでの生物変換
Ｐ２：限外濾過
Ｐ３：ナノ濾過
Ｐ４：濃縮
Ｓ１：生物変換
Ｓ２：限外濾過
Ｓ３：濃縮
１：バッチ式反応器
２：生物変換
３：膜濾過（実施例では限外濾過）
３´：膜濾過装置（実施例では限外濾過装置）
４、４´、４´´：水性液体（実施例では水）
５：ナノ濾過
５´：ナノ濾過装置
６：フルクトース
７：蒸発脱水
７´：蒸発脱水装置
８：アルテルナンオリゴ糖（実施例ではマルトースアルテルナンオリゴ糖（ＭＡＯＳ））
９：スクロース
１０：供給
１１：反応器
１２：アクセプター分子（実施例ではマルトース）
１３：アルテルナンスクラーゼ（ＡｌＳｕ）
１４：アルテルナンポリマー（アルテルナン多糖類）
１５：ロイクロース
１６：膜を含む装置（実施例では膜セル）
１７：膜濾過（実施例では生物変換とナノ濾過（定容積ダイアフィルトレーション））

【図1】

【図2】

【図3】