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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-10
(45)【発行日】2025-02-19
(54)【発明の名称】加齢関連疾患及び症状の遺伝子治療法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/761 20150101AFI20250212BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250212BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250212BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20250212BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20250212BHJP
【ＦＩ】
A61K35/761
A61K47/68
A61K48/00
A61P9/04 ZNA
A61P43/00 105
A61P43/00 121
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/864 100Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2018560974
(86)(22)【出願日】2017-05-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-07-11
(86)【国際出願番号】 US2017033815
(87)【国際公開番号】W WO2017201527
(87)【国際公開日】2017-11-23
【審査請求日】2020-05-22
【審判番号】
【審判請求日】2022-08-05
(31)【優先権主張番号】62/339,182
(32)【優先日】2016-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/421,665
(32)【優先日】2016-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507044516
【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】デイビッドソン、 ノア
(72)【発明者】
【氏名】チャーチ、 ジョージ エム．
【合議体】
【審判長】冨永 みどり
【審判官】関 景輔
【審判官】齋藤 恵
(56)【参考文献】
【文献】特表２００１－５１５３６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２６４４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５３２０２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／２１３５１２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】ウイルス（１９９７）， ｖｏｌ．４７， ｐ２２１－２３０
【文献】Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１６， ｖｏｌ．７８， ｐ．２２３－２４１
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K
C12N
Ｃａｐｌｕｓ、Ｍｅｄｌｉｎｅ、Ｂｉｏｓｉｓ、Ｅｍｂａｓｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ（ｓＴＧＦβＲ２）タンパク質をコードする第一の核酸配列を有する領域と、ＦＧＦ２１タンパク質をコードする第二の核酸配列を有する領域とを含み、ｓＴＧＦβＲ２タンパク質とＦＧＦ２１タンパク質の両方を発現する、ウイルスベクター；又はｓＴＧＦβＲ２タンパク質をコードする第一の核酸配列を有する領域を含み、ｓＴＧＦβＲ２タンパク質を発現する第一のウイルスベクターと、ＦＧＦ２１タンパク質をコードする第二の核酸配列を有する領域を含み、ＦＧＦ２１タンパク質を発現する第二のウイルスベクターと
を含み、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列は、それぞれｓＴＧＦβＲ２タンパク質又はＦＧＦ２１タンパク質の少なくとも一方の発現のための同一の又は異なる制御配列に作動可能に連結されている、
心不全の治療において使用するための組成物。
【請求項2】
前記第一の核酸配列及び／又は前記第二の核酸配列のための前記制御配列が構成的プロモーター又は誘導性プロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記第一の核酸配列及び／又は前記第二の核酸配列のための前記制御配列が、ｈｅＦ１ａプロモーター、ＣＡＧＧＳ（サイトメガロウイルス、ニワトリβアクチンイントロン、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアセプター）、ＣＭＶ、ｓｈＥｆ１ａ（切断型ｈＥｆ１ａ）、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＣＡＳＩ、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記第一の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現のために３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記３′非翻訳領域が、ＷＰＲＥ、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（切断型、配列番号１１４）、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、ウサギβグロビンポリＡ、ウシｂｇｐＡ、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、並びにこれらのハイブリッドからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記第一の核酸配列が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタのｓＴＧＦβＲ２タンパク質からなる群から選択されるｓＴＧＦβＲ２タンパク質をコードする、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ｓＴＧＦβＲ２タンパク質が、配列番号７、８、及び９で表されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ｓＴＧＦβＲ２タンパク質及びＦＧＦ２１タンパク質の少なくとも１つが、Ｉｇ Ｆｃドメインとの融合タンパク質であり、前記Ｉｇ Ｆｃドメインが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタのＩｇ Ｆｃからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記Ｉｇ Ｆｃが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧのサブタイプのＦｃである、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記Ｉｇ Ｆｃが、配列番号１１又は１３で表されるＩｇ Ｆｃのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項11】
前記第一の核酸配列と前記第二の核酸配列が、ポリシストロニック転写産物からのｓＴＧＦβＲ２タンパク質及びＦＧＦ２１タンパク質の発現のためのポリシストロニックエレメントを介して作動可能に連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記ポリシストロニックエレメントがＩＲＥＳ又は２Ａ配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願データ
本出願は、２０１６年５月２０日に出願された米国仮出願第６２／３３９，１８２号及び２０１６年１１月１４日に出願された米国仮出願第６２／４２１，６６５号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本出願は、２０１６年５月２０日に出願された米国仮出願第６２／３３９，１８２号及び２０１６年１１月１４日に出願された米国仮出願第６２／４２１，６６５号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【0002】
加齢とは、細胞、組織、及び臓器レベルでの段階的な機能の喪失及び悪化であり、疾患及び外的ストレス要因に対する感受性を増加させ、最終的には死に至る。全ての生物は老化するが、加齢の影響を遅らせたり、最小限に抑えたり、操作することが可能である。数多くの実験は、他の加齢関連病態に対する感受性の低下とともに、最大寿命及び健康寿命を増加させる能力を示している。今日までに試験された加齢介入には、カロリー制限（ＣＲ）などの環境操作、ラパマイシンなどの小分子薬、Ａｍｅｓ ｄｗａｒｆマウス及びＳｎｅｌｌ ｄｗａｒｆマウスなどのトランスジェニック動物の作製によって達成される遺伝子操作が含まれる。これらの実験は、加齢に関与するメカニズムのより深い理解をもたらしたが、老化するヒト及びペットの集団への返還には適していない。カロリー制限は、食事制限を厳密に遵守することを必要とし、これまでのエビデンスは、カロリー制限が治療の手段にならない可能性を示唆している。ラパマイシンは免疫調節作用を有し、特定の病原体に対する脆弱性を高めることができる。また、トランスジェニック動物を作製することは、既存のすべての生物には適用されない。癌耐性の遺伝的背景を持つマウスへのｈＴＥＲＴのＡＡＶ送達が、Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ ｄｅ Ｊｅｓｕｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．４（８）：６９１－７０４に記載されている。
【0003】
遺伝子治療法が知られている。例えば、ＧＬＹＢＥＲＡは、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）の筋肉内注射を介して関与遺伝子のワーキングコピーを加えることによって、リポタンパク質リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）を治療するｕｎｉＱｕｒｅによるヒト遺伝子治療である。ＳＰＫ－ＲＰＥ６５はＳｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製であり、非機能的ＲＰＥ６５遺伝子による稀な失明症状を治療するヒト遺伝子治療薬である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、１又は複数の内因性タンパク質を提供又は調節するための併用遺伝子治療法などの遺伝子治療法を提供する。本開示は、遺伝子治療を用いて加齢関連疾患及び症状又は前記加齢表現型を治療又は予防する方法を提供する。本開示は、加齢に関連した特定の疾患及び症状に関連する可能性のある遺伝子の同定を提供する。本開示は、遺伝子に関連するタンパク質の増加又は減少によるそうした遺伝子の調節を提供する。本開示は、細胞内で発現される機能性タンパク質をコードする核酸を導入することにより、遺伝子に関連する該機能性タンパク質を増加させることを提供する。発現は、細胞内であるか又は分泌され得る、治療効果又は予防効果を提供する機能性タンパク質の量の増加をもたらす。本開示は、発現された場合に遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡに結合して機能性タンパク質の発現を阻害する阻害性ＲＮＡをコードする核酸を導入することにより、遺伝子を阻害して該遺伝子に関連する機能性タンパク質を減少させることを提供する。本開示は、発現された場合に機能性タンパク質に結合する可溶性受容体タンパク質などのタンパク質阻害剤をコードする核酸を導入することによって、機能性タンパク質を阻害して該機能性タンパク質の活性を低下させることを提供する。本開示は、動物において細胞を標的とする遺伝子構築物及びウイルスベクターなどのベクターを用いた該遺伝子構築物の送達を用いる遺伝子治療法を提供する。本開示は、動物において細胞を標的とする遺伝子構築物、及びリポソーム、合成又は天然に存在するポリマー、エレクトロポレーション、被覆又は非被覆のナノ粒子送達、遺伝子銃送達、レーザー媒介トランスフェクション（オプトポレーション又は光トランスフェクション）などの手段を用いた該遺伝子構築物の送達を用いる遺伝子治療法を提供する。例えば、Ｋｉｍ、Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ及びＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３９７（８）：３１７３－３１７８を参照。本開示は、動物において細胞を標的とする遺伝子構築物及び該遺伝子構築物の送達を用いる遺伝子治療法であって、前記遺伝子構築物が元のＤＮＡからｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、又はｍＲＮＡ（ｍＲＮＡは５′キャップ及び３′ポリＡ又は同等物からなる）に加工されている遺伝子治療法を提供する。さらなる態様によれば、ＲＮＡは、当業者に公知の５′キャップ類似体又は当業者に公知の３′ポリＡ類似体を使用する翻訳のためにリボソームに標的化される。本明細書に記載の遺伝子治療法について、遺伝子若しくは遺伝子産物、前記遺伝子をコードするＤＮＡ、又は前記遺伝子に対応するｍＲＮＡ若しくはプロセシングされたｐｒｉ－ｍＲＮＡ若しくは前記遺伝子に対応するｍｉＲＮＡを改変又は調節して本明細書に記載の治療法又は予防法において細胞作用をもたらす限り、本開示は、本明細書に記載の遺伝子治療法において前記遺伝子若しくは遺伝子産物、前記遺伝子をコードするＤＮＡ、又は前記遺伝子に対応するｍＲＮＡ若しくはプロセシングされたｐｒｉ－ｍＲＮＡ若しくは前記遺伝子に対応するｍｉＲＮＡの使用を提供する。
【0005】
加齢関連疾患又は症状に関連する特定のタンパク質を調節又は提供することにより、加齢関連疾患又は症状に対処するための予防的方法又は治療方法が提供される。加齢関連疾患及び症状に関連する遺伝子に対応する、特定のタンパク質、遺伝子、前記遺伝子をコードする遺伝子産物、又は前記遺伝子に対応するｍＲＮＡ若しくはプロセシングされたｐｒｉ－ｍＲＮＡ若しくは前記遺伝子に対応するｍｉＲＮＡを調節又は提供することにより、ヒト及び他の哺乳動物を含む生物を若返らせる方法を提供する。本開示は、動物において遺伝子などの１以上又は複数の核酸が１又は複数の標的細胞に送達される、遺伝子治療法を提供する。本開示は、単一のベクターを使用して複数の核酸の発現を駆動する単一のプロモーターを含む前記複数の核酸の細胞への送達を提供する。１以上又は複数の核酸が発現され１又は複数の対応するタンパク質が産生され、前記１又は複数のタンパク質は前記生物の状態を変化させる。本開示は、動物において１以上又は複数の核酸によって異なる細胞型が標的化される併用療法を提供する。
【0006】
本開示は、細胞内の１又は複数の細胞プロセスが１以上又は複数の核酸によって標的化される併用療法を提供する。本開示は、パルボウイルスビリオンなどのウイルスベクターを用いた遺伝子治療を提供する。本開示は、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）などのウイルスベクターを用いた遺伝子治療を提供する。アデノ随伴ウイルスは細胞に外因性遺伝子を挿入し、該外因性遺伝子によってコードされるタンパク質が発現されることになる。このようにして、前記タンパク質は、機能性タンパク質、阻害性ＲＮＡ、又は阻害性タンパク質のいずれであろうと、細胞及び／又は細胞を有する生物を変化させることになる。
【0007】
本開示は、加齢関連疾患又は症状の緩徐化、阻害、予防、又は逆向を提供する。加齢関連若しくはその他の疾患又は症状の例としては、心臓血管疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、肥満、癌、感染、及び神経学的障害の１又は複数が挙げられる。本開示は、加齢関連若しくはその他の疾患又は症状を治療及び／又は予防するための長期遺伝子治療法を提供する。この方法には、加齢関連疾患及び症状を逆向させ、これらの病理学的状態を矯正して、健康寿命（長年の良好な生活の質）及び寿命の延長をもたらすことが含まれる。
【0008】
本開示は、加齢に関連する疾患又は症状などの疾患又は症状の１又は複数を予防又は治療する、調節すべき遺伝子又は遺伝子のセットを同定する方法を提供する。前記遺伝子又は遺伝子のセットは、加齢関連の疾患又は症状に関連するものとして同定される。前記遺伝子は、特定の組織型に関連又は非関連であると判定され、所望の方法を用いて遺伝子の適切な調節が決定され得る。さらに、特定の組織型に関連する遺伝子は、特定の組織型細胞に核酸、阻害性ＲＮＡ、又は阻害性タンパク質を送達して特定の組織型細胞内のタンパク質の量又は活性を調節する特定のベクターを用いる調節から利益を得ることが可能である。組織特異的プロモーターは、核酸を発現させるために使用され得る。
【0009】
特定の機能性タンパク質、阻害性ＲＮＡ、又は阻害性タンパク質をコードする例示的な核酸は、別表Ａに提供されており、その配列は別表Ａに提供されているか、又は文献上公知であるか若しくは容易に入手可能である。同様に、前記機能性タンパク質、阻害性ＲＮＡ、又は阻害性タンパク質の配列は、当業者に公知であるか、又は核酸配列由来であり得る。別表Ｂは、マウスバージョンの遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列、及び複数のＲＮＡ種を標的とするｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ ＤＮＡ構築物を含む。
【0010】
本明細書に記載の機能性タンパク質は、全長タンパク質であってもよく、全長タンパク質とは異なるが全長タンパク質の全部又は一部の活性を保持するタンパク質であってもよい。
【0011】
本発明の特定の実施形態のさらなる特徴及び利点は、以下の実施形態の説明及び図面並びに特許請求の範囲からより十分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＡＡＣ手術の７週間後の代表的な心エコー図である。
【図2】投与量に対するＴＧＦｂ１ノックダウンを示すデータのグラフである。
【図3】線維症の割合を示すデータのグラフ及び関連する画像である。
【図4】対照の心臓切片及び処置された心臓切片のＷＧＡ染色を示す画像である。
【図5】ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ投与に対する対照における心臓パラメータの変化を示すデータのグラフである。
【図6】代表的なトリクローム染色像である。
【図7】時間（日数）に対する生存率のグラフである。
【図8A】ＦＧＦ２１についての時間（日数）に対する体重減少のグラフである。
【図8B】種々のＦＧＦ２１遺伝子治療についての時間（日数）に対する重量損失のグラフである。
【図9】ＧＤＦ１５、アディポネクチン、ＺＡＧ、及びＮｒｆ２についての時間（日数）に対する重量減少のグラフである。
【図10】ＩＴＲｓプロモーターｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ及び３′ＵＴＲを含むウイルス構築物のベクターマップである。
【図11】ＩＴＲｓプロモーターＮｒｆ２及び３′ＵＴＲを含むウイルス構築物のベクターマップである。
【図12】７個のＰｒｉ－ｍｉＲＮＡの可能な構築物のベクターマップ、及びそれらが連結される順序を示す。ｍｉＲＮＡの適切なプロセッシングのための「ｓｈＲＮＡ」部分においてミスマッチが計画されている場所についても赤い印を付してある。
【図13】６個のＰｒｉ－ｍｉＲＮＡの可能な構築物のベクターマップ、及びそれらが連結される順序を示す。ｍｉＲＮＡの適切なプロセッシングのための「ｓｈＲＮＡ」部分においてミスマッチが計画されている場所についても赤い印を付してある。
【図14】ＥＬＩＳＡアッセイのデザインを示す。
【図15】イヌ血清中のＴＧＦｂ１に対する可溶性ＴＧＦｂ受容体２の結合データを示す。
【図16】対照マウスの摂餌量に対するＦＧＦ２１で処置したマウスの摂餌量のグラフである。
【図17】対照マウスに対するＦＧＦ２１で処置したマウスのデータを示す。
【図18】グルコース値のデータを示す。
【図19】短縮率データを示す。
【図20】遺伝子治療後の生存率のデータを示す。
【図21】健康寿命の増加に着目したデータを示す。
【図22】対照マウスの腎臓に対する本明細書に記載の遺伝子治療を受けたマウスの腎臓を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本開示は、機能性タンパク質、阻害性ＲＮＡ、又は阻害性タンパク質をコードする１以上又は複数の核酸が対象内の細胞に付与される遺伝子治療法を提供する。前記１以上又は複数の核酸は、老化及び加齢に関連する生理学的低下に伴う疾患又は症状を治療又は予防するために、１又は複数のベクターによって投与されるか、又はＡＡＶなどの単一のウイルスベクターに組み合わされる。
【0014】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上他に明示しない限り、複数形に対する参照も含まれる。したがって、例えば、「タンパク質（a protein）」に言及する場合、２以上のタンパク質を含み、「賦形剤（an excipient）」に言及する場合、２以上の賦形剤を含む。
【0015】
「又は」の使用は、他に記載がない限り、「及び／又は」を意味することがさらに理解される。同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」は互換的であり、限定することを意図するものではない。また、様々な実施形態の説明が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という言葉を使用して代替的に説明することができることを理解するであろう。
【0016】
図面を含む前述の一般的な説明、及び以下の詳細な説明は例示的及び説明的なものに過ぎず、本開示を限定するものではない。
【0017】
本明細書で使用されるセクション見出しは、構成的な目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0018】
定義
本開示に関連して、本明細書の記載において使用される技術的用語及び科学的用語は、他に特に定義されない限り、当業者によって一般的に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図している。
本開示に関連して、本明細書の記載において使用される技術的用語及び科学的用語は、他に特に定義されない限り、当業者によって一般的に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図している。
【0019】
本明細書で使用される「遺伝子」は、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドを発現する転写領域とも呼ばれる核酸領域を指す。転写されたポリヌクレオチドは、適切な調節領域の制御下に置かれた場合にコードされたポリペプチドに翻訳され得る、機能性タンパク質などのポリペプチドをコードする配列を有することができる。遺伝子は、プロモーター、５′リーダー配列、コード配列、及びポリアデニル化部位などの３′非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された断片を含み得る。キメラ遺伝子又は組換え遺伝子は、例えば、転写されたＤＮＡ領域の一部又は全部に本来はプロモーターが結合しない遺伝子のような、自然界には通常見出されない遺伝子である。「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写され、及び／又は機能的タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
【0020】
「遺伝子送達」又は「遺伝子導入」とは、組換えＤＮＡ又は外来ＤＮＡを宿主細胞に導入するための方法を指す。導入されたＤＮＡは、非組み込みのままであってもよいし、好ましくは宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。遺伝子送達は、例えば、形質導入、ウイルスベクターの使用、又はエレクトロポレーション、細胞衝撃などの既知の方法を用いた細胞の形質転換によって行うことができる。
【0021】
「導入遺伝子」は、宿主細胞に導入された遺伝子を指す。導入遺伝子は、細胞に固有の配列、細胞内に天然に存在しない配列、又はそれらの組み合わせを含み得る。導入遺伝子は、細胞内のコード配列の発現のための適切な調節配列に作動可能に連結され得る１又は複数のタンパク質をコードする配列を含み得る。
【0022】
「形質導入」とは、例えばｒＡＡＶなどの遺伝子送達ベクターによるレシピエント宿主細胞への核酸分子の送達を指す。例えば、ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞の形質導入により、該ビリオンに含まれるｒＡＡＶベクターが形質導入細胞へ移動される。「宿主細胞」又は「標的細胞」とは、核酸送達が行われる細胞を指す。
【0023】
「機能性タンパク質」には、全長タンパク質の変異体、突然変異体、相同体、及び機能的フラグメントが含まれる。当業者は、全長タンパク質の全部又は一部の活性を保持する完全長タンパク質と相同なタンパク質を容易に構築することができるであろう。
【0024】
「ベクター」は、一般に、ヌクレオチド配列のクローニング及び発現に適した核酸構築物を指す。ベクターの一例は、ウイルスベクターである。また、ベクターという用語は、ベクターを宿主細胞中及び宿主細胞間へ移行可能なウイルス又はビリオンなどのベクターを含む運搬体を指すこともある。
【0025】
「ＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶベクター」とは、例えば血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、ＡＡｖＤＪ、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸなどのアデノ随伴ウイルス由来の組換えベクターを指す。ｒＡＡＶベクターは、１つ又は好ましくは全ての野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失されているが、機能的ＩＴＲ核酸配列は含み得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、及びパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列又は（以下に定義する）実質的に同一の配列であってもよく、それらが機能性を保つ限り、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失、又は置換によって変更されてもよい。
【0026】
「治療有効量」とは、加齢関連疾患又は症状に関する結果などの所望の治療結果を達成するために必要な用量及び期間において有効な量を指す。パルボウイルスビリオン又は医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びにパルボウイルスビリオン又は医薬組成物が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因によって変化し得る。投与レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調節されていてもよい。治療有効量はまた、典型的には、パルボウイルスビリオン又は医薬組成物の治療上有益な効果が、毒性又は有害な効果を上回るものである。
【0027】
「予防的有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な用量及び期間において、例えば、様々な加齢関連疾患又は症状の予防又は抑制に有効な量を指す。予防的用量は、疾患の発症前又は初期の対象において使用されてもよく、場合によっては、予防的有効量は治療有効量より多くても少なくてもよい。
【0028】
「核酸」は、モノマーヌクレオチドから構成された又はモノマーヌクレオチドを含む任意の分子を含む。本明細書中において、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸」と互換的に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであってもよい。核酸は、ＤＮＡ又ＲＮＡであってもよい。核酸は、遺伝子であってもよい。核酸は、化学的に改変されていても人工的であってもよい。人工核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。これらの各々は、分子の骨格への変化によって天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドを使用してもよい。
【0029】
本明細書において、「核酸構築物」は、組換えＤＮＡ技術の使用により生じる人工核酸分子を意味すると理解される。核酸構築物は、核酸のセグメントを含むように改変された一本鎖又は二本鎖の核酸分子であり、天然には存在しないと考えられる様式で組み合わされて並置される。核酸構築物は、通常、「ベクター」、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される核酸分子である。核酸構築物の１つのタイプは、「発現カセット」又は「発現ベクター」である。これらの用語は、宿主生物又は前記配列と適合する宿主細胞において遺伝子の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を指す。発現カセット又は発現ベクターは、典型的には、適切な転写調節配列及び任意に３′転写終結シグナルを少なくとも含む。発現エンハンサーエレメントなどの、発現に必要な又は有用なさらなる因子も存在し得る。核酸構築物はまた、ＤＮＡの代わりにＲＮＡとして作用することによってタンパク質を発現又は抑制させるベクターであってもよい。標的タンパク質の発現が増加する場合、この核酸構築物は、細胞又はより具体的にはリボソームがタンパク質の多くのコピーを認識して生成する、ｍＲＮＡ又は同様のものであり得る。標的配列の発現を抑制する場合、ＲＮＡは、リボソームがタンパク質を生成することを防止することによって作用する形態であり得、これは、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はＰｒｉ－ｍｉＲＮＡのメカニズムを介して行われ得る。当業者はまた、ブール論理を介して、標的配列の既知の抑制因子を抑制すると、実際には抑制によって標的配列が増加することを想像することができ、ｍＲＮＡ（若しくは類似物）又はｓｈＲＮＡ（若しくは類似物）のいずれかの送達による「逆位」又は「暗示」により標的配列の調節を生じ得るように、当業者は標的タンパク質を取り除き得る。これは、ＡＡＶにおけるように発現されなければならないＤＮＡを提供するベクターを介して行うこともできる。
【0030】
「作動可能に連結」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」される。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるということは、連結されているＤＮＡ配列が通常は連続しており、必要であれば２つのタンパク質コード領域の連結が連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。
【0031】
「発現制御配列」は、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列がヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合、前記発現制御配列はヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されている。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、（マルチシストロン発現を可能にする）２Ａペプチド配列、及び停止コドンを含むことができる。用語「発現制御配列」は、発現に影響を及ぼすように設計された配列を最小限含み、さらに有利な成分を含み得ることを意図する。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。この用語には、フレーム内及びフレーム外の望ましくない潜在的な開始コドンが配列から除去されるような核酸配列の設計も含まれ得る。この用語には、望ましくない潜在的なスプライス部位が除去されるような核酸配列の設計も含まれ得る。この用語には、ポリＡテール、すなわちポリＡ配列とも呼ばれるｍＲＮＡの３′末端にアデニン残基の鎖を付加することを指示する、配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。また、ｍＲＮＡの安定性を高めるように設計することもできる。昆虫細胞での使用に適した転写及び翻訳の安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えば、プロモーター、及び翻訳に影響を与える配列、例えばＫｏｚａｋ配列は、当業者に周知である。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが達成されるように作動可能に連結されたヌクレオチド配列を調節するような性質を有し得る。
【0032】
機能性ドメインを既知のタンパク質に融合することもできる。カタラーゼがミトコンドリアへ往復するよう標的化されてその天然の位置の代わりにミトコンドリアの内部又は近傍で機能を果たすように、ミトコンドリアシグナルがＣＡＴ（カタラーゼ）に融合される場合が挙げられる。他のタンパク質に標的シグナルを加えて、細胞の他の部分に標的化されるか、又は細胞から分泌させることさえ可能である。いくつかのタンパク質の場合、ＴＧＦｂＲ２のヒト又はマウスの分泌シグナルを取り出し、それをイヌ型の当該タンパク質に融合させるなど、効果を高めるために、よく知られている型のタンパク質が天然配列を置き換えることができる。
【0033】
「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する核酸フラグメントを指し、並びに限定されるものではないが、転写因子結合部位、抑制タンパク質結合部位及び活性化タンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を直接的に又は間接的に調節することが当業者に知られている、例えば、アテニュエーター又はエンハンサー、及びサイレンサーなど、他の任意のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的条件下及び発生学的条件下で、ほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば、化学誘引物質の適用により生理学的又は発生学的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の組織又は細胞においてのみ活性である。本開示は、哺乳動物細胞適合性発現制御配列、例えばプロモーターへの核酸構築物の作動可能な連結を提供する。このようなプロモーターの多くは当技術分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１、上記参照）。ＣＭＶプロモーター及びｈＥｆ１αプロモーターなど、多くの細胞型で広く発現される構成的プロモーターが開示される。より短いが依然として効果的な構成的発現を付与する全長ｈＥｆ１αの変異体も開示される。誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、又は細胞周期特異的プロモーターが開示される。開示された実施形態において、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素をコードするヌクレオチド配列は、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結される。肝臓特異的プロモーターは、非赤血球デアミナーゼと併用することが特に好ましい。好ましくは、本開示の構築物において、肝臓特異的発現のための発現制御配列は、例えば、α１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択される。他の例としては、腫瘍選択的発現、特に神経細胞腫瘍選択的発現のためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５－９）又は単核血液細胞において使用するためのＩＬ－２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８５：２１０１－１０）が挙げられる。
【0034】
（３′非翻訳領域又は３′末端とも呼ばれることが多い）「３′ＵＴＲ」又は「３′非翻訳配列」は、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を指し、例えば、転写終結部位及び（全てではないがほとんどの場合、真核生物ｍＲＮＡにおいて）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はその変異体など）を含む。転写終結後、ｍＲＮＡ転写産物はポリアデニル化シグナルの下流で切断され、ｍＲＮＡの細胞質（そこで翻訳が行われる）への輸送に関与するポリＡテールが付加され得る。
【0035】
本明細書で使用される「天然に存在する配列」又は「天然配列」は、天然に存在する供給源から単離されたポリヌクレオチド又はアミノ酸を指す。「天然配列」には、天然形態と同一の配列を有する天然のポリペプチド又はポリヌクレオチドの組換え形態が含まれる。
【0036】
本明細書で使用される「突然変異」又は「変異」は、置換、挿入、及び／又は欠失によって改変されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、突然変異配列又は変異配列は、親配列と比較して、増加した、減少した、又は実質的に類似の活性若しくは特性を有し得る。
【0037】
「配列同一性の割合」及び「相同性の割合」は、本明細書において互換的に使用されてポリヌクレオチド幹及びポリペプチド間の比較を指し、比較ウィンドウにわたる２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、前記比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントのための参照配列と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算してもよい。あるいは、割合は、両方の配列において同一の核酸塩基若しくはアミノ酸残基が生じる位置の数、又は核酸塩基若しくはアミノ酸残基がギャップと整列する位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算してもよい。当業者には、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することが理解される。比較のための配列の最適なアライメントを、例えば、局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、類似方法の検索（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は外観検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）により行うことができる。
【0038】
配列同一性の割合及び配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３８９－３４０２にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトに公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又は満足する、クエリ配列内の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値を表す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記参照）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種として機能する。次に、前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（マッチする残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びパラメータＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの延長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少した場合、１又は複数のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合、又はいずれかの配列の終わりに達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）。
【0039】
アミノ酸配列同一性の割合の程度は、アラインメントにおけるマッチ数を数え、そのマッチ数を参照配列の長さで除算し、デフォルトＣｌｕｓｔａｌＷパラメータ（ギャップオープンペナルティ：１０；ギャップ延長ペナルティ：０．１０；タンパク質重量マトリックス：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ；ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ；Ｔｏｇｇｌｅ Ｓｌｏｗ／Ｆａｓｔペアワイズアラインメント＝ＳＬＯＷ又はＦＵＬＬアライメント）を使用してｓｌｏｗ／ａｃｃｕｒａｔｅペアワイズ最適アライメントを実現することにより、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析（バージョンＷ１．８）を行い、得ることができる。
【0040】
「対象」又は「患者」とは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル又はヒト）などの哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、及びブタなどの家畜動物又はヒト対象である。いくつかの実施形態では、ヒトは成人患者である。いくつかの実施形態では、ヒトは小児患者である。
【0041】
機能性タンパク質発現及び機能性タンパク質の発現調節による遺伝子治療
以上に要約したように、本開示は、標的遺伝子に関連する疾患又は症状を治療又は予防する方法において、１以上又は複数の遺伝子又はそれらの関連する機能性タンパク質の調節を提供する。特に、個々の標的遺伝子又は標的遺伝子の１又は複数の組み合わせは、加齢関連疾患又は症状に関連する、及び／又は生物学的寿命に影響を及ぼす。記載された遺伝子治療によって標的とされる遺伝子又は遺伝子産物は、代謝活性、インスリン様増殖因子活性経路（すなわち、ＩＧＦ１／ＧＨ／ｍＴＯＲ軸）、ミトコンドリア機能、炎症／線維症、オートファジー、神経機能、ゲノム安定性などの多様な細胞の役割に関与する。遺伝子治療は、限定するものではなく例として、機能性タンパク質又はその変異型を過剰発現する核酸又は遺伝子；別の標的遺伝子／タンパク質を調節する機能性タンパク質の発現；標的遺伝子の発現を調節するための、阻害性ＲＮＡなどのポリヌクレオチドの発現；及び標的遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで改変する遺伝子編集システムの発現の１又は複数に基づき得る。このような核酸は、本明細書において、ヌクレオチド配列自体は自然に生じないが、むしろ人間の介入によって設計、操作、及び／又は構築されたことを意味すると理解される「合成ヌクレオチド配列」であり得る。したがって、「合成」という用語は、必ずしもその配列が化学合成によってのみ及び／又は完全に化学合成から得られることを意味するものではない。むしろ、合成配列の一部分は、ある段階において化学合成によって得られたものであってもよいが、本発明の合成配列を含む分子は、通常、細胞（培養細胞、例えば組換え細胞）などの生物源から得られることになる。
以上に要約したように、本開示は、標的遺伝子に関連する疾患又は症状を治療又は予防する方法において、１以上又は複数の遺伝子又はそれらの関連する機能性タンパク質の調節を提供する。特に、個々の標的遺伝子又は標的遺伝子の１又は複数の組み合わせは、加齢関連疾患又は症状に関連する、及び／又は生物学的寿命に影響を及ぼす。記載された遺伝子治療によって標的とされる遺伝子又は遺伝子産物は、代謝活性、インスリン様増殖因子活性経路（すなわち、ＩＧＦ１／ＧＨ／ｍＴＯＲ軸）、ミトコンドリア機能、炎症／線維症、オートファジー、神経機能、ゲノム安定性などの多様な細胞の役割に関与する。遺伝子治療は、限定するものではなく例として、機能性タンパク質又はその変異型を過剰発現する核酸又は遺伝子；別の標的遺伝子／タンパク質を調節する機能性タンパク質の発現；標的遺伝子の発現を調節するための、阻害性ＲＮＡなどのポリヌクレオチドの発現；及び標的遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで改変する遺伝子編集システムの発現の１又は複数に基づき得る。このような核酸は、本明細書において、ヌクレオチド配列自体は自然に生じないが、むしろ人間の介入によって設計、操作、及び／又は構築されたことを意味すると理解される「合成ヌクレオチド配列」であり得る。したがって、「合成」という用語は、必ずしもその配列が化学合成によってのみ及び／又は完全に化学合成から得られることを意味するものではない。むしろ、合成配列の一部分は、ある段階において化学合成によって得られたものであってもよいが、本発明の合成配列を含む分子は、通常、細胞（培養細胞、例えば組換え細胞）などの生物源から得られることになる。
【0042】
いくつかの実施形態では、例えば、ウイルスベクター系又はＣａｓ９ガイドＲＮＡ系によって投与され得る、治療用途のための遺伝子及び対応する発現遺伝子産物が表１に示される。
【0043】
【表1】
【0044】
【表2】
【0045】
【表3】
【0046】
【表4】
【0047】
【表5】
【0048】
表１の記載は、例示的な遺伝子、及び遺伝子が方法において過剰発現されるか（「過剰発現」）又は阻害されるか（「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ」）を同定する。このように、前記記載が「過剰発現」遺伝子が参照する場合、遺伝子治療は、示されたタンパク質産物をコードする核酸が使用され、タンパク質産物が過剰発現される場合を指す。したがって、そのような記載において、同定された遺伝子への参照はまた、この遺伝子によってコードされるタンパク質も指す。例えば、「Ｋｌｏｔｈｏ」は、遺伝子及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質の両方を意味し得る。いくつかの実施形態において、核酸は、天然に存在する発現タンパク質の変異型であるタンパク質産物をコードし得る。限定するものではなく一例として、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）は、天然のＡｄｒａ１ａタンパク質産物の変異型をコードする核酸配列を指し、ここで、受容体タンパク質の発現される変異型は構成的に活性である。表１の記載が「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ」を参照する場合、遺伝子治療は、発現されるｐｒｉ－ｍｉＲＩＮＡ／ｓｈＲＮＡが標的遺伝子の遺伝子産物の発現を阻害するか最終的に弱める場合には前記発現されるｐｒｉ－ｍｉＲＩＮＡ／ｓｈＲＮＡのための配列を有する核酸の使用を指す。
【0049】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療のための核酸は、本明細書に提供されるか当技術分野で公知である遺伝子配列に相同であり、参照タンパク質、阻害ＲＮＡ、又は阻害タンパク質として機能する配列を使用し得る。したがって、本開示は、本明細書中に記載される核酸配列、及び該核酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％相同である核酸配列を意図する。同様に、本開示は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列、及びタンパク質が少なくとも部分的に又は全体的に機能又は活性を保持するように、前記アミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列を意図する。当業者は、遺伝コードの縮重に基づいて既知のタンパク質をコードするために、本明細書で同定された核酸配列又は当技術分野で公知のものとは異なる核酸配列を容易に設計することができることを理解されたい。したがって、本明細書中の特定の核酸配列の同定は限定的なものではないことを理解されたい。
【0050】
表１の各遺伝子及び対応する核酸は、遺伝子治療法において別々に使用して、所望の生理学的（例えば、治療的）効果を生じさせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、表１の核酸の組み合わせを遺伝子治療法で使用して、所望の治療効果を生じさせることができる。このように、本開示は、本明細書に記載されるように、遺伝子治療において使用するための、表１中の遺伝子及び対応する核酸の可能な組み合わせの全てを包含する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、表１の番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３の核酸のいずれか又はすべての組み合わせを含み、前記組み合わせは、特に加齢関連疾患又は症状の治療又は予防に関して、意図された治療効果を有する。当業者は治療方法で使用するための核酸の組み合わせ及び副次的組み合わせを容易に想定できることを理解されたい。
【0051】
ある態様によれば、ＦＧＦ２１又はＫｌｏｔｈｏなどの表１の１又は複数の遺伝子は、その半減期を増加させるために、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣによって例示されるような安定化ペプチドに作動可能に連結され得る。当業者は、適切な融合ペプチドを容易に同定することができ、その例はＦＣである。また、本開示は、遺伝子によってコードされるタンパク質の安定性又は半減期を増加させるために、ＦＧＦ２１及びＫｌｏｔｈｏなどの表１に列挙される１又は複数の遺伝子の改変を意図する。
【0052】
ある態様によれば、ＦＧＦ２１又はＫｌｏｔｈｏなどの表１の１又は複数の遺伝子は、発現を増強する様式で分泌シグナルが分泌タンパク質に結合されるように、分泌シグナルに作動可能に連結され得る。当業者は、適切な分泌シグナル及び発現増強のために分泌シグナルを分泌タンパク質に付加する方法を容易に同定することができる。
【0053】
表２に特定されるいくつかの実施形態において、加齢関連疾患又は症状を治療又は予防するための遺伝子治療方法は、それを必要とする対象に、上記表１に記載の遺伝子産物を発現する以下の遺伝子を発現する、有効量の単一のベクター又は複数のベクターを投与することを含む。
【0054】
【表6】
【0055】
【表7】
【0056】
【表8】
【0057】
上述の例示的な実施形態では、遺伝子治療に用いられる遺伝子が２つ以上存在する場合、これらの遺伝子は、個々に、又は許容される場合は、以下にさらに記載されるように、例えば意図された標的組織に基づいて、（例えば、ウイルス遺伝子治療ベクターの能力に基づいた）特定の組み合わせにおいて、別個の遺伝子送達ベクターに含まれていてもよい。
【0058】
本明細書においてさらに詳細に記載されるように、表１の核酸及び対応する核酸構築物、発現カセット、発現ベクター、発現制御配列、プロモーター、及び核酸配列の送達に関連する他のエレメントは、ウイルスベクターなどの遺伝子送達ベクターとして構築され得る。このベクターは、予防的効果又は治療的効果をもたらすように機能性タンパク質のレベルを変化させる核酸の発現を生じる条件下で哺乳動物に投与される。したがって、本開示はまた、表１に列挙された遺伝子及び対応する核酸のそれぞれに対するベクター、特にウイルスベクター、より詳細にはＡＡＶベクターを意図する。そのようなウイルスベクターの詳細は以下に記載される。
【0059】
いくつかの実施形態では、表１の核酸を集合的に調節して、所望の治療効果を生じさせることができる。遺伝子治療及び使用される対応する核酸は、とりわけ、代謝、ＩＧＦ１シグナル伝達又はＧＨシグナル伝達、タンパク質合成又はオートファジー、炎症、線維症、又は免疫応答、ゲノム安定性、癌、ミトコンドリア適応度若しくはミトコンドリア機能、酸化機能、又はニューロン機能に対する効果を含む、所望の効果に基づいて分類することができる。
【0060】
表３は、所望の効果を達成するために集合的に調節し得る、示された生物学的機能に対する効果に基づく例示的な遺伝子及びそれらのグループ分けを同定する。
【0061】
【表9】
【0062】
【表10】
【0063】
【表11】
【0064】
いくつかの実施形態において、遺伝子治療法は、表２又は表３の各群に規定される核酸（すなわち、遺伝子）の例示的な組み合わせに関する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、加齢に関連する代謝症状又は疾患を治療又は予防などのための、表１に規定されるような、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、Ｓｌｃ１３ａ１、ｍＴＯＲ、Ｃｅｂｐａ／Ｃｅｂｐｂ、Ｄｇａｔ１、Ｉｎｓｒ、Ｕｂｄ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、ＵＣＰ１、Ｐｃｋ１、Ｓｉｒｔ１、アディポネクチン、ＡＭＰＫ、ＰＣＳＫ９、及びＳｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）の核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、ＩＧＦ１／ＧＨ活性に関連する症状又は疾患の治療又は予防などのための、特に加齢関連疾患又は症状に関与するそのような活性に関する、表１に規定されるような、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、Ｐａｐｐａ、Ｋｌｏｔｈｏ、ｍＴＯＲ、Ｓｉｒｔ６、ｓＩＦＧ１ｒ－Ｆｃ、Ａｋｔ１、及びＲｐｓ６ｋｂ１（Ｓ６Ｋ１）の核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、タンパク質合成及びオートファジーに関連する症状又は疾患の治療又は予防などのための、特に加齢関連疾患又は症状に関与するそのような活性に関する、表１に規定されるような、ｍＴＯＲ、Ｃｉｓｄ２、Ａｔｇ５、Ａｋｔ１、ＴＦＥＢに対する核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、炎症、線維症、免疫症状又は疾患の治療又は予防などのための、特に加齢関連疾患又は症状に関与するそのような活性に関する、表１に規定されるような、Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２１、Ｃｔｆ１、Ｔｘｎ１、Ｎｒｆ２、Ｓｉｒｔ１、及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣの核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。例示的な遺伝子の組み合わせとしては、ＦＧＦ２１及びＫｌｏｔｈｏ；ＦＧＦ２１及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ；Ｋｌｏｔｈｏ及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ、又はＦＧＦ２１、Ｋｌｏｔｈｏ及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣが挙げられる。
【0068】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、ＤＮＡ損傷、ゲノム不安定性又は癌の治療又は予防などのための、特に加齢関連疾患又は症状に関与するＤＮＡ損傷又はゲノム不安定性などのそのような活性に関する、表１に規定されるような、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、ＮＵＤＴ１、ＢｕｂＲ１、ＴＥＲＴ、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、及びＨＡＳ２の核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、ミトコンドリア機能又は酸化的損傷に関連する症状又は疾患の治療又は予防などのための、特に加齢関連疾患又は症状に関与するそのような活性に関する、表１に規定されるような、Ａｄｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ｃｉｓｄ２、Ｃｏｑ７、ｍＣＡＴ、Ｍｔ１、Ｐｃｋ１、Ｓｉｒｔ６、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｎｒｆ２、及びＴＦＡＭの核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、認知障害又は認知低下などの神経学的症状又は疾患の治療又は予防などのための、特に加齢に関連する神経学的症状又は疾患に関する、表１に規定されるような、Ｉｋｂｋｂ、ＮＵＤＴ１、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＮＧＦ、ＮＥＵ１、ヒト化ＦｏｘＰ２、及びＰＤＥ４ｂの核酸の組み合わせ又は副次的組み合わせの使用を含む。
【0071】
生物学的プロセスの複数のクラスを治療するために、特にそれらの生物学的プロセスが加齢に関連していることから、生物学的プロセスの対応するクラスにおける症状又は疾患を治療又は予防するために使用される遺伝子及び対応する核酸の群は、遺伝子及び対応する核酸の１又は複数の他の群と組み合わせて使用可能であることも理解されたい。したがって、表１に列挙されるか、又は表２若しくは表３の異なる群で同定される遺伝子及び対応する核酸のあらゆる可能な組み合わせを使用する遺伝子治療法が、本開示に包含される。（ｉ）代謝症状又は疾患の治療又は予防、（ｉｉ）ＩＧＦ１／ＧＨ活性に関連する症状又は疾患、（ｉｉｉ）タンパク質合成及びオートファジーに関連する症状又は疾患、（ｉｖ）炎症、線維症、免疫症状又は疾患、（ｖ）ＤＮＡ損傷、ゲノム不安定性又は癌、（ｖｉ）ミトコンドリア機能又は酸化的損傷に関連する症状又は疾患、及び（ｖｉｉ）神経学的症状又は疾患のための遺伝子治療において使用される遺伝子及び対応する核酸の群は、複数のクラスの疾患又は症状、特に加齢に関連する複数の疾患又は症状を治療するために組み合わせて又は副次的に組み合わせて使用可能である。例として、神経学的疾患又は症状を治療又は予防するための遺伝子及び対応する核酸の群の組み合わせ又は副次的組み合わせ（ｖｉｉ）は、ミトコンドリア機能又は酸化的損傷、すなわち群（ｉｖ）に関連する疾患又は症状を治療又は予防するための遺伝子及び対応する核酸の群の組み合わせ又は副次的組み合わせとともに使用可能である。他のそのような例示的な組み合わせとしては、限定するものではなく例として、上記の群（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの２、３、４、５、６又は７つ全ての組み合わせが挙げられる。
【0072】
いくつかの実施形態では、本明細書における遺伝子治療方法の遺伝子及び対応する核酸のセットは、遺伝子治療の標的とされる組織型に基づいて選択することもできる。特定の組織における発現のための適切な遺伝子送達構築物は、遺伝子治療に関連する核酸を組み込むことができる。いくつかの実施形態では、組織特異的送達は、適切なウイルスベクター及びウイルスパッケージングシステムの選択に基づく。ウイルスベクターは、標的組織における遺伝子産物の発現を可能にする適切なプロモーター及び他の転写調節因子を組み込むことができる。ウイルスパッケージングシステムは、遺伝子治療ベクターが標的組織に送達されるように、ウイルスベクターをパッケージングするために使用されるウイルス成分の宿主細胞範囲特異性を利用することができる。ＡＡＶベクター及びキャプシド設計の観点から、天然に存在する誘導体又は合成誘導体のいずれかのＡＡＶ血清型は、以下にさらに詳細に記載されるように、遺伝子治療適用の指向性範囲を操作するために使用され得る。例えば、ニューロン標的遺伝子は、ＡＡＶ９のような血液脳関門を通過するように設計されたウイルスキャプシドを使用可能であり、肝臓標的遺伝子は、同程度には血液脳関門を通過しないが肝臓及び筋肉に蓄積するＡＡＶ８を使用可能である。
【0073】
他の組織特異的方法を用いて、とりわけ、組織特異的プロモーター及び標的組織で発現されるそれらの配列を標的とするｍｉＲＮＡ結合部位の使用を含む、対象となる組織における発現を制限することができる。表４は、本明細書で定義される例示的な遺伝子治療核酸、標的細胞又は組織、標的組織に対する適切な指向性を有するＡＡＶ血清型又は血清型の組み合わせ、特定の細胞又は標的組織において機能する発現を調節するための例示的なプロモーター、投与ルート、及び遺伝子のサイズを示す。Ａ＝脂肪組織、Ｍ＝筋肉組織、Ｂ＝脳組織、Ｌ＝肝組織、Ｅ＝生物全体にわたる全身送達、Ｎ＝非脳組織、及びＨ＝心臓組織。表４はまた、遺伝子産物が発現タンパク質であるか阻害性ＲＮＡであるかを示す。いくつかの実施形態では、遺伝子治療のための核酸は、発現されると１又は複数の非標的組織における遺伝子産物の発現を阻害又は減弱する発現阻害エレメントを含み、これは標的解除（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）とも呼ばれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８（２）：１１０４－１１１０を参照）。表４において、例示的な阻害エレメントは、肝臓などの特定の非標的組織においてｍＲＮＡ（又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡなどの他の転写ＲＮＡ）がサイレンシングされるような、発現されたｍＲＮＡの３′ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡの配列である。非標的組織において発現を標的解除するために使用される種々のｍｉＲＮＡは、とりわけ、肝細胞における発現をサイレンシングするためのｍｉＲＮＡ－１２２、神経細胞における発現をサイレンシングするためのｍｉＲＮＡ－１２４、及び造血細胞における発現をサイレンシングするためのｍｉＲＮＡ－１４２を含む。特定の細胞及び組織における発現を阻害するための当技術分野において公知の他のｍｉＲＮＡを、当業者は本開示の遺伝子治療用途に使用することができる。そのようなサイレンシングｍｉＲＮＡ標的配列の１つ又は組み合わせを用いて、１又は複数の非標的細胞及び組織における遺伝子治療構築物の望ましくない発現を阻害又は減弱することができ、前記非標的組織は互いに異なっていてもよい。
【0074】
【表12】
【0075】
【表13】
【0076】
【表14】
【0077】
表４の記載を考慮して、本開示は、表４の実施形態１～５３のそれぞれについて特定されたエレメント（すなわち、遺伝子、プロモーター、ｍｉＲＮＡサイレンサー）を含む例示的な遺伝子治療ベクターに関する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ベクター構築物ｈＥｆ１ａ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０に基づくことができ、ここで、Ｈｅｆ１ａは、ヒト伸長因子１ａプロモーターを意味し、ＷＰＲＥ３は、切断型のウッドチャック肝炎転写後調節エレメントであり、ＳＶ４０は、切断型のＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３９７５４６１）である。本開示は、表４の実施形態１～５３のそれぞれについて特定のＡＡＶ血清型及び特定のベクターエレメントを有する組換えＡＡＶウイルス粒子に関する。組換えウイルス粒子の血清型を特定するＡＡＶキャプシドタンパク質は、適切なＡＡＶヘルパーウイルスを用いて提供することができる。例えば、参照により本明細書に取り込まれる、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２（５）：６１３－２４を参照。ｈＥｆ１ａはまた、２３１ｂｐ長であり、配列番号１８として参照されるｈＥｆ１ａプロモーターの切断型を指すことがある。
【0078】
標的細胞に核酸を送達するための遺伝子治療ベクターの能力を考慮して、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、２つ以上の対応する機能性タンパク質、阻害性ＲＮＡ、又は阻害性タンパク質の発現のための２つ以上の核酸を有することができる。異なる遺伝子発現産物を発現するための個々の核酸は、それ自身の転写調節エレメントを有することができ、タンパク質を発現する場合、別々のＲＮＡが発現されるように翻訳制御エレメントを分離することができる。いくつかの実施形態では、単一のＲＮＡをシストロンの形で発現させることができ、この場合、遺伝子産物は単一のＲＮＡから発現される。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、単一のＲＮＡからの種々の遺伝子治療産物の発現に必要とされ得るようなリボソームスキッピングを誘導するための配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａ配列（ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０８４７０３）などのポリシストロニックエレメントを有し得る。
【0079】
いくつかの実施形態では、複数の異なる遺伝子産物を発現する複数の核酸を用いた遺伝子治療において、２つ以上の遺伝子送達ベクター、特にウイルスベクターが哺乳動物に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子治療の方法において、関連する遺伝子を送達するための２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上の別個のベクターを同時に又は別個に投与することを含む。単独で又は組み合わせて投与される個々のベクターの量は、とりわけ、ベクター設計、送達される核酸配列、標的組織への送達効率、投与様式、及び意図される治療効果に基づいて決定され得る。種々の実施形態において、同時に投与される各ウイルスベクターの最適な比率は、各対象の最大ウイルス用量及び個々のベクターの有効性から評価することができる。当業者は、本開示に基づいて適切な比率及び用量を決定することができる。
【0080】
遺伝子治療のための１又は複数の遺伝子を有するウイルスベクターの例示的なセットを表２に示す。参照されるタンパク質及び／又は阻害性ＲＮＡを発現する遺伝子の組み合わせを用いた遺伝子治療のために、記載される複数のウイルスが、遺伝子治療の方法において哺乳動物に投与される。したがって、本開示は、１又は複数の遺伝子、阻害性ＲＮＡ、又は阻害タンパク質を含む複数のウイルスを投与する方法を提供し、その例及び組み合わせ、特に、加齢関連疾患又は症状を治療又は予防するための例及び組み合わせは、以下に規定される。
【0081】
グループ１では、ウイルス１は対照としてＡＡＶ８－ＧＦＰを含み、ウイルス２は対照としてＡＡＶ９：ＧＦＰを含む。
【0082】
グループ２では、単一の遺伝子を含む単一のウイルスであるＧＤＦ１５が、遺伝子治療の方法において哺乳動物に投与される。
【0083】
グループ３では、ウイルス１はＴＥＲＴを含み、ウイルス２はＢｕｂＲ１を含む。
【0084】
グループ４では、ウイルス１はＧＤＦ１５を含み、ウイルス２はＴＥＲＴを含み、ウイルス３はＢｕｂＲ１を含む。
【0085】
グループ５では、ウイルス１はＧＤＦ１５を含み、ウイルス２はＴＥＲＴを含み、ウイルス３はＦＧＦ２１を含み、ウイルス４はＢｕｂＲ１を含む。
【0086】
グループ６では、ウイルス１はＧＤＦ１５を含み、ウイルス２はＴＥＲＴを含み、ウイルス３はＦＧＦ２１を含み、ウイルス４はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス５はＢｕｂＲ１を含む。
【0087】
グループ７では、ウイルス１はＢｕｂＲ１、ｐ２Ａ、及びＰａｒ４を含み、ウイルス２はＣｉｓ２ｄを含み、ウイルス３はＴｘｎ１を含み、ウイルス４はＦＧＦ２１を含み、ウイルス５はＢｕｂＲ１を含み、ウイルス６はＡｇｔｒ１ａ、ｉｋｂｋｂ、及びｍＴＯＲを含み、ウイルス７はＮｕｄｔ１を含み、ウイルス８はＳｌｃ１３ａ５及びｐａｐｐａを含み、ウイルス９はＣｏｑ７、ＡＳｄｃｙ５、及びＡｇｔｒ１ａを含み、ウイルス１０はＣｔｆ１／ａｋｔ１を含む。
【0088】
グループ８では、ウイルス１はＦＧＦ２１を含み、ウイルス２はＮｒｆ２を含み、ウイルス３はｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃを含み、ウイルス４はＨＡＳ２を含み、ウイルス５はＮｕｄｔ１、ウイルス６はＴＥＲＴ、ウイルス７はＢｕｂＲ１、ｐ２Ａ及びＰａｒ４を含み、ウイルス８はＵｂｄ及びＤｇａｔ１を含み、ウイルス９はＣｔｆ１及びＣｏｑ７を含み、ウイルス１０はＡｄｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、及びｍＴＯＲを含む。
【0089】
グループ９では、ウイルス１はＡｔｇ５を含み、ウイルス２はＮｕｄｔ１を含み、ウイルス３はＡｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）を含み、ウイルス４はＮＧＦを含み、ウイルス５はＮＥＵ１を含み、ウイルス６はヒト化ＦｏｘＰ２を含み、ウイルス７はＴＦＥＢを含み、ウイルス８はＰＤＥ４ｂ、ｍＴＯＲ、及びＳｌｃ１３ａ５を含み、ウイルス９はＳｌｃ１３ａ５、Ｃｏｑ７、及びＡｋｔ１を含み、ウイルス１０はｉｋｂｋｂ及びＳｌｃ１３ａ１を含む。
【0090】
グループ１０では、ウイルス１はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス２はＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）を含み、ウイルス３はｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃを含み、ウイルス４はＭｔ１を含み、ウイルス５はＡｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）を含み、ウイルス６はＮｒｆ２を含み、ウイルス７はＲｐｓ６ｋｂ１及びＰＣｓｋ９を含み、ウイルス８はＰｒｋａｒ２ｂ及びＤｇａｔを含み、ウイルス９はＣｔｆ１及びＣｏｑ７を含み、ウイルス１０はｐａｐｐａ及びｉｋｂｋｂを含む。
【0091】
グループ１１では、ウイルス１はＡｔｇ５を含み、ウイルス２はＣｅｂｐａ及びＣｅｂｐｂを含み、ウイルス３はＣｔｆ１及びａｋｔ１を含み、ウイルス４はＰｃｋ１を含み、ウイルス５はアディポネクチンを含み、ウイルス６はＰｃｓＫ９を含み、ウイルス７はＮｒｆ２を含み、ウイルス８はＣｉｓｄ２を含み、ウイルス９はｐａｐｐａ及びＤｇａｔを含み、ウイルス１０はＣｔｆ１、Ｃｏｑ７、及びｍＴＯＲを含む。
【0092】
グループ１２では、ウイルス１はＦＧＦ２１を含み、ウイルス２はＧＤＦ１５を含み、ウイルス３はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス４はＡｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）を含み、ウイルス５はＳｉｒｔ６を含み、ウイルス６はＢｕｂｒ１、ｐ２Ａ、及びＰａｒ４を含み、ウイルス７はＣｏｑ７、Ａｄｃｙ５、及びＡｇｔｒ１ａを含み、ウイルス８はＡｇｔｒ１ａ、ｉｋｂｋｂ、及びｍＴＯＲを含み、ウイルス９はＳｌｃ１３ａ１、ｐａｐｐａ、及びＣｔｆ１を含み、ウイルス１０はＣｔｆ１及びＳｌｃ１３ａ５（ＡＡＶ９）を含む。
【0093】
グループ１３では、ウイルス１はＦＧＦ２１を含み、ウイルス２はＧＤＦ１５を含み、ウイルス３はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス４はＴＥＲＴを含み、ウイルス５はｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃを含み、ウイルス６はＢｕｂｒ１、ｐ２Ａ、及びＰａｒ４を含み、ウイルス７はＲｐｓ６ｋｂ１及びＰＣＳｋ９を含み、ウイルス８はＡｄｃｙ５及びＣｏｑ７を含み、ウイルス９はＡｇｔｒ１ａ及びｉｋｂｋｂを含み、ウイルス１０はｍＴＯＲ及びＳｌｃ１３ａ１を含む。
【0094】
グループ１４では、ウイルス１はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス２はＴｘｎ１を含み、ウイルス３はＮｒｆ２を含み、ウイルス４はＴＦＥＢを含み、ウイルス５はｓＴＧＦｂｒ２－Ｆｃを含み、ウイルス６はＮｕｄｔ１を含み、ウイルス７はｍｔ１を含み、ウイルス８はＡｔｇ５を含み、ウイルス９はＢｕｂｒ１、ｐ２Ａ、及びＰａｒ４を含み、ウイルス１０はＣｔｆ１、Ｃｏｑ７、及びｉｋｂｋｂを含む。
【0095】
グループ１５では、ウイルス１はＦＧＦ２１、ＩＲＥＳ、及びｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃを含み、ウイルス２はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス３はｓＴＧＦｂｒ２－Ｆｃ、ＩＲＥＳ、及びＧＤＦ１５を含み、ウイルス４はＨＡＳ２、ｐ２Ａ、Ｍｔ１、及びＴｘｎ１を含み、ウイルス５はＮｒｆ２、ｐ２Ａ、及びｍＣＡＴを含み、ウイルス６はＡｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ｐ２Ａｍ、及びＴＦＥＢを含み、ウイルス７はＢｕｂｒ１、ｐ２Ａ、及びＰａｒ４を含み、ウイルス８はＡｔｇ５、ｐ２Ａ、Ｃｉｓｄ２、及びＮｕｄｔ１を含み、ウイルス９はＳｉｒｔ１、ｐ２Ａ、及びＳｉｒｔ６を含み、ウイルス１０はｍＴＯＲ、ｓｌｃ１３ａ５、ｐａｐｐａ、ｉｋｂｋｂ、ａｄｃｙ５、ａｇｔｒ１ａ、及びａｋｔ１を含む。
【0096】
グループ１６では、ウイルス１はＴＦＥＢ、ｐ２Ａ、及びＡｔｇ５を含み、ウイルス２はＫｌｏｔｈｏを含み、ウイルス３はＵＣＰ１、ｐ２Ａ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、及びｍｉＣｅｂｐａを含み、ウイルス４はアディポネクチン、ＩＲＥＳ、Ｍｔ１、ｐ２Ａ、及びＴｘｎ１を含み、ウイルス５はＮｒｆ２、ｐ２Ａ、及びｍＣＡＴを含み、ウイルス６はＴＥＲＴを含み、ウイルス７はＢｕｂｒ１、ｐ２Ａ、及びＰａｒ４を含み、ウイルス８はＴＦＡＭ、ｐ２Ａ、Ｃｉｓｄ２、及びＮｕｄｔ１を含み、ウイルス９はＮｅｕ１、ｐ２Ａ、ＮＧＦ、及びＳｉｒｔ６を含み、ウイルス１０はＤｇａｔ、ｐｒｋａｒ２ｂ、ｉｎｓｒ、ｕｂｄ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、及びＳｌｃ１３ａ５を含む。
【0097】
グループ１７では、前記ウイルスはｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ及び／又はＮｒｆ２を含む。
【0098】
グループ１８では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、ＴＥＲＴ、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｋｌｏｔｈｏ、ＧＤＦ１５、ＣＴＦ１、ｍＴＯＲ、Ｓｌｃ１３ａ５、Ｐａｐｐａ、Ｐｃｓｋ９、及び／又はＲｐｓ６ｋｂ１を含む。
【0099】
グループ１９では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５、Ｋｌｏｔｈｏ、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、Ｓｉｒｔ６、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、Ａｋｔ１、ＭＣＡＴ、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、Ｃｏｑ７、及び／又はＳｌｃ１３ａ５を含む。
【0100】
グループ２０では、前記ウイルスは、Ｔｘｎ１、Ｓｉｒｔ６、Ｍｔ１、ＴＦＥＢ、Ｐｃｋ１、アディポネクチン、Ｃｉｓｄ２、Ｎｕｄｔ１、Ａｔｇ５、Ｃｔｆ１、Ｉｋｂｋｂ、及び／又はＣｏｑ７を含む。
【0101】
グループ２１では、前記ウイルスは、Ｆｇｆ２１、Ｎｒｆ２、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ、Ｈａｓ２、ＮｕｄＴ１、ＴＥＲＴ、ＢｕｂＲ１、Ｄｇａｔ１、Ｐａｐｐａ、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ５、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、及び／又はＡｋｔ１を含む。
【0102】
グループ２２では、前記ウイルスは、Ｃｔｆ１、Ｃｏｑ７、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、ｍＴＯＲ、Ｃｉｓｄ２、ＭＣＡＴ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｔｘｎ１、及び／又はＳｉｒｔ６を含む。
【0103】
グループ２３では、前記ウイルスは、Ｋｌｏｔｈｏ、ＧＤＦ１５、Ｎｅｕ１、Ｍｔ１、Ａｄｒａ１ａ、ｈＦｏｘＰ２、ＰＣＳＫ９、Ｒｐｓ６ｋｂ１、Ｃｔｆ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ１、ｍＴＯＲ、及び／又はＮｕｄＴ１を含む。
【0104】
グループ２４では、前記ウイルスは、Ａｔｇ５、Ｃｔｆ１、Ａｋｔ１、ＢｕｂＲ１、Ｐｃｋ１、アディポネクチン、ＴＥＲＴ、Ｎｒｆ２、Ｃｉｓｄ２、Ｄｇａｔ１、Ｐａｐｐａ、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、Ｃｏｑ７、及び／又はＳｌｃ１３ａ５を含む。
【0105】
グループ２５では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１及び／又はＢＭＰ２を含む。
【0106】
グループ２６では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１及び／又はＢＭＰ４を含む。
【0107】
グループ２７では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１及び／又はＳｅｍａ３ａを含む。
【0108】
グループ２８では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、ＢＭＰ２、及び／又はＢＭＰ４を含む。
【0109】
グループ２９では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、ＢＭＰ２、及び／又はＳｅｍａ３ａを含む。
【0110】
グループ３０では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、ＢＭＰ４、及び／又はＳｅｍａ３ａを含む。
【0111】
グループ３１では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、及び／又はＳｅｍａ３ａを含む。
【0112】
グループ３２では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１及びＫｌｏｔｈｏを含む。
【0113】
グループ３３では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣを含む。
【0114】
グループ３４では、前記ウイルスは、Ｋｌｏｔｈｏ及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣを含む。
【0115】
グループ３５では、前記ウイルスは、ＦＧＦ２１、Ｋｌｏｔｈｏ、及びｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃを含む。
【0116】
標的遺伝子に対するＰｒｉ－ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを用いた遺伝子治療
本開示では、一次ｍｉＲＮＡ分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）及び／又はショートヘアピン（ｓｈＲＮＡ）を発現する遺伝子構築物を用いて、標的遺伝子の発現が阻害又は減弱される。単一のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡには１～６のｍｉＲＮＡ前駆体が含まれていてもよく、該ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡはプロセシングされてｍｉＲＮＡを産生し、ｍｉＲＮＡは核から細胞質に輸送されてそこで標的ＲＮＡの発現を停止させる。例示的なヘアピンループ構造は、それぞれ約７０ヌクレオチドから構成される。各ヘアピンは効率的なプロセシングに必要な配列に隣接している。
本開示では、一次ｍｉＲＮＡ分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）及び／又はショートヘアピン（ｓｈＲＮＡ）を発現する遺伝子構築物を用いて、標的遺伝子の発現が阻害又は減弱される。単一のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡには１～６のｍｉＲＮＡ前駆体が含まれていてもよく、該ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡはプロセシングされてｍｉＲＮＡを産生し、ｍｉＲＮＡは核から細胞質に輸送されてそこで標的ＲＮＡの発現を停止させる。例示的なヘアピンループ構造は、それぞれ約７０ヌクレオチドから構成される。各ヘアピンは効率的なプロセシングに必要な配列に隣接している。
【0117】
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにおけるヘアピンの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造は、ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群との関連で命名されたＤｉＧｅｏｒｇｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｇｉｏｎ８（ＤＧＣＲ８又は無脊椎動物における「Ｐａｓｈａ」）として知られる核タンパク質によって認識される。ＤＧＣＲ８は、ＲＮＡを切断するタンパク質である酵素Ｄｒｏｓｈａと会合して、マイクロプロセッサ複合体を形成する。Ｌｅｅ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ４２５（６９５６）：４１５－９（２００３）；Ｇｒｅｇｏｒｙ ＲＩ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３３－４７を参照。この複合体では、ＤＧＣＲ８はＤｒｏｓｈａの触媒性ＲＮａｓｅＩＩＩドメインを配向させ、ヘアピン塩基から約１１ヌクレオチドのＲＮＡを切断することによりｐｒｉ－ｍｉＲＮＡからヘアピンを遊離させる（１本のらせん状のｄｓＲＮＡがステムになる）。Ｈａｎ、Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８（２４）：３０１６－２７；Ｈａｎ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２５（５）：８８７－９０１を参照。得られた生成物は、その３′末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有し、３′ヒドロキシル基及び５′ホスフェート基を有する。それはしばしばｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（前駆体－ｍｉＲＮＡ）と称される。効率的なプロセシングにとって重要なｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの下流の配列モチーフが同定されている。Ｃｏｎｒａｄ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９（２）：５４２－５５４；Ａｕｙｅｕｎｇ、Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２（４）：８４４－８５８；Ａｌｉ、Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８６（２２）：３９８６－９０。
【0118】
マイクロプロセッサ複合体をバイパスしてイントロンから直接スプライシングされるＰｒｅ－ｍｉＲＮＡは、「ミュートロン（ｍｉｒｔｒｏｎ）」として知られている。もともと、ショウジョウバエと線虫にのみ存在すると考えられていたミュートロンは、現在、哺乳動物に見出されている。Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ Ｅ．ｅｔ ａｌ．、２００７、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｒｔｒｏｎ ｇｅｎｅｓ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２８（２）：３２８－３６を参照。
【0119】
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの１６％が核ＲＮＡ編集によって変更される可能性がある。Ｋａｗａｈａｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１６）：５２７０－８０；Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１（３）：２２８－３４；Ｏｈｍａｎ Ｍ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８９（１０）：１１７１－６を参照。最も一般的には、ＲＮＡ（ＡＤＡＲ）に作用するアデノシンデアミナーゼとして知られている酵素は、アデノシンからイノシン（ＡからＩ）への転移を触媒する。ＲＮＡ編集は、核プロセシング（例えば、リボヌクレアーゼＴｕｄｏｒ－ＳＮによる分解をもたらすｐｒｉ－ｍｉＲ－１４２の核プロセシング）を停止させ、（例えば、中枢神経系におけるｍｉＲ－３７６のシード領域を変化させることにより）細胞質ｍｉＲＮＡプロセシング及び標的特異性を含む下流プロセスを改変することができる。Ｋａｗａｈａｒａ Ｙ、ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１６）：５２７０－８０を参照。
【0120】
Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンは、核－細胞質シャトルタンパク質であるＥｘｐｏｒｔｉｎ－５が関与するプロセスにおいて核から輸送される。このタンパク質は、カリオフェリンファミリーのメンバーであり、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素ｍｉｒｔｒｏｎＤｒｏｓｈａによってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの３′末端に残された２ヌクレオチドのオーバーハングを認識する。Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５媒介性の細胞質への輸送は、Ｒａｎタンパク質に結合したＧＴＰを用いる、エネルギー依存性である。Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎ Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（３）：２２３－９を参照。
【0121】
細胞質において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンはＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であるＤｉｃｅｒによって切断される。Ｌｕｎｄ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７１：５９－６６を参照。このエンドリボヌクレアーゼは、前記ヘアピンの５′末端及び３′末端と相互作用して（Ｐａｒｋ、Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５（７３５５）：２０１－５を参照）、３′アームと５′アームを連結するループを切断し、約２２ヌクレオチド長の不完全なｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖を生じる。Ｌｕｎｄ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７１：５９－６６を参照。全体のヘアピンの長さ及びループサイズはＤｉｃｅｒプロセシングの効率に影響する。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊ペアの不完全な性質も切断に影響する。Ｌｕｎｄ Ｅ．ｅｔ ａｌ、（２００６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７１：５９－６６；Ｊｉ Ｘ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２０：９９－１１６を参照。Ｇリッチなｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのいくつかは、標準的なステムループ構造の代替物として、潜在的にＧ四重鎖構造をとり得る。例えば、ヒトｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ９２ｂは、細胞質におけるＤｉｃｅｒ介在性切断に耐性であるＧ四重鎖構造をとる。Ｍｉｒｉｈａｎａ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２２：２６２－２７２を参照。二本鎖のいずれの鎖も潜在的に機能的ｍｉＲＮＡとして作用する可能性があるが、ｍｉＲＮＡ及びそのｍＲＮＡ標的が相互作用するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）には、通常、一本の鎖のみが組み込まれる。
【0122】
機能性タンパク質のＣａｓ９媒介調節による遺伝子治療
本開示はまた、転写制御因子と共にＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムを用いて、本明細書に記載の標的遺伝子及びそれらの対応する機能性タンパク質を調節する方法を提供する。当業者は、本明細書に記載の標的遺伝子を含む標的核酸と共局在化複合体を形成するための適切なガイドＲＮＡを設計可能であろうことを理解されたい。
本開示はまた、転写制御因子と共にＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムを用いて、本明細書に記載の標的遺伝子及びそれらの対応する機能性タンパク質を調節する方法を提供する。当業者は、本明細書に記載の標的遺伝子を含む標的核酸と共局在化複合体を形成するための適切なガイドＲＮＡを設計可能であろうことを理解されたい。
【0123】
Ｃａｓ９ ＤＮＡ結合タンパク質
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、様々な目的のためにＤＮＡに結合することが当業者には容易に知られている。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は、天然に存在し得る。ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質は当業者に公知であり、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在するＣａｓ９タンパク質など、ヌクレアーゼ活性を有する天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質を含む。このようなＣａｓ９タンパク質及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当技術分野で十分に報告されている。参照によりその全体が本明細書に取り込まれるすべての補足情報を含む、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９、Ｊｕｎｅ ２０１１、ｐｐ．４６７－４７７参照。そのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質のヌクレアーゼへの移動を容易にするために当該タンパク質に結合された１又は複数の核局在化シグナルを含み得る。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、様々な目的のためにＤＮＡに結合することが当業者には容易に知られている。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は、天然に存在し得る。ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質は当業者に公知であり、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在するＣａｓ９タンパク質など、ヌクレアーゼ活性を有する天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質を含む。このようなＣａｓ９タンパク質及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当技術分野で十分に報告されている。参照によりその全体が本明細書に取り込まれるすべての補足情報を含む、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９、Ｊｕｎｅ ２０１１、ｐｐ．４６７－４７７参照。そのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質のヌクレアーゼへの移動を容易にするために当該タンパク質に結合された１又は複数の核局在化シグナルを含み得る。
【0124】
一般に、細菌及び古細菌のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する短いガイドＲＮＡに依存して、侵入外来核酸内に存在する相補的配列の分解を指示する。Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１、６０２－６０７；Ｇａｓｉｕｎａｓ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９、Ｅ２５７９－２５８６；Ｊｉｎｅｋ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６－８２１；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９：９２７５－９２８２；及びＢｈａｙａ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎ ４５：２７３－２９７を参照。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの最近のインビトロ再構成は、通常はトランスコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）に融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）により、Ｃａｓ９タンパク質に、ｃｒＲＮＡと一致する標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断させるのに十分であることが示された。標的部位に相同なｇＲＮＡを発現させると、Ｃａｓ９の補充及び標的ＤＮＡの分解が起こる。Ｈ．Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｂａｃｔ １９０、１３９０を参照。さらなる有用なＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ又はＳ．ａｕｒｅｕｓ由来である。
【0125】
ＣＲＩＳＰＲシステムの３つのクラスが一般に知られており、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型と呼ばれる。ある態様によれば、ｄｓＤＮＡを切断するための本開示の特定の有用な酵素は、ＩＩ型に共通の単一エフェクター酵素Ｃａｓ９である。Ｋ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９：４６７を参照。すべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【0126】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメインであるＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメイン及び非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインによって媒介されるプロセスを介して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を生じさせる。その全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６－８２１を参照。Ｃａｓ９タンパク質は、多くのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在することが知られており、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９、Ｊｕｎｅ ２０１１、ｐｐ．４６７－４７７の補足情報に記載されている以下を含む：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ Ｃ７；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ ＹＳ－３１４；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２ Ｋｉｔａｓａｔｏ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２ Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ ＤＳＭ ４４３８５；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ＡＴＣＣ １９９７７；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ ＩＦＭ１０１５２；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＰＲ４；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ ＲＨＡ１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ Ｂ４ ｕｉｄ３６５７３；Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ １１Ｂ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６；Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ ＤＳＭ １７８３６ ｕｉｄ４３４６５；Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｒｖａｔａ ＤＳＭ ４３１８３；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ Ｂｄ１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＤＪＯ１０Ａ；Ｓｌａｃｋｉａ ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＤＳＭ ２０４７６；Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＥＸ Ｈ１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ ９４３４；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ ＤＳＭ ７２７１；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＪＩＰ０２ ８６；Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ ８３５；Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ ＤＳＭ １３９４１；Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ＲＳ１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ６８０３；Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ Ｐｅｉ１９１；ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｔｅｒｍｉｔｅ ｇｒｏｕｐ １ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ Ｒｓ Ｄ１７；Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ Ｓ８５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＵＣＣ１１８；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ Ａ９０９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＮＥＭ３１６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ２６０３；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ ＧＧＳ １２４；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＧＣＳ１０５６５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＵＣＮ３４ ｕｉｄ４６０６１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｃｈａｌｌｉｓ ｓｕｂｓｔ ＣＨ１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＮＮ２０２５ ｕｉｄ４６３５３；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ５００５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ２０９６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ９４２９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１０２７０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ６１８０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ３１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＳＳＩ－１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１０７５０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＺ１３１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＣＮＲＺ１０６６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＬＭＤ－９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＬＭＧ １８３１１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ Ｅｋｌｕｎｄ １７Ｂ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂａ４ ６５７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ ＡＴＣＣ ３３６５６；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ １６３Ｋ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ ５３；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １２１１２；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＢＴＡｉ１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ Ｘ１４；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ１８；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ５；Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ ＤＳ－１；Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ ＤＦＬ １２；Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ Ｐａｌ ５ ＦＡＰＥＲＪ；Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ Ｐａｌ ５ ＪＧＩ；Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ Ｂ５１０ ｕｉｄ４６０８５；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ １１１７０；Ｄｉａｐｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ ＴＰＳＹ ｕｉｄ２９９７５；Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ＥＦ０１－２；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ０５３４４２；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ａｌｐｈａ１４；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｚ２４９１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ ＤＳＭ ２６３８；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｄｏｙｌｅｉ ２６９ ９７；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ８１１１６；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ ＲＭ２１００；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ；Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ；Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ ａｕｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ９１８７；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ Ｔ６ｃ；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ ＡＴＣＣ ７００３４５；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｐａｒｉｓ；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ １３０Ｚ；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＦＳＣ １９８；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＷＹ９６－３４１８；及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ３５４０５。文献において、Ｃａｓ９タンパク質は、当業者によりＣｓｎ１とも呼ばれる。例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質の配列は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１、６０２－６０７に規定されている。
【0127】
Ｃａｓ９タンパク質の改変は、本開示の代表的な実施形態である。本開示において有用なＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂａｒｒａｎｇｏｕ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．３：１４３及びＷｉｅｄｅｎｈｅｆｔ、Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８２、３３１に記載されており、これらの各文献は参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【0128】
特定の態様によれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように変更されるか改変される。そのような変更又は改変には、ヌクレアーゼ活性又はヌクレアーゼドメインを不活性化するための１又は複数のアミノ酸の改変が含まれる。そのような改変には、ヌクレアーゼ活性を示す１又は複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインには、ＤＮＡ結合タンパク質が存在しないように、前記ヌクレアーゼ活性を示す１又は複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインを除去することが含まれる。ヌクレアーゼ活性を不活性化する他の改変は、本開示に基づいて当業者には容易に明らかであろう。したがって、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するよう改変されたポリペプチド配列又はヌクレアーゼ活性を不活性化するための１又は複数のポリペプチド配列の除去を含む。ヌクレアーゼ活性が不活性化されている場合でも、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡに結合する能力を保持している。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な１又は複数のポリペプチド配列を含むが、ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列の１又は複数若しくは全てを欠いていてもよい。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な１又は複数のポリペプチド配列を含むが、不活性化されたヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列の１又は複数若しくは全てが不活性化されていてもよい。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６－８２１を参照。ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（「Ｃａｓ９Ｎｕｃ」）と呼ばれ、ヌクレアーゼ活性の低下又は除去を示すか、又はヌクレアーゼ活性が検出レベル内に存在しないか又は実質的に存在しない。この態様によれば、Ｃａｓ９Ｎｕｃについてのヌクレアーゼ活性は、既知のアッセイでは検出できない、すなわち既知のアッセイの検出レベル未満であることがある。
【0129】
ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の天然に存在するＣａｓ９及び当該タンパク質に少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質であるタンパク質配列に対して定義される配列含む。
【0130】
例示的なＣＲＩＳＰＲシステムには、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳＴ１ Ｃａｓ９）（その全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｅｓｖｅｌｔ、Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１１）：１１１６－２１を参照）が含まれる。例示的ＣＲＩＳＰＲシステムには、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連システムから単離された極めて親和性の高い（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ｈ．、ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７、６２－６７を参照）、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、Ｇａｒｎｅａｕ、Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６８、６７－７１及びＪｉｎｅｋ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６－８２１を参照）である、前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｓｐ．Ｃａｓ９）を含む。様々なＣａｓタンパク質が当業者に知られており、ＣａｓＩ（Ｃａｓ３）、Ｃａｓ ＩＡ（Ｃａｓ８ａ）、ＣａｓＩＢ（Ｃａｓ８ｂ）、ＣａｓＩＣ（Ｃａｓ８ｃ）、ＣａｓＩＤ（Ｃａｓ１０ｄ）、ＣａｓＩＥ（Ｃｓｅ１）、ＣａｓＩＦ（Ｃｓｙ１）、ＣａｓＩＵ、ＣａｓＩＩ（Ｃａｓ９）、ＣａｓＩＩＡ（Ｃｓｎ２）、ＣａｓＩＩＢ（Ｃａｓ４）、ＣａｓＩＩＣ、ＣａｓＩＩＩ（Ｃａｓ１０）、ＣａｓＩＩＩＡ（Ｃｓｍ２）、ＣａｓＩＩＩＢ（Ｃｍｒ５）、ＣａｓＩＩＩＣ、ＣａｓＩＩＩＤ、ＣａｓＩＶ（Ｃｓｆ１）、ＣａｓＩＶＡ、ＣａｓＩＶＢ、ＣａｓＶ（Ｃｐｆ１）、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ１などが含まれる。
【0131】
多数のＣＲＩＳＰＲに基づくバイオテクノロジーアプリケーションにおいて（各々が参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、Ｍａｌｉ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９５７－９６３；Ｈｓｕ、Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ １５７、１２６２－１２７８；Ｃｈｅｎ、Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５５：１４７９－１４９１；Ｓｈａｌｅｍ、Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３、８４－８７；Ｗａｎｇ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：８０－８４；Ｎｉｓｓｉｍ、Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５４：６９８－７１０；Ｒｙａｎ、Ｏ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３；Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ １５９（３）：６４７－６１；及びＣｉｔｏｒｉｋ、Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１１４１－１１４５を参照）、前記ガイドはしばしば、いわゆるｓｇＲＮＡ（一本鎖ガイドＲＮＡ）と呼ばれ、２つの天然Ｃａｓ９ ＲＮＡ補因子（ｇＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）は、操作されたループ又はリンカーを介して融合される。
【0132】
ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、酵素的に活性なＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質野生型タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質ニッカーゼ、又はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質若しくはヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９タンパク質である。さらなる例示的なＣａｓ９タンパク質には、転写活性化因子又は転写抑制因子などの転写調節因子などの機能性タンパク質に結合、結合、又は融合したＣａｓ９タンパク質が含まれる。
【0133】
特定の態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、注射又はリポフェクションを含む当業者に公知の方法によって、又はその同族ｍＲＮＡから翻訳されるか、その同族ＤＮＡからｍＲＮＡに転写されて（その後、タンパク質に翻訳される）、直接的に細胞に送達され得る。Ｃａｓ９ ＤＮＡ及びｍＲＮＡは、エレクトロポレーション、一過性かつ安定したトランスフェクション（リポフェクションを含む）、及びウイルス形質導入、又は当業者に公知の他の方法を介して、それ自体が細胞に導入され得る。
【0134】
ガイドＲＮＡ
本開示は、本明細書に記載のようにＣａｓタンパク質を標的遺伝子に標的化するためのガイドＲＮＡの使用を提供する。そのようなガイドＲＮＡは、当業者が特定の標的核酸を知っている場合、容易に設計可能である。ガイドＲＮＡは、スペーサー配列、ｔｒａｃｒメイト配列、及びｔｒａｃｒ配列のうち１又は複数を含み得る。スペーサー配列という用語は、当業者には理解されており、標的核酸配列とハイブリダイズし、標的配列にＣＲＩＳＰＲ複合体を配列特異的に結合させるために十分な標的核酸配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（ｃｒＲＮＡと呼ばれることもある）及び別個のｔｒａｃｒ配列に共有結合されたスペーサー配列から形成可能であり、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列の一部にハイブリダイズされる。特定の態様によれば、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列は、例えばリンカー配列による共有結合などによって結合又は連結されており、この構築物は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との融合体と呼ばれることがある。本明細書に記載されるリンカー配列は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列とを連結する、本明細書で核酸配列と呼ばれるヌクレオチドの配列である。したがって、ガイドＲＮＡは、２成分種（すなわち、共にハイブリダイズする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡ）又は単分子種（すなわち、しばしばｓｇＲＮＡと称される、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒ ＲＮＡ融合体）であってもよい。
本開示は、本明細書に記載のようにＣａｓタンパク質を標的遺伝子に標的化するためのガイドＲＮＡの使用を提供する。そのようなガイドＲＮＡは、当業者が特定の標的核酸を知っている場合、容易に設計可能である。ガイドＲＮＡは、スペーサー配列、ｔｒａｃｒメイト配列、及びｔｒａｃｒ配列のうち１又は複数を含み得る。スペーサー配列という用語は、当業者には理解されており、標的核酸配列とハイブリダイズし、標的配列にＣＲＩＳＰＲ複合体を配列特異的に結合させるために十分な標的核酸配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（ｃｒＲＮＡと呼ばれることもある）及び別個のｔｒａｃｒ配列に共有結合されたスペーサー配列から形成可能であり、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列の一部にハイブリダイズされる。特定の態様によれば、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列は、例えばリンカー配列による共有結合などによって結合又は連結されており、この構築物は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との融合体と呼ばれることがある。本明細書に記載されるリンカー配列は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列とを連結する、本明細書で核酸配列と呼ばれるヌクレオチドの配列である。したがって、ガイドＲＮＡは、２成分種（すなわち、共にハイブリダイズする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡ）又は単分子種（すなわち、しばしばｓｇＲＮＡと称される、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒ ＲＮＡ融合体）であってもよい。
【0135】
特定の態様によれば、ガイドＲＮＡは約１０～約５００ヌクレオチド長である。ある態様によれば、ガイドＲＮＡは、約２０～約１００ヌクレオチド長である。特定の態様によれば、スペーサー配列は、約１０～約５００ヌクレオチド長である。特定の態様によれば、ｔｒａｃｒメイト配列は約１０～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は約１０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、リンカー核酸配列は、約１０～約１００ヌクレオチド長である。
【0136】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、注射又はリポフェクションを含む当業者に公知の方法により天然種として、又はその同族ＤＮＡから転写されて細胞に直接的に送達されてもよく、同族ＤＮＡは、エレクトロポレーション、一過性かつ安定したトランスフェクション（リポフェクションを含む）、及びウイルス形質導入により細胞に導入される。
【0137】
Ｃａｓ９を用いた標的遺伝子の転写の改変
ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９又はガイドＲＮＡに転写制御ドメインを繋留又は結合することによって、ヒト細胞などの細胞においてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ調節を可能にする改変Ｃａｓ９－ｇＲＮＡシステムが提供される。本開示のある態様によれば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９又は１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に、１又は複数の転写調節タンパク質又はドメイン（これらの用語は互換的に使用される）が連結又は結合される。転写調節ドメインは標的遺伝子座に対応する。したがって、本開示の態様は、Ｃａｓ９Ｎ又はｇＲＮＡのいずれかに転写調節ドメインを融合、結合、又は連結することによって、これら転写調節ドメインを標的遺伝子座に局在化させるための方法及び材料を含む。
ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９又はガイドＲＮＡに転写制御ドメインを繋留又は結合することによって、ヒト細胞などの細胞においてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ調節を可能にする改変Ｃａｓ９－ｇＲＮＡシステムが提供される。本開示のある態様によれば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９又は１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に、１又は複数の転写調節タンパク質又はドメイン（これらの用語は互換的に使用される）が連結又は結合される。転写調節ドメインは標的遺伝子座に対応する。したがって、本開示の態様は、Ｃａｓ９Ｎ又はｇＲＮＡのいずれかに転写調節ドメインを融合、結合、又は連結することによって、これら転写調節ドメインを標的遺伝子座に局在化させるための方法及び材料を含む。
【0138】
ある態様によれば、転写活性化が可能な変異型Ｃａｓ９Ｎ融合タンパク質が提供される。ある態様によれば、ＶＰ６４活性化ドメイン（その全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９、１４９－１５３（２０１１）参照）は、変異型Ｃａｓ９ＮのＣ末端に連結、融合、結合、又は繋留される。ある方法によれば、転写調節ドメインは、変異型ｖＣａｓ９Ｎタンパク質によって標的ミトコンドリアＤＮＡの部位に提供される。ある方法によれば、転写調節ドメインに融合された変異型Ｃａｓ９Ｎが、１又は複数のガイドＲＮＡと共に細胞内に提供される。転写調節ドメインが融合された変異型Ｃａｓ９Ｎは、標的ミトコンドリアＤＮＡ又はその近くに結合する。１又は複数のガイドＲＮＡは、標的ミトコンドリアＤＮＡ又はその近くに結合する。転写調節ドメインは、標的ミトコンドリア核酸配列の発現を調節する。特定の態様によれば、変異型Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４融合体は、プロモーター付近の配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わせた場合にレポーター構築物の転写を活性化し、それによってＲＮＡ誘導型転写活性化を示した。
【0139】
ある態様によれば、転写活性化が可能なｇＲＮＡ融合タンパク質が提供される。ある態様によれば、ＶＰ６４活性化ドメインは、ｇＲＮＡと連結、融合、結合、又は繋留される。ある方法によれば、転写調節ドメインは、ｇＲＮＡによって標的ミトコンドリアＤＮＡの部位に提供される。ある方法によれば、転写調節ドメインに融合されたｇＲＮＡが、変異型Ｃａｓ９Ｎタンパク質とともに細胞内に提供される。変異型Ｃａｓ９Ｎは、標的ＤＮＡ又はその近くに結合する。転写調節タンパク質又はそれに融合されたドメインを有する１又は複数のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ又はその近くに結合する。転写調節ドメインは、標的遺伝子の発現を調節する。特定の態様によれば、変異型Ｃａｓ９Ｎタンパク質及び転写調節ドメインと融合したｇＲＮＡは、レポーター構築物の転写を活性化し、それによってＲＮＡ誘導型転写活性化を示した。
【0140】
転写活性化因子である転写調節タンパク質又はドメインは、ＶＰ１６及びＶＰ６４、並びに本開示に基づいて当業者によって容易に同定され得る他のものを含む。例えば、治療的効果又は予防的効果のために組み合わせて使用される本明細書に規定される標的遺伝子の発現を増加又は減少させるために使用され得る、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡシステム（インタクトな切断を有するシステム、又はＶＰ１６、ＫＲＡＢ、ＨＤＡＣ、メチルトランスフェラーゼなどに融合されているか若しくはされていない、又は「スパイキャッチャー」又はＭＳ２リクルートドメイン若しくは類似するドメインを有する同様の活性化因子又は抑制因子を動員し得るｄＣａｓ９を有するシステム）を当業者は使用可能であろう。
【0141】
標的核酸
標的核酸は、本明細書で同定される遺伝子などの、本明細書に記載の共局在化複合体が調節に有用であり得る任意の核酸配列を含む。標的核酸は、タンパク質に発現され得る核酸配列を含む。本開示の目的のために、共局在化複合体は、標的核酸上で共局在化複合体が所望の効果を有するように、標的核酸の位置で、標的核酸に隣接して、又は標的核酸の近傍で、標的核酸に結合するか標的核酸と共局在化し得る。本開示に基づく当業者は、標的核酸に共局在化するガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を容易に同定又は設計可能であろう。当業者はさらに、同様に標的調節核酸に共局在化する転写調節タンパク質又はドメインを同定可能であろう。
標的核酸は、本明細書で同定される遺伝子などの、本明細書に記載の共局在化複合体が調節に有用であり得る任意の核酸配列を含む。標的核酸は、タンパク質に発現され得る核酸配列を含む。本開示の目的のために、共局在化複合体は、標的核酸上で共局在化複合体が所望の効果を有するように、標的核酸の位置で、標的核酸に隣接して、又は標的核酸の近傍で、標的核酸に結合するか標的核酸と共局在化し得る。本開示に基づく当業者は、標的核酸に共局在化するガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を容易に同定又は設計可能であろう。当業者はさらに、同様に標的調節核酸に共局在化する転写調節タンパク質又はドメインを同定可能であろう。
【0142】
細胞
本開示による細胞には、本明細書に記載のように外来核酸を導入して発現させることができる任意の細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本的概念は、細胞の種類によって制限されないことを理解されたい。本開示による細胞には、真核細胞、哺乳動物細胞、動物細胞、及びヒト細胞などが含まれる。さらに、細胞には、機能性タンパク質の産生を調節することが有益であるか又は望ましいと考えられるものが含まれる。そのような細胞には、疾患又は有害な症状をもたらす特定のタンパク質の発現を欠く細胞が含まれ得る。そのような疾患又は有害な症状は、当業者に容易に知られている。本開示によれば、特定のタンパク質の発現を担う核酸は、本明細書に記載される方法により、標的核酸の上方制御及び特定のタンパク質の対応する発現をもたらす転写活性化因子によって標的化され得る。このようにして、本明細書に記載の方法は、治療的処置を提供する。そのような細胞は、特定のタンパク質を過剰発現するもの、又は特定のタンパク質の産生が疾患又は有害な症状の誘導の低減が望まれるものを含み得る。そのような疾患又は有害な症状は、当業者に容易に知られている。本開示によれば、特定のタンパク質の発現を担う核酸は、本明細書に記載される方法、並びに標的核酸の下方制御及び特定のタンパク質の対応する発現をもたらす転写抑制因子によって標的化され得る。このようにして、本明細書に記載の方法は、治療的処置を提供する。
本開示による細胞には、本明細書に記載のように外来核酸を導入して発現させることができる任意の細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本的概念は、細胞の種類によって制限されないことを理解されたい。本開示による細胞には、真核細胞、哺乳動物細胞、動物細胞、及びヒト細胞などが含まれる。さらに、細胞には、機能性タンパク質の産生を調節することが有益であるか又は望ましいと考えられるものが含まれる。そのような細胞には、疾患又は有害な症状をもたらす特定のタンパク質の発現を欠く細胞が含まれ得る。そのような疾患又は有害な症状は、当業者に容易に知られている。本開示によれば、特定のタンパク質の発現を担う核酸は、本明細書に記載される方法により、標的核酸の上方制御及び特定のタンパク質の対応する発現をもたらす転写活性化因子によって標的化され得る。このようにして、本明細書に記載の方法は、治療的処置を提供する。そのような細胞は、特定のタンパク質を過剰発現するもの、又は特定のタンパク質の産生が疾患又は有害な症状の誘導の低減が望まれるものを含み得る。そのような疾患又は有害な症状は、当業者に容易に知られている。本開示によれば、特定のタンパク質の発現を担う核酸は、本明細書に記載される方法、並びに標的核酸の下方制御及び特定のタンパク質の対応する発現をもたらす転写抑制因子によって標的化され得る。このようにして、本明細書に記載の方法は、治療的処置を提供する。
【0143】
機能性タンパク質を調節する核酸の送達
異種核酸（すなわち、細胞の天然の核酸組成物の一部ではないもの）とも呼ばれる外来核酸は、そのような導入において当業者に公知の任意の方法を用いて細胞に導入され得る。そのような方法には、トランスフェクション、形質導入、ウイルス形質導入、マイクロインジェクション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、ナノ粒子銃、形質転換、接合などが含まれる。当業者は容易に同定可能な文献ソースを用いてそのような方法を容易に理解し適応させるであろう。外来核酸は、静脈内投与若しくは静脈内注射、腹腔内投与若しくは腹腔内注射、筋肉内投与若しくは筋肉内注射、頭蓋内投与若しくは頭蓋内注射、眼内投与若しくは眼内注射、皮下投与若しくは皮下注射などによる対象に対する全身投与などによって、本明細書に記載の核酸を含む核酸又はベクターを対象に投与することにより対象に送達されてもよい。
異種核酸（すなわち、細胞の天然の核酸組成物の一部ではないもの）とも呼ばれる外来核酸は、そのような導入において当業者に公知の任意の方法を用いて細胞に導入され得る。そのような方法には、トランスフェクション、形質導入、ウイルス形質導入、マイクロインジェクション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、ナノ粒子銃、形質転換、接合などが含まれる。当業者は容易に同定可能な文献ソースを用いてそのような方法を容易に理解し適応させるであろう。外来核酸は、静脈内投与若しくは静脈内注射、腹腔内投与若しくは腹腔内注射、筋肉内投与若しくは筋肉内注射、頭蓋内投与若しくは頭蓋内注射、眼内投与若しくは眼内注射、皮下投与若しくは皮下注射などによる対象に対する全身投与などによって、本明細書に記載の核酸を含む核酸又はベクターを対象に投与することにより対象に送達されてもよい。
【0144】
例えば、アデノ随伴ウイルスを使用した遺伝子治療法及び対象への遺伝子送達方法は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、米国特許第６，９６７，０１８号、国際公開第２０１４／０９３６２２号、米国特許出願公開第２００８／０１７５８４５号、米国特許出願公開第２０１４／０１００２６５号、欧州特許第２４３２４９０号、欧州特許第２３５２８２３号、欧州特許第２３８４２００号、国際公開第２０１４／１２７１９８号、国際公開第２００５／１２２７２３号、国際公開第２００８／１３７４９０号、国際公開第２０１３／１４２１１４号、国際公開第２００６／１２８１９０号、国際公開第２００９／１３４６８１号、欧州特許第２３４１０６８号、国際公開第２００８／０２７０８４号、国際公開第２００９／０５４９９４号、国際公開第２０１４０５９０３１号、米国特許第７，９７７，０４９号、及び国際公開第２０１４／０５９０２９号に記載されている。
【0145】
ベクター
ベクターは、本明細書に記載の方法及び構築物と共に使用することが意図される。用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を含む。本明細書に記載される核酸を細胞に送達するために使用されるベクターには、当業者に公知のベクターが含まれ、そのような目的のために使用される。特定の例示的なベクターとしては、とりわけ、プラスミド、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、当業者に知られている。ベクターとしては、一本鎖核酸分子、二本鎖核酸分子、若しくは部分的に二本鎖である核酸分子；１又は複数の遊離末端を含む核酸分子若しくは遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子：ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはその両方を含む核酸分子；及び当該分野で公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの一種は、標準的な分子クローニング技術などにより、追加のＤＮＡセグメントを挿入可能な環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスが有するポリヌクレオチドを含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含み得るものであり、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される核酸配列に作動可能に連結された、１又は複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において又はベクターが宿主細胞に導入された場合には宿主細胞内で）ヌクレオチド配列の発現を可能にするような方法で調節エレメントに連結されることを意味することを意図する。
ベクターは、本明細書に記載の方法及び構築物と共に使用することが意図される。用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を含む。本明細書に記載される核酸を細胞に送達するために使用されるベクターには、当業者に公知のベクターが含まれ、そのような目的のために使用される。特定の例示的なベクターとしては、とりわけ、プラスミド、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、当業者に知られている。ベクターとしては、一本鎖核酸分子、二本鎖核酸分子、若しくは部分的に二本鎖である核酸分子；１又は複数の遊離末端を含む核酸分子若しくは遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子：ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはその両方を含む核酸分子；及び当該分野で公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの一種は、標準的な分子クローニング技術などにより、追加のＤＮＡセグメントを挿入可能な環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスが有するポリヌクレオチドを含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含み得るものであり、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される核酸配列に作動可能に連結された、１又は複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において又はベクターが宿主細胞に導入された場合には宿主細胞内で）ヌクレオチド配列の発現を可能にするような方法で調節エレメントに連結されることを意味することを意図する。
【0146】
核酸又は天然ＤＮＡ結合タンパク質、天然のガイドＲＮＡ又は他の天然種の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強されたＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第５，０４９，３８６号、同４，９４６，７８７号、及び同４，８９７，３５５号に記載されている。リポフェクション試薬は、市販の供給源から入手可能である（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適しているカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号に記載のものが挙げられる。細胞（例えば、インビトロ投与又はエクスビボ投与）又は標的組織（例えば、インビボ投与）に対して送達可能である。用語「天然」には、タンパク質、酵素、又はガイドＲＮＡ種自体が含まれ、これらの種をコードする核酸は含まれない。
【0147】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法で使用するための遺伝子治療ベクターは、哺乳動物細胞におけるポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素をコードするヌクレオチド配列の導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルスなどのパルボウイルスベクター、特に感染性ヒトアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は感染性サルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのディペンドウイルス及びその成分（例えば、動物パルボウイルスゲノム）である。パルボウイルス科のウイルスは、小ＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）の２つのサブファミリーに分けられる。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書中ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属を含む。それらの属名から推測されるように、ディペンドウイルスのメンバーは、細胞培養における生産的感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を通常必要とする点に特徴がある。ディペンドウイルス属には、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常は感染するＡＡＶ、及び他の温血動物に感染する近縁ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ １．Ｂｅｒｎｓ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版、１９９６）、６９章、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」に記載されている。便宜上、本発明はＡＡＶを参照して本明細書においてさらに例示及び記載される。しかし、本発明はＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスにも同様に適用できることが理解される。
【0148】
全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である。末端逆位配列（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質のための固有のコードヌクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）がキャプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能する。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）がそれぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製において機能を有する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシング事象により、実際には４種のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）が発現される。しかしながら、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＡＡＶベクター産生に十分であることが示されている。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター産生に十分である。
【0149】
本明細書において「組換えパルボウイルス」、「ＡＡＶベクター」、又は「ｒＡＡＶベクター」は、少なくとも１つのパルボウイルス又はＡＡＶ末端逆位反復配列と隣接する、目的のポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）、目的の遺伝子、又は「導入遺伝子」の１又は複数を含むベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ及遺伝子産物びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質）を発現する昆虫宿主細胞中に存在する場合、複製されて感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターがより大きな核酸構築物（例えば、染色体、又はクローニング又はトランスフェクションに使用されるプラスミド又はバキュロウイルスなどの別のベクター）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは通常「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下で、複製及びキャプシド形成によって「レスキューされる」ことが可能である。したがって、さらなる態様において、本発明は、上記のように定義されたポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関し、前記核酸構築物は、組換えパルボウイルス又はＡＡＶベクターであり、少なくとも１つのパルボウイルス又はＡＡＶ ＩＴＲを含む。好ましくは、核酸構築物において、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルス又は両側のＡＡＶ ＩＴＲと隣接する。
【0150】
ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染可能である。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０）及びＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２４４５－２４５０）を参照。しかし、ヒト滑膜線維芽細胞のＡＡＶ形質導入は、類似のマウス細胞よりも有意により効率的であり（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ、３：１）、ＡＡＶの細胞指向性は血清型によって異なる。例えば、哺乳類ＣＮＳ細胞指向性及び形質導入効率に関するＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５間の差異を検討したＤａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：３４２８－３４３２、及びＡＡＶ指向性の改変へのアプローチを検討したＧｏｎｃａｌｖｅｓ、（２００５）Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２（１）：４３を参照。いくつかの実施形態では、肝細胞の形質導入のために、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質、及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンが好ましく（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９（４）：１４１４－１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １８６（１）：６５－７３）、そのうちＡＡＶ５キャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンが最も好ましいことがある。
【0151】
ＡＡＶは、ヒト集団内で最も蔓延しており（Ｇａｏ、Ｇ．、ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６３８１－８及びＢｏｕｔｉｎ、Ｓ．、ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１（６）：７０４－１２を参照）、ウイルスベクターとして有用である。多くの血清型が存在し、それぞれが組織型に対して異なる指向性を有し（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ、Ｃ．、ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６（６）：１０７３－８０）、適切なシュードタイピングを用いて特定の組織を優先的に標的化することができる。血清型８、９、及びｒｈ１０などのいくつかの血清型は、哺乳類の体に形質導入する。Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ、Ｃ．、ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６（６）：１０７３－８０、Ｉｎａｇａｋｉ、Ｋ．、ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１４（１）：４５－５３；Ｋｅｅｌｅｒ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０（６）：１１３１－８；Ｇｒａｙ、Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（６）：１０５８－６９；Ｏｋａｄａ、Ｈ．、ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２：ｅ９５；及びＦｏｕｓｔ、Ｋ．Ｄ．、ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（１）：５９－６５を参照。ＡＡＶ９は、多くのウイルスベクターや生物製剤にはアクセスできない血液脳関門を通過することが実証されている。Ｆｏｕｓｔ、Ｋ．Ｄ．、ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（１）：５９－６５；及びＲａｈｉｍ、Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２５（１０）：３５０５－１８）を参照。特定のＡＡＶは、４．７～５．０ｋｂの負荷量を有し、ウイルスパッケージングのためにｃｉｓに必要とされるウイルス末端逆位反復（ＩＴＲ）を含む。すべての刊行物が参照により本明細書に取り込まれる、Ｗｕ、Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８（１）：８０－６及びＤｏｎｇ、Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１７）：２１０１－１２を参照。
【0152】
ＡＡＶ ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞指向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質をコードする配列は、種々のＡＡＶ血清型間でＲｅｐタンパク質及びＲｅｐ遺伝子よりも著しく保存性が低い。他の血清型の対応する配列を相互補完するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力により、ある血清型（例えばＡＡＶ５）のキャプシドタンパク質と別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列とを含む偽型ｒＡＡＶ粒子の産生が可能になる。そのような偽型ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。ここで、偽型ｒＡＡＶ粒子は、「ｘ／ｙ」型と呼ばれ、「ｘ」はＩＴＲの供給源を示し、「ｙ」はキャプシドの血清型を示す。例えば、２／５ ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ及びＡＡＶ５由来のキャプシドを有する。改変された「ＡＡＶ」配列もまた、本開示の文脈において使用可能であり、例えば昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生のために使用される。そのような改変飾配列は、例えば、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ２．５ ＩＴＲ、ＡＡｖＤＪ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性（例えば、約７５％～約９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を有する配列を含み、それらは野生型のＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列の代わりに使用可能である。好ましいアデノウイルスベクターは、宿主応答を低下させるために改変される。例えば、すべての刊行物が、参照により本明細書に取り込まれる、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－２６０４；米国特許出願公開第２００８／０００８６９０号、及びＺａｌｄｕｍｂｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（４）：２３９－４６を参照。
【0153】
調節エレメント及びターミネーター
調節エレメントは、本明細書に記載の遺伝子治療ベクター構築物と共に使用することが意図される。用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ－Ｕ配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図する。そのような調節エレメントは、例えばＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントは、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するエレメント及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するエレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）などの目的の所望の組織において主に発現を指示し得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発達段階依存的などの時間依存的に発現を指示することができ、組織又は細胞型に特異的であってもよいし、特異的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、１又は複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１又は複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４ 、５、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１又は複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）又はこれらの組み合わせを含んでいてもよい。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、並びに本明細書に記載のＥＦ１αプロモーター及びＰｏｌ ＩＩプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」にはまた、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ－１のＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５′セグメント（Ｔａｋｅｂｅ、Ｙ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１）：４６６－４７２）、ＳＶ４０エンハンサー、及びウサギβ－グロビンの第２エキソン及び第３エキソンの間のイントロン配列（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８（３）：１５２７－３１）などのエンハンサーエレメントも包含される。当業者は、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現のレベルなどの要因に依存し得ることを理解するであろう。ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記載の核酸（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの変異体、それらの融合タンパク質など）にコードされる融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチドを産生することができる。
調節エレメントは、本明細書に記載の遺伝子治療ベクター構築物と共に使用することが意図される。用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ－Ｕ配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図する。そのような調節エレメントは、例えばＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントは、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するエレメント及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するエレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）などの目的の所望の組織において主に発現を指示し得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発達段階依存的などの時間依存的に発現を指示することができ、組織又は細胞型に特異的であってもよいし、特異的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、１又は複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１又は複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４ 、５、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１又は複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）又はこれらの組み合わせを含んでいてもよい。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、並びに本明細書に記載のＥＦ１αプロモーター及びＰｏｌ ＩＩプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」にはまた、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ－１のＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５′セグメント（Ｔａｋｅｂｅ、Ｙ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１）：４６６－４７２）、ＳＶ４０エンハンサー、及びウサギβ－グロビンの第２エキソン及び第３エキソンの間のイントロン配列（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８（３）：１５２７－３１）などのエンハンサーエレメントも包含される。当業者は、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現のレベルなどの要因に依存し得ることを理解するであろう。ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記載の核酸（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの変異体、それらの融合タンパク質など）にコードされる融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチドを産生することができる。
【0154】
本明細書に記載の方法の態様は、ターミネーター配列を利用してもよい。ターミネーター配列は、転写中にゲノムＤＮＡ中の遺伝子又はオペロンの終点を示す核酸配列の部分を含む。この配列は、転写複合体からｍＲＮＡを放出するプロセスを引き起こす新たに合成されたｍＲＮＡ中のシグナルを提供することによって転写終結を媒介する。これらのプロセスには、ｍＲＮＡ二次構造と複合体との直接的な相互作用及び／又は動員された終結因子の間接的な活性が含まれる。転写複合体の放出により、ＲＮＡポリメラーゼ及び関連する転写機構が解放されて、新たなｍＲＮＡの転写が開始される。ターミネーター配列には、当技術分野で公知であり、本明細書において同定及び記載されるものが含まれる。
【0155】
用法、用量、及び治療
様々な実施形態では、ウイルスベクターを含む１又は複数の遺伝子送達ベクター、及びウイルスベクターを含むパッケージングされたウイルス粒子は、医薬品又は医薬組成物の形態であり得、医薬品又は医薬品又は医薬組成物の製造において使用されてもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。好ましくは、担体は、非経口投与に適している。特定の実施形態では、担体は、静脈内投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与に適している。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９７）に記載されている。例示的な医薬形態は、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、若しくは緩衝溶液、又は他の薬学的に許容される滅菌液体と組み合わせてもよい。あるいは、例えばマイクロキャリアビーズなどの固体担体を使用してもよい。
様々な実施形態では、ウイルスベクターを含む１又は複数の遺伝子送達ベクター、及びウイルスベクターを含むパッケージングされたウイルス粒子は、医薬品又は医薬組成物の形態であり得、医薬品又は医薬品又は医薬組成物の製造において使用されてもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。好ましくは、担体は、非経口投与に適している。特定の実施形態では、担体は、静脈内投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与に適している。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９７）に記載されている。例示的な医薬形態は、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、若しくは緩衝溶液、又は他の薬学的に許容される滅菌液体と組み合わせてもよい。あるいは、例えばマイクロキャリアビーズなどの固体担体を使用してもよい。
【0156】
医薬組成物は、通常、製造及び貯蔵条件下で無菌であり安定である。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は遺伝子治療ベクターの送達に適した秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。本開示のベクターは、例えば、徐放性ポリマー、又はインプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む急速放出から化合物を保護するその他の担体を含む組成物中の持続放出製剤又は制御放出製剤で投与することができる。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳／ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。
【0157】
いくつかの実施形態では、任意の許容可能な担体と共に製剤化された遺伝子治療ベクターは、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、若しくは筋肉内投与、四肢灌流、又はこれらの組み合わせなど、非経口的に投与可能である。投与は、遺伝子送達ベクターが対象の全身に送達されるような、全身性であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは、心臓、肝臓、滑膜への投与又は神経組織に対する髄腔内投与など、標的組織に直接投与することが可能である。いくつかの実施形態では、遺伝子送達ベクターは、カテーテルによってなど、局所的に投与可能である。投与経路は、例えば、標的組織の性質、遺伝子送達ベクター、意図する治療効果、標的組織に投与及び吸収され得る最大負荷などを考慮して、当業者により決定され得る。
【0158】
一般に、有効量、特に治療有効量の遺伝子送達ベクターが、それを必要とする対象に投与される。「治療有効量」とは、所望の治療結果、例えば加齢関連症状の治療又は改善を達成するために必要な用量及び期間において有効な量を指す。効果的又は治療上有効な量のベクターは、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発するウイルスベクターの能力などの因子によって変化し得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整されていてもよい。
【0159】
特定の実施形態では、核酸、核酸構築物、パルボウイルスビリオン、又は医薬組成物の治療有効量又は予防有効量の範囲は、１×１０１１～１×１０１４ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇ又は１×１０１２～１×１０１３ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇである。投与量の値は、緩和すべき症状の重症度によって変化し得ることに留意されたい。投与量はまた、使用されるビリオンの効力に基づいて変化し得る。例えば、ＡＡＶ８はＡＡＶ２と比較して肝臓への感染についてより優れており、ＡＡＶ９はＡＡＶ８よりも脳への感染について優れている。これらの２つのケースでは、肝臓又は脳のそれぞれの場合について、より少ないＡＡＶ８又はＡＡＶ９が必要とされる。任意の特定の対象について、個人の必要性及び組成物の投与を管理又は監督する専門家の判断に従って、特定の投与計画を経時的に調整することができる。本明細書に記載の投与量範囲は、例示的なものに過ぎず、医師によって選択され得る投与量範囲を限定するものではない。
【0160】
標的組織は、例えば肝組織など、特異的であってもよく、又は筋肉組織及び肝組織など、いくつかの組織の組み合わせであってもよい。例示的な標的組織としては、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮細胞、及び／又は造血細胞が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、筋肉内注射による小動物（マウス）の有効用量範囲は、１×１０１２～１×１０１３ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇ、より大きな動物（ネコ又はイヌ）及びヒトでは１×１０１１～１×１０１２ｇｃ／ｋｇ又は１×１０１１～１×１０１４ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇである。
【0161】
様々な実施形態において、遺伝子送達ベクターは、急速投与として又は経時的な持続注入によって投与することができる。いくつかの実施形態では、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させることができる。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは、毎日、毎週、隔週、又は毎月投与することができる。治療期間は、少なくとも１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、又はそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、治療期間は、１年以上まで、２年以上まで、３年以上まで、又は無期限であり得る。
【0162】
いくつかの実施形態では、例えば加齢関連疾患又は障害などの老化に関連する症状又は疾患を治療するために、治療有効量が対象に投与される。本発明の適用は、個体が一般的に健康であり、慢性疾患のない期間を延長し、及び／又は本発明は、心血管疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、肥満、癌、感染症、及び神経障害の１又は複数を含む、高齢集団及び老化成人集団においてしばしば現れる障害を改善する。老化の進行についての任意の十分に確立された指標を用いることができる。
【0163】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子治療は、以下の老化の指標、すなわち、癌の発生率の低下、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の遅延又は改善、骨粗鬆症の遅延及び／又は改善、グルコース耐性の改善又は糖尿病及び肥満などの関連疾患の発生率の減少、記憶機能及び他の認知機能の低下の改善又は低減、神経筋共応性の低下の改善又は低減、免疫機能の低下の改善又は低減のうちの少なくとも１つに使用される。本明細書の遺伝子治療法によってもたらされる加齢関連障害の改善は、罹患した対象における症状の軽減、又は未治療の集団と比較した集団における疾患又は障害の発生率の低下の結果として起こり得る。遺伝子治療は、特定のマーカー及び老化障害によって評価されるように、様々な加齢関連症状及び疾患を治療及び／又は予防する効果を有する。したがって、さらなる態様において、本発明は、心血管機能の低下、骨粗鬆症、関節症、グルコース耐性、インスリン抵抗性、記憶喪失、神経筋共応性の喪失、心臓血管疾患の増加、心機能、循環機能、又は肺機能の低下、及び寿命の低下、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの老化障害又はマーカーの対象における治療又は予防における使用のための、上記のような遺伝子治療法又は核酸ベクターの使用に言及する。
【0164】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子治療は、任意の特定の種の対象の寿命を延ばすために使用される。延長された寿命は、成体に達したその種の個体の平均寿命の延長及び／又はその種の最大寿命の延長であり得る。いくつかの実施形態では、延長された寿命は、最大寿命の５％、１０％、１５％、２０％、又はそれ以上の増加、及び／又は平均寿命の５％、１０％、１５％、２０％、又はそれ以上の増加であり得る。
【実施例】
【0165】
実施例１：ＴＧＦβ１を調節する方法
本開示は、ヒト又はイヌ若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、ＴＧＦβ１の長期間の調節のための遺伝子治療法を提供する。本開示は、炎症、リモデリング、又は線維症を治療又は予防する方法として、ヒト又はイヌ若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、ＴＧＦβ１の長期間の調節のための遺伝子治療法を提供する。本開示は、線維症の増大などの心臓病を治療するために、ヒト又はイヌや若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、ＴＧＦβ１の調節のための遺伝子治療法を提供する。この開示は、例えばアデノ随伴ベクターを用いることによる細胞への核酸送達を含む、遺伝子治療法によるＴＧＦβ１の調節を提供する。本開示は、ＴＧＦβ１に結合して、その内因性経路を活性化する能力を阻害する可溶性循環タンパク質を産生する核酸の送達によるＴＧＦβ１の調節を提供する。可溶性循環タンパク質は、ＴＧＦβ受容体２の細胞外ドメインであり得る。当業者はまた、ＴＧＦβ受容体１又はＴＧＦβ受容体３からの形態も同様に作製することができる。可溶性ＴＧＦβ受容体２タンパク質は、アノテーションソフトウェア及びアミノ酸の疎水性によって予測されるタンパク質の膜貫通ドメインで切断されている。
本開示は、ヒト又はイヌ若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、ＴＧＦβ１の長期間の調節のための遺伝子治療法を提供する。本開示は、炎症、リモデリング、又は線維症を治療又は予防する方法として、ヒト又はイヌ若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、ＴＧＦβ１の長期間の調節のための遺伝子治療法を提供する。本開示は、線維症の増大などの心臓病を治療するために、ヒト又はイヌや若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、ＴＧＦβ１の調節のための遺伝子治療法を提供する。この開示は、例えばアデノ随伴ベクターを用いることによる細胞への核酸送達を含む、遺伝子治療法によるＴＧＦβ１の調節を提供する。本開示は、ＴＧＦβ１に結合して、その内因性経路を活性化する能力を阻害する可溶性循環タンパク質を産生する核酸の送達によるＴＧＦβ１の調節を提供する。可溶性循環タンパク質は、ＴＧＦβ受容体２の細胞外ドメインであり得る。当業者はまた、ＴＧＦβ受容体１又はＴＧＦβ受容体３からの形態も同様に作製することができる。可溶性ＴＧＦβ受容体２タンパク質は、アノテーションソフトウェア及びアミノ酸の疎水性によって予測されるタンパク質の膜貫通ドメインで切断されている。
【0166】
プラスミド
ＡＡＶベクターは、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマー
を用いて細胞外ドメインを増幅することにより作製した。
ＡＡＶベクターは、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマー
を用いて細胞外ドメインを増幅することにより作製した。
【0167】
【化1】
【0168】
前記フォワードプライマーの太字且つ斜体の箇所は、Ｋｏｚａｋ配列である。前記リバースプライマーの太字且つ斜体の箇所は、重複ＰＣＲによってＣ末端に融合したマウスｉｇｇドメインとマッチする。
【0169】
以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ｉｇｇドメインを増幅した。
【0170】
【化2】
【0171】
太字且つ斜体の箇所は、重複ＰＣＲに対してＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインにマッチする。ＴＧＦｂＲ２増幅からのフォワードプライマー及びｉｇｇ増幅からのリバースプライマーを使用したＰＣＲの第２ラウンドにおいて、等モル比の増幅された切片を用いて、これら２つの部分を組み合わせた。これにより、全長１２５１塩基対の融合タンパク質ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ（ｉｇｇ２Ａｅ）が作製された。これを固有の制限酵素部位オーバーハングであるＮｏｔＩ及びＮｈｅＩを用いてＡＡＶ骨格中にライゲーションした。
【0172】
ＡＡＶ産生
ＡＡＶ産生及び力価の定量は、Ｌｏｃｋ，Ｍ．２０１０ Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ及びＫｗｏｎ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５８（８）：６８７－６９４に従って実施した。簡潔には、製造者の指示に従って、ＰＥＩトランスフェクション試薬を用いてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（イリノイ州、ロックフォード）製の１０層Ｎｕｎｃ（商標） Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）システム中、７５％コンフルエンシーでＨｅｋ２９３細胞を３種同時形質導入した。細胞及び上清を、トランスフェクションの７２時間後に別々に採取した。細胞を遠心沈殿し、３回の凍結融解サイクルで溶解し、ベンゾナーゼ（Ｅ１０１５－２５ＫＵ、Ｓｉｇｍａ社）でインキュベートした。次いで、１０，５００×Ｇで２０分間遠心することによってそれらを清澄化し、上清を残りの培地上清に添加した。すべてを０．２μＭフィルターで濾過し、次いで実験室規模のＴＦＦシステム（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ニュージャージー州、ギブスタウン）を用いて１５ｍｌまで濃縮した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ １００ｋＤａフィルターを使用し、製造業者の指示（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ニュージャージー州、ギブスタウン）に従った。濃縮した調製物を１０，５００×ｇ、１５℃で２０分間の遠心分離によって再清澄化し、上清を注意深く新しいチューブに移した。Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎらの方法に従って、６つのイオジキサノール段階勾配を形成した。Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ．、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３－８５を参照し、下記のように改変した。１０ｍＭの塩化マグネシウム及び２５ｍＭのカリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の段階的高密度のイオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、セントルイス）溶液を、３９ｍｌのＱｕｉｃｋ－Ｓｅａｌ遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州、パロアルト）に順次重層した。勾配の段階は、４ｍｌの１５％イオジキサノール、９ｍｌの２５％イオジキサノール、９ｍｌの４０％イオジキサノール、及び５ｍｌの５４％イオジキサノールであった。清澄化された原料を１４ｍｌずつ勾配の上に重ね、チューブを密封した。試験管をＶＴｉ ５０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）中、１８℃で２４２，０００×ｇで７０分間遠心分離し、５４％／４０％界面に水平に挿入した１８ゲージの針を通して４０％勾配を回収した。イオジキサノールを含有するウイルスをＡｍｉｃｏｎ １５－Ｕｌｔｒａを用いて透析ろ過し、最終製剤緩衝液（ＰＢＳ－３５ｍＭ ＮａＣｌ）で５回洗浄し、約１ｍｌに濃縮した。
ＡＡＶ産生及び力価の定量は、Ｌｏｃｋ，Ｍ．２０１０ Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ及びＫｗｏｎ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５８（８）：６８７－６９４に従って実施した。簡潔には、製造者の指示に従って、ＰＥＩトランスフェクション試薬を用いてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（イリノイ州、ロックフォード）製の１０層Ｎｕｎｃ（商標） Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）システム中、７５％コンフルエンシーでＨｅｋ２９３細胞を３種同時形質導入した。細胞及び上清を、トランスフェクションの７２時間後に別々に採取した。細胞を遠心沈殿し、３回の凍結融解サイクルで溶解し、ベンゾナーゼ（Ｅ１０１５－２５ＫＵ、Ｓｉｇｍａ社）でインキュベートした。次いで、１０，５００×Ｇで２０分間遠心することによってそれらを清澄化し、上清を残りの培地上清に添加した。すべてを０．２μＭフィルターで濾過し、次いで実験室規模のＴＦＦシステム（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ニュージャージー州、ギブスタウン）を用いて１５ｍｌまで濃縮した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ １００ｋＤａフィルターを使用し、製造業者の指示（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ニュージャージー州、ギブスタウン）に従った。濃縮した調製物を１０，５００×ｇ、１５℃で２０分間の遠心分離によって再清澄化し、上清を注意深く新しいチューブに移した。Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎらの方法に従って、６つのイオジキサノール段階勾配を形成した。Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ．、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３－８５を参照し、下記のように改変した。１０ｍＭの塩化マグネシウム及び２５ｍＭのカリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の段階的高密度のイオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、セントルイス）溶液を、３９ｍｌのＱｕｉｃｋ－Ｓｅａｌ遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州、パロアルト）に順次重層した。勾配の段階は、４ｍｌの１５％イオジキサノール、９ｍｌの２５％イオジキサノール、９ｍｌの４０％イオジキサノール、及び５ｍｌの５４％イオジキサノールであった。清澄化された原料を１４ｍｌずつ勾配の上に重ね、チューブを密封した。試験管をＶＴｉ ５０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）中、１８℃で２４２，０００×ｇで７０分間遠心分離し、５４％／４０％界面に水平に挿入した１８ゲージの針を通して４０％勾配を回収した。イオジキサノールを含有するウイルスをＡｍｉｃｏｎ １５－Ｕｌｔｒａを用いて透析ろ過し、最終製剤緩衝液（ＰＢＳ－３５ｍＭ ＮａＣｌ）で５回洗浄し、約１ｍｌに濃縮した。
【0173】
ベクターの特徴付け
導入遺伝子カセットにコードされたＷＰＲＥ３ポリアデニル化シグナルに対するプライマー及びプローブを用いて、ＤＮａｓｅ Ｉ耐性ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ ＰＣＲ増幅（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州、フォスターシティ）により力価測定した。勾配画分及び最終ベクターロットの純度を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって評価し、タンパク質をＳＹＰＲＯルビー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＵＶ励起によって視覚化した。
導入遺伝子カセットにコードされたＷＰＲＥ３ポリアデニル化シグナルに対するプライマー及びプローブを用いて、ＤＮａｓｅ Ｉ耐性ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ ＰＣＲ増幅（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州、フォスターシティ）により力価測定した。勾配画分及び最終ベクターロットの純度を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって評価し、タンパク質をＳＹＰＲＯルビー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＵＶ励起によって視覚化した。
【0174】
感染
マウスを腹腔内（ＩＰ）、尾静脈（ＩＶ）、又は後眼窩（ＲＯ）注射により感染させた。簡潔には、ＩＰ注射位置は、膝のすぐ上の腹部を横切る想像線を描くことによって決められる。針は、このラインに沿って動物の右側に刺入され、正中線の近くに挿入される。ＩＰ注射を実行するには、マウスを十分に拘束して、手順中に動かないようにする必要がある。頭頂部が地面を向くようにマウス全体を傾け、後肢を上げて腹部が術者に面するようにする。約３０度の角度で腹部に針を入れると、針のシャフトは約０．５センチメートルの深さに入ることになる。針が血管、腸又は膀胱に達していないことを確認するために吸引する。注射器の内容物を注入し、針を引き抜き、マウスを元のケージに戻す。マウスにおけるＩＰ注射に推奨される針のサイズは２５～２７ゲージである。尾静脈へのＩＶ注射のために、マウスを拘束し、尾部を明るい光の上で保持して尾静脈を見出す。マウスを熱ランプの下に短時間置いて血管を拡張させることにより、静脈を拡張させる。その後、２５ゲージの針を使用して、マウスに最大２００ｕｌを注射する。ＲＯ注射は麻酔下で行われる。わずかな圧力をかけて眼を膨らませることにより麻酔下のマウスを準備し、眼の後側に針をスライドさせて、成体マウスに対して最大でも１５０ｕｌを注入する。
マウスを腹腔内（ＩＰ）、尾静脈（ＩＶ）、又は後眼窩（ＲＯ）注射により感染させた。簡潔には、ＩＰ注射位置は、膝のすぐ上の腹部を横切る想像線を描くことによって決められる。針は、このラインに沿って動物の右側に刺入され、正中線の近くに挿入される。ＩＰ注射を実行するには、マウスを十分に拘束して、手順中に動かないようにする必要がある。頭頂部が地面を向くようにマウス全体を傾け、後肢を上げて腹部が術者に面するようにする。約３０度の角度で腹部に針を入れると、針のシャフトは約０．５センチメートルの深さに入ることになる。針が血管、腸又は膀胱に達していないことを確認するために吸引する。注射器の内容物を注入し、針を引き抜き、マウスを元のケージに戻す。マウスにおけるＩＰ注射に推奨される針のサイズは２５～２７ゲージである。尾静脈へのＩＶ注射のために、マウスを拘束し、尾部を明るい光の上で保持して尾静脈を見出す。マウスを熱ランプの下に短時間置いて血管を拡張させることにより、静脈を拡張させる。その後、２５ゲージの針を使用して、マウスに最大２００ｕｌを注射する。ＲＯ注射は麻酔下で行われる。わずかな圧力をかけて眼を膨らませることにより麻酔下のマウスを準備し、眼の後側に針をスライドさせて、成体マウスに対して最大でも１５０ｕｌを注入する。
【0175】
手術
大動脈狭窄（ＡＣＣ）は、上行大動脈の狭窄により成体動物に引き起こされる。概ね第３肋間部の胸壁に切開部が形成され得る。げっ歯類用開胸器を挿入し、肋骨を静かに広げ、胸腔へのアクセスを確保する。次いで、上行大動脈を肺動脈から単離し、滅菌８．０プロリーン結紮糸を心臓の基部から約３ｍｍのところに通す。２７ゲージ鈍針を大動脈の上端に置き、針周囲を結紮する。次に、針を結紮部の下から慎重に取り除く。開胸器を閉じ、肺を再度膨らませる。肋骨、胸筋、及び皮膚を、滅菌縫合糸（筋肉、皮下層、及び皮膚をそれぞれ閉鎖するための５－０Ｄｅｘｏｎ及び６－０Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸）を用いて閉鎖する。外科医は、開胸を閉鎖する最後の縫合の配置と併せて肺を拡張することによって気胸を最小限にする。偽手術動物は、大動脈の狭窄なしに同様の処置を受ける。麻酔から完全に回復するまで動物を注意深く監視する。動物が意識を回復する（且つ気道を確保できる）と、抜管される。完全な神経学的意識清明が達成されるまで、動物は絶えず厳密に監視されることになる。手術後１０～１４日で縫合糸を取り除く。手術手技の日付、時間、及び術式は、必要に応じて臨床術後記録に記録される。ＡＣＣ手術死亡率は３０％であってもよい。
大動脈狭窄（ＡＣＣ）は、上行大動脈の狭窄により成体動物に引き起こされる。概ね第３肋間部の胸壁に切開部が形成され得る。げっ歯類用開胸器を挿入し、肋骨を静かに広げ、胸腔へのアクセスを確保する。次いで、上行大動脈を肺動脈から単離し、滅菌８．０プロリーン結紮糸を心臓の基部から約３ｍｍのところに通す。２７ゲージ鈍針を大動脈の上端に置き、針周囲を結紮する。次に、針を結紮部の下から慎重に取り除く。開胸器を閉じ、肺を再度膨らませる。肋骨、胸筋、及び皮膚を、滅菌縫合糸（筋肉、皮下層、及び皮膚をそれぞれ閉鎖するための５－０Ｄｅｘｏｎ及び６－０Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸）を用いて閉鎖する。外科医は、開胸を閉鎖する最後の縫合の配置と併せて肺を拡張することによって気胸を最小限にする。偽手術動物は、大動脈の狭窄なしに同様の処置を受ける。麻酔から完全に回復するまで動物を注意深く監視する。動物が意識を回復する（且つ気道を確保できる）と、抜管される。完全な神経学的意識清明が達成されるまで、動物は絶えず厳密に監視されることになる。手術後１０～１４日で縫合糸を取り除く。手術手技の日付、時間、及び術式は、必要に応じて臨床術後記録に記録される。ＡＣＣ手術死亡率は３０％であってもよい。
【0176】
非侵襲的心エコー検査
心臓の構造及び機能を連続的に非侵襲的に評価するために、動物は、指定された時点（１週間に１回を超えない）で非侵襲的な経胸壁心エコー検査を受ける。このために、動物は指定された処置室に運ばれる。動物（マウス及びラット）を１．５～５％のイソフルランで軽く麻酔する。鎮静は、皮膚を穏やかにつまんだ際の反応の欠如によって確認される。麻酔した動物に眼軟膏を塗布して、眼の乾燥及び炎症又は潰瘍の発生を防止する。明瞭なエコー画像を得るために、＃４０ブレード及び医療グレードの脱毛クリームを使用して動物の胸部から体毛が取り除かれる。動物を静かに台に置き、心エコー用プローブを左胸壁に設置する。超音波イメージングが行われている間に、エコー装置及び動物が置かれている台に接続された生理学的モニタによって動物の心拍数及び呼吸数がモニタリングされる。超音波画像は一般に１５分以内に得られ、動物に検査による痛みは生じない。処置中、動物は苦痛の兆候がないかどうか厳密にモニタリングされ、兆候が認められる場合は、処置を直ちに終了し、動物を元のケージに戻す。
心臓の構造及び機能を連続的に非侵襲的に評価するために、動物は、指定された時点（１週間に１回を超えない）で非侵襲的な経胸壁心エコー検査を受ける。このために、動物は指定された処置室に運ばれる。動物（マウス及びラット）を１．５～５％のイソフルランで軽く麻酔する。鎮静は、皮膚を穏やかにつまんだ際の反応の欠如によって確認される。麻酔した動物に眼軟膏を塗布して、眼の乾燥及び炎症又は潰瘍の発生を防止する。明瞭なエコー画像を得るために、＃４０ブレード及び医療グレードの脱毛クリームを使用して動物の胸部から体毛が取り除かれる。動物を静かに台に置き、心エコー用プローブを左胸壁に設置する。超音波イメージングが行われている間に、エコー装置及び動物が置かれている台に接続された生理学的モニタによって動物の心拍数及び呼吸数がモニタリングされる。超音波画像は一般に１５分以内に得られ、動物に検査による痛みは生じない。処置中、動物は苦痛の兆候がないかどうか厳密にモニタリングされ、兆候が認められる場合は、処置を直ちに終了し、動物を元のケージに戻す。
【0177】
安楽死
動物は、施設内で利用可能な装置に従って、ＣＯ２投与を緩徐に行う方法によって安楽死させる。通常、動物は、他の動物の視野外で飼育ケージ内で安楽死させる。適切な流量を確保するためにレギュレーターを使用する。動物は３０秒以内に急速に意識消失することになる。呼吸停止時（数分間）、動物は二次的な物理的方法により安楽死させられることになる。
動物は、施設内で利用可能な装置に従って、ＣＯ２投与を緩徐に行う方法によって安楽死させる。通常、動物は、他の動物の視野外で飼育ケージ内で安楽死させる。適切な流量を確保するためにレギュレーターを使用する。動物は３０秒以内に急速に意識消失することになる。呼吸停止時（数分間）、動物は二次的な物理的方法により安楽死させられることになる。
【0178】
組織採取
安楽死後すぐに組織を採取する。各器官の一部をｑＰＣＲ分析及び配列決定のためにドライアイスで急速凍結し、次に、各器官の他の部分をサイズに応じて２４～４８時間ホルマリン固定し、切片作製及び分析のためにＯＣＴ緩衝液中で凍結させた。
安楽死後すぐに組織を採取する。各器官の一部をｑＰＣＲ分析及び配列決定のためにドライアイスで急速凍結し、次に、各器官の他の部分をサイズに応じて２４～４８時間ホルマリン固定し、切片作製及び分析のためにＯＣＴ緩衝液中で凍結させた。
【0179】
血液採取
マウスの後頸部を保持し、針を用いて下顎静脈／動脈を穿刺し、血液をヘパリン被覆チューブに採取する。
マウスの後頸部を保持し、針を用いて下顎静脈／動脈を穿刺し、血液をヘパリン被覆チューブに採取する。
【0180】
染色及び切片化
マウスをミクロトームを用いて切片化し、次にパラフィン包埋する。脱パラフィン及び再水和は、スライドを５０℃に加熱し、次にキシレン及びエタノールそして最後にＤＩ Ｈ２Ｏで連続浴を行う。次に、スライドを沸騰クエン酸緩衝液中で１０分間インキュベートし、ベンチ上、室温で冷却する。次に、スライドをＰＢＳで２分間ずつ５回洗浄する。スライドをＰＢＳ中の３％ＢＳＡで、室温で１時間ブロックする。一次抗体を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１：３００希釈で４℃で一晩適用した。次に、スライドをＰＢＳ中で２分間ずつ５回洗浄する。３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の二次抗体を１／１００希釈で、３７℃１時間適用する。次に、スライドをＰＢＳ中で２分間ずつ５回洗浄する。１スライドあたり５０μｌのＰＢＳ中のＤＡＰＩ（又はＨｏｅｃｈｓｔ最終濃度５μｇ／ｍｌ）を室温（湿潤チャンバー内）で３０分間適用する。次に、スライドをＰＢＳ中で２分間ずつ５回洗浄する。ＤＡＰＩを含まないマウント媒体でマウントしカバーする。
マウスをミクロトームを用いて切片化し、次にパラフィン包埋する。脱パラフィン及び再水和は、スライドを５０℃に加熱し、次にキシレン及びエタノールそして最後にＤＩ Ｈ２Ｏで連続浴を行う。次に、スライドを沸騰クエン酸緩衝液中で１０分間インキュベートし、ベンチ上、室温で冷却する。次に、スライドをＰＢＳで２分間ずつ５回洗浄する。スライドをＰＢＳ中の３％ＢＳＡで、室温で１時間ブロックする。一次抗体を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１：３００希釈で４℃で一晩適用した。次に、スライドをＰＢＳ中で２分間ずつ５回洗浄する。３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の二次抗体を１／１００希釈で、３７℃１時間適用する。次に、スライドをＰＢＳ中で２分間ずつ５回洗浄する。１スライドあたり５０μｌのＰＢＳ中のＤＡＰＩ（又はＨｏｅｃｈｓｔ最終濃度５μｇ／ｍｌ）を室温（湿潤チャンバー内）で３０分間適用する。次に、スライドをＰＢＳ中で２分間ずつ５回洗浄する。ＤＡＰＩを含まないマウント媒体でマウントしカバーする。
【0181】
トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）の阻害
大動脈結紮を用いて所望の表現型を最終的に引き起こす圧力過負荷を達成するＨＣＭ／ＤＣＭのマウスモデルにおいて、ＡＡＶを用いて、トランスフォーミング増殖因子受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）の可溶性受容体タンパク質をコードする核酸を細胞に送達した。ＡＡＶを、図７に示す生存曲線に示されるように、心不全を軽減し、寿命を延ばすのに有益である、ＴＧＦβ１の長期間の永久的な減少のために使用した。可溶性受容体タンパク質は、この経路のシグナル伝達を減少させ、線維性組織の誘導及び炎症反応を緩和するために、ＴＧＦβ１に結合する。図２に示されるように、トランスフォーミング増殖因子受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）の可溶性受容体タンパク質をコードする核酸をＡＡＶで投与すると、血清ＴＧＦβ１が最大９５％減少し、ＴＧＦβ１シグナル伝達が低下した。
大動脈結紮を用いて所望の表現型を最終的に引き起こす圧力過負荷を達成するＨＣＭ／ＤＣＭのマウスモデルにおいて、ＡＡＶを用いて、トランスフォーミング増殖因子受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）の可溶性受容体タンパク質をコードする核酸を細胞に送達した。ＡＡＶを、図７に示す生存曲線に示されるように、心不全を軽減し、寿命を延ばすのに有益である、ＴＧＦβ１の長期間の永久的な減少のために使用した。可溶性受容体タンパク質は、この経路のシグナル伝達を減少させ、線維性組織の誘導及び炎症反応を緩和するために、ＴＧＦβ１に結合する。図２に示されるように、トランスフォーミング増殖因子受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）の可溶性受容体タンパク質をコードする核酸をＡＡＶで投与すると、血清ＴＧＦβ１が最大９５％減少し、ＴＧＦβ１シグナル伝達が低下した。
【0182】
遺伝子治療は線維性病変の発症に影響を与えた。図３に示すように、対照試料では、ＡＡＶ処置マウスの心臓の約８％と比較して、切片化心臓の総面積に対して約３０％の線維化が認められる。遺伝子治療はまた、ＡＡＣ手術の７週間後に心臓の機能に影響を与えた。図１に示すように、心エコー図に見られるように、心収縮力及び左室容量の強度には大きな差が認められる。図５は、対照動物が、心臓壁の厚さ、左室駆出率、左室内径短縮率、及び左室容量などのいくつかのパラメータにおいて負に変化することを示す。遺伝子治療動物は、これらのパラメータに変化がないか、又は正に変化する。
【0183】
【0184】
実施例２：併用遺伝子治療
本開示は、トランスフォーミング増殖因子受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）のための可溶性受容体タンパク質をコードする核酸、及びＮｒｆ２（又は核因子（赤血球由来２）様２ Ｎｆｅ２１２）をコードする核酸の送達のための遺伝子治療法を提供する。Ｎｒｆ２は、傷害及び炎症によって引き起こされる酸化的損傷から保護する抗酸化タンパク質である。本開示は、各々が１種の導入遺伝子カセットを含む２種のウイルス（すなわち ＩＴＲ－ｈＥｆ１α－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ、及びＩＴＲ－ｈＥｆ１α－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ）を直接注射することにより、それぞれを組み合わせて使用する方法を提供する。本開示は、２種の遺伝子が１種のプロモーターから発現されるウイルス２Ａ配列又はＩＲＥＳの使用によって（すなわち ＩＴＲ－ｈＥｆ１α－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－Ｐ２Ａ－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ、又はＩＴＲ－ｈＥｆ１α－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－ＩＲＥＳ－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ）、両方の導入遺伝子を１種のベクター中に組み合わせることを提供する。
本開示は、トランスフォーミング増殖因子受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）のための可溶性受容体タンパク質をコードする核酸、及びＮｒｆ２（又は核因子（赤血球由来２）様２ Ｎｆｅ２１２）をコードする核酸の送達のための遺伝子治療法を提供する。Ｎｒｆ２は、傷害及び炎症によって引き起こされる酸化的損傷から保護する抗酸化タンパク質である。本開示は、各々が１種の導入遺伝子カセットを含む２種のウイルス（すなわち ＩＴＲ－ｈＥｆ１α－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ、及びＩＴＲ－ｈＥｆ１α－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ）を直接注射することにより、それぞれを組み合わせて使用する方法を提供する。本開示は、２種の遺伝子が１種のプロモーターから発現されるウイルス２Ａ配列又はＩＲＥＳの使用によって（すなわち ＩＴＲ－ｈＥｆ１α－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－Ｐ２Ａ－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ、又はＩＴＲ－ｈＥｆ１α－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－ＩＲＥＳ－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ）、両方の導入遺伝子を１種のベクター中に組み合わせることを提供する。
【0185】
実施例３：アディポネクチンを調節する方法
本開示は、ヒト又はイヌ若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、アディポネクチンを調節するための遺伝子治療法を提供する。アディポネクチン及びＤｓｂＡ－Ｌ（ＧＳＴΚ１）をコードする核酸の発現を駆動する構成的プロモーターを含むアデノ随伴ウイルスが提供される。そのような核酸構築物は、ＷＰＲＥ３及びＳＶ４０後期ｐｏｌｙ（Ａ）を含む３′ＵＴＲを含み得る。アディポネクチンをコードする核酸は第一のベクター中に提供され、ＤｓｂＡ－Ｌをコードする核酸は第二のベクター中に提供される。第一のベクター及び第二のベクターは、自己相補型ＡＡＶベクターである。自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から操作されたウイルスベクターである。コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため、ｒＡＡＶは「自己相補型」と呼ばれる。典型的なＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡ鋳型であるため、標準的なＡＡＶゲノムの律速段階は第二鎖の合成を含む。しかし、これはｓｃＡＡＶゲノムの場合には当てはまらない。感染時、第二鎖の細胞媒介性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して即座の複製及び転写の準備が整った１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。ｒＡＡＶを利用する遺伝子治療の適用において、ウイルスは、２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）と隣接する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を用いて細胞に形質導入する。これらのＩＴＲは、その配列の末端にヘアピンを形成し、その後の感染工程が始まる前に、第二鎖の合成を開始させるためのプライマーとして働く。第二鎖の合成は、効率的な感染のためのいくつかのブロックの１つであると考えられる。ｓｃＡＡＶのさらなる利点としては、インビトロ及びインビボでの導入遺伝子発現の延長、並びにより高いインビボＤＮＡ安定性及びより効果的な環状化が挙げられる。
本開示は、ヒト又はイヌ若しくはネコなどの家畜などの他の哺乳動物などの動物における、アディポネクチンを調節するための遺伝子治療法を提供する。アディポネクチン及びＤｓｂＡ－Ｌ（ＧＳＴΚ１）をコードする核酸の発現を駆動する構成的プロモーターを含むアデノ随伴ウイルスが提供される。そのような核酸構築物は、ＷＰＲＥ３及びＳＶ４０後期ｐｏｌｙ（Ａ）を含む３′ＵＴＲを含み得る。アディポネクチンをコードする核酸は第一のベクター中に提供され、ＤｓｂＡ－Ｌをコードする核酸は第二のベクター中に提供される。第一のベクター及び第二のベクターは、自己相補型ＡＡＶベクターである。自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から操作されたウイルスベクターである。コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため、ｒＡＡＶは「自己相補型」と呼ばれる。典型的なＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡ鋳型であるため、標準的なＡＡＶゲノムの律速段階は第二鎖の合成を含む。しかし、これはｓｃＡＡＶゲノムの場合には当てはまらない。感染時、第二鎖の細胞媒介性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して即座の複製及び転写の準備が整った１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。ｒＡＡＶを利用する遺伝子治療の適用において、ウイルスは、２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）と隣接する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を用いて細胞に形質導入する。これらのＩＴＲは、その配列の末端にヘアピンを形成し、その後の感染工程が始まる前に、第二鎖の合成を開始させるためのプライマーとして働く。第二鎖の合成は、効率的な感染のためのいくつかのブロックの１つであると考えられる。ｓｃＡＡＶのさらなる利点としては、インビトロ及びインビボでの導入遺伝子発現の延長、並びにより高いインビボＤＮＡ安定性及びより効果的な環状化が挙げられる。
【0186】
実施例４：肥満を治療する方法
本開示は、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）をコードする核酸、及びＢＭＰ２、ＢＭＰ４、若しくはＳｅｍａ３ａのいずれか、又はそれら全てをまとめてコードする核酸の送達のための遺伝子治療法を提供する。ＦＧＦ２１は、細胞の骨芽細胞への細胞分化の阻害及び破骨細胞への細胞分化の促進を介して、骨芽細胞と破骨細胞とのバランスを破骨細胞形成にシフトさせることが知られている。ＦＧＦ２１の発現増加による骨量減少の負の副作用とのバランスをとるために、複数の遺伝子が送達される。ＦＧＦ２１は、（身体状態スコア及び活性モニタリングによって認められる）明らかな毒性を伴わずに、図８Ａ及び図８Ｂに見られるように体重減少を引き起こす。高脂肪食で維持されたマウスは、最大４０％体重減少（マウスの年齢に対する正常な体重への復帰）が可能であり、正常範囲で安定しているようであった。骨量減少に対抗するために、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、又はＳｅｍａ３ａの１つ、２つ、又は全てが、骨芽細胞及び破骨細胞のバランスを恒常性に戻すための併用療法の一部として、ＦＧＦ２１と共に同時に又は連続して送達される。
本開示は、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）をコードする核酸、及びＢＭＰ２、ＢＭＰ４、若しくはＳｅｍａ３ａのいずれか、又はそれら全てをまとめてコードする核酸の送達のための遺伝子治療法を提供する。ＦＧＦ２１は、細胞の骨芽細胞への細胞分化の阻害及び破骨細胞への細胞分化の促進を介して、骨芽細胞と破骨細胞とのバランスを破骨細胞形成にシフトさせることが知られている。ＦＧＦ２１の発現増加による骨量減少の負の副作用とのバランスをとるために、複数の遺伝子が送達される。ＦＧＦ２１は、（身体状態スコア及び活性モニタリングによって認められる）明らかな毒性を伴わずに、図８Ａ及び図８Ｂに見られるように体重減少を引き起こす。高脂肪食で維持されたマウスは、最大４０％体重減少（マウスの年齢に対する正常な体重への復帰）が可能であり、正常範囲で安定しているようであった。骨量減少に対抗するために、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、又はＳｅｍａ３ａの１つ、２つ、又は全てが、骨芽細胞及び破骨細胞のバランスを恒常性に戻すための併用療法の一部として、ＦＧＦ２１と共に同時に又は連続して送達される。
【0187】
特定の態様によれば、ＡＡＶを使用するなどの遺伝子治療法において線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）をコードする核酸の個体への送達又はＦＧＦ２１を調節（上方制御又は下方制御）することを含む、個体における体重を減少させる方法又は個体の代謝率を増加させる方法が提供される。
【0188】
実施された実験では、遺伝子治療としてマウスにＦＧＦ２１を与えた場合のマウスの摂餌量を測定し、治療を受けたマウスはより高脂肪の餌を消費するが、依然として正常なマウス除脂肪体重を維持することができ、代謝状態の変化が示された。図１６を参照。呼吸数及び活性に対する遺伝子治療の効果を決定した。ＦＧＦ２１で処置したマウスをＣｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＣＬＡＭＳシステムに入れ、マウスのＯ２消費量、ＣＯ２産生、及びＸ、Ｙ、Ｚ平面における運動を測定した。その結果を図１７に示す。マウスがシステム内に入れられると、データは自動的に生成された。より多くの餌を消費しながら除脂肪体重を維持するＦＧＦ２１マウスは、Ｏ２消費量及びＣＯ２産生の対照と比較したて増加によって示されるように、より高い代謝活性を有する。しかし、運動センサが示すように、ＦＧＦ２１マウスは動きが少なく、このことは、高脂肪食の期間は、ミトコンドリアの活性及び代謝状態が変化し、マウスの行動は除脂肪体重を維持する能力の要因にはならないという別の兆候を示す。
【0189】
グルコース感受性及びインスリン感受性に対するＦＧＦ２１の効果を、グルコース耐性試験によって検査し、図１８に示すように大きな効果があることが分かった。簡潔には、マウスを６～１０時間程度、一晩絶食させた。基準となる血糖値を分析するために血液を採取した。次いで、マウスに、最大５００ｕｌのｄｄＨ２Ｏ中の２５０ｍｇ／ｍｌグルコースを用いてグルコース溶液の用量を強制経口投与した。その後、血液を採取し、１５分、３０分、６０分、及び１２０分の間隔で血糖を測定した。データは図１８に示され、左側のグラフにはいくつかの異なる用量のＦＧＦ２１について、右側のグラフには一定の１Ｅ１０用量のＦＧＦ２１と他のタンパク質との異なる組み合わせについて示す。ＦＧＦ２１＋ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ、及びＦＧＦ２１＋ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋Ｋｌｏｔｈｏを試験し、結果をグルコースの差異と共に右側のグラフに示した。
【0190】
本開示は、成長分化因子１５（ＧＤＦ１５）をコードする核酸及びアディポネクチンをコードする核酸、並びにＺＡＧをコードする核酸及びＮｒｆ２をコードする核酸の送達のための遺伝子治療法を提供する。有効量のこれら４つの核酸全ての送達を組み合わせにより、（体調スコア及び活性モニタリングによって認められる）毒性を伴わずに体重減少のエビデンスが示された。これらのマウスは体重を最大１５％喪失し、図９に示すように下降傾向が続く。
【0191】
実施例５：発現カセット
本開示は、１４個のＰｒｉ－ｍｉＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ配列を含むＡＡＶ内に含まれる発現カセットを提供する。ベクターは、上流方向の第一のカセットと、下流方向の第二のカセットとを有する。第一のカセットは、７個のｍｉＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ配列を含む。第二のカセットは、複数のｍｉＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ配列を含む。上流方向のカセット及び下流方向のカセットは、２つのカセット間の読み取りを防止する。２つのカセットの概要は：ＩＴＲ＿３′ＵＴＲ－１＿７ｍｉＲＮＡｓ＿Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－１＿＿Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－２＿７ｍｉＲＮＡｓ＿３′ＵＴＲ－２＿ＩＴＲである。上記概要においてＩＴＲ＿＿＿＜－－－－－－－－－－－－－－－＿＿＿＿－－－－－－－－－－－－－－－＞＿＿＿ＩＴＲと示されるように、第一のカセットは上流３′←５′＜－－－－－－－方向へ向いており、前記第二のカセットは下流５′→３′（「通常」）－－－－－－＞方向へ向いている。ＩＴＲ－ｂＧＨｐＡ－７ｍｉＲＮＡ－ＣＭＶ－ｈＥｆ１α－７ｍｉＲＮＡ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ。
本開示は、１４個のＰｒｉ－ｍｉＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ配列を含むＡＡＶ内に含まれる発現カセットを提供する。ベクターは、上流方向の第一のカセットと、下流方向の第二のカセットとを有する。第一のカセットは、７個のｍｉＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ配列を含む。第二のカセットは、複数のｍｉＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ配列を含む。上流方向のカセット及び下流方向のカセットは、２つのカセット間の読み取りを防止する。２つのカセットの概要は：ＩＴＲ＿３′ＵＴＲ－１＿７ｍｉＲＮＡｓ＿Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－１＿＿Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－２＿７ｍｉＲＮＡｓ＿３′ＵＴＲ－２＿ＩＴＲである。上記概要においてＩＴＲ＿＿＿＜－－－－－－－－－－－－－－－＿＿＿＿－－－－－－－－－－－－－－－＞＿＿＿ＩＴＲと示されるように、第一のカセットは上流３′←５′＜－－－－－－－方向へ向いており、前記第二のカセットは下流５′→３′（「通常」）－－－－－－＞方向へ向いている。ＩＴＲ－ｂＧＨｐＡ－７ｍｉＲＮＡ－ＣＭＶ－ｈＥｆ１α－７ｍｉＲＮＡ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ－ＩＴＲ。
【0192】
実施例６：イヌタンパク質ｄｏｇ－ｓｔｇｆｂｒ２－ｆｃの改変
イヌタンパク質ｄｏｇ－ｓｔｇｆｂｒ２－ｆｃは、マウス／ヒト分泌シグナルを含むように改変された。ｄｏｇ－ｓｔｇｆｂｒ２－ｆｃをコードする核酸は、固有の分泌シグナル：ＡＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＧＣＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＴを、下記マウス／ヒト分泌シグナル：ＡＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧで置換するように改変された。
イヌタンパク質ｄｏｇ－ｓｔｇｆｂｒ２－ｆｃは、マウス／ヒト分泌シグナルを含むように改変された。ｄｏｇ－ｓｔｇｆｂｒ２－ｆｃをコードする核酸は、固有の分泌シグナル：ＡＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＧＣＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＴを、下記マウス／ヒト分泌シグナル：ＡＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧで置換するように改変された。
【0193】
最終タンパク質をコードする核酸配列は以下の通りである。
【0194】
【化3】
【0195】
太字は分泌シグナルを示す。太字且つ斜体はイヌＩＧｂ重鎖を示す。太字以外はイヌＴＧＦｂ受容体２細胞外ドメインを示す。
【0196】
図１４は、ハイブリッドタンパク質が元のイヌタンパク質よりも良好に機能することが実証されたインビトロＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＥＬＩＳＡは、ＴＧＦｂ１が可溶性ＴＧＦ受容体２によって結合され、そのためにＥＬＩＳＡアッセイでの結合が妨げられる場合を除いて、ＴＧＦｂ１を検出する。簡潔には、各構築物又は対照としてｓＨｅｆ１ａ－ＥＧＦＰをトランスフェクトした２９３－Ｈｅｋ細胞の上清を、天然のイヌＴＧＦｂ１を含むイヌ血清と混合し、可溶性ＴＧＦ受容体２を分泌する能力について細胞を評価した。図１５に示すように、天然のイヌタンパク質は、マウス／ヒト分泌シグナルを含むハイブリッドイヌタンパク質と同様には産生又は分泌されなかった。２９３－Ｈｅｋ細胞は、マウス／ヒト分泌シグナルを含むハイブリッドイヌタンパク質をよりよく分泌可能であった。
【0197】
実験には、天然のＴＧＦｂＲ２分泌シグナルの代わりに以下の分泌因子が含まれる。当業者は、本開示に基づいて発現を所望のレベルに調節する公に利用可能な情報におけるさらなる有用な分泌シグナルを同定することができるであろう。また、スクリーニング突然変異誘発を実施して、特定のペプチド配列が分泌されるための最適な分泌シグナルを見出すことができる。この態様によれば、分泌される配列は、分泌シグナルの効力を調節することができ、分泌シグナルは、目的の特定の遺伝子について最適化することができる。
【0198】
ある態様によれば、ベクターは、核からのＲＮＡの輸送を増強することにより発現を増加させるための合成イントロンを含むことができる。当業者に公知の合成イントロン又は天然イントロンをこの目的のために使用することができる。
【0199】
【化4】
【0200】
実施例７：心不全を予防する方法
特定の態様によれば、心不全を治療又は予防するための遺伝子治療法が提供される。第１グループのマウスを、ＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡについて１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇで処置し、ＡＡＶ９：ｓＨｅｆ１ａ－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡについて１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇで処置した（二重療法）。第２グループのマウスを、ＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡについて１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇで処置した（単独療法）。対照ＡＡＣマウスは手術を受けたが治療は受けなかった。二重療法又は単独療法のいずれかを受けたマウスは、対照と比較して、左室内径短縮率が高く、左室駆出率が高く、心臓質量が低かった。特定の態様によれば、心不全又は腎不全を治療又は予防する方法において、マウスは、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋ＦＧＦ２１、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋Ｋｌｏｔｈｏ、又はｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋ＦＧＦ２１＋Ｋｌｏｔｈｏを用いて処置される。
特定の態様によれば、心不全を治療又は予防するための遺伝子治療法が提供される。第１グループのマウスを、ＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡについて１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇで処置し、ＡＡＶ９：ｓＨｅｆ１ａ－Ｎｒｆ２－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡについて１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇで処置した（二重療法）。第２グループのマウスを、ＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡについて１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇで処置した（単独療法）。対照ＡＡＣマウスは手術を受けたが治療は受けなかった。二重療法又は単独療法のいずれかを受けたマウスは、対照と比較して、左室内径短縮率が高く、左室駆出率が高く、心臓質量が低かった。特定の態様によれば、心不全又は腎不全を治療又は予防する方法において、マウスは、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋ＦＧＦ２１、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋Ｋｌｏｔｈｏ、又はｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ＋ＦＧＦ２１＋Ｋｌｏｔｈｏを用いて処置される。
【0201】
ＦＧＦ２１、Ｋｌｏｔｈｏ、及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ遺伝子の組み合わせを、心不全を治療又は予防するための１又は複数のＡＡＶを用いるなどして遺伝子治療法として評価した。図１９に示すように、左室内径短縮率の測定値（手術後３ヶ月で、ＡＡＣについて前述の手術）は、遺伝子の組み合わせにより心不全が治療又は予防されることを示す。組み合わせ群のより多くのマウスは、代償性治療計画に二分され、それにより、３ヶ月前に留置された外科的結紮を克服する。全ての対照マウスは代償不全になり、今後数週間で死亡する可能性が高い。一方で、最終的に代償性が認められた他のグループのマウスは、死亡徴候を示さなかった。マウスの心エコー検査は全て良心的に実施し、装置付属のエコーソフトウェアで分析した。
【0202】
実施例８：体重減少を促進する方法
特定の態様によれば、肥満個体における体重減少を促進するためなどの体重減少を促進するための遺伝子治療法が提供される。高脂肪餌を３ヶ月間与えられた肥満マウスは、ジャクソン研究所から入手した。ジャクソン研究所から到着後、マウスは研究用餌形態から約４５％の高脂肪餌Ｄ１２４５１で約１週間維持された。次に、マウスに、異なる用量のＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ＦＧＦ２１－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ、並びに１マウスあたり１Ｅ９ｖｇのＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ＦＧＦ２１－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ、１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇのＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－Ｋｌｏｔｈｏ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ、１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇのＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡの１つの組み合わせを投与した。すべての用量で体重減少が促進されたが、１Ｅ１１及び１Ｅ１０では持続的な体重減少が促進された。
特定の態様によれば、肥満個体における体重減少を促進するためなどの体重減少を促進するための遺伝子治療法が提供される。高脂肪餌を３ヶ月間与えられた肥満マウスは、ジャクソン研究所から入手した。ジャクソン研究所から到着後、マウスは研究用餌形態から約４５％の高脂肪餌Ｄ１２４５１で約１週間維持された。次に、マウスに、異なる用量のＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ＦＧＦ２１－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ、並びに１マウスあたり１Ｅ９ｖｇのＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ＦＧＦ２１－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ、１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇのＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－Ｋｌｏｔｈｏ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡ、１マウスあたり１Ｅ１１ｖｇのＡＡＶ８：ｓＨｅｆ１ａ－ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ－ＷＰＲＥ３－ＳＶ４０ｐＡの１つの組み合わせを投与した。すべての用量で体重減少が促進されたが、１Ｅ１１及び１Ｅ１０では持続的な体重減少が促進された。
【0203】
実施例９：寿命を延長する方法
特定の態様によれば、個体の寿命、健康寿命、又は生存率を増加させるための本明細書に記載の遺伝子治療法が提供される。本明細書に記載の遺伝子治療法におけるｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣで処置したマウスを用いて実験を行った。ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ遺伝子を投与したマウスは、図２０に示すように、平均寿命及び最大寿命の約１０％の増加を伴う寿命の延長がもたらされた。
特定の態様によれば、個体の寿命、健康寿命、又は生存率を増加させるための本明細書に記載の遺伝子治療法が提供される。本明細書に記載の遺伝子治療法におけるｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣで処置したマウスを用いて実験を行った。ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ遺伝子を投与したマウスは、図２０に示すように、平均寿命及び最大寿命の約１０％の増加を伴う寿命の延長がもたらされた。
【0204】
１日２４時間、１週間に７日間カメラ及びセンサを使用して測定基準を得るための画像分析を行い、老齢に至る活動及び呼吸の増加によって測定される健康寿命の増加を決定する目的で追加実験を行った。マウスの体重を経時的に測定した。結果を図２１に示す。実験の結果、概日リズム、呼吸数、寿命、日常運動、及び夜間運動について、様々な治療グループ間に多数の相違点が認められた。治療グループ及び遺伝子治療の組み合わせは、以下の表５に示されている。
【0205】
【表15】
【0206】
【表16】
【0207】
実施例１０：腎不全の治療又は予防方法
特定の態様によれば、遺伝子治療法は、腎不全を治療又は予防するために提供される。ＦＧＦ２１、Ｋｌｏｔｈｏ、及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ遺伝子の組み合わせを、心不全を治療又は予防するための１又は複数のＡＡＶを用いるなどして遺伝子治療法として評価する。図２２は、対照マウスの腎臓とｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ遺伝子治療を受けたマウスとの顕著な差異を示す。Ａ及びＣは、非手術の対側対照腎臓を示す。Ｂ及びＤは、ＵＵＯによる腎臓を示し、Ｄと比較してＢは改善された結果を示す。
特定の態様によれば、遺伝子治療法は、腎不全を治療又は予防するために提供される。ＦＧＦ２１、Ｋｌｏｔｈｏ、及びｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ遺伝子の組み合わせを、心不全を治療又は予防するための１又は複数のＡＡＶを用いるなどして遺伝子治療法として評価する。図２２は、対照マウスの腎臓とｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ遺伝子治療を受けたマウスとの顕著な差異を示す。Ａ及びＣは、非手術の対側対照腎臓を示す。Ｂ及びＤは、ＵＵＯによる腎臓を示し、Ｄと比較してＢは改善された結果を示す。
【0208】
本出願に引用されるすべての文献、特許、特許出願、及び他の文書は、個々の文献、特許、特許出願、又は他の文書がすべての目的のために参照により取り込まれることが個々に示された場合と同程度に、すべての目的のために参照により取り込まれる。
【0209】
様々な特定の実施形態を例示及び説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。
【0210】
【表17】
【0211】
【表18】
【0212】
【表19】
【0213】
【表20】
【0214】
【表21】
【0215】
【表22】
【0216】
【表23】
【0217】
【表24】
【0218】
【表25】
【0219】
【表26】
【0220】
【表27】
【0221】
【表28】
【0222】
【表29】
【0223】
【表30】
【0224】
【表31】
【0225】
【表32】
【0226】
【表33】
【0227】
【表34】
【0228】
【表35】
【0229】
【表36】
【0230】
【表37】
【0231】
【表38】
【0232】
【表39】
【0233】
【表40】
【0234】
【表41】
【0235】
【表42】
【0236】
【表43】
【0237】
【表44】
【0238】
【表45】
【0239】
【表46】
【0240】
【表47】
【0241】
【表48】
【0242】
【表49】
【0243】
【表50】
【0244】
【表51】
【0245】
【表52】
【0246】
【表53】
【0247】
【表54】
【0248】
【表55】
【0249】
【表56】
【0250】
【表57】
【0251】
【表58】
【0252】
【表59】
【0253】
【表60】
本発明の態様は以下を含む。
付記１
哺乳動物タンパク質又はインヒビターｍＲＮＡ産物を発現可能な遺伝子を含む第一の核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記遺伝子が表１から選択され、前記第一の核酸配列が哺乳動物細胞における前記産物の発現のための第一の調節配列に作動可能に連結されている、ウイルスベクター。
付記２
前記第一の調節配列が第一のプロモーターを含み、前記第一のプロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記３
前記第一の調節配列が、ｈｅＦ１ａプロモーター、ＣＡＧＧＳ（サイトメガロウイルス、ニワトリβアクチンイントロン、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアセプター）、ＣＭＶ、ｓｈＥｆ１ａ（切断型ｈＥｆ１ａ）、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＣＡＳＩ、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択される第一のプロモーターを含む、付記１又は付記２に記載のウイルスベクター。
付記４
前記遺伝子がＦＧＦ２１、Ｋｌｏｔｈｏ、又はｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣである、付記１～付記４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記５
前記第一の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現のために第一の３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１～付記４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記６
前記第一の３′非翻訳領域が、哺乳動物細胞における前記融合タンパク質の発現を調節するための第一の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記５に記載のウイルスベクター。
付記７
前記第一の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列が、肝細胞における発現を阻害するために第一のｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記６に記載のウイルスベクター。
付記８
前記第一の３′非翻訳領域が、ＷＰＲＥ、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（切断型、配列番号１１４）、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、ウサギβグロビンポリＡ、ウシｂｇｐＡ、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、又はこれらのハイブリッドからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含む、付記５～付記７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記９
前記ウイルスベクターがパルボウイルスベクターである、付記１～付記８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記１０
前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、付記９に記載のウイルスベクター。
付記１１
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、又はＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択される、付記１０に記載のウイルスベクター。
付記１２
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、若しくはＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）、又はこれらの組み合わせについて血清型が決定される、付記１０～付記１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記１３
表３のＡＡＶベクターから選択されるＡＡＶベクター。
付記１４
付記１～付記１２のいずれか一項に記載のウイルスベクターの１種又は複数種又は付記１３に記載のＡＡＶベクターの１種又は複数種の治療有効量を投与することを含む、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記１５
表１から選択される複数のウイルスベクター又は表３から選択される複数のＡＡＶベクターを投与することを含む、付記１４に記載の方法。
付記１６
受容体細胞外ドメインを有する哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ（ｓＴＧＦβ－Ｒ２）タンパク質又はその断片とＩｇ Ｆｃドメインとの融合タンパク質をコードする第一の核酸配列を含むウイルスベクターであって、
前記融合タンパク質がＴＧＦβ１に結合可能であり、前記第一の核酸配列が哺乳動物細胞における前記融合タンパク質の発現のための第一の調節配列に作動可能に連結されている、ウイルスベクター。
付記１７
前記哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質が、ヒトｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質である、付記１６に記載のウイルスベクター。
付記１８
前記哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質が、イヌｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質である、付記１６に記載のウイルスベクター。
付記１９
前記哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタのｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質からなる群から選択される、付記１６に記載のウイルスベクター。
付記２０
前記コードされた哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質が、配列番号１７、１１、１０、５（ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタも同様）に対応する哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、付記１６に記載のウイルスベクター。
付記２１
前記Ｉｇ Ｆｃが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタのＩｇ Ｆｃからなる群から選択される、付記１６～付記２０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記２２
前記Ｉｇ Ｆｃが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧのＦｃである、付記２１に記載のウイルスベクター。
付記２３
前記Ｉｇ Ｆｃが、配列番号２０、２７で表されるＩｇ Ｆｃのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、付記２１に記載のウイルスベクター。
付記２４
前記第一の調節配列が、肝細胞における前記融合タンパク質の発現のための第一の肝組織特異的プロモーターを含む、付記１６～付記２３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記２５
前記第一の調節配列が第一のプロモーターを含み、前記第一のプロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、付記１６～付記２４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記２６
前記第一の調節配列が、ｈｅＦ１ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択される第一のプロモーターを含む、付記１６～付記２４に記載のウイルスベクター。
付記２７
前記第一の調節配列が、構成的プロモーターを含む、付記１６～付記２６に記載のウイルスベクター。
付記２８
前記第一の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現のために第一の３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１６～付記２７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記２９
前記第一の３′非翻訳領域が、哺乳動物細胞における前記融合タンパク質の発現を調節するための第一の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記２８に記載のウイルスベクター。
付記３０
前記第一の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列が、肝細胞における発現を阻害するために第一のｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記２９に記載のウイルスベクター。
付記３１
前記第一の３′非翻訳領域が、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（切断型、配列番号１１３及び１１４）、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、又はこれらのハイブリッドからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含む、付記２８～付記３０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記３２
哺乳動物核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする第二の核酸をさらに含み、前記第二の核酸配列が、前記哺乳動物細胞における前記Ｎｒｆ２タンパク質の発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されている、付記１６～付記３１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記３３
前記哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質及び前記哺乳動物Ｎｒｆ２タンパク質が、同一哺乳動物種のものである、付記３２に記載のウイルスベクター。
付記３４
前記哺乳動物種が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタからなる群から選択される、付記３３に記載のウイルスベクター。
付記３５
前記第二の調節配列が、肝細胞における前記Ｎｒｆ２タンパク質の発現のための第二の肝組織特異的プロモーターを含む、付記３２～付記３４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記３６
前記第二の調節配列が第二のプロモーターを含み、前記第二のプロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、付記３２～付記３５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記３７
前記第二の調節配列が、ｈｅＦ１ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択される第二のプロモーターを含む、付記３２～付記３６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記３８
前記第二の調節配列が、構成的プロモーターを含む、付記３２～付記３７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記３９
前記第二の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現を調節する第二の３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記３２～付記３８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記４０
前記第二の３′非翻訳領域が、哺乳動物細胞における前記Ｎｒｆ２タンパク質の発現を調節するための第二の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記３２～付記３９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記４１
前記第二の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列が、肝細胞における発現を阻害するために第二のｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記４０に記載のウイルスベクター。
付記４２
前記第二の３′非翻訳領域が、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（切断型、配列番号１１４）、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、又はこれらのハイブリッドからなる群から選択される第二のポリアデニル化シグナルを含む、付記３２～付記３９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記４３
前記Ｎｒｆ２タンパク質をコードする前記第二の核酸が、前記融合タンパク質及び前記Ｎｒｆ２タンパク質をコードするポリシストロニックｍＲＮＡ転写産物を発現するための前記第一の調節配列に作動可能に連結され、前記第二の調節配列が、前記ポリシストロニック転写産物からＮｒｆ２タンパク質を発現するための作動可能に連結されたＩＲＥＳ又は２Ａ配列を含む、付記３２に記載のウイルスベクター。
付記４４
前記ウイルスベクターがパルボウイルスベクターである、付記１６～付記４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記４５
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、付記４４に記載のウイルスベクター。
付記４６
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択される、付記４５に記載のウイルスベクター。
付記４７
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）、又はこれらの組み合わせについて血清型が決定される、付記４５～付記４７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記４８
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターを含む組成物であって、
前記第一のウイルスベクターは、受容体細胞外ドメインを有する哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ（ｓＴＧＦβ－Ｒ２）タンパク質又はその断片とＩｇ Ｆｃドメインとの融合タンパク質をコードする第一の核酸配列を含み、前記融合タンパク質はＴＧＦβ１に結合可能であり、前記第一の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための適切な調節配列に作動可能に連結されており、前記第一のウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するための第一の阻害配列を任意に含み、
前記第二のウイルスベクターは哺乳動物（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする第二の核酸配列を含み、前記第二の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されており、前記第二のウイルスベクターは非標的組織における前記第二の核酸配列の発現を阻害するための第二の阻害配列を任意に含む、組成物。
付記４９
付記１６～付記４７のいずれか一項に記載のウイルスベクター又は付記４８に記載の組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における線維性組織の形成を減少させる方法。
付記５０
付記１～付記４７のいずれか一項に記載のウイルスベクター又は付記４８に記載の組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓、肝臓、肺、又は腎臓の線維症の治療方法。
付記５１
哺乳動物アディポネクチンタンパク質をコードする第一の核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記第一の核酸配列は哺乳動物細胞における前記アディポネクチンタンパク質の発現のための調節配列に作動可能に連結されており、前記ウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するための阻害配列を任意に含む、ウイルスベクター。
付記５２
前記コードされた哺乳動物アディポネクチンタンパク質が、配列番号３４で表されるヒトアディポネクチンに対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、付記５１に記載のウイルスベクター。
付記５３
哺乳動物グルタチオンＳ－トランスフェラーゼΚ１（ＤｓｂＡ－Ｌ；ＧＳＴΚ１）タンパク質をコードする第二の核酸配列をさらに含み、前記第二の核酸が、哺乳動物細胞における前記ＧＳＴΚ１タンパク質の発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されている、付記５１～付記５２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記５４
前記コードされた哺乳動物ＧＳＴΚ１タンパク質が、ヒトＧＳＴΚ１タンパク質に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、付記５３に記載のウイルスベクター。
付記５５
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、付記５１～付記５４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記５６
前記ＡＡＶベクターが自己相補型ＡＡＶベクターである、付記５５に記載のウイルスベクター。
付記５７
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択される、付記５１～付記５６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
付記５８
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターを含む組成物であって、
第一のウイルスベクターは哺乳動物アディポネクチンタンパク質をコードする第一の核酸配列を含み、前記第一の核酸配列は哺乳動物細胞における前記アディポネクチンタンパク質の発現のための調節配列に作動可能に連結されており、前記第一のウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するための阻害配列を任意に含み、
前記第二のウイルスベクターは哺乳動物グルタチオンＳ－トランスフェラーゼΚ１（ＤｓｂＡ－Ｌ；ＧＳＴΚ１）タンパク質をコードする第二の核酸配列を含み、前記第二の核酸は、哺乳動物細胞における前記ＧＳＴΚ１タンパク質の発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されており、前記第二のウイルスベクターは非標的組織における前記第二の核酸配列の発現を阻害するための第二の阻害配列を任意に含む、組成物。
付記５９
前記第一のウイルスベクターが第一の自己相補型ＡＡＶであり、前記第二のウイルスベクターが第二の自己相補型ＡＡＶベクターである、付記５８に記載の組成物。
付記６０
前記第一のウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択されるＡＡＶベクターを含む、付記５８～付記５９のいずれか一項に記載の組成物。
付記６１
前記第二のウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択されるＡＡＶベクターを含む、付記５８～付記６０のいずれか一項に記載の組成物。
付記６２
付記５１～５７のいずれか一項に記載のウイルスベクター又は付記５８～付記６１のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記６３
治療有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを対象に投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターにより、前記対象において、アディポネクチン、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＡＭＰＫ、Ａｔｇ５、ＢｕｂＲ１、ｍＣａｔ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、Ｃｉｓｄ２ｄ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｍｔ１、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、Ｎｒｆ２、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、Ｐｃｋ１、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ６、ＴＥＲＴ、ＴＦＡＭ、ＴＦＥＢ、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＴｘｎ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質の治療有効量が発現される、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記６４
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ａｋｔ１、Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、Ｄｇａｔ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、ｎｆ－ｋｂ、Ｐａｐｐａ、ＰＡＣＫＳ、ＰＤＥ４ｂ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｒｐｓ６ｋｂ１（Ｓ６Ｋ１）、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄからなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の異種阻害ＲＮＡ配列の有効量を対象において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記６５
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
アディポネクチン、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＡＭＰＫ、Ａｔｇ５、ＢｕｂＲ１、ｍＣａｔ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、Ｃｉｓｄ２ｄ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｍｔ１、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、Ｎｒｆ２、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、Ｐｃｋ１、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ６、ＴＥＲＴ、ＴＦＡＭ、ＴＦＥＢ、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＴｘｎ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質の有効量を対象において発現させ、
ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ａｋｔ１、Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、Ｄｇａｔ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、ｎｆ－ｋｂ、Ｐａｐｐａ、ＰＡＣＫＳ、ＰＤＥ４ｂ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｒｐｓ６ｋｂ１（Ｓ６Ｋ１）、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄからなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の異種阻害ＲＮＡ配列の有効量を対象において発現させる、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記６６
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
アディポネクチン、ＡＭＰＫ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、Ｐｃｋ１、Ｓｉｒｔ１、ＰＣＳＫ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＵＣＰ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、又は、
Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｄｇａｔ１、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄからなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の異種阻害ＲＮＡ配列を哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記６７
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、Ｋｌｏｔｈｏ、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＳｉｒｔ６からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、及び
Ａｋｔ１、ｍＴＯＲ、Ｐａｐｐａ、Ｒｐｓ６ｋｂ１、及び（Ｓ６Ｋ１）からなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の異種阻害ＲＮＡ配列を前記哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記６８
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
Ａｔｇ５、Ｃｉｓｄ２ｄ、及びＴＦＥＢからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、及び
Ａｋｔ１及びｍＴＯＲからなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の異種インヒビターＲＮＡ配列を前記哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記６９
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
Ｋｌｏｔｈｏ、Ｎｒｆ２、Ｓｉｒｔ１、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、及びＴｘｎ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、及び
内因性Ｃｔｆ１タンパク質の発現を阻害する１又は複数の異種阻害ＲＮＡ配列を前記哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７０
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
ＢｕｂＲ１、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、及びＴＥＲＴからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、及び
Ｃｏｑ７及びＣｔｆ１からなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の阻害ＲＮＡ配列を前記哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７１
有効量の１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
ｍＣａｔ、Ｃｉｓｄ２ｄ、Ｍｔ１、Ｎｒｆ２、Ｐｃｋ１、Ｓｉｒｔ６、及びＴＦＡＭからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、及び
ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ｃｏｑ７、及びＳｌｃ１３ａ１からなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の阻害ＲＮＡ配列を発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７２
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、
Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、及びＮＵＤＴ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させること、及び
Ｉｋｂｋｂ及びＰＤＥ４ｂからなる群から選択される１又は複数の内因性タンパク質の発現を阻害する１又は複数の阻害ＲＮＡ配列を発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７３
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、及びＳＥＭ３Ａからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７４
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＧＤＦ１５、ＴＥＲＴ、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ１、及びＩｋｂｋｂからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７５
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＢｕｂＲ１、Ｃｉｓ２ｄ、Ｔｘｎ１、ＦＧＦ２１、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒ１ａ、ｉｋｂｋｂ、ｍＴＯＲ、Ｎｕｄｔ１、Ｓｌｃ１３ａ５、ｐａｐｐａ、Ｃｏｑ７、Ｓｄｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、及びＣｔｆ１／ａｋｔ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７６
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＢｕｂＲ１、Ｃｉｓ２ｄ、Ｔｘｎ１、ＦＧＦ２１、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒ１ａ、ｉｋｂｋｂ、ｍＴＯＲ、Ｎｕｄｔ１、Ｓｌｃ１３ａ５、ｐａｐｐａ、Ｃｏｑ７、Ｓｄｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、及びＣｔｆ１／ａｋｔ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記７７
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、Ｎｒｆ２、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、ＨＡＳ２、Ｎｕｄｔ１、ＴＥＲＴ、ＢｕｂＲ１、Ｐａｒ４、Ｕｂｄ、Ｄｇａｔ１、Ｃｔｆ１、Ｃｏｑ７ Ａｄｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、及びｍＴＯＲからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記７８
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ａｔｇ５、Ｎｕｄｔ１、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＮＧＦ、ＮＥＵ１、ヒト化ＦｏｘＰ２、ＴＦＥＢ、ＰＤＥ４ｂ、ｍＴＯＲ、Ｓｌｃ１３ａ５、Ｓｌｃ１３ａ５、Ｃｏｑ７、Ａｋｔ１、ｉｋｂｋｂ、及びＳｌｃ１３ａ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記７９
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ｋｌｏｔｈｏ、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｍｔ１、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、Ｎｒｆ２、Ｒｐｓ６ｋｂ１、ＰＣｓｋ９、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｄｇａｔ、Ｃｔｆ１、Ｃｏｑ７、ｐａｐａ、及びｉｋｂｋｂからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８０
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ａｔｇ５、Ｃｅｂｐａ、ｐｂ、Ｃｔｆ１、ａｋｔ１、Ｐｃｋ１、アディポネクチン、ＰｃｓＫ９、Ｎｒｆ２、Ｃｉｓｄ２、ｐａｐａ、Ｄｇａｔ、Ｃｔｆ１、Ｃｏｑ７、及びｍＴＯＲからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８１
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５、Ｋｌｏｔｈｏ、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、Ｓｉｒｔ６、Ｂｕｂｒ１、Ｐａｒ４、Ｃｏｑ７、Ａｄｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ａｇｔｒ１ａ、ｉｋｂｋｂ、ｍＴＯＲ、Ｓｌｃ１３ａ１、ｐａｐａ、Ｃｔｆ１、Ｃｔｆ１、及びＳｌｃ１３ａ５からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８２
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５、Ｋｌｏｔｈｏ、ＴＥＲＴ、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｂｕｂｒ１、Ｐａｒ４、Ｒｐｓ６ｋｂ１、ＰＣＳｋ９、Ａｄｃｙ５、Ｃｏｑ７、Ａｇｔｒ１ａ、ｉｋｂｋｂ、ｍＴＯＲ、及びＳｌｃ１３ａ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８３
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｔｘｎ１、Ｎｒｆ２、ＴＦＥＢ、ｓＴＧＦｂｒ２－Ｆｃ、Ｎｕｄｔ１、ｍｔ１、Ａｔｇ５、Ｂｕｂｒ１、Ｐａｒ４、Ｃｔｆ１、Ｃｏｑ７、及びｉｋｂｋｂからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８４
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｋｌｏｔｈｏ、ｓＴＧＦｂｒ２－Ｆｃ、ＧＤＦ１５、ＨＡＳ２、Ｍｔ１、Ｔｘｎ１、Ｎｒｆ２、ｍＣＡＴ、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＴＦＥＢ、Ｂｕｂｒ１、Ｐａｒ４、Ａｔｇ５、Ｃｉｓｄ２、Ｎｕｄｔ１、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ６、ｍＴＯＲ、ｓｌｃ１３ａ５、ｐａｐｐａ、ｉｋｂｋｂ、ａｄｃｙ５、ａｇｔｒ１ａ、及びａｋｔ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８５
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＴＦＥＢ、Ａｔｇ５、Ｋｌｏｔｈｏ、ＵＣＰ１、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、ｍｉＣｅｂｐａ、アディポネクチン、Ｍｔ１、Ｔｘｎ１、Ｎｒｆ２、ｍＣＡＴ、ＴＥＲＴ、Ｂｕｂｒ１、Ｐａｒ４、ＴＦＡＭ、Ｃｉｓｄ２、Ｎｕｄｔ１、Ｎｅｕ１、ＮＧＦ、Ｓｉｒｔ６、Ｄｇａｔ、ｐｒｋａｒ２ｂ、ｉｎｓｒ、ｕｂｄ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、及びＳｌｃ１３ａ５からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８６
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ及びＮｒｆ２からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８７
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ＴＥＲＴ、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｋｌｏｔｈｏ、ＧＤＦ１５、ＣＴＦ１、ｍＴＯＲ、Ｓｌｃ１３ａ５、Ｐａｐｐａ、Ｐｃｓｋ９、及びＲｐｓ６ｋｂ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８８
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５、Ｋｌｏｔｈｏ、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、Ｓｉｒｔ６、ＢｕｂＲ１、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、Ａｋｔ１、ＭＣＡＴ、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、Ｃｏｑ７、及びＳｌｃ１３ａ５からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記８９
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ｔｘｎ１、Ｓｉｒｔ６、Ｍｔ１、ＴＦＥＢ、Ｐｃｋ１、アディポネクチン、Ｃｉｓｄ２、Ｎｕｄｔ１、Ａｔｇ５、Ｃｔｆ１、Ｉｋｂｋｂ、及びＣｏｑ７からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記９０
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ｆｇｆ２１、Ｎｒｆ２、ｓＴＧＦｂＲ２－ＦＣ、Ｈａｓ２、ＮｕｄＴ１、ＴＥＲＴ、ＢｕｂＲ１、Ｄｇａｔ１、Ｐａｐｐａ、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ５、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、及びＡｋｔ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記９１
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ｃｔｆ１、Ｃｏｑ７、Ａｇｔｒａ１ａ、Ａｄｃｙ５、ｍＴＯＲ、Ｃｉｓｄ２、ＭＣＡＴ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｔｘｎ１、及びＳｉｒｔ６からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記９２
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与することにより、Ｋｌｏｔｈｏ、ＧＤＦ１５、Ｎｅｕ１、Ｍｔ１、Ａｄｒａ１ａ、ｈＦｏｘＰ２、ＰＣＳＫ９、Ｒｐｓ６ｋｂ１、Ｃｔｆ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｃｏｑ７、Ｓｌｃ１３ａ１、ｍＴＯＲ、及びＮｕｄＴ１からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記９３
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、Ａｔｇ５、Ｃｔｆ１、Ａｋｔ１、ＢｕｂＲ１、Ｐｃｋ１、アディポネクチン、ＴＥＲＴ、Ｎｒｆ２、Ｃｉｓｄ２、Ｄｇａｔ１、Ｐａｐｐａ、Ｃｔｆ１、ｍＴＯＲ、Ｃｏｑ７、及びＳｌｃ１３ａ５からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、肥満及び２型糖尿病について哺乳動物を治療する方法。
付記９４
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＦＧＦ２１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、及びＳＥＭ３Ａからなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、脂肪蓄積及び血糖を制御するために哺乳動物を治療する方法。
付記９５
１種又は複数種の適切なウイルス発現ベクターを投与して、ＧＤＦ１５、アディポネクチン、ＺＡＧ、及びＮＲＦ２からなる群から選択される１又は複数の異種機能性タンパク質を哺乳動物において発現させることを含む、加齢関連疾患又は症状について哺乳動物を治療する方法。
付記９６
それぞれ対応する機能性タンパク質をコードし、哺乳動物における発現のための調節配列に作動可能に連結されている、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の核酸配列を含むウイルスベクター。
付記９７
それぞれ阻害性ＲＮＡ配列をコードし、哺乳動物における発現のための調節配列に作動可能に連結されている、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の核酸配列を含むウイルスベクター。
付記９８
受容体の細胞外部分を含む哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列及びＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）ドメインをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を有するカセットを含むウイルスベクターであって、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現により、哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの融合体が産生され、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは、非標的組織における前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含む、ウイルスベクター。
付記９９
前記カセットが哺乳動物Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第三の核酸配列を含み、前記第三の核酸配列が哺乳動物細胞における発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されている、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１００
前記ウイルスベクターがパルボウイルスビリオンである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０１
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０２
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２からなる群から選択される、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０３
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２からなる群から選択されるアデノ随伴ウイルスの１又は複数の部位を含む、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０４
前記プロモーターが肝組織特異的プロモーターである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０５
前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質が、ヒト可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質である、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０６
前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質が、イヌ可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質である、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０７
前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタの可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質からなる群から選択される、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０８
前記Ｆｃが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタのＦｃ、又はＩｇｇ２ａ、Ｉｇｇ２ｂ、Ｉｇｇ３、若しくはＩｇｇ４を含むこれらのサブタイプからなる群から選択される、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１０９
前記適切なプロモーターが、構成的プロモーター若しくは誘導性プロモーター、又はｈｅＦ１ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択されるものである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１０
前記ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、及びＡＡＶ１２ ＩＴＲからなる群から選択される、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１１
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現のために３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１２
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列が、哺乳動物細胞における発現を調節するために組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１３
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列が、肝細胞における発現を阻害するためにｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１４
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列が、ポリアデニル化シグナルを有する３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１５
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列が、ＷＰＲＥ、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、又はこれらのハイブリッドからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを有する３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１６
前記遺伝子がＫｌｏｔｈｏ又はｓＴＧＦＲｂＲ２－ＦＣである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１１７
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターの組み合わせであって、
前記第一のウイルスベクターは、哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列及びＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）ドメインをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を有するカセットを含み、前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現により、前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの融合体が産生され、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは、非標的組織における前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含み、
前記第二のウイルスベクターは、哺乳動物Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第三の核酸配列を含み、前記第三の核酸配列が、哺乳動物細胞における発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第二のウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記第二のウイルスベクターは、非標的組織における前記第三の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含む、前記ウイルスベクターの組み合わせ。
付記１１８
哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列及びＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）ドメインをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を有するカセットを含むウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含み、前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現により、前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの融合体が産生され、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは、非標的組織における前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含み、
前記ウイルスベクターが細胞に導入され、前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの前記融合体が前記細胞により産生されてトランスフォーミング増殖因子β１に結合することにより、トランスフォーミング増殖因子β１の活性が阻害される、哺乳動物における線維性組織の形成を減少させる方法。
付記１１９
哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列及びＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）ドメインをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を有するカセットを含むウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含み、前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現により、前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの融合体が産生され、ウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含み、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは、非標的組織における前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含み、
前記ウイルスベクターが心臓、肝臓、肺、又は腎臓に導入され、前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの前記融合体が前記細胞により産生されてトランスフォーミング増殖因子β１に結合することにより、トランスフォーミング増殖因子β１の活性が阻害される、哺乳動物の心臓、肝臓、肺又は腎臓における線維症を治療する方法。
付記１２０
哺乳動物のアディポネクチンをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列を有するカセットを含むウイルスベクターであって、前記第一の核酸配列の発現によりアディポネクチンが産生され、
前記第一の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは、非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含む、ウイルスベクター。
付記１２１
前記ウイルスベクターが自己相補型ＡＡＶである、付記１に記載のウイルスベクター。
付記１２２
前記ウイルスカセットが、ＤｓｂＡ－Ｌ（ＧＳＴΚ１）をコードする第二の核酸配列を有する、付記１に記載の方法。
付記１２３
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターの組み合わせであって、前記第一のウイルスベクターは、哺乳動物のアディポネクチンをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列を含むカセットを含み、前記第一の核酸配列の発現によりアディポネクチンが産生され、
前記第一の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第一のウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記第一のウイルスベクターは、非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するためのインヒビターを任意に含み、
前記第二のウイルスベクターは、ＤｓｂＡ－Ｌ（ＧＳＴΚ１）をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を有するカセットを含み、
前記第二の核酸配列は、哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第二のウイルスベクターは、前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記第二のウイルスベクターは、非標的組織における前記第二の核酸配列の発現を妨げるためのインヒビターを任意に含む、前記ウイルスベクターの組み合わせ。
付記１２４
前記第一のウイルスベクターが第一の自己相補型ＡＡＶであり、前記第二のウイルスベクターが第二の自己相補型ＡＡＶベクターである、付記１に記載の方法。
付記１２５
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、アディポネクチン、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＡＭＰＫ、Ａｔｇ５、ＢｕｂＲ１、ｍＣａｔ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、Ｃｉｓｄ２ｄ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｍｔ１、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、Ｎｒｆ２、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、Ｐｃｋ１、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ６、ＴＥＲＴ、ＴＦＡＭ、ＴＦＥＢ、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＴｘｎ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現される、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記１２６
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ａｋｔ１、Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、Ｄｇａｔ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、ｎｆ－ｋｂ、Ｐａｐｐａ、ＰＡＣＫＳ、ＰＤＥ４ｂ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｒｐｓ６ｋｂ１（Ｓ６Ｋ１）、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記１２７
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
アディポネクチン、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＡＭＰＫ、Ａｔｇ５、ＢｕｂＲ１、ｍＣａｔ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、Ｃｉｓｄ２ｄ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｍｔ１、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、Ｎｒｆ２、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、Ｐｃｋ１、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ６、ＴＥＲＴ、ＴＦＡＭ、ＴＦＥＢ、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＴｘｎ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ａｋｔ１、Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、Ｄｇａｔ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、ｎｆ－ｋｂ、Ｐａｐｐａ、ＰＡＣＫＳ、ＰＤＥ４ｂ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｒｐｓ６ｋｂ１（Ｓ６Ｋ１）、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、加齢関連疾患又は症状を治療する方法。
付記１２８
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
アディポネクチン、ＡＭＰＫ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、Ｐｃｋ１、Ｓｉｒｔ１、ＰＣＳＫ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＵＣＰ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｄｇａｔ１、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１２９
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、Ｋｌｏｔｈｏ、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、及びＳｉｒｔ６からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
Ａｋｔ１、ｍＴＯＲ、Ｐａｐｐａ、Ｒｐｓ６ｋｂ１、及び（Ｓ６Ｋ１）からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１３０
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
Ａｔｇ５、Ｃｉｓｄ２ｄ、及びＴＦＥＢからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
Ａｋｔ１及びｍＴＯＲからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１３１
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
Ｋｌｏｔｈｏ、Ｎｒｆ２、Ｓｉｒｔ１、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、及びＴｘｎ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現される、又は
Ｃｔｆ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１３２
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
ＢｕｂＲ１、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、及びＴＥＲＴからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
Ｃｏｑ７及びＣｔｆ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１３３
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
ｍＣａｔ、Ｃｉｓｄ２ｄ、Ｍｔ１、Ｎｒｆ２、Ｐｃｋ１、Ｓｉｒｔ６、及びＴＦＡＭからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ｃｏｑ７、及びＳｌｃ１３ａ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１３４
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、及びＮＵＤＴ１からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現されるか、又は
Ｉｋｂｋｂ及びＰＤＥ４ｂからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する機能性タンパク質の発現を阻害する１又は複数のインヒビターＲＮＡ配列が発現される、動物を治療する方法。
付記１３５
それぞれ対応する機能性タンパク質をコードし、プロモーター配列に作動可能に連結されている、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の核酸配列を含むウイルスベクター。
付記１３６
それぞれ阻害性ＲＮＡ配列をコードし、プロモーター配列に作動可能に連結されている、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の核酸配列を含むウイルスベクター。
付記１３７
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
ＦＧＦ２１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、及びＳＥＭ３Ａからなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現される、動物を治療する方法。
付記１３８
１又は複数の核酸配列を有する１又は複数のカセットを含む１又は複数のウイルスベクターを投与することを含み、前記１又は複数のウイルスベクターが導入された細胞により発現されると、
ＧＤＦ１５、アディポネクチン、ＺＡＧ、及びＮＲＦ２からなる群から選択される前記１又は複数の核酸配列に関連する１又は複数の機能性タンパク質が発現される、動物を治療する方法。
付記１３９
真核細胞に１又は複数の対応する標的核酸配列に相補的な１又は複数のガイドＲＮＡ配列を提供すること、
哺乳動物タンパク質又はインヒビターｍＲＮＡ産物を発現可能な１又は複数のドナー核酸配列を前記真核細胞に提供すること、ここで前記１又は複数のドナー核酸配列は、アディポネクチン、Ａｄｒａ１ａ（ｍｕｔ）、ＡＭＰＫ、Ａｔｇ５、ＢｕｂＲ１、ｍＣａｔ、Ｃｅｂｐｂｅｔａ、Ｃｉｓｄ２ｄ、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ１５（ｈＮＡＧ）、ＨＡＳ２（ｎｍｒ）、ヒト化ＦｏｘＰ２、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｍｔ１、ＮＥＵ１、ＮＧＦ、Ｎｒｆ２、ＮＵＤＴ１、Ｐａｒ４ ＳＡＣドメイン、Ｐｃｋ１、ｓＩＧＦ１ｒ－Ｆｃ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ６、ＴＥＲＴ、ＴＦＡＭ、ＴＦＥＢ、ｓＴＧＦｂＲ２－Ｆｃ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｓｅｍａ３ａ、Ｔｘｎ１、ＡＤｃｙ５、Ａｇｔｒ１ａ、Ａｋｔ１、Ｃｅｂｐａｌｐｈａ、Ｃｏｑ７、Ｃｔｆ１、Ｄｇａｔ１、Ｉｋｂｋｂ、Ｉｎｓｒ、ｍＴＯＲ、ｎｆ－ｋｂ、Ｐａｐｐａ、ＰＡＣＫＳ、ＰＤＥ４ｂ、Ｐｒｋａｒ２ｂ、Ｒｐｓ６ｋｂ１（Ｓ６Ｋ１）、Ｓｌｃ１３ａ１、Ｓｌｃ１３ａ５（ＩＮＤＹ）、及びＵｂｄ、又はこれらの任意の組み合わせ、サブコンビネーション、又は集団からなる群から選択される、
前記１又は複数のガイドＲＮＡ配列と相互作用し前記１又は複数の対応する標的核酸配列を部位特異的に切断するＣａｓ９酵素を前記真核細胞に提供することを含み、
前記１又は複数のガイドＲＮＡ配列は、前記相補的な１又は複数の対応する標的核酸配列に結合し、前記Ｃａｓ９酵素は部位特異的に前記１又は複数の標的核酸配列を切断し、
前記１又は複数のドナー配列が前記ゲノム核酸配列に組み込まれて発現される、真核細胞のゲノム核酸配列に外来ＤＮＡを組み込む方法。
付記１４０
前記１又は複数のドナー核酸配列が、相同組換えにより前記ゲノム核酸配列に組み込まれる、付記１３９に記載の方法。
付記１４１
前記細胞に前記１又は複数のガイドＲＮＡ配列をコードする１又は複数の核酸を導入することにより、前記１又は複数のガイドＲＮＡ配列が前記真核細胞に提供され、
前記細胞に前記Ｃａｓ９酵素をコードする核酸を導入することにより、前記Ｃａｓ９酵素が前記細胞に提供され、
前記細胞により、前記１又は複数のガイドＲＮＡ配列及び前記Ｃａｓ９タンパク質が発現される、付記１３９に記載の方法。
付記１４２
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、付記１３９に記載の方法。
付記１４３
前記真核細胞がヒト細胞である、付記１３９に記載の方法。
付記１４４
前記分泌シグナルが、前記所望の発現を得るように発現を調節するために前記公知の哺乳動物分泌シグナルから選択される、付記１６に記載のウイルスベクター。
付記１４５
Ｋｌｏｔｈｏをコードする第二の核酸及び／又はＦＧＦ２１をコードする第三の核酸をさらに含み、前記第二の核酸配列又は前記第三の核酸配列が、前記哺乳動物細胞における前記Ｋｌｏｔｈｏ又はＦＧＦ２１タンパク質の発現のための第二の調節配列又は第三の調節配列に作動可能に連結されている、付記１６に記載のウイルスベクター。
付記１４６
前記哺乳動物ｓＴＧＦβ－Ｒ２タンパク質及び前記哺乳動物Ｋｌｏｔｈｏタンパク質又はＦＧＦ２１タンパク質が、同一哺乳動物種のものである、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１４７
前記哺乳動物種が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタからなる群から選択される、付記１４６に記載のウイルスベクター。
付記１４８
前記第二の調節配列又は前記第三の調節配列が、肝細胞における前記Ｋｌｏｔｈｏ又はＦＧＦ２１タンパク質の発現のための第二の肝組織特異的プロモーターを含む、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１４９
前記第二の調節配列又は前記第三の調節配列が第二のプロモーター又は第三のプロモーターを含み、前記第二のプロモーター又は前記第三のプロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５０
前記第二調節配列又は前記第三の調節配列が、ｈｅＦ１ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択される第二のプロモーター又は第三のプロモーターを含む、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５１
前記第二の調節配列又は前記第三の調節配列が構成的プロモーターを含む、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５２
前記第二の核酸配列又は前記第三の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現を調節する第二の３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５３
前記第二の３′非翻訳領域又は前記第三の３′非翻訳領域が、哺乳動物細胞における前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質又はＦＧＦ２１タンパク質の発現を調節するための第二の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列又は第三の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５４
前記第二の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列又は前記第三の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列が、肝細胞における発現を妨げるための第二のｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列又は第三のｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記１５３に記載のウイルスベクター。
付記１５５
前記第二の３′非翻訳領域又は前記第三の３′非翻訳領域が、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（切断型、配列番号１１４）、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、又はこれらのハイブリッドからなる群から選択される第二のポリアデニル化シグナル又は第三のポリアデニル化シグナルを含む、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５６
前記ＦＧＦ２１タンパク質をコードする前記第二の核酸又は前記第三の核酸が前記第一の調節配列に作動可能に連結されることにより、前記融合タンパク質及び前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質又はＦＧＦ２１タンパク質をコードするポリシストロニックｍＲＮＡ転写産物が発現され、前記第二の調節配列又は前記第三の調節配列は前記ポリシストロニック転写産物から前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質又はＦＧＦ２１タンパク質を発現するための作動可能に連結されたＩＲＥＳ又は２Ａ配列を含む、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５７
前記ウイルスベクターがパルボウイルスベクターである、付記１４５に記載のウイルスベクター。
付記１５８
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、付記１５７に記載のウイルスベクター。
付記１５９
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択される、付記１５８に記載のウイルスベクター。
付記１６０
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）、又はこれらの組み合わせについて血清型が決定される、付記１５８に記載のウイルスベクター。
付記１６１
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターを含む組成物であって、
前記第一のウイルスベクターは、受容体細胞外ドメインを有する哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ（ｓＴＧＦβ－Ｒ２）タンパク質又はその断片とＩｇ Ｆｃドメインとの融合タンパク質をコードする第一の核酸配列を含み、前記融合タンパク質はＴＧＦβ１に結合可能であり、前記第一の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための適切な調節配列に作動可能に連結されており、前記第一のウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するための第一のインヒビター配列を任意に含み、
前記第二のウイルスベクターはＫｌｏｔｈｏタンパク質又はＦＧＦ２１タンパク質をコードする第二の核酸配列を含み、前記第二の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されており、前記第二のウイルスベクターは非標的組織における前記第二の核酸配列の発現を阻害するための第二のインヒビター配列を任意に含む、組成物。
付記１６２
付記１６１に記載の組成物の前記ウイルスベクターの治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における線維性組織の形成を減少させる方法。
付記１６３
付記１６１に記載の組成物の前記ウイルスベクターの治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓、肝臓、肺、又は腎臓の線維症の治療方法。
付記１６４
ＦＧＦ２１タンパク質をコードする第一の核酸配列を含むウイルスベクターであって、
前記第一の核酸配列が、哺乳動物細胞における前記ＦＧＦ２１タンパク質の発現のための第一の調節配列に作動可能に連結されている、ウイルスベクター。
付記１６５
Ｋｌｏｔｈｏをコードする第二の核酸をさらに含み、前記第二の核酸配列が、前記哺乳動物細胞における前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されている、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１６６
前記ＦＧＦ２１タンパク質及び前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が、同一哺乳動物種のものである、付記１６５に記載のウイルスベクター。
付記１６７
前記哺乳動物種が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネズミ、及びブタからなる群から選択される、付記１６６に記載のウイルスベクター。
付記１６８
前記第二の調節配列が、肝細胞における前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現のための第二の肝組織特異的プロモーターを含む、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１６９
前記第二の調節配列が第二のプロモーターを含み、前記第二のプロモーターが構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７０
前記第二の調節配列が、ｈｅＦ１ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、並びにマウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメント及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターと組み合わせられたＡＡＴプロモーターからなる群から選択される第二のプロモーターを含む、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７１
前記第二の調節配列が構成的プロモーターを含む、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７２
前記第二の核酸配列が、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び発現を調節する第二の３′非翻訳領域に作動可能に連結されている、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７３
前記第二の３′非翻訳領域が、哺乳動物細胞における前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現を調節するための第二の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７４
前記第二の組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列が、肝細胞における発現を妨げるための第二のｍｉｒ１２２ａ組織特異的ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、付記１７３に記載のウイルスベクター。
付記１７５
前記第二の３′非翻訳領域が、ＷＰＲＥ３、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（切断型、配列番号１１４）、ＨＢＧポリアデニル化シグナル、及びＥＴＣポリアデニル化シグナル、又はこれらのハイブリッドからなる群から選択される第二のポリアデニル化シグナルを含む、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７６
前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする前記第二の核酸が前記第一の調節配列に作動可能に連結されることにより、前記ＦＧＦ２１タンパク質及び前記Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードするポリシストロニックｍＲＮＡ転写産物が発現され、前記第二の調節配列は前記ポリシストロニック転写産物からＫｌｏｔｈｏタンパク質を発現するための作動可能に連結されたＩＲＥＳ又は２Ａ配列を含む、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７７
前記ウイルスベクターがパルボウイルスベクターである、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７８
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、付記１６４に記載のウイルスベクター。
付記１７９
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）ウイルスベクターから選択される、付記１７８に記載のウイルスベクター。
付記１８０
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶｒｈ１０．ＸＸ（ここでｘｘは異なる既知の変異体を意味する）、又はこれらの組み合わせについて血清型が決定される、付記１７８に記載のウイルスベクター。
付記１８１
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターを含む組成物であって、
前記第一のウイルスベクターはＦＧＦ２１タンパク質をコードする第一の核酸配列又はその断片を含み、前記第一の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための適切な調節配列に作動可能に連結されており、前記第一のウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を阻害するための第一のインヒビター配列を任意に含み、
前記第二のウイルスベクターはＫｌｏｔｈｏタンパク質をコードする第二の核酸配列を含み、前記第二の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための第二の調節配列に作動可能に連結されており、前記第二のウイルスベクターは非標的組織における前記第二の核酸配列の発現を阻害するための第二のインヒビター配列を任意に含む、組成物。
付記１８２
付記１８１に記載の組成物の前記ウイルスベクターの治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における線維性組織の形成を減少させる方法。
付記１８３
付記１８１に記載の組成物の前記ウイルスベクターの治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓、肝臓、肺、又は腎臓の線維症の治療方法。
付記１８４
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターの組み合わせであって、前記第一のウイルスベクターは、哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列及びＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）ドメインをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を有するカセットを含み、前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現により、前記哺乳動物可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩタンパク質と前記Ｆｃとの融合体が産生され、
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列は哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列の発現を妨げるためのインヒビターを任意に含み、
前記第二のウイルスベクターはＫｌｏｔｈｏ又はＦＧＦ２１をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第三の核酸配列を含み、前記第三の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第二のウイルスベクターは前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、前記第二のウイルスベクターは非標的組織における前記第三の核酸配列の発現を妨げるためのインヒビターを任意に含む、前記ウイルスベクターの組み合わせ。
付記１８５
第一のウイルスベクター及び第二のウイルスベクターの組み合わせであって、前記第一のウイルスベクターは、ＦＧＦ２１タンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第一の核酸配列を含むカセットを含み、
前記第一の核酸配列は哺乳動物細胞の発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ウイルスベクターは前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、
前記ウイルスベクターは非標的組織における前記第一の核酸配列の発現を妨げるためのインヒビターを任意に含み、
前記第二のウイルスベクターはＫｌｏｔｈｏをコードする核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する第二の核酸配列を含み、前記第二の核酸配列は哺乳動物細胞における発現のための適切なプロモーターに作動可能に連結されており、
前記第二のウイルスベクターは前記カセットに隣接する１又は複数のＩＴＲ配列を含み、前記第二のウイルスベクターは非標的組織における前記第三の核酸配列の発現を妨げるためのインヒビターを任意に含む、前記ウイルスベクターの組み合わせ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【図21-3】
【図21-4】
【図21-5】
【図22】
【配列表】