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特許7633102蛍光寿命計測のバックグラウンド除去方法及び標的物質の定量方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-10
(45)【発行日】2025-02-19
(54)【発明の名称】蛍光寿命計測のバックグラウンド除去方法及び標的物質の定量方法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20250212BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 B
G01N21/64 F
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021102976
(22)【出願日】2021-06-22
(65)【公開番号】P2023002007
(43)【公開日】2023-01-10
【審査請求日】2024-04-24
(73)【特許権者】
【識別番号】000236436
【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113435
【弁理士】
【氏名又は名称】黒木 義樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140442
【弁理士】
【氏名又は名称】柴山 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】小田 明典
(72)【発明者】
【氏名】里園 浩
【審査官】伊藤 裕美
(56)【参考文献】
【文献】特許第６１３３０５３（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２０１６－５３８９８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３４１７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０２１２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０５６９０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００４／０９０５１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１４６８２７（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／８３
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶媒中に存在する標的物質を、前記標的物質と結合する蛍光物質を用いて定量する方法であって、第１の溶媒と、前記標的物質又は前記蛍光物質とを含み、かつ前記蛍光物質と結合した前記標的物質を含まない第１の試料に対して、前記蛍光物質を励起する励起光を照射して第１の蛍光減衰曲線を取得し、前記第１の蛍光減衰曲線及び第１の蛍光寿命値から、第１の重み因子を取得する第１ステップと、
第２の溶媒と、前記蛍光物質と結合した前記標的物質とを含む第２の試料に対して、前記蛍光物質を励起する励起光を照射して第２の蛍光減衰曲線を取得し、前記第２の蛍光減衰曲線、第２の蛍光寿命値、前記第１の蛍光寿命値及び前記第１の重み因子から、第２の重み因子を取得する第２ステップと、
前記第２の重み因子から、前記標的物質の定量を行う第３ステップと、を備える方法。
【請求項2】
前記第１の蛍光寿命値は、第１の蛍光減衰曲線から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第２の蛍光寿命値は、第２の蛍光減衰曲線から取得される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して前記第２の蛍光寿命値及び前記第２の重み因子を取得する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して前記第１の蛍光寿命値及び前記第１の重み因子を取得する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の試料は、前記標的物質及び前記蛍光物質のうち、前記標的物質のみを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の試料は、前記標的物質及び前記蛍光物質のうち、前記蛍光物質のみを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記標的物質がタンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記第３ステップにおいて、前記第２の重み因子を有するパラメータと、既知濃度の前記標的物質を含む標準試料に対して前記第１ステップ及び前記第２ステップを実施して得られる第２の重み因子を有するパラメータとを対比する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光寿命計測のバックグラウンド除去方法及び標的物質の定量方法に関する。
【背景技術】
【0002】
被験試料中に存在する標的物質の定量は、蛍光物質を標的物質に結合させて蛍光強度を測定する方法によって行われている（例えば特許文献１，２。）蛍光強度の測定結果に影響する因子の一つに蛍光寿命があり、蛍光寿命を正確に測定することが、標的物質を正しく定量するのに重要である。
【0003】
蛍光寿命は、蛍光減衰曲線を測定し、得られた蛍光減衰曲線を、理論式（一般的には複数成分の指数関数）にカーブフィッティングして求める。蛍光減衰曲線の測定及び解析においては、バックグラウンド光の存在が結果に大きく影響し、間違った解析の原因となるため、バックグラウンド光を正しく解析することが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１４－１２２８４６号公報
【文献】国際公開第２００４／０９０５１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、溶媒中に存在する標的物質の定量の正確性を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の［１］～［９］に関する。
【0007】
［１］溶媒中に存在する標的物質を、上記標的物質と結合する蛍光物質を用いて定量する方法であって、第１の溶媒と、上記標的物質又は上記蛍光物質とを含み、かつ上記蛍光物質と結合した上記標的物質を含まない第１の試料に対して、上記蛍光物質を励起する励起光を照射して第１の蛍光減衰曲線を取得し、上記第１の蛍光減衰曲線及び第１の蛍光寿命値から、第１の重み因子を取得する第１ステップと、第２の溶媒と、上記蛍光物質と結合した上記標的物質とを含む第２の試料に対して、上記蛍光物質を励起する励起光を照射して第２の蛍光減衰曲線を取得し、上記第２の蛍光減衰曲線、第２の蛍光寿命値、上記第１の蛍光寿命値及び上記第１の重み因子から、第２の重み因子を取得する第２ステップと、上記第２の重み因子から、上記標的物質の定量を行う第３ステップと、を備える方法。
［２］上記第１の蛍光寿命値は、第１の蛍光減衰曲線から取得される、［１］に記載の方法。
［３］上記第２の蛍光寿命値は、第２の蛍光減衰曲線から取得される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］上記第２ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して上記第２の蛍光寿命値及び前記第２の重み因子を取得する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記第１ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して上記第１の蛍光寿命値及び上記第１の重み因子を取得する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］上記第１の試料は、上記標的物質及び上記蛍光物質のうち、上記標的物質のみを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］上記第１の試料は、上記標的物質及び上記蛍光物質のうち、上記蛍光物質のみを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［８］上記標的物質がタンパク質である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］上記第３ステップにおいて、上記第２の重み因子を有するパラメータと、既知濃度の上記標的物質を含む標準試料に対して上記第１ステップ及び上記第２ステップを実施して得られる第２の重み因子を有するパラメータとを対比する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［２］上記第１の蛍光寿命値は、第１の蛍光減衰曲線から取得される、［１］に記載の方法。
［３］上記第２の蛍光寿命値は、第２の蛍光減衰曲線から取得される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］上記第２ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して上記第２の蛍光寿命値及び前記第２の重み因子を取得する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記第１ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して上記第１の蛍光寿命値及び上記第１の重み因子を取得する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］上記第１の試料は、上記標的物質及び上記蛍光物質のうち、上記標的物質のみを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］上記第１の試料は、上記標的物質及び上記蛍光物質のうち、上記蛍光物質のみを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［８］上記標的物質がタンパク質である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］上記第３ステップにおいて、上記第２の重み因子を有するパラメータと、既知濃度の上記標的物質を含む標準試料に対して上記第１ステップ及び上記第２ステップを実施して得られる第２の重み因子を有するパラメータとを対比する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、溶媒中に存在する標的物質の定量の正確性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0011】
本実施形態に係る方法は、溶媒中に存在する標的物質を、上記標的物質と結合する蛍光物質を用いて定量する方法であって、第１の溶媒と、上記標的物質又は上記蛍光物質とを含み、かつ上記蛍光物質と結合した上記標的物質を含まない第１の試料に対して、上記蛍光物質を励起する励起光を照射して第１の蛍光減衰曲線を取得し、上記第１の蛍光減衰曲線及び第１の蛍光寿命値から、第１の重み因子を取得する第１ステップと、第２の溶媒と、上記蛍光物質と結合した上記標的物質とを含む第２の試料に対して、上記蛍光物質を励起する励起光を照射して第２の蛍光減衰曲線を取得し、上記第２の蛍光減衰曲線、第２の蛍光寿命値、上記第１の蛍光寿命値及び上記第１の重み因子から、第２の重み因子を取得する第２ステップと、上記第２の重み因子から、上記標的物質の定量を行う第３ステップと、を備える。
【0012】
本実施形態に係る方法によれば、蛍光寿命の測定の正確性を上げることができ、それにより、標的物質の定量の正確性を向上させることができる。
【0013】
標的物質としては、タンパク質、核酸、ウイルス、細菌、汚染物質等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ａβ（１－４２）凝集体等が挙げられる。
【0014】
蛍光物質としては、蛍光色素、蛍光染色剤、量子ドット、蛍光ビーズ等が挙げられる。より具体的には、例えば、チオフラビンＳ、６－（２－フルオロエトキシ）－２－（４－メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール（ＢＦ－１６８）、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、チオフラビンＴ、２－（４´－アミノフェニル）－６－メチルベンゾオキサゾール（ＭＢＰＡ）、２－（４´－メチルアミノフェニル）－６－メチルベンゾオキサゾール（（６－Ｍｅ－）ＢＴＡ－１）、２－（４´－ジメチルアミノフェニル）－６－ヨードベンゾチアゾール（ＴＺＤＭ）、２－（４´－メチルアミノフェニル）－６－ヒドロキシベンゾチアゾール（ＰＩＢ）、２－（４´－ジメチルアミノフェニル）－６－ヨードベンゾオキサゾール（ＩＢＯＸ）ＡＴＴＯ４２５、ＡＴＴＯ３９０等が挙げられる。
【0015】
溶媒としては、水、緩衝液、培地等が挙げられる。より具体的には、例えば、精製水、イオン交換水、超純水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、グリシン緩衝溶液（グリシン－水酸化ナトリウム溶液）、ＤＭＳＯ含有培地等が挙げられる。溶媒は第１の溶媒及び第２の溶媒を含有していてよく、第１の溶媒及び第２の溶媒が同じものであっても異なるものであってもよい。
【0016】
（第１ステップ）
第１ステップにおいては、まず、第１の試料に対して、蛍光物質を励起する励起光を照射して第１の蛍光減衰曲線（バックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ））を取得する。この操作は、図１における、「（２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定」に相当する。第１ステップにおいては、バックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を、多成分指数関数で解析することができる。この操作は、図１における、「（３）バックグラウンドの減衰曲線の解析」に相当する。数式３で示される関数Ｇｂ（ｔ）を、数式４にしたがってコンボリューション積分してＩｂ（ｔ）を計算し、このＩｂ（ｔ）と、バッググラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）から、数式５に従ってχ２値を計算することができる。Ｉｂ（ｔ）とＢ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数の組み合わせを探索し、数式３におけるτｂ１～τｂｎ、Ａｂ１～Ａｂｎの最良の組み合わせを得ることができる。この解析の結果得られたτｂ１～τｂｎ（第１の蛍光寿命値）及びＡｂ１～Ａｂｎ（第１の重み因子）を、バックグラウンド成分のパラメータとすることができる。
第１ステップにおいては、まず、第１の試料に対して、蛍光物質を励起する励起光を照射して第１の蛍光減衰曲線（バックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ））を取得する。この操作は、図１における、「（２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定」に相当する。第１ステップにおいては、バックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を、多成分指数関数で解析することができる。この操作は、図１における、「（３）バックグラウンドの減衰曲線の解析」に相当する。数式３で示される関数Ｇｂ（ｔ）を、数式４にしたがってコンボリューション積分してＩｂ（ｔ）を計算し、このＩｂ（ｔ）と、バッググラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）から、数式５に従ってχ２値を計算することができる。Ｉｂ（ｔ）とＢ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数の組み合わせを探索し、数式３におけるτｂ１～τｂｎ、Ａｂ１～Ａｂｎの最良の組み合わせを得ることができる。この解析の結果得られたτｂ１～τｂｎ（第１の蛍光寿命値）及びＡｂ１～Ａｂｎ（第１の重み因子）を、バックグラウンド成分のパラメータとすることができる。
【0017】
数式３において、ｂｎはバックグランドの解析に使用される指数関数の成分数とすることができる。成分数ｂｎの値は任意のものであってよいが、χ２＜１．２を目安として良好なフィッティングが得られるのに十分な数とするのが好ましい。実際には２～３成分程度とするのが一般的であるが、単一の成分に関して第１の蛍光寿命値及び第１の重み因子を取得することが妨げられるわけではない。数式４において、Ｅ（ｔ）は事前に測定された測定装置の装置応答関数とすることができる。数式５において、ｃ１は解析の開始時間、ｃ２は解析の終了時間とすることができる。
【0018】
【数1】
【0019】
第１ステップにおいて、複数の蛍光成分又は複数のバックグラウンド成分に関して第１の蛍光寿命値及び第１の重み因子を取得することができる。第１の蛍光寿命値及び第１の重み因子を取得することによって、蛍光物質と結合した標的物質の蛍光寿命値をより正しく測定することができ、その結果、標的物質の定量の正確性が向上する。
【0020】
第１の蛍光寿命値は、既知の値であってもよく、第１の蛍光減衰曲線から取得される値であってもよい。
【0021】
第１の試料は、標的物質及び蛍光物質のうち、標的物質のみを含んでいてよく、また、蛍光物質のみを含んでいてもよい。
【0022】
（第２ステップ）
第２ステップにおいては、まず、第２の試料に対して、蛍光物質を励起する励起光を照射して第２の蛍光減衰曲線（バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ））を取得する。この操作は、図１における、「（１）蛍光減衰曲線の測定」に相当する。第２ステップにおいては、第１ステップで求められたバックグラウンド成分のパラメータを用いて、バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を、多成分指数関数で解析することができる。この操作は、図１における、「（４）バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析」に相当する。数式６に従って関数Ｇ（ｔ）を計算し、数式７にしたがってコンボリューション積分してＩ（ｔ）を計算し、Ｉ（ｔ）と、蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）とから、数式８に従ってχ２値を計算することができる。Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数τｌ～τｎ、Ａ１～Ａｎの組み合わせを探索することができる。この結果得られたτｌ～τｎ及びＡ１～Ａｎを、求める第２の蛍光寿命及び第２の重み因子の解析結果とすることができる。数式８において、ｃ１は解析の開始時問、ｃ２は解析の終了時間としてよい。数式６における成分数ｎの値は任意のものであってよいが、χ２＜１．２を目安として良好なフィッティングが得られるのに十分な数とするのが好ましい。実際には２～３成分程度とするのが一般的であるが、単一の成分に関して第２の蛍光寿命値及び第２の重み因子を取得することが妨げられるわけではない。数式６において、ｂｎ、Ａ１～Ａｂｎ及びτ１～τｂｎは、第１ステップで決定したバックグラウンドの成分数とパラメータである。数式７において、Ｅ（ｔ）は事前に測定された測定装置の装置応答関数とすることができる。
第２ステップにおいては、まず、第２の試料に対して、蛍光物質を励起する励起光を照射して第２の蛍光減衰曲線（バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ））を取得する。この操作は、図１における、「（１）蛍光減衰曲線の測定」に相当する。第２ステップにおいては、第１ステップで求められたバックグラウンド成分のパラメータを用いて、バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を、多成分指数関数で解析することができる。この操作は、図１における、「（４）バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析」に相当する。数式６に従って関数Ｇ（ｔ）を計算し、数式７にしたがってコンボリューション積分してＩ（ｔ）を計算し、Ｉ（ｔ）と、蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）とから、数式８に従ってχ２値を計算することができる。Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数τｌ～τｎ、Ａ１～Ａｎの組み合わせを探索することができる。この結果得られたτｌ～τｎ及びＡ１～Ａｎを、求める第２の蛍光寿命及び第２の重み因子の解析結果とすることができる。数式８において、ｃ１は解析の開始時問、ｃ２は解析の終了時間としてよい。数式６における成分数ｎの値は任意のものであってよいが、χ２＜１．２を目安として良好なフィッティングが得られるのに十分な数とするのが好ましい。実際には２～３成分程度とするのが一般的であるが、単一の成分に関して第２の蛍光寿命値及び第２の重み因子を取得することが妨げられるわけではない。数式６において、ｂｎ、Ａ１～Ａｂｎ及びτ１～τｂｎは、第１ステップで決定したバックグラウンドの成分数とパラメータである。数式７において、Ｅ（ｔ）は事前に測定された測定装置の装置応答関数とすることができる。
【0023】
【数2】
【0024】
第２の蛍光寿命値は、既知の値であってもよく、第２の蛍光減衰曲線から取得される値であってもよい。
【0025】
（第３ステップ）
第２の蛍光寿命値と第２の重み因子との積を、濃度が未知である標的物質に結合した蛍光物質の蛍光量とすることができる。標的物質の濃度（又は重量）が様々である複数の標準試料について、第１ステップ及び第２ステップをそれぞれ実施し、第２の蛍光寿命値と第２の重み因子との積（すなわち蛍光量）をそれぞれ求め、蛍光量及び濃度（又は重量）をプロットして検量線を作成することができる。この検量線と、濃度（又は重量）が未知である標的物質について求めた蛍光量とから、標的物質の濃度（又は重量）を定量することができる。標的物質の濃度を正確に求めなくてもよい場合においては、必ずしも検量線の作成は必要ではなく、いくつかの標準試料の蛍光量と比較するだけでもよい。また、標的物質の第２の蛍光寿命値が同一であることが保証されている場合は、第２の蛍光寿命値と第２の重み因子の積から蛍光量を求める必要はなく、第２の重み因子の比較のみでもよい。
第２の蛍光寿命値と第２の重み因子との積を、濃度が未知である標的物質に結合した蛍光物質の蛍光量とすることができる。標的物質の濃度（又は重量）が様々である複数の標準試料について、第１ステップ及び第２ステップをそれぞれ実施し、第２の蛍光寿命値と第２の重み因子との積（すなわち蛍光量）をそれぞれ求め、蛍光量及び濃度（又は重量）をプロットして検量線を作成することができる。この検量線と、濃度（又は重量）が未知である標的物質について求めた蛍光量とから、標的物質の濃度（又は重量）を定量することができる。標的物質の濃度を正確に求めなくてもよい場合においては、必ずしも検量線の作成は必要ではなく、いくつかの標準試料の蛍光量と比較するだけでもよい。また、標的物質の第２の蛍光寿命値が同一であることが保証されている場合は、第２の蛍光寿命値と第２の重み因子の積から蛍光量を求める必要はなく、第２の重み因子の比較のみでもよい。
【実施例】
【0026】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0027】
（実施例１）
本発明による蛍光減衰曲線の解析例を、図１のフローチャートに従って、以下に記す。なお、本実施例においては、従来法に比べてより正しい答えが得られることを示すために、実験で得られた減衰曲線ではなく、既知のパラメータから理論的に求められた、検証用の減衰曲線を用いて説明する。
本発明による蛍光減衰曲線の解析例を、図１のフローチャートに従って、以下に記す。なお、本実施例においては、従来法に比べてより正しい答えが得られることを示すために、実験で得られた減衰曲線ではなく、既知のパラメータから理論的に求められた、検証用の減衰曲線を用いて説明する。
【0028】
（１－１）検証用減衰曲線の計算
（１－１－１）バックグラウンドの蛍光減衰曲線
バックグラウンドの蛍光減衰曲線の作成方法を以下に記す。実際の実験において、この操作は図１における「（２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定」に相当する。
表１に示すバックグラウンドの寿命パラメータを数式１に代入し、蛍光減衰曲線Ｇ（ｔ）を求めた。なお数式１中の添字ｉは、バックグラウンド成分の順を表している。Ｇ（ｔ）と、図２に示す事前に実測された測定装置の装置応答関数Ｅ（ｔ）から、数式２を使ってコンボリューション積分して減衰曲線Ｉ（ｔ）を求め、最後に強度に対応したポアソン雑音を付加してバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を計算した。計算されたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を図３に示す。
（１－１－１）バックグラウンドの蛍光減衰曲線
バックグラウンドの蛍光減衰曲線の作成方法を以下に記す。実際の実験において、この操作は図１における「（２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定」に相当する。
表１に示すバックグラウンドの寿命パラメータを数式１に代入し、蛍光減衰曲線Ｇ（ｔ）を求めた。なお数式１中の添字ｉは、バックグラウンド成分の順を表している。Ｇ（ｔ）と、図２に示す事前に実測された測定装置の装置応答関数Ｅ（ｔ）から、数式２を使ってコンボリューション積分して減衰曲線Ｉ（ｔ）を求め、最後に強度に対応したポアソン雑音を付加してバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を計算した。計算されたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を図３に示す。
【0029】
【数3】
【0030】
【表1】
【0031】
【数4】
【0032】
（１－１－２）バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線
バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線の作成方法を以下に記す。実際の実験において、この操作は図１における「（１）蛍光減衰曲線の測定」に相当する。表２に示す蛍光寿命パラメータとバックグラウンドの寿命パラメータとを数式１に代入し、蛍光減衰曲線Ｇ（ｔ）を求めた。なお、数式１中の添字ｉは、バックグラウンド成分の順を表している。Ｇ（ｔ）と、図２に示す事前に実測された測定装置の装置応答関数Ｅ（ｔ）から、数式２を使ってコンボリューション積分して減衰曲線Ｉ（ｔ）を求め、最後に強度に対応したポアソン雑音を付加してバックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を計算した。本パラメータにおいて、蛍光成分とバックグラウンド成分の強度の比、すなわちＳＮ比は５であった。計算されたバックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を図４に示す。
バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線の作成方法を以下に記す。実際の実験において、この操作は図１における「（１）蛍光減衰曲線の測定」に相当する。表２に示す蛍光寿命パラメータとバックグラウンドの寿命パラメータとを数式１に代入し、蛍光減衰曲線Ｇ（ｔ）を求めた。なお、数式１中の添字ｉは、バックグラウンド成分の順を表している。Ｇ（ｔ）と、図２に示す事前に実測された測定装置の装置応答関数Ｅ（ｔ）から、数式２を使ってコンボリューション積分して減衰曲線Ｉ（ｔ）を求め、最後に強度に対応したポアソン雑音を付加してバックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を計算した。本パラメータにおいて、蛍光成分とバックグラウンド成分の強度の比、すなわちＳＮ比は５であった。計算されたバックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を図４に示す。
【0033】
【表2】
【0034】
（１－２）本発明による、バックグラウンド含んだ蛍光減衰曲線の解析
本発明に基づき、（１－１－２）で計算したバックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）の、バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析を行う手順と例を以下に示す。
本発明に基づき、（１－１－２）で計算したバックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）の、バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析を行う手順と例を以下に示す。
【0035】
（１－２－１）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析
（１－１－１）で計算されたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を多成分指数関数で解析した。この操作は、図１における、「（３）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析」に相当する。この解析は次の手順で行った。まず数式３で示される関数Ｇｂ（ｔ）を、数式４にしたがってコンボリューション積分してＩｂ（ｔ）を計算し、このＩｂ（ｔ）と、（１－１－１）で計算されたバッググラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）から、数式５に従ってχ２値を計算した。Ｉｂ（ｔ）とＢ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数の組み合わせを探索し、数式３におけるτｂ１～τｂｎ、Ａｂ１～Ａｂｎの最良の組み合わせを得た。この解析の結果得られたτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎがバックグラウンド成分のパラメータとなる。
（１－１－１）で計算されたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）を多成分指数関数で解析した。この操作は、図１における、「（３）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析」に相当する。この解析は次の手順で行った。まず数式３で示される関数Ｇｂ（ｔ）を、数式４にしたがってコンボリューション積分してＩｂ（ｔ）を計算し、このＩｂ（ｔ）と、（１－１－１）で計算されたバッググラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ（ｔ）から、数式５に従ってχ２値を計算した。Ｉｂ（ｔ）とＢ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数の組み合わせを探索し、数式３におけるτｂ１～τｂｎ、Ａｂ１～Ａｂｎの最良の組み合わせを得た。この解析の結果得られたτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎがバックグラウンド成分のパラメータとなる。
【0036】
数式３において、ｂｎはバックグランドの解析に使用される指数関数の成分数である。成分数ｂｎの値は任意であるが、χ２＜１．２が目安となる良好なフィッティングが得られるのに十分な数とする。実際には２～３成分程度であるが、本実施例では、バックグラウンドの蛍光減衰曲線を計算する際に仮定されたバックグラウンド成分数である２成分（ｂｎ＝２）とした。数式４において、Ｅ（ｔ）は事前に測定された測定装置の装置応答関数である。数式５において、ｃ１は解析の開始時間、ｃ２は解析の終了時間を示し、本解析ではｃ１として減表曲線の立ち上がりがピーク値の９０％となる１０１ｃｈａｎｎｅｌ、ｃ２としては計測終了時間である１０２４ｃｈａｎｎｅｌとした。
【0037】
解析の結果を表３に示す。解析で得られた各パラメータと、（１－１－２）で用いた各パラメータとの誤差は、２％以下であった。
【0038】
【数5】
【0039】
【表3】
【0040】
（１－２－２）バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線の解析
（１－２－１）で求められたバックグラウンドのパラメータを用いて、バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を、多成分指数関数で解析した。この操作は、図１における、「（４）バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析」に相当する。数式６に従って関数Ｇ（ｔ）を計算し、数式７にしたがってコンボリューション積分してＩ（ｔ）を計算し、Ｉ（ｔ）と（１－１－２）で計算した蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）から、数式８に従ってχ２値を計算した。Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数τｌ～τｎ、Ａ１～Ａｎの組み合わせを探索した。この結果得られたτｌ～τｎ及びＡ１～Ａｎを、求める第２の蛍光寿命及び第２の重み因子の解析結果とすることができる。数式８において、ｃ１は解析の開始時問、ｃ２は解析の終了時間を示し、本解析では、ｃ１として減衰曲線の立ち上がりがピーク値９０％となる１１４ｃｈａｎｎｅｌ、ｃ２としては計測終了時間である１０２４ｃｈａｎｎｅｌとした。数式６における成分数ｎの値は任意であるが、良好なフィッティングが得られるのに十分な数が必要である。実際にはχ２＜１．２が目安となる。本例では、蛍光減衰曲線の作成時に使用された成分数ｎ＝３とした。また、数式６において、ｂｎ、τｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎは、（１－２－１）で決定したバックグラウンドの成分数とパラメータである。数式７において、Ｅ（ｔ）は事前に測定された測定装置の装置応答関数である。
（１－２－１）で求められたバックグラウンドのパラメータを用いて、バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）を、多成分指数関数で解析した。この操作は、図１における、「（４）バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析」に相当する。数式６に従って関数Ｇ（ｔ）を計算し、数式７にしたがってコンボリューション積分してＩ（ｔ）を計算し、Ｉ（ｔ）と（１－１－２）で計算した蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）から、数式８に従ってχ２値を計算した。Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数τｌ～τｎ、Ａ１～Ａｎの組み合わせを探索した。この結果得られたτｌ～τｎ及びＡ１～Ａｎを、求める第２の蛍光寿命及び第２の重み因子の解析結果とすることができる。数式８において、ｃ１は解析の開始時問、ｃ２は解析の終了時間を示し、本解析では、ｃ１として減衰曲線の立ち上がりがピーク値９０％となる１１４ｃｈａｎｎｅｌ、ｃ２としては計測終了時間である１０２４ｃｈａｎｎｅｌとした。数式６における成分数ｎの値は任意であるが、良好なフィッティングが得られるのに十分な数が必要である。実際にはχ２＜１．２が目安となる。本例では、蛍光減衰曲線の作成時に使用された成分数ｎ＝３とした。また、数式６において、ｂｎ、τｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎは、（１－２－１）で決定したバックグラウンドの成分数とパラメータである。数式７において、Ｅ（ｔ）は事前に測定された測定装置の装置応答関数である。
【0041】
【数6】
【0042】
以上の解析手順により、蛍光寿命値τｌ～τ３、及び、相当する寿命値の重み因子Ａ１～Ａ３を求めた。解析の結果を表４に示す。想定されたパラメータとの相対誤差を表５に示す。フィッティングの良否の目安であるχ２は１．１１で、フィッティングは良好であった。以下の比較例１に示す従来法による解析結果と異なり、蛍光成分については、２％以下の精度で、減衰曲線の作成に使用した寿命値と重み因子を再現できた。この結果から、バックグラウンドを含む蛍光減衰曲線の解析において、本発明がバックグラウンドと蛍光成分を正しく分離し、精度の高い解析が可能であることが示された。
【0043】
【表4】
【0044】
【表5】
【0045】
（比較例１）従来法による、バックグラウンドを含んだ蛍光減衰曲線の解析
従来法、すなわちバックグラウンド成分を、蛍光成分の追加の成分として扱い、目的の蛍光成分と同時に解析した結果について、以下に記す。
まず、数式９に従って関数Ｇ（ｔ）を計算し、数式１０に従ってコンボリューション積分してＩ（ｔ）を計算し、このＩ（ｔ）と、（１－１－２）で計算した蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）から、数式１１に従ってフィッティングの目安となるχ２値を計算した。Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数τｌ～τｎ、Ａ１～Ａｎの組み合わせを探索した。この結果得られたτｌ～τｎ及びＡ１～Ａｎが、求める蛍光寿命値及び重み因子の解析結果となる。
従来法、すなわちバックグラウンド成分を、蛍光成分の追加の成分として扱い、目的の蛍光成分と同時に解析した結果について、以下に記す。
まず、数式９に従って関数Ｇ（ｔ）を計算し、数式１０に従ってコンボリューション積分してＩ（ｔ）を計算し、このＩ（ｔ）と、（１－１－２）で計算した蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）から、数式１１に従ってフィッティングの目安となるχ２値を計算した。Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、χ２を最小にする変数τｌ～τｎ、Ａ１～Ａｎの組み合わせを探索した。この結果得られたτｌ～τｎ及びＡ１～Ａｎが、求める蛍光寿命値及び重み因子の解析結果となる。
【0046】
数式９において、ｎは解析に用いる指数関数の数である。ここでは、蛍光の指数関数３成分にバックグラウンドの成分数２を加え、ｎ＝５とした。数式１１において、ｃ１は解析の開始時問、ｃ２は解析の終了時間で、本解析ではｃ１として減衰曲線の立ち上がりがピーク値の９０％となる１１４ｃｈａｎｎｅｌ、ｃ２としては計測終了時間である１０２４ｃｈａｎｎｅｌとした。解析の結果を表６に示す。解析で得られた各パラメータと、（１－１－２）で用いた各パラメータとの誤差を表７に示す。
【0047】
フィッティングの良否の目安であるχ２は１．０９で、フィッティングは良好であった。しかしながら、蛍光成分（ｉ＝２）とバックグラウンド成分（ｉ＝４）の蛍光寿命値が同じ値となっており、蛍光成分とバックグラウンド成分とを分離できていなかった。その影響で、蛍光成分（ｉ＝２）の重み因子、蛍光成分（ｉ＝３）及びバックグラウンド成分（ｉ＝４、ｉ＝５）の蛍光寿命値及び重み因子の誤差が大きかった。この結果から、バックグラウンド成分を考慮するために、単純に指数関数成分を増やしても、精度の高い解析は出来ないことが示された。
【0048】
【数7】
【0049】
【表6】
【0050】
【表7】
【0051】
（実施例２）
実施例１で記載した解析法を、チオフラビンＴと結合したＡβ（１－４２）凝集体の試料の蛍光減衰曲線に適応した例を説明する。本実施例において、蛍光試料は、チオフラビンＴに結合したＡβ（１－４２）凝集体である。
実施例１で記載した解析法を、チオフラビンＴと結合したＡβ（１－４２）凝集体の試料の蛍光減衰曲線に適応した例を説明する。本実施例において、蛍光試料は、チオフラビンＴに結合したＡβ（１－４２）凝集体である。
【0052】
（２－１）Ａβ（１－４２）凝集体の調製
ヒト由来Ａβ（１－４２）タンパク質（ペプチド研究所）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、更にｌ０ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて１００μｍｏ１／Ｌに希釈した。得られた溶液を３７℃のインキュベータ内に２４時間静置し、Ａβ（１－４２）凝集体サンプルを調製した。
ヒト由来Ａβ（１－４２）タンパク質（ペプチド研究所）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、更にｌ０ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて１００μｍｏ１／Ｌに希釈した。得られた溶液を３７℃のインキュベータ内に２４時間静置し、Ａβ（１－４２）凝集体サンプルを調製した。
【0053】
（２－２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定
Ａβ（１－４２）凝集体サンプル１０μＬに、グリシン緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン－水酸化ナトリウム溶液 ｐＨ９．０）４１０μＬと、蒸留水８０μＬを混合してバックグラウンド用試料とした。バックグラウンド用試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定を行った。得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ２（ｔ）を図５に示す。
Ａβ（１－４２）凝集体サンプル１０μＬに、グリシン緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン－水酸化ナトリウム溶液 ｐＨ９．０）４１０μＬと、蒸留水８０μＬを混合してバックグラウンド用試料とした。バックグラウンド用試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定を行った。得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ２（ｔ）を図５に示す。
【0054】
（２－３）チオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の蛍光減衰曲線の測定
Ａβ（１－４２）凝集体サンプル１０μＬに、グリシン緩衝溶液４１０μＬと、１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液ｌ０μＬと蒸留水７０μＬ又は１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液２０μＬと蒸留水６０μＬを混合し、Ａβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が１である試料（以下、ＴＡ１と略記する。）と、Ａβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が２である試料（以下、ＴＡ２と略記する。）とをそれぞれ調製した。各試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社 Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで蛍光減衰曲線の測定を行った。得られた２本の蛍光減衰曲線ＦＴＡ１（ｔ）及びＦＴＡ２（ｔ）を図６に示す。
Ａβ（１－４２）凝集体サンプル１０μＬに、グリシン緩衝溶液４１０μＬと、１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液ｌ０μＬと蒸留水７０μＬ又は１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液２０μＬと蒸留水６０μＬを混合し、Ａβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が１である試料（以下、ＴＡ１と略記する。）と、Ａβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が２である試料（以下、ＴＡ２と略記する。）とをそれぞれ調製した。各試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社 Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで蛍光減衰曲線の測定を行った。得られた２本の蛍光減衰曲線ＦＴＡ１（ｔ）及びＦＴＡ２（ｔ）を図６に示す。
【0055】
（２－４）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析
図１における「（３）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析」について説明する。（２－２）で得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線から、実施例１の（１－２－１）の手順に従って、バックグラウンドのパラメータを決定した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＢ２（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎの組み合わせが探索された。パラメータ決定において、減衰曲線は３成分で解析された。得られたバックグラウンドのパラメータを表８に示す。
図１における「（３）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析」について説明する。（２－２）で得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線から、実施例１の（１－２－１）の手順に従って、バックグラウンドのパラメータを決定した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＢ２（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎの組み合わせが探索された。パラメータ決定において、減衰曲線は３成分で解析された。得られたバックグラウンドのパラメータを表８に示す。
【0056】
【表8】
【0057】
（２－５）チオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の蛍光減衰曲線の解析
図１における「（４）バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析」について説明する。（２－３）で得られたチオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の蛍光減衰曲線と、表８のバックグラウンドのパラメータから、実施例１の（１－２－１）の手順に従って、蛍光減衰曲線をそれぞれ解析した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＦＴＡ１（ｔ）又はＦＴＡ２（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτ１～τｎ及びＡ１～Ａｎの組み合わせが探索された。蛍光部分は４成分、すなわちｎ＝４で解析された。ＴＡｌ試料の蛍光寿命の解析結果を表９に、ＴＡ２試料の解析結果を表１０に示す。なお表９、表１０においてバックグラウンド成分のパラメータは省略した。
図１における「（４）バックグラウンドのパラメータを含めた蛍光減衰曲線の解析」について説明する。（２－３）で得られたチオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の蛍光減衰曲線と、表８のバックグラウンドのパラメータから、実施例１の（１－２－１）の手順に従って、蛍光減衰曲線をそれぞれ解析した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＦＴＡ１（ｔ）又はＦＴＡ２（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτ１～τｎ及びＡ１～Ａｎの組み合わせが探索された。蛍光部分は４成分、すなわちｎ＝４で解析された。ＴＡｌ試料の蛍光寿命の解析結果を表９に、ＴＡ２試料の解析結果を表１０に示す。なお表９、表１０においてバックグラウンド成分のパラメータは省略した。
【0058】
【表9】
【0059】
【表10】
【0060】
χ２値は両方ともｌ．２以下で、フィッティングは良好であった。ＴＡｌとＴＡ２の蛍光寿命値は、第２成分がわずかに異なることを除き、一致した。
【0061】
（比較例２）
本発明に依らずに（比較例１と同じ方法で）ＴＡｌとＴＡ２の蛍光減衰曲線を４指数関数成分で直接解析した結果を、表１１と表１２にそれぞれ示す。
本発明に依らずに（比較例１と同じ方法で）ＴＡｌとＴＡ２の蛍光減衰曲線を４指数関数成分で直接解析した結果を、表１１と表１２にそれぞれ示す。
【0062】
【表11】
【0063】
【表12】
【0064】
本発明に依らずに（比較例１と同じ方法で）解析した場合でも、χ２値は両方ともｌ．２以下で、フィッティングは良好であった。一方で、蛍光寿命値は、濃度によって異なる値を示した。濃度変化による蛍光寿命値の変化は、特別な動的相互作用が蛍光分子に働く場合を除き無いことを考えると、本発明に依らない解析結果は間違っており、本発明による解析結果の方がより正しく解析できていることが分かる。以上の結果から、実サンプルにおいても、本発明により正しく蛍光寿命値を解析できることが示され、正しく標的物質の定量ができることが示唆された。
【0065】
（実施例３）
参考例で記載した解析法を、チオフラビンＴと結合したＡβ（１－４２）凝集体試料の蛍光減衰曲線に適応した、もう一つの例を示す。本実施例においては、実施例２と異なり、バックグラウンドの蛍光減衰曲線を得るための試料に蛍光色素チオフラビンＴが含まれており、チオフラビンＴ中の蛍光性不純物によるバックグラウンドの影響を除いて、正しく解析出来ることを示す。なお、簡略化のため実施例２と重複する部分は省き、異なる部分のみを記す。
参考例で記載した解析法を、チオフラビンＴと結合したＡβ（１－４２）凝集体試料の蛍光減衰曲線に適応した、もう一つの例を示す。本実施例においては、実施例２と異なり、バックグラウンドの蛍光減衰曲線を得るための試料に蛍光色素チオフラビンＴが含まれており、チオフラビンＴ中の蛍光性不純物によるバックグラウンドの影響を除いて、正しく解析出来ることを示す。なお、簡略化のため実施例２と重複する部分は省き、異なる部分のみを記す。
【0066】
（３－１）Ａβ（１－４２）凝集体の調製
実施例２の（２－１）の手順にしたがってＡβ（１－４２）凝集体サンプルを調製した。調製時に使用した溶媒（Ａβ（１－４２）タンパク質及びＡβ（１－４２）凝集体のいずれも含まない、ジメチルスルホキシドと塩酸を含む液）を溶媒Ａという。
実施例２の（２－１）の手順にしたがってＡβ（１－４２）凝集体サンプルを調製した。調製時に使用した溶媒（Ａβ（１－４２）タンパク質及びＡβ（１－４２）凝集体のいずれも含まない、ジメチルスルホキシドと塩酸を含む液）を溶媒Ａという。
【0067】
（３－２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定
グリシン緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ グリシン－水酸化ナトリウム溶液 ｐＨ９．０）８００μＬと、１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液１００μＬ、並びに溶媒Ａ１００μＬを混合し、バックグラウンド用試料とした。試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定を行った。得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ３（ｔ）を図７に示す。
グリシン緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ グリシン－水酸化ナトリウム溶液 ｐＨ９．０）８００μＬと、１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液１００μＬ、並びに溶媒Ａ１００μＬを混合し、バックグラウンド用試料とした。試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定を行った。得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ３（ｔ）を図７に示す。
【0068】
（３－３）チオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の蛍光減衰曲線の測定
Ａβ（１－４２）凝集体サンプル１２．５μＬ及び溶媒Ａ８７．５μＬ、並びに、Ａβ（１－４２）凝集体サンプル６．２５μＬ及び溶媒Ａ９３．７５μＬに、１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液１００μＬと、グリシン緩衝溶液８００μＬを混合し、Ａβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が８（以下、ＴＡ８と略記する。）とＡβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が１６（以下、ＴＡ１６と略記する。）の各試料を調製した。各々の試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線の測定を行った。得られた２本の蛍光減衰曲線ＦＴＡ８（ｔ）及びＦＴＡ１６（ｔ）を図８に示す。
Ａβ（１－４２）凝集体サンプル１２．５μＬ及び溶媒Ａ８７．５μＬ、並びに、Ａβ（１－４２）凝集体サンプル６．２５μＬ及び溶媒Ａ９３．７５μＬに、１００μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ水溶液１００μＬと、グリシン緩衝溶液８００μＬを混合し、Ａβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が８（以下、ＴＡ８と略記する。）とＡβ（１－４２）に対するチオフラビンＴのモル数の比が１６（以下、ＴＡ１６と略記する。）の各試料を調製した。各々の試料について、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）を用い、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線の測定を行った。得られた２本の蛍光減衰曲線ＦＴＡ８（ｔ）及びＦＴＡ１６（ｔ）を図８に示す。
【0069】
（３－４）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析
（３－２）で得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ３（ｔ）から、実施例２の（２－４）の手順に従って、バックグラウンドのパラメータを決定した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＢ３（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎの組み合わせが探索された。パラメータ決定において、減衰曲線は３成分で解析された。得られたパラメータを表１３に示す。ここで、パラメータの第１成分τｂ１とＡｂ１は、チオフラビンＴ由来の蛍光であるのは明らかで、それ以外の成分がバックグラウンドとなる。したがって、バックグラウンドのパラメータとしてτｂ２～τｂ３、Ａｂ２～Ａｂ３を採用した。
（３－２）で得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線Ｂ３（ｔ）から、実施例２の（２－４）の手順に従って、バックグラウンドのパラメータを決定した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＢ３（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎの組み合わせが探索された。パラメータ決定において、減衰曲線は３成分で解析された。得られたパラメータを表１３に示す。ここで、パラメータの第１成分τｂ１とＡｂ１は、チオフラビンＴ由来の蛍光であるのは明らかで、それ以外の成分がバックグラウンドとなる。したがって、バックグラウンドのパラメータとしてτｂ２～τｂ３、Ａｂ２～Ａｂ３を採用した。
【0070】
【表13】
【0071】
（３－５）チオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の蛍光減衰曲線の解析
（３－３）で得られたチオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の２つの蛍光減衰曲線と、表１３のバックグラウンドのパラメータτｂ２～τｂ３、Ａｂ２～Ａｂ３から、実施例２の（２－４）の手順に従って、蛍光減衰曲線ＦＴＡ８（ｔ）及びＦＴＡ１６（ｔ）をそれぞれ解析した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＦＴＡ８（ｔ）又はＦＴＡ１６（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎの組み合わせが探索された。この解析において、蛍光成分は両方とも４成分で解析された。ＴＡ８における蛍光寿命の解析結果を表１４に、ＴＡ１６における蛍光寿命の解析結果を表１５に示す。
（３－３）で得られたチオフラビンＴで染色したＡβ（１－４２）凝集体の２つの蛍光減衰曲線と、表１３のバックグラウンドのパラメータτｂ２～τｂ３、Ａｂ２～Ａｂ３から、実施例２の（２－４）の手順に従って、蛍光減衰曲線ＦＴＡ８（ｔ）及びＦＴＡ１６（ｔ）をそれぞれ解析した。χ２値の計算では、Ｉ（ｔ）とＦＴＡ８（ｔ）又はＦＴＡ１６（ｔ）とが最もよく一致するように、χ２値を最小にするτｂ１～τｂｎ及びＡｂ１～Ａｂｎの組み合わせが探索された。この解析において、蛍光成分は両方とも４成分で解析された。ＴＡ８における蛍光寿命の解析結果を表１４に、ＴＡ１６における蛍光寿命の解析結果を表１５に示す。
【0072】
【表14】
【0073】
【表15】
【0074】
χ２値は両方とも１．２以下で、フィッティングは良好であった。濃度による寿命値の変化がほとんど無く、正しく解析できていることが分かる。
【0075】
（比較例３）
本発明に依らずに（比較例１と同じ方法で）２つの蛍光減衰曲線ＦＴＡ８（ｔ）及びＦＴＡ１６（ｔ）を、４指数関数成分で直接解析した結果を、表１６と表１７に示す。
本発明に依らずに（比較例１と同じ方法で）２つの蛍光減衰曲線ＦＴＡ８（ｔ）及びＦＴＡ１６（ｔ）を、４指数関数成分で直接解析した結果を、表１６と表１７に示す。
【0076】
【表16】
【0077】
【表17】
【0078】
χ２値は両方ともｌ．２以下で、フィッティングは良好であった。濃度の変化で寿命値が異なっており、正しく解析できなかった。
【0079】
（実施例４）
本発明を、蛍光標識試薬ＡＴＴＯ４２５の定量に適応した例を説明する。本実施例において、蛍光試料はＡＴＴＯ４２５であり、バックグラウンド蛍光体としてＡＴＴＯ３９０を混合した。
本発明を、蛍光標識試薬ＡＴＴＯ４２５の定量に適応した例を説明する。本実施例において、蛍光試料はＡＴＴＯ４２５であり、バックグラウンド蛍光体としてＡＴＴＯ３９０を混合した。
【0080】
（４－１）試料の調製
目的の蛍光物質であるビオチン修飾ＡＴＴＯ４２５（ＡＤ４２５－７１，ＡＴＴＯ－ＴＥＣＧｍｂＨ）と、バックグラウンド蛍光物質であるビオチン修飾ＡＴＴＯ３９０（ＡＤ３９０－７１，ＡＴＴＯ－ＴＥＣＧｍｂＨ）をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、濃度をそれぞれ５ｎＭ、１０ｎＭとした。
本試料において、ＡＴＴＯ４２５の蛍光強度は、バックグラウンドのＡＴＴＯ３９０の約１．３倍である。
目的の蛍光物質であるビオチン修飾ＡＴＴＯ４２５（ＡＤ４２５－７１，ＡＴＴＯ－ＴＥＣＧｍｂＨ）と、バックグラウンド蛍光物質であるビオチン修飾ＡＴＴＯ３９０（ＡＤ３９０－７１，ＡＴＴＯ－ＴＥＣＧｍｂＨ）をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、濃度をそれぞれ５ｎＭ、１０ｎＭとした。
本試料において、ＡＴＴＯ４２５の蛍光強度は、バックグラウンドのＡＴＴＯ３９０の約１．３倍である。
【0081】
（４－２）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の測定
ビオチン修飾ＡＴＴＯ３９０をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、濃度を１０ｎＭとした。この試料を蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）に設置し、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線を測定した。得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線を図９の曲線（ａ）に示す。
ビオチン修飾ＡＴＴＯ３９０をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、濃度を１０ｎＭとした。この試料を蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）に設置し、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線を測定した。得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線を図９の曲線（ａ）に示す。
【0082】
（４－３）試料の蛍光減衰曲線の測定
（４－１）で調製した試料を、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）に設置し、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線を測定した。得られた試料の蛍光減衰曲線を図９の曲線（ｂ）に示す。
（４－１）で調製した試料を、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－Ｔａｕ）に設置し、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線を測定した。得られた試料の蛍光減衰曲線を図９の曲線（ｂ）に示す。
【0083】
（４－４）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析
図１における「（３）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析」について説明する。
（４－３）で得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線から、実施例１の（１－２－１）の手順に従って、バックグラウンドのパラメータを決定した。パラメータ決定において、減衰曲線は１成分で解析された。得られたバックグラウンドのパラメータを表１８に示す。
図１における「（３）バックグラウンドの蛍光減衰曲線の解析」について説明する。
（４－３）で得られたバックグラウンドの蛍光減衰曲線から、実施例１の（１－２－１）の手順に従って、バックグラウンドのパラメータを決定した。パラメータ決定において、減衰曲線は１成分で解析された。得られたバックグラウンドのパラメータを表１８に示す。
【0084】
【表18】
【0085】
（４－５）試料の蛍光減衰曲線の解析
本発明に基づき、バックグラウンド蛍光の寿命値と重み因子を前もって求めておいて、試料の減衰曲線の解析に際して両方とも定数として解析した結果を、表１９に示す。
本発明に基づき、バックグラウンド蛍光の寿命値と重み因子を前もって求めておいて、試料の減衰曲線の解析に際して両方とも定数として解析した結果を、表１９に示す。
【0086】
【表19】
【0087】
表１９において、ＡＴＴＯ４２５の蛍光寿命値は３．５１ｎｓ、蛍光強度比は１．３６と、正しい値の３．６ｎｓ、１．３にほぼ相当する結果となった。したがって、本発明による解析方法で、バックグラウンド蛍光が存在する試料においても（バックグラウンド成分と標的蛍光成分との差が小さい試料においても）正しく蛍光寿命値と重み因子を求めることができることが示された。
【0088】
（比較例４）
本発明に依らずに、バックグラウンド蛍光を陽に解析成分に含めて、すなわち試料の蛍光成分とバックグラウンド成分との２成分で解析した結果を表２０に示す。
本発明に依らずに、バックグラウンド蛍光を陽に解析成分に含めて、すなわち試料の蛍光成分とバックグラウンド成分との２成分で解析した結果を表２０に示す。
【0089】
【表20】
【0090】
表２０において、第１成分が目的とするＡＴＴＯ４２５の蛍光であると思われるが、ＡＴＴＯ４２５の正しい寿命値３．６ｎｓと値が違うことや、蛍光強度がバックグラウンドのＡＴＴＯ３９０より１．３倍強いはずが、逆に弱くなっているなど、間違った解析結果が得られた。したがって本試料では、バックグラウンド蛍光を陽に解析成分に含める方法では正しく解析できなかった。
【0091】
（比較例５）
例えば特許第６１３３０５３号には、バックグラウンドの寿命値を先に求めておき、試料の減衰曲線の解析に際して、バックグラウンドの寿命値を定数に、重み因子を変数として解析する方法が示されている。この方法に基づき、前もって測定されたＡＴＴＯ３９０の寿命値５．１４ｎｓを用いて解析した結果を表２１に示す。
例えば特許第６１３３０５３号には、バックグラウンドの寿命値を先に求めておき、試料の減衰曲線の解析に際して、バックグラウンドの寿命値を定数に、重み因子を変数として解析する方法が示されている。この方法に基づき、前もって測定されたＡＴＴＯ３９０の寿命値５．１４ｎｓを用いて解析した結果を表２１に示す。
【0092】
【表21】
【0093】
表２１において、ＡＴＴＯ４２５の蛍光寿命値は３．６７ｎｓとほとんど正しく求められたが、蛍光強度比は１．８３と正しい値の１．３とは異なっており、正しい解析結果が得られなかった。したがって、特許第６１３３０５３号の方法では、蛍光強度は正しく求めることができない。
【0094】
以上の結果から、本発明は従来法と比較して精度よく蛍光寿命値を解析できることが示された。蛍光寿命（及び重み因子）の正確な測定は標的物質の正確な定量につながるため、実施例１～４で得られた蛍光寿命値及び重み因子を用いれば、標的物質を正確に定量することができると考えられる。本実施例は、蛍光試薬に不純物がある場合においても、それを考慮した、より正しい蛍光減衰曲線の解析が可能であることを示すものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
