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特許7633643サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット及びサツマイモ病原ウイルスの検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-12
(45)【発行日】2025-02-20
(54)【発明の名称】サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット及びサツマイモ病原ウイルスの検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20250213BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20250213BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z
C12N15/09 Z ZNA
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020167637
(22)【出願日】2020-10-02
(65)【公開番号】P2021094016
(43)【公開日】2021-06-24
【審査請求日】2023-09-04
(31)【優先権主張番号】P 2019227418
(32)【優先日】2019-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】504224153
【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】竹下 稔
(72)【発明者】
【氏名】小倉 李来
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０３８４９６９１（ＣＮ，Ａ）
【文献】Journal of Virological Methods，2012年，Vol.186，pp.161-166
【文献】Plant Pathology Journal，2014年，Vol.30, No.4，pp.416-424
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（２）～（１０）からなる群より選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット：（２）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（４）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（５）配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（６）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（７）配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（８）配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（９）配列表の配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（１０）配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【請求項2】
請求項１に記載のプライマーセットの１種または複数種を用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスを検出する方法。
【請求項3】
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶの存在を検出する方法。
【請求項4】
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧ及びＳＰＶ２の存在を検出する方法。
【請求項5】
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧの存在を検出する方法。
【請求項6】
配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；又は配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出する方法。
【請求項7】
配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＳＭＶ－１の存在を検出する方法。
【請求項8】
配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び／又は配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７を用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃの存在を検出する方法。
【請求項9】
請求項１に記載のプライマーセットを含むサツマイモ病原ウイルスの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット、及び該プライマーセットを用いたサツマイモ病原ウイルスの検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
自然界には、多種多様な植物ウイルスが存在しており、我が国における主要農作物の１つであるサツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ（Ｌ．Ｌａｍ）にも甚大な被害を引き起こしている。これまでにサツマイモ斑紋モザイクウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＦＭＶ））、サツマイモ潜在ウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＬＶ））、サツマイモシンプトムレスウイルス（Ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ
ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＳＭＶ－１））、サツマイモ葉巻ウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＬＣＶ））、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｇ（ＳＰＶＧ）などが報告されている。さらに、諸外国では、これらの他に、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ＳＰＣＳＶ）など多数の種類が報告されている（非特許文献１）。
ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＳＭＶ－１））、サツマイモ葉巻ウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＬＣＶ））、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｇ（ＳＰＶＧ）などが報告されている。さらに、諸外国では、これらの他に、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ＳＰＣＳＶ）など多数の種類が報告されている（非特許文献１）。
【0003】
上記の他にもサツマイモに感染するウイルス種は、判明しているだけで２０数種にも及ぶ。これらの多数の種類のうち、例えば、帯状粗皮病などの重大な病害を引き起こすサツマイモ斑紋モザイクウイルス（ＳＰＦＭＶ）など、いくつかの種類は強毒ウイルスとして知られている。
【0004】
これまでは、サツマイモに感染する個々のウイルスをそれぞれ検出する方法が提案されているのみである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】ＹＡＭＡＳＡＫＩ，Ｓら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．７５：１０２‐１０８（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、甚大な被害をもたらす強毒ウイルス種は、数種に限られると考えられる。さらに、強毒とされるウイルス種に感染しているサツマイモは、ほぼ他のウイルス種と重複感染している可能性も高い。従って、主要なウイルス数種を検出することができれば、なんらかのウイルス感染株に感染しているサツマイモをほぼ網羅的に検知できる可能性がある。
本発明は、高精度でかつ迅速に、複数のサツマイモ病原ウイルスを同時に検出できる手段を提供することを目的とする。
本発明は、高精度でかつ迅速に、複数のサツマイモ病原ウイルスを同時に検出できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために、サツマイモウイルスの強毒ウイルス種の外被タンパク質遺伝子、複製関連タンパク質遺伝子、及び細胞間移行タンパク質遺伝子領域に着目し、プライマーを複数検討し、その中から、網羅的な検出率と特異性を比較して好適なプライマーセットを選抜し、さらに網羅的検出と特異性を向上させるための改良を行った。さらには、系統によって塊根への影響が異なるＳＰＦＭＶウイルスについて、詳細な系統把握を可能とするプライマーセットの設計を試みた。この結果、強毒ウイルスとして知られる複数種ウイルスを効率的に正しく検出することのできるプライマーセットを確立すること、及び同種系統のウイルスの把握が可能なプライマーセットを確立することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、下記に掲げるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを提供する。
項１．以下の（１）～（１１）からなる群より選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（４）配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（６）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（７）配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（８）配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（９）配列表の配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（１０）配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（１１）配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
項１．以下の（１）～（１１）からなる群より選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（４）配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（６）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（７）配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（８）配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（９）配列表の配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（１０）配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；
（１１）配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【0009】
本発明はまた、
項２．
サツマイモ由来試料の核酸を鋳型とし、項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスを検出する方法；
項３．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧの存在を検出する方法；
項４．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶの存在を検出する方法；
項５．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧ及びＳＰＶ２の存在を検出する方法；
項６．
配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧの存在を検出する方法；
項７．
配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；又は配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出する方法；
項８．
配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＳＭＶ－１の存在を検出する方法；
項９．
配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ‐ＲＣ系統の存在を検出する方法；
項１０．
配列表の配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ‐Ｏ系統の存在を検出する方法；
項１１．
配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット、又は
配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ‐Ｃ系統の存在を検出する方法；
に関する。
項２．
サツマイモ由来試料の核酸を鋳型とし、項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスを検出する方法；
項３．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧの存在を検出する方法；
項４．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶの存在を検出する方法；
項５．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧ及びＳＰＶ２の存在を検出する方法；
項６．
配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧの存在を検出する方法；
項７．
配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；又は配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出する方法；
項８．
配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＳＭＶ－１の存在を検出する方法；
項９．
配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ‐ＲＣ系統の存在を検出する方法；
項１０．
配列表の配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ‐Ｏ系統の存在を検出する方法；
項１１．
配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット、又は
配列表の配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ‐Ｃ系統の存在を検出する方法；
に関する。
【0010】
本発明はまた、項１に記載のプライマーセットを含むサツマイモ病原ウイルス検出用キットに関する。
【発明の効果】
【0011】
本発明のプライマーセットによれば、サツマイモ病原ウイルスの複数種を同時に検知することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実施例のプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図2】実施例のプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図3】実施例のプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図4】実施例のプライマーセットによる４種のサツマイモ病原ウイルスの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図5】実施例のプライマーセットによる４種のサツマイモ病原ウイルスの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図6】実施例のプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルス株ＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図7】実施例のプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルス株ＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図8】実施例のプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルス株ＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃの遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
［サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット］
本発明のプライマーセットは、サツマイモ病原ウイルス遺伝子を効率よく増幅することのできるオリゴヌクレオチドの対から構成されるプライマーセットであって、サツマイモ病原ウイルスの検出を行うことができる。
本発明のプライマーセットは、サツマイモ病原ウイルス遺伝子を効率よく増幅することのできるオリゴヌクレオチドの対から構成されるプライマーセットであって、サツマイモ病原ウイルスの検出を行うことができる。
【0014】
本発明のサツマイモ病原ウイルスの検出用プライマーセットを構成するそれぞれのプライマーは、オリゴヌクレオチドであり、ウイルスの外被タンパク質遺伝子、複製関連タンパク質遺伝子、及び細胞間移行タンパク質遺伝子領域に、フォワードプライマーとリバースプライマーとして設計された２０～２５塩基の連続したヌクレオチオドである。
【0015】
プライマーの設計にあたり、サツマイモに感染するウイルス遺伝子配列情報をＮＣＢＩサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）にて、ウイルス種別に入手した。塩基配列情報は、刊行物から得ることもできる。本発明者らは、最も登録データ数が多い外被タンパク質（ＣＰ）遺伝子、複製関連タンパク質遺伝子、及び細胞間移行タンパク質遺伝子領域を利用した。その後、ウイルス種別に両遺伝子領域の核酸配列の比較表を作成した。この時、農産物輸出入の現状を踏まえ、日本を中心とした中国、韓国などの近隣アジア諸国でのウイルス分離株に加えて、北南米、アフリカ諸国由来のウイルス分離株も比較対象とした。塩基配列のアラインメントには、アラインメントソフト（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４）を利用することができる。
【0016】
特定した塩基配列に基づき、プライマーを設計する。プライマーの設計にあたっては、従来の縮重プライマーで、同種内の複数系統間の塩基置換に十分な対応ができなかった点を踏まえ、従来の欠点を除くように、オリゴヌクレオチド間の相補性を考慮した。
【0017】
具体的には、特に、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＬＣＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＶ２及びＳＰＳＭＶ－１に着目して、塩基置換対応型の縮重プライマーを作成する点に留意した。
【0018】
このような着目点に基づき、本発明のサツマイモ病原ウイルスの検出用プライマーセットとして次のプライマーセットを作成することができた。
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶとＳＰＶＧの一括検出用）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ－３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＴＧＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＡＴＷＣＣＹＡＡＧＡＧ－３’（配列表の配列番号２）
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶとＳＰＶＧの一括検出用）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ－３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＴＧＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＡＴＷＣＣＹＡＡＧＡＧ－３’（配列表の配列番号２）
【0019】
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶの識別用）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ－３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＴＡＣＡＧＴＧＣＡＲＡＧＫＷＴＳＷＣＣＴＡＹＴＧＣ－３’（配列表の配列番号３）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ－３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＴＡＣＡＧＴＧＣＡＲＡＧＫＷＴＳＷＣＣＴＡＹＴＧＣ－３’（配列表の配列番号３）
【0020】
（プライマーセット：ＳＰＶＧとＳＰＶ２の一括検出用）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ －３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＣＡＴＡＴＧＹＧＣＹＴＣＹＣＴＲＧＣＢＣＧＡＡＣ－３’ （配列表の配列番号４）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ －３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＣＡＴＡＴＧＹＧＣＹＴＣＹＣＴＲＧＣＢＣＧＡＡＣ－３’ （配列表の配列番号４）
【0021】
（プライマーセット：ＳＰＬＣＶ検出用）
フォワード：５’－ＣＴＡＣＡＣＴＫＧＧＡＡＴＧＣＹＧＴＣＣＣＡＡＴＴＧ－３’（配列表の配列番号５）
リバース：５’－ＡＧＴＣＣＴＧＫＡＹＣＴＴＡＣＡＧＧＧＡＣＣＶＡＣＲＣ－３’（配列表の配列番号６）
フォワード：５’－ＣＴＡＣＡＣＴＫＧＧＡＡＴＧＣＹＧＴＣＣＣＡＡＴＴＧ－３’（配列表の配列番号５）
リバース：５’－ＡＧＴＣＣＴＧＫＡＹＣＴＴＡＣＡＧＧＧＡＣＣＶＡＣＲＣ－３’（配列表の配列番号６）
【0022】
（プライマーセット：ＳＰＬＣＶ検出用）
フォワード：５’－ＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＲＧＡＡＧＡＹＷＧＴＧ－３’（配列表の配列番号７）
リバース：５’－ＡＹＡＧＹＡＡＹＡＧＴＧＣＹＴＧＧＴＡＹＡＡＣＧＴＣ－３’（配列表の配列番号８）
フォワード：５’－ＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＲＧＡＡＧＡＹＷＧＴＧ－３’（配列表の配列番号７）
リバース：５’－ＡＹＡＧＹＡＡＹＡＧＴＧＣＹＴＧＧＴＡＹＡＡＣＧＴＣ－３’（配列表の配列番号８）
【0023】
（プライマーセット：ＳＰＶＧの識別用）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ －３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＴＣＹＣＴＲＧＣＳＣＧＡＡＣＷＧＧＡＧＴＧＴＴＣ－３’ （配列表の配列番号９）
フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ －３’（配列表の配列番号１）
リバース：５’－ＴＣＹＣＴＲＧＣＳＣＧＡＡＣＷＧＧＡＧＴＧＴＴＣ－３’ （配列表の配列番号９）
【0024】
（プライマーセット：ＳＰＳＭＶ－１の識別用）
フォワード：５’－ＡＣＧＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴＴＣＧＧＷＣＡＧＡＣ－３’（配列表の配列番号１０）
リバース：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＭＧＧＴＴＴＡＣ－３’（配列表の配列番号１１）
フォワード：５’－ＡＣＧＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴＴＣＧＧＷＣＡＧＡＣ－３’（配列表の配列番号１０）
リバース：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＭＧＧＴＴＴＡＣ－３’（配列表の配列番号１１）
【0025】
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶ－ＲＣ検出用）
フォワード：５’－ＡＡＧＡＴＧＣＡＹＹＡＡＹＴＧＧＴＡＲＣＡＴＣＣ－３’（配列表の配列番号１２）
リバース：５’－ＣＴＧＴＡＫＡＧＹＣＣＣＣＡＹＣＴＣＣＡＴＴＴＹＡＣ－３’（配列表の配列番号１３）
フォワード：５’－ＡＡＧＡＴＧＣＡＹＹＡＡＹＴＧＧＴＡＲＣＡＴＣＣ－３’（配列表の配列番号１２）
リバース：５’－ＣＴＧＴＡＫＡＧＹＣＣＣＣＡＹＣＴＣＣＡＴＴＴＹＡＣ－３’（配列表の配列番号１３）
【0026】
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶ－Ｏ検出用）
フォワード：５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＲＡＧＧＧＡＲＴＡＹＴＴＣＡＲＲＣＣＴＣ－３’（配列表の配列番号１４）
リバース：５’－ＧＲＴＧＲＹＹＴＴＣＴＡＹＡＴＣＲＴＧＤＴＣＡＣＴＣ－３’（配列表の配列番号１５）
フォワード：５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＲＡＧＧＧＡＲＴＡＹＴＴＣＡＲＲＣＣＴＣ－３’（配列表の配列番号１４）
リバース：５’－ＧＲＴＧＲＹＹＴＴＣＴＡＹＡＴＣＲＴＧＤＴＣＡＣＴＣ－３’（配列表の配列番号１５）
【0027】
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶ－Ｃ検出用）
フォワード：５’－ＧＣＡＣＣＡＡＡＲＣＹＲＡＡＡＧＧＧＳＣＡＴＷＴＲＣ－３’（配列表の配列番号１６）
リバース：５’－ＣＡＣＹＣＴＴＴＧＴＧＫＴＧＡＡＡＹＡＧＡＲＣＧＣＡ－３’（配列表の配列番号１７）
フォワード：５’－ＧＣＡＣＣＡＡＡＲＣＹＲＡＡＡＧＧＧＳＣＡＴＷＴＲＣ－３’（配列表の配列番号１６）
リバース：５’－ＣＡＣＹＣＴＴＴＧＴＧＫＴＧＡＡＡＹＡＧＡＲＣＧＣＡ－３’（配列表の配列番号１７）
【0028】
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶ－Ｃ検出用）
フォワード：５’－ＧＣＡＣＣＡＡＡＲＣＹＲＡＡＡＧＧＧＳＣＡＴＷＴＲＣ－３’（配列表の配列番号１６）
リバース：５’－ＹＡＧＡＲＣＧＣＡＴＡＧＲＴＴＴＣＴＣＡＣＹＴＧ－３’（配列表の配列番号１８）
フォワード：５’－ＧＣＡＣＣＡＡＡＲＣＹＲＡＡＡＧＧＧＳＣＡＴＷＴＲＣ－３’（配列表の配列番号１６）
リバース：５’－ＹＡＧＡＲＣＧＣＡＴＡＧＲＴＴＴＣＴＣＡＣＹＴＧ－３’（配列表の配列番号１８）
【0029】
ここで、配列表の配列番号１～１８に示される塩基配列中、ＢはＣ、Ｇ、又はＴのいずれかを示し；Ｄは、Ａ、Ｇ又はＴのいずれかを示し；Ｋは、Ｇ又はＴのいずれかを示し；Ｍは、Ａ又はＣのいずれかを示し；Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを示し；Ｖは、Ａ、Ｃ、又はＧのいずれかを示し；Ｗは、Ａ又はＴのいずれかを示し；Ｙは、Ｃ又はＴのいずれかを示し；Ｓは、Ｃ又はＧのいずれかを示す。（配列表ではすべて小文字で示される。）
【0030】
配列表の配列番号１～１８に示す配列のＧＣ含量、Ｔｍ値はそれぞれ、以下の通りである。
配列番号１：ＧＣ含量 ４２％、 Ｔｍ値 ５７
配列番号２：ＧＣ含量 ５７％、 Ｔｍ値 ６２
配列番号３：ＧＣ含量 ４４％、 Ｔｍ値 ５９
配列番号４：ＧＣ含量 ５８％、 Ｔｍ値 ６３
配列番号５：ＧＣ含量 ４６％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号６：ＧＣ含量 ５６％、 Ｔｍ値 ６５
配列番号７：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６２
配列番号８：ＧＣ含量 ４６％、 Ｔｍ値 ６１
配列番号９：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号１０：ＧＣ含量 ５７％、 Ｔｍ値 ６１
配列番号１１：ＧＣ含量 ５４％、 Ｔｍ値 ６１
配列番号１２：ＧＣ含量 ４６％、 Ｔｍ値 ５９
配列番号１３：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号１４：ＧＣ含量 ４３％、 Ｔｍ値 ５９
配列番号１５：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号１６：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６２
配列番号１７：ＧＣ含量 ５４％、 Ｔｍ値 ６５
配列番号１８：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ５９。
配列番号１：ＧＣ含量 ４２％、 Ｔｍ値 ５７
配列番号２：ＧＣ含量 ５７％、 Ｔｍ値 ６２
配列番号３：ＧＣ含量 ４４％、 Ｔｍ値 ５９
配列番号４：ＧＣ含量 ５８％、 Ｔｍ値 ６３
配列番号５：ＧＣ含量 ４６％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号６：ＧＣ含量 ５６％、 Ｔｍ値 ６５
配列番号７：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６２
配列番号８：ＧＣ含量 ４６％、 Ｔｍ値 ６１
配列番号９：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号１０：ＧＣ含量 ５７％、 Ｔｍ値 ６１
配列番号１１：ＧＣ含量 ５４％、 Ｔｍ値 ６１
配列番号１２：ＧＣ含量 ４６％、 Ｔｍ値 ５９
配列番号１３：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号１４：ＧＣ含量 ４３％、 Ｔｍ値 ５９
配列番号１５：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６０
配列番号１６：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ６２
配列番号１７：ＧＣ含量 ５４％、 Ｔｍ値 ６５
配列番号１８：ＧＣ含量 ５０％、 Ｔｍ値 ５９。
【0031】
上記プライマーセット１１種は、それぞれで使用することで、所望のサツマイモ病原ウイルスを検出することができる。さらには、２種以上を混合して、マルチプレックスＰＣＲ法に利用することで、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＶ２、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１という５種の病原ウイルスを、複数の組み合わせで同時かつ特異的に検出することも可能となる。さらには、ＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、ＳＰＦＭＶ－ＣのＳＰＦＭＶの中の系統を区別して検出し、異なる塊根への影響を詳細に調べることが可能となる。特に、深刻な影響を与える可能性のあるＳＰＦＭＶ－ＲＣ系統を区別できる意義は大きい。
【0032】
具体的には、上記プライマーセットを構成する各フォワードプライマー及びリバースプライマーは、その塩基配列のＢ、Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｓの位置にそれぞれ指定された２種または３種の塩基を同時に含んでいる縮重プライマーであり、縮重プライマー中の各プライマーの割合はいかなる割合でもよいが、等当量ずつであることが好ましい。
【0033】
上記プライマーセットの各プライマーは、当業者に公知のオリゴヌクレオチドの合成法で作成することができる。例えば、ＤＮＡ自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｍｏｄｅｌ ３９４など）を利用して合成することも可能である。
【0034】
本発明のプライマーセットを用いて試料中のサツマイモ病原ウイルスを検出する方法は、サツマイモ試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応により合成したｃＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーセットのいずれか又は２種以上又はそれらのすべてを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、遺伝子を増幅させる工程と、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析する工程を含む。
【0035】
サツマイモ試料としては、葉、茎、塊根、などのサツマイモの植物体のいずれの部位から調製しても良い。サツマイモ試料が、葉の場合、例えば、コルクポーラーでくり抜き、１個体から数１０ｍｇ（例えば５０ｍｇ程度）をサンプリングすることができる。この時、サンプリング部位は、葉脈間の葉肉部分で、斑点や葉巻などの症状を呈する部分がある場合には、そのような部位を選ぶことが好ましい。サツマイモ試料が、塊根の場合、カッターの刃などを使用し、表皮のみを数１０ｍｇ（例えば５０ｍｇ程度）切取って調製することができる。
【0036】
本発明のプライマーセットを用いたサツマイモ病原性ウイルスの検出は、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方をターゲットとすることもできる。そのため核酸抽出は、ＤＮＡ及びＲＮＡを同時に抽出しても良く、このような場合には、標準プロトコールを改変することで、ＤＮＡ及びＲＮＡの同時抽出を行う。
【0037】
サツマイモ試料の調製後、核酸を抽出する。核酸の抽出は、当業者に公知の方法で行うことができる他、植物組織からＲＮＡを抽出・精製するための市販のキットを使用することもできる。試料からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法を採用することもできる。核酸の抽出には、限定はされないが、例えばＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）のようなキットを使用することもできる。あるいは、まず、イソチオシアネート、フェノール及びクロロホルムを用いたＲＮＡ抽出法又は、市販のＲＮＡ抽出試薬（例えば、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、１５５９６－０１８））を用いて、抽出し、その後、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する。ここで、プライマーとしては市販のランダムプライマーを用い、ｄＮＴＰｓの存在下で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素としては、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、等を用いることができる。
【0038】
次に、合成したｃＤＮＡを鋳型として、本発明のプライマーセットの１種又は２種以上を用いて、ＰＣＲ増幅反応を行う。ＰＣＲ増幅は本発明のプライマーセット又はそれらの組み合わせのいずれか又はすべてを用いることができる。それ以外の点については、常法に従って行うことができる。ＰＣＲは、ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）である。ＰＣＲでは、具体的には、鋳型ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリング、及び耐熱性酵素を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、各外被タンパク質遺伝子領域の塩基配列を含む断片を増幅させる。ＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ反応条件は、当業者に公知の物を適切に選択及び設定することができる。プライマーのＴｍに基づいて最適なＰＣＲ反応条件を選択する方法は、知られている。
【0039】
ＰＣＲ法の核酸増幅工程で使用されるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ等のα型ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ等のＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。特に限定はされないが、市販の、ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ（東洋紡製）、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いることもできる。
【0040】
ＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その操作説明書に従って行うこともできる。例えば、ＰＣＲの反応液はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、＃Ａ２５７４２）を用い、ＰＣＲ装置は７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いることもできる。
【0041】
ＰＣＲ反応は、鋳型の熱変性、プライマーのアニーリング、及び伸長反応を１サイクルとして、複数サイクル行うことで実施できる。通常の当業者に公知の条件のいずれを使用することもでき、限定はされないが、例えば、最初に９０℃～９６℃で２０秒～１分の熱変性、次いで、５０℃～５８℃程度の温度範囲で２０秒～１分程度のアニーリング、７０℃～７３℃で２０秒～１分程度の伸長反応を１サイクルとして、３０～４０サイクル程度を行うことが好ましい。特に、アニーリングの温度は、５４℃～５８℃程度がより好ましく、５５℃～５６℃程度がさらに好ましい。アニーリング温度を相対的に高く設定することで、非特異的増幅のリスクをより低くすることができる。
【0042】
また、ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、特に限定されず、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ＲＦＬＰ法、インターカレーターを用いて増幅産物を検出する方法、増幅された産物の塩基配列に特異的に結合する核酸プローブを用いて増幅産物を検出する方法が挙げられる。より好ましくは核酸プローブを用いて増幅産物を検出する方法であり、当該核酸プローブとして、例えばＴａｑＭｑｎプローブや消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ；ＱＰｒｏｂｅ）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎが挙げられる。増幅及び検出におけるその他の条件は公知の核酸増幅及び核酸検出技術を考慮して適宜選択することができる。
【0043】
［サツマイモ病原ウイルスを検出する方法］
本発明はまた、本発明のプライマーセットの１種または複数種を用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスを検出する方法に関する。
本発明はまた、本発明のプライマーセットの１種または複数種を用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原ウイルスを検出する方法に関する。
【0044】
本発明においては、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧを特異的に検出することができる。
【0045】
本発明においては、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶを特異的に識別することができる。
【0046】
本発明においては、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧ及びＳＰＶ２を特異的に識別することができる。
【0047】
本発明においては、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＶＧを特異的に識別することができる。
【0048】
本発明においては、配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出することができる。同様に、本発明においては、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出することができる。
【0049】
本発明においては、配列番号１、３、４、７、及び８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーとして用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＶ２及びＳＰＬＣＶの存在を一括かつ同時あるいは区別して検出することができる。
【0050】
本発明のこれらのプライマーセットは、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲに使用することも可能である。既報のプライマーではＳＰＦＭＶ－Ｓ、Ｏ、Ｂｕｎｇｏ、ＳＰＶＧの共通配列を採用しているため、同時に増幅・検出されるＳＰＦＭＶ－Ｓ、Ｏ、Ｂｕｎｇｏ、ＳＰＶＧの遺伝子断片を特異的な制限酵素認識部位で切断してウイルスの識別を行う必要があった。しかしながら、本発明のプライマーセットを用いて、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ（リバーストランスクリプターゼＰＣＲ）を行うことで、ウイルスを直接識別することもでき、省力かつ迅速に検定することも可能となる。
【0051】
本発明においては、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＳＭＶ－１の存在を検出することができる。
【0052】
本発明においては、配列番号１、３、７、８、９、１０及び１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーとして用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１の４種類のウイルスの存在を一括かつ区別して検出することができる。
【0053】
一方、本発明においては、配列番号１２～１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーとして用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶの系統をＳＰＦＭＶ－ＲＣ株、ＳＰＦＭＶ－Ｏ株、ＳＰＦＭＶ－Ｃ株として、区別して検出することもできる。
【0054】
ＳＰＦＭＶとＳＰＶＧとを同時に検出する場合には、配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドのセットのプライマーがモル濃度の比率で１：１又はそれに近い値で存在することが好ましい。ＳＰＦＭＶを検出する為には、配列番号１及び３のセットのオリゴヌクレオチドのプライマーがモル濃度の比率で１：１又はそれに近い値で存在することが好ましい。ＳＰＶＧとＳＰＶ２を同時に識別する為には、配列番号１及び４のセットのオリゴヌクレオチドのプライマーがモル濃度の比率で１：１又はそれに近い値で存在することが好ましい。ＳＰＬＣＶの検出の為には、配列番号５及び６に示すオリゴヌクレオチドの全種類のプライマーがモル濃度の比率で１：１又はそれに近い値で存在することが好ましい。あるいはＳＰＬＣＶの検出の為には配列番号７及び８に示すオリゴヌクレオチドのプライマーがモル濃度の比率で１：１又はそれに近い値で存在することが好ましい。
【0055】
一方、マルチプレックスＰＣＲ法に利用する場合には、上記セットの２種以上、好ましくは、配列番号１、３、４、７、及び８のオリゴヌクレオチドの全種類のプライマーを含む。この時、例えば、配列番号３、４、７、及び８のオリゴヌクレオチドをモル濃度の比率で、等量ずつ、及び配列番号１のオリゴヌクレオチドをその１～３倍量、好ましくは２倍量程度存在させることも好ましい。あるいは適宜すべてのオリゴヌクレオチドについて、そのモル濃度の比率をお互いに１：１～３の範囲に収めて使用することができる。
【0056】
さらに、マルチプレックスＰＣＲ法に利用する場合には、好ましくは、配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１のオリゴヌクレオチドの全種類のプライマーを含む。この時、例えば、配列番号３、７、８、９、１０及び１１のオリゴヌクレオチドをモル濃度の比率で、等量ずつ、及び配列番号１のオリゴヌクレオチドをその２倍量又は３倍量存在させることも好ましい。あるいは、限定はされないが、ＰＣＲの効率化の為に、モル濃度の比率で、例えば、配列番号１のオリゴヌクレオチドを１として、配列番号３のオリゴヌクレオチドを好ましくは、０．１～１、より好ましくは０．３～０．８、さらに好ましくは、０．５～０．７程度；配列番号９のオリゴヌクレオチドを好ましくは０．１～１、より好ましくは、０．１～０．３、さらに好ましくは、０．２程度；配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドを、好ましくは０．１～１、より好ましくは、０．２～０．６、さらに好ましくは０．５程度；配列番号１０及び１１のオリゴヌクレオチドを、好ましくは０．１～１、より好ましくは０．２～０．４、さらに好ましくは、０．３程度とすることができる。このようにして、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１を同時かつ区別して検出することも可能である。
【0057】
あるいは、配列番号１２及び配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７、並びに配列番号１６及び配列番号１８の各プライマーを対で、あるいは全種類のプライマーを含み、マルチプレックスＰＣＲ法に供することもできる。マルチプレックスＰＣＲでは、限定はされないが、ＰＣＲの効率化の為に、モル濃度の比率で、例えば、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを１として、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを１として、配列番号１３のオリゴヌクレオチドを好ましくは、０．５～１．５、より好ましくは１程度；配列番号１４及び１５のオリゴヌクレオチドをそれぞれ、０．５～１．５、より好ましくは、１程度；配列番号１６及び１８のオリゴヌクレオチドを、好ましくは０．１～１、より好ましくは、０．２～０．６、さらに好ましくは０．３程度程度とすることができる。このようにして、ＳＰＦＭＶ－ＲＣ株、ＳＰＦＭＶ－Ｏ株、ＳＰＦＭＶ－Ｃ株として、ＳＰＦＭＶの中の系統を区別して検出することも可能である。
【0058】
限定はされないが、本発明において、これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、好ましくは、０．１μＭ～５０μＭ、より好ましくは、１μＭ～１５μＭの範囲で用いられ得る。
【0059】
［キット］
本発明のプライマーセットは、キット化することができる。本発明のキットは、［サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット］の項で述べたプライマーセットのうち、少なくとも１つ又は２つ以上を含み、検出すべき対象ウイルスによって、適宜変更することができる。さらに、任意に、核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類を一緒に含ませることもできる。具体的には、本発明のプライマー、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、鋳型依存性核酸合成酵素、緩衝液や塩類、又は指示書をキット化して提供することもできる。このようなキットは、例えば、サツマイモの苗がウイルスに感染しているか否かを検定するのに好都合に使用することができる。
本発明のプライマーセットは、キット化することができる。本発明のキットは、［サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット］の項で述べたプライマーセットのうち、少なくとも１つ又は２つ以上を含み、検出すべき対象ウイルスによって、適宜変更することができる。さらに、任意に、核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類を一緒に含ませることもできる。具体的には、本発明のプライマー、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、鋳型依存性核酸合成酵素、緩衝液や塩類、又は指示書をキット化して提供することもできる。このようなキットは、例えば、サツマイモの苗がウイルスに感染しているか否かを検定するのに好都合に使用することができる。
【実施例】
【0060】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、実施例において、各配列番号でしめされるすべての縮重プライマーにおいて、同一配列番号内での各プライマーの割合は、等当量ずつであった。
【0061】
（実施例１）プライマーセットの設計
ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、外被タンパク質遺伝子及び複製関連タンパク質遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる株を同時に検出することに利用できると考えた。特に、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶのウイルスに着目し、外被タンパク質遺伝子領域の一部及び複製関連タンパク質遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、外被タンパク質遺伝子及び複製関連タンパク質遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる株を同時に検出することに利用できると考えた。特に、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶのウイルスに着目し、外被タンパク質遺伝子領域の一部及び複製関連タンパク質遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
【0062】
これまでに既知のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－Ｓ株、ＳＰＦＭＶ－Ｏ株、ＳＰＦＭＶ－Ｂｕｎｇｏ株について、上記で設計した複数の候補プライマーを用いてウイルスの存在を検出し、プライマーを一次選抜した。さらに、標的とする３種ウイルスへの混合感染株を用いてさらにプライマーを改良した。
【0063】
上記サツマイモ病原ウイルス株は、日本ＳＰＦＭＶ－Ｓ株、日本ＳＰＦＭＶ－Ｏ株、日本ＳＰＦＭＶ－Ｂｕｎｇｏ株で構成されていた。
【0064】
サツマイモ試料としては、葉と塊根を用いた。サツマイモ試料が、葉の場合、コルクポーラーでくり抜き、１個体から５０ｍｇをサンプリングした。サンプリング部位は、葉脈間の葉肉部分で、斑点や葉巻などの症状を呈する部分とした。サツマイモ試料が、塊根の場合、カッターの刃を使用し、表皮のみを５０ｍｇ切取って調製した。
【0065】
ウイルス株からの核酸抽出、ＲＴ－ＰＣＲ増幅の手法及び条件は、以下の手順で行った。
【0066】
ウイルス株からの核酸抽出は、ＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いた。ここで、プライマーセットはＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方をターゲットとして、両核酸を抽出することとした。そこで、標準プロトコールのＰＴ Ｗａｓｈ １ ＢｕｆｆｅｒとＤＮａｓｅ Ｉ 溶液による処理を省くことで、両核酸の同時抽出を行った。サンプルの破砕には、Ｍｉｃｒｏ ＳｍａｓｈＴＭ ＭＳ－１００Ｒ（トミー精工）を用い、４２００ｒｐｍで１６０秒、ステンレスビーズφ４．８を１サンプルにつき１個用いた条件下で実施した。
【0067】
逆転写反応及びＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（Ｄｙｅ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）を用いて行った。ＰＣＲ反応液組成及び条件は下記のとおりである。反応後、ＰＣＲ増幅産物３μｌを２．０％アガロースゲル電気泳動にて解析した。
【0068】
（ＰＣＲ反応液組成：１反応つき１０μｌ）
核酸 １μｌ
各プライマー １．０μｌ （各５ｐｍｏｌ）
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２μｌ
２×１ ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｙｅ Ｐｌｕｓ） ２５μｌ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ５０μｌ
核酸 １μｌ
各プライマー １．０μｌ （各５ｐｍｏｌ）
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２μｌ
２×１ ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｙｅ Ｐｌｕｓ） ２５μｌ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ５０μｌ
【0069】
（ＲＴ－ＰＣＲ条件）
ｃＤＮＡ合成は、５０℃で３０分、９４℃で２分間インキュベートし、続くＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
ｃＤＮＡ合成は、５０℃で３０分、９４℃で２分間インキュベートし、続くＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
【0070】
ＰＣＲ解析結果から、下記表１に示す配列（各欄の上の配列はフォワードプライマー、下の配列はリバースプライマー）を有するプライマーセットを最終的に決定し、それらのプライマーセットから構成されるプライマーセットを設定した。
【0071】
【表1】
【0072】
（実施例２）プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例１で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、前記のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
実施例１で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、前記のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0073】
プライマーは、以下の表２に示す量（ｐｍｏｌ／μＬ）を反応液１０μＬあたり０．２μＬ使用した。
【0074】
【表2】
【0075】
使用したウイルス罹病株は以下の通りである。
【0076】
【表3】
【0077】
ＭＣ２：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
ＭＣ４：ＳＰＬＣＶ罹病株
１－３６：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
ＭＣ４：ＳＰＬＣＶ罹病株
１－３６：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
【0078】
鋳型核酸濃度
ＭＣ２：３６６．８（ｎｇ／μｌ）
ＭＣ４：１７７．９（ｎｇ／μｌ）
１－３６：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
ＭＣ２：３６６．８（ｎｇ／μｌ）
ＭＣ４：１７７．９（ｎｇ／μｌ）
１－３６：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
【0079】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
【0080】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図１に示す。いずれも検証できるレベルではあるが、特に、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、及び配列番号８のプライマーを同時に使用する条件下で、３種のウイルスとも明確に判定することができ、良好な結果を示した。
【0081】
（実施例３）プライマーセットによる、サツマイモ病原性ウイルスの再検出
実施例２の結果をもとに、再度プライマー濃度の調整を行い、前記のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
実施例２の結果をもとに、再度プライマー濃度の調整を行い、前記のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0082】
プライマーは、以下の表４に示す量（ｐｍｏｌ／μＬ）を反応液１０μＬあたり０．２μＬ使用した。
【0083】
【表4】
【0084】
使用したウイルス罹病株は以下の通りである。
【0085】
【表5】
【0086】
ＭＣ２：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
１－３６：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
鋳型核酸濃度（未希釈時）
ＭＣ２：３６６．８（ｎｇ／μｌ）
１－３６：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
イモ１－３：１５５．０（ｎｇ／μｌ）
イモ４－３：１２６．２（ｎｇ／μｌ）
イモ１１：１２１．２（ｎｇ／μｌ）
イモ１２：８６．０（ｎｇ／μｌ）
イモ１５：５０．３（ｎｇ／μｌ）
イモ１６：２６．１（ｎｇ／μｌ）
イモ１７：５９．３（ｎｇ／μｌ）
イモ１８：６９．９（ｎｇ／μｌ）
イモ１９：９６．１（ｎｇ／μｌ）
１－３６：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
鋳型核酸濃度（未希釈時）
ＭＣ２：３６６．８（ｎｇ／μｌ）
１－３６：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
イモ１－３：１５５．０（ｎｇ／μｌ）
イモ４－３：１２６．２（ｎｇ／μｌ）
イモ１１：１２１．２（ｎｇ／μｌ）
イモ１２：８６．０（ｎｇ／μｌ）
イモ１５：５０．３（ｎｇ／μｌ）
イモ１６：２６．１（ｎｇ／μｌ）
イモ１７：５９．３（ｎｇ／μｌ）
イモ１８：６９．９（ｎｇ／μｌ）
イモ１９：９６．１（ｎｇ／μｌ）
【0087】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計４０サイクルを行った。
【0088】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図２に示す。いずれも検証できるレベルではあるが、特に、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、及び配列番号８のプライマーを同時に使用する条件下で、３種のウイルスとも明確に判定することができ、良好な結果を示した。ウイルス感染が疑われる塊根サンプルについては、イモ１－３、４－３、１１、１２、１５、１７、１８、１９は、ＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧに重複感染し、イモ１６はＳＰＦＭＶに感染していることが示された。
【0089】
（実施例４）プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出感度
実施例３で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出感度を、前記のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株を用い、鋳型核酸濃度の段階希釈を行って調べた。ウイルス核酸の抽出は実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
実施例３で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出感度を、前記のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株を用い、鋳型核酸濃度の段階希釈を行って調べた。ウイルス核酸の抽出は実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0090】
プライマーは、以下の表６に示す量（ｐｍｏｌ／μＬ）を反応液１０μＬあたり０．２μＬ使用した。
【0091】
【表6】
【0092】
使用したウイルス罹病株は以下の通りである。
【0093】
１－３６：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ罹病株
鋳型核酸濃度
１００：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
１０－１：４０．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－２：４．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－３：４０３．５（ｐｇ／μｌ）
１０－４：４０．３５（ｐｇ／μｌ）
鋳型核酸濃度
１００：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
１０－１：４０．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－２：４．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－３：４０３．５（ｐｇ／μｌ）
１０－４：４０．３５（ｐｇ／μｌ）
【0094】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計４０サイクルを行った。
【0095】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図３に示す。配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、及び配列番号８のプライマーを同時に使用する条件下で、３種のウイルスとも明確に判定することができ、配列番号１と配列番号３のプライマーセット、配列番号１と配列番号４のプライマーセット、配列番号７と配列番号８のプライマーセットを別々に使用して行ったＰＣＲと同様の良好な結果を示した。
【0096】
（参考例１）プライマーセットと国内外既報プライマーとの性質比較
ＮＣＢＩサイトにて、３種ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を世界各地の分離株を対象として収集した。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、プライマー配列を含めたマルチプルアライメントを作成した。この比較によると、本発明のプライマーセットで１００％の相同性を有するウイルス分離株のうち、国内既報プライマー及び中国、韓国既報プライマーでプライマーとウイルスゲノム上の塩基の異なる部分が散見された。
ＮＣＢＩサイトにて、３種ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を世界各地の分離株を対象として収集した。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、プライマー配列を含めたマルチプルアライメントを作成した。この比較によると、本発明のプライマーセットで１００％の相同性を有するウイルス分離株のうち、国内既報プライマー及び中国、韓国既報プライマーでプライマーとウイルスゲノム上の塩基の異なる部分が散見された。
【0097】
本発明のプライマーセットとの比較に用いた既報プライマーは表７に示す。
【0098】
【表7】
【0099】
ＳＰＦＭＶ検出を目的としたプライマーの比較結果を表８に示す。表内の＋は１００％相同性を有することを示し、表内の数字はプライマー配列とウイルスゲノム上の異なる塩基数を示す。また、表内のＮＤについては、プライマー認識部位のウイルスゲノム情報がデータベース上に登録されていないことを示す。
【0100】
【表8】
【0101】
ＳＰＦＭＶ検出を目的としたプライマーの性質比較結果を表９に示す。
【0102】
【表9】
【0103】
ＳＰＶＧ検出を目的としたプライマーの比較結果を表１０に示す。表内の＋は１００％相同性を有することを示し、表内の数字はプライマー配列とウイルスゲノム上の異なる塩基数を示す。また、表内のＮＤについては、プライマー認識部位のウイルスゲノム情報がデータベース上に登録されていないことを示す。
【0104】
【表10】
【0105】
ＳＰＶＧ検出を目的としたプライマーの性質比較結果を表１１に示す。
【0106】
【表11】
【0107】
ＳＰＬＣＶ検出を目的としたプライマーの比較結果を表１２及び表１３に示す。表内の＋は１００％相同性を有することを示し、表内の数字はプライマー配列とウイルスゲノム上の異なる塩基数を示す。また、表内のＮＤについては、プライマー認識部位のウイルスゲノム情報がデータベース上に登録されていないことを示す。
【0108】
【表12】
【表13】
【0109】
ＳＰＬＣＶ検出を目的としたプライマーの性質比較結果を表１４に示す。
【0110】
【表14】
【0111】
表８～表１４に示す通り、配列表の配列番号１～８に示すプライマーセットを用いることで、非特異的増幅が見られず、目的のウイルスを特異的に検出できることがわかった。
【0112】
（実施例５）プライマーセットの設計
ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、外被タンパク質遺伝子及び細胞間移行タンパク質遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる株を同時に検出することに利用できると考えた。特に、ＳＰＶＧ、及びＳＰＳＭＶ－１のウイルスに着目し、外被タンパク質遺伝子領域の一部及び細胞間移行タンパク質遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、外被タンパク質遺伝子及び細胞間移行タンパク質遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる株を同時に検出することに利用できると考えた。特に、ＳＰＶＧ、及びＳＰＳＭＶ－１のウイルスに着目し、外被タンパク質遺伝子領域の一部及び細胞間移行タンパク質遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
【0113】
実施例１と同様のＰＣＲ解析結果から、下記表１５に示す配列（各欄の上の配列はフォワードプライマー、下の配列はリバースプライマー）を有するプライマーセットを最終的に決定し、それらのプライマーセットから構成されるプライマーセットを設定した。
【0114】
【表15】
【0115】
（実施例６）プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出及び感度比較
実施例１及び実施例５で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
実施例１及び実施例５で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0116】
プライマーは、配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーを、以下に示す量（μＭ）、別々に、あるいは一緒に反応液１０μＬあたり使用した。
配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーをそれぞれ、配列番号１：１０μＭ、配列番号３：５μＭ、配列番号９：２μＭ、配列番号７、８：５μＭ、配列番号１０、１１：３μＭとした。
図４におけるウイルス罹病株は、以下の鋳型濃度であり、使用プライマーの種類に対応するものであった。
鋳型核酸濃度
１００：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
１０－１：４０．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－２：４．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－３：４０３．５（ｐｇ／μｌ）
１０－４：４０．３５（ｐｇ／μｌ）
配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーをそれぞれ、配列番号１：１０μＭ、配列番号３：５μＭ、配列番号９：２μＭ、配列番号７、８：５μＭ、配列番号１０、１１：３μＭとした。
図４におけるウイルス罹病株は、以下の鋳型濃度であり、使用プライマーの種類に対応するものであった。
鋳型核酸濃度
１００：４０３．５（ｎｇ／μｌ）
１０－１：４０．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－２：４．３５（ｎｇ／μｌ）
１０－３：４０３．５（ｐｇ／μｌ）
１０－４：４０．３５（ｐｇ／μｌ）
【0117】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５２～５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計４０サイクルを行った。
【0118】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図４に示す。図４（ａ）はプライマーセットを別々に用いた場合の検出限界を示し、左は、図４（ｂ）は、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ条件下での検出感度を示す。いずれも検証できるレベルではあり、マルチプレックスＰＣＲの条件下でも、高感度で検出が可能であることが実証された。
【0119】
（実施例７）
プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例１及び実施例５で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例１及び実施例５で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＳＭＶ－１罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0120】
プライマーは、配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーを、以下に示す量（μＭ）を反応液１０μＬあたり使用した。
配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーをそれぞれ、配列番号１：１０μＭ、配列番号３：５μＭ、配列番号９：２μＭ、配列番号７、８：５μＭ、配列番号１０、１１：３μＭとした。
図５におけるウイルス罹病株は、１反応当たり、３００～５００ｎｇの鋳型核酸濃度で調整した。
配列番号１、３、７、８、９、１０、及び１１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーをそれぞれ、配列番号１：１０μＭ、配列番号３：５μＭ、配列番号９：２μＭ、配列番号７、８：５μＭ、配列番号１０、１１：３μＭとした。
図５におけるウイルス罹病株は、１反応当たり、３００～５００ｎｇの鋳型核酸濃度で調整した。
【0121】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５２～５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
【0122】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図５に示す。図５において、左端レーンは、ＤＮＡマーカーを示し、続く左側４列は、各ウイルス単独感染株の増幅産物を示す。右７列のレーンは、自然界でウイルス感染したサツマイモの検証結果を示す。マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲによって様々な感染パターンが確認され、４種のウイルスの同時識別に有用な技術であることが実証された。
【0123】
（実施例８）
プライマーセットの設計
別途、ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルライメントを作成した。この比較により、同じＳＰＦＭＶウイルスであっても系統が異なる場合に異なる配列領域が存在していることに着目し、フォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
プライマーセットの設計
別途、ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルライメントを作成した。この比較により、同じＳＰＦＭＶウイルスであっても系統が異なる場合に異なる配列領域が存在していることに着目し、フォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
【0124】
実施例１と同様のＰＣＲの結果から、下記表１６に示す配列（各欄の上の配列はフォワードプライマー、下の配列はリバースプライマー）を有するプライマーセットを最終的に決定し、それらのプライマーセットから構成されるプライマーセットを設定した。
【0125】
【表16】
【0126】
（実施例９）
プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例８で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例８で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0127】
プライマーは、以下に示す量（μＭ）を反応液１０μＬあたり使用した。
図６におけるウイルス罹病株は、以下の使用プライマーの種類に対応するものであった。
レーン１、１３：ＤＮＡマーカー
レーン２－４：ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統プライマー（５μＭ、５μＭ、３μＭ）
レーン６－８：ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統プライマー（５μＭ、５μＭ、２．５μＭ）、
レーン１０－１２：ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統プライマー（５μＭ、５μＭ、２μＭ）
図６におけるウイルス罹病株は、以下の使用プライマーの種類に対応するものであった。
レーン１、１３：ＤＮＡマーカー
レーン２－４：ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統プライマー（５μＭ、５μＭ、３μＭ）
レーン６－８：ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統プライマー（５μＭ、５μＭ、２．５μＭ）、
レーン１０－１２：ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統プライマー（５μＭ、５μＭ、２μＭ）
【0128】
鋳型核酸濃度は、ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統で、それぞれ３００ｎｇ／μｌで調整した。
【0129】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５２～５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
【0130】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図６に示す。いずれも検証できるレベルではあるが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び１７のプライマーを同時に使用する条件下で、ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統ウイルスを明確に判定することができ、良好な結果を示した。
【0131】
（実施例１０）
プライマーセットによるユニプレックスとマルチプレックスＰＣＲの効率検証
実施例８で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
プライマーセットによるユニプレックスとマルチプレックスＰＣＲの効率検証
実施例８で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、サツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－ＲＣ、ＳＰＦＭＶ－Ｏ、及びＳＰＦＭＶ－Ｃ罹病株を用いて調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0132】
プライマーは、ＳＰＦＭＶ－ＲＣ用として配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ５μＭ
ＳＰＦＭＶ－Ｏ用として、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ：５μＭ
ＳＰＦＭＶ－Ｃ用として、配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ３μＭを反応液１０μＬあたり使用した。
ＳＰＦＭＶ－Ｏ用として、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ：５μＭ
ＳＰＦＭＶ－Ｃ用として、配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ３μＭを反応液１０μＬあたり使用した。
【0133】
結果を図７に示す。
図７におけるウイルス罹病株は、以下の使用プライマーに対応するものであった。
レーン１、７、１３、２０：ＤＮＡマーカー、
レーン２－６：ユニプレックスＲＴ－ＰＣＲ（ＲＣ系統）の検出限界、
レーン８－１２：ユニプレックスＲＴ－ＰＣＲ（Ｏ系統）の検出限界、
レーン１４－１８：ユニプレックスＲＴ－ＰＣＲ（Ｃ系統）の検出限界、
レーン２１－２５：マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲでの検出限界。
図７におけるウイルス罹病株は、以下の使用プライマーに対応するものであった。
レーン１、７、１３、２０：ＤＮＡマーカー、
レーン２－６：ユニプレックスＲＴ－ＰＣＲ（ＲＣ系統）の検出限界、
レーン８－１２：ユニプレックスＲＴ－ＰＣＲ（Ｏ系統）の検出限界、
レーン１４－１８：ユニプレックスＲＴ－ＰＣＲ（Ｃ系統）の検出限界、
レーン２１－２５：マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲでの検出限界。
【0134】
鋳型核酸濃度は、鋳型を１０倍ずつ段階的に希釈して、１０－０：３００ｎｇ／μｌ、１０－１：３０ｎｇ／μｌ、１０－２：３ｎｇ／μｌ、１０－３：３００ｐｇ／μｌ、１０－４：３０ｐｇ／μｌで調整した。
【0135】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５４℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
【0136】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図７に示す。配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び１７のプライマーを同時に使用する条件下で、別々に使用するのと同様の感度で、ＲＣ、Ｏ、Ｃ系統を明確に判定することができ、良好な結果を示した。
【0137】
（実施例１１）
プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例８で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、様々なサツマイモを用いて、その感染状況を調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
プライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出
実施例８で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原ウイルスの検出を、様々なサツマイモを用いて、その感染状況を調べた。ウイルス核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0138】
プライマーは、以下に示す量（μＭ）を反応液１０μＬあたり使用した。
図８における使用プライマーは、ＳＰＦＭＶ－Ｏ用として、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ：５μＭ
ＳＰＦＭＶ－Ｃ用として、配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ３μＭを反応液１０μＬあたり使用した。
図８における使用プライマーは、ＳＰＦＭＶ－Ｏ用として、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ：５μＭ
ＳＰＦＭＶ－Ｃ用として、配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ３μＭを反応液１０μＬあたり使用した。
【0139】
鋳型核酸濃度は、１００～５００ｎｇ／μｌで調整した。
【0140】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の熱変性、５４℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクルを行った。
【0141】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。その結果を図８に示す。様々な感染パターンを示しており、本方法が、実際の栽培株において、ＳＰＦＭＶ系統識別に有用であることがわかった。
【0142】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】