特許 7634001 ４－１ＢＢに結合する抗体およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-12

(45)【発行日】2025-02-20

(54)【発明の名称】４－１ＢＢに結合する抗体およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20250213BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250213BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250213BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250213BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20250213BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250213BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20250213BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250213BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250213BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250213BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250213BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250213BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

A61K39/395 T

A61K45/00

A61P31/00

A61P37/06

C07K16/46

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

【請求項の数】 28

(21)【出願番号】P 2022522002

(86)(22)【出願日】2020-09-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-27

(86)【国際出願番号】 CN2020119388

(87)【国際公開番号】W WO2021068841

(87)【国際公開日】2021-04-15

【審査請求日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】62/913,744

(32)【優先日】2019-10-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】522145605

【氏名又は名称】ナンチン リーズ バイオラブス カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】シアオチアン カン

(72)【発明者】

【氏名】ホアン シアオ

(72)【発明者】

【氏名】スン チエンミン

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０２５５４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０５６８２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５０４８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２０６５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０４５１１０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／００－４６

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １／００－３８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域と、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域と、を含み、
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号１、２および３に示される配列からなり、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号４、５および６に示される配列からなる、
４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

前記重鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号２５または７７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなる、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２６（Ｘ１＝ＳまたはＧ）または７８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ配列を含む又はからなる、
請求項１又は２に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

（１）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む又はからなる重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は、
（２）配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む又はからなる重鎖可変領域と、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
を含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

前記重鎖可変領域に連結された、配列番号３３、３４または７５のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および／または、前記軽鎖可変領域に連結された、配列番号３５または６３のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、請求項１又は４に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

４－１ＢＢシグナル伝達を活性化し、モノクローナル抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

マウス、ヒト、キメラまたはヒト化抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項9】

抗原結合部分は、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）ｄＡｂ断片、（ｖｉ）ナノボディ、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項10】

第１の抗原結合領域および第２の結合領域を含み、
前記第１の結合領域は４－１ＢＢに結合し、
前記第１の結合領域は、請求項１に記載の前記重鎖ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、ＣＤＲ３領域、および、前記軽鎖ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、ＣＤＲ３領域；または、請求項２に記載の前記重鎖可変領域、および請求項３に記載の前記軽鎖可変領域；または請求項４に記載の前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域
を含む、二重特異性抗体。

【請求項11】

前記第２の結合領域が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１またはＣＴＬＡ－４に結合する、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

（１）リンカーを介してまたはリンカーを介せずに、Ｎ末端またはＣ末端で請求項１～９のいずれか一項に記載の前記抗体の前記抗原結合部分に連結された第２の抗原に対する抗体の重鎖であり、前記抗原結合部分がｓｃＦｖである、鎖１と、
（２）前記第２の抗原に対する抗体の軽鎖である、鎖２と、
を含む、二重特異性抗体。

【請求項13】

前記リンカーが、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ又は（ＧｌｙＳｅｒ４）ｎを含み、前記ｎが、１～７の正の整数である、請求項１２に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

２つの鎖１および２つの鎖２からなる、請求項１２又は１３に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

前記第２の抗原は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１またはＣＴＬＡ－４から選択される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項16】

前記第２の抗原はＰＤ－Ｌ１であり、前記ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４０、４１および４２に示される配列からなり、
前記軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４３、４４および４５に示される配列からなる、
請求項１５に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

抗４－１ＢＢ抗体の前記ｓｃＦｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、２および３に示される配列からなり、
前記軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、５および６に示される配列からなる、
請求項１２～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

前記二重特異性抗体の鎖１は、配列番号４８または５０に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、
前記二重特異性抗体の鎖２は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、
請求項１２～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項19】

請求項１～９のいずれか一項に記載の前記抗体またはその抗原結合部分、または、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体またはその鎖をコードするポリヌクレオチド。

【請求項20】

請求項１９に記載の前記ポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項21】

請求項１９に記載の前記ポリヌクレオチドと一体化したゲノムを有するか、または、請求項２０に記載の前記ベクターを含むか、または、請求項１９に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項22】

請求項１～９のいずれか一項に記載の前記抗体またはその抗原結合部分、または請求項１０～１８のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体、および薬学的に受容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項23】

請求項１～９のいずれか一項に記載の前記抗体またはその抗原結合部分、または、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体と、１つ以上の追加の治療剤と、を含む組み合わせ品。

【請求項24】

前記追加の治療剤が、化学療法剤、細胞毒性剤、ワクチン、他の抗体、抗感染剤、低分子薬剤、または免疫調節剤から選択される、請求項２３に記載の組み合わせ品。

【請求項25】

前記他の抗体が、免疫チェックポイント分子に対する抗体から選択される、請求項２４に記載の組み合わせ品。

【請求項26】

前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１から選択される、請求項２５に記載の組み合わせ品。

【請求項27】

被験体の癌を治療するための、もしくは被験体の感染症を治療するための、もしくは被験体の自己免疫疾患を治療するための、請求項２２に記載の医薬組成物、又は請求項２３～２６のいずれか一項に記載の組み合わせ品。

【請求項28】

前記被験体は、治療モダリティおよび／または他の治療剤によって治療され得、前記治療モダリティは、手術および／または放射線療法を含み、および／または、前記他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、低分子薬剤、または免疫調節剤からなる群より選択される、請求項２７に記載の医薬組成物又は組み合わせ品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／９１３，７４４号の優先権を主張し、その内容全体は参照により本出願に組み込まれる。

【0002】

技術分野
本開示は、一般に、機能性をもってヒト４－１ＢＢに特異的に結合する、分離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。本開示は、抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および、抗体またはその抗原結合部分を発現させるための方法をも提供する。本開示は、二重特異性分子をさらに提供する。また、本開示は、抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物、および、抗体またはその抗原結合部分を用いる治療方法をさらに提供する。

【背景技術】

【0003】

４－１ＢＢは、ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＳＦ９とも呼ばれ、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである。これは、ＴＣＲによって誘導されるＴ細胞の活性化を調節するＴ細胞表面上の共刺激分子として最もよく特徴付けられる。活性化された抗原提示細胞上で発現されるその主要な天然リガンドである４－１ＢＢＬにより結合すると、４－１ＢＢは、抗アポトーシス分子をアップレギュレートし、サイトカイン産生およびエフェクター機能を促進する。４－１ＢＢは、樹状細胞、活性化単球、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、および肥満細胞にも見られ、４－１ＢＢシグナル伝達は、ＩＦＮ－γ分泌を刺激し、ＮＫ細胞の増殖およびＤＣ活性化を促進すると報告されている（Ｃａｒｉａｄ Ｃｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｌｏｏｄ １３１（１）：４９－５７）。

【0004】

一方、４－１ＢＢの発現は、癌患者の腫瘍細胞および血清で観察される。主に腫瘍微小血管系およびアテローム性動脈硬化症領域内の炎症部位における血管壁に沿った４－１ＢＢ発現は、それが白血球遊走を媒介する可能性があることを示唆している（Ｄｒｅｎｋａｒｄ Ｄ ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２１（２）：４５６－４６３）。さらに、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）上で４－１ＢＢを結紮すると、Ｔｒｅｇの増殖が誘導されることがある（Ｚｈａｎｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６６（４）：４３５－４４０）。

【0005】

４－１ＢＢの複雑な機能を調べるために、Ｍｅｌｅｒｏ等は、１９９７年に免疫原性の低いＡｇ１０４Ａ肉腫および免疫原性の高いＰ８１５肥満細胞腫に対するアゴニスティック抗４－１ＢＢ抗体の効果を試験し、４－１ＢＢアゴニストの抗腫瘍活性を明らかにした（Ｍｅｌｅｒｏ Ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３（６）：６８２－６８５）。その後、生後１２か月の４－１ＢＢＬ^－／－マウスの約６０％がＢ細胞リンパ腫を発症し、４－１ＢＢＬ^－／－マウスのＮＫ細胞数および活性が低下したことが報告された（Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｐ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１１）：２２８０－２２８９；Ｖｉｎａｙ Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（６）：４２１８－４２２９）。Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞の注射は、４－１ＢＢ^－／－マウスではより多くの死を引き起こしたが、４－１ＢＢ^＋／＋マウスでは引き起こさなかった（Ｊｕ Ｓ．Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８３（４）：３４４－３５１）。これらの発見により、４－１ＢＢは、強力な免疫系賦活剤および免疫療法の標的候補として浮上した。研究によると、４－１ＢＢアゴニストは、腫瘍、ウイルス感染症、自己免疫疾患の治療、および移植片の生存率の向上に使用できることが示されている（Ｓｅｏ Ｓ．Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０（１０）：１０８８－１０９４；Ｓｕｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（３）：１４５７－１４６５；Ａｇａｒｗａｌ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３（４）：３６６－３７２）。

【0006】

特に、４－１ＢＢの効果は、他の病態よりも癌において非常に詳細に研究されている。４－１ＢＢシグナル伝達は、細胞傷害性Ｔリンパ球において確立されたアネルギーを破壊し、逆転させることが判明した。例えば、Ｂ１６．ＳＩＹ黒色腫モデルでは、抗４－１ＢＢ ｍＡｂの投与により、ＩＬ－２分泌能を失ったＣＤ８＋ＴＩＬの機能が回復した（Ｃａｒｉａｄ Ｃｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）ｓｕｐｒａ）。抗４－１ＢＢ ｍＡｂの抗腫瘍効果のほとんどは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって示されるが、ＮＫ、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍治療にも重要で必要であることが証明されている（Ｄａｓｓ Ｓ．Ｖ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＢＭＢ Ｒｅｐ．４７（３）：１２２－１２９）。さらに、抗４－１ＢＢ投与後のＩＣＡＭ－１やＣＸＡＭ－１などの一部の接着分子のアップレギュレーションにより、Ｔ細胞の腫瘍部位への遊走が増加することが見出された（Ｐａｌａｚｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１（３）：８０１－８１１）。さらに重要なことに、抗４－１ＢＢ療法の有効性は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、扁平上皮肺癌など、他の固形腫瘍およびリンパ腫の予備的モデルでも実証されている（Ｃａｒｉａｄ Ｃｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）ｓｕｐｒａ）。

【0007】

ウレルマブは、ＢＭＳによって開発された完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であり、臨床試験に参加した最初の抗４－１ＢＢ治療薬であった。これは、４－１ＢＢ発現免疫細胞に特異的に結合して活性化し、第１相および第２相の単剤療法試験で有望な有効性を示したが、用量依存的な様式で肝毒性を示した。耐量でのウレルマブの単剤療法および併用療法は、有望な免疫刺激薬力学効果を示したものの、抗腫瘍効果には限定的であった。Ｐｆｉｚｅｒのヒト化ＩｇＧ２モノクローナル抗体であるウトミルマブは、優れた安全性プロファイルを示しているが、ウレルマブと比較して弱い４－１ＢＢアゴニストである。現在では、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、キイトルーダ、アベルマブ、および他の抗腫瘍抗体と組み合わせて、様々な癌の治療に用いる臨床試験が行われている（Ｃａｒｉａｄ Ｃｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）ｓｕｐｒａ）。

【0008】

さらに、抗４－１ＢＢと他の抗体（抗ＰＤ－１抗体など）との併用療法も臨床試験中である。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断するＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢの両方を同時に標的とし、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１の架橋時に４－１ＢＢを介して共刺激シグナルを与える二重特異性抗体が必要である。しかしながら、米国特許ＵＳ２０１７／０１９８０５０Ａ１に記載されている二重特異性抗体は、標的細胞と架橋することなく４－１ＢＢシグナル伝達を活性化または誘導し、高い濃度で４－１ＢＢによって引き起こされる潜在的な毒性の懸念を提起した。

【0009】

したがって、安全性プロファイルとアゴニズムとの間の最適なバランスを有する新しい抗４－１ＢＢ抗体を開発することが、当技術分野において依然として強く必要とされている。また、そのような抗４－１ＢＢ抗体は、４－１ＢＢおよび他の抗原、例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合できる二重特異性抗体を含む、新たな二重特異性抗体を構築するのにも役立つであろう。４－１ＢＢに特異的に結合できる一方で、より高い親和性でＰＤ－Ｌ１などの他の抗原に結合できるこのような二重特異性抗体も、４－１ＢＢ抗体の領域での開発の目的である。

【発明の概要】

【0010】

本開示は、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に特異的に結合する、分離されたモノクローナルアゴニスト抗体、例えば、ヒト、マウス、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、安全性プロファイルとアゴニズムとの間に最適なバランスを提供する。

【0011】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、４－１ＢＢタンパク質の検出、および腫瘍、感染症および自己免疫疾患などの４－１ＢＢ関連疾患の治療を含む、様々な用途に使用することができる。

【0012】

したがって、一態様において、本開示は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を有する、４－１ＢＢに結合する分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）またはその抗原結合部分に関するもので、ここで、前記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ配列番号１、２および３、（２）それぞれ配列番号７、８および９、（３）それぞれ配列番号１３、１４および１５、または（４）それぞれ配列番号１９、２０および２１に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0013】

一態様において、本開示の、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２５、２７、２９、３１、または７７に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、前記抗体またはその抗原結合断片は、４－１ＢＢに結合する。

【0014】

一態様において、４－１ＢＢに結合する、本開示の、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、前記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ配列番号４、５および６、（２）それぞれ配列番号１０、１１および１２、（３）それぞれ配列番号１６、１７および１８、または（４）それぞれ配列番号２２、２３および２４に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0015】

一態様において、本開示の、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２６（Ｘ１＝ＳまたはＧ）、２８、３０、３２または７８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、前記抗体またはその抗原結合断片は、４－１ＢＢに結合する。

【0016】

一態様において、本開示の、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、それぞれがＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、（１）それぞれ配列番号１、２、３、４、５および６、（２）それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１および１２、（３）それぞれ配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８、または（４）それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記抗体またはその抗原結合断片は、４－１ＢＢに結合する。

【0017】

一実施形態において、本開示の、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号２５および２６（Ｘ１＝Ｓ）、（２）それぞれ配列番号２５および２６（Ｘ１＝Ｇ）、（３）それぞれ配列番号２７および２８、（４）それぞれ配列番号２９および３０、（５）それぞれ配列番号３１および３２、または（６）それぞれ配列番号７７および７８に対して、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記抗体またはその抗原結合断片は、４－１ＢＢに結合する。

【0018】

一実施形態において、本開示の、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含み、前記軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域であり得、前記軽鎖定常領域は、ヒトラムダまたはカッパ定常領域であり得、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、上記のアミノ酸配列を含み、ここで、前記抗体またはその抗原結合断片は、４－１ＢＢに結合する。さらなる実施形態において、前記重鎖定常領域は、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、前記軽鎖定常領域は、配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列を含む。前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域に由来する定常領域、例えば、配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有する変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４定常領域、または配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有する変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ（ＥＵナンバリング）を有するＩｇＧ１定常領域などの、他の適切な定常領域であり得る。前記軽鎖定常領域は、ヒトカッパまたはラムダ定常領域に由来する他の適切な定常領域であり得る。

【0019】

本開示の抗体は、幾つかの実施形態において、ジスルフィド結合によって接続された２つの重鎖および２つの軽鎖を含むかまたはそれらからなり、ここで、各重鎖は、前記重鎖定常領域、重鎖可変領域または前記ＣＤＲ配列を含み、各軽鎖は、前記軽鎖定常領域、軽鎖可変領域または前記ＣＤＲ配列を含み、ここで、前記重鎖可変領域のＣ末端は、前記重鎖定常領域のＮ末端に連結され、前記軽鎖可変領域のＣ末端は、前記軽鎖定常領域のＮ末端に連結される。本開示の抗体は、全長抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプであり得る。本開示の抗体は、カッパまたはラムダ定常領域を含んでいてもよい。本開示の他の実施形態に係る抗体またはその抗原結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、またはＦａｂまたはＦａｂ’２断片などの抗体断片であってもよい。

【0020】

本開示の例示的な抗体またはその抗原結合部分は、４－１ＢＢ、特にヒト４－１ＢＢに特異的に結合し、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化するアゴニスト抗４－１ＢＢ抗体である。

【0021】

本開示はまた、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分（例えば、第２の抗体）に連結された、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む、二重特異性分子を提供する。前記二重特異性分子は、４－１ＢＢおよびＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４などの別の分子に結合してもよく、好ましくは、前記分子はＰＤ－Ｌ１である。

【0022】

一態様において、本開示の抗体は、二重特異性抗体を指す。したがって、本開示はまた、４－１ＢＢ（例えば、ヒト４－１ＢＢ）に特異的に結合する第１の結合領域と、癌、感染症または自己免疫疾患に関連する第２の抗原に特異的に結合する第２の結合領域とを含む二重特異性抗体を提供する。一実施形態において、第２の抗原は、（ヒト）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４から選択される。より好ましくは、第２の抗原は（ヒト）ＰＤ－Ｌ１である。一実施形態において、４－１ＢＢに特異的に結合する第１の結合領域は、上記のような重鎖可変領域および／または上記のような軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、第１の結合領域は、上述したような重鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域、および／または上述したような軽鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む。一実施形態において、第１の結合領域は、（ヒト）４－１ＢＢに特異的に結合し、かつ高親和性で第２の抗原に特異的に結合する。

【0023】

一実施形態において、上記の二重特異性抗体は、Ｔ細胞を全身的に刺激することを避けつつ、ＰＤ－Ｌ１発現を有する腫瘍微小環境でのみ活性を有するように、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する第１の結合領域と、ヒトＰＤ－Ｌ１に高い親和性で特異的に結合する第２の結合領域とを含む。

【0024】

本開示の抗体またはその抗原結合部分または二重特異性分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。一実施形態において、前記組成物は医薬組成物である。

【0025】

本開示は、本開示の抗体またはその抗原結合部分または抗体の鎖をコードする核酸分子、ならびに、該核酸を含む発現ベクター、および、該発現ベクターを含むか、または前記抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドと統合されているそのゲノムを有する、宿主細胞をまた含む。発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗４－１ＢＢ抗体を調製するための方法もまた提供され、この方法は、（ｉ）宿主細胞において抗体を発現させるステップ、および（ｉｉ）宿主細胞またはその細胞培養物から抗体を分離するステップを含む。

【0026】

さらに別の態様において、本開示は、被験体における癌疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする被験体に本開示の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本開示の組成物、または二重特異性分子、または任意選択的に被験体において組成物または二重特異性分子を発現し得る核酸分子を投与することを含む。前記二重特異性分子は、４－１ＢＢ、および、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４、好ましくはＰＤ－Ｌ１などの別のタンパク質に結合できる。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの追加の抗体を、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの、本開示の抗体またはその抗原結合部分と共に投与し得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの追加の抗癌剤を、本開示の抗体またはその抗原結合部分と共に投与し得る。前記癌は、固形癌または非固形癌、例えば、結腸癌、結腸直腸癌（大腸癌）、または直腸癌などの消化管（胃腸管）の癌であり得る。

【0027】

別の態様において、本開示は、被験体における感染症を治療するための方法を開示し、前記方法は、それを必要とする被験体に、本開示の抗体、その抗原結合部分、特定の分子、または医薬組成物を、必要に応じて追加の抗ウイルス剤、抗菌剤または抗真菌剤とともに投与することを含む。

【0028】

別の態様において、本開示は、自己免疫疾患を治療するための方法を開示し、前記方法は、それを必要とする被験体に、本開示の抗体、その抗原結合部分、特定の分子、または医薬組成物を投与することを含む。前記自己免疫疾患は、喘息または関節リウマチである可能性がある。必要に応じて、追加の抗喘息剤または抗関節リウマチ剤を投与してもよい。

【0029】

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかになるであろうが、限定的であると解釈されるべきではない。本出願を通じて引用されたすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリ、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1A】ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒト４－１ＢＢへの抗４１ＢＢ抗体４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２（Ａ）、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２（Ｂ）、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２（Ｃ）、および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２（Ｄ）の結合能力を示す図である。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D】同上。

【0031】

【図2A】ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＣＤ４０、ヒトＨＶＥＭ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＤ２７、ヒトＧＩＴＲおよびＲｈｅｓｕｓ ４－１ＢＢへの抗４－１ＢＢ抗体４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２（Ａ）および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２（Ｂ）の結合能力を示す図である。

【図2B】同上。

【0032】

【図3A】架橋の有無にかかわらず、４－１ＢＢシグナル伝達における抗４－１ＢＢ抗体４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２のアゴニスト活性を示す図である。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図3E】同上。

【図3F】同上。

【図3G】同上。

【0033】

【図4A】架橋剤の有無にかかわらず、４－１ＢＢシグナル伝達における抗４－１ＢＢ抗体４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ１および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ４のアゴニスト活性を示す図である。

【図4B】同上。

【0034】

【図5A】二重特異性抗体Ｐ４Ｂ－３（Ａ）およびＰ４Ｂ－２（Ｂ）の構造を示す図である。

【図5B】同上。

【0035】

【図6】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＰＤ－Ｌ１への二重特異性抗体の結合を示す図である。

【0036】

【図7】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト４－１ＢＢへの二重特異性抗体の結合を示す図である。

【0037】

【図8】標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ１細胞を用いた４－１ＢＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合依存性４－１ＢＢ刺激を誘導する二重特異性抗体（Ｐ４Ｂ－３およびＮＭ２１－ＰＲＯ１１８６）の能力を示す図である。

【0038】

【図9A】標的細胞Ａ３７５／ＰＤ－Ｌ１の有無にかかわらず、４－１ＢＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、４－１ＢＢ刺激を誘導する二重特異性抗体（Ｐ４Ｂ－３およびＩＮＢＲＸ－１０５－１）の能力を示す図である。

【図9B】同上。

【0039】

【図10】Ｐ４Ｂ－３がヒトＰＢＭＣを活性化してＩＬ－２を放出することを示す図である。

【0040】

【図11】治療後の腫瘍成長曲線を示す図である。

【0041】

【図12】腫瘍微小環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）におけるｍＣＤ３のｍＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。

【0042】

【図13】ＴＭＥにおけるｍＣＤ４のｍＴｒｅｇｓパーセンテージを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本開示をより容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明全体で記載されている。

【0044】

用語「４－１ＢＢ」とは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー９を指す。用語「４－１ＢＢ」は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的な抗体は、特定のケースにおいて、サルなどのヒト以外の種からの４－１ＢＢタンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的な抗体は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して完全に特異的であり得、他の種または他のタイプに対して交差反応性を示さないか、または、特定の他の種からの４－１ＢＢと交差反応し得るが、他のすべての種からのものではない。

【0045】

用語「ヒト４－１ＢＢ」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２を有するヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列などの、ヒト由来のアミノ酸配列を有する４－１ＢＢタンパク質を指す。一実施形態において、ヒト４－１ＢＢは、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む。用語「サルまたはＲｈｅｓｕｓ４－１ＢＢ」および「マウス４－１ＢＢ」とは、それぞれサルおよびマウスの４－１ＢＢ配列を指し、例えば、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２５３０５７．１およびＮＰ＿０３３４３０．１を有するアミノ酸配列を有するものを指す。

【0046】

本明細書において、用語「抗体」は、全抗体及びそのいずれかの抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。さらに、本明細書で使用されている用語「抗体」はまた、二重特異性抗体または三重特異性抗体などの複数の特異的抗体を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここで、Ｖ_Ｈと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここで、Ｖ_Ｌと略される）及び軽鎖定常領域（ここで、Ｃ_Ｌと略される）から構成される。軽鎖定常領域は、Ｃ_Ｌの１つのドメインから構成される。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する領域にさらに細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への免疫グロブリンの結合を媒介できる。

【0047】

本明細書で使用されている抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）との用語とは、抗原（例えば、4-1BBタンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって達成できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインから構成される一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法により、それらを単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーを用いて結合することができる。前記単一タンパク質鎖において、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈがペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）を形成する。このような一本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれることが意図されている。これらの断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。

【0048】

用語「二重特異性」とは、抗体が少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合領域を含み、そのそれぞれが異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に、同時に結合することができる。本明細書において使用する用語「抗原決定基」は、「抗原」および「エピトープ」と同義であり、ポリペプチド高分子上の部位（例えば、一続きの連続するアミノ酸のストレッチ、またはアミノ酸が連続していない異なる領域から構成されるコンフォメーション構成）であって、そこに抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成する部位を指す。有用な抗原決定基を、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、遊離した状態で血清中に、および／または細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）中に、見いだすことができる。

【0049】

本明細書において使用する用語「抗原結合領域」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施形態において、抗原結合領域は、それが付着している実体（例えば、第２の抗原結合領域）を標的部位、例えば、抗原決定基を有する特定のタイプの腫瘍細胞に方向付けることができる。別の実施形態において、抗原結合領域（例えば、第１の抗原結合領域）は、その標的抗原、例えば、Ｔ細胞受容体抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合領域には、本明細書において定義される抗体またはその抗原結合断片が含まれる。特定の抗原結合領域には、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合断片が含まれる。特定の実施形態において、抗原結合領域は、本明細書において定義され、当技術分野において公知の抗体定常領域を含んでもよい。

【0050】

「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用または非特異的な相互作用と区別できることを意味する。抗原結合領域が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者がよく知っている他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）によって測定することができる。

【0051】

特に指示のない限り、本明細書において使用する用語「結合親和性」とは、結合ベアのメンバー（例えば、モノクローナル抗体と抗原、抗原結合領域と抗原、または受容体とそのリガンド）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当技術分野において公知の十分に確立された方法によって測定することができる。

【0052】

本明細書で使用されている「分離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、４－１ＢＢタンパク質に特異的に結合する分離された抗体は、４－１ＢＢタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的に結合する分離された抗体は、他の抗原（例えば、他の種に由来する４－１ＢＢタンパク質）に対して交差反応性を有してもよい。さらに、分離された抗体は、他の細胞物質及び／及び化学物質を実質的に含まない。

【0053】

本明細書において使用する用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボの体細胞変異によって導入される変異）。しかしながら、本明細書において使用する用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図していない。

【0054】

用語「アゴニスティックな４－１ＢＢ抗体」または「アゴニスティックな抗４－１ＢＢ抗体」とは、４－１ＢＢに結合し、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化または誘導して、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化および／または増殖を促進する抗４－１ＢＢ抗体を指す。

【0055】

用語「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。

【0056】

用語「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。

【0057】

本明細書において使用する「ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する」抗体は、ヒト４－１ＢＢタンパク質（および場合により、１つ以上の非ヒト種由来の４－１ＢＢタンパク質）に結合するが、非４－１ＢＢタンパク質には実質的に結合しない抗体を指すことを意図している。前記抗体は、Ｋ_Ｄが１．０×１０^－６Ｍ以下、好ましくは５．０×１０^－７Ｍ以下、より好ましくは１．０×１０^－７Ｍ以下でヒト４－１ＢＢタンパク質に結合することが望ましい。

【0058】

本明細書において使用する用語、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」とは、該タンパク質または細胞に特異的に結合しないか、または高い親和性で結合しないこと、すなわち、Ｋ_Ｄが１．０×１０^－６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０^－５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０^－４Ｍ以上、さらに好ましくは１．０×１０^－３Ｍ以上、さらにより好ましくは１．０×１０^－２Ｍ以上で該タンパク質または細胞に結合することを意味する。

【0059】

ＩｇＧ抗体またはその抗原結合領域に対する「高親和性で第２の抗原（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する」という用語は、Ｋ_Ｄが１．０×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０^－９Ｍ以下である抗体または抗原結合領域を指す。

【0060】

本明細書において、用語「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」又は「Ｋ_ａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図している。また、用語「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_ｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。用語「Ｋ_Ｄ」は、解離定数であり、Ｋ_ａに対するＫ_ｄの比（即ち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られａｎモル濃度（Ｍ）で示される。抗体のＫ_Ｄ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。好ましくは、抗体のＫ_Ｄの決定は、表面プラズモン共鳴、より好ましくは、バイオセンサーシステム（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭシステム）を使用して行われる。

【0061】

用語「ＥＣ_５０」は、最大有効濃度の半分として知られており、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との中間の反応を誘発する抗体の濃度を指す。

【0062】

用語「ＩＣ_５０」とは、最大阻害濃度の半分として知られており、抗体の非存在下と比較して、特定の生物学的または生化学的機能を５０％阻害する抗体の濃度を指す。

【0063】

用語「被験体」には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、爬虫類のような哺乳類及び非哺乳類が含まれる。非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマのような哺乳類動物が好ましい。

【0064】

用語「治療有効量」とは、疾患や病態（癌など）に関連する症状を予防または改善するのに十分な、且つ／または、疾患や病態の重症度を軽減するのに十分な本開示の抗体の量を意味する。治療有効量は、実際の有効量が当業者に容易に識別される治療対象病態に関連して理解される。

【0065】

本明細書に記載の用語「治療薬（治療剤）」とは、化学療法剤、細胞毒性剤、ワクチン、他の抗体（例えば、免疫チェックポイント分子に対する抗体）、抗感染剤、免疫調節剤、小分子薬剤を含む、腫瘍（癌など）または感染症または自己免疫疾患の予防または治療に有効な物質を含む。

【0066】

用語「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物を含む。

【0067】

用語「抗感染剤」は、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物、例えば寄生虫などの、微生物の増殖を特異的に阻害または排除する分子を含み、宿主に致死的ではない、投与濃度および投与間隔で使用される。

【0068】

本明細書において使用する用語「抗感染剤」は、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗原虫剤を含む。一特定の態様において、抗感染剤は、投与濃度および投与間隔において宿主に対して非毒性である。

【0069】

免疫調節剤には、免疫チェックポイント分子阻害剤および共刺激分子活性化剤が含まれる。

【0070】

用語「小分子薬剤」とは、生物学的プロセスを調節できる低分子量有機化合物を指す。「小分子」とは、分子量が通常２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満、より好ましくは約５００ダルトン以下の分子と定義される。小分子には、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣物、および抗体模倣物が含まれるが、これらに限定されない。

【0071】

用語「癌」および「癌性」とは、典型的に調節されていない細胞成長（細胞増殖）によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的疾患を指すかまたは説明する。

【0072】

用語「腫瘍」とは、悪性か良性かに関係なく、すべての腫瘍性細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」とは、本明細書において言及される場合、互いに排他的ではない。

【0073】

用語「感染症」とは、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症などの原生動物を含む、病原体によって引き起こされる疾患を指す。

【0074】

用語「腫瘍免疫回避」とは、免疫認識およびクリアランスを回避する腫瘍を指す。したがって、治療の概念として、腫瘍免疫は「治療」され、回避が弱まると、腫瘍は免疫系によって認識され攻撃される。腫瘍認識の例として、腫瘍結合、腫瘍縮小、および腫瘍クリアランスが挙げられる。

【0075】

本開示の様々な態様については、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。

【0076】

ヒト４－１ＢＢに対する結合親和性を有する抗４－１ＢＢ抗体。

【0077】

本開示の例示的な抗体またはその抗原結合部分は、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する。本開示の例示的な抗体またはその抗原結合部分は、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化および／または増殖を促進するために４－１ＢＢシグナル伝達を活性化または誘導するアゴニスティック抗体である。

【0078】

一態様において、本発明は、３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。
別の態様において、本発明は、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。
さらなる態様において、本発明は、３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）と、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）とを含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。

【0079】

別の態様において、本発明は、重鎖可変領域を含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。
別の態様において、本発明は、軽鎖可変領域を含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。
さらなる態様において、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。
一実施形態において、重鎖可変領域は、３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。
別の実施形態において、軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。

【0080】

一実施形態において、３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ） 配列番号２５、２７、２９、３１または７７に示される配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域ＶＨに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
一実施形態において、３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ） 配列番号２６、２８、３０、３２、または７８に示される配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域ＶＬに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
一実施形態において、本発明は、配列番号２５、２７、２９、３１または７７に示される配列からなる重鎖可変領域Ｖ_Ｈに由来する３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、配列番号２６、２８、３０、３２または７８に示される配列からなる軽鎖可変領域Ｖ_Ｌに由来する３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含む、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する。
別の実施形態において、本発明は、以下を含む抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する：
（１） 配列番号２５または７７に示される配列からなる重鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および、配列番号２６または７８に示される配列からなる軽鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）；
（２） 配列番号２７に示される配列からなる重鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および、配列番号２８に示される配列からなる軽鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）；
（３） 配列番号２９に示される配列からなる重鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および、配列番号３０に示される配列からなる軽鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）；
（４） 配列番号３１に示される配列からなる重鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および、配列番号３２に示される配列からなる軽鎖可変領域に由来する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）。

【0081】

一実施形態において、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１は、配列番号１、７、１３または１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１は、配列番号１、７、１３または１９からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２は、配列番号２、８、１４または２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２は、配列番号２、８、１４または２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、配列番号３、９、１５または２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、配列番号３、９、１５または２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つ修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、Ｖ_ＬのＣＤＲ１は、配列番号４、１０、１６または２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_ＬのＣＤＲ１は、配列番号４、１０、１６または２２からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、Ｖ_ＬのＣＤＲ２は、配列番号５、１１、１７または２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_ＬのＣＤＲ２は、配列番号５、１１、１７または２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、Ｖ_ＬのＣＤＲ３は、配列番号６、１２、１８または２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_ＬのＣＤＲ３は、配列番号６、１２、１８または２４からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、た１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0082】

一実施形態において、３つの重鎖可変領域Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ） それぞれ配列番号１、２および３に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ） それぞれ配列番号７、８および９に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉｉ） それぞれ配列番号１３、１４および１５に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｖ） それぞれ配列番号１９、２０および２１に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｖ） （ｉ）から（ｉｖ）のいずれかの３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
一実施形態において、３つの軽鎖可変領域Ｖ_ＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ） それぞれ配列番号４、５および６に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ） それぞれ配列番号１０、１１および１２に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉｉ） それぞれ配列番号１６、１７および１８に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｖ） それぞれ配列番号２２、２３および２４に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｖ） （ｉ）から（ｉｖ）のいずれかの３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
別の実施形態において、本発明は、以下を含む抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する：
（ｉ） それぞれ配列番号１、２および３に示される配列からなるＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、５および６に示される配列からなるＶ_ＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
（ｉｉ） それぞれ配列番号７、８および９に示される配列からなるＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１および１２に示される配列からなるＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
（ｉｉｉ） それぞれ配列番号１３、１４および１５に示される配列からなるＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７および１８に示される配列からなるＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
（ｉｖ） それぞれ配列番号１９、２０および２１に示される配列からなるＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号２２、２３および２４に示される配列からなるＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３。

【0083】

一実施形態において、重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号２５、２７、２９、３１または７７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号２５、２７、２９、３１または７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか：または
（ｉｉｉ）配列番号２５、２７、２９、３１または７７からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸修飾はＣＤＲ領域では起こらず、より好ましくは、前記アミノ酸修飾はＦＲ領域、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で起こる。
別の実施形態において、軽鎖可変領域は
（ｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または７８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸修飾はＣＤＲ領域では起こらず、より好ましくは、前記アミノ酸修飾はＦＲ領域、例えば、ＦＲ１領域、ＦＲ２領域、ＦＲ３領域またはＦＲ４領域で起こる。
一実施形態において、抗体の精製を改善するために可変領域を改変することができる。例えば、重鎖可変領域の末端において、アミノ酸をＳからＧに変異させて高純度に調製できる抗体を得ることができる。
別の実施形態において、可変領域を改変して、抗体または抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）の安定性を向上させることができる。例えば、変異は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にジスルフィドを形成するように行うことができる。例えば、重鎖可変領域の変異はＧ４４Ｃ（Ｅｕナンバリング）であり、および／または軽鎖可変領域の変異はＴ１０４Ｃ（Ｅｕナンバリング）である。
別の実施形態において、本発明は、以下を含む抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する：
配列番号２５、２７、２９、３１または７７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または
配列番号２６、２８、３０、３２または７８に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域。
別の実施形態において、本発明は、以下を含む抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片に関する：
（１） 配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（２） 配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（３） 配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（４） 配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；または
（５） 配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【0084】

さらなる態様において、抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域、および／または軽鎖定常領域をさらに含む。

【0085】

一実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域、好ましくは、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域またはＩｇＧ４定常領域であるかまたはそれに由来する。
別の実施形態において、重鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、例えば、ヒトラムダ軽鎖定常領域であるかまたはそれに由来する。
別の実施形態において、軽鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0086】

一実施形態において、抗体の定常領域を変異させて、抗体の産生および精製を改善することができる。例えば、ＩｇＧ４定常領域はＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング）の変異を有することができる。ＩｇＧ１定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ（Ｅｕナンバリング）の変異を有することができる。

【0087】

一実施形態において、本開示の抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ断片である。特に、ｓｃＦｖ断片は、リンカーによって連結された軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。一実施形態において、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を単独でまたは組み合わせて有するリンカーなどの柔軟なリンカーである。一実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたは（ＧｌｙＳｅｒ４）ｎを含み、ここで、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６である。一実施形態において、ｎは１、２、３または４である。特定の実施形態において、リンカーは、配列番号３６、配列番号５１、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0088】

本開示の好ましい抗体はモノクローナル抗体である。

【0089】

モノクローナル抗４－１ＢＢ抗体

【0090】

本開示の抗体は、以下および以下の実施例に記載されるように構造的および化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体であってもよい。抗体のＣＤＲ領域または重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列番号を以下の表１にまとめる。抗体の重鎖定常領域は、例えば、配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域またはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列を有するヒトラムダ定常領域であってもよい。抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖および２つの軽鎖を含むかそれらからなり、重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結されており、軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結されている。

【表1】

【0091】

表１の重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって定義されている。しかしながら、当分野で周知されているように、ＣＤＲ領域はまた、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｏｎｔａｃｔナンバリングシステム／方法などの他のシステムによって決定することもできる。異なるナンバリングシステムで得られる抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なることがあることに留意すべきである。すなわち、異なるナンバリングシステムによって定義される抗体の可変領域のＣＤＲ配列は異なる。よって、抗体が本発明により定義される特定のＣＤＲ配列によって定義される場合、その抗体の範囲はまた、可変領域配列がその特定のＣＤＲ配列を含んでなるが、異なるプロトコル（例えば、異なるナンバリングシステム規則またはそれらの組み合わせ）の適用のために本発明によって定義された特定のＣＤＲ境界とは異なるＣＤＲ境界が主張される抗体も包含する。

【0092】

ヒト４－１ＢＢに結合する他の抗４－１ＢＢ抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列（またはＣＤＲ配列）は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列（またはＣＤＲ配列）と「混合および適合」することができる。好ましくは、Ｖ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖（またはそのような鎖内のＣＤＲ）が混合され適合される場合、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_ＬペアリングからのＶ_Ｈ配列を、構造的に類似したＶ_Ｈ配列に置き換える。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_ＬペアリングからのＶ_Ｌ配列を、構造的に類似したＶ_Ｌ配列に置き換える。したがって、一実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）上記の表１に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）上記の表１に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または別の抗４－１ＢＢ抗体のＶ_Ｌを含み、
ここで、前記抗体はヒト４－１ＢＢに特異的に結合する。

【0093】

別の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）上記の表１に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域；および
（ｂ）上記の表１に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域、または別の抗４－１ＢＢ抗体のＣＤＲを含み、
ここで、前記抗体はヒト４－１ＢＢに特異的に結合する。

【0094】

さらに別の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、ヒト４－１ＢＢに結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、異なる抗４－１ＢＢ抗体の、重鎖可変領域のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３、および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３と組み合わされている、抗４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２を含む。

【0095】

さらに、当分野で周知されているように、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインとは独立して単独で、同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定でき、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測可能に生成される。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３ （１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）ａｎｄ Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６；６，９１４，１２８号；第６，０９０，３８２号；第６，８１８，２１６号；第６，１５６，３１３号；第６，８２７，９２５号；第５，８３３，９４３号；第５，７６２，９０５号および第５，７６０，１８５号も参照されたい。これらの参考文献のそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0096】

したがって、別の実施形態において、本開示の抗体は、抗４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、ならびに、抗４－１ＢＢ抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、またはヒト４－１ＢＢに特異的に結合し得る別の抗４－１ＢＢ抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。これらの抗体は、好ましくは、本発明の抗４－１ＢＢ抗体と（ａ）４－１ＢＢとの結合について競合する、（ｂ）機能的特性を保持している、（ｃ）同一のエピトープに結合する、および／または（ｄ）類似の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体はさらに、抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、またはヒト４－１ＢＢに特異的に結合し得る別の抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を含み得る。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗４－１ＢＢ抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、またはヒト４－１ＢＢに特異的に結合し得る別の抗４－１ＢＢ抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含み得る。

【0097】

本開示の好ましい抗体は二重特異性抗体である。

【0098】

二重特異性分子

【0099】

他の態様において、本開示は、少なくとも１つの他の機能分子に連結された本開示の１つ以上の抗体または抗体結合断片を含む二重特異性分子を特徴とする。前記他の機能分子は、例えば、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生する他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体のための別の抗体およびリガンド）である。したがって、本明細書で使用される「二重特異性分子」には、３つ以上の特異性を有する分子が含まれる。

【0100】

一実施形態において、二重特異性分子は、抗４－１ＢＢ結合特異性に加えて、第２の特異性を有する。第２の特異性は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対するものであり得る。

【0101】

一実施形態において、二重特異性分子は、抗４－１ＢＢ結合特異性および抗ＰＤ－Ｌ１結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、癌治療のためのＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４に対するものであり得る。

【0102】

二重特異性分子は、多くの異なる形式およびサイズを有する。サイズスペクトルにおいて、二重特異性分子は、同一の特異性を持つ２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を持つ２つの結合アームを有する以外、従来の抗体形式を保持する。もう１つの極端な例では、二重特異性分子は、ペプチド鎖、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）_２構築物によって連結された２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ’ｓ）からなる。中間サイズの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片が含まれる。これらおよび他の形式の二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞交雑、および化学的方法によって調製することができる。例えば、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ｃｉｔｅｄ ｓｕｐｒａ，Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８），ａｎｄ ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）を参照されたい。これらの参考文献は本明細書に組み込まれる。

【0103】

一実施形態において、本発明の二重特異性分子は、４－１ＢＢに特異的に結合する第１の結合領域、および、癌、感染症または自己免疫疾患に関連する第２の抗原に特異的に結合する第２の結合領域を含む二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、いくつかの構造形式を有することができる（ｃ．ｆ．，Ａｒａｎ Ｆ．Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｖｏｌｕｍｅ １８，ｐａｇｅｓ ５８５-６０８（２０１９））。例えば、二重特異性抗体は、ＩｇＧ様の抗体、すなわち全長の二重特異性抗体である場合もあれば、全長の抗体構築物ではない非ＩｇＧ様の二重特異性抗体である場合もある。

【0104】

特に、第２の抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４、例えば、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４から選択される。より好ましくは、第２の抗原は、ＰＤ－Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１である。一実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１は、配列番号６１で示されるアミノ酸配列、または、配列番号６１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１は、配列番号６２で示される核酸配列、または、配列番号６２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。

【0105】

一実施形態において、第１の結合領域は、上記の抗４－１ＢＢ抗体または抗体結合断片について開示されたＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌを含む。別の実施形態において、第１の結合領域は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、これらは、上記のような抗４－１ＢＢ抗体または抗体結合断片について開示される。さらなる実施形態において、第１の結合領域は、定常領域、例えば、重鎖定常領域または軽鎖定常領域をさらに含み、これらは、上記のような抗４－１ＢＢ抗体または抗体結合断片について開示される。一実施形態において、第１の結合領域は、本明細書で上記に開示される抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖを含む。

【0106】

別の実施形態において、第２の結合領域は、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗体結合断片について開示されたＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌを含む。別の実施形態において、第２の結合領域は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、これらは、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗体結合断片について開示されている。一実施形態において、第２の結合領域は、定常領域、例えば、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域、例えば、本開示に開示されるこれらをさらに含む。

【0107】

特定の実施形態において、第２の結合領域は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合することができ、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗体結合断片について開示されたＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌを含む。別の実施形態において、第２の結合領域は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、これらは、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗体結合断片について開示されている。一実施形態において、第２の結合領域は、定常領域、例えば、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含む。

【0108】

二重特異性抗体の構築のために、二重特異性抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌは、それらが由来するモノクローナル抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌと１もしくは数個のアミノ酸が異なる可能性があることが知られている。例えば、由来したＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、ｓｃＦｖをより安定させるために１つ以上の変異を有することができる。一実施形態において、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌは、抗体またはその抗原結合部分をより安定にするために、互いにジスルフィド結合を形成するための変異を有することができる。例えば、Ｖ_ＨはＧ４４Ｃ（ＥＵナンバリング）を有し、Ｖ_ＬはＴ１０４Ｃ（ＥＵナンバリング）を有することができる。

【0109】

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、以下の鎖を含む：
（１）鎖１：リンカーを介してまたはリンカーを介さずに、Ｎ末端またはＣ末端で本開示の抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ断片に連結された第２の抗原に対する抗体の重鎖：および
（２）鎖２：第２の抗原に対する抗体の軽鎖。
特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２本鎖１および２本鎖２を含む。さらに特定の実施形態において、二重特異性抗体の構造が図５Ａまたは図５Ｂに示される。
特に、第２の抗原に対する抗体の重鎖は、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗体結合断片について開示されたＶ_Ｈを含む。別の実施形態において、第２の抗原に対する抗体の重鎖は、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、これらは、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４について開示されている。特に、第２の抗原に対する抗体の軽鎖は、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗体結合断片について開示されたＶ_Ｌを含む。別の実施形態において、第２の抗原に対する抗体の軽鎖は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、これらは、当技術分野における抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４について開示されている。
一実施形態において、第２の抗原はＰＤ－Ｌ１であり、第２の抗原に対する抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された重鎖可変領域Ｖ_Ｈを含む。特定の実施形態において、Ｖ_Ｈは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、重鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特に、重鎖は定常領域をさらに含む。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された軽鎖可変領域Ｖ_Ｌを含む。特定の実施形態において、Ｖ_Ｌは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、軽鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特に、重鎖は定常領域をさらに含む。

【0110】

特定の実施形態において、本開示の抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ断片は、本明細書の上記の抗４－１ＢＢ抗体または抗体結合断片について開示されたＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌを含む。別の実施形態において、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、これらは、本明細書の上記の抗４－１ＢＢ抗体または抗体結合断片について開示されている。
特に、抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ断片は、配列番号２５または７７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域と、配列番号２６または７８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む。
特に、抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ断片は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域と、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む。
特に、抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ断片は、それぞれ配列番号１、２および３に示される配列からなるＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４、５および６に示される配列からなるＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含む。
特に、Ｖ_ＨとＶ_Ｌとを連結したリンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を単独でまたは組み合わせて有するリンカーなどの柔軟なリンカーである。一実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたは（ＧｌｙＳｅｒ４）ｎを含み、ここで、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６である。一実施形態において、ｎは１、２、３または４である。特定の実施形態において、リンカーは、配列番号３６、配列番号５１、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0111】

特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された重鎖可変領域Ｖ_Ｈは、
（ｉ）配列番号４６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または、
（ｉｉ）配列番号４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号４６からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸修飾はＣＤＲ領域では起こらず、より好ましくは、前記アミノ酸修飾はＦＲ領域、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で起こる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号４６に示される配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ）（ｉ）の３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されたＶ_Ｈ ＣＤＲ１は、配列番号４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１は、配列番号４０からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されたＶ_Ｈ ＣＤＲ２は、配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２は、配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されたＶ_Ｈ ＣＤＲ３は、配列番号４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、配列番号４２からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ） それぞれ配列番号４０、４１および４２に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
一実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域、好ましくはＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域またはＩｇＧ４定常領域であるかまたはそれに由来する。
別の実施形態において、重鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号３３、３４または７５に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された軽鎖可変領域Ｖ_Ｌは、
（ｉ）配列番号４７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号４７からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸修飾はＣＤＲ領域で起こらず、より好ましくは、前記アミノ酸変化はＦＲ領域、例えばＦＲ１領域、ＦＲ２領域、ＦＲ３領域またはＦＲ４領域で起こる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されている３つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号４７に示される配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ）（ｉ）の３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されたＶ_Ｌ ＣＤＲ１は、配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１は、配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されたＶ_Ｌ ＣＤＲ２は、配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２は、配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示されたＶ_Ｌ ＣＤＲ３は、配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか、または、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ３は、配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体について開示された３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ） それぞれ配列番号４３、４４および４５に示される配列からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
（ｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。
一実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトカッパ軽鎖定常領域であるかまたはそれに由来する。
別の実施形態において、軽鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号３５または６３に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＣＮ１０９０２１１０７Ａに開示されている抗体である。

【0112】

一実施形態において、本発明の二重特異性抗体におけるリンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を単独でまたは組み合わせて有するリンカーなどの柔軟なリンカーである。一実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたは（ＧｌｙＳｅｒ４）ｎを含み、ここで、ｎは、１以上の正の整数であり、例えば、ｎは、１から７までの正の整数であり、 ｎは２、３、４、５、６である。一実施形態において、ｎは１、２、３、または４、好ましくは１または３である。一実施形態において、ｎは１、２、３、または４、好ましくは１または３である。特定の実施形態において、二重特異性抗体のリンカーは、配列番号３６、５１または５２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。好ましい実施形態において、二重特異性抗体のリンカーは、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、ここで、ｎ＝１または３である。

【0113】

一実施形態において、二重特異性抗体の鎖１は、
（ｉ）少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる配列番号４８または５０に示されるアミノ酸配列との％、９８％または９９％の同一性；または
（ｉｉ）配列番号４８または５０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号４８または５０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは２０以下、より好ましくは１０または５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0114】

一実施形態において、二重特異性抗体の鎖２は、
（ｉ）配列番号４９に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉ）配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるか；または
（ｉｉｉ）配列番号４９に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下または５以下）のアミノ酸修飾（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0115】

＜保存的修飾＞

【0116】

別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾によって本開示の抗４－１ＢＢ抗体のものとは異なる、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む。当分野で理解されているように、抗原結合機能が維持されたままで特定の保存的配列修飾を行うことができる。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８、ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２、Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５、Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。

【0117】

したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／またはＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、および／またはその保存的修飾を含み；および／または
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、および／またはその保存的修飾を含み；および／または
（ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、およびその保存的修飾を含み；および／または
（ｄ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列および／またはＣＤＲ２配列および／またはＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；および／またはその保存的修飾を含み；および
（ｅ）抗体は、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する。

【0118】

別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾によって本開示の抗４－１ＢＢ抗体のものとは異なる、重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含み、好ましくは、修飾はＣＤＲで起こらず、好ましくは、修飾はＦＲで起こる。

【0119】

別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾によって本開示の抗４－１ＢＢ抗体のものとは異なる、重鎖および／または軽鎖配列を含み、好ましくは、修飾はＣＤＲで起こらず、好ましくは、修飾はＦＲで起こるかまたは定常領域で起こる。

【0120】

幾つかの実施形態において、修飾は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体の構築のために、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のＦＲに組み込まれる。例えば、修飾を、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域に組み込んで、互いにジスルフィド結合を形成し、二重特異性抗体に構築可能なｓｃＦｖの安定性を向上させることができる。

【0121】

幾つかの実施形態において、修飾は、置換、付加および／または欠失である。

【0122】

幾つかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、アミノ酸の同類の他のアミノ酸への置換、例えば、酸性アミノ酸の他の酸性アミノ酸への置換、塩基性アミノ酸の他の塩基性アミノ酸への置換、または中性アミノ酸の他の中性アミノ酸への置換を指す。次の表に、置換の例を示す：

【化1】

【0123】

本開示の抗体は、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合するなど、上述した以下の機能的特性のうちの１つ以上を有する。

【0124】

様々な実施形態において、抗体は、例えば、マウス、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体であり得る。

【0125】

本明細書において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性を顕著に影響及び変化を与えないアミノ酸修飾を指すことを意図している。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠失を含む。修飾は、部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入などの当分野で知られている標準的な技術により本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。このようにして、本発明の抗体のＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更された抗体は、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して、保持機能（即ち、上記の機能）について試験することができる。

【0126】

＜改造抗体及び修飾体＞

【0127】

本開示の抗体は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列の１つ以上を有する抗体を、修飾抗体を改造するための出発材料として用いて、調製することができる。抗体は、一方及び両方の可変領域（即ち、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ）、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより改造され得る。追加及び代替として、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を修飾することにより改造され得る。

【0128】

特定の実施形態において、ＣＤＲ移植を採用して抗体の可変領域を改造することができる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）にあるアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体－抗原相互作用の原因であるため、異なる特性を有する異なる抗体に由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然型抗体に由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３、米国特許第５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０）。

【0129】

したがって、本開示の別の実施形態は、上記のような本発明の配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／または上記のような本発明の配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。これらの抗体は本開示のモノクローナル抗体のＶ_Ｈ ＣＤＲ配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体は、異なるフレームワーク配列を含んでいてもよい。

【0130】

このようなフレームワーク配列は、公共ＤＮＡデータベース又は生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開された参考文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネット上で利用可能：ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）、及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），ｃｉｔｅｄ ｓｕｐｒａ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６から見出される。それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。他の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから見出される。例えば、以下のＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスで見出される重鎖生殖細胞系列配列は、付随のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ_－００１０１０９、ＮＴ_－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ_－－００１０１０９＆ＮＴ_－－０２４６３７）及び３－７（ＮＧ_－－００１０１０９＆ＮＴ_－－０２４６３７）で入手可能である。他の例として、以下のＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウスで見出される重鎖生殖細胞系列配列は、付随のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ_－００１０１０９、ＮＴ_－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ_－－００１０１０９＆ＮＴ_－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ_－－００１０１０９＆ＮＴ_－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３－２３（ＡＪ４０６６７８）で入手可能である。

【0131】

抗体タンパク質配列は、当業者に周知であるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴと呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），ｓｕｐｒａ）。

【0132】

本発明の抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、本発明の抗体で使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するもの。Ｖ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得る。或いは、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の例では、フレームワーク領域内の残基を変異させて抗体の抗原結合能力を維持及び強化することが有益であることが発見された（例えば、米国特許第５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０）。

【0133】

他の可変領域修飾のタイプは、内Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域のアミノ酸残基を変異させることで目的抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を向上させることである。部位特異的変異導入又はＰＣＲ媒介変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の目的機能特性に対する影響は、本明細書に記載され、実施例に提供されているインビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的修飾（当分野で知られている）が導入されるのが好ましい。変異は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ及び５つ以下の残基が変更される。

【0134】

したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、または、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１領域、（ｂ）本開示の配列、または、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２領域、（ｃ）本開示の配列、または、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３領域、（ｄ）本開示の配列、または、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１領域、（ｅ）本開示の配列、または、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２領域、および（ｆ）本開示の配列、または、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域を含む、分離された抗４－１ＢＢモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

【0135】

本発明の改造抗体は、例えば、抗体の特性を改善するためのＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌにおけるフレームワーク残基に対する修飾を含む。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る．このような残基は、前記抗体フレームワーク配列を前記抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。

【0136】

他のフレームワーク修飾のタイプは、フレームワーク領域、又は１つ以上のＣＤＲ領域における１つ以上の残基をＴ細胞エピトープが除去されるように変異させることにより、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公開第２００３０１５３０４３号に詳しく記載されている。

【0137】

フレームワーク又はＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて又はその代わりに、本発明の抗体は、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、及び／及び抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内の修飾を含むように改造されてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されてもよく（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に取り付けられてもよく）、そのグリコシル化を変更するように修飾されてもよく、又は１つ以上の抗体の機能特性を変更するように修飾されてもよい。

【0138】

一実施形態において、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更（例えば、増加又は減少）されるようにＣ_Ｈ１のヒンジ領域を修飾する。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に詳しく記載されている。Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを促進するために、及び抗体の安定性を増加若しくは減少させるために変更される。

【0139】

他の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させることにより、生物学的半減期を短縮させる。より具体的には、Ｆｃヒンジ断片のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン界面領域に１つ以上のアミノ酸変異を導入することにより、抗体は、天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下する。このアプローチは米国特許第６，１６５，７４５号に詳しく記載されている。

【0140】

さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製される（即ち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化を変更することにより、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列における１つ以上のグリコシル化部位を変更することにより達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を導入することにより、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去することで、その部位のグリコシル化を除去することができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照されたい。

【0141】

追加及び代替として、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体及び二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などのグリコシル化のタイプが変更された抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が変更された宿主細胞で発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が変更された細胞は、当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現する抗体の炭水化物がフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８^－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製された（米国特許公開第２００４０１１０７０４及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照）。他の例として、ＥＰ１，１７６，１９５には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子（フコシルトランスフェラーゼをコードする）を持つ細胞株が記載されている。このような細胞株で発現される抗体は、α－１，６結合関連酵素を減少及び除去することにより低フコシル化を示す。ＥＰ１，１７６，１９５には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を持たないＮ－アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性が低い細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）がさらに記載されている。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合する能力が低下し、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０を参照）。ＰＣＴ公開ＷＯ ０６／０８９２３１に記載されているように、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は鶏の卵でも産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、レムナなどの植物細胞で産生され得る。植物系で抗体を産生する方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されています。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように改造された細胞株が記載されている。この改造された細胞株で発現された抗体は、増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、これにより、抗体のＡＤＣＣ活性が増加する（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０を参照）。或いは、フコシダーゼ酵素により抗体のフコース残基を切り離すことができる。例えば、α－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

【0142】

本発明の抗体の他の修飾はペグ化である。抗体をペグ化することにより、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を延長することができる。抗体をペグ化するために、１つ以上のＰＥＧ基が抗体及び抗体断片に結合する条件下で、抗体及びその断片を、典型的に、ＰＥＧの反応性エステル及びアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（及び類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応及びアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－若しくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール－マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意図している。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化方法は当分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰＯ１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照されたい。

【0143】

＜抗体の物理的性質＞

【0144】

本発明の抗体は、それらの異なるクラスを検出及び／及び区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。

【0145】

例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合の変化により、抗体の免疫原性の増加、及び抗体のｐＫの変化をもたらす可能性がある（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２、Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４、Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９、Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ、Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７、Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。いくつかの例では、可変領域グリコシル化を含まない抗ＰＤ－１抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることにより達成できる。

【0146】

好ましい実施形態において、抗体にはアスパラギン異性部位が含まれない。アスパラギンの脱アミド化はＮ－Ｇ及びＤ－Ｇ配列で起こり、ポリペプチド鎖にキンクを導入し、その安定性を低下させるイソアスパラギン酸残基の生成をもたらす可能性がある（イソアスパラギン酸効果）。

【0147】

各抗体には固有の等電点（ｐＩ）があり、一般的に６～９．５のｐＨ範囲にある。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には７～９．５のｐＨ範囲内にあり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には６～８のｐＨ範囲内にある。正常範囲外のｐＩを持つ抗体は、インビボ条件下でいくらかの展開及び不安定性を有する可能性があると推測されている。したがって、正常範囲にあるｐＩ値を含む抗4-1BB抗体を有することが好ましい。これは、ｐＩが正常範囲の抗体を選択するか、又は帯電した表面残基を変異させることにより達成できる。

【0148】

＜本発明の抗体をコードする核酸分子＞

【0149】

他の態様において、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物に存在し、又は部分的に精製された形若しくは実質的に純粋な形で存在し得る。核酸は、標準技術により他の細胞成分及び他の汚染物質、例えば他の細胞核酸及びタンパク質から精製されると、「分離」されるか、又は「実質的に純粋に」なる。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

【0150】

本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに説明するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって作られた抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅及びｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体の場合（例えば、ファージディスプレイ技術を使用する）、このような抗体をコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。

【0151】

本発明の好ましい核酸分子は、４－１ＢＢモノクローナル抗体のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列またはＣＤＲをコードする核酸分子を含む。本発明の好ましい核酸分子は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列またはその各鎖をコードする核酸分子をさらに含む。Ｖ_ＨおよびＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することにより、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子、または多重特異性（二重特異性）抗体鎖遺伝子に変換することができる。これらの操作では、Ｖ_ＬまたはＶ_ＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域や柔軟なリンカーなどの、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に機能的に連結される。本明細書で使用される用語「機能的に連結される」は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持されるように２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味する。

【0152】

一実施形態において、本発明の例示的な核酸は、配列番号２５～３２、４８、５０、７７および７８のいずれかより選択されるアミノ酸配列をコードする核酸、または、配列番号２５～３２、４８、５０、７７および７８のいずれかより選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。

【0153】

別の実施形態において、本発明の核酸は、配列番号６５、６６、７３、７４、７９または８０のいずれかより選択されるヌクレオチド配列、または、配列番号６５、６６、７３、７４、７９または８０のいずれかより選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0154】

Ｖ_Ｈ領域をコードする分離されたＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域、または、変異を有する定常領域、例えば、配列番号３３、３４または７５に示される配列、または、その配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる定常領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、Ｖ_ＨコードＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に機能的に連結することができる。

【0155】

Ｖ_Ｌ領域をコードする分離されたＤＮＡは、Ｖ_ＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域Ｃ_Ｌをコードする他のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域、例えば、配列番号３５または６３に示される配列、または、その配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖定常領域であり得る。

【0156】

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬコードＤＮＡ断片を柔軟なリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_３をコードする他の断片に機能的に連結することにより、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列は、柔軟なリンカーを介してＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が結合された連続した一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４）。

【0157】

本開示の抗体の調製

【0158】

本発明は、本発明の抗体を調製するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、抗体の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップと、培養から得られた抗体構築物を回収するステップとを含む。

【0159】

本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、よく知られている体細胞ハイブリダイゼーション技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）を使用して調製することができる。モノクローナル抗体を調製するための他の実施形態には、Ｂリンパ球のウイルス及び発がん性形質転換及びファージディスプレイ技術が含まれる。キメラ抗体及びヒト化抗体も当分野で周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７、５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０号を参照されたい。それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0160】

本開示の二重特異性抗体は、二重特異性抗体のフォーマットに従って、二重特異性抗体のための周知のプラットフォームを用いて構築することができる。二重特異性抗体を生成する、当技術分野において公知のいくつかの方法があり、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および米国公開第２０１３／００７８２４９号に記載されているように、それは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0161】

＜本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの調製＞

【0162】

本発明の抗体は、例えば、組換えＤＮＡ技術と当分野で周知である遺伝子トランスフェクション方法との組み合わせにより宿主細胞トランスフェクトーマ内で産生することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られた部分及び全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に機能的に連結されるように１つ以上の発現ベクターに挿入される。本明細書において、用語「機能的に連結される」とは、ベクター内の転写及び翻訳調制御列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味する。

【0163】

用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写及び翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素（例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及び／及びエンハンサー（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマ）が含まれる。或いは、ユビキチンプロモーターやβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用してもよい。さらに、調節要素は、異なる由来源からの配列から構成され、例えば、ＳＲαプロモーターシステムは、ＳＶ４０初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列に由来する配列を含む（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。

【0164】

抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別々の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態において、可変領域を使用して、Ｖ_Ｈセグメントがベクター内のＣ_Ｈセグメントに機能的に連結され、Ｖ_Ｌセグメントがベクター内のＣ_Ｌセグメントに機能的に連結されるように、可変領域を目的のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製する。追加及び代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド及び異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。

【0165】

本発明の組換え発現ベクターは、前記抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの追加の配列を持ってもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７号）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞で使用）及びＮｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。

【0166】

軽鎖及び重鎖の発現のために、標準的な技術により発現ベクターをコードする重鎖及び軽鎖を宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」のさまざまな形態は、外因性ＤＮＡを原核生物及び真核生物の宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなど）を包含することを意図している。原核及び真核宿主細胞のいずれかで本発明の抗体を発現させることは理論的には可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。これは、このような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核細胞よりも免疫学的活性を有する適切に折りたたまれた抗体を組み立てて分泌する可能性が高いためである。

【0167】

本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択マーカー（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１）と共に使用されるｄｈｆｒ^－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０）を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８，８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。組換え発現ベクターをコードする抗体遺伝子が哺乳動物宿主細胞に導入された場合、抗体は、宿主細胞での抗体の発現、又は好ましくは宿主細胞が成長する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。標準的なタンパク質精製法により培地から抗体を回収することができる。

【0168】

＜医薬組成物＞

【0169】

別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本開示の１つ以上の抗体（またはその抗原結合部分、または二重特異性分子）を含む医薬組成物を提供する。この抗体（またはその抗原結合部分、または二重特異性分子）は、組成物が複数の抗体（またはその抗原結合部分、または二重特異性分子）を含む場合、個別に投与され得る。この組成物は、抗癌薬、抗菌薬もしくは抗喘息薬、例えば、化学療法剤、細胞毒性剤、ワクチン、その他の抗体（例えば、ＰＤ－１などの免疫チェックポイント分子に対する抗体）、抗感染剤、小分子薬剤、または免疫調節剤のような、他の抗体または薬物などの治療薬などの１つ以上の追加の薬学的有効成分を任意に含有してもよい。

【0170】

本明細書に記載の用語「治療薬」は、化学療法剤、細胞毒性剤、ワクチン、その他の抗体（例えば、免疫チェックポイント分子に対する抗体）、抗感染剤、免疫調節剤、または小分子薬剤を含む、腫瘍（癌など）の予防または治療に有効な物質を包含する。

【0171】

医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含み得る。使用できる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤及び乳化剤、固体バインダー、分散及び懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択と使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0172】

好ましくは、前記医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄及び表皮投与（例えば、注射及び注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物は、酸の作用及びそれを不活性化する可能性のある他の自然条件から保護するために材料でコーティングすることができる。本明細書で使用される「非経口投与」という用語は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内注射及び注入を含むがこれらに限定されない。或いは、本発明の抗体は、局所、表皮及び粘膜投与経路などの非腸管外経路を介して、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下及び局所的に投与することができる。

【0173】

医薬組成物は、滅菌水溶液及び分散液の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、及び高薬物濃度に適した他の秩序構造に製剤化することができます。

【0174】

担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる有効成分の量は、治療される被験体及び特定の投与経路に応じて異なり、一般的に、治療効果を奏する組成物の量である。一般的には、有効成分と薬学的に許容される担体の合計１００％に対して、有効成分の量は、約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％である。

【0175】

投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、治療状況の緊急性によって経時的に分割された用量で投与してもよいか、又は用量を比例的に減少及び増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性の観点から、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される被験体の単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬品担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与してもよく、この場合、投与頻度を減少させる必要がある。

【0176】

抗体の投与については、投与量は宿主体重の約０．０００１－１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１－５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１－１０ｍｇ／ｋｇであり得る。例示的な治療計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回及び３～６か月に１回の投与を伴う。本発明の抗４－１ＢＢ抗体の好ましい投与計画には、１ｍｇ／ｋｇ体重及び３ｍｇ／ｋｇ体重での静脈内投与が含まれ、各薬剤は、投薬計画（ｉ）４週間に１回で６回後、３か月に１回、（ｉｉ）３週間に１回及び（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回後、１ｍｇ／ｋｇ体重で３週間に１回のうちの１種により同時に与えられる。いくつの方法では、投与量は、血漿抗体濃度が約１～１０００μｇ／ｍｌ、いくつの方法では約２５～３００μｇ／ｍｌとなるように調整される。

【0177】

本発明の抗４－１ＢＢ抗体の「治療有効用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患の症状のない期間の頻度と時間の増加、又は疾患の苦痛による障害若しくは障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する被験体の治療のために、「治療有効用量」は、治療されていない被験体と比較して腫瘍の成長を、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療的化合物の治療的有効量は、被験体の腫瘍サイズを減少させるか、又は症状を改善することができる。被験体は、典型的にはヒト、他の哺乳動物であり得る。

【0178】

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ｃｏｌＬＡＧｅｎ、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

【0179】

治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４及び４，５９６，５５６号）、（２）微量注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）点滴装置（米国特許第４，４４７，２３３及び４，４４７，２２４号）、及び（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６及び４，４７５，１９６号）などの医療機器により投与することができる。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0180】

特定の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、生体内での適切な分布が確保されるように製剤化することができる。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を通過することを確保するために、リポソームに製剤化することができ、特定の細胞及び器官への選択的輸送を促進する標的化部分をさらに含んでもよい。例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８、５，４１６，０１６及び５，３９９，３３１号、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５、Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８、Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０、Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０、Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、並びにＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。

【0181】

組み合わせ品（コンビネーション製品）

【0182】

別の態様において、本開示は、本開示の１つ以上の抗体（またはその抗原結合部分、または二重特異性分子）と、抗癌薬、抗菌薬もしくは抗喘息薬、例えば、化学療法剤、細胞毒性剤、ワクチン、その他の抗体（例えばＰＤ－１などの免疫チェックポイント分子に対する抗体）、抗感染剤、小分子薬剤、または免疫調節剤のような、他の抗体または薬物などの１つ以上の追加の治療薬と、を含む組み合わせ品を提供する。

【0183】

「組み合わせ品」とは、２つ以上の治療薬を同時に単独で投与したり、時間間隔内で別々に投与したりできる、組み合わせて投与するための、投与単位形態の固定もしくは非固定の組み合わせ、またはパーツキットであり、特にこれらの時間間隔内で組み合わせパートナーがコラボレーション、例えば相乗効果を発揮できる場合に使用される。用語「固定組み合わせ」とは、本発明の抗体および組み合わせパートナー（例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤のような免疫調節剤などの他の治療薬）が、単一の実体または用量の形で同時に患者に投与されることを意味する。用語「非固定組み合わせ」とは、本発明の抗体および組み合わせパートナー（例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤のような免疫調節剤などの他の治療薬）が、同時に、一緒に、または別個の実体として連続的に患者に投与されることを意味し、そして、そのような投与が患者に対して治療的に有効なレベルの２つの化合物を提供する場合には、特定の時間制限はない。後者は、３つ以上の治療薬の投与などのカクテル療法にも適用される。好ましい実施形態において、薬物の組み合わせは非固定組み合わせである。

【0184】

用途および方法

【0185】

本発明の抗体またはその抗原結合部分、または二重特異性分子を含む組成物は、例えば、癌、感染症、および自己免疫疾患の治療を含む、インビトロおよびインビボでの多くの有用性を有する。抗体は、これらの疾患を軽減するために、例えばインビボでヒト被験者に投与することができる。

【0186】

一態様において、本発明は、被験体における免疫応答を調節する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、Ｔ細胞を活性化するか、またはＴ細胞媒介性の抗腫瘍活性を誘導する方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の態様において、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を減少させる方法を提供する。
一実施形態において、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞のサイトカイン分泌、例えば、Ｔ細胞のＩＬ－１２分泌を刺激することを含む。
一実施形態において、本発明は、４－１ＢＢシグナル伝達経路を活性化する方法を提供する。

【0187】

幾つかの実施形態において、上記の方法は、本発明の抗体または抗原結合断片、医薬組成物または製剤、組み合わせ品または核酸を投与することを含む。

【0188】

一態様において、本発明の抗体は、上記のように、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体である。
一実施形態において、本発明は、本開示の４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体、またはそれらを含む医薬組成物もしくは組み合わせ品を投与することを含む、被験体の癌を治療する方法を提供する。

【0189】

幾つかの実施形態において、癌は腫瘍免疫回避である。

【0190】

幾つかの実施形態において、癌は、固形癌および非固形癌ならびに転移性病変を含む。一実施形態において、固形癌の例として悪性腫瘍が挙げられる。一実施形態において、固形癌の例として悪性腫瘍が挙げられる。癌は、早期癌、中期癌、または進行癌もしくは転移性癌のいずれもありうる。幾つかの実施形態において、癌は、Ｔ細胞機能不全を伴う癌など、Ｔ細胞活性化を必要とする癌である。

【0191】

幾つかの実施形態において、癌は、例えば、正常な被験体または正常な細胞におけるレベルと比較して、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現レベルの増加またはＰＤ－Ｌ１をコードする核酸レベルの増加を示す。

【0192】

好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌（大腸癌）、直腸癌または結腸癌などの消化管（胃腸管）の癌の癌である。

【0193】

幾つかの実施形態において、癌の治療には、以下のようなベネフィットが得られる。
（ｉ） ＰＤ－Ｌ１核酸またはタンパク質レベルを阻害する。
（ｉｉ） ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１などの受容体への結合を遮断する。
（ｉｉｉ） ４－１ＢＢシグナル伝達経路を活性化する。
（ｉｖ） Ｔ細胞の活性化、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させ、またはＴｒｅｇ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を減少させる。
（ｖ） 上記のうちのいずれか１つ以上の組み合わせが挙げられる。

【0194】

別の態様において、本開示は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合部分、もしくは二重特異性分子を、被験体の癌、感染症または自己免疫疾患を軽減するのに有効な追加の抗体などの１つ以上の治療薬と併用投与する併用療法の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、被験体に、抗４－１ＢＢ抗体（またはその抗原結合部分、または二重特異性抗体）と、１つ以上の治療薬、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの追加の抗体とを投与することを含む、被験体の癌疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、被験体はヒトである。

【0195】

４－１ＢＢシグナル伝達の活性化は、標準的な疾患治療とさらに組み合わせて行うことができる。例えば、４－１ＢＢシグナル伝達の活性化は、上記の抗体または化学的抗癌剤の投与と組み合わせて行うことができる。

【0196】

したがって、併用療法（組み合わせ療法）は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合部分、もしくは二重特異性分子を、医薬組成物およびその組み合わせ品、ならびに他の療法のものと併用投与する組合せを含む。他の療法のものとしては、例えば、治療モダリティおよび／または他の治療薬が挙げられ、好ましくは、治療モダリティは、手術および／または放射線療法を含み、および／または他の治療薬は、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子薬剤または免疫調節剤からなる群より選択される。

【0197】

本明細書で論じられる治療薬の組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時に、または薬学的に許容される担体中の各薬剤との別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、複数の治療薬の組み合わせを順次投与することができる。

【0198】

さらに、併用療法の複数回投与を順次行う場合、各投与時点で順次投与の順序を逆にしたり、同じ順序に保ったりすることができ、順次投与は、同時投与と組み合わせることも、それらの任意の組み合わせでも可能である。

【実施例】

【0199】

本開示は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これらの実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての図およびすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

実施例
実施例１：ファージパニング、スクリーニングおよび親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）

【0200】

ファージライブラリー

【0201】

抗体一本鎖ファージディスプレイライブラリーを、軽鎖可変領域（ＶＬ）のレパートリーおよび重鎖可変領域（ＶＨ）のレパートリーをクローニングすることによって作成した。重鎖レパートリーおよび軽鎖レパートリーを、主に末梢血から採取したヒトリンパ球からのＰＣＲ増幅によって作成した。ＶＬレパートリーおよびＶＨレパートリーを混合し、オーバーラッププライマーを用いるＰＣＲにかけた。抗体の最終フォーマットは、ＶＨ断片およびＶＬ断片を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）に、可撓性のリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６））が連結したものであった。

【0202】

ヒト４－１ＢＢに対するファージライブラリーパニング

【0203】

特異的ｓｃＦｖ断片を表示するファージ粒子の選択を、Ｉｍｍｕｎｏ ９６ ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ^ＴＭプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で行った。まず、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）を、プレートに一晩、４℃でコーティングした。ＰＢＳ（２％ ＭＰＢＳ）中の２％（ｗ／ｖ）ミルクパウダーでブロックした後、約１０^１１個のファージ粒子を含むライブラリーを添加し、プレートを２時間、室温（ＲＴ、２５～２８℃）でインキュベートした。プレートを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で１０～２０回洗浄し、その後、ＰＢＳで１０～２０回洗浄することにより、結合していないファージを除去した。結合したファージを、５０μｌの１μｇ／μｌトリプシンと１０分間インキュベートした後、ｐＨ２．０の５０μｌの５０ｍＭグリシン－ＨＣｌと１０分間インキュベートすることで溶出し、すぐにｐＨ７．５の５０μｌの２００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４で中和した。４ラウンドのパニングを行った。

【0204】

ファージスクリーニング

【0205】

第３ラウンドおよび第４ラウンドのパニングから、ファージをピックアップし、ヒト４－１ＢＢ結合について試験した。具体的には、ヒト４－１ＢＢ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）を０．１μｇ／ｍＬで９６ウェルプレートにコーティングし、単一クローンファージファージをプレートに添加した。次いで、結合していないファージを洗い流し、結合したファージを抗Ｍ１３二次抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５０３７０）によって検出した。

【0206】

ＥＬＩＳＡ陽性クローンをシーケンシングし、そこから、クローン４１ＢＢ－２、４１ＢＢ－９、４１ＢＢ－１３、および４１ＢＢ－２７を含む２８つのユニークな配列を同定した。例示的な抗４－１ＢＢ抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列ＩＤ番号およびそのＣＤＲ（カバット番号付けによる定義）を、表２に示した。これらの重鎖／軽鎖可変領域配列を用いて、ヒトＩｇＧ２（配列番号３３）またはＩｇＧ１（配列番号３４）またはＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号７５）およびヒト軽鎖ラムダ定常領域（配列番号３５）を有する全抗体４１ＢＢ－２、４１ＢＢ－９、４１ＢＢ－１３および４１ＢＢ－２７を調製した。ここで、重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結されており、軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結されていた。また、抗体４１ＢＢ－２の軽鎖可変領域には、配列番号２６、Ｘ１＝Ｓのアミノ酸配列が含まれていた。

【0207】

また、４１ＢＢ－２抗体の軽鎖可変領域は、最終部位にＳからＧへの変異を有し、ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号３４）に接続されている。得られた変性４１ＢＢ－２は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する４１ＢＢ－２よりも高純度で調製できた（データは示されていない）。

【表2】

【0208】

上記の配列を有する抗体を、当技術分野で知られている一般的な方法で調製および精製する。具体的には、抗体の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造元の指示に従って使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ発現培地において１２日間培養した後、培養上清を採取し、製造元の指示に従ってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製に送った。

実施例２：例示的な抗４－１ＢＢ抗体のヒト４－１ＢＢへの結合

【0209】

ＥＬＩＳＡアッセイを行って、ヒト４－１ＢＢへの抗体の相対的結合能力を決定した。

【0210】

炭酸塩バッファーｐＨ９．６中のヒト４－１ＢＢ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）を、４℃、２５ｎｇ／ウェルで一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。段階希釈した抗４－１ＢＢ抗体およびウレルマブブコントロール（Ｕｒｅｌｕｍａｂ ｃｏｎｔｒｏｌ：配列番号３７および３８で示される重鎖および軽鎖アミノ酸配列を使用してＷＯ２００５０３５５８４に従って調製）を、それぞれ結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製し、プレート内で固定化タンパク質と３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７）とともに３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３４０２８）で１５分間発色させた後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止させた。各プレートウェルには、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。

【0211】

５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。ヒト４－１ＢＢに結合している抗体についてのＥＣ_５０値および結合曲線を図１Ａ～図１Ｄに示し、これは、抗４－１ＢＢ抗体の４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２、および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２が、ウレルマブブコントロールよりも高い結合能力でヒト４－１ＢＢに特異的に結合したことを示唆している。

実施例３：例示的な抗４－１ＢＢ抗体とＲｈｅｓｕｓ ４－１ＢＢとの交差反応があるが、ヒトＣＤ４０、ヒトＨＶＥＭ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＤ２７またはヒトＧＩＴＲとの交差反応はない

【0212】

ＥＬＩＳＡアッセイを行って、組換えヒトＣＤ４０、ヒトＨＶＥＭ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＤ２７、ヒトＧＩＴＲまたはＲｈｅｓｕｓ ４－１ＢＢに対する例示的な抗４－１ＢＢ抗体の結合活性を決定した。

【0213】

炭酸バッファーｐＨ９．６中のヒトＣＤ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０７７４－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＨＶＥＭ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０３３４－Ｈ０３Ｈ）、ヒトＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０４８１－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＣＤ２７（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００３９－Ｈ３１Ｈ）、ヒトＧＩＴＲ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１３６４３－Ｈ０８Ｈ）およびＲｈｅｓｕｓ ４－１ＢＢ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０８４７－Ｋ０８Ｈ）を、それぞれ４℃、２５ｎｇ／ウェルで一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。その後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。抗４－１ＢＢ抗体およびウレルマブを、それぞれ５００ｎｇ／ｍＬの結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製し、固定化タンパク質と３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７）とともに３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号３４０２８）で１５分間発色させた後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止させた。各プレートウェルには、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。

【0214】

４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定し、図２Ａ～２Ｂに示した。抗４－１ＢＢ抗体の４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２、および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２は、ヒトＣＤ４０、ヒトＨＶＥＭ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＤＧＩＴＲ、またはヒトＧＩＴＲに結合しなかったが、Ｒｈｅｓｕｓ ４－１ＢＢと交差反応したことがわかる。ウレルマブはこれらのタンパク質のいずれにも結合しなかった。

実施例４：例示的な抗４－１ＢＢ抗体の細胞表面４－１ＢＢへの結合およびＮＦκＢレポーター遺伝子発光シグナルの誘導

【0215】

ヒト４－１ＢＢシグナル伝達に対する例示的な抗４－１ＢＢ抗体のアゴニスト効果を、ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢレポーター遺伝子アッセイで評価した。

【0216】

実施例１では、全抗体４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ４、４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１を調製および精製した。

【0217】

４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２の全抗体を以下のように評価した。

【0218】

簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５７３）を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で維持した。ヒト４－１ＢＢ（配列番号３９で示されるＮＰ＿００１５５２．２のアミノ酸）およびｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ８４９Ａ）をコードする核酸配列を、リポフェクタミンＴＭ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、ヒト４－１ＢＢおよびＮＦ－κＢ－Ｌｕｃを安定的に発現するクローンを、限界希釈によって得た。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地において得られたＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－４－１ＢＢ細胞を、１日目に９６ウェルプレート（５００００細胞／ウェル）に播種し、ＣＯ_２インキュベーターで一晩培養した。２日目に、９６ウェルプレート上の培地を廃棄し、次いで、２倍濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００５－０９８）で前処理したかどうかにかかわらず、１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで抗４－１ＢＢ抗体またはウレルマブを段階希釈し、プレートに添加し、ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－４－１ＢＢ細胞と共培養した。該プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで６時間インキュベートした。次に、６０μＬのＯｎｅ－ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）をアッセイプレートのウェルに添加し、発光を、発光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｆ２００ Ｐｒｏ）を使用して測定した。ＥＣ_５０値を決定し、抗４－１ＢＢ抗体の代表的な曲線を図３Ａ～図３Ｇに示した。

【0219】

ヤギ抗ヒトＩｇＧは、抗４－１ＢＢ抗体のＦｃ部分と反応して、２つ以上の抗４－１ＢＢ抗体を架橋させた。抗体二量体またはポリマーの形成は、４－１ＢＢシグナル伝達に対するより良いアゴニスト効果に寄与することができる。

【0220】

結果は、４１ＢＢ－２－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ２、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ２および４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ２が、いずれも細胞表面に発現した４－１ＢＢに結合し、それに応じて、それらが架橋されているかどうかにかかわらず、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化し、ＮＦκＢレポーター遺伝子の発光発現を誘導できることを示した。しかしながら、架橋がない場合、本発明の４－１ＢＢ抗体は、ヒト４－１ＢＢシグナル伝達に対して非常に低いアゴニスト効果を有するものの、架橋を有する場合は、より高いアゴニスト効果を有する。４つの４－１ＢＢクローンのアゴニスト効果は、Ｆｃ架橋に依存している。

【0221】

全抗体４１ＢＢ－９－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ４、４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１を、以下のように検証した。

【0222】

簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５７３）を、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で維持した。ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３プラスミドおよびｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ８４９Ａ）におけるヒト４－１ＢＢ（配列番号３９で示されるＮＰ＿００１５５２．２のアミノ酸）をコードする核酸配列を、リポフェクタミンＴＭ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、ヒト４－１ＢＢおよびＮＦ－κＢ－Ｌｕｃを安定的に発現するクローンを、ピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８０２）およびハイグロマイシンでスクリーニングした後、限定希釈によって得た。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地において得られたＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞を、３８４ウェルプレート（４０μＬで２００００細胞／ウェル）に播種した。次に、２倍希釈系列で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００５－０９８）で前処理したかどうかにかかわらず、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで１０μＬ／ウェルの抗４－１ＢＢ抗体の４１ＢＢ－９－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ４、４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１、またはウレルマブ（３倍希釈系列で５０μｇ／ｍＬから開始）を段階希釈し、プレートに添加した。該プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベーション後、３０μＬのＯｎｅ－ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）をアッセイプレートのウェルに添加し、発光を、発光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｆ２００ Ｐｒｏ）を使用して測定した。その結果を、図４Ａおよび図４Ｂに示した。

【0223】

ヤギ抗ヒトＩｇＧは、抗４－１ＢＢ抗体のＦｃ部分と反応して、２つ以上の抗４－１ＢＢ抗体を架橋させた。

【0224】

結果は、架橋剤を有する場合、４１ＢＢ－２７－ＩｇＧ４以外の４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－９－ＩｇＧ１、４１ＢＢ－１３－ＩｇＧ１は、ヒト４－１ＢＢシグナル伝達を活性化し、ウレルマブに比べて非常に高いＮＦκＢレポーター遺伝子シグナルを誘導することを示した。一方、架橋剤がない場合、４つの４－１ＢＢ抗体は、ウレルマブに比べて非常に低いＮＦκＢレポーター遺伝子シグナルを誘導した。４つの４－１ＢＢクローンのアゴニスト効果は、Ｆｃ架橋に依存している。

実施例５：二重特異性抗体の発現および精製

【0225】

２つの二重特異性抗体、Ｐ４Ｂ－２およびＰ４Ｂ－３を構築した。それらの構造を図５Ｂ（Ｐ４Ｂ－２）および図５Ａ（Ｐ４Ｂ－３）に示した。
具体的には、二重特異性Ｐ４Ｂ－２を以下のように構築し、４－１ＢＢ抗体の２つのｓｃＦｖｓを、全ＰＤ－Ｌ１抗体の２つの重鎖のＮ末端にそれぞれ連結し、
４－１ＢＢ抗体からのＶ_Ｈ（抗４－１ＢＢのＶ_Ｈ）－リンカー－４－１ＢＢ抗体からのＶ_Ｌ（抗４－１ＢＢのＶ_Ｌ）－ＰＤ－Ｌ１抗体からのリンカー－Ｖ_Ｈ（抗ＰＤ－Ｌ１のＶ_Ｈ）－重鎖定常領域である、
Ｎ末端からＣ末端までからなる重鎖と、
ＰＤ－Ｌ１抗体からの軽鎖（抗ＰＤＬ１の軽鎖、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖定常領域のＶ_Ｌ）と、を含む二重特異性抗体を構築する。
二重特異性Ｐ４Ｂ－３を以下のように構築し、４－１ＢＢ抗体の２つのｓｃＦｖを、全ＰＤ－Ｌ１抗体の２つの重鎖のＣ末端にそれぞれ連結し、
ＰＤ－Ｌ１抗体からのＶ_Ｈ（抗ＰＤ－Ｌ１のＶ_Ｈ）－重鎖定常領域－リンカー－４－１ＢＢ抗体からのＶ_Ｈ（抗４－１ＢＢ Ｖ_Ｈ）－リンカー－４－１ＢＢ抗体からのＶ_Ｌ（抗４－１ＢＢのＶ_Ｌ）である、Ｎ末端からＣ末端までからなる重鎖と、
ＰＤ－Ｌ１抗体からの軽鎖（抗ＰＤＬ１の軽鎖、すなわち抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖定常領域のＶ_Ｌ）と、を含む二重特異性抗体を構築する。

【0226】

二重特異性抗体およびコントロールをコードするヌクレオチドを、遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）により生成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。それぞれ、軽鎖可変領域をコードする核酸を、軽鎖定常領域をコードする核酸を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して、抗体の軽鎖を発現するベクターを構築し、重鎖可変領域をコードする核酸を、重鎖定常領域をコードする核酸を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して、抗体の重鎖を発現するベクターを構築する。得られたベクターを、製造元の指示に従ってＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ２９１３３）を使用して、モル比１：１でＣＨＯ－Ｓ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地で１２日間培養した後、培養上清を採取し、製造元の指示に従ってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア）で精製した。

【0227】

異なる領域のアミノ酸配列および核酸配列を表３に示す。

【表3】

実施例６：ヒトＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢタンパク質に結合する抗体

【0228】

ヒトＰＤ－Ｌ１、Ｈｉｓタグタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２２９）を、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で、４℃で一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレート（Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｘｉｎｙｏｕ、カタログ番号１０００９６Ｈ）に固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。２ｎＭから０．００３ｎＭまで段階希釈したＰ４Ｂ－２、Ｐ４Ｂ－３およびネガティブコントロールＩｇＧ（重鎖：配列番号８２；軽鎖：配列番号８３）を、希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で調製し、上記の固定化タンパク質と３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、希釈バッファー中に１／２００００特異的に希釈したペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）とともに３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで再度洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８）をプレートに加えて、反応を開始した。１５分後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。抗体のヒトＰＤ－Ｌ１への結合に対するＥＣ_５０および代表的な結合曲線を、図６に示した。

【0229】

結果は、２つの抗体Ｐ４Ｂ－２とＰ４Ｂ－３が両方とも、それぞれ０．０２３９５ｎＭと０．０２８８７ｎＭのＥＣ_５０でヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合できることを示した。

【0230】

ヒト４－１ＢＢ、ヒトＦｃタグタンパク質（配列番号８１、Ｈｕ４－１ＢＢ－ｈＦｃ）を、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で、４℃で一晩インキュベートすることにより、９６ウェルプレート（Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｘｉｎｙｏｕ、カタログ番号１０００９６Ｈ）に固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。６．６５ｎＭから０．００９ｎＭまで段階希釈したＰ４Ｂ－２、Ｐ４Ｂ－３およびネガティブコントロールＩｇＧ（重鎖：配列番号８２；軽鎖：配列番号８３）を、希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で調製し、固定化タンパク質Ｈｕ４－１ＢＢ－ｈＦｃと３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、希釈バッファー中に１／１００００特異的に希釈したペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７）とともに３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで再度洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８）をプレートに加えて、反応を開始した。１０分後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。クローンのヒト４－１ＢＢへの結合に対するＥＣ_５０および代表的な結合曲線を、図７に示した。

【0231】

結果は、２つの抗体Ｐ４Ｂ－２とＰ４Ｂ－３が両方とも、それぞれ０．１１２６ｎＭと０．０７２３４ｎＭのＥＣ_５０でヒト４－１ＢＢタンパク質に結合できることを示した

【0232】

したがって、２つの二重特異性抗体Ｐ４Ｂ２およびＰ４Ｂ３は、ＥＣ_５０が低く、ヒトＰＤ－Ｌ１およびヒト４－１ＢＢタンパク質の両方に結合できる。

実施例７：結合親和性
ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合親和性

【0233】

ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２２９）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０２５１－Ｃ０８Ｈ）に対するＰ４Ｂ－３抗体の動態結合活性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によって測定した。

【0234】

Ｐ４Ｂ－３抗体を、事前に平衡化された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０６０）にコーティングした。ヒトＰＤ－Ｌ１（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２２９）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０２５１－Ｃ０８Ｈ）タンパク質を分析物として使用し、抗体により捕捉した。データセットは、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを使用して１：１結合モデルに適合した。

【0235】

表４は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する本発明のＰ４Ｂ－３の二重特異性抗体の親和性を要約したものである。

【表4】

【0236】

結果は、抗体Ｐ４Ｂ－３が、それぞれ０．２９ｎＭと０．０６１ｎＭのＫ_ＤでヒトＰＤ－Ｌ１とカニクイザルＰＤ－Ｌ１の両方に特異的に結合することを示唆した。

４－１ＢＢタンパク質への結合親和性

【0237】

ヒト４－１ＢＢタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）に対するＰ４Ｂ－３抗体の動態結合活性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によって測定した。

【0238】

抗４－１ＢＢ抗体を、事前に平衡化された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０６０）にコーティングした。ヒト４－１ＢＢ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）を分析物として使用し、抗体により捕捉した。データセットは、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを使用して１：１結合モデルに適合した。

【0239】

表５はヒト４－１ＢＢタンパク質に対する抗ヒト４－１ＢＢ抗体の親和性をまとめたものである。

【表5】

【0240】

結果は、抗体Ｐ４Ｂ－３が、１．４６Ｅ－７ＭのＥＣ_５０でヒト４－１ＢＢタンパク質に結合できることを示唆した。

実施例8：ＨＥＫ２９３－４－１ＢＢ／ＮＦκＢ系におけるＰ４Ｂ－３の４－１ＢＢレポーター遺伝子アッセイ

【0241】

Ｐ４Ｂ－３二重特異性抗体の活性化を、ＰＤ－Ｌ１依存性４－１ＢＢレポーター遺伝子システムで評価した。ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞株、Ａ３７５－ＰＤ－Ｌ１標的細胞株およびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ－１細胞株は、Ｌｅａｄｓｂｉｏｌａｂｓ社によって開発された。

【0242】

ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞株は、段落［００２２２］、実施例４に記載の手順に従って得られる。

【0243】

Ａ３７５（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＣＳＰ－５３３）親細胞株を、リポフェクタミンＴＭ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を用いて、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（配列番号６２；配列番号６１のアミノ酸配列をコードする）でトランスフェクトした。Ａ３７５－ＰＤ－Ｌ１細胞を得るためにピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８０２）でスクリーニングした後、安定な単一細胞クローン高発現ヒトＰＤ－Ｌ１を選択した。

【0244】

ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ カタログ番号ＣＣＬ－６１）親細胞株を、リポフェクタミンＴＭ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を用いて、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（配列番号６２：配列番号６１のアミノ酸配列をコードする）でトランスフェクトした。ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ１細胞を得るためにピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８０２）でスクリーニングした後、安定な単一細胞クローン高発現ヒトＰＤ－Ｌ１を選択した。

【0245】

ルシフェラーゼの発現は、４－１ＢＢの活性と直接相関している。

【0246】

ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞とＡ３７５－ＰＤ－Ｌ１細胞を採取し、それぞれアッセイバッファー（１０ｎＭ，４希釈から始まるＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ）で適切な細胞密度に希釈し、ＨＥＫ２９３－４－１ＢＢ／ＮＦκΒ細胞の密度が４００００細胞／６０μＬ、Ａ３７５－ＰＤ－Ｌ１細胞の密度が２００００細胞／６０μＬとなるように、２つの細胞を混合した。６０μＬ／ウェルの混合物を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）に添加した。標的細胞非依存性刺激を試験する平行アッセイでは、ＨＥＫ２９３－ＮＦκΒ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞のみを別の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）に加えた。

【0247】

その後、得られたプレートに、６０μＬ／ウェルの段階希釈された試験サンプルＰ４Ｂ－３およびＩＮＢＲＸ－１０５－１（ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体、配列番号８４、ＵＳ２０１７０１９８０５０Ａ１）（２００ｎＭから開始、５倍希釈系列、９濃度）を加えた。３７℃のインキュベーターで６時間インキュベートした後、６０μＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬をプレートに添加した。相対発光単位をルミノメーター（Ｔｅｃａｎ、カタログ番号Ｆ２００）で測定した。

【0248】

図９Ａ～図９Ｂは、ＰＤ－Ｌ１なしで４－１ＢＢ刺激を誘発する、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢの二重特異性抗体（Ｐ４Ｂ－３およびＩＮＢＲＸ－１０５－１）の能力を示している。Ｐ４Ｂ－３はＰＤ－Ｌ１なしで４－１ＢＢシグナル経路を刺激できなかったが、ＩＮＢＲＸ－１０５－１コントロールは高いアッセイ濃度でシグナル経路を刺激できた（図９Ｂ）。

【0249】

ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞とＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１細胞を採取し、それぞれアッセイバッファー（ＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ）を用いて適切な細胞密度に希釈し、これら２つの細胞を混合した。この場合、ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢ細胞の密度は４００００細胞／６０μＬであり、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１細胞の密度は２００００細胞／６０μＬであった。６０μＬ／ウェルの混合物を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）に添加した。

【0250】

その後、得られたプレートに、６０μＬ／ウェルの段階希釈された試験サンプルＰ４Ｂ－３およびＮＭ２１－ＰＲＯ１１８６（ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体、ＷＯ２０１９０７２８６８Ａ１）（２００ｎＭから開始、５倍希釈系列、９濃度）を加えた。３７℃のインキュベーターで６時間インキュベーションした後、６０μＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬を添加した。相対発光単位をルミノメーター（Ｔｅｃａｎ、カタログ番号Ｆ２００）で測定した。

【0251】

図８は、ＰＤ－Ｌ１－結合依存性の４－１ＢＢ刺激を誘発する、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢの二重特異性抗体（Ｐ４Ｂ－３およびＮＭ２１－ＰＲＯ１１８６）の能力を示している。その結果、Ｐ４Ｂ－３とＮＭ２１－ＰＲＯ１１８６の両方がＰＤ－Ｌ１の存在下で４－１ＢＢシグナル経路を刺激でき、すなわち、ＰＤ－Ｌ１への結合に依存することを示した。それらのアゴニスト活性は比較可能である。これらの結果は、ＨＥＫ２９３－ＮＦκΒ－Ｌｕｃ－ヒト４－１ＢＢレポーター遺伝子におけるＰ４Ｂ－３の活性化能力は、ＰＤ－Ｌ１への結合に厳密に依存することを示した。

実施例９：インビトロヒトＰＢＭＣ細胞の活性化

【0252】

健康なドナーからヒト末梢血単核細胞を採取した。ＳｅｐＭａｔｅ ５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｎｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む単核細胞を分離した。どちらの細胞も後で使用するために液体窒素で凍結された。

【0253】

９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３７９９）を、４℃で０．２μｇ／ｍＬの機能グレードの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５）で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートをＤＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄した。

【0254】

ＰＢＭＣ細胞（Ｄｏｎｏｒ７１２０２３）を３７℃の水浴で急速に解凍し、細胞懸濁液を温かい完全培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２２４００）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１））を含むチューブに移した。その後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ＰＢＭＣ細胞を完全培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ）で再懸濁し、１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。

【0255】

標的細胞Ｒａｊｉ／ＰＤ－Ｌ１を以下のように調製した。Ｒａｊｉ親細胞株（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＴＣＨｕ４４）は、レンチウイルスシステム（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａＴＭ、カタログ番号ＬＴ００１）にパッケージされたヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（配列番号６２；配列番号６１のアミノ酸配列をコードする）に感染した。Ｒａｊｉ／ＰＤ－Ｌ１細胞を得るために、ピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８０２）でスクリーニングした後、安定な単一細胞クローン高発現ヒトＰＤ－Ｌを選択した。

【0256】

インキュベーション後、標的細胞Ｒａｊｉ／ＰＤ－Ｌ１を３００ｇで５分間の遠心分離により採取した。上清を捨て、標的細胞を完全培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ）において１×１０^６細胞／ｍＬまで穏やかに懸濁した。実施例１で調製した抗体Ｐ４Ｂ－３、抗ＰＤ－Ｌ１（ＣＮ１０９０２１１０７ＡからのＨＵＬ０２）、４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１、抗ＰＤ－Ｌ１＋４１ＢＢ－２（比率１：１）、およびヒトＩｇＧ陰性コントロール（重鎖配列番号８２、軽鎖配列番号８３）を段階希釈して、試験サンプル溶液（最終濃度０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、および５０ｎＭ）を調製した。

【0257】

次に、コーティングされた９６ウェルアッセイプレートに５０，０００細胞／ウェルのＲａｊｉ／ＰＤ－Ｌ１を添加し、各テストサンプル溶液の５０μＬ／ウェルを添加した後、１００，０００細胞／ウェルのＰＢＭＣを完全培地に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベーションした後、細胞上清を採取し、培養上清中のヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）レベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２０２）を使用して製造元の指示に従って定量した。その結果を図１０に示した。

【0258】

結果は、Ｐ４Ｂ－３がＰＢＭＣ細胞を用量依存的に刺激し、抗ＰＤ－Ｌ１単独、抗４－１ＢＢ（４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１ｍｕｔ）単独、または抗ＰＤ－Ｌ１と抗４－１ＢＢの併用よりも高いレベルのＩＬ－２を放出することを示した。

実施例１０：ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１を有するｈｕＰＤ－Ｌ１／ｈｕ４－１ＢＢ ＫＩマウスモデルにおけるＰ４Ｂ－３の抗腫瘍効果

【0259】

６～７週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｈｕＰＤ－Ｌ１／ｈｕ４－１ＢＢダブルノックインマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を５×１０^５ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）で皮下移植し、０日目に平均腫瘍体積が約８７ｍｍ^３（長さ×幅^２／２）に達した時点で４群にランダム化した。

【0260】

０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１５日目には、マウスにＰ４Ｂ－３、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＣＮ１０９０２１１０７ＡのＨＵＬ０２）、４１ＢＢ－２－ＩｇＧ１、およびビヒクル（ＰＢＳ）をそれぞれ腹腔内投与した。研究期間中、週２回のキャリパー測定により腫瘍体積をモニタリングした。

【0261】

ビヒクル群と比較して、Ｐ４Ｂ－３は非常に有意な腫瘍抑制効果（Ｐ＜０．００１）を示し、腫瘍体積のＴＧＩ（腫瘍増殖阻害）＝８１．８％であり、抗ＰＤ－Ｌ１群（ＴＧＩｔｖ＝７０．５％）および抗４－１ＢＢ群（ＴＧＩｔｖ＝４６．１％）よりも高かった。Ｐ４Ｂ－３の平均腫瘍重量もビヒクル群よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。

【0262】

最終的に、ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を腫瘍から分離し、さまざまな細胞マーカー抗体（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０^ＴＭ抗－マウスＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号１０３１３８）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ 抗－マウスＴＣＲ β ｃｈａｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号１０９２２８）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１^ＴＭ抗－マウスＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号１００４３８）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１^ＴＭ抗－マウスＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号１００７４８）、ＰＥ抗マウス／ラットＦｏｘｐ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号１２－５７７３－８２））で染色し、次いで、ＦＡＣＳにより検出した。

【0263】

ビヒクル群および抗ＰＤ－Ｌ１群と比較して、Ｐ４Ｂ－３群のＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は有意に高かった（Ｐ＜０．０５）が、ＣＤ３＋細胞のＴｒｅｇ細胞の比率は有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。

【0264】

結果は、図１１、図１２および図１３に示した。これらの結果は、ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞を有するＢＡＬＢ／ｃ－ｈｕＰＤ－Ｌ１／ｈｕ４－１ＢＢ ＫＩマウスモデルにおいて、Ｐ４Ｂ－３が強力な抗腫瘍効果を示したことを示した。さらに、Ｐ４Ｂ－３は、ＣＤ８＋比を上昇させ、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ比を低下させることもできた。

【表6】

実施例１１：ラットにおけるＰ４Ｂ－３の薬物動態試験

【0265】

ラットにおけるＰ４Ｂ－３の薬物動態プロファイルを評価した。試験における動物のケアと使用を含む手順は、ＰｈａｍａＬａｇａｎｃｙによってレビューされ承認された。３匹の雄ＳＤラット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ－ＢＫ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いた。

【0266】

この試験では、Ｐ４Ｂ－３をラットに１０ｍｇ／ｋｇの単回投与で静脈内注射した。血液サンプルは、０～３３６時間（０～１４日）の様々な時点で、特に０日目０分、１０分、３０分、１時間、４時間、８時間、１日目、２日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目に採血を行い、すべてのサンプルを処理して血漿を採取し、血漿を－７０～－８６℃で凍結保存して分析した。血漿中に存在するＰ４Ｂ－３の濃度は、ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢ抗原捕捉アッセイによって決定された。薬物動態パラメータを表７に示した。

【0267】

４－１ＢＢ抗原捕捉アッセイ：ヒト４－１ＢＢ、ヒトＦｃタグタンパク質（Ｈｕ４－１ＢＢ－ｈｕＦｃ、配列番号８１）を、０．５μｇ／ｍＬの９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号４２５９２）上に、４℃で一晩、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中でインキュベートすることにより固定化した。その後、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）中の１％ＢＳＡ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ａ５０００２３－００２５）と３７℃で１時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。Ｐ４Ｂ－３を血清希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０と、２％ｖ／ｖラット血清を有する０．５％ＢＳＡとを含むＰＢＳ）中に０．１μｇ／ｍＬで希釈し、３倍段階希釈６回、計７濃度の抗体溶液を標準曲線とした。同時に、高、中、低品質管理としてそれぞれ８０ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬおよび０．８ｎｇ／ｍＬのＰ４Ｂ３を血清希釈バッファーで希釈した。すべてのラット血清サンプルを、投与前の混合ラット血清と希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で希釈し、最終濃度を８０～０．８ｎｇ／ｍＬの範囲に保ち、サンプル希釈中に２％ｖ／ｖのラット血清を含めた。標準曲線、品質管理およびサンプルをプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、希釈バッファー中に１／１００００特異的に希釈したペルオキシダーゼアフィニピュアヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７）とともに３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで再度洗浄した。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８）をプレートに加え、１５分後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。

【0268】

ＰＤ－Ｌ１抗原捕捉アッセイ：ヒトＰＤ－Ｌ１、Ｈｉｓタグタンパク質（ｈｕＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ、ＡＣＲＯ、カタログ番号１００８４－Ｈ０８Ｈ）を、０．５μｇ／ｍＬの９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号４２５９２）上に、４℃で一晩、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中でインキュベートすることにより固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。Ｐ４Ｂ－３を血清希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０と、２％ｖ／ｖラット血清を有する０．５％ＢＳＡとを含むＰＢＳ）中に０．１μｇ／ｍＬで希釈し、３倍段階希釈６回、計７濃度の抗体溶液を標準曲線とした。同時に、高、中、低品質管理としてそれぞれ８０ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬおよび０．８ｎｇ／ｍＬのＰ４Ｂ３を血清希釈バッファーで希釈した。すべてのラット血清サンプルを、投与前の混合ラット血清と希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で希釈し、最終濃度を８０～０．８ｎｇ／ｍＬの範囲に保ち、サンプル希釈中に２％ｖ／ｖのラット血清を含めた。標準曲線、品質管理およびサンプルをプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、希釈バッファー中に１／２００００特異的に希釈したペルオキシダーゼアフィニピュアヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）とともに３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで再度洗浄した。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８）をプレートに加え、１５分後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。

【表7】

【0269】

Ｐ４Ｂ－３の薬物動態はラットで良好に行われ、医薬品分野で使用できることを示している。

【0270】

本開示は、１つ以上の実施形態に関連して上記で説明されてきたが、本開示はそれらの実施形態に限定されず、説明は、添付の特許請求項の精神と範囲内に含まれる、すべての選択肢、修正および均等物をカバーすることを意図していることを理解すべきであろう。本明細書で引用されているすべての参照文献は、参照によりその全体がさらに組み込まれる。

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【表8-4】

【表8-5】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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