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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-13
(45)【発行日】2025-02-21
(54)【発明の名称】乳癌の検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20250214BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20250214BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20250214BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20250214BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20250214BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20250214BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20250214BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20250214BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20250214BHJP
C07K 14/82 20060101ALN20250214BHJP
C07K 14/765 20060101ALN20250214BHJP
C07K 16/32 20060101ALN20250214BHJP
C07K 14/79 20060101ALN20250214BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 M
G01N33/68
C12Q1/6886 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12N15/12
A61P35/00
A61K31/337
A61K31/704
C12Q1/6851 Z
C12Q1/04
C07K14/47
C07K14/82
C07K14/765
C07K16/32
C07K14/79
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021572041
(86)(22)【出願日】2020-06-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(86)【国際出願番号】 GB2020051352
(87)【国際公開番号】W WO2020245590
(87)【国際公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-05-29
(31)【優先権主張番号】1907999.5
(32)【優先日】2019-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】598176569
【氏名又は名称】キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カレド ワリド ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ペンサ サラ
(72)【発明者】
【氏名】バッハ カルステン
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０７３０４７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Pensa, Sara，Bcl11a Marks Mammary Progenitor Cells and Promotes Early Cellular Changes Associated with TNBC by Recruiting Chd8，SSRN Electronic Journal，2018年08月02日，pp.1-44，http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3224558
【文献】Umekita, Yoshihisa，Gene expression profile of terminal end buds in rat mammary glands exposed to diethylstilbestrol in neonatal period，Toxicology Letters，2011年08月10日，205(1)，pp.15-25，https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2011.04.031.
【文献】Bach, Karsten，Differentiation dynamics of mammary epithelial cells revealed by single-cell RNA sequencing，Nat Commun.，2017年12月11日，8(1):2128，pp.1-11，https://doi.org/10.1038/s41467-017-02001-5
【文献】Sauter, Edward R.，Identification of a β-casein-like peptide in breast nipple aspirate fluid that is associated with breast cancer，Biomarkers Med.，2009年10月08日，3(5)，pp.577-588，https://doi.org/10.2217/bmm.09.46
【文献】Lazarus, Kyren，Abstract PR01: Understanding the role of BCL11A in triple-negative breast cancer，Mol Cancer Res，2016年02月29日，14 (2_Supplement): PR01.，pp.1，https://doi.org/10.1158/1557-3125.ADVBC15-PR01
【文献】Khaled, W.，BCL11A is a triple-negative breast cancer gene with critical functions in stem and progenitor cells，Nat Commun.，2015年01月09日，6:5987，pp.1-10，https://doi.org/10.1038/ncomms6987
【文献】Roberts, K.，Proteomic analysis of selected prognostic factors of breast cancer，Proteomics，2004年02月19日，4(3)，pp.784-792，https://doi.org/10.1002/pmic.200300633
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法であって、前記方法が、前記対象の乳房からの材料のサンプルを分析して、異常に分化した細胞に関連する種が該サンプルに存在するかどうかを決定することにより異常に分化した管腔前駆細胞が乳房に存在するかどうかを決定することを含み、前記異常に分化した細胞に関連する種の存在は、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものであり、前記異常に分化した細胞に関連する種は、ベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）、ベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）をコードするＤＮＡ分子、ベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）をコードするＲＮＡ分子、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）をコードするＤＮＡ分子、及び乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）をコードするＲＮＡ分子の一種以上である、方法。
【請求項2】
前記対象の乳房からの材料のサンプルを分析する工程が、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析法から選択される１つ又は複数の技術を使用して、前記サンプル中にタンパク質の存在を決定するか、並びに／あるいは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）及びＤＮＡ配列決定（ＤＮＡｓｅｑ）から選択される１つ又は複数の技術を使用して、前記サンプル中のＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子の存在を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対象の乳房からの材料のサンプルが、前記対象の乳房の乳首から、あるいは外科手術又は生検から得られている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記対象の乳房からの材料のサンプルが、乳房ポンプ及び／又は針を介して得られたサンプルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記対象の乳房からの材料のサンプルが、前記対象から採取された血液のサンプルから得られるか、又は、前記対象の前記乳房から発現した流体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、前記対象の乳房を分析して、胞構造が前記対象の乳房に存在するかどうかを決定することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記方法が、前記対象の乳房に異常な組織が存在するかどうかを決定するために前記対象の乳房を走査及び／又は画像化することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記対象の乳房が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、マンモグラフィ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、及び／又はコントラスト画像化から選択される１つ又は複数の技術を使用して、走査及び／又は画像化される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記方法が、前記対象の乳房から得られた材料のサンプルを分析して、異常に分化した細胞に関連する更なる種が該サンプル中に存在するかどうかを決定することを更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記異常に分化した細胞に関連する前記更なる種が、ＢＣＬ１１ＡからのＤＮＡ又はＲＮＡ、或いはＢＣＬ１１Ａから発現される任意のタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記対象が、トリプルネガティブ乳癌を発症するリスクがあると特定された対象である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記対象が、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異を有するか、あるいは乳癌の家族歴を有するか、あるいは相同組換え修復欠損である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記対象が妊娠していない対象である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態の発症をモニタリングするための方法、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングするための方法であって、前記方法が、所定の時間間隔によって分離された２つ以上の時点で、請求項１～１３のいずれか一項に記載された方法を実行することを含む、方法。
【請求項15】
乳癌又は乳癌に関連する前癌状態の治療のための化学療法剤であって、前記治療の対象が、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法によって、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する高い可能性有すると決定されていることを特徴とし、前記化学療法剤が、タモキシフェン、アリミデックス（登録商標）（アナストロゾール）、アロマシン（登録商標）（エキセメスタン）、フェマーラ（登録商標）（レトロゾール）、フェソロデックス（登録商標）（フルベストラント）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、タイケルブ（登録商標）ラパチニブ）、アントラサイクリン、又はタキサンである、化学療法剤。
【請求項16】
前記化学療法剤が、アントラサイクリン又はタキサンを含み、アントラサイクリンがドキソルビシン又はエピルビシンであり、タキサンがドコタキセル又はパクリタキセルである、請求項１５に記載の化学療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法に関する。本発明はまた、対象において乳癌の治療が必要であるかどうかを決定する方法、及び当該治療を必要とする対象の治療で使用するための化学療法剤に関する。
【背景技術】
【0002】
乳癌は、女性で診断される最も一般的な悪性腫瘍である。英国では、毎年約５５，０００名の女性が乳癌と診断されており、英国では毎年約１１，０００名が乳癌で死亡していると報告されている。
【0003】
乳癌は、いくつかのサブタイプで構成される異質性疾患（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）である。乳癌の分類には、典型的には、免疫組織学的方法を使用して、乳癌の発症に関連するいくつかの重要なホルモン受容体の発現レベルを決定することが含まれる。分析されたホルモン受容体のうち、最も注目すべき３つの受容体は、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、及びヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である。ＰｇＲ及びＥＲを発現し、またＨＥＲ２の過剰発現レベルを有する乳癌患者は、例えば、これらの重要なホルモン受容体のうちの１つ又は複数を特異的に標的とする化学療法剤（例えば、タモキシフェン、アリミデックス（商標）（アナストロゾール）、アロマシン（商標）（エキセメスタン）、フェマーラ（商標）（レトロゾール）、フェソロデックス（商標）（フルベストラント）、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、タイケルブ（商標）ラパチニブ））の投与等のホルモン療法に良好に応答する可能性がより高いという事実により、典型的には良好な臨床転帰を示す。
【0004】
全ての乳癌の１５％～２０％を占める、乳癌の最も侵襲性のサブタイプの１つは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。ＴＮＢＣは、ＥＲ、ＰｇＲのタンパク質発現の欠如、及びＨＥＲ２タンパク質の過剰発現の不存在によって分類される乳癌の一種である。ＰｇＲ、ＥＲ、及びＨＥＲ２が存在しない場合、ＴＮＢＣ腫瘍は標準的なホルモン療法治療レジメンにも反応しないため、したがって、ＴＮＢＣは通常、予後不良、低生存率、及び腫瘍の高再発率に関連する。しかし、早期に診断された場合、ＴＮＢＣは、手術、放射線療法、及び一部の化学療法剤による治療に成功する可能性があり、選択的乳房切除術及び／又は予防的化学療法を使用して、更に管理又は予防することができる。
【0005】
乳癌患者、特にＴＮＢＣ患者の予後は、乳癌が早期に発見されれば大幅に改善される。したがって、乳癌を検出するための、特にＴＮＢＣのリスクのある女性の乳癌の初期の発症を検出するための、簡単で費用対効果の高い方法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0006】
本発明の第１の態様によれば、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法が提供され、当該方法は、対象の乳房を分析して、乳房に異常に分化した管腔前駆細胞が存在するかどうかを決定することを含み、乳房内の異常に分化した細胞の存在は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである。
【0007】
適切には、異常に分化した管腔前駆細胞は、異常に分化して胞構造（例えば、対象の乳房における乳汁形成構造）を形成する細胞である。
【0008】
本発明の第２の態様によれば、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有するかどうかを決定する方法が提供され、当該方法は、対象の乳房を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞及び／又は胞構造が乳房に存在するかどうかを決定することを含み、乳房における異常に分化した細胞及び／又は胞構造の存在は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有することを示すものである。
【0009】
本発明の第３の態様によれば、対象の乳癌を治療する方法が提供され、当該方法は、
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に標準的な乳癌治療レジメンを投与する工程と、とを含む。
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に標準的な乳癌治療レジメンを投与する工程と、とを含む。
【0010】
本発明の第４の態様によれば、対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態の発症をモニタリングする方法、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングする方法が提供され、当該方法は、所定の時間間隔で隔てられた２つ以上の時点で、本明細書で定義される方法を使用して、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価することを含む。
【0011】
本発明の第５の態様によれば、当該治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤が提供され、治療は、
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に化学療法剤を投与する工程と、を含む。
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に化学療法剤を投与する工程と、を含む。
【0012】
本発明の第６の態様によれば、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法が提供され、当該方法は、対象の乳房から得られた材料のサンプルを分析して、ベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）が存在するかどうかを決定することを含み、対象の乳房から得られた材料のサンプル中のベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）の存在は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである。
【0013】
対象が乳癌を有する可能性の評価が高レベルの確実性で行われる場合、本発明の方法は、対象が乳癌を有するかどうかを決定する方法である。
【0014】
したがって、好ましい実施形態では、対象が乳癌を有する可能性を評価する方法は、対象が乳癌を有するかどうかを決定する方法である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１のＡ）は、ＦＡＣＳによって決定されるように、標識後８週間（８ｗ）及び妊娠１４．５日（１４．５ｄＧ）における、Ｂｃｌ１１ａ標識マウス（例えば、タモキシフェン（ＴＡＭ）を投与したマウス）から回収した乳腺の管腔（左）又は基底（右）コンパートメント内の細胞の割合を示し、データは平均±ＳＤとして表され、対応のないｔ検定が実行された（＊はＰ＜０．０５を示す）。Ｂ）は、乳腺上皮構造のオーバービュー（上２パネル）及び代表的なＺ－スライス（下２パネル）として示され、表されるように、ＥｐＣＡＭ又はＫ５で免疫染色されたＣＵＢＩＣ透明化全腺のｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ細胞の共焦点３Ｄ画像である（スケールバー、１００μｍ）。
【図2】図２のＡ）は、Ｂｃｌ１１ａ標識の誘導後にマウスにおいてＴＮＢＣ腫瘍を誘導するために使用されるＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコルの概略図であり、Ｂ）は、乳腺上皮構造の代表的なＺ－スライスとして示され、表されるように、ＥｐＣＡＭ又は平滑筋アクチン（ＳＭＡ）で免疫染色されたＣＵＢＩＣ透明化全腺のｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ細胞の共焦点３Ｄ画像である（スケールバー、１００μｍ）。
【図3】図３は、Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（Ｂｃｌ１１ａ＋／＋又はｆ／＋）（ｎ＝１４）及びＢｃｌ１１ａｆ／ｆ；Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（ｎ＝６）の腫瘍を有さない生存を示すカプラン・マイヤー生存プロットを示す。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－ｃｏｘ）検定を実行した（ｐ＝０．０００１７）。
【図4】図４は、ＦＡＣＳによって分離され、ドロップレットベースのｓｃＲＮＡｓｅｑを経た、Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（左パネル）及びＢｃｌ１１ａｆ／ｆ；Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（右パネル）のマウスからの乳腺上皮細胞を表すｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を示す。細胞は、推測された細胞型に基づいて色付けされる。
【図5】図５は、様々な年齢からの、バージン対照、ＢＣＬ１１Ａｏｖｘ；ＭＭＴＶ－Ｃｒｅ、ＢＣＬ１１Ａｏｖｘ；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ、Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ及びＢｃｌ１１ａｆ／ｆ；Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅマウスの代表的な乳腺ホールマウントを示す。
【図6】図６のＡ）は、ＩＨＣによって測定された、ＢＲＣＡ１変異キャリア及び非ＢＲＣＡ１キャリア（正常）におけるＣＳＮ２の平均タンパク質発現を表すグラフを示し、Ｂ）は、ｑＰＣＲによって測定された、ＢＲＣＡ１変異キャリア及び非ＢＲＣＡ１キャリア（正常）におけるＣＳＮ２の平均ＲＮＡ発現を表すグラフを示す。
【図7】図７のＡ）は、成熟期に低用量のタモキシフェンを単回腹腔内注射することによるＢｃｌ１１ａ標識の誘導から７週間後、マウスをＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコルを受けさせて、ＴＮＢＣ腫瘍を誘導し、１１週間後にサンプルを採取した概略図を示す。Ｂ）は、ＲＦＰ（ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞を検出するため）及びＤＡＰＩで免疫染色された乳腺切片のタイルスキャンを示す（スケールバー、１００μｍ）。Ｃ）は、２つの代表的な乳腺上皮構造の３Ｄ再構成のフレームショットとして示されている、ＥｐＣＡＭで免疫染色されたＣＵＢＩＣ透明化全腺のｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の共焦点３Ｄ画像化（スケールバー、１００μｍ）を示す。Ｄ）は、ＲＦＰ（ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞を検出するため）、Ｃｓｎ２又はＤＡＰＩで免疫染色された乳腺切片を示す（スケールバー、１００μｍ）。Ｅ）は、ＭＰＡ／ＤＭＢＡ処理後の様々な時点でＦＡＣＳ単離された管腔前駆細胞からのＲＮＡ抽出を示す概略図であり、グラフは様々なサンプルにおけるＣｓｎ２発現を示している。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の方法
対象が乳癌を有する可能性
広範な調査の後、本発明者等は、驚くべきことに、管腔前駆細胞が、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）と診断された動物及びヒトの両方の対象の乳房において、しばしば腫瘍の発症の可視的兆候のいずれかの前に、異常に分化することを発見した。管腔前駆細胞は、女性の乳房に存在する細胞であり、通常、妊娠中に分化して胞構造（例えば、乳汁産生細胞）を形成するだけである。したがって、本発明者等にとって、そのような細胞が（妊娠していない対象において）乳癌の初期段階で異常に分化することが見出されたことは驚くべきことであった。
対象が乳癌を有する可能性
広範な調査の後、本発明者等は、驚くべきことに、管腔前駆細胞が、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）と診断された動物及びヒトの両方の対象の乳房において、しばしば腫瘍の発症の可視的兆候のいずれかの前に、異常に分化することを発見した。管腔前駆細胞は、女性の乳房に存在する細胞であり、通常、妊娠中に分化して胞構造（例えば、乳汁産生細胞）を形成するだけである。したがって、本発明者等にとって、そのような細胞が（妊娠していない対象において）乳癌の初期段階で異常に分化することが見出されたことは驚くべきことであった。
【0017】
この発見を考慮して、本発明は、対象の乳房における異常に分化した管腔前駆細胞の検出（及び／又は胞構造の検出）を使用する、患者が乳癌を有する可能性を決定するための新規な方法を提供する。更に、管腔前駆細胞の分化、及びその後の胞構造の形成は、典型的には、腫瘍形成の可視的兆候のいずれかの前に観察されたため、本発明はまた、初期形態の乳癌を検出するための方法を有利に提供する。
【0018】
したがって、本発明の一態様では、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法が提供され、当該方法は、対象の乳房を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞が存在するかどうかを決定することを含み、異常に分化した細胞の存在は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである。異常に分化した細胞が存在しないことは、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が低いことを示すものである。
【0019】
特定の実施形態では、方法は、対象の乳房を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞及び／又は胞構造が乳房に存在するかどうかを決定することを含み、異常に分化した細胞の存在及び／又は胞構造の存在は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである。
【0020】
適切には、管腔前駆細胞は、例えば、異常に分化して胞構造を形成する胞管腔前駆細胞である。
【0021】
特定の実施形態では、本発明の方法は、対象が乳癌を有する可能性を評価することを含む。最も適切には、本発明の方法は、対象がトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を有する可能性を評価することを含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象が乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価することを含む。前癌状態は、特定の細胞の形態が乱れ、それによって対象の乳癌のリスクが増大する状態である。
【0023】
乳房分析
異常に分化した管腔前駆細胞及び／又は胞構造が存在するかどうかを決定するための対象の乳房の分析は、当技術分野で知られている任意の適切な技術を含み得る。特定の実施形態では、対象の乳房の分析は、異常に分化した細胞及び／又は胞構造が存在するかどうかを決定するために乳房を走査及び／又は画像化することを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、対象の乳房から材料のサンプルを取得し、材料を分析して、異常に分化した細胞に関連する１つ又は複数の種が存在するかどうかを決定する工程を含み得る。
異常に分化した管腔前駆細胞及び／又は胞構造が存在するかどうかを決定するための対象の乳房の分析は、当技術分野で知られている任意の適切な技術を含み得る。特定の実施形態では、対象の乳房の分析は、異常に分化した細胞及び／又は胞構造が存在するかどうかを決定するために乳房を走査及び／又は画像化することを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、対象の乳房から材料のサンプルを取得し、材料を分析して、異常に分化した細胞に関連する１つ又は複数の種が存在するかどうかを決定する工程を含み得る。
【0024】
したがって、特定の実施形態では、対象の乳房の分析は、
ａ）異常に分化した管腔前駆細胞が存在するかどうかを決定するために乳房を走査及び／又は画像化すること、
ｂ）並びに／あるいは対象の乳房から材料のサンプルを取得し、材料を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種が存在するかどうかを決定すること、から選択される１つ又は複数の技術を含む。
ａ）異常に分化した管腔前駆細胞が存在するかどうかを決定するために乳房を走査及び／又は画像化すること、
ｂ）並びに／あるいは対象の乳房から材料のサンプルを取得し、材料を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種が存在するかどうかを決定すること、から選択される１つ又は複数の技術を含む。
【0025】
乳房の走査及び／又は画像化は、当技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して実行することができる。適切には、乳房の走査及び／又は画像化は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、マンモグラフィ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、及び／又はコントラスト画像化から選択される１つ又は複数の技術を使用して実施される。
【0026】
異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種は、例えば、タンパク質、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子を含み得る。適切には、異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種は、乳タンパク質及び／又は乳タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子からなる群から選択される。
【0027】
特定の実施形態では、異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種は、乳タンパク質である。適切には、乳タンパク質は、カゼイン（例えば、ベータ－カゼイン）、アルファ－ラクトアルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリン免疫グロブリンＡ、リゾチーム、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）及び血清アルブミンから選択される。最も適切には、乳タンパク質はカゼイン（例えばベータ－カゼイン）又は乳清酸性タンパク質である。更により適切には、乳タンパク質はベータ－カゼイン又はＷＡＰである。最も適切には、乳タンパク質はベータ－カゼインである。
【0028】
他の実施形態では、異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種は、乳タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。適切には、乳タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、アルファＳ１－カゼイン（ＣＳＮ１Ｓ１）、ベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）、カッパ－カゼイン（ＣＳＮ３）、乳清酸性タンパク質及びベータ－ラクトグロブリン（ＬＧＢ）から選択される。より適切には、乳タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）又はベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）である。最も適切には、乳タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子はベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）である。
【0029】
異常に分化した管腔前駆細胞に関連する種が存在するかどうかを決定するための対象の乳房から得られた材料の分析は、当技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して実行することができる。
【0030】
対象の乳房から得られた材料の分析が、タンパク質が存在するかどうかの決定を含む実施形態では、分析は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析法から選択される１つ又は複数の技術を使用して実行され得る。
【0031】
対象の乳房から得られた材料の分析が、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が存在するかどうかの決定を含む実施形態では、分析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）及びＤＮＡ配列決定（ＤＮＡｓｅｑ）から選択される１つ又は複数の技術を使用して実行され得る。
【0032】
対象の乳房からの材料のサンプルは、生検又は外科手術によって乳房から得られたサンプル、あるいは乳房から発現した材料のサンプル（例えば、乳房の乳首から発現した流体）、あるいは対象から採取した血液のサンプルから得られたサンプルであり得る。
【0033】
適切には、対象の乳房からの材料のサンプルは、対象の乳房から発現した流体である。最も適切には、対象の乳房からの材料のサンプルは、対象の乳房の乳首を介して発現した流体である。（発現した）材料のサンプルは、例えば、乳房ポンプによる抽出及び／又は針による抽出等、当技術分野で知られている任意の技術を使用して取得することができる。
【0034】
適切には、対象の乳房からの材料のサンプルは、対象から採取された血液のサンプルから得られたサンプルである。対象の乳房からの材料のサンプルは、乳房から（例えば、乳腺から）対象の血液に入る材料であり得ることが理解されるであろう。したがって、乳房からの材料のサンプルが得られる上記の血液のサンプルは、必ずしも対象の乳房である必要はなく、対象の身体のいずれからでも採取することができる。
【0035】
特定の実施形態では、本発明の方法は、対象の乳房から得られた材料を分析して、乳癌及び／又は異常に分化した管腔前駆細胞に一般に関連する１つ又は複数の更なる種が存在するか、あるいは適切なものとしての正常な（対照の）対象よりも高いレベルで存在するかどうかを決定する工程を含む。１つ又は複数の更なる種は、例えば、一般に乳癌に関連する癌遺伝子であり得る。適切には、１つ又は複数の更なる種は、ＢＣＬ１１Ａ、ＥＬＦ５、ＳＯＸ１０、ＦＯＸＣ１ Ｋｉ－６７、ＨＯＸＤ１３及びＰＣＤＨＧＢ７から選択される遺伝子、並びに／あるいは当該遺伝子から発現されるタンパク質からの、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。最も適切には、１つ又は複数の更なる種は、ＢＣＬ１１Ａ、ＥＬＦ５、ＳＯＸ１０、ＦＯＸＣ１及びＫｉ－６７から選択される遺伝子、並びに／あるいは当該遺伝子から発現されるタンパク質からの、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子から選択される。更により適切には、１つ又は複数の更なる種は、ＢＣＬ１１Ａ、ＳＯＸ１０、及びＫｉ－６７から選択される遺伝子、並びに／あるいは当該遺伝子から発現されるタンパク質からの、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子から選択される。最も適切には、１つ又は複数の更なる種は、ＢＣＬ１１Ａ及び／又はＢｃｌ１１ａタンパク質からのＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
【0036】
本発明者等は、乳癌の癌遺伝子であるＢＣＬ１１Ａと管腔前駆細胞の異常な分化との間に強い相関関係が存在することを発見した。例えば、Ｂｃｌ１１ａを削除すると、Ｂｒｃａ１／ｐ５３のＴＮＢＣマウスモデルの管腔前駆細胞の異常な分化に対する保護がもたらされ（以下の実施例で説明）、場合によっては、乳房腫瘍の形成に対する保護がもたらされる。
【0037】
本発明者等は更に、異常に分化した管腔前駆細胞において、多くの遺伝子が上方制御されたことを発見した。Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ１ｓ１、Ｂ２ｍ、Ｃｓｎ１ｓ２ａ、Ｈ２．Ｑ７、Ｂｓｔ２、Ｔｃｅａｌ９、Ｐｌｉｎ２、Ｍｕｃ１５、Ｆｔｈ１、Ｈ２．Ｋ１、Ｍｔ１、Ｈｓｐｅ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｍｔ２、Ｗｆｄｃ１８、Ｓｅｃ６１ｂ、Ｖａｍｐ８、Ｔｕｂｂ５、Ｕｂｄ、Ｏｇｆｒｌ１、Ｓｔｍｎ１、Ｒｂｐ１、Ｈ２．Ｑ６、Ｄｂｉ、Ｅｌｆ５、Ｐｓｍｂ８、Ｃｈｃｈｄ２、Ｓｅｒｆ２、Ｐｒｄｘ２、Ｃａｉｒ、Ａｔｐ５ｈ、Ｍｇｓｔ１、Ｆａｍ３ｃ、Ｈ２ａｆｚ、Ｐｄｋ４、Ｎｄｕｆｂ９、Ｕｂａｌｄ２、Ｃｏｘ８ａ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、Ｃｏｘ６ａ１、Ｈ２．Ｄ１、Ｓｏｄ２、Ｈ３ｆ３ａ、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｃｏｘ７ｂ、Ａｔｐ５ｏ、Ｃｏｘ６ｂ１、Ｐｓｍｂ３、Ｐｄｉａ６、Ｃ３、Ｃｏｘ４ｉ１、Ｃｔｓｚ、Ｇａｐｄｈ、Ｍｉｆ、Ａｔｐ５ｊ２、Ｐｓｍａ７、Ｃｌｔａ、Ｓａｔ１、Ｐｌｓｃｒ１、Ｈｓｐａ８、Ｆｋｂｐ１１、Ｓｃｄ１、Ａｃｏｔ１、Ｍｒｐｓ２１、Ｃｅｎｐｘ、Ｃｏｘ５ｂ、Ｃｏｘ６ｃ、Ｐｅｂｐ１、Ｎｄｕｆｃ２、Ａｔｐ５ｃ１、Ｉｆｉｔｍ３、Ｈｓｐｄ１、Ｍｂｄ１、Ｄｎａｊａ１、Ｐｏｍｐ、Ａｎｇｐｔｌ４、Ｔｅｃｒ、Ｓｓｒ２、Ｃｉｂ１、Ｃ１ｑｔｎｆ１、Ｃｌｄｎ３、Ｃｄ７４、Ｃｙｂａ、Ｐ４ｈｂ、Ｍａｐ１ｌｃ３ｂ、１７０００２５Ｇ０４Ｒｉｋ、Ｃａｌｍ２、Ｐｓｍｂ１、Ｈｓｐ９０ａｂ１、Ｅｅｆ１ｇ、Ｎｄｕｆｂ６、Ａｔｆ３、Ｊｐｔ１、Ｎｄｕｆａ４、Ｈ２．Ｑ４、Ｈｓｐ９０ｂ１、Ｐｄｉａ３、Ｃｕｔａ、Ｆｋｂｐ２、Ｓｓｒ４、Ｈ２ａｆｖ、Ｎｄｕｆｂ１１、Ｔｍｅｍ２５８、Ｓｅｌｅｎｏｆ、Ｃｏｘ５ａ、Ｓｏｘ４、Ｚｆａｎｄ５、ｍｔ．Ｃｏ２、Ｐｒｄｘ１、Ａｔｐｉｆ１、Ｕｑｃｒ１０、Ｓｅｒｐ１、Ｎｏｐ１０、Ｐｓｍｂ４、Ｎｄｕｆａ７、Ｎｄｕｆｓ６、Ａｔｐ５ｊ、Ｎｄｕｆａ２、Ｒｓｐｏ１、Ｔａｌｄｏ１、Ｎｄｕｆａ１１、Ｈｓｐａ５、Ｅｃｉ２、Ｕｑｃｒ１１、Ｎｄｕｆｂ３、Ｅｎｏ１、Ｅｈｆ、Ｈ２．Ｔ２２、Ｃｏｘ７ａ２、Ｃｋｓ１ｂ、Ｈｉｓｔ１ｈ２ｂｃ、Ｎｐｃ２、Ｐｌｓｃｒ２、Ａｔｐ５ｇ３、及びＳｄｆ２ｌ１を含む本発明者等が発見した遺伝子は、異常に分化した管腔前駆細胞において有意に上方制御された。
【0038】
したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、対象の乳房から得られた材料を分析して、以下の遺伝子、Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ１ｓ１、Ｂ２ｍ、Ｃｓｎ１ｓ２ａ、Ｈ２．Ｑ７、Ｂｓｔ２、Ｔｃｅａｌ９、Ｐｌｉｎ２、Ｍｕｃ１５、Ｆｔｈ１、Ｈ２．Ｋ１、Ｍｔ１、Ｈｓｐｅ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｍｔ２、Ｗｆｄｃ１８、Ｓｅｃ６１ｂ、Ｖａｍｐ８、Ｔｕｂｂ５、Ｕｂｄ、Ｏｇｆｒｌ１、Ｓｔｍｎ１、Ｒｂｐ１、Ｈ２．Ｑ６、Ｄｂｉ、Ｅｌｆ５、Ｐｓｍｂ８、Ｃｈｃｈｄ２、Ｓｅｒｆ２、Ｐｒｄｘ２、Ｃａｉｒ、Ａｔｐ５ｈ、Ｍｇｓｔ１、Ｆａｍ３ｃ、Ｈ２ａｆｚ、Ｐｄｋ４、Ｎｄｕｆｂ９、Ｕｂａｌｄ２、Ｃｏｘ８ａ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、Ｃｏｘ６ａ１、Ｈ２．Ｄ１、Ｓｏｄ２、Ｈ３ｆ３ａ、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｃｏｘ７ｂ、Ａｔｐ５ｏ、Ｃｏｘ６ｂ１、Ｐｓｍｂ３、Ｐｄｉａ６、Ｃ３、Ｃｏｘ４ｉ１、Ｃｔｓｚ、Ｇａｐｄｈ、Ｍｉｆ、Ａｔｐ５ｊ２、Ｐｓｍａ７、Ｃｌｔａ、Ｓａｔ１、Ｐｌｓｃｒ１、Ｈｓｐａ８、Ｆｋｂｐ１１、Ｓｃｄ１、Ａｃｏｔ１、Ｍｒｐｓ２１、Ｃｅｎｐｘ、Ｃｏｘ５ｂ、Ｃｏｘ６ｃ、Ｐｅｂｐ１、Ｎｄｕｆｃ２、Ａｔｐ５ｃ１、Ｉｆｉｔｍ３、Ｈｓｐｄ１、Ｍｂｄ１、Ｄｎａｊａ１、Ｐｏｍｐ、Ａｎｇｐｔｌ４、Ｔｅｃｒ、Ｓｓｒ２、Ｃｉｂ１、Ｃ１ｑｔｎｆ１、Ｃｌｄｎ３、Ｃｄ７４、Ｃｙｂａ、Ｐ４ｈｂ、Ｍａｐ１ｌｃ３ｂ、１７０００２５Ｇ０４Ｒｉｋ、Ｃａｌｍ２、Ｐｓｍｂ１、Ｈｓｐ９０ａｂ１、Ｅｅｆ１ｇ、Ｎｄｕｆｂ６、Ａｔｆ３、Ｊｐｔ１、Ｎｄｕｆａ４、Ｈ２．Ｑ４、Ｈｓｐ９０ｂ１、Ｐｄｉａ３、Ｃｕｔａ、Ｆｋｂｐ２、Ｓｓｒ４、Ｈ２ａｆｖ、Ｎｄｕｆｂ１１、Ｔｍｅｍ２５８、Ｓｅｌｅｎｏｆ、Ｃｏｘ５ａ、Ｓｏｘ４、Ｚｆａｎｄ５、ｍｔ．Ｃｏ２、Ｐｒｄｘ１、Ａｔｐｉｆ１、Ｕｑｃｒ１０、Ｓｅｒｐ１、Ｎｏｐ１０、Ｐｓｍｂ４、Ｎｄｕｆａ７、Ｎｄｕｆｓ６、Ａｔｐ５ｊ、Ｎｄｕｆａ２、Ｒｓｐｏ１、Ｔａｌｄｏ１、Ｎｄｕｆａ１１、Ｈｓｐａ５、Ｅｃｉ２、Ｕｑｃｒ１１、Ｎｄｕｆｂ３、Ｅｎｏ１、Ｅｈｆ、Ｈ２．Ｔ２２、Ｃｏｘ７ａ２、Ｃｋｓ１ｂ、Ｈｉｓｔ１ｈ２ｂｃ、Ｎｐｃ２、Ｐｌｓｃｒ２、Ａｔｐ５ｇ３、及びＳｄｆ２ｌ１のうち１つ又は複数が存在するか、あるいは上方制御されるかを決定する工程を含む。
【0039】
適切には、本発明の方法は、対象の乳房から得られた材料を分析して、以下の遺伝子、Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ１ｓ１、Ｂ２ｍ、Ｃｓｎ１ｓ２ａ、Ｈ２．Ｑ７、Ｂｓｔ２、Ｔｃｅａｌ９、Ｐｌｉｎ２、Ｍｕｃ１５、Ｆｔｈ１、Ｈ２．Ｋ１、Ｍｔ１、Ｈｓｐｅ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｍｔ２、Ｗｆｄｃ１８、Ｓｅｃ６１ｂ、Ｖａｍｐ８、Ｔｕｂｂ５、Ｕｂｄ、Ｏｇｆｒｌ１、Ｓｔｍｎ１、Ｒｂｐ１、Ｈ２．Ｑ６、Ｄｂｉ、Ｅｌｆ５及びＰｓｍｂ８のうち１つ又は複数が存在するか、あるいは上方制御されるかどうかを決定する工程を含む。
【0040】
より適切には、本発明の方法は、対象の乳房から得られた材料を分析して、以下の遺伝子、Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ１ｓ１、Ｂ２ｍ、Ｃｓｎ１ｓ２ａ、Ｈ２．Ｑ７、Ｂｓｔ２、Ｔｃｅａｌ９、Ｐｌｉｎ２、Ｍｕｃ１５、Ｆｔｈ１、Ｈ２．Ｋ１、Ｍｔ１、Ｈｓｐｅ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｍｔ２、Ｗｆｄｃ１８、Ｓｅｃ６１ｂ、Ｖａｍｐ８及びＴｕｂｂ５のうち１つ又は複数が存在するか、あるいは上方制御されるかどうかを決定する工程を含む。
【0041】
更により適切には、本発明の方法は、対象の乳房から得られた材料を分析して、以下の遺伝子、Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ１ｓ１、Ｂ２ｍ、Ｃｓｎ１ｓ２ａ、Ｈ２．Ｑ７、Ｂｓｔ２及びＴｃｅａｌ９のうち１つ又は複数が存在するか、あるいは上方制御されるかどうかを決定する工程を含む。
【0042】
最も適切には、本発明の方法は、対象の乳房から得られた材料を分析して、以下の遺伝子、Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ１ｓ１、Ｂ２ｍ及びＣｓｎ１ｓ２ａのうち１つ又は複数が存在するか、あるいは上方制御されるかどうかを決定する工程を含む。
【0043】
本発明はまた、対象の乳房から得られた材料を分析して、上記の遺伝子から発現した１つ又は複数のタンパク質が存在するか（又は過剰発現されるか）どうかを決定する工程を含み得る。
【0044】
一実施形態では、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法が提供され、当該方法は、対象から採取された血液のサンプルから得られた対象の乳房からの材料のサンプルを分析して、ベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）が存在するかどうかを決定することを含み、対象の乳房から得られた材料のサンプル中のベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）の存在は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである。
【0045】
検出技術
上で概説したように、本発明は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を決定するための新規な方法を提供する。したがって、本発明は、対象が乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）を有する可能性を評価するために医師が利用できる既存の方法と一緒に有益に使用することができる。したがって、本発明は医師が、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価するのを助けるために使用できる追加の技術を有利に提供する。
上で概説したように、本発明は、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を決定するための新規な方法を提供する。したがって、本発明は、対象が乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）を有する可能性を評価するために医師が利用できる既存の方法と一緒に有益に使用することができる。したがって、本発明は医師が、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価するのを助けるために使用できる追加の技術を有利に提供する。
【0046】
対象が乳癌を有する可能性を決定するために医師によって一般的に使用される技術は当業者に周知であり、例えば、対象の病歴及び／又は対象の家族の病歴の評価、患者の検査、乳房の全体又は一部の画像化、乳癌バイオマーカに関する対象の血液の検査、対象のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの遺伝的検査、並びに対象から採取した生検の評価を含む。このような技術は、乳癌に一般的に関連する危険因子（例えば、乳癌の家族歴、乳癌に一般的に関連する遺伝的欠陥／変異（例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子への変異））、及び／又は対象の乳房の非定型の成長／腫瘍）の存在を決定するために日常的に使用される。
【0047】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象が乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）を有する可能性があるかどうかの指標を導く、対象の乳房における異常に分化した細胞及び／又は胞構造の存在に加えて、前述の技術の１つ又は複数を使用して、１つ又は複数の危険因子の存在が検出されるように、本明細書において上に記載した方法に加えて、前述の技術のうち１つ又は複数を使用することを含み得る。
【0048】
対象
対象は、ヒト又は動物の対象であり得ることが理解されるであろう。好ましくは、対象はヒト対象であり、乳癌又は前癌状態は、ヒト乳癌又はヒト乳癌に関連する前癌状態である。
対象は、ヒト又は動物の対象であり得ることが理解されるであろう。好ましくは、対象はヒト対象であり、乳癌又は前癌状態は、ヒト乳癌又はヒト乳癌に関連する前癌状態である。
【0049】
特定の好ましい実施形態では、対象は妊娠していない対象である。したがって、適切には、対象は、妊娠検査を実施した対象であり、最も適切には、対象は、妊娠検査を実施し、陰性の結果を示した対象である。
【0050】
いくつかの実施形態では、対象は、トリプルネガティブ乳癌を発症するリスクがあると特定された対象である。したがって、適切には、対象は、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）に一般的に関連する１つ又は複数の危険因子を有する対象である。危険因子は、例えば、乳癌の家族歴、乳房の痛み又は不快感、乳房上又はその周辺の非定型成長、片方又は両方の乳房の腫れ又は肥大、乳房組織の密集、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異、並びに相同組換え修復欠損を含み得る。適切には、対象は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異、並びに最も適切には、ＢＲＣＡ１遺伝子の変異を有する対象である。
【0051】
乳癌の治療
本発明の第３の態様によれば、対象の乳癌を治療する方法が提供され、当該方法は、
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に標準的な乳癌治療レジメンを投与する工程と、とを含む。
本発明の第３の態様によれば、対象の乳癌を治療する方法が提供され、当該方法は、
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に標準的な乳癌治療レジメンを投与する工程と、とを含む。
【0052】
１つ又は複数の標準的な腫瘍治療レジメンは、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を治療するために一般的に使用される任意の適切な治療レジメンであり得る。適切には、１つ又は複数の標準的な腫瘍治療レジメンは、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、及びそれらの組合わせから選択される。最も適切には、標準的な腫瘍治療レジメンは、外科手術、化学療法又は放射線療法、及びそれらの組合わせから選択される。
【0053】
外科手術は、腫瘍（及び／又は乳房）の全体又は一部を切除するための医師による外科的介入であり得る。適切な外科的介入の非限定的な例には、乳房の生検、切開、ドレナージ、及び除去が含まれる。外科手術には、例えば、選択的乳房切除術等の予防的外科的介入も含まれる。
【0054】
放射線療法は、電離放射線を利用する任意の形態の治療であり得る。適切な放射線療法治療の非限定的な例には、例えば、外照射療法（ＥＢＲＴ）、定位放射線照射（ＳＴＲＳ）及び遠隔照射治療が含まれる。適切には、放射線療法は外照射療法（ＥＢＲＴ）である。
【0055】
化学療法は、１つ又は複数の抗腫瘍（抗癌）剤の投与による治療であり得る。適切な抗腫瘍剤の非限定的な例には、例えば、タモキシフェン、アリミデックス（商標）（アナストロゾール）、アロマシン（商標）（エキセメスタン）、フェマーラ（商標）（レトロゾール）、フェソロデックス（商標）（フルベストラント）、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、タイケルブ（商標）（ラパチニブ）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）、タキサン（例えば、ドコタキセル（ｄｏｃｏｔａｘｅｌ）又はパクリタキセル）及びそれらの組合わせが含まれる。適切には、抗腫瘍剤は、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）、タキサン（例えば、ドコタキセル又はパクリタキセル）、又はそれらの組合わせである。
【0056】
化学療法はまた、予防的化学療法、並びに例えば、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）の発症を予防及び／又は管理するために一般的に使用されるタモキシフェン及びラロキシフェン等の薬剤の投与を含み得る。
【0057】
免疫療法は、患者の免疫系を利用する任意の形態の治療であり得る。適切な免疫療法治療の非限定的な例には、例えば、モノクローナル抗体（ＭＡＢ）、予防接種、サイトカイン、及びＣＡＲ－Ｔ細胞のうちの１つ又は複数を利用する治療が含まれる。
【0058】
アクティブサーベイランス
一部の乳癌及び乳癌に関連する前癌状態は、非常にゆっくりと成長する。したがって、そのような状況では、対象の乳房を経時的にモニタリングして、乳癌（又は乳癌に関連する前癌状態）が形成及び／又は成長するかどうかを確認するために、対象のアクティブサーベイランスが必要となる場合がある。
一部の乳癌及び乳癌に関連する前癌状態は、非常にゆっくりと成長する。したがって、そのような状況では、対象の乳房を経時的にモニタリングして、乳癌（又は乳癌に関連する前癌状態）が形成及び／又は成長するかどうかを確認するために、対象のアクティブサーベイランスが必要となる場合がある。
【0059】
アクティブサーベイランスは、例えば、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異、あるいは乳癌の家族歴を有する対象、あるいは相同組換え修復欠損である対象等の、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）を発症するリスクがあると特定された対象に特に有用である。
【0060】
したがって、本発明の第４の態様によれば、対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態の発症をモニタリングする方法、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングする方法が提供され、当該方法は、所定の時間間隔で隔てられた２つ以上の時点で、本明細書で定義される方法によって、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価することを含む。
【0061】
所定の時間間隔の数及び期間は、方法の意図される用途に応じて変化し得ることが理解されるであろう。例えば、使用される所定の時間間隔は、検出される乳癌のタイプ、分析に使用される機器のタイプ及び感度、並びに／あるいは分析が実行されている対象に応じて変化し得る。所定の時間間隔に対するそのような変動は、方法論の意図された用途に基づいて当業者によって日常的に決定され得る。
【0062】
本発明の対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態をモニタリングするための、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングするための方法の特定の実施形態では、所定の時間間隔は１～１２か月毎（例えば、１～６か月毎、１～３か月毎、１～２か月毎、又は毎月）である。
【0063】
本発明の対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態をモニタリングするための、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングするための方法の他の実施形態では、所定の時間間隔は１～４週間毎（例えば、１～３週間毎、１～２週間毎、又は毎週）である。
【0064】
本発明の対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態をモニタリングするための、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングするための方法の他の実施形態では、所定の時間間隔は１～１４日毎（例えば、１～７日毎、１～３日毎、又は毎日）である。
【0065】
化学療法剤
本発明の第５の態様によれば、当該治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤が提供され、治療は、
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に化学療法剤を投与する工程と、を含む。
本発明の第５の態様によれば、当該治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤が提供され、治療は、
ａ）本明細書に記載の方法により、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、対象に化学療法剤を投与する工程と、を含む。
【0066】
特定の実施形態では、化学療法剤は、タモキシフェン、アリミデックス（商標）（アナストロゾール）、アロマシン（商標）（エキセメスタン）、フェマーラ（商標）（レトロゾール）、フェソロデックス（商標）（フルベストラント）、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、タイケルブ（商標）（ラパチニブ）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）又はタキサン（例えば、ドコタキセル又はパクリタキセル）から選択される。適切には、化学療法剤は、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）又はタキサン（例えば、ドコタキセル又はパクリタキセル）である。
【0067】
本明細書において上に記載した本発明の第１の態様に関連する好ましい適切な特徴はまた、本発明の更なる全ての態様の好ましい適切な特徴を表す。したがって、本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例に関連して説明される特徴、整数、特性、又は手段は、矛盾しない限り、本明細書に記載の全ての態様、実施形態、又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（付随する特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された全ての特徴、及び／又はそのように開示された任意の方法の全ての工程は、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合わせを除いて、任意の組合わせで組み合わせることができる。
【0068】
本明細書において上に記載した本発明の第１の態様に関連する好ましい適切な特徴はまた、本発明の更なる全ての態様の好ましい適切な特徴を表す。したがって、本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例に関連して説明される特徴、整数、特性、又は手段は、矛盾しない限り、本明細書に記載の全ての態様、実施形態、又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（付随する特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された全ての特徴、及び／又はそのように開示された任意の方法の全ての工程は、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合わせを除いて、任意の組合わせで組み合わせることができる。
項１
対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法であって、前記方法が、前記対象の乳房を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞が前記乳房に存在するかどうかを決定することを含み、前記乳房内の前記異常に分化した細胞の存在は、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法。
項２
前記異常に分化した細胞が、異常に分化して胞構造を形成する、項１に記載の方法。
項３
前記方法が、前記対象の乳房を分析して、胞構造が前記対象の乳房に存在するかどうかを決定することを含む、項１又は２に記載の方法。
項４
前記対象が、トリプルネガティブ乳癌を発症するリスクがあると特定された対象である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５
前記対象が、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異、例えば、前記ＢＲＣＡ１遺伝子の変異を有するか、あるいは乳癌の家族歴を有するか、あるいは相同組換え修復欠損である、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
項６
前記対象の乳房の分析が、
ａ）異常に分化した細胞が存在するかどうかを決定するために前記乳房を走査及び／又は画像化すること、並びに／あるいは
ｂ）前記対象の乳房から材料のサンプルを取得し、前記材料を分析して、異常に分化した細胞に関連する種が存在するかどうかを決定すること、から選択される１つ又は複数の技術を含む、項１～５いずれか一項に記載の方法。
項７
前記異常に分化した細胞に関連する種が、タンパク質、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなる群から選択される、項６に記載の方法。
項８
前記種が、乳タンパク質及び乳タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子からなる群から選択される、項７に記載の方法。
項９
前記乳タンパク質が、カゼイン（例えば、ベータ－カゼイン）、アルファ－ラクトアルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリン免疫グロブリンＡ、リゾチーム、乳清酸性タンパク質及び血清アルブミンから選択される、項８に記載の方法。
項１０
前記乳タンパク質がベータ－カゼイン及び乳清酸性タンパク質から選択される、項９に記載の方法。
項１１
前記乳タンパク質がベータ－カゼインである、項１０に記載の方法。
項１２
前記乳タンパク質が乳清酸性タンパク質である、項１０に記載の方法。
項１３
前記方法が、前記対象の乳房から得られた材料を分析して、異常に分化した細胞に関連する更なる種が存在するかどうかを決定することを更に含む、項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
項１４
前記異常に分化した細胞に関連する前記更なる種が、ＢＣＬ１１Ａ、ＥＬＦ５、ＳＯＸ１０、ＦＯＸＣ１ ｋｉ－６７、ＨＯＸＤ１３及びＰＣＤＨＧＢ７から選択される遺伝子からのＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにこれらの遺伝子から発現される任意のタンパク質である、項１３に記載の方法。
項１５
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析法から選択される１つ又は複数の技術を使用して、タンパク質が前記サンプル中に存在すると決定されるか、並びに／あるいは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）及びＤＮＡ配列決定（ＤＮＡｓｅｑ）から選択される１つ又は複数の技術を使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡが前記サンプル中に存在すると決定される、項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６
前記対象の乳房からの前記材料のサンプルが、前記対象の乳房の前記乳首を介して、あるいは外科手術又は生検から得られる、項６～１５のいずれか一項に記載の方法。
項１７
前記サンプルが、前記対象の前記乳房から発現した流体から選択される、項６～１６のいずれか一項に記載の方法。
項１８
前記材料のサンプルが、乳房ポンプ及び／又は針を介して前記対象の乳房から得られる、項６～１７のいずれか一項に記載の方法。
項１９
前記乳房からの材料のサンプルが、前記対象から採取された血液のサンプルから得られる、項６～１５のいずれか一項に記載の方法。
項２０
前記血液のサンプルが前記対象の前記乳房から採取されない、項１９に記載の方法。
項２１
前記対象の前記乳房からの前記材料のサンプルが、前記対象から採取された血液のサンプルから得られ、前記異常に分化した細胞に関連する種がベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）である、項１９又は２０に記載の方法。
項２２
前記対象の前記乳房が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、マンモグラフィ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、及び／又はコントラスト画像化から選択される１つ又は複数の技術を使用して、走査及び／又は画像化される、項６に記載の方法。
項２３
前記対象が妊娠検査を受けた対象である、項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
項２４
乳癌を治療する方法であって、
ａ）項１～２３のいずれか一項で特許請求されたような方法により、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、前記対象に標準的な乳癌治療レジメンを投与する工程と、とを含む、乳癌を治療する方法。
項２５
前記標準的な乳癌治療レジメンが、外科手術、化学療法、及び／又は放射線療法から選択される、項２４に記載の方法。
項２６
前記標準的な乳癌治療レジメンが、選択的乳房切除術及び／又は予防的化学療法から選択される、項２４に記載の方法。
項２７
対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態の発症をモニタリングする方法、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングする方法であって、前記方法が、所定の時間間隔によって分離された２つ以上の時点で、項１～２３のいずれか一項で特許請求されたような方法によって、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価することを含む、方法。
項２８
前記治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤であって、前記治療が、
ａ）項１～２３のいずれか一項で特許請求されたような方法により、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、前記対象に化学療法剤を投与する工程と、とを含む、前記治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤。
項２９
前記化学療法剤が、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）又はタキサン（例えば、ドコタキセル又はパクリタキセル）である、項２８に記載の化学療法剤。
項１
対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法であって、前記方法が、前記対象の乳房を分析して、異常に分化した管腔前駆細胞が前記乳房に存在するかどうかを決定することを含み、前記乳房内の前記異常に分化した細胞の存在は、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いことを示すものである、対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する方法。
項２
前記異常に分化した細胞が、異常に分化して胞構造を形成する、項１に記載の方法。
項３
前記方法が、前記対象の乳房を分析して、胞構造が前記対象の乳房に存在するかどうかを決定することを含む、項１又は２に記載の方法。
項４
前記対象が、トリプルネガティブ乳癌を発症するリスクがあると特定された対象である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５
前記対象が、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異、例えば、前記ＢＲＣＡ１遺伝子の変異を有するか、あるいは乳癌の家族歴を有するか、あるいは相同組換え修復欠損である、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
項６
前記対象の乳房の分析が、
ａ）異常に分化した細胞が存在するかどうかを決定するために前記乳房を走査及び／又は画像化すること、並びに／あるいは
ｂ）前記対象の乳房から材料のサンプルを取得し、前記材料を分析して、異常に分化した細胞に関連する種が存在するかどうかを決定すること、から選択される１つ又は複数の技術を含む、項１～５いずれか一項に記載の方法。
項７
前記異常に分化した細胞に関連する種が、タンパク質、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなる群から選択される、項６に記載の方法。
項８
前記種が、乳タンパク質及び乳タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子からなる群から選択される、項７に記載の方法。
項９
前記乳タンパク質が、カゼイン（例えば、ベータ－カゼイン）、アルファ－ラクトアルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリン免疫グロブリンＡ、リゾチーム、乳清酸性タンパク質及び血清アルブミンから選択される、項８に記載の方法。
項１０
前記乳タンパク質がベータ－カゼイン及び乳清酸性タンパク質から選択される、項９に記載の方法。
項１１
前記乳タンパク質がベータ－カゼインである、項１０に記載の方法。
項１２
前記乳タンパク質が乳清酸性タンパク質である、項１０に記載の方法。
項１３
前記方法が、前記対象の乳房から得られた材料を分析して、異常に分化した細胞に関連する更なる種が存在するかどうかを決定することを更に含む、項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
項１４
前記異常に分化した細胞に関連する前記更なる種が、ＢＣＬ１１Ａ、ＥＬＦ５、ＳＯＸ１０、ＦＯＸＣ１ ｋｉ－６７、ＨＯＸＤ１３及びＰＣＤＨＧＢ７から選択される遺伝子からのＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにこれらの遺伝子から発現される任意のタンパク質である、項１３に記載の方法。
項１５
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析及び質量分析法から選択される１つ又は複数の技術を使用して、タンパク質が前記サンプル中に存在すると決定されるか、並びに／あるいは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）及びＤＮＡ配列決定（ＤＮＡｓｅｑ）から選択される１つ又は複数の技術を使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡが前記サンプル中に存在すると決定される、項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６
前記対象の乳房からの前記材料のサンプルが、前記対象の乳房の前記乳首を介して、あるいは外科手術又は生検から得られる、項６～１５のいずれか一項に記載の方法。
項１７
前記サンプルが、前記対象の前記乳房から発現した流体から選択される、項６～１６のいずれか一項に記載の方法。
項１８
前記材料のサンプルが、乳房ポンプ及び／又は針を介して前記対象の乳房から得られる、項６～１７のいずれか一項に記載の方法。
項１９
前記乳房からの材料のサンプルが、前記対象から採取された血液のサンプルから得られる、項６～１５のいずれか一項に記載の方法。
項２０
前記血液のサンプルが前記対象の前記乳房から採取されない、項１９に記載の方法。
項２１
前記対象の前記乳房からの前記材料のサンプルが、前記対象から採取された血液のサンプルから得られ、前記異常に分化した細胞に関連する種がベータ－カゼイン（ＣＳＮ２）である、項１９又は２０に記載の方法。
項２２
前記対象の前記乳房が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、マンモグラフィ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、及び／又はコントラスト画像化から選択される１つ又は複数の技術を使用して、走査及び／又は画像化される、項６に記載の方法。
項２３
前記対象が妊娠検査を受けた対象である、項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
項２４
乳癌を治療する方法であって、
ａ）項１～２３のいずれか一項で特許請求されたような方法により、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、前記対象に標準的な乳癌治療レジメンを投与する工程と、とを含む、乳癌を治療する方法。
項２５
前記標準的な乳癌治療レジメンが、外科手術、化学療法、及び／又は放射線療法から選択される、項２４に記載の方法。
項２６
前記標準的な乳癌治療レジメンが、選択的乳房切除術及び／又は予防的化学療法から選択される、項２４に記載の方法。
項２７
対象において、乳癌又は乳癌に関連する前癌状態の発症をモニタリングする方法、あるいは乳癌の再発及び／又は成長をモニタリングする方法であって、前記方法が、所定の時間間隔によって分離された２つ以上の時点で、項１～２３のいずれか一項で特許請求されたような方法によって、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価することを含む、方法。
項２８
前記治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤であって、前記治療が、
ａ）項１～２３のいずれか一項で特許請求されたような方法により、前記対象が乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性を評価する工程と、
ｂ）乳癌又は乳癌に関連する前癌状態を有する可能性が高いと評価される場合、前記対象に化学療法剤を投与する工程と、とを含む、前記治療を必要とする対象の治療に使用するための化学療法剤。
項２９
前記化学療法剤が、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）又はタキサン（例えば、ドコタキセル又はパクリタキセル）である、項２８に記載の化学療法剤。
【0069】
実施例
材料及び方法
マウス実験
全ての実験動物の作業は、動物（科学的処置）法１９８６（英国）に従って実施し、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会によって承認された。Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（ＪＡＸ０１２６２０）（Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．，２１１，３８９－３９８（２００７））を使用して、ＴＮＢＣ腫瘍の形成を研究した。これらのマウスは、Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆマウスと交配させて、Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆ、Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅマウスを作製した。管腔前駆細胞におけるＢｃｌ１１ａノックアウトは、Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆをＢｌｇ－Ｃｒｅマウスと交配させることによって達成した（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，７，３８７－３９６（１９９８））。Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＢＣＬ１１Ａｏｖｘマウスは、最近記載された（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，０，３３２７，（２０１８））。簡単に説明すると、ＲＯＳＡ２６対立遺伝子は、挿入されたｃＤＮＡの下流にある内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下で、ｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセット及びマークされたｅＧＦＰが先行して、ヒトＢＣＬ１１ＡのｃＤＮＡを含むコンストラクトにより標的化され、導入遺伝子の転写はＣＡＧＧプロモータによって制御される。これらのマウスをＢｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅと交配して、ＴＮＢＣ腫瘍形成に対するＢＣＬ１１Ａの過剰発現の影響を研究した。Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２対立遺伝子は、ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２－ｐｏｌｙＡ－ＦＲＴ－ＰＧＫ－Ｅ７－Ｎｅｏ－ｐｏｌｙＡ－ＦＲＴカセットをＢｃｌ１１ａ遺伝子座の３’ＵＴＲに導入することによって生成した。遺伝子標的化はＡＢ２．２細胞（１２９バックグラウンド）で実施した。正確な標的化はロングレンジ（ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによって確認され、標的化されたクローンは胚盤胞注射に使用した。次に、キメラマウスを野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６）と交配させ、生殖細胞系列の伝達を確認した。次に、Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２系統をＲｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス系統（ＪＡＸ００７９０５）２５と交配させて、ダブルトランスジェニックマウスを作製した。各実験に関して、使用した動物はＢｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２についてはヘテロ接合であり、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏについてはホモ接合であった。系譜追跡は、成熟期（５週齢）又は成体（９週齢）に、コーン油中のタモキシフェン（注射当たり１ｍｇ）を３日間連続して１回腹腔内注射又は３回注射することで誘発した。タモキシフェンの投与により、乳腺のＢｃｌ１１ａ発現細胞が真に標識されることをｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。注射後の示された時点で組織を回収した。妊娠時点では、タモキシフェン注射の８週間後に雌をスタッドと交配させ、妊娠１４．５日に組織を採取した。各時点で、Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２野生型対照同腹子を実験動物と同時に注射して、組織を回収してＦＡＣＳ及び全組織ＩＦ実験の両方でｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光のバックグラウンドレベルを設定した。ｓｃＲＮＡシーケンス実験は、全ての動物を回収し、組織を同時に処理できるように設定され、遺伝子型毎に２匹の個別のマウスを研究に使用した。未経産動物の発情周期の段階は、膣塗抹標本によって決定した。全てのマウスは、１２：１２時間の明暗サイクルの下で個別に換気されたケージに収容され、水及び餌は自由に摂取でき、最終的に麻酔によって安楽死させた。
材料及び方法
マウス実験
全ての実験動物の作業は、動物（科学的処置）法１９８６（英国）に従って実施し、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会によって承認された。Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（ＪＡＸ０１２６２０）（Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．，２１１，３８９－３９８（２００７））を使用して、ＴＮＢＣ腫瘍の形成を研究した。これらのマウスは、Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆマウスと交配させて、Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆ、Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅマウスを作製した。管腔前駆細胞におけるＢｃｌ１１ａノックアウトは、Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆをＢｌｇ－Ｃｒｅマウスと交配させることによって達成した（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，７，３８７－３９６（１９９８））。Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＢＣＬ１１Ａｏｖｘマウスは、最近記載された（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，０，３３２７，（２０１８））。簡単に説明すると、ＲＯＳＡ２６対立遺伝子は、挿入されたｃＤＮＡの下流にある内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下で、ｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセット及びマークされたｅＧＦＰが先行して、ヒトＢＣＬ１１ＡのｃＤＮＡを含むコンストラクトにより標的化され、導入遺伝子の転写はＣＡＧＧプロモータによって制御される。これらのマウスをＢｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅと交配して、ＴＮＢＣ腫瘍形成に対するＢＣＬ１１Ａの過剰発現の影響を研究した。Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２対立遺伝子は、ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２－ｐｏｌｙＡ－ＦＲＴ－ＰＧＫ－Ｅ７－Ｎｅｏ－ｐｏｌｙＡ－ＦＲＴカセットをＢｃｌ１１ａ遺伝子座の３’ＵＴＲに導入することによって生成した。遺伝子標的化はＡＢ２．２細胞（１２９バックグラウンド）で実施した。正確な標的化はロングレンジ（ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによって確認され、標的化されたクローンは胚盤胞注射に使用した。次に、キメラマウスを野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６）と交配させ、生殖細胞系列の伝達を確認した。次に、Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２系統をＲｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス系統（ＪＡＸ００７９０５）２５と交配させて、ダブルトランスジェニックマウスを作製した。各実験に関して、使用した動物はＢｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２についてはヘテロ接合であり、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏについてはホモ接合であった。系譜追跡は、成熟期（５週齢）又は成体（９週齢）に、コーン油中のタモキシフェン（注射当たり１ｍｇ）を３日間連続して１回腹腔内注射又は３回注射することで誘発した。タモキシフェンの投与により、乳腺のＢｃｌ１１ａ発現細胞が真に標識されることをｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。注射後の示された時点で組織を回収した。妊娠時点では、タモキシフェン注射の８週間後に雌をスタッドと交配させ、妊娠１４．５日に組織を採取した。各時点で、Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２野生型対照同腹子を実験動物と同時に注射して、組織を回収してＦＡＣＳ及び全組織ＩＦ実験の両方でｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光のバックグラウンドレベルを設定した。ｓｃＲＮＡシーケンス実験は、全ての動物を回収し、組織を同時に処理できるように設定され、遺伝子型毎に２匹の個別のマウスを研究に使用した。未経産動物の発情周期の段階は、膣塗抹標本によって決定した。全てのマウスは、１２：１２時間の明暗サイクルの下で個別に換気されたケージに収容され、水及び餌は自由に摂取でき、最終的に麻酔によって安楽死させた。
【0070】
乳腺の単細胞浮遊液への分離
リンパ節を切除した乳腺（頸部ペアを除く）をマウスから解剖し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１ｍｇ ｍｌ－１コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）＋１００Ｕｍｌ－１ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）（ＣＨ）＋ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）でＯ／Ｎを３７℃において消化した。ｓｃＲＮＡシーケンス実験では、代わりに、回収後に乳腺を機械的に分離し、細かく刻んだ組織を２倍量のＣＨを含む消化ミックスに３７℃で３時間移し、３０分毎にボルテックスした。ＮＨ４Ｃｌで赤血球を溶解した後、細胞を温かい０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）、５ｍｇ ｍｌ－１ディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ）及び１ｍｇ ｍｌ－１ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で簡単に消化し、セルストレーナ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通して濾過した。
リンパ節を切除した乳腺（頸部ペアを除く）をマウスから解剖し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１ｍｇ ｍｌ－１コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）＋１００Ｕｍｌ－１ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）（ＣＨ）＋ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）でＯ／Ｎを３７℃において消化した。ｓｃＲＮＡシーケンス実験では、代わりに、回収後に乳腺を機械的に分離し、細かく刻んだ組織を２倍量のＣＨを含む消化ミックスに３７℃で３時間移し、３０分毎にボルテックスした。ＮＨ４Ｃｌで赤血球を溶解した後、細胞を温かい０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）、５ｍｇ ｍｌ－１ディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ）及び１ｍｇ ｍｌ－１ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で簡単に消化し、セルストレーナ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通して濾過した。
【0071】
細胞標識並びにそれに続くフローサイトメトリー及び選別
単細胞浮遊液をＨＦ培地（ハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ）＋１０％正常ラット血清（Ｓｉｇｍａ）で氷上で２０分間インキュベートして、抗体染色の前にプレブロックした。全ての抗体のインキュベーションは、ＨＦ培地中の氷上で１０分間行った。マウス乳腺細胞を以下の一次抗体、Ｃｄ３１－ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３９０、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）；Ｃｄ４５－ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３０Ｆ１１、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）；Ｔｅｒ１１９－ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＴｅｒ１１９、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）、ＥｐＣＡＭ－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧ８．８、０．５μｇ ｍｌ－１、１：５００）、Ｃｄ４９ｆ－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ３１３６２３、２μｇ ｍｌ－１、１：１００）、Ｃｄ４９ｂ－ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＭａ２、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）及びＳｃａ１－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＤ７、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）で染色した。次いで、細胞をストレプトアビジン－ＡＰＣ又はストレプトアビジン－ＰＥ／Ｃｙ７（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．４μｇ ｍｌ－１、１：５００）で染色した。７－ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ ｍｌ－１、１：１００）又はＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：１００）を死細胞を検出するために使用した。ヒト乳腺細胞を次の一次抗体、ＣＤ４５－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨ１３０、１：１００）、ＣＤ３１－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＷＭ－５９、１：１００）、ＥＰＣＡＭ－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン９Ｃ４、１：５０）、ＣＤ４９ｆ－ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧｏＨ３、１μｇ ｍｌ－１、１：２００）で染色した。ＤＡＰＩは死細胞を検出するために使用した。選別する前に、細胞をセルストレーナ（Ｐａｒｔｅｃ）で濾過した。細胞の選別は、選別直前に、自動セットアップビーズ（ＳＯＮＹ）又はＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎを使用して選別キャリブレーションを実行した後、ＳＨ８００Ｚソータ（ＳＯＮＹ）を使用して行った。単一染色された対照細胞を使用して、手動でコンペンセーションを行った。未染色の細胞及び対照動物を使用してゲートを設定した。ダブレットの後、死細胞並びに汚染された造血細胞、内皮細胞、間質細胞をゲートアウトした。ＳＨ８００ＺのＳＯＮＹソフトウェア又はＦｌｏｗＪｏを使用してＦＡＣＳデータを分析した。マウス細胞を乳腺管腔又は基底コンパートメントにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現について分析したか、あるいは管腔細胞を管腔前駆細胞ＣＦＣアッセイのために選別した。ｓｃＲＮＡｓｅｑの場合、ＥｐＣＡＭ陽性細胞をＨＦを含むＬｏＢｉｎｄマイクロ遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で選別した。選別後、細胞をスピンダウンし、ＨＦに再懸濁した。改良ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）チャンバを使用してサンプルを手動でカウントし、ＨＦの添加により細胞濃度を正規化した。サンプル当たり同数の細胞をｓｃＲＮＡライブラリ調製のために処理した。サンプルは、組織分離から９時間以内のライブラリ調製のために処理した。ヒト管腔前駆細胞は、ＲＮＡ処理のために選別した。
単細胞浮遊液をＨＦ培地（ハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ）＋１０％正常ラット血清（Ｓｉｇｍａ）で氷上で２０分間インキュベートして、抗体染色の前にプレブロックした。全ての抗体のインキュベーションは、ＨＦ培地中の氷上で１０分間行った。マウス乳腺細胞を以下の一次抗体、Ｃｄ３１－ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３９０、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）；Ｃｄ４５－ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３０Ｆ１１、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）；Ｔｅｒ１１９－ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＴｅｒ１１９、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）、ＥｐＣＡＭ－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧ８．８、０．５μｇ ｍｌ－１、１：５００）、Ｃｄ４９ｆ－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ３１３６２３、２μｇ ｍｌ－１、１：１００）、Ｃｄ４９ｂ－ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＭａ２、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）及びＳｃａ１－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＤ７、１μｇ ｍｌ－１、１：５００）で染色した。次いで、細胞をストレプトアビジン－ＡＰＣ又はストレプトアビジン－ＰＥ／Ｃｙ７（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．４μｇ ｍｌ－１、１：５００）で染色した。７－ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ ｍｌ－１、１：１００）又はＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：１００）を死細胞を検出するために使用した。ヒト乳腺細胞を次の一次抗体、ＣＤ４５－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨ１３０、１：１００）、ＣＤ３１－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＷＭ－５９、１：１００）、ＥＰＣＡＭ－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン９Ｃ４、１：５０）、ＣＤ４９ｆ－ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧｏＨ３、１μｇ ｍｌ－１、１：２００）で染色した。ＤＡＰＩは死細胞を検出するために使用した。選別する前に、細胞をセルストレーナ（Ｐａｒｔｅｃ）で濾過した。細胞の選別は、選別直前に、自動セットアップビーズ（ＳＯＮＹ）又はＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎを使用して選別キャリブレーションを実行した後、ＳＨ８００Ｚソータ（ＳＯＮＹ）を使用して行った。単一染色された対照細胞を使用して、手動でコンペンセーションを行った。未染色の細胞及び対照動物を使用してゲートを設定した。ダブレットの後、死細胞並びに汚染された造血細胞、内皮細胞、間質細胞をゲートアウトした。ＳＨ８００ＺのＳＯＮＹソフトウェア又はＦｌｏｗＪｏを使用してＦＡＣＳデータを分析した。マウス細胞を乳腺管腔又は基底コンパートメントにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現について分析したか、あるいは管腔細胞を管腔前駆細胞ＣＦＣアッセイのために選別した。ｓｃＲＮＡｓｅｑの場合、ＥｐＣＡＭ陽性細胞をＨＦを含むＬｏＢｉｎｄマイクロ遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で選別した。選別後、細胞をスピンダウンし、ＨＦに再懸濁した。改良ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）チャンバを使用してサンプルを手動でカウントし、ＨＦの添加により細胞濃度を正規化した。サンプル当たり同数の細胞をｓｃＲＮＡライブラリ調製のために処理した。サンプルは、組織分離から９時間以内のライブラリ調製のために処理した。ヒト管腔前駆細胞は、ＲＮＡ処理のために選別した。
【0072】
管腔前駆細胞ＣＦＣアッセイ
管腔前駆細胞コロニー形成アッセイのために、５％ウシ胎児血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、１０ｎｇ ｍｌ－１上皮成長因子（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ ｍｌ－１塩基性線維芽細胞成長因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、４μｇ ｍｌ－１ヘパリン、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）及びゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）で補充したＥｐｉＣｕｌｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）において、照射したフィーダにより、管腔ｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ又はｔｄＴｏｍａｔｏｎｅｇ細胞を選別及び播種し、培養物を３７℃／５％ＣＯ２で１５日間維持し、次いで氷冷アセトン／メタノール（１：１）を使用して固定化し、ギムザ染色（Ｍｅｒｃｋ）を使用して可視化し、乳腺ＣＦＣの数を数えた。
管腔前駆細胞コロニー形成アッセイのために、５％ウシ胎児血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、１０ｎｇ ｍｌ－１上皮成長因子（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ ｍｌ－１塩基性線維芽細胞成長因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、４μｇ ｍｌ－１ヘパリン、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）及びゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）で補充したＥｐｉＣｕｌｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）において、照射したフィーダにより、管腔ｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ又はｔｄＴｏｍａｔｏｎｅｇ細胞を選別及び播種し、培養物を３７℃／５％ＣＯ２で１５日間維持し、次いで氷冷アセトン／メタノール（１：１）を使用して固定化し、ギムザ染色（Ｍｅｒｃｋ）を使用して可視化し、乳腺ＣＦＣの数を数えた。
【0073】
ＭＰＡ／ＤＭＢＡ腫瘍形成プロトコル
タモキシフェンの投与７週間後、単一のＭＰＡ徐放性ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）をマウスの皮下に移植した。マウスを１０日間回復させた後、１ｍｇのＤＭＢＡ（Ｓｉｇｍａ）を経口投与した。これに続いて、毎週１ｍｇのＤＭＢＡを更に３用量投与した。次に、マウスの腫瘍発生率を毎週検査し、最後のＤＭＢＡ投与の１１週間後に回収した。対照Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２、タモキシフェンを投与されなかったが、同じ腫瘍形成プロトコルを受けたｔｄＴｏｍ動物、及び同腹子Ｂｃｌ１１ａＷＴ、タモキシフェン及びＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコルの両方に曝露されたｔｄＴｏｍは、検出可能なｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞を有さず、ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の標識及び増殖がＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコルの人為結果ではないことを確認した。
タモキシフェンの投与７週間後、単一のＭＰＡ徐放性ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）をマウスの皮下に移植した。マウスを１０日間回復させた後、１ｍｇのＤＭＢＡ（Ｓｉｇｍａ）を経口投与した。これに続いて、毎週１ｍｇのＤＭＢＡを更に３用量投与した。次に、マウスの腫瘍発生率を毎週検査し、最後のＤＭＢＡ投与の１１週間後に回収した。対照Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２、タモキシフェンを投与されなかったが、同じ腫瘍形成プロトコルを受けたｔｄＴｏｍ動物、及び同腹子Ｂｃｌ１１ａＷＴ、タモキシフェン及びＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコルの両方に曝露されたｔｄＴｏｍは、検出可能なｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞を有さず、ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の標識及び増殖がＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコルの人為結果ではないことを確認した。
【0074】
光学的組織の透明化及びホールマウント免疫染色
乳腺組織を解剖し、免疫染色及び透明化のために大きな断片（約１５×１５×２ｍｍ）に切断した。前述のようにＣＵＢＩＣベースの組織透明化２７を行い（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８，１２７（２０１６）及びＮａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７，１３０５３（２０１６））、ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の可視化のためのホールマウント免疫標識と組み合わせた。簡単に説明すると、ＣＵＢＩＣ試薬１Ａは、蒸留水において、尿素（Ｓｉｇｍａ、１０％（ｗ／ｗ））、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、５％（ｗ／ｗ））、ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ＶＷＲ、１０％（ｗ／ｗ））及びＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、２５ｍＭ）を使用して調製した。ＣＵＢＩＣ試薬２は、蒸留水において、スクロース（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４％ｗ／ｗ）、尿素（Ｓｉｇｍａ、２２％ｗ／ｗ）、２，２’，２’’－ニトリロトリエタノール（Ｓｉｇｍａ、９％ｗ／ｗ）、及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＶＷＲ、０．１％ｗ／ｗ）を使用して調製した。組織をＣＵＢＩＣ試薬１Ａに３７℃で２～３日間浸漬した。免疫染色では、サンプルを洗浄した後、ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（０．５％（ｗ／ｖ））及びヤギ血清（１０％（ｖ／ｖ））を含むＰＢＳで４℃で一晩ブロッキングした。一次抗体をブロッキング緩衝液で４℃で４日間、穏やかに揺り動かしながら希釈した。組織を洗浄し（３×１時間）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体と２日間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、屈折率を一致させるために３７℃で少なくとも１日、ＣＵＢＩＣ試薬２に移した。サンプルを画像化のためにＣＵＢＩＣ試薬２に浸漬し、２週間以内に画像化した。以下の一次抗体、ラット抗ＥｐＣＡＭ－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧ８．８、１μｇ ｍｌ－１、１：２５０）、ウサギ抗Ｋ５（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＰＲＢ１６０Ｐ、１：１００）を免疫染色に使用した。以下のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体、ヤギ抗マウス４８８（Ａ１１００１）、ヤギ抗ラット６４７（Ａ２１２４７）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、１：５００で使用した。
乳腺組織を解剖し、免疫染色及び透明化のために大きな断片（約１５×１５×２ｍｍ）に切断した。前述のようにＣＵＢＩＣベースの組織透明化２７を行い（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８，１２７（２０１６）及びＮａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７，１３０５３（２０１６））、ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の可視化のためのホールマウント免疫標識と組み合わせた。簡単に説明すると、ＣＵＢＩＣ試薬１Ａは、蒸留水において、尿素（Ｓｉｇｍａ、１０％（ｗ／ｗ））、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、５％（ｗ／ｗ））、ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ＶＷＲ、１０％（ｗ／ｗ））及びＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、２５ｍＭ）を使用して調製した。ＣＵＢＩＣ試薬２は、蒸留水において、スクロース（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４％ｗ／ｗ）、尿素（Ｓｉｇｍａ、２２％ｗ／ｗ）、２，２’，２’’－ニトリロトリエタノール（Ｓｉｇｍａ、９％ｗ／ｗ）、及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＶＷＲ、０．１％ｗ／ｗ）を使用して調製した。組織をＣＵＢＩＣ試薬１Ａに３７℃で２～３日間浸漬した。免疫染色では、サンプルを洗浄した後、ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（０．５％（ｗ／ｖ））及びヤギ血清（１０％（ｖ／ｖ））を含むＰＢＳで４℃で一晩ブロッキングした。一次抗体をブロッキング緩衝液で４℃で４日間、穏やかに揺り動かしながら希釈した。組織を洗浄し（３×１時間）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体と２日間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、屈折率を一致させるために３７℃で少なくとも１日、ＣＵＢＩＣ試薬２に移した。サンプルを画像化のためにＣＵＢＩＣ試薬２に浸漬し、２週間以内に画像化した。以下の一次抗体、ラット抗ＥｐＣＡＭ－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧ８．８、１μｇ ｍｌ－１、１：２５０）、ウサギ抗Ｋ５（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＰＲＢ１６０Ｐ、１：１００）を免疫染色に使用した。以下のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体、ヤギ抗マウス４８８（Ａ１１００１）、ヤギ抗ラット６４７（Ａ２１２４７）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、１：５００で使用した。
【0075】
免疫蛍光法
乳腺の５μｍ切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又はＣｓｎ２（ｓｃ－１６６５３０、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、１：５０）及びＲＦＰ（６００－４０１－３７９、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、１：２００）に対する抗体で免疫染色した。二次染色には、ヤギ抗ウサギ６４７、ヤギ抗ラット６４７、又は抗マウス４８８、抗ウサギ５９４（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。核染色は、ＤＡＰＩを備えたＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｐ３６９４１）を使用して検出した。
乳腺の５μｍ切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又はＣｓｎ２（ｓｃ－１６６５３０、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、１：５０）及びＲＦＰ（６００－４０１－３７９、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、１：２００）に対する抗体で免疫染色した。二次染色には、ヤギ抗ウサギ６４７、ヤギ抗ラット６４７、又は抗マウス４８８、抗ウサギ５９４（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。核染色は、ＤＡＰＩを備えたＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｐ３６９４１）を使用して検出した。
【0076】
共焦点顕微鏡法及び画像分析
ホールマウント乳腺の画像は、１０×／０．４又は４０×／１．３のＨＣ ＰＬ ＡＰＯ対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８及びＳＰ５倒立共焦点顕微鏡を使用して取得した。Ｈ＆Ｅ画像は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡を使用して取得した。レーザ出力、ライン平均化、及び工程増分を手動で調整して、光退色を最小限に抑えながら各フルオロフォアに最適な蛍光強度を得た。画像オーバービュー及び３Ｄ再構成は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して生成した。
ホールマウント乳腺の画像は、１０×／０．４又は４０×／１．３のＨＣ ＰＬ ＡＰＯ対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８及びＳＰ５倒立共焦点顕微鏡を使用して取得した。Ｈ＆Ｅ画像は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡を使用して取得した。レーザ出力、ライン平均化、及び工程増分を手動で調整して、光退色を最小限に抑えながら各フルオロフォアに最適な蛍光強度を得た。画像オーバービュー及び３Ｄ再構成は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して生成した。
【0077】
発現差異
遺伝子発現差異分析は、ｅｄｇｅＲ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６，１３９－１４０（２０１０））を使用して行った。クラスター間のペアワイズ比較では、平均発現レベルが０．１未満の遺伝子を分析から除外した。負の二項一般化対数線形モデルは、共変量（複数可）としてクラスター割当により残りの遺伝子に適合した。「ｔｒｅｎｄ＝ＴＲＵＥ、ｒｏｂｕｓｔ＝ＴＲＵＥ」の「ｔｒｅａｔ」関数を使用して、ＦＤＲ０．０１でＩｏｇ２（１．５）よりも有意に高い対数倍数変化を有する遺伝子を同定した。細胞型の推論に使用されるマーカ遺伝子は、デフォルト設定のスクランで「ｆｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ」関数を使用して同定した。
遺伝子発現差異分析は、ｅｄｇｅＲ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６，１３９－１４０（２０１０））を使用して行った。クラスター間のペアワイズ比較では、平均発現レベルが０．１未満の遺伝子を分析から除外した。負の二項一般化対数線形モデルは、共変量（複数可）としてクラスター割当により残りの遺伝子に適合した。「ｔｒｅｎｄ＝ＴＲＵＥ、ｒｏｂｕｓｔ＝ＴＲＵＥ」の「ｔｒｅａｔ」関数を使用して、ＦＤＲ０．０１でＩｏｇ２（１．５）よりも有意に高い対数倍数変化を有する遺伝子を同定した。細胞型の推論に使用されるマーカ遺伝子は、デフォルト設定のスクランで「ｆｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ」関数を使用して同定した。
【0078】
ウェスタンブロット
製造元の指示に従って、ＲＩＰＡ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞を溶解した。組織溶解のために、乳腺組織を液体窒素、乳鉢及び乳棒を使用して粉砕した。粉砕したサンプルをＲＩＰＡに溶解した後、サンプルを２５Ｇの針に通した。総タンパク質は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して測定した。合計で、５０μｇの細胞溶解物を７．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分離し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写した。膜は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中の５％（ｗ／ｖ）乳汁でブロックした。次に、示されているように、ブロットを一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、続いて室温で１時間二次抗体でプローブした。次いで、ＥＣＬ溶液を膜に加えて分析した。使用した抗体は、ＢＣＬ１１Ａ（Ａ３００－３８０Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ、１：１０００）、ＷＡＰ（ｓｃ－３９８２７６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１０００）及びβ－アクチン（ｓｃ－１３０６５６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１０００）であった。
製造元の指示に従って、ＲＩＰＡ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞を溶解した。組織溶解のために、乳腺組織を液体窒素、乳鉢及び乳棒を使用して粉砕した。粉砕したサンプルをＲＩＰＡに溶解した後、サンプルを２５Ｇの針に通した。総タンパク質は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して測定した。合計で、５０μｇの細胞溶解物を７．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分離し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写した。膜は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中の５％（ｗ／ｖ）乳汁でブロックした。次に、示されているように、ブロットを一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、続いて室温で１時間二次抗体でプローブした。次いで、ＥＣＬ溶液を膜に加えて分析した。使用した抗体は、ＢＣＬ１１Ａ（Ａ３００－３８０Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ、１：１０００）、ＷＡＰ（ｓｃ－３９８２７６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１０００）及びβ－アクチン（ｓｃ－１３０６５６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１０００）であった。
【0079】
液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）
等量の６ＭのＧｕＨＣＩを血清に加え、混合した。次に、有機溶媒（７５％ＡＣＮ）を添加し、サンプルを混合した。サンプルを遠心分離し、上澄みを移し、ＯＦＮ下で蒸発させた。抽出物を０．１％ギ酸に再構成し、Ｗａｔｅｒｓ ＨＬＢ Ｍｉｃｒｏ溶出プレートにロードし、ＳＰＥで抽出した。溶離液を蒸発させ、還元し、アルキル化した後、消化し、ナノＬＣシステムを使用したＬＣ－ＭＳで分析した。ペプチドは、ＰＲＭ及びＩＤＡベースの分析を使用したＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ ｏｒｂｉｔｒａｐを使用して分析した。
等量の６ＭのＧｕＨＣＩを血清に加え、混合した。次に、有機溶媒（７５％ＡＣＮ）を添加し、サンプルを混合した。サンプルを遠心分離し、上澄みを移し、ＯＦＮ下で蒸発させた。抽出物を０．１％ギ酸に再構成し、Ｗａｔｅｒｓ ＨＬＢ Ｍｉｃｒｏ溶出プレートにロードし、ＳＰＥで抽出した。溶離液を蒸発させ、還元し、アルキル化した後、消化し、ナノＬＣシステムを使用したＬＣ－ＭＳで分析した。ペプチドは、ＰＲＭ及びＩＤＡベースの分析を使用したＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ ｏｒｂｉｔｒａｐを使用して分析した。
【0080】
統計的有意性
図のレジェンドに特に示されていない限り、全てのＰ値はスチューデントのｔ検定を使用して計算した。
図のレジェンドに特に示されていない限り、全てのＰ値はスチューデントのｔ検定を使用して計算した。
【0081】
結果
胞の形成におけるＢｃｌ１１Ａの役割
Ｂｃｌ１１ａ発現細胞が胞分化及びＴＮＢＣ腫瘍開始の部分をなすかどうかを評価するために、ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２カセットをＢｃｌ１１ａの３’ＵＴＲ領域にノックインすることにより、Ｂｃｌ１１ａレポータマウスを作製し、これは本明細書ではＢｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２と呼ばれる。これらのマウスは、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポータマウス（ｔｄＴｏｍ）と交配した場合に系譜追跡を実行することを可能にした。タモキシフェンを介したＣｒｅＥＲＴ２の活性化は、Ｂｃｌ１１ａ発現細胞及びそれらの任意の将来の子孫でｔｄＴｏｍａｔｏの発現を誘導した（図１Ａ）。標識の１日後の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の大部分（９５％±１．６）が管腔コンパートメント内に存在し、主に管腔前駆細胞であることが明らかになった（図１Ａ）。
胞の形成におけるＢｃｌ１１Ａの役割
Ｂｃｌ１１ａ発現細胞が胞分化及びＴＮＢＣ腫瘍開始の部分をなすかどうかを評価するために、ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２カセットをＢｃｌ１１ａの３’ＵＴＲ領域にノックインすることにより、Ｂｃｌ１１ａレポータマウスを作製し、これは本明細書ではＢｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２と呼ばれる。これらのマウスは、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポータマウス（ｔｄＴｏｍ）と交配した場合に系譜追跡を実行することを可能にした。タモキシフェンを介したＣｒｅＥＲＴ２の活性化は、Ｂｃｌ１１ａ発現細胞及びそれらの任意の将来の子孫でｔｄＴｏｍａｔｏの発現を誘導した（図１Ａ）。標識の１日後の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の大部分（９５％±１．６）が管腔コンパートメント内に存在し、主に管腔前駆細胞であることが明らかになった（図１Ａ）。
【0082】
Ｂｃｌ１１ａ標識細胞が胞形成プロセスに寄与するかどうかを調べるために、タモキシフェン注射後８週に雌を交配させ、妊娠１４．５日でマウスを分析した。ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ管腔細胞の数が有意に増加して、管腔コンパートメントの約３０％を構成し、自然離乳後の分析により、未経産マウスと同様のレベルで標識細胞の持続性が明らかになったことが見出された（図１Ｂ）。
【0083】
上記のデータは、胞産生におけるＢｃｌ１１ａの役割を裏付ける。
【0084】
Ｂｃｌｌ１１ａの発現は、ＴＮＢＣモデルの初期段階の腫瘍発生における検出である
ＴＮＢＣ発症の初期段階で長寿命のｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ細胞の役割を調べるために、Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍマウスは、ＴＮＢＣ腫瘍形成のＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコル（図２Ａ）（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，８，Ｒ７６（２００７）及びＮａｔｕｒｅ，４６８，１０３－１０７（２０１０））を受け、これはＢｃｌ１１ａ依存性であることが以前に示されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１５，９０７－９１３（２００９））。ＤＭＢＡ投与後の１１週の前癌段階における腺のタイルスキャンは、ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の拡大及び胞様構造の出現を明らかにし、場合によっては、この拡大は、成長し管腔に侵入した異常な構造の形成を導いた（図２Ｂ）。
ＴＮＢＣ発症の初期段階で長寿命のｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ細胞の役割を調べるために、Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍマウスは、ＴＮＢＣ腫瘍形成のＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコル（図２Ａ）（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，８，Ｒ７６（２００７）及びＮａｔｕｒｅ，４６８，１０３－１０７（２０１０））を受け、これはＢｃｌ１１ａ依存性であることが以前に示されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１５，９０７－９１３（２００９））。ＤＭＢＡ投与後の１１週の前癌段階における腺のタイルスキャンは、ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の拡大及び胞様構造の出現を明らかにし、場合によっては、この拡大は、成長し管腔に侵入した異常な構造の形成を導いた（図２Ｂ）。
【0085】
Ｂｃｌｌ１１ａのＫ／ＯマウスはＴＮＢＣを発症しない
ドライバー癌遺伝子がＴＮＢＣの管腔前駆細胞の運命をどのように調節するかを調査するために、管腔前駆細胞コンパートメントの条件付きＢｒｃａ１機能喪失を含む、Ｂｒｃａ１／ｐ５３のＴＮＢＣマウスモデル（Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ）を、ＴＮＢＣ癌遺伝子ＢＣＬ１１Ａ１に焦点を当てて、使用した。管腔前駆細胞におけるＢｃｌ１１ａの欠失は、Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスを乳腺腫瘍の形成から完全に保護することが見出され（図１Ａ）、Ｂｃｌ１１ａがＢｒｃａ１を介したＴＮＢＣに不可欠であることを示唆した。
ドライバー癌遺伝子がＴＮＢＣの管腔前駆細胞の運命をどのように調節するかを調査するために、管腔前駆細胞コンパートメントの条件付きＢｒｃａ１機能喪失を含む、Ｂｒｃａ１／ｐ５３のＴＮＢＣマウスモデル（Ｂｒｃａ１ｆ／ｆ；ｐ５３＋／－；Ｂｌｇ－Ｃｒｅ）を、ＴＮＢＣ癌遺伝子ＢＣＬ１１Ａ１に焦点を当てて、使用した。管腔前駆細胞におけるＢｃｌ１１ａの欠失は、Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスを乳腺腫瘍の形成から完全に保護することが見出され（図１Ａ）、Ｂｃｌ１１ａがＢｒｃａ１を介したＴＮＢＣに不可欠であることを示唆した。
【0086】
乳腺組織のＲＮＡＳｅｑは、担癌マウス（Ｂｃｌ１１Ａ Ｋ／Ｏ）では胞様細胞を同定するが、無病動物（Ｂｃｌ１１Ａ ＷＴ）では同定しない。
腫瘍（Ｂｃｌ１１ａ陽性）の３０週目及び非腫瘍（Ｂｃｌ１１ａ欠失）動物３３週目（３３週目は腫瘍の物理的証拠の前）の乳腺組織のＲＮＡＳｅｑ。クラスタリング分析は、腫瘍動物と非腫瘍動物との間の４つの一般的な細胞集団を明らかにする。Ｌｐ；管腔前駆細胞、Ｈｓｐ；ホルモン感知前駆細胞、Ｈｓｄ；ホルモン感知分化及びＢｓｌ；基底。担癌動物には、Ｌｐ－Ａｖ（胞細胞）の集団が存在した。
腫瘍（Ｂｃｌ１１ａ陽性）の３０週目及び非腫瘍（Ｂｃｌ１１ａ欠失）動物３３週目（３３週目は腫瘍の物理的証拠の前）の乳腺組織のＲＮＡＳｅｑ。クラスタリング分析は、腫瘍動物と非腫瘍動物との間の４つの一般的な細胞集団を明らかにする。Ｌｐ；管腔前駆細胞、Ｈｓｐ；ホルモン感知前駆細胞、Ｈｓｄ；ホルモン感知分化及びＢｓｌ；基底。担癌動物には、Ｌｐ－Ａｖ（胞細胞）の集団が存在した。
【0087】
これは、初期の腫瘍形成（物理的兆候の前）では、無病動物には存在しない胞細胞の集団が存在することを示唆する。
【0088】
乳腺の特異的なＢｃｌ１１Ａの過剰発現は胞形成を促進し、これらの構造は、妊娠していない初期段階の腫瘍を有する動物でも観察することができる。
Ｂｒｃａ１／ｐ５３モデルのＢｃｌ１１ａ欠失のこの保護効果を支える細胞イベントを同定するために、腫瘍が検出される前に、３０～３３週齢の未経産のＢｒｃａ１／ｐ５３及びＢｃｌ１１ａｆ／ｆ；Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスからの乳腺上皮細胞に対するｓｃＲＮＡｓｅｑを実施した。Ｂｒｃａ１／ｐ５３乳腺上皮は、妊娠中のマウスの上皮に表現型が似ていることがわかり（図５）、これは、Ｂｒｃａ１／ｐ５３の異なるモデルにおける早発な乳腺胞形成の以前の報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）３１４，１４６７ＬＰ－１４７０（２００６））と一致している。
Ｂｒｃａ１／ｐ５３モデルのＢｃｌ１１ａ欠失のこの保護効果を支える細胞イベントを同定するために、腫瘍が検出される前に、３０～３３週齢の未経産のＢｒｃａ１／ｐ５３及びＢｃｌ１１ａｆ／ｆ；Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスからの乳腺上皮細胞に対するｓｃＲＮＡｓｅｑを実施した。Ｂｒｃａ１／ｐ５３乳腺上皮は、妊娠中のマウスの上皮に表現型が似ていることがわかり（図５）、これは、Ｂｒｃａ１／ｐ５３の異なるモデルにおける早発な乳腺胞形成の以前の報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）３１４，１４６７ＬＰ－１４７０（２００６））と一致している。
【0089】
Ｂｃｌ１１ａｆ／ｆ、Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスのｓｃＲＮＡｓｅｑ及びホールマウント分析は、Ｂｃｌ１１ａを削除すると、管腔前駆細胞の異常な分化挙動が完全に消失することを明らかにした（図５）。
【0090】
上記の結果は、ＴＮＢＣの初期段階で、Ｂｃｌ１１ａに依存する胞形成が起こることを示唆する。
【0091】
ＭＰＡ／ＤＭＢＡ処理動物に対する異常な分化の検出
次に、ＴＮＢＣ発症の初期段階で長寿命のｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ細胞の役割を調査した。Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍマウスは、ＴＮＢＣ腫瘍形成のＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコル（図７Ａ）（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，８，Ｒ７６（２００７）及びＮａｔｕｒｅ，４６８，１０３－１０７（２０１０））を受け、これは、Ｂｃｌ１１ａに依存することが以前に示されている（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，６，５９８７（２０１５））。ＤＭＢＡ投与後１１週の前癌段階における腺のタイルスキャンは、ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の拡大及び胞様構造の出現を明らかにした（図７Ｂ）。場合によっては、拡大により異常な構造が形成され、それが成長し、管腔に侵入した（図７Ｃ）。これらの構造の３Ｄ画像化は、ｉｎ ｓｉｔｕで異型乳管過形成及び乳管癌に対する類似性を明らかにした（図７Ｃ）。これらのマウスのＩＨＣ分析により、胞様構造の外観と互換性があり、Ｂｒｃａ１／ｐ５３モデルで行われた観察と一致する、乳汁産生細胞の外観が明らかになった（図７Ｄ）。ＲＮＡは、ＭＰＡ／ＤＭＢＡ処理後の様々な時点でＦＡＣＳ分離された管腔前駆細胞から抽出した。図７Ｅは、様々なサンプルにおけるＣｓｎ２の発現を示す。ＭＰＡ単独のマウスは、サンプル回収の３週間前にＭＰＡを受けた。定量化は、最初にＧａｐｄｈレベルに対して、ＭＰＡ単独のサンプルと比較して正規化することによって実行した。
次に、ＴＮＢＣ発症の初期段階で長寿命のｔｄＴｏｍａｔｏｐоｓ細胞の役割を調査した。Ｂｃｌ１１ａＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍマウスは、ＴＮＢＣ腫瘍形成のＭＰＡ／ＤＭＢＡプロトコル（図７Ａ）（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，８，Ｒ７６（２００７）及びＮａｔｕｒｅ，４６８，１０３－１０７（２０１０））を受け、これは、Ｂｃｌ１１ａに依存することが以前に示されている（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，６，５９８７（２０１５））。ＤＭＢＡ投与後１１週の前癌段階における腺のタイルスキャンは、ｔｄＴｏｍａｔｏｐｏｓ細胞の拡大及び胞様構造の出現を明らかにした（図７Ｂ）。場合によっては、拡大により異常な構造が形成され、それが成長し、管腔に侵入した（図７Ｃ）。これらの構造の３Ｄ画像化は、ｉｎ ｓｉｔｕで異型乳管過形成及び乳管癌に対する類似性を明らかにした（図７Ｃ）。これらのマウスのＩＨＣ分析により、胞様構造の外観と互換性があり、Ｂｒｃａ１／ｐ５３モデルで行われた観察と一致する、乳汁産生細胞の外観が明らかになった（図７Ｄ）。ＲＮＡは、ＭＰＡ／ＤＭＢＡ処理後の様々な時点でＦＡＣＳ分離された管腔前駆細胞から抽出した。図７Ｅは、様々なサンプルにおけるＣｓｎ２の発現を示す。ＭＰＡ単独のマウスは、サンプル回収の３週間前にＭＰＡを受けた。定量化は、最初にＧａｐｄｈレベルに対して、ＭＰＡ単独のサンプルと比較して正規化することによって実行した。
【0092】
上記の結果は、Ｃｓｎ２の発現が治療後３週の管腔前駆細胞で観察されたのに対し、腫瘍は治療後およそ１２～１４週まで観察されなかったことを示す。したがって、これらの結果は、本発明、特に対象の乳房における異常に分化した管腔前駆細胞及び／又はＣｓｎ２の検出が、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）の初期兆候を検出するための優れた方法であることを実証する。
【0093】
ＣＳＮ２及び／又はＷＡＰの検出
驚くべきことに、Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスの乳腺組織のＬＣ－ＭＳ分析により、ＣＳＮ２及びＷＡＰに一致するペプチドを検出できることが見出された（図８及び９）。これは、上記の管腔前駆細胞の異常な分化を示すマウスと相関している。
驚くべきことに、Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスの乳腺組織のＬＣ－ＭＳ分析により、ＣＳＮ２及びＷＡＰに一致するペプチドを検出できることが見出された（図８及び９）。これは、上記の管腔前駆細胞の異常な分化を示すマウスと相関している。
【0094】
更に、ＬＣ－ＭＳを使用して、授乳中のＷＴマウスの血液で同じペプチドを検出することができ、これは、これらのタンパク質が血液に入る可能性があることを示している（図１０及び１１）。これらの乳タンパク質ペプチドは、雄マウスの血清では（ＬＣ－ＭＳを使用して）検出されない。したがって、これらのペプチドは、より感度の高い方法を使用して、Ｂｒｃａ１病原性変異体（ＰＶ）を有する女性の異常な管腔分化の早期発見に使用することができる。
【0095】
ＣＳＮ２をコードするＲＮＡは、ｑＰＣＲを使用して、Ｂｒｃａ１／ｐ５３マウスの血液でも検出されている。同じＲＮＡは雄マウスの血液では（ｑＰＣＲを使用して）検出できなかった。
【0096】
ヒトのデータ
ＲＮＡは、ｉ）対照患者、又はｉｉ）ＢＲＣＡ１担持患者のいずれかからＦＡＣＳ単離された乳腺管腔前駆細胞から抽出した。次に、これらのヒトサンプルにおけるＣＳＮ２発現を決定した。定量化は、最初にＧＡＰＤＨレベルに対して、対照ＳＴＧ２１８と比較して正規化することによって実行した。
ＲＮＡは、ｉ）対照患者、又はｉｉ）ＢＲＣＡ１担持患者のいずれかからＦＡＣＳ単離された乳腺管腔前駆細胞から抽出した。次に、これらのヒトサンプルにおけるＣＳＮ２発現を決定した。定量化は、最初にＧＡＰＤＨレベルに対して、対照ＳＴＧ２１８と比較して正規化することによって実行した。
【0097】
図６は、ＩＨＣによって測定された、ＢＲＣＡ１変異キャリア及び非ＢＲＣＡ１キャリア（正常）におけるＣＳＮ２の平均タンパク質発現（図６Ａ）、並びにｑＰＣＲによって測定された、ＢＲＣＡ１変異キャリア及び非ＢＲＣＡ１キャリア（正常）におけるＣＳＮ２の平均ＲＮＡ発現を（図６Ｂ）示す。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A-B】
【図7C-D】
【図7E】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
