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特許7634551標的核酸を検出するためのループプライマー及びループ・デ・ループ方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-13
(45)【発行日】2025-02-21
(54)【発明の名称】標的核酸を検出するためのループプライマー及びループ・デ・ループ方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20250214BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20250214BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20250214BHJP
C12Q 1/6881 20180101ALI20250214BHJP
C12Q 1/6848 20180101ALI20250214BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6881 Z
C12Q1/6848 Z
【請求項の数】
36
(21)【出願番号】P 2022555105
(86)(22)【出願日】2021-03-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-28
(86)【国際出願番号】 US2021022192
(87)【国際公開番号】W WO2021183941
(87)【国際公開日】2021-09-16
【審査請求日】2024-03-12
(31)【優先権主張番号】62/989,140
(32)【優先日】2020-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522362257
【氏名又は名称】ユーエイチ－オーエイチ ラブス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100145791
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 志麻子
(74)【代理人】
【識別番号】100126354
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 尚
(72)【発明者】
【氏名】ボール，キャメロン，スコット
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】特表２００１－５１３６２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】THELWELL, Nicola et al.，“Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection”，Nucleic Acids Research，2000年10月01日，Vol. 28，No. 19，pp.3752-3761，DOI: 10.1093/nar/28.19.3752
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、（ｉ）５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
前記標的配列と相補的ではないスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含むループプライマーであって、前記ループプライマーが、前記標的配列に結合した場合に、鎖置換ポリメラーゼにより増幅されるように構成されている、ループプライマーと、
（ｉｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｖ）フォワードプライマー（Ｆ３）及び（ｖ）バックワードプライマー（Ｂ３）、（ｖｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｖｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）とを含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合し、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ、及び前記ＬＢの少なくとも１つが、前記第１の結合部位に結合する、プライマー混合物。
【請求項2】
第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、請求項１に記載のプライマー混合物。
【請求項3】
前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、請求項２に記載のプライマー混合物。
【請求項4】
（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項２に記載のプライマー混合物。
【請求項5】
（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項２に記載のプライマー混合物。
【請求項6】
第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第３のプライマー配列と、
を含む、請求項２に記載のプライマー混合物。
【請求項7】
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、請求項１に記載のプライマー混合物と、ポリメラーゼとを含み、前記ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼである、キット。
【請求項8】
逆転写酵素をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
試料中の標的配列を検出する方法であって、前記試料を用意する工程と、
（ｉ）請求項１に記載のプライマー混合物と、ポリメラーゼとを前記試料に添加し、それにより反応混合物を生成する工程と、
前記反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と、
前記反応混合物からの蛍光信号を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項10】
標的配列のループ・デ・ループ増幅（ＬｄＬ）のためのループプライマーであって、５’から３’に向って、第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含み、
第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第１のさらなるオリゴヌクレオチドが、前記ループプライマーの５’末端にあり、前記第１のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、
ループプライマー。
【請求項11】
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項12】
前記第１のバイオセンサ対が、エネルギー供与体と受容体の対である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項13】
前記第１のバイオセンサ対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である、請求項１２に記載のループプライマー。
【請求項14】
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が、検出可能な光信号を生成する複合体を形成し得る、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項15】
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が６０℃を超える、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項16】
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超える、請求項１５に記載のループプライマー。
【請求項17】
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が８０℃を超える、請求項１６に記載のループプライマー。
【請求項18】
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が７０から８０℃である、請求項１５に記載のループプライマー。
【請求項19】
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が６０℃未満である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項20】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドの各々が、３から１０ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項21】
前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、５から３５ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項22】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項23】
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項24】
第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第２のさらなるオリゴヌクレオチドが前記第１のセンサ分子と前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間にあり、前記第１のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列であり、かつ前記第２のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項25】
前記標的配列が病原体ゲノムに特異的である、請求項１０に記載のループプライマー。
【請求項26】
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、請求項１０に記載のループプライマーを含む、プライマー混合物。
【請求項27】
（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３及び前記Ｂ３が、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項２６に記載のプライマー混合物。
【請求項28】
（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含み、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項２７に記載のプライマー混合物。
【請求項29】
第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、請求項２６に記載のプライマー混合物。
【請求項30】
前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、請求項２９に記載のプライマー混合物。
【請求項31】
（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項２９に記載のプライマー混合物。
【請求項32】
（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項２９に記載のプライマー混合物。
【請求項33】
第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、請求項２９に記載のプライマー混合物。
【請求項34】
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、請求項１０に記載のループプライマー及びポリメラーゼを含む、キット。
【請求項35】
逆転写酵素をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項36】
前記ポリメラーゼが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス・ポリメラーゼである、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９８９，１４０号の優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９８９，１４０号の優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
【0002】
２．配列表
本出願は、ＸＸＸ配列を有する配列表を含み、これはＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＸＸＸＸに作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名前は４８３９７ＷＯ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズはＸＸＸバイトである。
本出願は、ＸＸＸ配列を有する配列表を含み、これはＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＸＸＸＸに作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名前は４８３９７ＷＯ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズはＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【0003】
３．背景
核酸配列の相補性を使用して標的核酸を検出する方法は、伝統的なサザンハイブリダイゼーションから今日に至るまで様々に改良又は改変されてきた。特に、様々なインビトロ核酸増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及びループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）の確立によって、より少量の標的核酸を検出することが可能になった。これらの方法は、感染症の医学的診断、突然変異遺伝子型の決定、一塩基多型（ＳＮＰ）及び点突然変異の検出などのための試料中の標的核酸の配列特異的検出及び定量化に使用されてきた。核酸増幅方法は、その高い特異性及び感度のために、試験のゴールドスタンダードであった。
核酸配列の相補性を使用して標的核酸を検出する方法は、伝統的なサザンハイブリダイゼーションから今日に至るまで様々に改良又は改変されてきた。特に、様々なインビトロ核酸増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及びループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）の確立によって、より少量の標的核酸を検出することが可能になった。これらの方法は、感染症の医学的診断、突然変異遺伝子型の決定、一塩基多型（ＳＮＰ）及び点突然変異の検出などのための試料中の標的核酸の配列特異的検出及び定量化に使用されてきた。核酸増幅方法は、その高い特異性及び感度のために、試験のゴールドスタンダードであった。
【0004】
しかしながら、増幅反応及び信号検出には、制御された環境及び高価な機器を用いた正確な測定が必要であるため、現在の核酸増幅方法には限界がある。したがって、この方法は、多くの場合、ポイント・オブ・ケア状況で使用するのには法外な費用がかかる。さらに、この方法は、単一の患者の試料における多重化標的の検出のために最適化されていない。多重化標的の検出は、シングルポット反応における信号多重化（蛍光スペクトル多重化、電気化学検出器のアレイ）、複数の反応の固有の反応容器への物理的分離、又はそれらの組み合わせによって達成され得る。しかしながら、ＣＬＩＡ放棄試験の場合、単一の患者の試料を使用して核酸標的のパネルを同時に照会するために、ユーザは３工程以下の簡素な工程を求めるはずである。したがって、複雑な装置又はディスポーザブルがプロセスを自動的に処理しない限り、試料を別個のチャンバに物理的に分離することは、ＣＬＩＡ放棄試験ではすぐに実行不可能になる。蛍光によるスペクトル多重化は、核酸標的のパネルを標的化するのに必要な固有の反応の数を減らすことができるが、スペクトル多重化ＬＡＭＰ反応は、アッセイ速度又は信号強度を劇的に犠牲にする必要があり、このことがＰＯＣ試験へうまく適用する見込みをくじく。
【0005】
そのため、標的核酸、特に多重化された標的を低コストで高い感度及び特異性をもって容易に増幅及び検出することを可能にする新たな方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【0006】
４．概要
本開示は、閉鎖系において標的核酸の検出を容易に行うことを可能にする新たな増幅方法を提供する。本方法は、バイオセンサ対を有するループプライマーを用いることにより、少量の標的核酸を高い特異性及び感度をもって検出することを可能にする。バイオセンサ対は、例えば、蛍光／クエンチャーＦＲＥＴ技術を使用して、ループプライマーの立体配座の変化を検出することによって、標的配列のループ・デ・ループ（「ＬＤＬ」）増幅の決定を可能にする。さらに、複数のバイオセンサを使用することによって、単一のチューブの中の多重化標的を検出することが可能になる。ループプライマーは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）だけでなく、鎖置換ポリメラーゼを利用する任意の他の核酸増幅方法と組み合わせて使用することができる。
本開示は、以下の［１］から［９５］を含む。
［１］標的配列のループ・デ・ループ増幅（ＬｄＬ）のためのループプライマーであって、５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含むループプライマー。
［２］前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［１］に記載のループプライマー。
［３］前記第１のバイオセンサ対が、エネルギー供与体と受容体の対である、上記［１］又は［２］に記載のループプライマー。
［４］前記第１のバイオセンサ対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である、上記［３］に記載のループプライマー。
［５］前記第１のセンサ分子がＦＲＥＴフルオロフォアであり、前記第２のセンサ分子がＦＲＥＴクエンチャーである、上記［３］に記載のループプライマー。
［６］前記第１のセンサ分子がＦＲＥＴクエンチャーであり、前記第２のセンサ分子がＦＲＥＴフルオロフォアである、上記［３］に記載のループプライマー。
［７］前記第１のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー供与体であり、前記第２のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー受容体である、上記［３］に記載のループプライマー。
［８］前記第１のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー受容体であり、前記第２のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー供与体である、上記［３］に記載のループプライマー。
［９］前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が、検出可能な光信号を生成する複合体を形成し得る、上記［１］に記載のループプライマー。
［１０］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６０℃を超える、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１１］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６５℃を超える、上記［１０］に記載のループプライマー。
［１２］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が７０℃を超える、上記［１１］に記載のループプライマー。
［１３］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が８０℃を超える、上記［１２］に記載のループプライマー。
［１４］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が７０から８０℃である、上記［１２］に記載のループプライマー。
［１５］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が７２．５から７７．５℃である、上記［１３］に記載のループプライマー。
［１６］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が約７５℃である、上記［１４］に記載のループプライマー。
［１７］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６０℃未満である、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１８］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６０から６５℃である、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１９］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、３から１０ヌクレオチド長である、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２０］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、３から７ヌクレオチド長である、上記［１９］に記載のループプライマー。
［２１］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、６ヌクレオチド長である、上記［２０］に記載のループプライマー。
［２２］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、５から３５ヌクレオチド長である、上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２３］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１０から２０ヌクレオチド長である、上記［２２］に記載のループプライマー。
［２４］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１３から１８ヌクレオチド長である、上記［２３］に記載のループプライマー。
［２５］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１３ヌクレオチド長である、上記［２４］に記載のループプライマー。
［２６］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である、上記［１］～［２５］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２７］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、２０から３０ヌクレオチド長である、上記［２６］に記載のループプライマー。
［２８］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、２３から２８ヌクレオチド長である、上記［２７］に記載のループプライマー。
［２９］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む、上記［１］～［２８］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３０］前記ループプライマーの５’末端に第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む、上記［１］～［２９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３１］前記第１のセンサ分子と前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間に第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む、上記［１］～［３０］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３２］前記第１又は第２のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、上記［３０］又は［３１］に記載のループプライマー。
［３３］前記標的配列が病原体ゲノムに特異的である、上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３４］前記標的配列がクラミジア・トラコマチスに特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［３５］前記標的配列がｏｒｆ８又はｃｄｓ２に由来する、上記［３４］に記載のループプライマー。
［３６］配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、上記［３４］に記載のループプライマー。
［３７］前記標的配列が、淋菌に特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［３８］前記標的配列が、ｐｏｒＡ又はｇｌｎＡに由来する、上記［３７］に記載のループプライマー。
［３９］配列番号５又は配列番号７のオリゴヌクレオチドを含む、上記［３７］に記載のループプライマー。
［４０］前記標的配列がウイルスに特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［４１］前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、上記［４０］に記載のループプライマー。
［４２］前記標的配列がホモサピエンスに特異的である、上記［１］～［３０］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［４３］前記標的配列がｔｂｃ１ｄ３に由来する、上記［４２］に記載のループプライマー。
［４４］配列番号２２のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４２］に記載のループプライマー。
［４５］標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマーを含む、プライマー混合物。
［４６］（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３及び前記Ｂ３が、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［４５］に記載のプライマー混合物。
［４７］（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含み、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［４６］に記載のプライマー混合物。
［４８］前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ、又は前記ＬＢが前記標的配列上の前記第１の結合部位に結合する、上記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［４９］前記ＦＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＦＩＰと前記ループプライマーの量の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５０］前記ＢＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＢＩＰと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５１］前記ＬＦが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＦと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５２］前記ＬＢが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＢと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５３］前記Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５４］前記Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５５］前記Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５６］前記Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５７］前記Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５８］前記Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５９］第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、上記［４５］～［５８］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６０］前記第３のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［５９］に記載のプライマー混合物。
［６１］前記標的配列と前記第２の標的配列が同一である、上記［５９］又は［６０］に記載のプライマー混合物。
［６２］前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、上記［５９］又は［６０］に記載のプライマー混合物。
［６３］（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［５９］～［６２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６４］（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［５９］～［６０］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６５］第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、上記［４５］～［６４］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６６］前記第５のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［６５］に記載のプライマー混合物。
［６７］前記標的配列、前記第２の標的配列及び前記第３の標的配列が同一である、上記［６５］又は［６６］に記載のプライマー混合物。
［６８］前記標的配列、前記第２の標的配列及び前記第３の標的配列が異なる、上記［６５］又は［６６］に記載のプライマー混合物。
［６９］（ｉ）第３のフォワードインナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３のバックワードインナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３のフォワードプライマー（ＴＦ３）、及び（ｉｖ）第３のバックワードプライマー（ＴＢ３）をさらに含み、前記ＴＦＩＰ、前記ＴＢＩＰ、前記ＴＦ３、及び前記ＴＢ３が、前記第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［６５］～［６８］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７０］（ｉ）第３のループフォワードプライマー（ＴＬＦ）及び（ｉｉ）第３のループバックワードプライマー（ＴＬＢ）をさらに含み、前記ＴＬＦ及び前記ＴＬＢが、前記第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［６５］～［６９］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７１］第４のループプライマーをさらに含む、上記［６５］～［７０］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７２］第５のループプライマーをさらに含む、上記［７１］に記載のプライマー混合物。
［７３］上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマー又は上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物を凍結乾燥することによって得られる乾燥プライマー混合物。
［７４］標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、
上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマー、上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物、又は上記［７３］に記載の乾燥プライマー混合物を含む、キット。
［７５］ポリメラーゼをさらに含み、前記ポリメラーゼが、任意選択で、バチルス・ステアロサーモフィルス・ポリメラーゼである、上記［７４］に記載のキット。
［７６］ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ ４ 及び緩衝液をさらに含む、上記［７４］～［７５］のいずれか一項に記載のキット。
［７７］逆転写酵素をさらに含む、上記［７４］～［７６］のいずれか一項に記載のキット。
［７８］ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、上記［７４］～［７７］のいずれか一項に記載のキット。
［７９］前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタ又はマウスのＲＮａｓｅ阻害剤である、上記［７８］に記載のキット。
［８０］試料中の標的配列を検出する方法であって、
試料を用意する工程と、
（ｉ）上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のプライマー、（ｉｉ）上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物、又は（ｉｉｉ）上記［７３］に記載の乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた再構成プライマー混合物と、ポリメラーゼとを試料に添加し、それにより反応混合物を生成する工程と、
前記反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と
を含む、方法。
［８１］前記インキュベーションが５０～７０℃で行われる、上記［８０］に記載の方法。
［８２］前記インキュベーションが６０～６５℃で行われる、上記［８１］に記載の方法。
［８３］前記インキュベーションが６２～６５℃で行われる、上記［８２］に記載の方法。
［８４］前記ポリメラーゼがバチルス・ステアロサーモフィルスポリメラーゼである、上記［８０］～［８３］のいずれか一項に記載の方法。
［８５］前記反応混合物からの信号を検出する工程をさらに含む、上記［８０］～［８４］のいずれか一項に記載の方法。
［８６］前記信号が蛍光信号である、上記［８５］に記載の方法。
［８７］前記検出する工程が、前記インキュベーションの工程の間に行われる、上記［８５］～［８６］のいずれか一項に記載の方法。
［８８］前記試料中の前記標的配列の存在又は非存在を調べる工程をさらに含む、上記［８０］～［８７］のいずれか一項に記載の方法。
［８９］前記試料を調製する先行する工程をさらに含む、上記［８０］～［８８］のいずれか一項に記載の方法。
［９０］前記試料を調製する工程が、逆転写酵素とＲＮＡ分子を相互作用させることを含み、それにより、ＤＮＡ分子を含む前記試料を生成する、上記［８９］に記載の方法。
［９１］前記試料を調製する工程が、前記逆転写酵素と相互作用させる前又は前記逆転写酵素の間に前記ＲＮＡ分子を予熱する工程をさらに含む、上記［９０］に記載の方法。
［９２］前記反応混合物がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、上記［８０］～［９１］のいずれか一項に記載の方法。
［９３］前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタ又はマウスのＲＮＡ阻害剤である、上記［９２］に記載の方法。
［９４］前記試料が、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、全ヒト細胞、唾液若しくは鼻スワブ、又は鼻若しくは鼻咽頭スワブを含む、上記［８０］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。
［９５］前記試料が、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全細菌又は膣スワブ由来の全ヒト細胞を含む、上記［８０］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。
本開示は、閉鎖系において標的核酸の検出を容易に行うことを可能にする新たな増幅方法を提供する。本方法は、バイオセンサ対を有するループプライマーを用いることにより、少量の標的核酸を高い特異性及び感度をもって検出することを可能にする。バイオセンサ対は、例えば、蛍光／クエンチャーＦＲＥＴ技術を使用して、ループプライマーの立体配座の変化を検出することによって、標的配列のループ・デ・ループ（「ＬＤＬ」）増幅の決定を可能にする。さらに、複数のバイオセンサを使用することによって、単一のチューブの中の多重化標的を検出することが可能になる。ループプライマーは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）だけでなく、鎖置換ポリメラーゼを利用する任意の他の核酸増幅方法と組み合わせて使用することができる。
本開示は、以下の［１］から［９５］を含む。
［１］標的配列のループ・デ・ループ増幅（ＬｄＬ）のためのループプライマーであって、５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含むループプライマー。
［２］前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［１］に記載のループプライマー。
［３］前記第１のバイオセンサ対が、エネルギー供与体と受容体の対である、上記［１］又は［２］に記載のループプライマー。
［４］前記第１のバイオセンサ対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である、上記［３］に記載のループプライマー。
［５］前記第１のセンサ分子がＦＲＥＴフルオロフォアであり、前記第２のセンサ分子がＦＲＥＴクエンチャーである、上記［３］に記載のループプライマー。
［６］前記第１のセンサ分子がＦＲＥＴクエンチャーであり、前記第２のセンサ分子がＦＲＥＴフルオロフォアである、上記［３］に記載のループプライマー。
［７］前記第１のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー供与体であり、前記第２のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー受容体である、上記［３］に記載のループプライマー。
［８］前記第１のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー受容体であり、前記第２のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー供与体である、上記［３］に記載のループプライマー。
［９］前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が、検出可能な光信号を生成する複合体を形成し得る、上記［１］に記載のループプライマー。
［１０］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６０℃を超える、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１１］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６５℃を超える、上記［１０］に記載のループプライマー。
［１２］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が７０℃を超える、上記［１１］に記載のループプライマー。
［１３］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が８０℃を超える、上記［１２］に記載のループプライマー。
［１４］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が７０から８０℃である、上記［１２］に記載のループプライマー。
［１５］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が７２．５から７７．５℃である、上記［１３］に記載のループプライマー。
［１６］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が約７５℃である、上記［１４］に記載のループプライマー。
［１７］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６０℃未満である、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１８］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）が６０から６５℃である、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１９］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、３から１０ヌクレオチド長である、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２０］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、３から７ヌクレオチド長である、上記［１９］に記載のループプライマー。
［２１］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、６ヌクレオチド長である、上記［２０］に記載のループプライマー。
［２２］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、５から３５ヌクレオチド長である、上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２３］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１０から２０ヌクレオチド長である、上記［２２］に記載のループプライマー。
［２４］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１３から１８ヌクレオチド長である、上記［２３］に記載のループプライマー。
［２５］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１３ヌクレオチド長である、上記［２４］に記載のループプライマー。
［２６］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である、上記［１］～［２５］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２７］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、２０から３０ヌクレオチド長である、上記［２６］に記載のループプライマー。
［２８］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、２３から２８ヌクレオチド長である、上記［２７］に記載のループプライマー。
［２９］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む、上記［１］～［２８］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３０］前記ループプライマーの５’末端に第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む、上記［１］～［２９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３１］前記第１のセンサ分子と前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間に第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む、上記［１］～［３０］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３２］前記第１又は第２のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、上記［３０］又は［３１］に記載のループプライマー。
［３３］前記標的配列が病原体ゲノムに特異的である、上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３４］前記標的配列がクラミジア・トラコマチスに特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［３５］前記標的配列がｏｒｆ８又はｃｄｓ２に由来する、上記［３４］に記載のループプライマー。
［３６］配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、上記［３４］に記載のループプライマー。
［３７］前記標的配列が、淋菌に特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［３８］前記標的配列が、ｐｏｒＡ又はｇｌｎＡに由来する、上記［３７］に記載のループプライマー。
［３９］配列番号５又は配列番号７のオリゴヌクレオチドを含む、上記［３７］に記載のループプライマー。
［４０］前記標的配列がウイルスに特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［４１］前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、上記［４０］に記載のループプライマー。
［４２］前記標的配列がホモサピエンスに特異的である、上記［１］～［３０］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［４３］前記標的配列がｔｂｃ１ｄ３に由来する、上記［４２］に記載のループプライマー。
［４４］配列番号２２のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４２］に記載のループプライマー。
［４５］標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマーを含む、プライマー混合物。
［４６］（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３及び前記Ｂ３が、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［４５］に記載のプライマー混合物。
［４７］（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含み、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［４６］に記載のプライマー混合物。
［４８］前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ、又は前記ＬＢが前記標的配列上の前記第１の結合部位に結合する、上記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［４９］前記ＦＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＦＩＰと前記ループプライマーの量の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５０］前記ＢＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＢＩＰと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５１］前記ＬＦが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＦと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５２］前記ＬＢが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＢと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５３］前記Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５４］前記Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５５］前記Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５６］前記Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５７］前記Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５８］前記Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５９］第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、上記［４５］～［５８］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６０］前記第３のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［５９］に記載のプライマー混合物。
［６１］前記標的配列と前記第２の標的配列が同一である、上記［５９］又は［６０］に記載のプライマー混合物。
［６２］前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、上記［５９］又は［６０］に記載のプライマー混合物。
［６３］（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［５９］～［６２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６４］（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［５９］～［６０］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６５］第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ ｍ ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、上記［４５］～［６４］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６６］前記第５のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［６５］に記載のプライマー混合物。
［６７］前記標的配列、前記第２の標的配列及び前記第３の標的配列が同一である、上記［６５］又は［６６］に記載のプライマー混合物。
［６８］前記標的配列、前記第２の標的配列及び前記第３の標的配列が異なる、上記［６５］又は［６６］に記載のプライマー混合物。
［６９］（ｉ）第３のフォワードインナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３のバックワードインナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３のフォワードプライマー（ＴＦ３）、及び（ｉｖ）第３のバックワードプライマー（ＴＢ３）をさらに含み、前記ＴＦＩＰ、前記ＴＢＩＰ、前記ＴＦ３、及び前記ＴＢ３が、前記第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［６５］～［６８］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７０］（ｉ）第３のループフォワードプライマー（ＴＬＦ）及び（ｉｉ）第３のループバックワードプライマー（ＴＬＢ）をさらに含み、前記ＴＬＦ及び前記ＴＬＢが、前記第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［６５］～［６９］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７１］第４のループプライマーをさらに含む、上記［６５］～［７０］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７２］第５のループプライマーをさらに含む、上記［７１］に記載のプライマー混合物。
［７３］上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマー又は上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物を凍結乾燥することによって得られる乾燥プライマー混合物。
［７４］標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、
上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマー、上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物、又は上記［７３］に記載の乾燥プライマー混合物を含む、キット。
［７５］ポリメラーゼをさらに含み、前記ポリメラーゼが、任意選択で、バチルス・ステアロサーモフィルス・ポリメラーゼである、上記［７４］に記載のキット。
［７６］ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ ４ 及び緩衝液をさらに含む、上記［７４］～［７５］のいずれか一項に記載のキット。
［７７］逆転写酵素をさらに含む、上記［７４］～［７６］のいずれか一項に記載のキット。
［７８］ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、上記［７４］～［７７］のいずれか一項に記載のキット。
［７９］前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタ又はマウスのＲＮａｓｅ阻害剤である、上記［７８］に記載のキット。
［８０］試料中の標的配列を検出する方法であって、
試料を用意する工程と、
（ｉ）上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のプライマー、（ｉｉ）上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物、又は（ｉｉｉ）上記［７３］に記載の乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた再構成プライマー混合物と、ポリメラーゼとを試料に添加し、それにより反応混合物を生成する工程と、
前記反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と
を含む、方法。
［８１］前記インキュベーションが５０～７０℃で行われる、上記［８０］に記載の方法。
［８２］前記インキュベーションが６０～６５℃で行われる、上記［８１］に記載の方法。
［８３］前記インキュベーションが６２～６５℃で行われる、上記［８２］に記載の方法。
［８４］前記ポリメラーゼがバチルス・ステアロサーモフィルスポリメラーゼである、上記［８０］～［８３］のいずれか一項に記載の方法。
［８５］前記反応混合物からの信号を検出する工程をさらに含む、上記［８０］～［８４］のいずれか一項に記載の方法。
［８６］前記信号が蛍光信号である、上記［８５］に記載の方法。
［８７］前記検出する工程が、前記インキュベーションの工程の間に行われる、上記［８５］～［８６］のいずれか一項に記載の方法。
［８８］前記試料中の前記標的配列の存在又は非存在を調べる工程をさらに含む、上記［８０］～［８７］のいずれか一項に記載の方法。
［８９］前記試料を調製する先行する工程をさらに含む、上記［８０］～［８８］のいずれか一項に記載の方法。
［９０］前記試料を調製する工程が、逆転写酵素とＲＮＡ分子を相互作用させることを含み、それにより、ＤＮＡ分子を含む前記試料を生成する、上記［８９］に記載の方法。
［９１］前記試料を調製する工程が、前記逆転写酵素と相互作用させる前又は前記逆転写酵素の間に前記ＲＮＡ分子を予熱する工程をさらに含む、上記［９０］に記載の方法。
［９２］前記反応混合物がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、上記［８０］～［９１］のいずれか一項に記載の方法。
［９３］前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタ又はマウスのＲＮＡ阻害剤である、上記［９２］に記載の方法。
［９４］前記試料が、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、全ヒト細胞、唾液若しくは鼻スワブ、又は鼻若しくは鼻咽頭スワブを含む、上記［８０］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。
［９５］前記試料が、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全細菌又は膣スワブ由来の全ヒト細胞を含む、上記［８０］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。
【0007】
本出願人は、ループ・デ・ループ増幅方法が、阻害性蛍光プローブ、例えば、ＤＡＲＱ（消光の放出による増幅の検出）及びＯＳＤ（一段階置換）プローブを含む以前から公知の方法と比較して、より速いターンアラウンド時間で、改善された感度及び特異性をもって標的核酸分子の配列特異的増幅を可能にすることを実証した。さらに、ループ・デ・ループ増幅方法は、ＱＵＡＳＲ（組み込まれていない増幅信号レポーターの消光）とは異なり、増幅信号のリアルタイム検出を可能にする。ループ・デ・ループ法によれば、粗試料でも強い信号が得られるため、本方法を低コストの装置で行うことができる。
【0008】
したがって、本発明は、ループプライマー（例えば、フルオロフォア標識プライマー）を使用して試料中に存在する１つ又はそれ以上の標的核酸を検出する方法を提供する。フルオロフォア標識プライマーは、標的核酸に対する相補性と、バイオセンサ対、例えばフルオロフォア又はクエンチャー分子で修飾されていないプライマー配列の５’末端又はその近くで内部的に標識された連続ループ配列とを有するフルオロフォア標識オリゴヌクレオチドである。フルオロフォア標識プライマーを、付加されたループ配列の５’末端又はその近くでクエンチャー又はフルオロフォアでそれぞれ標識して、先の論点で説明した内部標識でＦＲＥＴを可能にする。いくつかの実施形態では、フルオロフォア標識プライマーは、付加されたループ配列の５’末端又はその近くでフルオロフォア及びクエンチャーを有する内部部位で標識される。フルオロフォア標識プライマーは、（未修飾プライマー配列との交差部において）ループ配列の３’末端に第１のクランピング配列をさらに含む。この配列は、修飾されていないプライマー配列と重複していてもよく、修飾されていないプライマー配列に直接隣接していてもよく、又は修飾されていないプライマー配列から離間していてもよい。この配列は、ｄＮＴＰ、ロックド核酸、又は任意の他の形態の核酸修飾若しくは置換を含み得る。
【0009】
上記クランピング配列の融解温度は、好ましくは、鎖置換ポリメラーゼを使用するアッセイの伸長温度よりも約１０℃高いが、アッセイの伸長温度よりも低いか、それに等しいか、又はそれよりも任意の量高くすることができる。
【0010】
クランピング配列の融解温度が反応の伸長温度よりも低い場合、リアルタイム検出は、この方法では（クランピング配列のＴｍ付近又はＴｍ未満に反応を冷却する）終点検出に置き換えることができる。この場合、ループプライマーを最大強度で使用する（非修飾プライマーをループプライマー類似体で１００％置換する）場合であっても反応の阻害はない。
【0011】
クランピング配列の融解温度が反応の伸長温度に等しい場合、リアルタイム検出は依然として実行可能であるが、終点決定のために反応を冷却するまでより高いバックグラウンド蛍光が存在し得る。
【0012】
クランピング配列の融解温度が反応の伸長温度よりも高い場合、リアルタイム検出が基本動作モードであり、バックグラウンド蛍光は最小限になる。
【0013】
フルオロフォア標識プライマーは、プライマーが直鎖（伸長）立体配座にあるときにＦＲＥＴを阻害するために、５’末端クエンチャー又はフルオロフォアから適切な距離だけ内部コンジュゲートしたフルオロフォア又はクエンチャーを分離し、その結果として蛍光を増加させる、スペーシング配列をさらに含む。スペーシング配列は配列及び長さが任意であり、デオキシリボヌクレオチド、ロックド核酸などを含むことができる。その長さは２５ヌクレオチドであり得るが、より短くても長くてもよい。
【0014】
フルオロフォア標識プライマーは、ループ配列の５’末端又はその近くに第２のクランピング配列、すなわち第１のクランピング配列の逆相補体をさらに含む。フルオロフォア標識プライマーは、ループ・デ・ループオリゴヌクレオチドの５’末端にさらに追加のＤＮＡバーコード、プローブ、又は配列をさらに含むことができる。この配列は、ｄＮＴＰ、ロックド核酸、又は任意の他の形態の核酸修飾若しくは置換を含み得る。
【0015】
第１のクランピング配列と対になった第２のクランピング配列の融解温度は、好ましくは、鎖置換ポリメラーゼを使用するアッセイの伸長温度よりも１０℃高いが、アッセイの伸長温度よりも低いか、それに等しいか、又はそれよりも任意の量高くすることができる。
【0016】
ループ状のフルオロフォア標識プライマーは、さらなる用途、例えば、核酸捕捉、分子バーコード化、磁気分離、カラム精製、電気泳動分離を可能にするために、５’末端にさらなる配列、分子、精製タグ、ビーズ又は他の部分をさらに含むことができる。基板上にパターン化されたプローブ捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、増幅産物を捕捉し、これにより蛍光、比色、発光、又は他のバンド若しくはゾーンを作り出すことができる。
【0017】
ループプライマーは、コストを最小限に抑えるために、又は感度及び特異性を高めるために、様々な程度にアッセイに滴定することができる。
【0018】
本明細書に記載のループプライマーは、蛍光体以外のセンサ分子、例えば、発光、色の変化、又は他の測定可能な信号を、ごく近接した際に、又は十分に離れて移動したときに提供するレポーター分子を用いて設計することができる。場合によっては、バイオセンサ、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ、Ｎａｎｏｂｉｔ、ＮｏｎｏＢＲＥＴを使用することができる。
【0019】
発光タンパク質が使用される場合、信号の減少は陽性反応の重要な指標となり得る。いくつかの実施形態では、生物発光による終点分析を行うことができる。
【0020】
標的配列の増幅には、鎖置換が可能な酵素を用いることができる。選択された核酸増幅方法によって必要とされる他の試薬をさらに使用することができる。
【0021】
本明細書で提供される方法は、高濃度の非標的ＲＮＡ又はＤＮＡを有する高バックグラウンド条件での蛍光信号の特異的検出を可能にするので、偽陽性及び非特異的増幅検出を減少させることができる。蛍光検出は、標識プライマーを組み込んだアンプリコン及び産物のみの特異的検出を可能にする。これにより、粗試料又は未処理試料、例えば、生殖器スワブ、糞便、唾液、尿、血液、植物材料、土壌、環境試料を使用する場合であっても、特異的な検出が可能になる。
【0022】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ又はそれ以上のユニークな核酸標的の検出に適用することができる。そのような二重、三重、又は高次多重化ＬＡＭＰアッセイでは、標的を差次的に標識することができる。例えば、一方の標的はＦＡＭで標識され、他方はＣｙ５で標識される。場合によっては、検出は、真陽性と偽陽性とを区別する能力をさらに低下させるために、複数の標識プライマーを用いて単一の核酸標的を検出するためにスペクトル多重化される。場合によっては、検出は、複数の標的に対して単一の標識、例えばＦＡＭを使用し、各標的の同一性は、アッセイの特定の状況に応じてリアルタイム又は終点信号の分析（例えば、相対信号強度、結果に至るまでの時間など）に基づいて決定することができる。場合によっては、多重化は、物理的反応チャンバ内で反応を行うことによって達成し得る。場合によっては、多重化は、単一の反応チャンバ内で達成し得る。
【0023】
本明細書で提供される方法は、他のリアルタイムＬＡＭＰ変位プローブ技術と比較して阻害を最小限に抑え、この方法を高感度にする。アッセイへの滴定は、完全な反応速度がループプライマー置換の少なくとも５０％において維持されることを実証する。アッセイへの滴定は、完全な反応速度がインナープライマー置換の少なくとも２５％において維持されることを実証する。
【0024】
本明細書で提供されるループプライマーは、鎖置換ポリメラーゼ、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacilus stearothermophilus）（以前はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））から単離又は適合されたポリメラーゼを利用するループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）に使用することができる。この場合、ループプライマーは、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーなどの、ＬＡＭＰ用の他のプライマーと一緒に使用することができる。
【0025】
いくつかの実施形態では、プライマー及び場合によって他の反応成分は、限定するものではないが、凍結乾燥のプロセスなどのプロセスを使用して乾燥される。乾燥したプライマーは、診断キットに含めることができる。好ましい実施形態では、凍結乾燥のプロセスは、ＬＡＭＰプライマーセットの感受性に影響を与えない。
【0026】
一態様において、本開示は、標的配列のループ・デ・ループ増幅（ＬｄＬ）のためのループプライマーであって、５’から３’に向って、第１のセンサ分子と、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、スペーシングオリゴヌクレオチド（spacing oligonucleotide）と、第２のクランピングオリゴヌクレオチド（clamping oligonucleotide）であって、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、第２のセンサ分子であって、第１のセンサ分子及び第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、を含むループプライマーを提供する。
【0027】
いくつかの実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である。
【0028】
いくつかの実施形態では、第１のバイオセンサ対はエネルギー供与体と受容体の対である。いくつかの実施形態では、第１のバイオセンサ対は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＦＲＥＴフルオロフォアであり、第２のセンサ分子はＦＲＥＴクエンチャーである。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＦＲＥＴクエンチャーであり、第２のセンサ分子はＦＲＥＴフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー供与体であり、第２のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー受容体である。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー受容体であり、第２のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー供与体である。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子及び第２のセンサ分子は、検出可能な光信号を生成する複合体を形成することができる。
【0029】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６５℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７０℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、８０℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７０から８０℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７２．５から７７．５℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、約７５℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃未満である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０から６５℃である。
【0030】
いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、３から１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、３から７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、５から３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１０から２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３から１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、全体で、２０から３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、全体で、２３から２８ヌクレオチド長である。
【0031】
いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、ループプライマーは、ループプライマーの５’末端に第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、第１のセンサ分子と第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間に第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、第１又は第２のさらなるオリゴヌクレオチドは、バーコード配列である。
【0034】
いくつかの実施形態では、標的配列は、病原体ゲノムに特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｏｒｆ８又はｃｄｓ２に由来する。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、標的配列は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｐｏｒＡ又はｇｌｎＡに由来する。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、配列番号５又は７のオリゴヌクレオチドを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、標的配列はウイルスに特異的である。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0037】
いくつかの実施形態では、標的配列はホモサピエンスに特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｔｂｃ１ｄ３に由来する。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、配列番号２２のオリゴヌクレオチドを含む。
【0038】
別の態様において、本開示は、本明細書で提供されるループプライマーを含む、標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物を提供する。
【0039】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含み、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３及びＢ３は、標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）を含み、ＬＦ及びＬＢは標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ又はＬＢは、標的配列上の第１の結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、ＦＩＰは、第１の結合部位に結合し、プライマー混合物におけるＦＩＰとループプライマーの量の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。いくつかの実施形態では、ＢＩＰは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＢＩＰとループプライマーの量の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。いくつかの実施形態では、ＬＦは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物におけるＬＦとループプライマーの量の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１．５２である。いくつかの実施形態では、ＬＢは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物中のＬＢとループプライマーの量の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。
【0040】
いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む、Ｂ３は配列番号２のオリゴヌクレオチドを含む、ＦＩＰは配列番号３のオリゴヌクレオチドを含む、ＢＩＰは配列番号４のオリゴヌクレオチドを含む、ＬＦは配列番号６のオリゴヌクレオチドを含む、又はＬＢは配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、及びＬＢは配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号９のオリゴヌクレオチドを含む、Ｂ３は配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む、ＦＩＰは配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含む、ＢＩＰは配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含む、ＬＦは配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含む、又はＬＢは配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、及びＬＢは配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含む、Ｂ３は配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、ＦＩＰは配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含む、ＢＩＰは配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、ＬＦは配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含む、又はＬＢは配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３は配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰは配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰは配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦは配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、及びＬＢは配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、第２のループプライマーをさらに含み、第２のループプライマーは、第３のセンサ分子と、第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、第４のセンサ分子であって、第３のセンサ分子及び第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、第２のバイオセンサ対が第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、第３のクランピングオリゴヌクレオチドは、第４のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列及び第２の標的配列は同一である。いくつかの実施形態では、標的配列と第２の標的配列は異なる。
【0048】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、ＳＦＩＰ、ＳＢＩＰ、ＳＦ３及びＳＢ３は、第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。
【0049】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、ＳＬＦ及びＳＬＢは、第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、第３のループプライマーをさらに含み、第３のループプライマーは、第５のセンサ分子と、第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、第６のセンサ分子であって、第５のセンサ分子及び第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、第３のバイオセンサ対が第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列、第２の標的配列及び第３の標的配列は同一である。いくつかの実施形態では、標的配列、第２の標的配列及び第３の標的配列は異なる。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第３のフォワードインナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３のバックワードインナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３のフォワードプライマー（ＴＦ３）及び（ｉｖ）第３のバックワードプライマー（ＴＢ３）をさらに含み、ＴＦＩＰ、ＴＢＩＰ、ＴＦ３及びＴＢ３は、第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第３のループフォワードプライマー（ＴＬＦ）及び（ｉｉ）第３のループバックワードプライマー（ＴＬＢ）をさらに含み、ＴＬＦ及びＴＬＢは第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、第４のループプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、第５のループプライマーをさらに含む。
【0050】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書で提供されるループプライマー又はプライマー混合物を凍結乾燥することによって得られる乾燥プライマー混合物を提供する。
【0051】
一態様では、本開示は、標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、本明細書で提供されるループプライマー、プライマー混合物又は乾燥プライマー混合物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットはポリメラーゼをさらに含み、ポリメラーゼは、任意選択で、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）・ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、キットは、ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、及び緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは逆転写酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ブタ又はマウスのＲＮａｓｅ阻害剤である。
【0052】
別の態様において、本開示は、試料中の標的配列を検出する方法であって、試料を用意する工程と、（ｉ）プライマー、（ｉｉ）プライマー混合物、又は（ｉｉｉ）本明細書に記載の乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた再構成プライマー混合物と、ポリメラーゼとを試料に添加し、それにより反応混合物を生成する工程と、反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、インキュベーションは５０～７０℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは６０～６５℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは６２～６５℃で行われる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）・ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、本方法は、反応混合物からの信号を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、信号は蛍光信号である。いくつかの実施形態では、検出する工程はインキュベーションの工程中に行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、試料の中の標的配列の存在又は非存在を調べる工程をさらに含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、本方法は、試料を調製する先行する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、試料を調製する工程は、ＲＮＡ分子を逆転写酵素と相互作用させ、それによりＤＮＡ分子を含む試料を生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、試料を調製する工程は、逆転写酵素と相互作用させる前又は相互作用の間にＲＮＡ分子を予熱する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤はブタ又はマウスのＲＮＡ阻害剤である。
【0054】
いくつかの実施形態では、試料は、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、全ヒト細胞、唾液若しくは鼻スワブ、又は鼻若しくは鼻咽頭スワブを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全細菌又は膣スワブ由来の全ヒト細胞を含む。
５．図面の簡単な説明
５．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【図3-1】図３は、５０％置換のＦＡＭ標識ＬＦプライマーを用いたループ・デ・ループ法を使用したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の標的核酸の増幅を示す経時的なリアルタイム蛍光信号のプロットである。右側の表に示すように、陽性試料と陰性試料の両方を試験した。ｙ軸上の各「サイクル」は、摂氏６５度での３０秒の経過時間を表す。
【図3-2】（上記のとおり。）
【0060】
【図4-1】図４は、５０％置換のＦＡＭ標識ＬＦプライマーを用いたループ・デ・ループ法を用いた淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の標的核酸の増幅を示すリアルタイム蛍光信号の経時的なプロットである。右側の表に示すように、陽性試料と陰性試料の両方を試験した。ｙ軸上の各「サイクル」は、摂氏６５度での３０秒の経過時間を表す。
【図4-2】（上記のとおり。）
【0061】
【図5-1】図５は、５０％置換のＦＡＭ標識ＬＦプライマーを用いたループ・デ・ループ法を用いたホモサピエンスの標的核酸の増幅を示す、リアルタイム蛍光信号の経時的なプロットである。右側の表に示すように、陽性試料と陰性試料の両方を試験した。ｙ軸上の各「サイクル」は、摂氏６５度での３０秒の経過時間を表す。
【図5-2】（上記のとおり。）
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【図13】図１３Ａ及び図１３Ｂは、ループ・デ・ループ反応を用いたクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の標的配列の増幅から得られたリアルタイム蛍光信号を示す。図１３Ａは新たに混合した反応混合物から得られた結果であり、図１３Ｂは凍結乾燥した反応混合物から得られた結果である。凍結乾燥アッセイ混合物は、３ヶ月を超えて安定であり、良好な読み出しが得られた。このアッセイを、アッセイ（２０．７コピー／μＬ）のＬｏＤ９５（低陽性）のＣｔ Ｅ ＢＯＵＲ（クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）株）のそれぞれに、２つの鋳型なし対照（ＮＴＣ）を加えた１４個の複写物で実行した。新たな反応混合物と凍結乾燥した反応混合物との間で、感度に変化はなく（ＬｏＤ９５において、それぞれ１２／１４）、又は結果に至るまでの平均時間に変化はなかった（１６分、Ｔ検定、Ｐ値＝０．６６）。
【0070】
【図14】図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃは、単一チューブ反応（シングルポット）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト標的配列のループ・デ・ループ増幅から得られたスペクトル的に二重化された蛍光信号を示す。破線信号はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＦＡＭ）から得られたものであり、実線信号はヒト内部対照（Ｃｙ５）から得られたものである。標的配列を含まない対照試料（図１４Ａ）、粗ヒト鼻スワブ（図１４Ｂ）、及び熱不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ゲノムＲＮＡ標的配列を有するインタクトウイルス）と組み合わせた粗ヒト鼻スワブ（図１４Ｃ）の３種類の試料を使用した。このデータは、標的配列の存在下でのみ信号が特異的に増幅することを示す。このデータは、単一の反応容器におけるループ・デ・ループ法による反応のスペクトルが多重化することをさらに示している。
【0071】
【0072】
【図16】図１６は、コロナウイルス陽性対象から取得した未処理の鼻スワブにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＮＡ標的配列（ＯＲＦ１ａｂ）、ホモサピエンスに特異的なＲＮＡ標的配列（ＰＯＰ７ｂ）、両方の標的、又はどちらの標的でもない、のいずれかのループ・デ・ループＲＴ－ＬＡＭＰ増幅から得られたリアルタイム蛍光信号を示す。鼻スワブをループ・デ・ループＲＴ－ＬＡＭＰ試薬に直接溶出し、４種類の濃度に希釈して反応混合物とした。１×スワブは、単位体積当たりに溶出されるスワブの単位で、この試験構成で使用される試料の標準濃度を表す。この場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒトＲＮＡのプライマーセットを単一チューブ内で二重化した。各プライマーセットは、それぞれが同じフルオロフォアとクエンチャーの対（単一の蛍光チャネル）で標識された１つのループプライマーを含んでいた。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とヒトＲＮＡの両方が検出された反応は、二重増幅信号を特徴としていた。両方の標的の検出をもたらした希釈は、「二重陽性」とラベル付けされ、いずれかの標的の検出をもたらすものは、「単一陽性」とラベル付けされ、どちらの標的も検出されない結果となるものは、「二重陰性」とラベル付けされる。このデータは、このコロナウイルス陽性のボランティアのスワブ試料について、リアルタイムのループ・デ・ループＲＴ－ＬＡＭＰアッセイが、反応中の両方の標的を検出するのに必要な感度よりも少なくとも３７０倍高いことを示していた。
【0073】
【0074】
【図18】図１８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列及びヒト標的配列の多重ループ・デ・ループ増幅から得られた蛍光信号を示し、ループ・デ・ループ反応の特異性を示している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒトプライマーセットの両方を、ＦＡＭ標識プライマーを使用してループ・デ・ループ用に改変したので、二重陽性対照は２つの増幅現象を示す。ＲＰＰＯＳは、２２の非標的呼吸器病原体由来の遺伝物質を含有する呼吸器病原体パネル陽性（Ｅｘａｃｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ）である。ＰＲＮＥＧは、核酸を含まないＲＰＰＯＳ産物のバックグラウンドマトリックス対照である。このデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト標的を検出するためのループ・デ・ループＲＴ－ＬＡＭＰ反応がオフターゲット核酸を増幅しないことを示す。
【0075】
【図19-1】図１９は、多量のＣ．トラコマチス（C.trachomatis）（Ｃｔ）（１反応あたり１０，０００コピー当量）及び多量の淋菌（N.gonorrhoeae）（Ｎｇ）（１反応あたり１０，０００コピー当量）を含有する試料のループ・デ・ループ増幅から得られた蛍光信号を示す。
【図19-2】（上記のとおり。）
【0076】
【発明を実施するための形態】
【0077】
図面は、例示のみを目的として本発明の様々な実施形態を示す。当業者は、以下の説明から、本明細書に記載される本発明の原理から逸脱することなく、本明細書に示される構造及び方法の代替実施形態が使用され得ることを容易に理解するであろう。
【0078】
６．詳細な説明
６．１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に帰する意味を有する。
６．１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に帰する意味を有する。
【0079】
本明細書で使用される「バイオセンサ対」という用語は、２つのセンサ分子間の特定の物理的相互作用時に検出可能な信号を生成することができるセンサ分子の対を指す。例えば、バイオセンサ対は、フェルスター共鳴エネルギー移動、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に使用されるドナー分子とアクセプター分子の対であり得る。この場合、蛍光信号は、ドナー分子からアクセプター分子へのエネルギーの距離依存性伝達によって生成され得る。他の実施形態では、バイオセンサ対は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に使用されるセンサ分子対である。この場合、生物発光信号は、ドナー分子からアクセプター分子へのエネルギーの距離依存性伝達によって生成され得る。当分野で公知の他のバイオセンサ対を、本開示の様々な実施形態において使用することができる。
【0080】
本明細書で使用される「ループ・デ・ループ増幅」又は「ＬｄＬ増幅」という用語は、エネルギーの距離依存性伝達によって蛍光信号を生成することができるループプライマーを使用した標的核酸の増幅を指す。
【0081】
本明細書で使用される「ＬＯＤ」という用語は、検出の限界を指す。例えば、ＬＯＤ９５は、９５パーセンタイルの検出限界である。これは、アッセイが９５％の時間で陽性結果を検出すると統計的に予想される標的の濃度である。
【0082】
６．２．他の解釈規則
本明細書に記載された範囲は、記載された終点を含む範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。
本明細書に記載された範囲は、記載された終点を含む範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。
【0083】
別段示されない限り、１つ又はそれ以上の立体中心を有する化合物への言及は、その各立体異性体、及び立体異性体のすべての組み合わせを意図する。
【0084】
６．３．ループプライマー
一態様において、本発明は、ループ・デ・ループ増幅のためのループプライマーを提供する。ループプライマーは、５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
第１のセンサ分子及び第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含む。
一態様において、本発明は、ループ・デ・ループ増幅のためのループプライマーを提供する。ループプライマーは、５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
第１のセンサ分子及び第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１のクランピングオリゴヌクレオチドに結合することができるが、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと完全に相補的ではない。
【0086】
本明細書で提供される方法には、当分野で公知の様々なバイオセンサを使用することができる。例えば、ごく近接した際に又は十分に離れた際に、色を変えるか、又は測定可能な信号を生成する一対の分子（例えば、発光タンパク質に基づくＮａｎｏＬｕｃ、Ｎａｎｏｂｉｔ、ＮｏｎｏＢＲＥＴ技術）を使用することができる。
【0087】
いくつかの実施形態では、第１のバイオセンサ対はエネルギー供与体と受容体の対である。いくつかの実施形態では、第１のバイオセンサ対は、フェルスター共鳴エネルギー移動のためのエネルギー供与体及び受容体対である。いくつかの実施形態では、第１のバイオセンサ対は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＦＲＥＴフルオロフォアであり、第２のセンサ分子はＦＲＥＴクエンチャーである。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＦＲＥＴクエンチャーであり、第２のセンサ分子はＦＲＥＴフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー供与体であり、第２のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー受容体である。いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー受容体であり、第２のセンサ分子はＢＲＥＴエネルギー供与体である。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴクエンチャーは、５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱという商品名のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な５ＩＡＢｋＦＱである。５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱは、５３１ｎｍにピーク吸光度を有する、４２０から６２０ｎｍの範囲の広い吸光度スペクトルを持つＦＲＥＴクエンチャーである。このクエンチャーは、フルオレセイン及び緑色からピンク色のスペクトル範囲で発光する他の蛍光色素と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、クエンチャーは、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）のいずれか、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、Ｚｅｎ（登録商標）クエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、Ｏｎｙｘ（登録商標）クエンチャー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａから入手可能）のいずれか、又はＡＴＴＯ（登録商標）クエンチャー（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＧｍｂＨから入手可能）のいずれかである。
【0089】
いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴフルオロフォアは、Ｉｎｔ ６－ＦＡＭ（Ａｚｉｄｅ）という名称のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なｉ６－ＦＡＭＫ（ＦＡＭ（フルオレセイン）アジド）である。この形態のＦＡＭは、クリック化学を使用してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。この改変の内部バージョンは、ｄＴ塩基を介してオリゴに結合される。修飾の位置にｄＴヌクレオチドを付加することができる。あるいは、余分なヌクレオチドの付加を回避するために、配列中の既存のＴヌクレオチドを必要な修飾で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、又はＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）である。
【0090】
一実施形態では、ループプライマーは、内部クエンチャー（例えば、Ｚｅｎ（登録商標）又はＯｎｙｘ Ａ（登録商標））及び５’フルオロフォア（例えば、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）又はＨＥＸ）を含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、第１のセンサ分子及び第２のセンサ分子は、検出可能な光信号を生成する複合体を形成することができる。
【0092】
第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、互いに相補的であるため、互いに結合することができる。第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる。
【0093】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６５℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７０℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、８０℃を超える。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７０から８０℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、７２．５から７７．５℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、約７５℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０℃未満である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、６０から６５℃である。
【0094】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、鎖置換ポリメラーゼを用いるアッセイの伸長温度よりも１０℃高い。いくつかの実施形態では、融解温度は、アッセイの伸長温度より低いか、それに等しいか、又はそれよりも任意の量高くすることができる。
【0095】
Ｔｍが反応の伸長温度よりも低い場合、リアルタイム検出は、（クランピング配列のＴｍ付近又はＴｍ未満まで反応を冷却する）終点検出に置き換えることができ、完全な強度（１００％置換）でループ・デ・ループプライマーを使用した場合であっても、反応の阻害はない。
【0096】
Ｔｍが反応の伸長温度に等しい場合、リアルタイム検出は依然として実行可能であり得るが、終点決定のために反応を冷却するまでより高いバックグラウンド蛍光が存在し得る。
【0097】
Ｔｍが反応の伸長温度よりも高い場合、リアルタイム検出が基本動作モードであり得、バックグラウンド蛍光は最小限になる。
【0098】
いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、３から１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、３から７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長である。典型的な実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと第２のクランピングオリゴヌクレオチドは同じ長さを有する。
【0099】
いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、５から３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１０から２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３から１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーシングオリゴヌクレオチドは、１３ヌクレオチド長である。
【0100】
いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、全体で、２０から３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、全体で、２３から２８ヌクレオチド長である。
【0101】
ループプライマーは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含み得る。第１のクランピングオリゴヌクレオチド、スペーシングオリゴヌクレオチド及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、ループプライマーは、ループプライマーの５’末端に第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、第１のセンサ分子と第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間に第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１又は第２のさらなるオリゴヌクレオチドは、バーコード配列である。
【0103】
いくつかの実施形態では、ループプライマーは、ループプライマーの５’末端に、バーコード配列、プローブ配列又は他の配列をさらに含む。さらなる配列は、核酸塩基又はその修飾を含むことができる。
【0104】
いくつかの実施形態では、標的配列は、病原体ゲノムに特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｏｒｆ８又はｃｄｓ２に由来する。具体的には、標的結合部位は、配列番号１５の配列を有することができる。
【0105】
いくつかの実施形態では、標的配列は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｐｏｒＡ又はｇｌｎＡに由来する。具体的には、標的結合部位は、配列番号５又は配列番号７の配列を有することができる。
【0106】
いくつかの実施形態では、標的配列はホモサピエンスに特異的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｔｂｃ１ｄ３に由来する。具体的には、標的結合部位は、配列番号２２の配列を有することができる。
【0107】
６．４．ループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物
別の態様において、本発明は、ループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物を提供する。プライマー混合物は、本明細書で提供されるループプライマーを含む。
別の態様において、本発明は、ループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物を提供する。プライマー混合物は、本明細書で提供されるループプライマーを含む。
【0108】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、１つのループプライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、２つ以上のループプライマーを含む。それが２つ以上のループプライマーを含む場合、混合物中のプライマーは、単一の標的配列又は複数の標的配列に結合することができる。いくつかの実施形態では、複数のループプライマーは、複数の供給源からの標的配列を検出するように設計される。例えば、混合物は、複数の病原体から標的配列を検出するように設計された複数のループプライマーを含むことができる。
【0109】
プライマー混合物は、増幅反応のための追加のプライマーをさらに含むことができる。例えば、プライマー混合物は、（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含むことができ、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３及びＢ３は、標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含み、ＬＦ及びＬＢは標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、さらなるプライマーの１つ、例えば、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ又はＬＢは、第１の結合部位、すなわち、標的配列上のループプライマーと同じ結合部位に結合する。
【0110】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、１つのプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、本明細書で提供されるループ・デ・ループ増幅のためのループプライマー、（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及び（ｉｖ）バックワードプライマー（Ｂ３）を含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、プライマーセットは、本明細書で提供されるループ・デ・ループ増幅のためのループプライマーと、（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及び（ｉｖ）バックワードプライマー（Ｂ３）から選択される３つのプライマーとを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＢＩＰ、Ｆ３及びＢ３を含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、Ｆ３及びＢ３を含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ及びＢ３を含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ及びＦ３を含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、プライマーセットは、本明細書で提供されるループ・デ・ループ増幅のためのループプライマーと、（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）、（ｉｖ）バックワードプライマー（Ｂ３）、（ｖ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｖｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）から選択される５つのプライマーとを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ及びＬＢを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ及びＬＢを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ及びＬＢを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、ＬＦ及びＬＢを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３及びＬＦを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ループプライマー、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３及びＬＢを含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、２つのプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、３つのプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、４つ又は５つのプライマーセットを含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、各プライマーセットは、ユニークな標的配列を増幅するためのものである。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、同じ標的配列を増幅するための２つ又はそれ以上のプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、同じ標的配列上の同じ結合部位に結合する２つ又はそれ以上のループプライマーを含む。
【0115】
ループプライマーは、増幅反応に最適化された任意の比で追加のプライマーと混合することができる。いくつかの実施形態では、ＦＩＰは、第１の結合部位に結合し、プライマー混合物におけるＦＩＰとループプライマーの量の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。いくつかの実施形態では、ＢＩＰは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物におけるＢＩＰとループプライマーの量の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。いくつかの実施形態では、ＬＦは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物におけるＬＦとループプライマーの量の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。いくつかの実施形態では、ＬＢは第１の結合部位に結合し、プライマー混合物におけるＬＢとループプライマーの量の比は、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である。
【0116】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）に特異的な標的配列を検出するように設計される。いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む、Ｂ３は配列番号２のオリゴヌクレオチドを含む、ＦＩＰは配列番号３のオリゴヌクレオチドを含む、ＢＩＰは配列番号４のオリゴヌクレオチドを含む、ＬＦは配列番号６のオリゴヌクレオチドを含む、又はＬＢは配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、及びＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、配列番号５又は配列番号７のオリゴヌクレオチドである。
【0117】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に特異的な標的配列を検出するように設計される。いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号９のオリゴヌクレオチドを含む、Ｂ３は配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む、ＦＩＰは配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含む、ＢＩＰは配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含む、ＬＦは配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含む、又はＬＢは配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、及びＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、配列番号１５のオリゴヌクレオチドである。
【0118】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、ホモサピエンスに特異的な標的配列を検出するように設計される。いくつかの実施形態では、Ｆ３は配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含む、Ｂ３は配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、ＦＩＰは配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含む、ＢＩＰは配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、ＬＦは配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含む、又はＬＢは配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、及びＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ループプライマーは、配列番号２２のオリゴヌクレオチドである。
【0119】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、ウイルスに特異的な標的配列を検出するように設計される。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0120】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるプライマー混合物は、複数の標的配列の検出のためにさらに組み合わされる。いくつかの実施形態では、複数の標的配列は、異なる生物に特異的である。例えば、複数の標的配列は、異なる病原体に特異的である。
【0121】
したがって、いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、第２のループプライマーをさらに含み、第２のループプライマーは、
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
第３のセンサ分子及び第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、第２のバイオセンサ対が第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む。
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
第３のクランピングオリゴヌクレオチド、第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
第３のセンサ分子及び第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、第２のバイオセンサ対が第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、第３のクランピングオリゴヌクレオチドは、第４のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、第３のクランピングオリゴヌクレオチドは、第４のクランピングオリゴヌクレオチドに結合することができるが、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと完全に相補的ではない。
【0123】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、ＳＦＩＰ、ＳＢＩＰ、ＳＦ３及びＳＢ３は、第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、ＳＬＦ及びＳＬＢは、第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0124】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、第３のループプライマーをさらに含み、第３のループプライマーは、
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
第５のセンサ分子及び第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、第３のバイオセンサ対が第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む。
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
第５のクランピングオリゴヌクレオチド、第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
第５のセンサ分子及び第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、第３のバイオセンサ対が第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドに結合するが、第５のクランピングオリゴヌクレオチドは、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと完全には相補的ではない。
【0126】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第３のフォワードインナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３のバックワードインナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３のフォワードプライマー（ＴＦ３）及び第３のバックワードプライマー（ＴＢ３）をさらに含み、ＴＦＩＰ、ＴＢＩＰ、ＴＦ３及びＴＢ３は、第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する。
【0127】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、（ｉ）第３のループフォワードプライマー（ＴＬＦ）及び（ｉｉ）第３のループバックワードプライマー（ＴＬＢ）を含み、ＴＬＦ及びＴＬＢは第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する。
【0128】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのループプライマーを含む。プライマー混合物が２つ又はそれ以上のループプライマーを含む場合、各ループプライマーは、それぞれが検出のための固有の信号を提供する固有のバイオセンサ対を含み得る。いくつかの実施形態では、各バイオセンサ対は、検出のために固有の視覚信号（例えば、色）を提供する。いくつかの実施形態では、各バイオセンサ対は、固有の色素分子を含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、プライマー混合物中の２つ又はそれ以上のループプライマーは、同一のバイオセンサ対を含む。いくつかの実施形態では、プライマー混合物中の２つ又はそれ以上のループプライマーをＦＡＭで標識する。いくつかの実施形態では、プライマー混合物中の２つの異なるループプライマーをＦＡＭで標識する。
【0130】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるプライマー混合物は凍結乾燥される。乾燥プライマー混合物は、本明細書に記載のルーパープライマー又はプライマー混合物のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、２つ又はそれ以上のループプライマーを含むプライマー混合物が凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、プライマー混合物は、凍結乾燥ビーズの形態である。
【0131】
６．５．ループ・デ・ループ増幅用キット
別の態様では、ループ・デ・ループ増幅のためのキットが提供される。本キットは、本明細書で提供されるループプライマー又はプライマー混合物のいずれかを含むことができる。
別の態様では、ループ・デ・ループ増幅のためのキットが提供される。本キットは、本明細書で提供されるループプライマー又はプライマー混合物のいずれかを含むことができる。
【0132】
いくつかの実施形態では、キットは、１つのプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、本明細書で提供されるループ・デ・ループ増幅のためのループプライマー、（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）を含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、本キットは、２つのプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、本キットは、３つのプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、本キットは、４つ又は５つのプライマーセットを含む。
【0134】
いくつかの実施形態では、本キットは、単一の容器に入った複数のプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、本キットは、複数のプライマーセットを含み、各プライマーセットは、別個の容器に個別に入っている。
【0135】
いくつかの実施形態では、本キットはポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは鎖置換ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）・ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｎＳｔａｒｔ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢから入手可能）である。いくつかの実施形態では、本キットは、他の反応酵素、例えば、逆転写酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素はＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴｘ逆転写酵素（ＮＥＢから入手可能）である。いくつかの実施形態では、本キットはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ブタ又はマウスのＲＮａｓｅ阻害剤である。
【0136】
いくつかの実施形態では、本キットは、増幅反応のための試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、試薬は、ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、及び緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０％のＴｗｅｅｎ－２０を含む。いくつかの実施形態では、試薬はトレハロースを含む。いくつかの実施形態では、試薬はスクロースを含む。いくつかの実施形態では、試薬は安定化のためのポリマーを含む。増幅試薬は、ポリメラーゼに応じて選択及び最適化することができる。
【0137】
いくつかの実施形態では、本キットは、ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ４、緩衝液、ループ・デ・ループ増幅のための１つ又はそれ以上のプライマーセット及びポリメラーゼを含む混合物を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、ｄＮＴＰ、ループ・デ・ループ増幅のための１つ又はそれ以上のプライマーセット、ポリメラーゼ、逆転写酵素、及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む混合物を含む。
【0138】
いくつかの実施形態では、この混合物は液体形態である。いくつかの実施形態では、この混合物は、乾燥形態である。いくつかの実施形態では、この混合物を凍結乾燥ビーズ又はペレットに製剤化する。
【0139】
いくつかの実施形態では、本キットは、増幅反応のための装置をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、ループ媒介等温増幅のための装置を含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、本キットは、増幅反応を実行するための反応管をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、増幅反応の前に試料を濾過又は精製するためのコンポーネントをさらに含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、本キットは感染症の診断用である。いくつかの実施形態では、本キットは、病原性感染症、例えば、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及び淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の診断用である。いくつかの実施形態では、本キットは、一塩基多型（ＳＮＰ）及び点変異の決定のために使用される。いくつかの実施形態では、本キットは変異遺伝子型の決定のために使用される。いくつかの実施形態では、本キットは、薬物耐性表現型に関連する変異遺伝子型の決定のために使用される。例えば、薬剤耐性マーカー、例えば、セフトリアキソン／セフィキシム耐性マーカー、キノロン（シプロフロキサシン）耐性マーカー、マクロライド耐性マーカー（アジスロマイシン）を検出することができる。
【0142】
６．６．ループ・デ・ループ増幅方法
別の態様では、ループ・デ・ループ増幅方法が提供される。この方法は、
試料を用意する工程と、
（ｉ）プライマー、プライマー混合物、又は本明細書で提供される乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた再構成プライマー混合物、及び（ｉｉ）ポリメラーゼを試料に添加し、それによって反応混合物を生成する工程と、
反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と、
を含み得る。
別の態様では、ループ・デ・ループ増幅方法が提供される。この方法は、
試料を用意する工程と、
（ｉ）プライマー、プライマー混合物、又は本明細書で提供される乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた再構成プライマー混合物、及び（ｉｉ）ポリメラーゼを試料に添加し、それによって反応混合物を生成する工程と、
反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と、
を含み得る。
【0143】
反応温度は、ポリメラーゼ及び標的配列に応じて調整することができる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは５０～７０℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは５５～７０℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは６０～６５℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは６２～６５℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは６０、６１、６２、６３、６４又は６５℃で行われる。
【0144】
いくつかの実施形態では、本方法は、反応混合物からの信号を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、蛍光信号を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、色又は濁度の変化を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、非視覚信号を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程はインキュベーションの工程中に行われる。いくつかの実施形態では、検出する工程は、インキュベーション工程の完了後に行われる。いくつかの実施形態では、信号はリアルタイムで検出される。いくつかの実施形態では、信号はリアルタイムで記録され、インキュベーションの工程の完了後に分析される。
【0145】
いくつかの実施形態では、本方法は、ループ・デ・ループ増幅のための試料を調製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、試料を調製する工程は、ＲＮＡ分子を逆転写酵素と相互作用させ、それによりＤＮＡ分子を含む試料を生成する。いくつかの実施形態では、試料を調製する工程は、逆転写酵素と相互作用させる前に、ＲＮＡ分子を含有する試料又は反応混合物を予熱する工程をさらに含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ増幅のための試料は、精製ポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、試料は、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、全ヒト細胞、唾液若しくは鼻スワブ、又は鼻若しくは鼻咽頭スワブを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全細菌又は膣スワブ由来の全ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ増幅のための試料は、粗試料である。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ増幅のための試料は精製試料である。
【0147】
いくつかの実施形態では、２種類以上の信号が検出される。いくつかの実施形態では、複数の蛍光又は他の視覚信号が検出される。いくつかの実施形態では、複数の信号が、複数の標的配列の存在又は非存在を調べるために検出される。いくつかの実施形態では、単一の標的配列の有無を確認するために複数の信号が検出される。いくつかの実施形態では、本方法にさらなる感度及び特異性を提供するために複数の信号が検出される。
【0148】
標的配列の増幅には、当分野において公知の種々の増幅方法を用いることができる。
【0149】
典型的な実施形態では、ループ媒介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）は、標的核酸のループ・デ・ループ増幅に使用される。ＬＡＭＰは、ポリメラーゼとして知られる酵素の鎖置換活性に依存する等温ＤＮＡ増幅法であり、塩基特異的にヌクレオチド塩基を伸長ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖に付加して、相補配列を有する二本鎖核酸を形成する。等温増幅法では、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）細菌由来のポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ及びその変異体）などの鎖置換ポリメラーゼは、相補鎖を重合するときに二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を置換するので、熱サイクルを必要としない。
【0150】
ＬＡＭＰ法は、標的ＤＮＡ配列の６つの異なる領域を認識するように特別に設計された４つの異なるプライマー（Ｆ３、Ｂ３、インナーフォワードプライマー又はＦＩＰ、及びインナーバックワードプライマー又はＢＩＰ）を使用することができる。反応の速度を改善するために、２つのさらなる「ループ」プライマーを加えてもよい。反応混合物中のプライマーの濃度は変動し得るが、典型的には、ＦＩＰ及びＢＩＰプライマーについては１．６μＭ、順方向及び逆方向ループプライマー（ＬＦ，ＬＢ）については０．８μＭ、並びにＦ３及びＢ３プライマーについては０．２μＭに設定される。ＬＡＭＰ法のいくつかの実施形態では、５つのプライマーを利用することができる（２つの可能なＬＡＭＰプライマーのうちの１つのみを使用する）。ＬＡＭＰ反応は、鎖置換反応を利用して一定温度（６５℃前後）で進行する。標的の増幅及び検出は、試料、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、及び基質を一定温度でインキュベートすることによって、一段階で完了し得る。ＬＡＭＰの典型的な混合物組成物は、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔポリメラーゼ、前述の濃度のプライマー、及び水を含み、ｐＨは２０℃で８．８に調整されている。反応体積は、典型的には５μＬ～５０μＬである。反応の温度は、使用する特定の酵素及びプライマーに最適化され、反応は５～６０分間にわたって進行する。ＬＡＭＰは、感度、特異性及び効率が高い。
【0151】
ＬＡＭＰは、６つの標的部位（例えば、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ及びＢＩＰ）を認識する少なくとも４つのプライマーに依存して、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ標的を増幅する（ＲＮＡ標的は最初にＤＮＡへの逆転写を必要とする）。ループプライマー（例えば、ＬＦ及びＬＢ）が含まれる場合、標的核酸中の合計８つのユニーク部位が６つのプライマーによって認識される。本明細書で提供される様々な実施形態では、合計８つのユニーク部位のうちの１つが、本明細書に記載されるループプライマーによって認識され得る。標的が試料中に存在する場合、増幅反応が起こり、大量のＤＮＡがもたらされ得る。
【0152】
本明細書に記載の新規なループ・デ・ループ法は、ＬＡＭＰ以外の他の等温増幅法に適用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の温度サイクル依存性に対処するために、多数の等温増幅法が開発されている。これらの方法はかなり異なり得るが、それらはすべて共通のいくつかの特徴を共有する。例えば、ＤＮＡ鎖は熱変性されないので、すべての等温法は、プライマー結合及び増幅反応の開始を可能にするための代替アプローチに依存する。反応が開始されると、ポリメラーゼはまた、依然として目的の配列にアニールされている鎖を置換しなければならない。等温法は、典型的には、二本鎖ＤＮＡを分離するためのＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を用いる。この能力を有するポリメラーゼとしては、中程度の温度反応（２５～４０℃）では、クレノウフラグメント（３’－５’ｅｘｏ－）、Ｂｓｕラージフラグメント及びｐｈｉ２９が挙げられ、より高い温度（５０～６５℃）反応では、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントが挙げられる。ＲＮＡ種を検出するために、反応温度に適合する逆転写酵素を添加して増幅の等温性を維持する。ｄｓＤＮＡを分離するための鎖置換機構に加えて、等温法は、開始のための初期変性要件を回避するために酵素又はプライマーの設計を必要とし得る。
【0153】
上記のように、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）は、標的ＤＮＡの６～８個の異なる領域を認識する４～６個のプライマーを使用する。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが合成を開始し、２つのプライマーがループ構造を形成して、その後の増幅を促進する。ＬＡＭＰは迅速で高感度であり、増幅が非常に大きいため、ＬＡＭＰは現場の診断によく適している。ループ・デ・ループプライマーは、単一若しくは任意の組み合わせ又は内側及び／若しくはループプライマーに使用され得る。
【0154】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、典型的には、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント又はクレノウフラグメント（３’－５’ｅｘｏ－）に依存して、プライマーに含まれる部位の鎖制限エンドヌクレアーゼ又はニッキング酵素によって作られるニックで開始する。ＳＤＡは、１つのフォワードプライマー及び１つのリバースプライマー、並びに１つのバンピングフォワードプライマー及び１つのバンピングリバースプライマーを必要とする。ニッキング部位は、各ポリメラーゼ置換工程で再生され、指数関数的増幅をもたらす。ＳＤＡは、典型的には、臨床診断において使用される。既存の蛍光モニタリング技術は、ＳＤＡのために存在するが（Nadeau et al.,Real-Time,Sequence-specific detection of nucleic acids during strand displacement amplification,276m 2 177-187（1999））、蛍光を生成するために制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用に依存する。順方向又は逆方向のいずれかのＳＤＡプライマーを、フルオロフォア対とクエンチャー対との間の切断部位の位置を必要としないループ・デ・ループ法での使用に適合させることができる。切断部位は、ループ・デ・ループプライマーのクランピング配列の隣に、プライマーの３’末端に向かって存在し、その結果、制限エンドヌクレアーゼによるプライマー切断の前に、相補鎖上のポリメラーゼによるプライマーの５’末端の完全な伸長時に蛍光が生成される。
【0155】
ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）は、ヘリカーゼの二本鎖ＤＮＡ巻き戻し活性を利用して鎖を分離し、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーアニーリング及び伸長を可能にする。ＰＣＲと同様に、この系は、２つのプライマー、すなわち、１つのフォワードプライマー及び１つのリバースプライマーのみを必要とする。ＨＤＡは、いくつかの診断装置及びＦＤＡ承認試験で使用されている。ＨＤＡ中のいずれかのプライマーを、ループ・デ・ループ法での使用に適合させて、反応のリアルタイムの密閉チューブモニタリングをリアルタイムで行うことができる。ＨＤＡでは、ヘリカーゼ酵素はループ・デ・ループプライマーのループ構造を開くことができ、これは一本鎖結合タンパク質によって安定化され、次いでＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖蛍光アンプリコンに変換され得る。
【0156】
ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）は、ニッキング酵素によって作られたニックで開始する鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用し、標的配列から多くの短い核酸を迅速に生成する。このプロセスは非常に迅速かつ高感度であり、わずかな標的量を数分で検出することができる。ＮＥＡＲは、臨床及びバイオセーフティ用途において、一般的に病原体の検出に使用されている。ＮＥＡＲ用のフォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれかは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼによるループの伸長を介してリアルタイム蛍光を生成するためにループ・デ・ループ法を使用することができる。
【0157】
６．７．使用方法
本明細書で提供されるループ・デ・ループ増幅方法は、様々な供給源から標的配列を検出するために使用することができる。例えば、それは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、古細菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、原生生物ゲノム、原核生物ゲノム又は真核生物ゲノムに特異的な標的配列を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ（例えば、プラスセンスＲＮＡ、マイナスセンスＲＮＡ）又はＤＮＡを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本方法は、合成的に生成された標的配列を検出するために使用される。
本明細書で提供されるループ・デ・ループ増幅方法は、様々な供給源から標的配列を検出するために使用することができる。例えば、それは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、古細菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、原生生物ゲノム、原核生物ゲノム又は真核生物ゲノムに特異的な標的配列を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ（例えば、プラスセンスＲＮＡ、マイナスセンスＲＮＡ）又はＤＮＡを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本方法は、合成的に生成された標的配列を検出するために使用される。
【0158】
いくつかの実施形態では、病原体に特異的なＤＮＡの検出にループ・デ・ループ法が使用される。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原虫又は寄生虫である。いくつかの実施形態では、ＳＴＤに関連する病原体を検出するためにループ・デ・ループ法が使用される。いくつかの実施形態では、病原体はクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）である。いくつかの実施形態では、病原体は淋菌（Neisseria gonorrhoeae）である。いくつかの実施形態では、病原体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0159】
いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が感染の診断に使用される。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が、変異遺伝子型の決定のために使用される。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が、薬物耐性表現型に関連する変異遺伝子型の決定のために使用される。例えば、薬剤耐性マーカー、例えば、セフトリアキソン／セフィキシム耐性マーカー、キノロン（シプロフロキサシン）耐性マーカー、マクロライド耐性マーカー（アジスロマイシン）を検出することができる。
【0160】
いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が、一塩基多型（ＳＮＰ）の決定のために使用される。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が、変異の決定のために使用される。
【0161】
いくつかの実施形態では、単一の標的の検出のためにループ・デ・ループ法が使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上の標的の検出のためにループ・デ・ループ法が使用される。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が、２つ、３つ、４つ又は５つの標的の検出のために使用される。
【0162】
いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループ法が、試料の分析又はキャラクタリゼーションのために使用される。いくつかの実施形態では、ループ・デ・ループが、試料の供給源を同定するために使用される。例えば、ループ・デ・ループ法は、ヒト試料の同定に用いられる。
【0163】
本明細書に記載のループ・デ・ループ法は、様々な試料の分析に使用することができる。いくつかの実施形態では、血液、尿、精液、組織又は唾液試料が分析される。いくつかの実施形態では、試料は動物又はヒト患者から採取される。いくつかの実施形態では、精製された試料が分析される。いくつかの実施形態では、粗試料が分析される。いくつかの実施形態では、試料は、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、ヒト細胞全体、唾液若しくは鼻スワブ、又は中鼻甲介若しくは鼻咽頭スワブを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全細菌又は膣スワブ由来の全ヒト細胞を含む。
【実施例】
【0164】
６．８．実施例
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
６．８．１．実施例１：インターカレート色素（ＳＹＴＯ）を使用したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及び淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のＬＡＭＰアッセイ
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
６．８．１．実施例１：インターカレート色素（ＳＹＴＯ）を使用したクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及び淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のＬＡＭＰアッセイ
【0165】
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡ及び淋菌（Niesseria gonorrhea）ゲノムＤＮＡを別々に検出するために、ＬＡＭＰ反応混合物を調製した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．８μＭのＬＦ及びＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１～４、６、８～１４）、２．５μＭ ＳＹＴＯ８５インターカレート色素、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍希釈した。標的ＤＮＡ又はＤＮＡを含まない緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物に１μＬ添加した。反応の温度は６５℃であり、ＳＹＴＯ８５蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図２Ａに示されるデータは、インターカレーティング色素によってモニタリングされた、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）（緑色）及び淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（青色）についてのＬＡＭＰ反応から得られた縦軸上のリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸上の時間の代表的な曲線を、それぞれ３レベルのゲノムＤＮＡ標的－高（原液濃度）、低（Ｃｔについては原液ＤＮＡの１０－５希釈物、Ｎｇについては原液ＤＮＡの１０－６希釈物）、及び鋳型なし対照（ＤＮＡなし（ＮＴＣ））、について示す。
【0166】
６．８．２．実施例２：ループ・デ・ループ増幅によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の検出
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡを検出した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号９～１５）、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍又は２倍（より細かい分解能のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈物又はＤＮＡ非含有緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物中に１μＬ添加し、アッセイ感度を調べるために数ｌｏｇ濃度範囲にわたって１濃度当たり最大２０個の複写物を使用した。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。次いで、アッセイ感度（検出の限界、５０％及び９５％の確率）を、アッセイの終点決定に基づいてＰＲＯＢＩＴ分析によって推定した。
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ゲノムＤＮＡを検出した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号９～１５）、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍又は２倍（より細かい分解能のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈物又はＤＮＡ非含有緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物中に１μＬ添加し、アッセイ感度を調べるために数ｌｏｇ濃度範囲にわたって１濃度当たり最大２０個の複写物を使用した。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。次いで、アッセイ感度（検出の限界、５０％及び９５％の確率）を、アッセイの終点決定に基づいてＰＲＯＢＩＴ分析によって推定した。
【表1】
【0167】
６．８．３．実施例３：ループ・デ・ループ増幅による淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）ゲノムＤＮＡを検出した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１～４、６～８）、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍又は２倍（より細かい分解能のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈物又はＤＮＡ非含有緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物中に１μＬ添加し、アッセイ感度を調べるために数ｌｏｇ濃度範囲にわたって１濃度当たり最大２０個の複写物を使用した。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図２Ｂ～図２Ｃに示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間の代表的な曲線を示す。図２Ｂは、ループ・デ・ループアッセイから得られた信号を、図２Ａに示すように、ループ・デ・ループプライマーなしでＳＹＴＯ８５色素を用いて実施したＬＡＭＰアッセイの信号と比較する。ループ・デ・ループアッセイは、陽性増幅の場合にはるかに大きな信号を提供する。図２Ｃでは、ループ・デ・ループアッセイの再現性、並びに鋳型なし対照での無視できるバックグラウンド蛍光及び減少した後期偽増幅産物が示されている。図４に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。次いで、アッセイ感度（検出の限界、５０％及び９５％の確率）を、アッセイの終点決定に基づくＰＲＯＢＩＴ分析による連続希釈試験結果から推定した。
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）ゲノムＤＮＡを検出した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１～４、６～８）、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍又は２倍（より細かい分解能のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈物又はＤＮＡ非含有緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物中に１μＬ添加し、アッセイ感度を調べるために数ｌｏｇ濃度範囲にわたって１濃度当たり最大２０個の複写物を使用した。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図２Ｂ～図２Ｃに示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間の代表的な曲線を示す。図２Ｂは、ループ・デ・ループアッセイから得られた信号を、図２Ａに示すように、ループ・デ・ループプライマーなしでＳＹＴＯ８５色素を用いて実施したＬＡＭＰアッセイの信号と比較する。ループ・デ・ループアッセイは、陽性増幅の場合にはるかに大きな信号を提供する。図２Ｃでは、ループ・デ・ループアッセイの再現性、並びに鋳型なし対照での無視できるバックグラウンド蛍光及び減少した後期偽増幅産物が示されている。図４に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。次いで、アッセイ感度（検出の限界、５０％及び９５％の確率）を、アッセイの終点決定に基づくＰＲＯＢＩＴ分析による連続希釈試験結果から推定した。
【表2】
【0168】
６．８．４．実施例４：ループ・デ・ループ増幅によるホモサピエンスの検出
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、ホモサピエンスゲノムＤＮＡを検出した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１６～２２）、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍又は２倍（より細かい分解能のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈物又はＤＮＡ非含有緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物中に１μＬ添加し、アッセイ感度を調べるために数ｌｏｇ濃度範囲にわたって１濃度当たり最大２０個の複写物を使用した。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対するホモサピエンスのループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。次いで、アッセイ感度（検出の限界、５０％及び９５％の確率）を、アッセイの終点決定に基づいてＰＲＯＢＩＴ分析によって推定した。
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、ホモサピエンスゲノムＤＮＡを検出した。反応物は、１０μＬ容量で調製され、以下の試薬、すなわち、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１６～２２）、並びに、水を含有し、２０℃でｐＨを８．８に調整した。定量した標的ゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した原液からｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液で１０倍又は２倍（より細かい分解能のため）に希釈した。標的ＤＮＡ希釈物又はＤＮＡ非含有緩衝液（鋳型なし対照の場合）を、各ＰＣＲチューブ内の９μＬの溶液混合物中に１μＬ添加し、アッセイ感度を調べるために数ｌｏｇ濃度範囲にわたって１濃度当たり最大２０個の複写物を使用した。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図３に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対するホモサピエンスのループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。次いで、アッセイ感度（検出の限界、５０％及び９５％の確率）を、アッセイの終点決定に基づいてＰＲＯＢＩＴ分析によって推定した。
【表3】
【0169】
６．８．５．実施例５：ループ・デ・ループ増幅のための乾燥プライマー混合物
凍結乾燥試薬への製剤化は、５段階凍結乾燥プロトコルを用いた社内凍結乾燥試験で行った。淋菌（Neisseria gonorrhoeae）を検出するように設計されたループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を２５μＬ容量／チューブで調製し、各チューブに分注した。凍結乾燥混合物は、以下の試薬、すなわち、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、グリセロールを含まない製剤としての０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１～４、６～８）、５％トレハロース、並びに水（１反応あたり最大２５μＬ）を含有していた。チューブの蓋を凍結乾燥のために取り外した。チューブストリップを、製薬及びバイオテクノロジー産業における標準的な機器である加熱棚凍結乾燥機ユニット内の金属棚上に置いた。凍結乾燥機を５段階で実行するようにプログラムした。段階１：凝縮器ＯＮ、真空ＯＦＦ、棚及び試薬を４１°Ｆに冷却、３０分。段階２：凝縮器ＯＮ、真空ＯＦＦ、棚及び試薬を２３Ｆに冷却、３０分。段階３：凝縮器ＯＮ、真空ＯＦＦ、棚及び試薬を－２３Ｆに冷却、２時間。段階４：凝縮器ＯＮ、真空ＯＮ、棚及び試薬を－２３Ｆ、１０時間に維持する。段階５：凝縮器ＯＮ、真空ＯＮ、棚及び試薬を７７Ｆに加熱、５時間。このプロセスが完了したら、チューブを取り出し、蓋をして、図７に示す生成物を得た。凍結乾燥アッセイの活性を、様々な環境条件でのインキュベーション後に一定期間にわたって試験した。図８は、再水和反応の代表的なリアルタイムループ・デ・ループＬＡＭＰアッセイ活性を示す。再水和プロトコルは、２４μＬの再水和緩衝液を１μＬの淋菌（Neisseria gonorrhoeae）標的ゲノムＤＮＡと共に乾燥試薬に添加することからなっていた。再水和緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び水から構成され、ｐＨは２０℃で８．８に調整された。緩衝液をチューブに添加し、次いで再密封し、ボルテックス又は混合を行うことなく、リアルタイムｑＰＣＲ機にそのまま入れた。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図８に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。凍結乾燥ループ・デ・ループアッセイの速度、感度及び特異性は、新たに製剤化されたアッセイの速度、感度及び特異性と変わらないことが分かった。さらに、蛍光の大きさは乾燥及び再水和によって影響を受けず、ループ・デ・ループ法が病原体検出のための保存安定性インビトロ診断キットを提供し得ることを示している。
凍結乾燥試薬への製剤化は、５段階凍結乾燥プロトコルを用いた社内凍結乾燥試験で行った。淋菌（Neisseria gonorrhoeae）を検出するように設計されたループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を２５μＬ容量／チューブで調製し、各チューブに分注した。凍結乾燥混合物は、以下の試薬、すなわち、１．４ｍＭ ｄＮＴＰ、グリセロールを含まない製剤としての０．３２Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ、１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、０．４μＭのＬＦ及びＬＦ－ＬｄＬ、０．８μＭのＬＢ、０．２μＭのＦ３及びＢ３を有するプライマー（配列番号１～４、６～８）、５％トレハロース、並びに水（１反応あたり最大２５μＬ）を含有していた。チューブの蓋を凍結乾燥のために取り外した。チューブストリップを、製薬及びバイオテクノロジー産業における標準的な機器である加熱棚凍結乾燥機ユニット内の金属棚上に置いた。凍結乾燥機を５段階で実行するようにプログラムした。段階１：凝縮器ＯＮ、真空ＯＦＦ、棚及び試薬を４１°Ｆに冷却、３０分。段階２：凝縮器ＯＮ、真空ＯＦＦ、棚及び試薬を２３Ｆに冷却、３０分。段階３：凝縮器ＯＮ、真空ＯＦＦ、棚及び試薬を－２３Ｆに冷却、２時間。段階４：凝縮器ＯＮ、真空ＯＮ、棚及び試薬を－２３Ｆ、１０時間に維持する。段階５：凝縮器ＯＮ、真空ＯＮ、棚及び試薬を７７Ｆに加熱、５時間。このプロセスが完了したら、チューブを取り出し、蓋をして、図７に示す生成物を得た。凍結乾燥アッセイの活性を、様々な環境条件でのインキュベーション後に一定期間にわたって試験した。図８は、再水和反応の代表的なリアルタイムループ・デ・ループＬＡＭＰアッセイ活性を示す。再水和プロトコルは、２４μＬの再水和緩衝液を１μＬの淋菌（Neisseria gonorrhoeae）標的ゲノムＤＮＡと共に乾燥試薬に添加することからなっていた。再水和緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び水から構成され、ｐＨは２０℃で８．８に調整された。緩衝液をチューブに添加し、次いで再密封し、ボルテックス又は混合を行うことなく、リアルタイムｑＰＣＲ機にそのまま入れた。反応の温度は６５℃であり、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。図８に示すデータは、ゲノムＤＮＡ標的の１０倍希釈に対する淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のループ・デ・ループＬＡＭＰ反応から得られたリアルタイム蛍光（任意単位）対横軸の時間（各「サイクル」は３０秒を表す）の代表的な曲線を示す。凍結乾燥ループ・デ・ループアッセイの速度、感度及び特異性は、新たに製剤化されたアッセイの速度、感度及び特異性と変わらないことが分かった。さらに、蛍光の大きさは乾燥及び再水和によって影響を受けず、ループ・デ・ループ法が病原体検出のための保存安定性インビトロ診断キットを提供し得ることを示している。
【0170】
６．８．６．実施例６：ループ・デ・ループ増幅のための温度
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を上記のように調製し、一方はＯＲＦ１ａｂプライマーセットを含み、他方はＰＯＰ７ｂプライマーセットを含む。ＯＲＦ１ａｂプライマーセットは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに特異的である。ＰＯＰ７ｂプライマーセットは、ＤＮＡ鋳型として天然には存在しないヒトＲＮＡ標的に特異的であり、したがって、このプライマーセットは、試料中のヒトＲＮＡの特異的指標として有用である。両方の場合において、ループ・デ・ループを使用して、ＬＡＭＰに使用される６つの構成プライマーのうちの１つを修飾して、第７のループプライマーを作製した。ループプライマーは、フルオロフォアとクエンチャーの対を利用して、観測可能な信号を生成した。この実験では、各プライマーセットのＲＮＡ標的の配列に対応するそれらのプラスセンス鎖上の配列を含む中程度に高濃度の合成二本鎖ＤＮＡ鋳型を、ＬＡＭＰ反応温度最適化の標的として利用して、逆転写工程又は希薄な標的が遭遇する確率的ノイズによる変動を最小限に抑えた。標的ＤＮＡ希釈液を３８４ウェルプレート内の混合物に添加した。それらを５５から７０℃の範囲の様々な温度でインキュベートし、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。重複する温度範囲について２回実験（第１の試験及び第２の試験）を行い、それらのデータを図９Ａ及び図９Ｂに示す。この図は、検出に十分な信号を得るのに必要な時間を示す。この結果は、プライマーセットが広範囲の温度にわたって活性であることを示している。例えば、約５７～７０℃が、ＰＯＰ７ｂプライマーセット及びＯＲＦ１ａｂプライマーセットの両方について許容範囲であった。６０℃～６８℃の間で最適な性能が達成された。
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を上記のように調製し、一方はＯＲＦ１ａｂプライマーセットを含み、他方はＰＯＰ７ｂプライマーセットを含む。ＯＲＦ１ａｂプライマーセットは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに特異的である。ＰＯＰ７ｂプライマーセットは、ＤＮＡ鋳型として天然には存在しないヒトＲＮＡ標的に特異的であり、したがって、このプライマーセットは、試料中のヒトＲＮＡの特異的指標として有用である。両方の場合において、ループ・デ・ループを使用して、ＬＡＭＰに使用される６つの構成プライマーのうちの１つを修飾して、第７のループプライマーを作製した。ループプライマーは、フルオロフォアとクエンチャーの対を利用して、観測可能な信号を生成した。この実験では、各プライマーセットのＲＮＡ標的の配列に対応するそれらのプラスセンス鎖上の配列を含む中程度に高濃度の合成二本鎖ＤＮＡ鋳型を、ＬＡＭＰ反応温度最適化の標的として利用して、逆転写工程又は希薄な標的が遭遇する確率的ノイズによる変動を最小限に抑えた。標的ＤＮＡ希釈液を３８４ウェルプレート内の混合物に添加した。それらを５５から７０℃の範囲の様々な温度でインキュベートし、ループ・デ・ループプライマーによって発せられるＦＡＭ蛍光によって反応をモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、反応物を加熱し、リアルタイムで蛍光を測定した。反応を６０分間実行した。重複する温度範囲について２回実験（第１の試験及び第２の試験）を行い、それらのデータを図９Ａ及び図９Ｂに示す。この図は、検出に十分な信号を得るのに必要な時間を示す。この結果は、プライマーセットが広範囲の温度にわたって活性であることを示している。例えば、約５７～７０℃が、ＰＯＰ７ｂプライマーセット及びＯＲＦ１ａｂプライマーセットの両方について許容範囲であった。６０℃～６８℃の間で最適な性能が達成された。
【0171】
６．８．７．実施例７：精製された標的と粗検体中の標的の両方を検出するための多重ループ・デ・ループ反応
図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃは、それぞれにＯＲＦ１ａｂ及びＰＯＰ７ｂ ＬｄＬプライマーセットを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト標的配列のループ・デ・ループ増幅から得られた２つの蛍光信号を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ１ａｂ（ＦＡＭ）及びＰＯＰ７ｂヒト内部対照（Ｃｙ５）から得られた信号を示す。標的配列のない対照試料（鋳型なし対照）（図１４Ａ）、ヒト鼻スワブ（図１４Ｂ）、及び熱不活性化ウイルスの形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列と組み合わせたヒト鼻スワブ（図１４Ｃ）の３種類の試料を使用した。ヒト鼻スワブをボランティアから自己採取し、試料処理又は核酸抽出を行うことなく反応物に直接添加した。スワブを数秒間ねじることによって反応混合物に溶出させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性反応に添加されるインタクトな熱不活性化ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１９８６ＨＫ）として反応物に導入した。ＯＲＦ１ａｂ ＬｄＬ－ＦＡＭ及びＰＯＰ７ｂ ＬｄＬ－Ｃｙ５のプライマーセットを複製反応体積において１：１の比で二重鎖化した。両方のプライマーセットは、非標識プライマー類似体（２５％強度）に対して１：３の比でＬｄＬプライマーを利用した。反応物は、逆転写酵素、鎖置換ポリメラーゼ及びＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいた。リアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ－３８４（登録商標））を使用して、ＦＡＭ及びＣｙ５の蛍光測定値を記録しながら、５５．６℃で２．５分間反応物をインキュベートし、次いで６３．５℃で６０分間反応物をインキュベートした。予想されたように、鋳型なし対照の複製物は、６０分にわたってループ・デ・ループ蛍光信号を示さなかった。ＣＯＶＩＤ－１９陰性鼻スワブ試料を含む反応は、Ｃｙ５蛍光の増加によって証明されるように、ＰＯＰ７ｂ信号の増幅を示したが、ＯＲＦ１ａｂ信号はフラットなままであった（陰性）。熱不活性化ウイルスを添加した試料は、単一反応容器内の両方のＲＮＡ標的のスペクトル的二重検出を示した。この結果は、ループ・デ・ループＲＴ－ＬＡＭＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト標的の単一チューブのスペクトル多重化を可能にすることを示している。
図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃは、それぞれにＯＲＦ１ａｂ及びＰＯＰ７ｂ ＬｄＬプライマーセットを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト標的配列のループ・デ・ループ増幅から得られた２つの蛍光信号を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ１ａｂ（ＦＡＭ）及びＰＯＰ７ｂヒト内部対照（Ｃｙ５）から得られた信号を示す。標的配列のない対照試料（鋳型なし対照）（図１４Ａ）、ヒト鼻スワブ（図１４Ｂ）、及び熱不活性化ウイルスの形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列と組み合わせたヒト鼻スワブ（図１４Ｃ）の３種類の試料を使用した。ヒト鼻スワブをボランティアから自己採取し、試料処理又は核酸抽出を行うことなく反応物に直接添加した。スワブを数秒間ねじることによって反応混合物に溶出させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性反応に添加されるインタクトな熱不活性化ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１９８６ＨＫ）として反応物に導入した。ＯＲＦ１ａｂ ＬｄＬ－ＦＡＭ及びＰＯＰ７ｂ ＬｄＬ－Ｃｙ５のプライマーセットを複製反応体積において１：１の比で二重鎖化した。両方のプライマーセットは、非標識プライマー類似体（２５％強度）に対して１：３の比でＬｄＬプライマーを利用した。反応物は、逆転写酵素、鎖置換ポリメラーゼ及びＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいた。リアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ－３８４（登録商標））を使用して、ＦＡＭ及びＣｙ５の蛍光測定値を記録しながら、５５．６℃で２．５分間反応物をインキュベートし、次いで６３．５℃で６０分間反応物をインキュベートした。予想されたように、鋳型なし対照の複製物は、６０分にわたってループ・デ・ループ蛍光信号を示さなかった。ＣＯＶＩＤ－１９陰性鼻スワブ試料を含む反応は、Ｃｙ５蛍光の増加によって証明されるように、ＰＯＰ７ｂ信号の増幅を示したが、ＯＲＦ１ａｂ信号はフラットなままであった（陰性）。熱不活性化ウイルスを添加した試料は、単一反応容器内の両方のＲＮＡ標的のスペクトル的二重検出を示した。この結果は、ループ・デ・ループＲＴ－ＬＡＭＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト標的の単一チューブのスペクトル多重化を可能にすることを示している。
【0172】
ＯＲＦ１ａｂ ＬｄＬプライマーセットを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の多重ループ・デ・ループ試験は、ＰＣＲ試験と同程度に感度が高く、抽出を必要としなかった。これは、粗試料との反応が、以下の表に示すように良好な結果をもたらしたためである。ＰＯＰ７ｂ ＬｄＬプライマーセットを内部対照として使用した。インタクトな熱不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１９８６ＨＫ）の段階希釈物を二重ループ・デ・ループ反応に添加し、リアルタイム信号発生についてモニタリングした。アッセイの検出限界は、試験キットの特定のフォーマットについて、ＬｏＤ９５＝４００ｃｐ／スワブ＝２．７×１０３ｃｐ／ｍＬと推定された。
【表4】
【0173】
三重化ループ・デ・ループ反応も単一のチューブで試験した。それは、３つの標的の特異的増幅を示し、結果に至るまでの速い時間を維持した。ＦＡＭフルオロフォアで標識された２つのループ・デ・ループプライマーセットを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの２つの別々の標的を検出した。Ｃｙ５で標識されたヒト内部対照ループ・デ・ループプライマーセットは、第３のＲＮＡ標的を検出した。内部Ｃｙ５フルオロフォアを５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱクエンチャーと対にした。反応物は粗鼻スワブ溶出液を含み、熱不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を添加した。
【0174】
ＰＯＰ７ｂヒト内部対照用のループ・デ・ループプライマーセットでの使用について、追加のループプライマーも試験した。ある場合では、第２のセンサ分子である内部ＴＡＭＲＡフルオロフォアを、第１のセンサ分子である５’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーと対にした。別の場合では、第１のセンサ分子である５’Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、第２のセンサ分子である内部Ｚｅｎ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）クエンチャーと対にした。Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ及びＺｅｎの配置について、ループプライマーの３つのバリエーションを作製し、試験した。第１の変形例では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドと第２のクランピングオリゴヌクレオチドは完全に相補的であり、それぞれ６塩基長であった。スペーシングオリゴヌクレオチドは１３塩基長であった。第２の変形例では、第１のクランピングオリゴヌクレオチドは、その５’末端の追加の塩基を特徴とし、その結果、第１のクランピングオリゴヌクレオチドは７塩基長であり、第２のクランピングオリゴヌクレオチドは６塩基長であった。第１のクランピングオリゴヌクレオチドと第２のクランピングオリゴヌクレオチドとの間に６個の相補的塩基が存在した。スペーシングオリゴヌクレオチドは１３塩基長であった。第３の変形例では、第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドは両方とも７塩基長であり、配列は完全に相補的であった。スペーシングオリゴヌクレオチドは１０塩基長であった。
【0175】
これらの追加のループプライマーは、ＬＡＭＰ反応に使用される。この反応は、標的配列の特異的増幅信号を提供する。
【0176】
６．８．８．実施例８：ループ・デ・ループ増幅によるヒト試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、処理されていないヒト唾液からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した。凍結乾燥酵素、ｄＮＴＰ、及びオリゴヌクレオチドプライマー混合物をｐＨ緩衝塩溶液にヒト唾液を混合した１０％体積／体積混合物で再水和することによって、ＰＣＲチューブ中で反応物を調製した。凍結乾燥プライマー混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト内部対照ＲＮＡ配列のプライマーセットを含んでいた。唾液試料で再水和した後、反応物を予熱温度で所定の期間インキュベートしてウイルスの溶解、ＲＮａｓｅ阻害、及び逆転写を促進し、次いでＬＡＭＰ ＤＮＡ増幅のためにより高い反応温度でインキュベートした。カスタム機器を使用して、温度制御データ及びリアルタイム蛍光データを収集した。
ループ・デ・ループＬＡＭＰ反応混合物を調製して、処理されていないヒト唾液からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した。凍結乾燥酵素、ｄＮＴＰ、及びオリゴヌクレオチドプライマー混合物をｐＨ緩衝塩溶液にヒト唾液を混合した１０％体積／体積混合物で再水和することによって、ＰＣＲチューブ中で反応物を調製した。凍結乾燥プライマー混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト内部対照ＲＮＡ配列のプライマーセットを含んでいた。唾液試料で再水和した後、反応物を予熱温度で所定の期間インキュベートしてウイルスの溶解、ＲＮａｓｅ阻害、及び逆転写を促進し、次いでＬＡＭＰ ＤＮＡ増幅のためにより高い反応温度でインキュベートした。カスタム機器を使用して、温度制御データ及びリアルタイム蛍光データを収集した。
【0177】
熱不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を匿名ドナーから採取した新鮮な唾液のプールに添加した。唾液の３倍連続希釈液を調製した。ループ・デ・ループ増幅方法を用いて２０個の試料を試験した。モバイルアプリケーション、目測、又はリアルタイムの曲線検査による読み出しを以下にまとめる。これらの結果は、ＬｏＤが約２，５００ｃｐ／ｍＬであることを示している。
【表5】
【0178】
自己採取した鼻スワブをボランティア対象から取得して、１０回ねじることによって反応混合物に直接添加した。図１６は、後にＰＣＲ試験によってＣＯＶＩＤ陽性であることが確認された症候性のボランティアから取得した鼻スワブから得られた増幅結果を示す。陽性／陰性の対照試料から得られた結果も併せて示す。これらの結果は、試料（１×スワブ）が、ループ・デ・ループアッセイで陽性試料を検出するのに必要な濃度よりも３６５倍濃縮されたことを示している。ＬｏＤが約２，５００ｃｐ／ｍＬであると推定されることから、特定の試料は約９．１×１０５ｃｐ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡを含有すると推定された。
【0179】
図１７は、陰性ボランティアから取得した鼻スワブから得られた増幅結果を示す。この患者は、ループ・デ・ループ反応及びＰＣＲ試験の両方によって陰性と検出された。
【0180】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための反応混合物を、１：１の比でヒトゲノム配列を検出するためのプライマーと多重化した。多重化された増幅結果を図１８に示す。これらの結果は、交差反応性を伴わない、２つの標的配列の特異的かつ高感度の検出を示す。
【0181】
６．８．９．実施例９：ループ・デ・ループ増幅によるヒト試料中のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及び淋菌（Neisseria gonorrhoeae）の検出
３０秒、１Ｈｚの回転法（Panpradist et al.,2016）を用いて、３つの膣スワブ（ＢＤ ＢＢＬ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｗａｂｓ、固有の個々のドナーから供給されたＬｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＭＯ）から購入したポリウレタンフォーム付きスワブ）を１，２９４μＬの再水和緩衝液（スワブあたり４３１μＬ）に溶出した。若干の流体がスワブに失われた後に、１０９５μＬのプールされた膣スワブ溶出液を得た。流体回収率は８５％であった。このスワブ溶出液を、ループ・デ・ループＬＡＭＰ用（１つはＣｔ用、１つはＮｇ用、１つはヒトプロセス対照用）の凍結乾燥反応混合物を含む射出成形プロトタイプディスポーザブルにピペットで入れた。
３０秒、１Ｈｚの回転法（Panpradist et al.,2016）を用いて、３つの膣スワブ（ＢＤ ＢＢＬ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｗａｂｓ、固有の個々のドナーから供給されたＬｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＭＯ）から購入したポリウレタンフォーム付きスワブ）を１，２９４μＬの再水和緩衝液（スワブあたり４３１μＬ）に溶出した。若干の流体がスワブに失われた後に、１０９５μＬのプールされた膣スワブ溶出液を得た。流体回収率は８５％であった。このスワブ溶出液を、ループ・デ・ループＬＡＭＰ用（１つはＣｔ用、１つはＮｇ用、１つはヒトプロセス対照用）の凍結乾燥反応混合物を含む射出成形プロトタイプディスポーザブルにピペットで入れた。
【0182】
各反応物を以下で再水和した。
・１８μＬのスワブ溶出液（再水和緩衝液に旋回させたスワブ）；
・再水和緩衝液に懸濁した１μＬの全Ｃｔ病原体
・再水和緩衝液に懸濁した１μＬの全Ｎｇ病原体
Ｃｔ及びＮｇの病原体試料は、ディスポーザブルの各反応チャンバの中にあった。したがって、例えば、Ｃｔアッセイは、Ｎｇ及びヒト標的並びにスワブ試料中に存在するあらゆる細菌環境の同時存在下でＣｔを検出することを課せられていた。
・１８μＬのスワブ溶出液（再水和緩衝液に旋回させたスワブ）；
・再水和緩衝液に懸濁した１μＬの全Ｃｔ病原体
・再水和緩衝液に懸濁した１μＬの全Ｎｇ病原体
Ｃｔ及びＮｇの病原体試料は、ディスポーザブルの各反応チャンバの中にあった。したがって、例えば、Ｃｔアッセイは、Ｎｇ及びヒト標的並びにスワブ試料中に存在するあらゆる細菌環境の同時存在下でＣｔを検出することを課せられていた。
【0183】
増幅結果を図１９～図２２に示す。図１９は、多量のＣｔ（１反応あたり１０，０００コピー当量）及び多量のＮｇ（１反応あたり１０，０００コピー当量）を含有する試料から得られた蛍光信号を示す。図２０は、陰性対照－スワブのみの対照（左の二枚のパネル）又は緩衝液のみの対照（右の二枚のパネル）から得られた信号を示す。スワブのみの対照ではＣｔ又はＮｇの増幅はなかったが、ヒトゲノム配列は予想通りに増幅された。緩衝液のみの対照では、Ｃｔ又はＮｇの増幅はなかった。ホモサピエンスの増幅は、一方の緩衝液のみの反応（試験２０）において遅れて検出されたが、信号が遅れたことを考えると、これは偽の増幅である可能性が高い。
【0184】
これらの結果は、このアッセイが、１反応あたり約１００コピーのＣｔ及び１反応あたり約１，０００超コピーのＮｇを検出するように感受性であったことを示す。
７．配列
７．配列
【表6】
【0185】
８．参照による組み込み
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願及び他の文献は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願及び他の文献は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0186】
９．均等物
本開示は、とりわけ、カンナビノイドの組成物及び同伴組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイド組成物及び同伴組成物を投与することによって神経変性疾患を治療する方法を提供する。様々な具体的な実施形態を図示及び説明してきたが、上記の明細書は限定的なものではない。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されよう。本明細書を検討すれば、多くの変形形態が当業者に明らかになるであろう。
本開示は、とりわけ、カンナビノイドの組成物及び同伴組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイド組成物及び同伴組成物を投与することによって神経変性疾患を治療する方法を提供する。様々な具体的な実施形態を図示及び説明してきたが、上記の明細書は限定的なものではない。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されよう。本明細書を検討すれば、多くの変形形態が当業者に明らかになるであろう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【配列表】