特許 7635165 ｐ５３におけるＲ１７５Ｈ又はＹ２２０Ｃ変異を認識するＴ細胞受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-14

(45)【発行日】2025-02-25

(54)【発明の名称】ｐ５３におけるＲ１７５Ｈ又はＹ２２０Ｃ変異を認識するＴ細胞受容体

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/725 20060101AFI20250217BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20250217BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250217BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250217BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250217BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250217BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250217BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250217BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250217BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20250217BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20250217BHJP

【ＦＩ】

C07K14/725 ZNA

A61K31/713

A61K35/17

A61K38/17

A61P35/00

C12N5/10

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/02 C

G01N33/574 A

【請求項の数】 38

(21)【出願番号】P 2021576970

(86)(22)【出願日】2020-06-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-31

(86)【国際出願番号】 US2020039785

(87)【国際公開番号】W WO2020264269

(87)【国際公開日】2020-12-30

【審査請求日】2023-06-21

(31)【優先権主張番号】62/867,619

(32)【優先日】2019-06-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510002280

【氏名又は名称】アメリカ合衆国

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】デニガー、ドリュー シー．

(72)【発明者】

【氏名】マレクザデ、パリサ

(72)【発明者】

【氏名】ローゼンバーグ、スティーヴン エー．

(72)【発明者】

【氏名】パセット、アンナ

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０６７２４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０６７２４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】DENIGER, Drew C. et al.，Clinical Cancer Research，2018年，Vol. 24, No. 22，p.5562-5573，DOI:10.1158/1078-0432.CCR-18-0573

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、配列番号８０のアミノ酸配列を含むα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号８２のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号８３のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号８４のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び、配列番号８５のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３を含む、ＴＣＲ。

【請求項2】

（１）配列番号８６及び８７の両方；
（２）配列番号１５６及び１５７の両方；
（３）配列番号１９９及び８７の両方；又は
（４）配列番号８６及び２１９の両方；
のアミノ酸配列を含む、請求項１のＴＣＲ。

【請求項3】

（１）配列番号８８及び８９の両方；
（２）配列番号１７４及び１７５の両方；
（３）配列番号２００及び８９の両方；又は
（４）配列番号８８及び２２０の両方；
のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２のＴＣＲ。

【請求項4】

ヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}のアミノ酸配列が配列番号１１３である、請求項１～３のいずれか１項のＴＣＲ。

【請求項5】

ＴＣＲが、配列番号１１２の野生型ヒトｐ５３のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有さない、請求項１～４のいずれか１項のＴＣＲ。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項のＴＣＲの機能的部分を含む、単離又は精製されたポリペプチドであって、該機能的部分が、ヒトｐ５３ ^{Ｙ２２０Ｃ} のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、且つ、配列番号８０のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号８２のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号８３のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号８４のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び、配列番号８５のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３
を含む、ポリペプチド。

【請求項7】

（１）配列番号８６及び８７の両方；
（２）配列番号１５６及び１５７の両方；
（３）配列番号１９９及び８７の両方；又は
（４）配列番号８６及び２１９の両方；
のアミノ酸配列を含む、請求項６のポリペプチド。

【請求項8】

（１）配列番号８８及び８９の両方；
（２）配列番号１７４及び１７５の両方；
（３）配列番号２００及び８９の両方；又は
（４）配列番号８８及び２２０の両方；
のアミノ酸配列を含む、請求項６又は７のポリペプチド。

【請求項9】

（１）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖可変領域を含む第１のポリペプチド鎖、及び、配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖可変領域を含む第２のポリペプチド鎖を含む、ヒトｐ５３ ^{Ｙ２２０Ｃ} のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する単離又は精製されたタンパク質。

【請求項10】

（１）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８６のアミノ酸配列を含み、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８７のアミノ酸配列を含む；
（２）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号１５６のアミノ酸配列を含み、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号１５７のアミノ酸配列を含む；
（３）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号１９９のアミノ酸配列を含み、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８７のアミノ酸配列を含む；又は
（４）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８６のアミノ酸配列を含む、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号２１９のアミノ酸配列を含む、請求項９のタンパク質。

【請求項11】

（１）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８８のアミノ酸配列を含み、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含む；
（２）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号１７４のアミノ酸配列を含み、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号１７５のアミノ酸配列を含む；
（３）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含む、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含む；又は、
（４）前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８８のアミノ酸配列を含む、及び、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号２２０のアミノ酸配列を含む、請求項９又は１０のタンパク質。

【請求項12】

請求項１～５のいずれか１項のＴＣＲ、請求項６～８のいずれか１項のポリペプチド、又は請求項９～１１のいずれか１項のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸。

【請求項13】

５’から３’へと、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸であって、第１及び第２のヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域；
配列番号８７のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域；
配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域；
配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域；
配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域；
配列番号８７のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域；
配列番号８６のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域及び配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域；又は、
配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変領域及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖可変領域；をコードしており、ここで、該ＴＣＲα鎖可変領域及びＴＣＲβ鎖可変領域が、ヒトｐ５３ ^{Ｙ２２０Ｃ} のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、核酸。

【請求項14】

第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に挿入された第３のヌクレオチド酸配列を更に含み、前記第３のヌクレオチド配列が切断可能なリンカーペプチドをコードする、請求項１３の単離又は精製された核酸。

【請求項15】

切断可能なリンカーペプチドが、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、請求項１４の単離又は精製された核酸。

【請求項16】

配列番号９０及び２０１からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１５の単離又は精製された核酸。

【請求項17】

請求項１２～１６のいずれか１項の核酸を含む、組み換え発現ベクター。

【請求項18】

トランスポゾンベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項１７の組換え発現ベクター。

【請求項19】

請求項１２～１６のいずれか１項の核酸又は請求項１７若しくは１８のベクターによってコードされる、単離又は精製されたＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質。

【請求項20】

細胞における請求項１２～１６のいずれか１項の核酸又は請求項１７若しくは１８のベクターの発現から生じる、単離又は精製されたＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質。

【請求項21】

配列番号１１３のペプチドに対して抗原特異性を有するＴＣＲを発現する宿主細胞を製造する方法であって、単離又は精製された細胞を、該細胞へのベクターの導入を可能にする条件下で、請求項１７又は１８のベクターと接触させることを含む、方法。

【請求項22】

請求項１２～１６のいずれか１項の核酸、又は請求項１７若しくは１８の組み換え発現ベクターを含む、単離又は精製された宿主細胞。

【請求項23】

細胞がヒトリンパ球である、請求項２２の宿主細胞。

【請求項24】

細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、不変ナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項２２の宿主細胞。

【請求項25】

請求項２２～２４のいずれか１項の宿主細胞を含む、単離又は精製された細胞集団。

【請求項26】

請求項１～５、１９、若しくは２０のいずれか１項のＴＣＲ、請求項６～８、１９、若しくは２０のいずれか１項のポリペプチド、又は請求項９～１１、１９、若しくは２０のいずれか１項のタンパク質を製造する方法であって、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質が製造されるように、請求項２２～２４のいずれか１項の宿主細胞、又は請求項２５の、宿主の細胞集団を培養することを含む、方法。

【請求項27】

（ａ）請求項１～５、１９、若しくは２０のいずれか１項のＴＣＲ、請求項６～８、１９、若しくは２０のいずれか１項のポリペプチド、請求項９～１１、１９、若しくは２０のいずれか１項のタンパク質、請求項２２～２４のいずれか１項の宿主細胞、又は請求項２５の細胞集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。

【請求項28】

哺乳動物におけるがん細胞の存在を検出する方法であって：
（ａ）がんの細胞を含む試料と、請求項１～５、１９、若しくは２０のいずれか１項のＴＣＲ、請求項６～８、１９若しくは２０のいずれか１項のポリペプチド、請求項９～１１、１９若しくは２０のいずれか１項のタンパク質、請求項２２～２４のいずれか１項の宿主細胞、請求項２５の細胞の集団、又は請求項２７の医薬組成物とを接触させ、それによって、複合体を形成させること；及び
（ｂ）前記複合体を検出すること、
を含み、
複合体の検出が、哺乳動物におけるがん細胞の存在を示す、方法。

【請求項29】

請求項１～５、１９、若しくは２０のいずれか１項のＴＣＲ、請求項６～８、１９、若しくは２０のいずれか１項のポリペプチド、請求項９～１１、１９、若しくは２０のいずれか１項のタンパク質、請求項１２～１６のいずれか１項の核酸、請求項１７又は１８の組換え発現ベクター、請求項２２～２４のいずれか１項の宿主細胞、又は請求項２５の細胞集団を含む、哺乳動物におけるがんに対する免疫応答を誘導するための医薬組成物。

【請求項30】

請求項１～５、１９、若しくは２０のいずれか１項のＴＣＲ、請求項６～８、１９、若しくは２０のいずれか１項のポリペプチド、請求項９～１１、１９、若しくは２０のいずれか１項のタンパク質、請求項１２～１６のいずれか１項の核酸、請求項１７又は１８の組換え発現ベクター、請求項２２～２４のいずれか１項の宿主細胞、又は請求項２５の細胞集団を含む、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項31】

細胞集団が哺乳動物に対して自己である、請求項２９又は３０の医薬組成物。

【請求項32】

細胞集団が哺乳動物に対して同種異系である、請求項２９又は３０の医薬組成物。

【請求項33】

がんが上皮がんである、請求項２８の方法。

【請求項34】

がんが上皮がんである、請求項２９～３２のいずれか１項の医薬組成物。

【請求項35】

がんが胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんである、請求項２８の方法。

【請求項36】

がんが胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんである、請求項２９～３２のいずれか１項の医薬組成物。

【請求項37】

がんが、ヒトｐ５３におけるＹ２２０Ｃ変異を含むことが知られている、請求項２８、３３及び３５のいずれか１項の方法。

【請求項38】

がんが、ヒトｐ５３におけるＹ２２０Ｃ変異を含むことが知られている、請求項２９～３２、３４及び３６のいずれか１項の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１９年６月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／８６７，６１９号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。

【0002】

連邦政府支援の研究又は開発に関する陳述
本発明は、連邦政府の支援を受け、プロジェクト番号ＢＣ０１０９８５の下、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所によりなされた。本発明において、連邦政府は一定の権利を有する。

【0003】

電子的に提出された物件の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０２０年６月２３日付けの「７４９３３８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の３５７，７７５バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。

【背景技術】

【0004】

幾つかのがんは、特に該がんが転移性且つ切除不能になったとき、非常に限られた治療法の選択肢しか有しない場合がある。例えば、外科手術、化学療法、及び放射線療法等の治療法の進歩にもかかわらず、多くのがん、例えば、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣、及び前立腺のがんの予後は不良である場合がある。従って、がんの更なる治療法に対するアンメットニーズが存在する。

【発明の概要】

【0005】

発明の簡単な要旨
本発明の実施形態は、ヒトｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}又はヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって：（１）配列番号３～８の全て；（２）配列番号１４～１９の全て；（３）配列番号２５～３０の全て；（４）配列番号３６～４１の全て；（５）配列番号４７～５２の全て；（６）配列番号５８～６３の全て；（７）配列番号６９～７４の全て；（８）配列番号８０～８５の全て；又は（９）配列番号１３１～１３６の全てのアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを提供する。

【0006】

本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、ヒトｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}又はヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、ヒトｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}のアミノ酸配列は、配列番号２又は配列番号９６である。

【0007】

本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、ヒトｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}又はヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、ヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}のアミノ酸配列は、配列番号１１３である。

【0008】

本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号９５の野生型ヒトｐ５３のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有さない。

【0009】

本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１１２の野生型ヒトｐ５３のアミノ酸配列に対して抗原特異性を有さない。

【0010】

本発明の更なる実施形態は、関連するポリペプチド及びタンパク質、並びに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、及び本発明のＴＣＲに関連する医薬組成物を提供する。

【0011】

本発明の実施形態は、５’から３’へと、第１の核酸配列及び第２のヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸であって、第１及び第２のヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号９及び１０；１０及び９；２０及び２１；２１及び２０；３１及び３２；３２及び３１；４２及び４３；４３及び４２；５３及び５４；５４及び５３；６４及び６５；６５及び６４；７５及び７６；７６及び７５；８６及び８７；８７及び８６；１３７及び１３８；１３８及び１３７；１４２及び１４３；１４３及び１４２；１４４及び１４５；１４５及び１４４；１４６及び１４７；１４７及び１４６；１４８及び１４９；１４９及び１４８；１５０及び１５１；１５１及び１５０；１５２及び１５３；１５３及び１５２；１５４及び１５５；１５５及び１５４；１５６及び１５７；１５７及び１５６；１５９及び１５８；１５８及び１５９；１７８及び１０；１０及び１７８；１８１及び２１；２１及び１８１；１８４及び３２；３２及び１８４；１８７及び４３；４３及び１８７；１９０及び５４；５４及び１９０；１９３及び６５；６５及び１９３；１９６及び７６；７６及び１９６；１９９及び８７；８７及び１９９；１３７及び２０２；２０２及び１３７；９及び２０５；２０５及び９；２０及び２０７；２０７及び２０；３１及び２０９；２０９及び３１；４２及び２１１；２１１及び４２；５３及び２１３；２１３及び５３；６４及び２１５；２１５及び６４；７５及び２１７；２１７及び７５；８６及び２１９；２１９及び８６；１３７及び２２１；２２１及び１３７；２２３及び２０２；２０２及び２２３；２２３及び２２１；２２１及び２２３；２０及び２２６；２２６及び２０；１８１及び２２６；又は２２６及び１８１のアミノ配列をコードする、核酸を提供する。

【0012】

本発明の実施形態は、５’から３’へと、第１の核酸配列及び第２のヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸であって、第１及び第２のヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号１１及び１２；１２及び１１；２２及び２３；２３及び２２；３３及び３４；３４及び３３；４４及び４５；４５及び４４；５５及び５６；５６及び５５；６６及び６７；６７及び６６；７７及び７８；７８及び７７；８８及び８９；８９及び８８；１３９及び１４０；１４０及び１３９；１６０及び１６１；１６１及び１６０；１６２及び１６３；１６３及び１６２；１６４及び１６５；１６５及び１６４；１６６及び１６７；１６７及び１６６；１６８及び１６９；１６９及び１６８；１７０及び１７１；１７１及び１７０；１７２及び１７３；１７３及び１７２；１７４及び１７５；１７５及び１７４；１７６及び１７７；１７７及び１７６；１７９及び１２；１２及び１７９；１８２及び２３；２３及び１８２；１８５及び３４；３４及び１８５；１８８及び４５；４５及び１８８；１９１及び５６；５６及び１９１；１９４及び６７；６７及び１９４；１９７及び７８；７８及び１９７；２００及び８９；８９及び２００；１３９及び２０３；２０３及び１３９；１１及び２０６；２０６及び１１；２２及び２０８；２０８及び２２；３３及び２１０；２１０及び３３；４４及び２１２；２１２及び４４；５５及び２１４；２１４及び５５；６６及び２１６；２１６及び６６；７７及び２１８；２１８及び７７；８８及び２２０；２２０及び８８；１３９及び２２２；２２２及び１３９；２２４及び２０３；２０３及び２２４；２２４及び２２２；２２２及び２２４；２２及び２２７；２２７及び２２；１８２及び２２７；又は２２７及び１８２のアミノ配列をコードする、核酸を提供する。

【0013】

本発明の一実施形態においては、単離又は精製された核酸は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に挿入された第３のヌクレオチド酸配列を更に含み、前記第３のヌクレオチド配列が切断可能なリンカーペプチドをコードする。

【0014】

本発明の一実施形態においては、切断可能なリンカーペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。

【0015】

本発明の一実施形態においては、単離又は精製された核酸は、配列番号１３、２４、３５、４６、５７、６８、７９、９０、１４１、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２２５、２２８、及び２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。

【0016】

本発明の一実施形態においては、組換え発現ベクターは、トランスポゾンベクター又はレンチウイルスベクターである。

【0017】

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の核酸又はベクターのいずれかによりコードされる、単離又は精製されたＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。

【0018】

本発明の別の実施形態は、細胞における本明細書に記載の核酸又はベクターのいずれかの発現から生じる、単離又は精製されたＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。

【0019】

本発明の別の実施形態は、配列番号２、９６又は１１３のペプチドに対して抗原特異性を有するＴＣＲを発現する宿主細胞を製造する方法であって、細胞を、細胞へのベクターの導入を可能にする条件下で、本明細書に記載のベクターのいずれかと接触させることを含む、方法を提供する。

【0020】

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の核酸又は組換え発現ベクターのいずれかを含む、単離又は精製された宿主細胞を提供する。

【0021】

本発明の一実施形態においては、宿主細胞はヒトリンパ球である。

【0022】

本発明の一実施形態においては、宿主細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、不変ナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。

【0023】

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかを製造する方法であって、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質が製造されるように、本明細書に記載の宿主細胞、又は宿主の細胞集団のいずれかを培養することを含む、方法を提供する。

【0024】

本発明の別の実施形態は、哺乳動物におけるがんに対する免疫応答の誘導における使用のための、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物のいずれかを提供する。一実施形態においては、本発明は、哺乳動物におけるがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法を提供する。

【0025】

本発明のなお更なる実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法を提供する。一実施形態においては、本発明は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物のいずれかを投与することを含む、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法を提供する。一実施形態においては、がんは、胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんである。

【0026】

本発明の一実施形態においては、がんは、ヒトｐ５３におけるＲ１７５Ｈ変異又はＹ２２０Ｃ変異を含むことが知られている。

【図面の簡単な説明】

【0027】

図面のいくつかの観点の簡単な説明

【図1-1】図１Ａは、実験計画を示す模式図（親ゲートはリンパ球→単一細胞→生（ＰＩ陰性）→ＣＤ３^＋（Ｔ細胞）である）である。

【図1-2】図１Ｂ～１Ｃは、ＩＶＳ（ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ（Ｂ）又はｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ（Ｃ））及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮後に検出された４－１ＢＢ陽性細胞のパーセンテージを示すグラフである。陽性と見なされる培養物を太字で示す。変異ＴＰ５３（ＴＭＧ（黒色丸）；ＬＰ（黒色四角））及び野生型（ＷＴ）対応物（ＴＭＧ（白色丸）；ＬＰ（白色四角））に対する応答を示す。

【図1-3】図１Ｄは、ＷＴ又は変異（ＭＵＴ）ＴＰ５３タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）とエレクトロポレーションした自己抗原提示細胞との共培養後の４１４１－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物からの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

【図1-4】図１Ｅは、抗原を経験したＣＤ４ Ｔ細胞を選別し、変異ＴＰ５３－ＴＭＧとエレクトロポレーションした未成熟樹状細胞でインビトロ刺激した後に測定したインターフェロンガンマ分泌（左軸）又は４－１ＢＢの上方制御（右軸）を示す。次いで、培養物を、変異ＴＰ５３－ＴＭＧとエレクトロポレーションした未成熟樹状細胞と共培養し、翌日、４－１ＢＢ^＋及び／又はＯＸ４０^＋細胞を選別し、急速増幅プロトコルによって増幅させた。増幅の１２～１４日後、培養物（４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ）を、インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴ（左軸）によってｐ５３－Ｒ１７５Ｈ新抗原に対する特異性について、又はフローサイトメトリー（右軸）によって４－１ＢＢの上方制御について試験した。

【図1-5】図１Ｆは、４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳとペプチドをパルスした自己抗原提示細胞との共培養の上清に対するＥＬＩＳＡによって測定したインターフェロン－γ分泌を示すグラフである。４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３テクニカルレプリケート）である。

【図2-1】図２Ａは、全集団のクローン性を示すグラフであり、これは、試料多様性の正規化された推定値である（１に近い数ほどより多様性が低い）。ＴＣＲＢシークエンシングを、ＩＶＳによる増幅及びＬＰ又はＴＭＧのいずれかによる４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮の前後にＰＢＬに対して行った。確認したｐ５３新抗原応答を伴う培養物をアスタリスクで強調表示する。図２Ｂは、各集団からの生産的で特有のＣＤＲ３Ｂの最大頻度を示すグラフである。ＴＣＲＢシークエンシングを、ＩＶＳによる増幅及びＬＰ又はＴＭＧのいずれかによる４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮の前後にＰＢＬに対して行った。確認したｐ５３新抗原応答を伴う培養物をアスタリスクで強調表示する。

【図2-2】図２Ｃは、非形質導入Ｔ細胞（ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞に対するネガティブコントロール）を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。図２Ｄは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ１で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図2-3】図２Ｅは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ２で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。図２Ｆは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ３で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図2-4】図２Ｇは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ５で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。図２Ｈは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ６で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図2-5】図２Ｉは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ７で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。図２Ｊは、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ９で形質導入したＴ細胞を、漸減濃度の、２５アミノ酸長のＷＴ（白色丸）又は変異（黒色四角）ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドのいずれかでパルスした未成熟樹状細胞と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図2-6】図２Ｋ～２Ｌは、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ濃縮プロトコルの前（ＰＢＬ）及び後（ＩＶＳ／濃縮）の変異ＴＰ５３に対する既知の特異性を有するＣＤＲ３Ｂを追跡した後に測定したＴＣＲＢクロノタイプのパーセンテージを示すグラフである。Ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}特異的クロノタイプをＫに示す。Ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}特異的クロノタイプをＬに示す。

【図3-1】図３Ａは、ＣＯＳ７サル細胞株の、表示したＨＬＡでのトランスフェクション及び表示した最短ｐ５３ペプチド（ＷＴ（白色棒）；変異（黒色棒））のパルス後に測定した、４－１ＢＢ陽性細胞のパーセンテージを示すグラフである。４１４１－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物からの結果を示す。ＴＭＧ－ｗｔＲ１７５は、Ｒ１７５Ｈを除く全ての位置で変異ＴＰ５３を有した。配列ＨＭＴＥＶＶＲＲＣは配列番号９５である。配列ＨＭＴＥＶＶＲＨＣは配列番号９６である。図３Ｂは、ＣＯＳ７サル細胞株の、表示したＨＬＡでのトランスフェクション及び表示した最短ｐ５３ペプチド（ＷＴ（白色棒）；変異（黒色棒））のパルス後に測定した、ＩＦＮ－γ量を示すグラフである。４２６６－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物からの結果を示す。配列ＳＳＣＭＧＧＭＮＲＲは配列番号９７である。配列ＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲは配列番号９８である。

【図3-2】図３Ｃは、ＣＯＳ７サル腫瘍細胞株を、患者４２８５のハプロタイプに対応するＨＬＡプラスミドＤＮＡ及び、ＷＴ ＴＰ５３ ＴＭＧ（Ｒ１７５Ｈ位のみ）（ＷＴ－Ｒ１７５－ＴＭＧ；白色棒）又はｐ５３－Ｒ１７５Ｈ新抗原を含有する変異ＴＰ５３－ＴＭＧ（黒色棒）のいずれかでトランスフェクションした実験の結果を示すグラフである。翌日、４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物を加え、共培養した。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図3-3】図３Ｄは、ＴＣ＃４２６６（患者４２６６からの自己異種移植片；Ａ^＊６８：０１；ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}）と全長ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}遺伝子を過剰発現するＳａｏｓ２細胞（Ａ^＊０２：０１）との共培養後のＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物からのＣＤ８^＋Ｔ細胞における４－１ＢＢの上方制御を示すフローサイトメトリープロット（左が４２６６－ＣＤ８、右が４１４１－ＣＤ８）を示す。

【図4】図４は、ＣＯＳ７サル腫瘍細胞株を、ＤＲＡ１^＊０１：０１：０１及びＤＲＢ１^＊１３：０１：０１、並びに関係性無し（白色棒）、ＷＴ ＴＰ５３ ＴＭＧ（Ｒ１７５Ｈ位のみ）（ＷＴ－Ｒ１７５－ＴＭＧ；灰色棒）又はｐ５３－Ｒ１７５Ｈ新抗原を含有する変異ＴＰ５３－ＴＭＧ（黒色棒）のいずれかでトランスフェクションした実験の結果を示すグラフである。翌日、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲで形質導入したか、又は非形質導入のＴ細胞を加え、共培養した。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図5】図５は、４２５９－Ｆ１腫瘍断片培養物からＣＤ８^＋Ｔ細胞を選別した後、限界希釈によりＴ細胞クローンを調製した実験の結果を示すグラフである。２４の培養物を、ＤＭＳＯ（ペプチドビヒクル）、ＷＴ ｐ５３－Ｙ２２０ペプチド、又はＭＵＴ ｐ５３－Ｙ２２０ＣペプチドでパルスしたＴ２腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）と共培養した。一晩のインキュベーション後、細胞をＣＤ３、ＣＤ８、及び４－１ＢＢについて染色し、次いで、フローサイトメトリーにより分析した。培養物からのＣＤ８^＋４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の頻度を表示する。

【図6】図６は、４２５９－Ｆ１－ＴＣＲをドナー末梢血Ｔ細胞に形質導入し、次いで、漸減濃度のＷＴ ｐ５３－Ｙ２２０ペプチド

【0028】

【化1】

【0029】

又はＭＵＴ ｐ５３－Ｙ２２０Ｃペプチド

【0030】

【化2】

【0031】

のいずれかでパルスしたＴ２腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、共培養上清を、インターフェロンガンマ分泌について、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図7】図７は、ＴＣＲ非発現（非形質導入）か、ｐ５３－Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲを発現するか、又は４２５９－Ｆ１－ＴＣＲを発現するかのいずれかのＴ細胞を、腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ｐ５３－Ｒ１７５Ｈ又はｐ５３－Ｙ２２０Ｃの発現有り若しくは無しのいずれか）と共培養した実験の結果を示すグラフである。一晩のインキュベーション後、細胞をＣＤ３、ＣＤ８、及び４－１ＢＢについて染色し、次いで、フローサイトメトリーにより分析した。培養物からのＣＤ８^＋４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の頻度を表示する。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図8】図８は、９のｐ５３スプライスバリアントのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＳＰ｜Ｐ０４６３７｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－２｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１１４）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－３｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１１５）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－４｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１１６）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－５｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１１７）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－６｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１１８）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－７｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１１９）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７－８｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１２０）；及びＳＰ｜Ｐ０４６３７－９｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１２１）。

【図9】図９は、ＴＲＢＶ７－９^＊０３の配列の一部分のアミノ酸配列とＴＲＢＶ７－９^＊０１のそれとのアラインメントを示す。「Ｌ３６０９２｜ＴＲＢＶ７－９^＊０１｜Ｈｏｍｏ」は配列番号１２９である。「ＡＦ００９６６３｜ＴＲＢＶ７－９^＊０３｜Ｈｏｍｏ」は配列番号１３０である。

【図10】図１０は、患者４１４１からのＴＩＬ（断片培養物１２）と、関係性のない変異（ＴＭＧ－ＩＲＲ）、ＷＴ ｐ５３配列（ＴＰ５３－ｗｔ－ＴＭＧ）、又はＲ１７５Ｈを含む変異ｐ５３配列（ＴＰ５３－ｍｕｔ－ＴＭＧ）をコードするＴＭＧでトランスフェクションした自己ＡＰＣとの共培養後に測定した、４－１ＢＢ陽性細胞（ＣＤ８^＋の％）（右のｙ軸；黒色棒）及びＩＦＮ－γ（２ｘ１０４細胞あたりのスポット）（左のｙ軸；斜線模様棒）のパーセンテージを示すグラフである。培地のみ、並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれネガティブ及びポジティブコントロールであった。

【図11】図１１は、患者４１４１からのＴＩＬ（断片培養物１２）と、表示したＨＬＡ対立遺伝子及び追加遺伝子無し（ＨＬＡのみ、白色棒）、ＷＴ ＴＰ５３ ＴＭＧ（灰色斜線模様棒）、又はｐ５３－Ｒ１７５Ｈ配列を含有する変異ＴＰ５３ＴＭＧ（黒色棒）のいずれかと共トランスフェクションしたＣｏｓ７細胞との共培養後に測定した２ｘ１０４エフェクター細胞あたりのＩＦＮ－γ陽性スポットの数を示すグラフである。

【図12】図１２は、モック（ＴＣＲ無し）又は４１４１－ＴＣＲ１ａ２を発現するＴ細胞と、Ｔ２腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２を発現する）との共培養後に測定したＩＦＮ－γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。Ｔ２細胞を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；灰色棒）又はＷＴ ｐ５３－Ｒ１７５ペプチド（斜線灰色模様棒）若しくは変異ｐ５３－Ｒ１７５Ｈペプチド（黒色棒）で構成される精製（ＨＰＬＣにより＞９５％）ペプチドでパルスした。培地のみ（白色棒）、並びにＰＭＡ及びイオノマイシン（格子模様棒）が、それぞれネガティブ及びポジティブコントロールであった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

【図13】図１３は、４１４１－ＴＣＲ１ａ２を発現するＴ細胞と、未操作（陰影無しの棒）か、又は全長ｐ５３－Ｒ１７５Ｈタンパク質を過剰発現するように作製した（陰影有りの棒）かの、いずれかのＳａｏｓ２細胞（ｐ５３－ＮＵＬＬ及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１＋）との共培養後に、表示したマーカーのうちの１の発現について陽性の細胞のパーセンテージを示すグラフである。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。統計分析のために、２の細胞株間の各サイトカインに対してスチューデントの両側ｔ検定を行った（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【発明を実施するための形態】

【0032】

腫瘍タンパク質Ｐ５３（「ＴＰ５３」又は「ｐ５３」とも称される）は、例えば、細胞分裂を制御することによって腫瘍抑制因子として作用する。ｐ５３タンパク質は、細胞の核内に位置し、そこでＤＮＡに直接結合する。ＤＮＡが損傷を受けると、ｐ５３タンパク質は、ＤＮＡを修復するか又は損傷を受けた細胞をアポトーシスさせるかの決定に関与する。ＤＮＡを修復することができる場合、ｐ５３は他の遺伝子を活性化させて損傷を修復する。ＤＮＡを修復することができない場合、ｐ５３タンパク質は、細胞が分裂するのを阻止し、該細胞にシグナルを伝達してアポトーシスさせる。変異したか又は損傷を受けたＤＮＡを有する細胞の分裂を停止させることによって、ｐ５３は腫瘍の発達を阻止するのに役立つ。ＷＴ（正常）全長ｐ５３は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0033】

ｐ５３タンパク質における変異によって、ｐ５３タンパク質の腫瘍抑制因子機能が低下するか又は失われることがある。或いは又は更に、ｐ５３変異は、ドミナントネガティブ方式でＷＴｐ５３に干渉することによる機能獲得型変異であり得る。変異ｐ５３タンパク質は、様々なヒトがん、例えば、胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんのいずれかで発現し得る。

【0034】

本発明の実施形態は、変異ヒトｐ５３（以後、「変異ｐ５３」）に対して抗原特異性を有する単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。以後、「ＴＣＲ」に対する言及は、特に規定のない限り、ＴＣＲの機能的部分及び機能的バリアントも指す。ｐ５３の変異は、本明細書では、全長ＷＴｐ５３（配列番号１）のアミノ酸配列を参照することによって定義される。ｐ５３の変異は、本明細書では、特定の位置に存在するアミノ酸残基、続いて、位置番号、続いて、検討中の特定の変異において該残基に置き換わったアミノ酸を参照することによって記載される。ｐ５３のアミノ酸配列（例、ｐ５３ペプチド）は、全長のＷＴ ｐ５３タンパク質のすべてのアミノ酸残基よりも少ない場合がある。従って、位置番号は、本明細書においては、ｐ５３アミノ酸配列の特定の例における対応する残基の実際の位置は異なる場合があることを理解した上で、ＷＴ全長ｐ５３タンパク質（即ち、配列番号１）を参照することにより定義される。位置が配列番号１によって定義されるので、用語「Ｒ１７５」とは、配列番号１の１７５位に存在するアルギニンを指し、「Ｒ１７５Ｈ」は、配列番号１の１７５位に存在するアルギニンがヒスチジンに置き換わっていることを示し、一方、「Ｙ２２０Ｃ」は、配列番号１の２２０位に存在するチロシンがシステインに置き換わっていることを示す。例えば、ｐ５３のアミノ酸配列の特定の例が、例、ＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＲＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧ（配列番号１１０）（配列番号１の連続するアミノ酸残基１６３～１８７に対応する例示的なＷＴ ｐ５３ペプチド）である場合、配列番号１１０中に下線で示すアルギニンの実際の位置が１３であっても、「Ｒ１７５Ｈ」が、配列番号１１０中に下線で示すアルギニンの、ヒスチジンとの置換を指す。以下、Ｒ１７５Ｈ変異を有するヒトｐ５３アミノ酸配列は「Ｒ１７５Ｈ」又は「ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}」と称される。以下、Ｙ２２０Ｃ変異を有するヒトｐ５３アミノ酸配列は「Ｙ２２０Ｃ」又は「ｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}」と称される。本明細書で用いられる場合、「変異ｐ５３」は、ヒトｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}又はヒトｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}を指す。

【0035】

Ｐ５３には、９の既知のスプライスバリアントがある。本明細書に記載のｐ５３変異は、９のｐ５３スプライスバリアント全てに亘って保存されている。９のｐ５３スプライスバリアントのアラインメントを図８に示す。従って、本発明のＴＣＲは、９のｐ５３スプライスバリアントのいずれかによってコードされる、本明細書に記載の任意の変異ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有し得る。位置は配列番号１によって定義される通りであるため、ｐ５３の特定のスプライスバリアントのアミノ酸配列の実際の位置は、配列番号１の対応する位置に相対的に定義され、及び配列番号１によって定義される位置は、特定のスプライスバリアント中における実際の位置とは異なり得る。従って、例えば、変異は、配列番号１の、３９３アミノ酸の配列の表示された位置に対応する、ｐ５３の特定のスプライスバリアントのアミノ酸配列中におけるアミノ酸残基の置換を指し、スプライスバリアント中における実際の位置は異なり得るとの理解である。

【0036】

本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１によって定義される通り、１７５位に変異を有するヒトｐ５３に対して抗原特異性を有する。１７５位でのｐ５３変異は、任意のミスセンス変異であり得る。従って、１７５位での変異は、１７５位に存在する天然（ＷＴ）アルギニン残基の、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基との置換であり得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、Ｒ１７５Ｈ変異を有するヒトｐ５３に対して抗原特異性を有する。例えば、本発明のＴＣＲは、ＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ（配列番号２）、ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号９６）、ＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨ（配列番号１００）、ＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨ（配列番号１０１）、ＳＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥ（配列番号１０２）、ＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ（配列番号１０３）、ＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣ（配列番号１０４）、ＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳ（配列番号１０５）、ＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤ（配列番号１０６）、ＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳ（配列番号１０７）、ＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤ（配列番号１０８）、ＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧ（配列番号１０９）、ＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧ（配列番号１１１）から成る群から選択される１以上の変異ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有し得る。

【0037】

本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１によって定義される通り、２２０位に変異を有するヒトｐ５３に対する抗原特異性を有する。２２０位におけるｐ５３変異は、任意のミスセンス変異であり得る。従って、２２０位における変異は、２２０位に存在する天然（ＷＴ）チロシン残基の、チロシン以外の任意のアミノ酸残基との置換であり得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、Ｙ２２０Ｃ変異を有するヒトｐ５３に対して抗原特異性を有する。例えば、本発明のＴＣＲは、

【0038】

【化3】

【0039】

の変異ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有し得る。

【0040】

本発明の実施形態においては、本発明のＴＣＲは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子依存的に変異ｐ５３を認識することができ得る。「ＨＬＡ分子依存的に」とは、本明細書で用いるとき、ＴＣＲが、該ＴＣＲを単離した患者で発現するＨＬＡ分子の枠の中で、変異ｐ５３に結合したときに免疫応答を惹起することを意味する。本発明のＴＣＲは、適用可能なＨＬＡ分子によって提示された変異ｐ５３を認識することができ得、変異ｐ５３に加えてＨＬＡ分子にも結合し得る。

【0041】

本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるＲ１７５Ｈを認識することができる。これに関して、ＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の関係でのＲ１７５Ｈへの結合に際して、免疫応答を誘発し得る。本発明のＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩＩ分子により提示されるＲ１７５Ｈを認識することができ、Ｒ１７５Ｈに加えてＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し得る。

【0042】

本発明の一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲヘテロ二量体である。ＨＬＡ－ＤＲヘテロ二量体は、α鎖及びβ鎖を含む細胞表面受容体である。ＨＬＡ－ＤＲα鎖はＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子によりコードされる。一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩＩ分子のアルファ鎖は、ＨＬＡ－ＤＲＡ１^＊０１：０１：０１対立遺伝子により発現する。ＨＬＡ－ＤＲβ鎖は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子、又はＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子によってコードされる。ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子によってコードされる分子の例としては、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ５、ＨＬＡ－ＤＲ６、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、ＨＬＡ－ＤＲ１６、及びＨＬＡ－ＤＲ１７が挙げられ得るが、これらに限定されない。ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子はＨＬＡ－ＤＲ５２をコードする。ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子はＨＬＡ－ＤＲ５３をコードする。ＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子はＨＬＡ－ＤＲ５１をコードする。本発明の一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１：ＨＬＡ－ＤＲＡヘテロ二量体である。ＨＬＡクラスＩＩ分子のベータ鎖は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０７、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０８、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０９、又はＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：１０対立遺伝子によって発現し得る。特に好ましい実施形態においては、ＨＬＡクラスＩＩ分子のベータ鎖は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０１対立遺伝子によって発現する。

【0043】

本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲのうちの１は、ＨＬＡクラスＩ分子によって提示されるＹ２２０Ｃを認識することができる。これに関して、ＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩ分子の関係でのＹ２２０Ｃへの結合に際して、免疫応答を誘発し得る。本発明のＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩ分子により提示されるＹ２２０Ｃを認識することができ、Ｙ２２０Ｃに加えてＨＬＡクラスＩ分子に結合し得る。

【0044】

本発明の一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩ分子はＨＬＡ－Ａ分子である。ＨＬＡ－Ａ分子は、α鎖及びβ２ミクログロブリンのヘテロ二量体である。ＨＬＡ－Ａα鎖はＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされ得る。β２ミクログロブリンは、アルファ鎖のアルファ１、アルファ２及びアルファ３ドメインに非共有結合して、ＨＬＡ－Ａ複合体を構築する。ＨＬＡ－Ａ分子は任意のＨＬＡ－Ａ分子であり得る。本発明の一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩ分子はＨＬＡ－Ａ２分子である。ＨＬＡ－Ａ２分子は、任意のＨＬＡ－Ａ２分子であり得る。ＨＬＡ－Ａ２分子の例としては、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７、又はＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１分子である。

【0045】

養子細胞移入に使用される細胞で発現した場合を含む、本発明のＴＣＲは、多くの利点のいずれか１以上を提供し得る。変異ｐ５３は、がん細胞で発現し、正常非がん細胞では発現しない。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明のＴＣＲは、有利には、例えば毒性を最小化又は排除することによって、正常非がん細胞の破壊を最小化又は排除すると同時に、がん細胞の破壊を目的とし、それによって、低減すると考えられる。更に、本発明のＴＣＲは、有利には、例えば化学療法、外科手術、又は放射線照射等の他の種類の治療には応答しない変異ｐ５３陽性がんを成功裏に治療又は予防することができる。更に、本発明のＴＣＲは、変異ｐ５３を高い結合活性で（ｈｉｇｈｌｙ ａｖｉｄ）認識することができ、これによって、操作されていない腫瘍細胞（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）－γで処理されていない、変異ｐ５３及び適用可能なＨＬＡ分子の一方又は両方をコードしているベクターをトランスフェクションしていない、ｐ５３変異を有するｐ５３ペプチドをパルスしていない、又はこれらの組み合わせの腫瘍細胞）を認識する能力が付与され得る。全ての腫瘍のおよそ半分はｐ５３に変異を有し、そのうちの約半分はミスセンス変異である。Ｒ１７５Ｈ変異は、すべてのがんの約４．５％で発現しており、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０１対立遺伝子は米国人の集団の約１５％で発現している。Ｙ２２０Ｃ変異は、すべてのがんの約１．５％で発生し、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１対立遺伝子は、米国人の集団の約４０％～約５０％で発現している。Ｒ１７５Ｈ及びＹ２２０Ｃ変異は多くのがん組織学において生じており、このことは、多様な群の患者が本発明のＴＣＲから利益を得る可能性があることを示唆している。従って、本発明のＴＣＲは、免疫療法による治療の適格性を有する可能性のある患者の数を増加させることができる。

【0046】

語句「抗原特異性」とは、本明細書で用いるとき、ＴＣＲが、高い結合活性で変異ｐ５３に特異的に結合し、免疫学的に認識できることを意味する。例えば、（ａ）低濃度の変異ｐ５３ペプチド（例えば、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）をパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異ｐ５３を発現するように変異ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、ＴＣＲを発現している約１×１０^４～約１×１０^５個のＴ細胞が少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）のＩＦＮ－γを分泌した場合、該ＴＣＲが変異ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。本発明のＴＣＲを発現している細胞は、より高濃度の変異ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際にもＩＦＮ－γを分泌することができる。

【0047】

或いは又は更に、ネガティブコントロールで発現するＩＦＮ－γの量と比較して、（ａ）低濃度の変異ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異ｐ５３を発現するように変異ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、ＴＣＲを発現しているＴ細胞が少なくとも２倍のＩＦＮ－γを分泌した場合、該ＴＣＲが変異ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ネガティブコントロールは、例えば、（ｉ）（ａ）同濃度の関係性の無いペプチド（例えば、変異ｐ５３ペプチドとは異なる配列を有する幾つかの他のペプチド）をパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞若しくは（ｂ）標的細胞が関係性の無いペプチドを発現するように該関係性の無いペプチドをコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した、該ＴＣＲを発現しているＴ細胞、又は（ｉｉ）（ａ）同濃度の変異ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞若しくは（ｂ）標的細胞が変異ｐ５３を発現するように変異ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した、形質導入されていないＴ細胞（例えば、該ＴＣＲを発現しないＰＢＭＣ由来）であってよい。ＩＦＮ－γ分泌は、当技術分野において公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。

【0048】

或いは又は更に、ＩＦＮ－γを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、（ａ）低濃度の変異ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異ｐ５３を発現するように変異ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、ＩＦＮ－γを分泌するＴＣＲを発現しているＴ細胞の数が少なくとも２倍であった場合、該ＴＣＲが変異ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ペプチドの濃度及びネガティブコントロールは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。ＩＦＮ－γを分泌する細胞の数は、当技術分野において公知の方法、例えば、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって測定することができる。

【0049】

或いは又は更に、同じ標的細胞と共培養したネガティブコントロールＴ細胞についてＥＬＩＳＰＯＴによって検出されたスポット数と比較して、（ａ）低濃度の変異ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異ｐ５３を発現するように変異ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、ＴＣＲを発現しているＴ細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴによって少なくとも２倍のスポットが検出された場合、該ＴＣＲが変異ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ペプチドの濃度及びネガティブコントロールは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。

【0050】

或いは又は更に、（ａ）低濃度の変異ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異ｐ５３を発現するように変異ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、ＴＣＲを発現しているＴ細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴによって約５０個を超えるスポットが検出された場合、該ＴＣＲが変異ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ペプチドの濃度は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。

【0051】

或いは又は更に、変異ｐ５３を発現している標的細胞で刺激した後に例えばフローサイトメトリーによって測定したとき、ＴＣＲを発現しているＴ細胞が４－１ＢＢ及びＯＸ４０の一方又は両方の発現を上方制御した場合、該ＴＣＲが変異ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。

【0052】

本発明の一実施形態は、例えば、ＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖、又はこれらの組み合わせ等の２本のポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含むＴＣＲを提供する。本発明のＴＣＲのポリペプチドは、ＴＣＲが変異ｐ５３に対して抗原特異性を有する限り、任意のアミノ酸配列を含んでいてよい。

【0053】

本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域をそれぞれ含む、２本のポリペプチド鎖を含む。本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、α鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１α）、α鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２α）、及びα鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）を含む第１のポリペプチド鎖と、β鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１β）、β鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２β）、及びβ鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、（１）配列番号３～８の全て；（２）配列番号１４～１９の全て；（３）配列番号２５～３０の全て；（４）配列番号３６～４１の全て；（５）配列番号４７～５２の全て；（６）配列番号５８～６３の全て；（７）配列番号６９～７４の全て；（８）配列番号８０～８５の全て；又は（９）配列番号１３１～１３６の全てのアミノ酸配列を含む。この段落における上述の９のアミノ酸配列のコレクションのそれぞれ１つは、変異ヒトｐ５３に対して抗原特異性を有する９の異なるＴＣＲのそれぞれの６のＣＤＲ領域を示す。各コレクションにおける６のアミノ酸配列は、それぞれ、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βに対応する。

【0054】

本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、合わせて上記ＣＤＲのコレクションのうちの１つを含む、α鎖可変領域のアミノ酸配列及びβ鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。これに関して、該ＴＣＲは、例えば、配列番号９、１０、２０、２１、３１、３２、４２、４３、５３、５４、６４、６５、７５、７６、８６、８７、１３７、１３８、１４２－１５９、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、及び２２６のいずれか１のアミノ酸配列を含む。例えば、該ＴＣＲは、（１）配列番号９及び１０の両方；（２）配列番号２０及び２１の両方；（３）配列番号３１及び３２の両方；（４）配列番号４２及び４３の両方；（５）配列番号５３及び５４の両方；（６）配列番号６４及び６５の両方；（７）配列番号７５及び７６の両方；（８）配列番号８６及び８７の両方；（９）配列番号１３７及び１３８の両方；（１０）配列番号１４２及び１４３の両方；（１１）配列番号１４４及び１４５の両方；（１２）配列番号１４６及び１４７の両方；（１３）配列番号１４８及び１４９の両方；（１４）配列番号１５０及び１５１の両方；（１５）配列番号１５２及び１５３の両方；（１６）配列番号１５４及び１５５の両方；（１７）配列番号１５６及び１５７の両方；（１８）配列番号１５９及び１５８の両方；（１９）配列番号１７８及び１０の両方；（２０）配列番号１８１及び２１の両方；（２１）配列番号１８４及び３２の両方；（２２）配列番号１８７及び４３の両方；（２３）配列番号１９０及び５４の両方；（２４）配列番号１９３及び６５の両方；（２５）配列番号１９６及び７６の両方；（２６）配列番号１９９及び８７の両方；（２７）配列番号１３７及び２０２の両方；（２８）配列番号９及び２０５の両方；（２９）配列番号２０及び２０７の両方；（３０）配列番号３１及び２０９の両方；（３１）配列番号４２及び２１１の両方；（３２）配列番号５３及び２１３の両方；（３３）配列番号６４及び２１５の両方；（３４）配列番号７５及び２１７の両方；（３５）配列番号８６及び２１９の両方；（３６）配列番号１３７及び２２１の両方；（３７）配列番号２２３及び２０２の両方；（３８）配列番号２２３及び２２１の両方；（３９）配列番号２０及び２２６の両方；又は（４０）配列番号１８１及び２２６の両方のアミノ酸配列を含み得る。この段落における上述の４７のアミノ酸配列のコレクションのそれぞれ１つは、変異ヒトｐ５３に対して抗原特異性を有する４７の異なるＴＣＲのそれぞれの２の可変領域を示す。各コレクションにおける２のアミノ酸配列は、それぞれ、ＴＣＲのα鎖の可変領域及びβ鎖の可変領域に対応する。

【0055】

本発明のＴＣＲは、定常領域を更に含み得る。定常領域は、例えばヒト又はマウス等の任意の好適な種に由来していてよい。本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、マウスの定常領域を更に含む。本明細書で用いるとき、用語「マウス」又は「ヒト」は、本明細書に記載のＴＣＲ又はＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、アルファ鎖、及び／又はベータ鎖）に言及するとき、それぞれマウス又はヒト由来のＴＣＲ（又はその構成要素）、即ち、それぞれマウスＴ細胞又はヒトＴ細胞を起源とするか又は該細胞によってかつて発現されたＴＣＲ（又はその構成要素）を意味する。本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、マウスα鎖定常領域及びマウスβ鎖定常領域を含み得る。マウスα鎖定常領域は、改変されていてもよく、改変されていなくてもよい。改変マウスα鎖定常領域は、例えば米国特許第１０，１７４，０９８号に記載の通り、例えば、システイン置換されていてもよく、ＬＶＬ改変されていてもよく、又はシステイン置換及びＬＶＬ改変の両方が行われていてもよい。マウスβ鎖定常領域は、改変されていてもよく、改変されていなくてもよい。改変マウスβ鎖定常領域は、例えば米国特許第１０，１７４，０９８号に記載の通り、例えば、システイン置換されていてよい。本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号９１又は９２のアミノ酸配列を含むシステイン置換ＬＶＬ改変マウスα鎖定常領域を含む。本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号９３のアミノ酸配列を含むシステイン置換マウスβ鎖定常領域を含む。

【0056】

本発明の実施形態においては、本発明のＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖及びＴＣＲのβ鎖を含み得る。ＴＣＲのα鎖は、α鎖の可変領域及びα鎖の定常領域を含み得る。この種のα鎖は、ＴＣＲの任意のβ鎖と対合し得る。β鎖は、β鎖の可変領域及びβ鎖の定常領域を含み得る。

【0057】

いくつかの実施形態においては、本明細書に開示されるα鎖及び／又はβ鎖のいずれかのアミノ酸配列は、Ｃ末端にアミノ酸配列ＲＡＫＲ（配列番号２３０）を更に含む。

【0058】

本発明の実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１１、１２、２２、２３、３３、３４、４４、４５、５５、５６、６６、６７、７７、７８、８８、８９、１３９、１４０、１６０－１７７、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、及び２２７のいずれか１のアミノ酸配列を含む。例えば、ＴＣＲは、（１）配列番号１１及び１２の両方；（２）配列番号２２及び２３の両方；（３）配列番号３３及び３４の両方；（４）配列番号４４及び４５の両方；（５）配列番号５５及び５６の両方；（６）配列番号６６及び６７の両方；（７）配列番号７７及び７８の両方；（８）配列番号８８及び８９の両方；（９）配列番号１３９及び１４０の両方；（１０）配列番号１６０及び１６１の両方；（１１）配列番号１６２及び１６３の両方；（１２）配列番号１６４及び１６５の両方；（１３）配列番号１６６及び１６７の両方；（１４）配列番号１６８及び１６９の両方；（１５）配列番号１７０及び１７１の両方；（１６）配列番号１７２及び１７３の両方；（１７）配列番号１７４及び１７５の両方；（１８）配列番号１７６及び１７７の両方；（１９）配列番号１７９及び１２の両方；（２０）配列番号１８２及び２３の両方；（２１）配列番号１８５及び３４の両方；（２２）配列番号１８８及び４５の両方；（２３）配列番号１９１及び５６の両方；（２４）配列番号１９４及び６７の両方；（２５）配列番号１９７及び７８の両方；（２６）配列番号２００及び８９の両方；（２７）配列番号１３９及び２０３の両方；（２８）配列番号１１及び２０６の両方；（２９）配列番号２２及び２０８の両方；（３０）配列番号３３及び２１０の両方；（３１）配列番号４４及び２１２の両方；（３２）配列番号５５及び２１４の両方；（３３）配列番号６６及び２１６の両方；（３４）配列番号７７及び２１８の両方；（３５）配列番号８８及び２２０の両方；（３６）配列番号１３９及び２２２の両方；（３７）配列番号２２４及び２０３の両方；（３８）配列番号２２４及び２２２の両方；（３９）配列番号２２及び２２７の両方；又は（４０）配列番号１８２及び２２７の両方のアミノ酸配列を含み得る。この段落における上述のアミノ酸配列のコレクションのそれぞれ１つは、変異ヒトｐ５３に対して抗原特異性を有する、異なるＴＣＲのそれぞれのα鎖及びβ鎖を示す。各コレクションにおける２のアミノ酸配列は、それぞれ、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖に対応する。

【0059】

本明細書に記載の本発明のＴＣＲの機能的バリアントは、本発明の範囲に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で用いるとき、親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対して実質的な又は著しい配列の同一性又は類似性を有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、該機能的バリアントは、該バリアントがそのバリアントであるＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を保持している。機能的バリアントは、例えば、親のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質と同様の程度、同一程度、又はより高程度、親ＴＣＲが抗原特異性を有するか又は親のポリペプチド若しくはタンパク質が特異的に結合する変異ｐ５３に特異的に結合する能力を保持している、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質）のバリアントを包含する。親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に関連して、機能的バリアントは、例えば、それぞれ親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対してアミノ酸配列が少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上同一であってよい。

【0060】

機能的バリアントは、例えば、少なくとも１の保存的アミノ酸置換を有する親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は、当技術分野において公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有するあるアミノ酸が、同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）による置換、非極性側鎖を有するアミノ酸の、別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ等）による置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ等）による置換、極性側鎖を有するアミノ酸の、別の極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）による置換等であってよい。

【0061】

或いは又は更に、機能的バリアントは、少なくとも１の非保存的アミノ酸置換を有する親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が、機能的バリアントの生物活性に干渉もせず、阻害もしないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は機能的バリアントの生物活性を増強し、その結果、機能的バリアントの生物活性が、親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と比べて増大する。

【0062】

ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、本明細書に記載の指定のアミノ酸配列（複数可）から本質的になっていてよく、その結果、該ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の他の構成要素、例えば、他のアミノ酸が、該ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を実質的に変化させることはない。

【0063】

また、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかの機能的部分を含むポリペプチドが本発明によって提供される。用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いるとき、オリゴペプチドを含み、そして、１以上のペプチド結合によって連結された一本鎖のアミノ酸を指す。

【0064】

本発明のポリペプチドに関して、機能的部分は、変異ｐ５３に特異的に結合する限り、該機能的部分がその一部であるＴＣＲの連続アミノ酸を含む任意の部分であってよい。用語「機能的部分」は、ＴＣＲに関連して使用されるとき、本発明のＴＣＲの任意の部分又は断片であって、該部分又は断片がその一部であるＴＣＲ（親ＴＣＲ）の生物活性を保持している部分又は断片を指す。機能的部分は、例えば、親ＴＣＲと同様の程度、同一程度、又はより高程度、（例えば、適用可能なＨＬＡ分子依存的に）変異ｐ５３に特異的に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防する能力を保持しているＴＣＲの部分を包含する。親ＴＣＲに関連して、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％、又はそれ以上を構成し得る。

【0065】

機能的部分は、該部分のアミノ若しくはカルボキシ末端又は両末端に、親ＴＣＲのアミノ酸配列にはみられない追加のアミノ酸を含んでいてもよい。望ましくは、追加のアミノ酸は、例えば、変異ｐ５３に特異的に結合する、及び／又はがんを検出する、がんを治療若しくは予防する能力を有する等の機能的部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＴＣＲの生物活性と比較して生物活性を増強する。

【0066】

ポリペプチドは、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の機能的部分、例えば、本発明のＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のうちの１以上を含む機能的部分を含み得る。本発明の実施形態においては、該ポリペプチドは：（１）配列番号３～８の全て；（２）配列番号１４～１９の全て；（３）配列番号２５～３０の全て；（４）配列番号３６～４１の全て；（５）配列番号４７～５２の全て；（６）配列番号５８～６３の全て；（７）配列番号６９～７４の全て；（８）配列番号８０～８５の全て；又は（９）配列番号１３１～１３６の全てのアミノ酸配列を含む機能的部分を含み得る。

【0067】

本発明の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、例えば、上記ＣＤＲ領域の組み合わせを含む本発明のＴＣＲの可変領域を含み得る。これに関して、該ポリペプチドは、例えば：（１）配列番号９及び１０の両方；（２）配列番号２０及び２１の両方；（３）配列番号３１及び３２の両方；（４）配列番号４２及び４３の両方；（５）配列番号５３及び５４の両方；（６）配列番号６４及び６５の両方；（７）配列番号７５及び７６の両方；（８）配列番号８６及び８７の両方；（９）配列番号１３７及び１３８の両方；（１０）配列番号１４２及び１４３の両方；（１１）配列番号１４４及び１４５の両方；（１２）配列番号１４６及び１４７の両方；（１３）配列番号１４８及び１４９の両方；（１４）配列番号１５０及び１５１の両方；（１５）配列番号１５２及び１５３の両方；（１６）配列番号１５４及び１５５の両方；（１７）配列番号１５６及び１５７の両方；（１８）配列番号１５９及び１５８の両方；（１９）配列番号１７８及び１０の両方；（２０）配列番号１８１及び２１の両方；（２１）配列番号１８４及び３２の両方；（２２）配列番号１８７及び４３の両方；（２３）配列番号１９０及び５４の両方；（２４）配列番号１９３及び６５の両方；（２５）配列番号１９６及び７６の両方；（２６）配列番号１９９及び８７の両方；（２７）配列番号１３７及び２０２の両方；（２８）配列番号９及び２０５の両方；（２９）配列番号２０及び２０７の両方；（３０）配列番号３１及び２０９の両方；（３１）配列番号４２及び２１１の両方；（３２）配列番号５３及び２１３の両方；（３３）配列番号６４及び２１５の両方；（３４）配列番号７５及び２１７の両方；（３５）配列番号８６及び２１９の両方；（３６）配列番号１３７及び２２１の両方；（３７）配列番号２２３及び２０２の両方；（３８）配列番号２２３及び２２１の両方；（３９）配列番号２０及び２２６の両方；又は（４０）配列番号１８１及び２２６の両方のアミノ酸配列を含み得る。

【0068】

本発明の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、上記本発明のＴＣＲの定常領域を更に含み得る。これに関して、該ポリペプチドは、例えば、（ｉ）配列番号９１～９３のうちの１又は（ｉｉ）配列番号９３及び配列番号９１及び９２のうちの１のアミノ酸配列を含み得る。

【0069】

本発明の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖を含み得る。これに関して、該ポリペプチドは、例えば：（１）配列番号１１及び１２の両方；（２）配列番号２２及び２３の両方；（３）配列番号３３及び３４の両方；（４）配列番号４４及び４５の両方；（５）配列番号５５及び５６の両方；（６）配列番号６６及び６７の両方；（７）配列番号７７及び７８の両方；（８）配列番号８８及び８９の両方；（９）配列番号１３９及び１４０の両方；（１０）配列番号１６０及び１６１の両方；（１１）配列番号１６２及び１６３の両方；（１２）配列番号１６４及び１６５の両方；（１３）配列番号１６６及び１６７の両方；（１４）配列番号１６８及び１６９の両方；（１５）配列番号１７０及び１７１の両方；（１６）配列番号１７２及び１７３の両方；（１７）配列番号１７４及び１７５の両方；（１８）配列番号１７６及び１７７の両方；（１９）配列番号１７９及び１２の両方；（２０）配列番号１８２及び２３の両方；（２１）配列番号１８５及び３４の両方；（２２）配列番号１８８及び４５の両方；（２３）配列番号１９１及び５６の両方；（２４）配列番号１９４及び６７の両方；（２５）配列番号１９７及び７８の両方；（２６）配列番号２００及び８９の両方；（２７）配列番号１３９及び２０３の両方；（２８）配列番号１１及び２０６の両方；（２９）配列番号２２及び２０８の両方；（３０）配列番号３３及び２１０の両方；（３１）配列番号４４及び２１２の両方；（３２）配列番号５５及び２１４の両方；（３３）配列番号６６及び２１６の両方；（３４）配列番号７７及び２１８の両方；（３５）配列番号８８及び２２０の両方；（３６）配列番号１３９及び２２２の両方；（３７）配列番号２２４及び２０３の両方；（３８）配列番号２２４及び２２２の両方；（３９）配列番号２２及び２２７の両方；又は（４０）配列番号１８２及び２２７の両方のアミノ酸配列を含み得る。

【0070】

本発明は、更に、本明細書に記載のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含むタンパク質を提供する。「タンパク質」とは、１本以上のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。実施形態においては、本発明のタンパク質は：（１）配列番号３～５の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６～８の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２）配列番号１４～１６の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１７～１９の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３）配列番号２５～２７の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２８～３０の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（４）配列番号３６～３８の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号３９～４１の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（５）配列番号４７～４９の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号５０～５２の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（６）配列番号５８～６０の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６１～６３の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（７）配列番号６９～７１の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号７２～７４の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（８）配列番号８０～８２の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号８３～８５の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（９）配列番号１３１～１３３の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１３４～１３６の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。

【0071】

本発明の実施形態においては、該タンパク質は：（１）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２）配列番号２０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３）配列番号３１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（４）配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（５）配列番号５３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（６）配列番号６４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（７）配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号７６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（８）配列番号８６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（９）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１０）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１１）配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１２）配列番号１４６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１３）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１４）配列番号１５０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１５）配列番号１５２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１６）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１７）配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１８）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１９）配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２０）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２１）配列番号１８４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２２）配列番号１８７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２３）配列番号１９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２４）配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２５）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号７６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２６）配列番号１９９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２７）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２８）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２９）配列番号２０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３０）配列番号３１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３１）配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３２）配列番号５３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３３）配列番号６４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３４）配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３５）配列番号８６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３６）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３７）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３８）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３９）配列番号２０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（４０）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。

【0072】

本発明の実施形態においては、該タンパク質は：（１）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２）配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（４）配列番号４４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（５）配列番号５５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（７）配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（８）配列番号８８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（９）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１０）配列番号１６０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１１）配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１２）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１３）配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１４）配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１５）配列番号１７０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１６）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１７）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１７５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１８）配列番号１７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（１９）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２０）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２１）配列番号１８５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２２）配列番号１８８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２３）配列番号１９１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２４）配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２５）配列番号１９７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２６）配列番号２００のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２７）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２８）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（２９）配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３０）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３１）配列番号４４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３２）配列番号５５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３３）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３４）配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３５）配列番号８８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３６）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３７）配列番号２２４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３８）配列番号２２４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（３９）配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（４０）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号２２７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。

【0073】

本発明のタンパク質は、ＴＣＲであってよい。或いは、該タンパク質の第１の及び／又は第２のポリペプチド鎖（複数可）が、他のアミノ酸配列、例えば免疫グロブリン又はその一部分をコードしているアミノ酸配列を更に含む場合、本発明のタンパク質は、融合タンパク質であってもよい。これに関して、本発明は、また、少なくとも１の他のポリペプチドと共に、本明細書に記載の本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む融合タンパク質を提供する。他のポリペプチドは、融合タンパク質の別々のタンパク質として存在してもよく、又は本明細書に記載の本発明のポリペプチドのうちの１つとインフレームで（タンデムに）発現するポリペプチドとして存在してもよい。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ等が挙げられるがこれらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性の分子、又はこれらの一部分をコードしていてよい。

【0074】

融合タンパク質は、１コピー以上の本発明のポリペプチド及び／又は１コピー以上の他のポリペプチドを含み得る。例えば、融合タンパク質は、１、２、３、４、５、又はそれ以上のコピーの本発明のポリペプチド及び／又は他のポリペプチドを含み得る。融合タンパク質を作製する好適な方法は、当技術分野において公知であり、例えば、組み換え法が挙げられる。

【0075】

本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現し得る。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、リンカーペプチドを更に含み得る。リンカーペプチドは、有利には、宿主細胞における組み換え体のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質の発現を促進し得る。リンカーペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。例えば、リンカーペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列を含み得る。リンカーペプチドを含むコンストラクトが宿主細胞によって発現されたら、リンカーペプチドを切断してもよく、その結果、分離されたα鎖及びβ鎖が得られる。本発明の実施形態においては、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、全長α鎖、全長β鎖、及びα鎖とβ鎖との間に位置するリンカーペプチドを含むアミノ酸配列を含み得る。

【0076】

いくつかの実施形態においては、本明細書に開示されるＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、シグナルペプチドを含む、本明細書に開示される通りのα鎖及び／又はβ鎖を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に開示されるα鎖及び／又はβ鎖のいずれかのシグナルペプチドの配列は、２位の野生型残基と置換されたアラニン又はヒスチジン残基を含む。

【0077】

いくつかの実施形態においては、本明細書に開示されるＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、シグナルペプチドを欠く、本明細書に開示される通りのα鎖及び／又はβ鎖の成熟型を含む。

【0078】

本発明のタンパク質は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、組み換え抗体又はその抗原結合部分であってよい。本明細書で用いるとき、「組み換え抗体」とは、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つ、及び抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分を含む組み換え（例えば、遺伝的に操作された）タンパク質を指す。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、抗体の重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ、Ｆａｂ、若しくはＦ（ａｂ）_２’の断片であってよい。抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、組み換え抗体の別々のポリペプチドとして存在してよい。或いは、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、本発明のポリペプチドとインフレームで（タンデムに）発現するポリペプチドとして存在してもよい。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、本明細書に記載の抗体及び抗体断片のいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体断片のポリペプチドであってよい。

【0079】

本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、その生物活性、例えば、変異ｐ５３に特異的に結合する能力、哺乳動物におけるがんを検出する能力、又は哺乳動物におけるがんを治療若しくは予防する能力等を保持している限り、任意の長さであってよい、即ち、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ポリペプチドは、約５０～約５０００アミノ酸長の範囲、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上のアミノ酸長であってよい。これに関して、本発明のポリペプチドは、オリゴペプチドも含む。

【0080】

本発明の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、１以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでいてもよい。このような合成アミノ酸は、当技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。

【0081】

本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質を、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化、又は酸付加塩に変換、及び／又は任意で二量体化若しくは多量体化、又はコンジュゲートしてもよい。

【0082】

本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質は、当技術分野において公知の方法、例えば、デノボ合成によって得ることができる。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組み換え法を使用し、本明細書に記載の核酸を用いて組み換え的に生成することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。或いは、例えば、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ），Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の企業が、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質を商業的に合成することもできる。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、合成であってもよく、組み換え体であってもよく、単離されていてもよく、及び／又は精製されていてもよい。

【0083】

本発明の実施形態は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。「核酸」は、本明細書で用いるとき、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」を含み、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよく、そして、改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりに、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合を含有していてもよい。実施形態においては、核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。核酸は、任意の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含まないことが一般に好ましい。しかし、幾つかの例では、本明細書で論じた通り、核酸が１以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが好適である場合もある。

【0084】

好ましくは、本発明の核酸は、組み換え体である。本明細書で用いるとき、用語「組み換え体」とは、（ｉ）天然若しくは合成の核酸セグメントを生細胞で複製可能な核酸分子に連結させることによって生細胞の外部で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されているものの複製によって得られる分子を指す。本明細書における目的のために、複製は、インビトロ複製であってもインビボ複製であってもよい。

【0085】

核酸は、当技術分野において公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増大させるか若しくはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学的に合成することができる。核酸を作製するために用いることができる修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキュェオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の核酸のうちの１以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入することができる。

【0086】

本発明の実施形態においては、核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードしている、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増大させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブなコドンを、同じアミノ酸をコードしているが細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンで置換し、それによって、翻訳効率を増大させることを伴い得る。また、ヌクレオチド配列の最適化は、翻訳に干渉するｍＲＮＡの二次構造を低減し、それによって、翻訳効率を増大させることもできる。

【0087】

また、本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0088】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に多い量で、標的配列（本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確な相補的配列を有するポリヌクレオチド又は幾つかの散在している不一致しか含有していないものを、該ヌクレオチド配列に一致している幾つかの小さな領域（例えば、３～１０塩基）を偶然有するランダム配列と識別する条件を含む。このような相補的な小さな領域は、１４～１７又はそれ以上の塩基の全長相補体よりも容易に融解するので、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによって容易に識別可能になる。比較的高ストリンジェンシー条件は、例えば、約０．０２～０．１Ｍ ＮａＣｌ又は等価物、約５０～７０℃の温度によって提供されるもの等の低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列とテンプレート又は標的鎖との間の（もし存在するとしても）わずかな不一致しか許容せず、本発明のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。一般的に、漸増量のホルムアミドを添加することによって、条件をよりストリンジェントにすることができると理解される。

【0089】

また、本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかと少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかから本質的になっていてよい。

【0090】

本発明の核酸は、組み換え発現ベクターに組み込むことができる。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本発明の実施形態においては、組み換え発現ベクターは、α鎖、β鎖、及びリンカーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。

【0091】

本明細書における目的のために、用語「組み換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含み、宿主細胞内で該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下でベクターを該細胞と接触させたときに、該細胞に該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させる、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。本発明のベクターは、全体としては天然に存在しない。しかし、ベクターの一部が天然に存在していてもよい。本発明の組み換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない任意の種類のヌクレオチドを含んでいてよく、該ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、合成されても天然源から部分的に入手されてもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよい。組み換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然には存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含んでいてよい。好ましくは、天然には存在しないか又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写も複製も妨げない。

【0092】

本発明の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするために用いることができる。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等、伝播及び増殖用、若しくは発現用、又は両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、トランスポゾン／トランスポゼースシリーズ、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターを用いてもよい。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組み換え発現ベクターは、トランスポゾンベクター又はウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。

【0093】

本発明の組み換え発現ベクターは、例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋら、前記に記載されている標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。円形又は線形である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス等に由来していてよい。

【0094】

望ましくは、組み換え発現ベクターは、制御配列、例えば、必要に応じて、そして、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の種類（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的な転写及び翻訳の開始及び終止のコドンを含む。

【0095】

組み換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞の選別を可能にする１以上のマーカー遺伝子を含んでいてよい。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を与えるための栄養要求性宿主における補完等を含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。

【0096】

組み換え発現ベクターは、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードしているヌクレオチド配列に、又はＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードしているヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結しているネイティブ又は非ネイティブのプロモータを含んでいてよい。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、及び発生段階特異的なプロモータの選択は、当業者の技能の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモータとの組み合わせも当業者の技能の範囲内である。プロモータは、非ウイルスプロモータ、例えば、ヒト伸長因子－１αプロモータであってもよく、ウイルスプロモータ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＲＳＶプロモータ、及びマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列にみられるプロモータであってもよい。

【0097】

本発明の組み換え発現ベクターは、一過的発現用、安定的発現用、又は両方のために設計することができる。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現用又は誘導性発現用に作製することができる。

【0098】

更に、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製してもよい。本明細書で用いるとき、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現している細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、該遺伝子が発現する細胞に対して剤、例えば薬物に対する感受性を付与し、そして、該細胞が該剤と接触したとき又は該剤に曝露されたときに該細胞を死に至らしめる遺伝子であってよい。自殺遺伝子は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼを含む。

【0099】

本発明の別の実施形態は、更に、本明細書に記載の組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本明細書で用いるとき、用語「宿主細胞」とは、本発明の組み換え発現ベクターを含有し得る任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、又は藻類であってもよく、原核細胞、例えば、細菌又は原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、即ち、生物、例えばヒトから直接単離された細胞であってよい。宿主細胞は、接着細胞又は懸濁細胞、即ち、懸濁液中で成長する細胞であってよい。好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組み換え発現ベクターを増幅又は複製する目的の場合、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、例えばＤＨ５α細胞である。組み換え体のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を生成する目的の場合、宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。宿主細胞は、任意の細胞型であってよく、任意の種類の組織に由来していてよく、任意の発生段階であってよいが、宿主細胞は、好ましくは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。

【0100】

本明細書における目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は哺乳動物から得られたＴ細胞であってよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは流体を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。また、Ｔ細胞は、濃縮又は精製されていてもよい。好ましくは、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリＴ細胞及びエフェクタメモリＴ細胞）、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0101】

また、本明細書に記載の少なくとも１の宿主細胞を含む細胞の集団が本発明によって提供される。細胞の集団は、組み換え発現ベクターのいずれも含まない少なくとも１の他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて、記載される組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均質な集団であってよい。或いは、細胞の集団は、組み換え発現ベクターを含む（例えば、から本質的になる）宿主細胞を主に含む、実質的に均質な集団であってもよい。また、集団は、該集団の全ての細胞が、組み換え発現ベクターを含む１の宿主細胞のクローンであり、その結果、該集団の全ての細胞が組み換え発現ベクターを含む、細胞のクローン集団であってもよい。本発明の一実施形態においては、細胞の集団は、本明細書に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。

【0102】

本発明の実施形態においては、集団内の細胞数を、急速に増幅させることができる。Ｔ細胞数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号、同第８，３８３，０９９号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）、及びＲｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９－２０１（１９９０）に記載されている通り、当技術分野において公知の多数の方法のいずれかによって実現することができる。実施態様においては、Ｔ細胞数の増幅は、該Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、放射線照射された同種ＰＢＭＣ）と共に培養することによって実行される。

【0103】

本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）は、単離及び／又は精製されてもよい。用語「単離された」は、本明細書で用いるとき、その天然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」は、本明細書で用いるとき、純度が増大したことを意味し、「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈される訳ではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％であってもよく、約１００％であってもよい。

【0104】

本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）（以後、これらの全てをまとめて「本発明のＴＣＲ材料」と称する）は、医薬組成物等の組成物に製剤化してもよい。これに関して、本発明は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）のいずれかと、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１つを超える本発明のＴＣＲ材料、例えばポリペプチド及び核酸、又は２つ以上の異なるＴＣＲを含んでいてもよい。或いは、医薬組成物は、別の薬学的活性剤（複数可）又は薬物（複数可）、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等の化学療法剤と組み合わせて、本発明のＴＣＲ材料を含んでいてもよい。

【0105】

好ましくは、担体は、薬学的に許容し得る担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の具体的な本発明のＴＣＲ材料に従来使用されているもののいずれかであってよい。投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に公知であるか又は明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）により詳細に記載されている。薬学的に許容し得る担体は、使用条件下で有害な副作用も毒性も有しないものであることが好ましい。

【0106】

担体の選択は、具体的な本発明のＴＣＲ材料によって、並びに本発明のＴＣＲ材料を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、腫瘍内、又は腹腔内に投与するためのもののいずれかを含み得る。１つを超える経路を用いて本発明のＴＣＲ材料を投与してよく、特定の例では、特定の経路が別の経路よりも即時且つより有効な応答を提供し得る。

【0107】

好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、例えば静脈内に注射することによって投与される。本発明のＴＣＲ材料が、本発明のＴＣＲを発現している宿主細胞であるとき、注射用の細胞のための薬学的に許容し得る担体としては、任意の等張担体、例えば、通常生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖ ＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／Ｌ ＮａＣｌ、又は水１リットルあたり約９．０ｇ ＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％デキストロース、又は乳酸リンゲル液を挙げることができる。実施形態においては、薬学的に許容し得る担体にヒト血清アルブミンを補給する。

【0108】

本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ材料の量又は用量（例えば、本発明のＴＣＲ材料が１以上の細胞である場合は細胞数）は、好適な時間枠にわたって被験体又は動物において効果、例えば治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、投与時点から約２時間以上、例えば、１２～２４時間又はそれ以上の期間、がん抗原（例えば、変異ｐ５３）に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態においては、期間は更に長くてもよい。用量は、具体的な本発明のＴＣＲ材料の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。

【0109】

投与される用量を決定するための多くのアッセイが、当技術分野において公知である。本発明の目的のために、それぞれ異なる用量のＴ細胞を与えた哺乳動物のセット間で、所与の用量の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を発現しているＴ細胞を哺乳動物に投与した際に標的細胞が溶解するか又はこのようなＴ細胞によってＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイを用いて、哺乳動物に投与する開始用量を決定することができる。特定の用量を投与した際に標的細胞が溶解する又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。

【0110】

本発明のＴＣＲ材料の用量は、具体的な本発明のＴＣＲ材料の投与に付随する可能性のある任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。典型的には、主治医が、様々な要因、例えば、年齢、体重、全体的な健康状態、食生活、性別、投与される本発明のＴＣＲ材料、投与経路、及び治療されるがんの重篤度を考慮して、各個々の患者を治療するための本発明のＴＣＲ材料の投与量を決定する。本発明のＴＣＲ材料が細胞の集団である実施形態においては、注入１回あたりに投与される細胞数は、例えば、約１×１０^６～約１×１０^１２細胞又はそれ以上で変動し得る。特定の実施形態においては、１×１０^６細胞未満を投与してもよい。

【0111】

当業者は、本発明のＴＣＲ材料を任意の数の方法で修飾してよく、その結果、該修飾を通して本発明のＴＣＲ材料の治療又は予防の有効性が増大することを容易に理解するであろう。例えば、本発明のＴＣＲ材料を、直接又は架橋を介して間接的に化学療法剤にコンジュゲートしてもよい。化合物の化学療法剤へのコンジュゲートの実施は、当技術分野において公知である。当業者は、架橋及び／又は化学療法剤が本発明のＴＣＲ材料に結合した時点で本発明のＴＣＲ材料の機能、即ち、変異ｐ５３に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防する能力には干渉しない限り、本発明のＴＣＲ材料の機能に必須ではない本発明のＴＣＲ材料の部位が、架橋及び／又は化学療法剤を結合させるのに理想的な部位であることを認識する。

【0112】

本発明の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は細胞の集団は、がんを治療又は予防する方法において使用できることが企図される。特定の理論に縛られるものではないが、本発明のＴＣＲは変異ｐ５３に特異的に結合し、その結果、ＴＣＲ（又は関連する本発明のポリペプチド若しくはタンパク質）は、細胞によって発現されたとき、変異ｐ５３を発現している標的細胞に対する免疫応答を媒介することができると考えられる。これに関して、本発明の実施形態は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組み換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれかをコードしている組み換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞の集団を、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するのに有効な量、該哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。

【0113】

本発明の実施形態は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防において用いるための、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組み換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれかをコードしている組み換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞の集団を提供する。

【0114】

用語「治療する」及び「予防する」、並びにそれから派生する語は、本明細書で用いるとき、必ずしも１００％、即ち、完全な治療又は予防を意味するものではない。どちらかといえば、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物における任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されるがんの１以上の病態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、がん又はその症状若しくは病態の発生を遅らせることを包含し得る。或いは又は更に、「予防」は、がん又はその症状若しくは病態の再発を防ぐ又は遅らせることを包含し得る。

【0115】

また、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法も本発明の実施形態によって提供される。該方法は、（ｉ）本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、又は医薬組成物のいずれかを、哺乳動物由来の１以上の細胞を含む試料と接触させ、それによって、複合体を形成させることと、該複合体を検出することとを含み、該複合体の検出が、該哺乳動物におけるがんの存在を示す。

【0116】

哺乳動物におけるがんを検出する本発明の方法に関して、細胞の試料は、全細胞、その溶解物、又は全細胞溶解物の画分、例えば、核若しくは細胞質の画分、全タンパク質画分、又は核酸画分を含む試料であってよい。

【0117】

本発明の検出方法の目的のために、接触は、哺乳動物に対してインビトロ又はインビボで行ってよい。好ましくは、インビトロで接触させる。

【0118】

また、複合体の検出は、当技術分野において公知の任意の数の方法を通して行うことができる。例えば、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は細胞の集団を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例えば、金粒子）等で標識してよい。

【0119】

宿主細胞又は細胞の集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳動物にとって同種又は自己である細胞であってよい。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自己である。

【0120】

本発明の方法に関して、がんは、例えば、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、網、及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん、並びに膀胱がんのいずれかを含む任意のがんであってよい。好ましい実施形態においては、がんは、変異ｐ５３を発現するがんである。がんは、配列番号１により定義される１７５位及び２２０位のうちの一方又は両方に変異を有するｐ５３を発現し得る。がんは、以下のヒトｐ５３変異のうちの一方又は両方を有するｐ５３を発現し得る：Ｒ１７５Ｈ及びＹ２２０Ｃ。好ましくは、該がんは、上皮がん、又は胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんである。

【0121】

本発明の方法において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であってよい。本明細書で用いるとき、用語「哺乳動物」とは、げっ歯目の哺乳動物、例えばマウス及びハムスター、並びにウサギ目の哺乳動物、例えばウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ及びイヌを含む食肉目の哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物は、ウシ及びブタを含む偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目の哺乳動物であることがより好ましい。哺乳動物は、霊長目、サル目（Ｃｅｂｏｉｄｓ又はＳｉｍｏｉｄｓ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の哺乳動物であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。

【実施例】

【0122】

以下の実施例は、本発明を更に説明するが、無論、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0123】

実施例１～７に記載の実験においては、以下の材料及び方法を用いた。

【0124】

被験体及び試料
白血球アフェレーシス産物及び腫瘍試料を、国立がん研究所（ＮＣＩ）の施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された国立衛生研究所プロトコルＮＣＴ０１１７４１２１に登録された、転移性上皮がんを有する個人から得た。患者は、治療前の白血球アフェレーシス及びＴＩＬスクリーニング結果の利用可能性に基づいて選択され、標準治療に従って前治療（手術、化学療法、放射線療法）を受けていた（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）： １１０９－１４（２０１９）；Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，２４（２２）：５５６２－７３（２０１８））。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅを用いて白血球アフェレーシスからＰＢＬを単離し、細胞を、将来用いるために凍結保存した。研究した全ての患者は、以前に記載（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））の通りの、臨床プロトコルに沿った全エクソームシークエンシングによって確認されたＴＰ５３変異を有した。

【0125】

抗体及びＦＡＣＳ
蛍光標識抗体フローサイトメトリーを表１に詳述する。フローサイトメトリー分析は、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）による分析により、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で行った。全ての細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された細胞を排除することによって、リンパ球及び生細胞によりゲートした。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０について細胞を選別した。４－１ＢＢ^＋及び／又はＯＸ４０^＋細胞を、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－（ＣＤ４）及びＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（ＣＤ８）ゲートを介して別々に選別した。共培養物を、ＴＣＲ遺伝子を同定するための単一細胞ＰＣＲ用に、ＳＨ８００Ｓ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって選別した。

【0126】

【表1】

【0127】

ＴＰ５３「ホットスポット」変異スクリーニング試薬
ＴＩＬスクリーニングのために、ＷＴ（ＴＭＧ－ＷＴ－ＴＰ５３）及び変異ＴＰ５３（ＴＭＧ－ＭＵＴ－ＴＰ５３）のＴＭＧコンストラクトを以前に記載（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））の通りに作製した。簡単に言うと、各ＴＰ５３「ホットスポット」変異（Ｒ１７５Ｈ、Ｙ２２０Ｃ、Ｇ２４５Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２７３Ｌ、及びＲ２８２Ｗ）を、中央に変異コドン、上流及び下流に１２個の正常コドンがあるミニ遺伝子に構成し、ミニ遺伝子をＴＭＧに連結した。ＷＴ配列に対応する類似配列も導出した。ＴＭＧをＤＮＡとして合成し、ＬＡＭＰシグナル配列及びＤＣ－ＬＡＭＰ局在化配列にインフレームでクローン化し、次いで、製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵｌｔｒａＫｉｔを用いてインビトロでｍＲＮＡに転写した。更に、ＷＴ及び変異ペプチドをｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}、ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}、及びｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}について合成し、高速液体クロマトグラフィー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって＞９５％に精製した。全てのペプチドをＤＭＳＯ中で再構成した。

【0128】

抗原提示細胞
単球由来の未成熟樹状細胞（ＤＣ）を、接着法によって生成した（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５０（６２６６）：１３８７－９０（２０１５））。簡単に言うと、ＰＢＬを、ＤＮａｓｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を含有するＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にプレーティングし、３７℃で１．５～２時間インキュベーションした。非接着細胞を取り出し、フレッシュで、又は凍結保存して用いた。接着細胞をＡＩＭ－Ｖで洗浄し、３７℃で１時間インキュベーションし、培地をＤＣ培地（５％ヒト血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、８００ＩＵ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及び２００Ｕ／ｍＬインターロイキン－４（ＩＬ－４）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ，ＮＪ）を含む、ＲＰＭＩ－１６４０、２ｍＭ Ｌ－グルタミン）に交換した。細胞を２～３日ごとに栄養摂取させ、５～６日目に回収した。

【0129】

ＩＶＳ、変異体ＴＰ５３共培養、４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮及びＲＥＰ
抗原経験の選別を行うために、前処理ＰＢＬを以前に記載（Ｃａｆｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０（１）：４４９（２０１９））の通り処理した。凍結保存したアフェレーシス試料を解凍し、洗浄し、ＤＮａｓｅを含有するＡＩＭ－Ｖ培地で５～１０ｘ１０^６細胞／ｍｌに設定し、１．７５～２ｘ１０^８の生細胞をＴ１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）ごとにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で９０分間インキュベーションした。９０分後、非接着性の単球が枯渇したＰＢＬを回収し、遠心分離し、５０／５０培地（ＡＩＭ－Ｖ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩インキュベーションした。接着性の単球を、上記の通り未成熟ＤＣに分化させた。非接着細胞を一晩静置した後、細胞を回収し、１～２ｘ１０^８細胞を、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ抗体を含む５０μｌの染色バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を４℃で３０分間インキュベーションし、取得前に２回洗浄した。選別集団を決定するために、生細胞（ヨウ化プロピジウム陰性）、単一細胞、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、次いで抗原経験細胞（ＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ４５ＲＯ^－）でゲートを行い、更にＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋に細かく分けた。ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋の抗原経験メモリーＴ細胞を別々に選別し、回集し、計数し、濃度６０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）を含有する５０／５０培地に再懸濁した。自己ＤＣを、ＦＡＣＳ選別の日の１８～２４時間前にＴＭＧ－ＭＵＴ－ＴＰ５３とエレクトロポレーションするか、当該日に患者特異的変異体ｐ５３－ＬＰで２～４時間パルスした。標的細胞（ＤＣ）を５０／５０培地で２回洗浄し、サイトカインを含まない５０／５０培地中に再懸濁した。ＤＣの添加後、最終濃度３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１で、１：３～１：６の比率（ＤＣ：Ｔ細胞）の共培養でインビトロ刺激（ＩＶＳ）を行った。以前に記載（Ｃａｆｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０（１）：４４９（２０１９））の通り、１４日間の増殖及びＩＬ－２１及びインターロイキン－２（ＩＬ－２；アルデスロイキン）の３回の摂取後、自己ＤＣを、再度、ＴＭＧ－ＭＵＴ－ＴＰ５３と、又は変異ロングペプチド（ＬＰ）で、それぞれエレクトロポレーション又はパルスし、ＩＶＳ培養物を３７℃及び５％ＣＯ_２で１８～２４時間共培養した。並行して、４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮選別時のネガティブコントロール用に、ＩＶＳ培養物を、関係性のないＴＭＧとエレクトロポレーションしたＤＣ又はＤＭＳＯでパルスしたＤＣと共培養した。共培養後、細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、４－１ＢＢ及びＯＸ４０抗体を含有する５０μｌの染色バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベーションし、取得前に２回洗浄した。選別した４－１ＢＢ^＋／ＯＸ４０^＋を濃縮したＴ細胞を、放射線照射したＰＢＬフィーダー、３０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗体（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び５０／５０培地中３，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて、ＲＥＰにより増幅した。急速増幅（ＲＥＰ）培養物を３回栄養摂取させ、１４日目に反応性について試験、又は凍結保存した。

【0130】

共培養
ＩＶＳ及び濃縮Ｔ細胞のスクリーニングを、ＴＩＬ断片をスクリーニングするために用いられるのと同一の戦略によって達成した（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｂｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））。簡単に言うと、自己ＤＣをＴＭＧ（１０^５細胞／ウェル）とエレクトロポレーションし、一晩静置又はペプチド若しくはＤＭＳＯで２～４時間パルス（８ｘ１０^４細胞／ウェル）した。標的細胞を２回洗浄し、５０／５０培地中に再懸濁し、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）のＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）ｐｌａｔｅｓ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）中で２ｘ１０^４Ｔ細胞と共培養した。ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）及びイオノマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をポジティブコントロールとして使用し、培地のみがネガティブコントロールであった。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを製造業者の指示に従って処理しながら、共培養した細胞を取り出し、染色し、上記の通りフローサイトメトリーで分析した。腫瘍細胞株を、共培養前に凍結保存されたストックから少なくとも１週間増殖させた。それらの作製は他で説明される（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））。腫瘍細胞を、丸底９６ウェルプレート中においてＴ細胞（合計２ｘ１０^５細胞）と１：１の比率で一晩共培養した。共培養上清を回収して酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によりＩＦＮγ分泌を評価した後、共培養細胞をフローサイトメトリーで分析した。

【0131】

最短ペプチドアッセイ及びＨＬＡ拘束性マッピング（ＨＬＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ）
以前に記載された同様の方法を用いて、最短ペプチドを同定し、ＨＬＡ拘束性を決定した（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））。手短に言うと、ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ｖ３．４）を用いて（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２４（１１）：１３９７－８（２００８））、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子についてのネオエピトープを予測した。候補の９～１１アミノ酸を上記の通り共培養した。ＣＤ４^＋最短新抗原を調査するために、１４アミノ酸が重なり合う１５アミノ酸ペプチドを上記の通り共培養した。ＨＬＡ拘束性を決定するために、ＣＯＳ７腫瘍細胞を、平底９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ－１６４０、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１０％ウシ胎児血清に２．５ｘ１０^４細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃で一晩インキュベーションした。ＤＮＡプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１骨格）の、患者特異的な個々のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子（３００ｎｇ／ウェル）又はＨＬＡクラスＩＩα鎖とβ鎖の両方（それぞれ１５０ｎｇ／ウェル）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔで、製造業者の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従ってトランスフェクションした。ＴＭＧをＨＬＡと共トランスフェクションした場合、ＨＬＡの濃度を、クラスＩについては１５０ｎｇ／ウェルに、クラスＩＩについては１００ｎｇ／ウェルに低減した。これらの実験のために用いたＷＴ ＴＭＧは、目的の位置、例、Ｒ１７５Ｈ、でのみＷＴに復帰させたＴＭＧ－ＭＵＴ－ＴＰ５３であった。２４時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を除去し、ペプチド又はＤＭＳＯを５０／５０培地中において２～４時間パルスし、ウェルを５０／５０培地で２回洗浄し、１０^５Ｔ細胞を一晩インキュベーションした。共培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＦＮγ分泌について分析し、細胞を４－１ＢＢの上方制御について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0132】

ＴＣＲＢシークエンシング
ＴＣＲＢサーベイシークエンシングを、ゲノムＤＮＡから、Ａｄａｐｔｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）によって行った。シークエンシングのために、最小限の５ｘ１０^４個の細胞を送付した。生産的なＴＣＲ再構成の分析を、ＩＭＭＵＮＯＳＥＱ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ３．０ ｔｏｏｌ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。

【0133】

ＴＣＲの同定及び再構築
以前の研究（Ｐａｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，ｄｏｉ １０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－１６－０００１ （２０１６）；Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，２３（２）：３５１－６２（２０１７））と同様に、ｐ５３新抗原を発現するＴ細胞及びＤＣの共培養物を単一ウェルに選別し、続いてＴＣＲ遺伝子の単一細胞逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって、ＴＣＲを同定した。ＰＣＲ産物は、ＴＣＲα及びＴＣＲβを別々に維持し、サンガーシークエンシングによって分析した。これらの部分的なＴＣＲ配列を、正確なＣＤＲ３及びＪ又はＤ／Ｊ領域並びに最も可能性の高いＴＲＡＶ及びＴＲＢＶファミリーを同定する、ＩＭＧＴ／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ（ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ）及びＩＧＢＬＡＳＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）ウェブサイトにより分析した。他の研究で行われた通り、ヒトの全長可変配列をマウスの定常鎖に融合させた（Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，２３（２）：３５１－６２（２０１７）；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２５（１０）：３９８１－９１（２０１５）。マウス化されたＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子を、ＲＡＫＲ－ＳＧＳＧ（配列番号１２８）及びＰ２Ａリボソームスリップ配列と連結させ、単一シストロンにおけるＴＣＲの化学量論的発現をもたらした。この配列は、一過性のレトロウイルス上清の作製のために合成し、ＭＳＧＶ１ベクターにクローン化した。

【0134】

ＴＣＲ形質導入
ＰＢＬドナーを、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＯＫＴ３及び３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加した５０／５０培地中で３ｘ１０^６細胞／ｍｌに調整し、レトロウイルス形質導入の前に２日間接着低減プレート上で活性化した。変異特異的ＴＣＲをコードするｐＭＳＧＶ１プラスミド（１．５μｇ／ウェル）及びエンベロープをコードするプラスミドＲＤ１１４（０．７５μｇ／ウェル）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、６ウェルポリ－Ｄ－リシンコーティングプレートの１０^６ＨＥＫ２９３ＧＰ細胞／ウェルに共トランスフェクションした。トランスフェクションの２日後にレトロウイルス上清を回収し、ＤＭＥＭ培地で１：１に希釈し、２０００ｘｇ、３２℃で２時間、ＲＥＴＲＯＮＥＣＴＩＮ ｒｅａｇｅｎｔ（１０μｇ／ウェル、Ｔａｋａｒａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）でコーティングした非組織培養処理６ウェルプレート上に２回遠心分離した。上清を吸引し、２ｘ１０^６の刺激Ｔ細胞を、３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含む５０／５０培地中、５ｘ１０^５細胞／ｍＬで各ウェルに加えた。Ｔ細胞を、ＲＥＴＲＯＮＥＣＴＩＮ ｒｅａｇｅｎｔでコーティングしたプレート上に、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。培地は３～４日後に３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２と交換し、形質導入細胞を、形質導入の１０～１４日後にアッセイした。

【0135】

実施例１
本実施例は、ＴＰ５３変異を有する抗原経験末梢血Ｔ細胞のＩＶＳを実例で示す。

【0136】

ＰＢＬからの抗原経験Ｔ細胞を、ＴＰ５３変異腫瘍を有する７人の結腸がん患者、１人の直腸がん患者及び１人の卵巣がん患者において評価した（表２）。患者４２１７（ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}）、４２１３（ｐ５３^{Ｒ２４８Ｑ}）、４２５７（ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}）及び４２５４（ｐ５３^{Ｒ２７３Ｈ}）は、ｐ５３新抗原に対するＴＩＬ応答を示さなかった。対照的に、ＴＩＬは患者４１４１（ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}）、４２８５（ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}）、４１４９（ｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}）、４２６６（ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}）及び４２７３（ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}）の自己ＴＰ５３変異に反応した（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９）；Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，２４（２２）：５５６２－７３（２０１８））。凍結保存したアフェレーシス（任意のＡＣＴ前）を用いて、ＰＢＬから抗原を経験したＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞を選別した（図１Ａ左）。選別したＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞を、変異ＴＰ５３－ＴＭＧ ｍＲＮＡ（ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ）を発現するＤＣでインビトロ刺激したか、患者特異的変異ｐ５３－ＬＰ（ｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ）でパルスした。ＩＬ－２１及びＩＬ－２の存在下で１２日培養した後、インビトロ刺激したＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋メモリー細胞を、ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳの場合は、変異ＴＰ５３－ＴＭＧ ｍＲＮＡとエレクトロポレーションしたＤＣと共培養し、ｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳの場合は、患者特異的変異ｐ５３－ＬＰと共培養して、翌日、Ｔ細胞活性化マーカー４－１ＢＢ及び／又はＯＸ４０の発現に基づいて選別した（図１Ａ中央）。ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ及びｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ後の細胞収量は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方について同等で、０．３ｘ１０^７～１５．６ｘ１０^７のＴ細胞から開始して、０．９ｘ１０^７～１８．３ｘ１０^７細胞の範囲であった（表３）。ＣＤ４^＋ ４－１ＢＢ^＋／ＯＸ４０^＋及びＣＤ８^＋ ４－１ＢＢ^＋／ＯＸ４０^＋Ｔ細胞の一部分は、実験の完全性と等価性のために全ての集団から選別され、２ｘ１０^２～１．７ｘ１０^５細胞、親ＣＤ４又はＣＤ８のゲートの０．１％～６．９％の範囲であった（表３）。選別したＴ細胞はＲＥＰを経て、１４日の急速増幅後に分析した。最終的な細胞収量は７ｘ１０^６～４．２ｘ１０^８Ｔ細胞の範囲であり、ＲＥＰへのインプット細胞数の影響を受けた可能性がある（表３）。

【0137】

【表2】

【0138】

【表3】

【0139】

実施例２
本実施例は、ｐ５３新抗原に対する腫瘍内ＴＩＬ応答を伴う患者のＰＢＬ中に、ＴＰ５３変異反応性Ｔ細胞が存在したことを実証する。

【0140】

分析スクリーニングを、ＩＶＳ、４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮及びＲＥＰ後の実施例１の培養物で行い、ここで、反応性を、フローサイトメトリーにより、細胞表面マーカー４－１ＢＢの上方制御によって評価し、及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、ＩＦＮγ分泌によって評価した（図１Ａ右）。末梢血Ｔ細胞は、患者４２１３、４２１７、４２５４、及び４２５７中のｐ５３新抗原に反応しなかった。これは、ＴＩＬスクリーニングの結果を裏付けている（表２）。これらの患者は、ＨＬＡ及びｐ５３のネオエピトープの免疫原性の組み合わせを有していなかった可能性がある。対照的に、ＴＩＬによる変異ＴＰ５３に対する腫瘍内Ｔ細胞応答を示した５人の患者（４１４１及び４２８５：ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}、４１４９：ｐ５３^{Ｙ２２０Ｃ}、４２６６及び４２７３：ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}）のＰＢＬからの抗原経験Ｔ細胞中で、ＴＰ５３変異特異的Ｔ細胞が同定された（図１Ｂ～１Ｃ及び表２）（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））。ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳは４１４１－ＣＤ８、４２８５－ＣＤ４、４１４９－ＣＤ４及び４２６６－ＣＤ８培養においてｐ５３新抗原特異的Ｔ細胞をもたらし（図１Ｂ）、ｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳは４２８５－ＣＤ４及び４２７３－ＣＤ４培養物においてｐ５３新抗原特異的Ｔ細胞をもたらした（図１Ｃ）。変異ＴＰ５３に対する応答（図１Ｂ～１Ｃの塗りつぶし図形）の特異性は、ＷＴの対応物に対する応答（図１Ｂ～１Ｃの白抜き図形）の欠如によって説明された。ＴＰ５３変異反応性細胞の最高頻度は、ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}に対する４１４１－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物中において７８％であった（図１Ｄ）。Ｔ細胞が変異体のＴＭＧ－ＭＵＴ－ＴＰ５３及びｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ} ＬＰに反応したが、ＷＴ ＴＭＧ－ＭＵＴ－ＴＰ５３（関係性のないＴＭＧ）、ＤＭＳＯ（ペプチドビヒクル）又はＷＴ ｐ５３^Ｒ１７５ ＬＰに対してはしなかった（図１Ｅ）ので、４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養により、ＩＦＮγ分泌スクリーニングの肯定的結果が例示された。ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ} ＬＰは、アミノ酸配列ＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧ（配列番号１１１）を有していた。ＷＴ ｐ５３^Ｒ１７５ ＬＰは、アミノ酸配列ＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＲＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧ（配列番号１１０）を有していた。選択した培養物を、４－１ＢＢの上方制御及び／又はＩＦＮγ分泌に基づいて反応性であると見なし、更に研究した（表４Ａ～４Ｂ）。４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物は、１０ｎｇ／ｍＬまでのペプチド濃度で、同族のｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ} ＬＰの特異的認識を示した（図１Ｆ）。従って、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０の濃縮により、公開されているＴＰ５３変異を標的とする非常に特異的なＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を同定することができた。

【0141】

【表4-1】

【0142】

【表4-2】

【0143】

実施例３
本実施例は、ＴＣＲＢ追跡により、ＰＢＬからのｐ５３新抗原反応性Ｔ細胞の濃縮が実証されたことを実例で示す。

【0144】

各患者のＴＰ５３変異反応性Ｔ細胞集団に関するＴＣＲ多様性を更に特性解析し、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮がＴ細胞レパートリーを変化させたか否かを決定することが望まれた。これを達成するために、ＴＣＲＢディープシークエンシング（Ｐａｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，４（９）：７３４－４３（２０１６））を行い、特有のＣＤＲ３Ｂ配列と全体的な試料クローン性に基づいて、生産的なＴ細胞クロノタイプ頻度を測定した。これは、より多くのオリゴクローナル試料が１に近づく集団多様性の正規化測定値である（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，１（１２）：１２ｒａ２３）（２００９）；Ｈｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，７（３０１）：３０１ｒａ１３１（２０１５））。ＴＣＲＢのクローン性は、ＩＶＳ前のＰＢＬと比較して、全ての患者のＰＢＬ試料から生成されたＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ及びｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ培養物において有意に増加した（図２Ａ）。同様に、各ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ及びｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ試料中において最も頻度の高い特有のＴＣＲＢクロノタイプは、ＩＶＳ前のＰＢＬ中よりも頻度が高かった（図２Ｂ）。ｐ５３新抗原反応性ＴＣＲＢ配列の順位付けは、最終的なｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ又はＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物中においては１～１６７の範囲であったが、初代ＰＢＬ中においては、検出されなかったか、又は順位５，０２０であった（表５）。増加したクローン性又は最大ＴＣＲＢクロノタイプ頻度は、ｐ５３新抗原に対するＴ細胞応答を伴う培養に限定されなかった（図２Ａ～２Ｂ；アスタリスクは陽性培養物を示す）。これにより、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮を介して偏りが生じたＴ細胞レパートリーがあったことが示唆されたが、培養物の変異ＴＰ５３に対する応答を予測するには、最高頻度及びクローン性の評価では不十分であった。

【0145】

【表5】

【0146】

実施例４
本実施例は、ｐ５３新抗原反応性ＴＣＲの単離及びＴＣＲＢシークエンシングによる追跡を実例で示す。

【0147】

次いで、潜在的な治療及び研究用途のために、及び培養期間中のＴＣＲＢクロノタイプを追跡して、ＴＰ５３変異反応性Ｔ細胞濃縮の程度を評価するために、ｐ５３新抗原反応性ＩＶＳ集団からＴＣＲを同定した。ＴＣＲを、以前の研究（Ｐａｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，４（９）：７３４－４３（２０１６））と同様に、反応性ＩＶＳ培養物の同族のｐ５３新抗原（ＴＭＧ又はＬＰ）との共培養、４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の選別、及びＴＣＲアルファ及びベータ遺伝子の単一細胞ＲＴ－ＰＣＲを受けて同定した。ＴＣＲペアを再構築し、レトロウイルスベクターにクローン化し、ドナーＰＢＬに形質導入した。非常に効率的な翻訳のためのより強力なコザック配列を有するよう、２番目のアミノ酸残基をアラニン（Ａ）に変更した。ＴＣＲα鎖定常領域を、システイン置換、ＬＶＬ改変マウスα鎖定常領域に置き換えた。ＴＣＲβ鎖定常領域を、システイン置換マウスβ鎖定常領域に置き換えた。

【0148】

ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}（患者４１４１及び４２８５）及びｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}（患者４２６６及び４２７３）新抗原を標的とする合計１１個のＴＣＲを同定した（表５）。患者４１４９についてのＴＣＲは、利用可能なＴ細胞が限られているために決定できなかった。それぞれｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}／ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}／ＨＬＡ－Ａ^＊６８：０１、ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}／ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０２：０１を標的とする、ＴＩＬからの同一のｐ５３新抗原反応性ＴＣＲ（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））を、患者４１４１、４２６６及び４２７３におけるＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮後のＰＢＬ中において同定した。これらの患者においては、更なるＴＰ５３変異反応性Ｔ細胞は同定されなかった。対照的に、患者４２８５からの、ＴＩＬ研究においては存在しなかった、７の特有のｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}新抗原特異的ＴＣＲを、ＰＢＬから同定し、ＴＩＬに由来するＴＣＲは、ＰＢＬ集団には見られなかった。ＰＢＬ由来のＴＣＲ（４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ）の機能的アビディティは、ＴＩＬ由来のＴＣＲ（４２８５－ＴＩＬ－ＴＣＲ）と同等であり、ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ} ＬＰは１０ｎｇ／ｍＬまで認識され、ＷＴ ｐ５３^Ｒ１７５ ＬＰには応答しなかった（図２Ｃ～２Ｊ）。患者４１４１及び４２８５からのｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}新抗原特異的ＴＣＲＢクロノタイプの追跡により、開始ＰＢＬと比較した、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮後の指数関数的増幅が示された（図２Ｋ）。更に、患者４２８５からのＣＤＲ３Ｂ配列は、バルクＰＢＬにおける検出限界（２ｘ１０^５リードから＜０．００１％）未満であったが、ＩＶＳ及び４－１ＢＢ／ＯＸ４０濃縮後、ＣＤＲ３Ｂクロノタイプ全体の上位１０のうち４のＴＣＲを含む十分な頻度であった（表５）。患者４２６６からのｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}新抗原特異的ＴＣＲも、ＰＢＬにおける検出限界未満であったが、４２６６－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物中においては２．６％（４２６６－ＰＢＬ－ＴＣＲ３）及び７．５％（４２６６－ＰＢＬ－ＴＣＲ２）であった（図２Ｌ）。ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}新抗原に特異的なＴＣＲは、４２７３－ＣＤ４ ｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ培養において０．００２％から０．０１７％に濃縮された（図２Ｌ）。まとめると、データにより、ＰＢＬが、腫瘍内ＴＣＲと同一又は同等の、公開されているＴＰ５３変異に反応性のＴＣＲの、ソースになり得ることが実証された。

【0149】

実施例５
本実施例は、一般的なＨＬＡ拘束性要素及びｐ５３ネオエピトープが免疫原性であることを実証した。

【0150】

次いで、認識した最短のｐ５３ネオエピトープ及び対応するＨＬＡ拘束性を評価した。ＨＬＡマッピングを、以前の報告（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９）；Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２４（２２）：５５６２－７３（２０１８））と同様に、患者の個々のＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれに対応するＤＮＡプラスミドをＣＯＳ７サル細胞株（ＨＬＡを欠く）にトランスフェクションし、ペプチドをパルスするか、ＴＭＧと共トランスフェクションすることによって達成した。４１４１－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物は、４－１ＢＢ発現によって測定したところ、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１（米国人集団において非常に頻繁なＨＬＡ）の関係でｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ} ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号９６）ネオエピトープに特異的であった（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｐ．Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｉｎｔ．，１５（４）：１８０－８（２０１７））（図３Ａ）。ＨＬＡ－Ａ^＊６８：０１は、ＩＦＮγ分泌によって測定したところ、ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物によって認識されたｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}ネオエピトープＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲ（配列番号９８）を拘束した（図３Ｂ）。このことは、患者４１４１及び４２６６におけるＴＩＬからのＴＣＲが、これらのＩＶＳ培養物中において発見され、最短のネオエピトープ及びＨＬＡ制限要素が既に確立されていたため、予期されていた（Ｍａｌｅｋｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２９（３）：１１０９－１４（２０１９））。同様に、４２７３－ＰＢＬ－ＴＣＲは、４２７３－ＣＤ４ ｐ５３－ＬＰ－ＩＶＳ培養物中において発見され、ＴＩＬ研究から公知のｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}及びＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０２：０１との組み合わせがあった。患者４２８５についてのＰＢＬとＴＩＬの間で、ＴＣＲが異なっているとしても、４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物は、ＴＩＬ中において発見した、同一のｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}及び、ＨＬＡ－ＤＢＲ１^＊１３：０１の組み合わせに特異的であった（図３Ｃ）。更に、全ての４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲはｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}及びＨＬＡ－ＤＢＲ１^＊１３：０１に特異的であり、ＴＣＲＢシークエンシングにより、全て、４２８５－ＣＤ４ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物に存在していた（表５；図４）。１４アミノ酸が重なり合う、１５アミノ酸のｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}ペプチドを患者４２８５からのＤＣにパルスし、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と共培養し、コアペプチドＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ（配列番号２）が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１３：０１の関係で４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲによって認識される共通配列であると決定した（表６）。まとめると、同一のＨＬＡ及び最短ｐ５３ネオエピトープを認識するＰＢＬ中のＴＩＬから、同一のＴＣＲを３ケースにおいて発見し、１ケースにおいては、腫瘍内Ｔ細胞と同一のｐ５３新抗原特異性を有する更なるＴＣＲを発見した。

【0151】

【表6】

【0152】

実施例６
本実施例は、腫瘍細胞が、ＩＶＳ後のＰＢＬ由来Ｔ細胞によって認識される、ＨＬＡ上のｐ５３ネオエピトープをプロセシング及び提示することを実証する。

【0153】

腫瘍細胞表面上に発現した、自然にプロセシングされ提示された抗原を認識する能力について、ＴＰ５３変異反応性Ｔ細胞を評価した。Ｓａｏｓ２－Ｒ１７５Ｈ骨肉腫腫瘍細胞株（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１且つ全長ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}を過剰発現）及びＴＣ＃４２６６ヒト異種移植腫瘍細胞株（ｐ５３^{Ｒ２４８Ｗ}且つＨＬＡ－Ａ^＊６８：０１：０２結腸がん）をモデルとして用いた。一晩共培養後、４１４１－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ及び４２６６－ＣＤ８ ＴＰ５３－ＴＭＧ－ＩＶＳ培養物からのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、それぞれＳａｏｓ２－Ｒ１７５Ｈ及びＴＣ＃４２６６細胞株に応答して４－１ＢＢを上方制御した（クロスマッチ細胞株の活性化は僅かであった（図３Ｄ））。従って、ＰＢＬからのＴＰ５３変異特異的Ｔ細胞は、自然にプロセシングされ提示されたｐ５３ネオエピトープを持つ腫瘍細胞を認識できる。

【0154】

実施例７
本実施例は、実施例４において構築され、表６のヘッダー中に名付けられたＴＣＲのアミノ酸配列を示す。これらのＴＣＲのＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖の可変領域のアミノ酸配列を表７に示す。ＣＤＲを下線で示す。

【0155】

【表7-1】

【0156】

【表7-2】

【0157】

【表7-3】

【0158】

【表7-4】

【0159】

【表7-5】

【0160】

【表7-6】

【0161】

【表7-7】

【0162】

【化4】

【0163】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ１の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号６）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号７）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号８）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号３）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号４）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号５）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号１０）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号９）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号１２）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号１１）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0164】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ１のバリアントを、配列番号１８０に示す。バリアントは、配列番号１７８に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１７９に示す。

【0165】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ１の別のバリアントは、配列番号２０５に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２０６に示す。

【0166】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ１アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１４２に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１６０に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１４３に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１６１に示す。

【0167】

【化5】

【0168】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ２の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号１７）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号１８）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号１９）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号１４）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号１５）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号１６）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号２１）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号２０）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号２３）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号２２）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0169】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ２のバリアントを、配列番号１８３に示す。バリアントは、配列番号１８１に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１８２に示す。

【0170】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ２の別のバリアントは、配列番号２０７に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２０８に示す。

【0171】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ２アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１４４に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１６２に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１４５に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１６３に示す。

【0172】

【化6】

【0173】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ３の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号２８）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号２９）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号３０）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号２５）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号２６）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号２７）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号３２）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号３１）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号３４）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号３３）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0174】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ３のバリアントを、配列番号１８６に示す。バリアントは、配列番号１８４に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１８５に示す。

【0175】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ３の別のバリアントは、配列番号２０９に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２１０に示す。

【0176】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ３アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１４６に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１６４に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１４７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１６５に示す。

【0177】

【化7】

【0178】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ５の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号３９）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号４０）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号４１）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号３６）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号３７）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号３８）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号４３）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号４２）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号４５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号４４）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0179】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ５のバリアントを、配列番号１８９に示す。バリアントは、配列番号１８７に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１８８に示す。

【0180】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ５の別のバリアントは、配列番号２１１に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２１２に示す。

【0181】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ５アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１４８に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１６６に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１４９に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１６７に示す。

【0182】

【化8】

【0183】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ６の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号５０）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号５１）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号５２）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号４７）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号４８）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号４９）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号５４）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号５３）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号５６）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号５５）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0184】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ６のバリアントを、配列番号１９２に示す。バリアントは、配列番号１９０に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１９１に示す。

【0185】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ６の別のバリアントは、配列番号２１３に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２１４に示す。

【0186】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ６アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１５０に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１６８に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１５１に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１６９に示す。

【0187】

【化9】

【0188】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ７の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号６１）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号６２）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号６３）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号５８）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号５９）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号６０）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号６５）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号６４）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号６７）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号６６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0189】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ７のバリアントを、配列番号１９５に示す。バリアントは、配列番号１９３に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１９４に示す。

【0190】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ７の別のバリアントは、配列番号２１５に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２１６に示す。

【0191】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ７アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１５２に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１７０に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１５３に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１７１に示す。

【0192】

【化10】

【0193】

患者４２８５から単離したＴＣＲ ４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ９の配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号７２）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号７３）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号７４）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号６９）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号７０）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号７１）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号７６）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号７５）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号７８）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号７７）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0194】

野生型アルファ鎖シグナルペプチドを有する４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ９のバリアントを、配列番号１９８に示す。バリアントは、配列番号１９６に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号１９７に示す。

【0195】

４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ９の別のバリアントは、配列番号２１７に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２１８に示す。

【0196】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２８５－ＰＢＬ－ＴＣＲ９アルファ鎖及びベータ鎖の予測可変領域成熟配列を表７に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない成熟配列について予測されるアルファ鎖可変領域を配列番号１５４に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１７２に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測ベータ鎖可変領域を配列番号１５５に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１７３に示す。

【0197】

実施例８
本実施例は、患者４２５９からの腫瘍試料からのＴ細胞と、変異ｐ５３－Ｙ２２０Ｃペプチドとの共培養後に検出したＣＤ８^＋４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の頻度を実例で示す。

【0198】

４２５９－Ｆ１腫瘍断片培養物からのＣＤ８^＋Ｔ細胞の選別後、限界希釈によって、Ｔ細胞クローンを調製した。２４培養物を、ＤＭＳＯ（ペプチドビヒクル）、ＷＴ ｐ５３－Ｙ２２０ペプチド

【0199】

【化11】

【0200】

又はＭＵＴｐ５３－Ｙ２２０Ｃペプチド

【0201】

【化12】

【0202】

でパルスしたＴ２腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）と共培養した。一晩のインキュベーション後、細胞をＣＤ３、ＣＤ８、及び４－１ＢＢについて染色し、次いでフローサイトメトリーで分析した。培養物からのＣＤ８^＋４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の頻度を図５に示す。図５に示す通り、反応性Ｔ細胞クローンが得られた。

【0203】

実施例９
本実施例は、ｐ５３－Ｙ２２０Ｃ新抗原反応性Ｔ細胞受容体４２５９－Ｆ１－ＴＣＲの単離を実例で示す。

【0204】

ｐ５３－Ｙ２２０Ｃ及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１（実施例８の患者４２５９の断片培養物Ｆ１から）に特異性を有するＴＣＲの配列を決定することは困難であった。該配列は、古典的な単一細胞ＰＣＲ技術を用いて決定することができなかった。単一細胞ＰＣＲ技術の２の限界は、（１）それによりシークエンシングするのは超可変ＣＤＲ３領域を取り巻くＴＣＲ遺伝子の短い部分のみである（これにより研究者がＴＣＲのより多型性が少ない領域、例、可変ファミリー、を用いて残りのＴＣＲを推測できるようになる）こと、及び（２）サンガーシークエンシング法による機能的シークエンシングリードアウト得るために存在できる配列は１つだけであることである。これらの問題を、Ｔ細胞クローンを、希釈を抑制することによって作製すること、次いで５’ＲＡＣＥによって、全長ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ遺伝子を、発現したｍＲＮＡ転写産物としてシークエンシングすることにより回避した。次いで、ｐ５３－Ｙ２２０Ｃ及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に特異性を有するＴ細胞クロノタイプが、２のＴＣＲアルファ鎖及び２のＴＣＲベータ鎖を発現することを判定した。これは、１のＴＣＲアルファ及び１のＴＣＲベータのみを発現する殆どのＴ細胞とは対照的である。ＴＣＲベータ鎖の１方のみが機能的であり、これは、もう１方にフレームシフトが有り、未成熟終止コドンがもたらされるためである。更に、このＴＣＲベータ鎖（単一細胞ＰＣＲ及びＴＲＢＶ７－９ファミリーの（低解像度）Ａｄａｐｔｉｖｅ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＣＲＢサーベイシークエンシングによって報告された）は、ＴＲＢＶ７－９^＊０１ファミリーではなく、ＴＲＢＶ７－９^＊０３ファミリーのものであった。該２可変鎖間には非保存的アミノ酸置換（２６位のＮ又はＤ）が有り、このことはＴＲＢＶ７－９^＊０３の選択が有用であったことを示している（図９を参照）。同定された２の機能的ＴＣＲアルファ鎖が有り、そのうちの１方のみが機能的ＴＣＲベータと正しく対形成し、ｐ５３－Ｙ２２０Ｃ及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に対する特異性が付与された。

【0205】

ＴＣＲ対を再構築し、レトロウイルスベクターにクローン化した。非常に効率的な翻訳のための、より強力なコザック配列を有するように、２番目のアミノ酸残基をアラニン（Ａ）に変更した。ＴＣＲα鎖定常領域を、システイン置換、ＬＶＬ改変マウスα鎖定常領域に置換した。ＴＣＲβ鎖定常領域を、システイン置換マウスβ鎖定常領域に置換した。

【0206】

【化13】

【0207】

患者４２５９から単離したｐ５３－Ｙ２２０Ｃ新抗原反応性のＴＣＲ ４２５９－Ｆ１－ＴＣＲの配列を直上に示す。アミノ末端から開始して、最初の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号８３）であり、２番目の下線領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号８４）であり、３番目の下線領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号８５）であり、第４の下線領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号８０）であり、５番目の下線領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号８１）であり、第６の下線領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号８２）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、第１の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）であり、第２の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）である。ベータ鎖可変領域（配列番号８７）は、アミノ末端から始まり、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。アルファ鎖可変領域（配列番号８６）は、リンカーの直後に始まり、アルファ鎖定常領域の開始の直前に終わる配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号８９）は、アミノ末端から始まり、リンカーの開始の直前に終わる配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号８８）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。

【0208】

野生型シグナルペプチドを有するアルファ鎖を含む４２５９－Ｆ１－ＴＣＲのバリアントを、配列番号２０１に示す。バリアントは、配列番号１９９に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号２００に示す。

【0209】

４２５９－Ｆ１－ＴＣＲの別のバリアントは、配列番号２１９に記載の通りのベータ鎖可変領域（野生型シグナルペプチドを有する）を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２２０に示す。

【0210】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４２５９－Ｆ１－ＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖の可変領域のアミノ酸配列を表８に示す。ＣＤＲを下線で示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１７４に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１７５に示す。

【0211】

【表8】

【0212】

実施例１０
本実施例は、実施例９の４２５９－Ｆ１－ＴＣＲが、変異ｐ５３－Ｙ２２０Ｃペプチドを特異的に認識し、対応するＷＴペプチドはしないことを実証する。

【0213】

実施例９の４２５９－Ｆ１－ＴＣＲをドナー末梢血Ｔ細胞に形質導入し、次いで、漸減濃度の、ＷＴ ｐ５３－Ｙ２２０ペプチド

【0214】

【化14】

【0215】

又はＭＵＴ ｐ５３－Ｙ２２０Ｃペプチド

【0216】

【化15】

【0217】

のいずれかでパルスした、Ｔ２腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）と共培養した。一晩のインキュベーション後、共培養上清をＥＬＩＳＡによってインターフェロンガンマ分泌について分析した。結果を図６に示す。

【0218】

実施例１１
本実施例は、４２５９－Ｆ１－ＴＣＲがｐ５３－Ｙ２２０Ｃ（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によって提示）を発現する腫瘍細胞を特異的に認識することを実証する。

【0219】

ＴＣＲを発現しない（非形質導入）、ｐ５３－Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲを発現する、又は実施例９の４２５９－Ｆ１－ＴＣＲを発現するいずれかのＴ細胞を、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ｐ５３－Ｒ１７５Ｈ又はｐ５３－Ｙ２２０Ｃの発現の有り若しくは無しのいずれかで、腫瘍細胞と共培養した。一晩のインキュベーション後、細胞をＣＤ３、ＣＤ８、及び４－１ＢＢについて染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。培養物からのＣＤ８^＋４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の頻度を図７に示す。

【0220】

実施例１２
本実施例は、患者４１４１からのＴＣＲの単離及び特異的反応性を実例で示す。

【0221】

ｐ５３変異反応性ＴＩＬを有する患者の治療のまとめを表９に示す。

【0222】

【表9】

【0223】

自己ＡＰＣを、関係性のない変異、ＷＴ ｐ５３配列、又はＲ１７５Ｈを含む変異ｐ５３配列をコードするＴＭＧでトランスフェクションした。培地のみ、並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれネガティブ及びポジティブコントロールであった。翌日、患者４１４１（断片培養物１２）からのＴＩＬを、ＴＭＧをトランスフェクションしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。ＩＦＮ－γの分泌を、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。４－１ＢＢの発現を、リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４^－ＣＤ８^＋についてゲートした後のフローサイトメトリーにより評価した。結果を図１０に示す。

【0224】

Ｃｏｓ７細胞（ウェルあたり２．５ｘ１０^４）を平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。翌日、細胞を患者４１４１からの個々のＨＬＡ対立遺伝子と、追加遺伝子無し、ＷＴ ＴＰ５３ ＴＭＧ、又はｐ５３－Ｒ１７５Ｈ配列を含有する変異ＴＰ５３ＴＭＧのいずれかで、共トランスフェクションした。患者４１４１（断片培養物１２）からのｐ５３－Ｒ１７５Ｈに特異性を有するＴＩＬを、翌日、トランスフェクションしたＣｏｓ７細胞と共培養し、３７℃で一晩インキュベーションした。ＩＦＮ－γの分泌をＥＬＩＳＰＯＴにより評価した。結果を図１１に示す。

【0225】

モック（ＴＣＲ無し）又は４１４１－ＴＣＲ１ａ２を発現するＴ細胞を、Ｔ２腫瘍細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１を発現する）と共培養した。Ｔ２細胞を３７℃で２時間、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＷＴ ｐ５３－Ｒ１７５ペプチドＨＭＴＥＶＶＲＲＣ（配列番号９５）又は変異ｐ５３－Ｒ１７５ＨペプチドＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号９６）で構成される精製（ＨＰＬＣで＞９５％）ペプチドでパルスした。培地のみ、並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれネガティブ及びポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩行った。ＩＦＮ－γの分泌をＥＬＩＳＡで評価した。結果を図１２に示す。

【0226】

４１４１－ＴＣＲ１ａ２を発現するＴ細胞を、未操作か、又は全長ｐ５３－Ｒ１７５Ｈタンパク質を過剰発現するように作製したかの、いずれかのＳａｏｓ２細胞（ｐ５３－ＮＵＬＬ及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１＋）と３７℃で一晩共培養した。分泌阻害剤（モネンシン及びブレフェルジンＡ）を共培養物に加えて、Ｔ細胞内にサイトカインをトラップした。６時間の共培養後、細胞を固定して透過処理し、次いでＩＬ－２、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）について染色した。フローサイトメトリーを用いて、リンパ球のゲートに基づいて共培養物を分析した。結果を図１３に示す。

【0227】

患者４１４１から単離されたＴＣＲ ４１４１－ＴＣＲ１ａ２の配列を以下に示す。アミノ末端から開始して、１番目の下線の領域がＣＤＲ１アルファ（配列番号１３１）であり、２番目の下線の領域がＣＤＲ２アルファ（配列番号１３２）であり、３番目の下線の領域がＣＤＲ３アルファ（配列番号１３３）であり、４番目の下線の領域がＣＤＲ１ベータ（配列番号１３４）であり、５番目の下線の領域がＣＤＲ２ベータ（配列番号１３５）であり、６番目の下線の領域がＣＤＲ３ベータ（配列番号１３６）である。太字の領域はリンカー（配列番号９４）である。アミノ末端から開始して、１番目の斜体領域がアルファ鎖定常領域（配列番号９１）であり、２番目の斜体領域がベータ鎖定常領域（配列番号９３）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１３７）は、アミノ末端から開始し、アルファ鎖定常領域の開始直前に終了する配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１３８）は、リンカーの直後に開始し、ベータ鎖定常領域の開始の直前に終了する配列を含む。全長アルファ鎖（配列番号１３９）は、アミノ末端から開始し、リンカーの開始の直前で終了する配列を含む。全長ベータ鎖（配列番号１４０）は、リンカーの直後に開始し、カルボキシ末端で終了する配列を含む。

【0228】

がん反応性Ｔ細胞を、以下に記載の通り同定した。ＴＣＲは、以下に記載の通り単離した。
ＴＣＲ名：４１４１－ＴＣＲ１ａ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ１７５Ｈ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４１４１注入バッグのＴＩＬの、ｐ５３ｍｕｔＴＭＧとの共培養そしてＣＤ８＋４１ＢＢ＋ Ｔ細胞の選別
ＴＣＲを同定する方法：アルファ鎖用の、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ、次いでＴＡ ＴＯＰＯクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
ＴＣＲオリエンテーション：アルファ－ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン

【0229】

【化16】

【0230】

野生型シグナルペプチドを有するベータ鎖を含む４１４１－ＴＣＲ１ａ２のバリアントを、配列番号２０４に示す。バリアントは、配列番号２０２に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）ベータ鎖可変領域を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２０３に示す。

【0231】

野生型シグナルペプチドを有するアルファ鎖を含む４１４１－ＴＣＲ１ａ２の別のバリアントを、配列番号２２５に示す。該バリアントは、配列番号２２１に記載の通りのベータ鎖可変領域を含む。バリアントの全長ベータ鎖を、配列番号２２２に示す。該バリアントは、配列番号２２３に記載の通りに（野生型シグナルペプチドを有する）アルファ鎖可変領域を含む。バリアントの全長アルファ鎖を、配列番号２２４に示す。

【0232】

Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、４１４１－ＴＣＲ１ａ２アルファ鎖及びベータ鎖の可変領域のアミノ酸配列を表１０に示す。ＣＤＲを下線で示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない、予測全長アルファ鎖（アルファ鎖可変領域及び定常領域を含む）を配列番号１７６に示す。Ｎ末端シグナルペプチドを有さない予測全長ベータ鎖（ベータ鎖可変領域及び定常領域を含む）を、配列番号１７７に示す。

【0233】

【表10】

【0234】

患者４１４１からの４１４１－ＴＣＲ１ａ２の統計値を、以下の表１１に示す。

【0235】

【表11】

【0236】

ＴＣＲ ４１４１－ＴＣＲ１ａ２を単離し、Ｔ細胞中において発現させ、関連抗原に対して試験した。結果のまとめを表１２に示す。

【0237】

【表12】

【0238】

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組込まれる。

【0239】

本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１」）は、本明細書に特記しないか又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項から選択された１の事項（Ａ若しくはＢ）又は列挙した事項のうち２以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書に個々に記述されているかのように本明細書に組込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。

【0240】

発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜用いることを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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