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▶ シャンドン シムセラ バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-14
(45)【発行日】2025-02-25
(54)【発明の名称】抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250217BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250217BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250217BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20250217BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250217BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250217BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250217BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20250217BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250217BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20250217BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20250217BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20250217BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250217BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20250217BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250217BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250217BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250217BHJP
A61K 35/15 20250101ALI20250217BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250217BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250217BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250217BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250217BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20250217BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N5/0783
C12N5/10
A61P35/00
A61P37/06
A61P35/04
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P25/00
A61P25/02
A61P37/02
A61P21/04
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K48/00
A61K35/15
A61K35/17
A61P37/04
A61K39/395 U
A61K39/395 T
A61K39/395 G
A61K39/395 E
A61K47/68
A61K47/46
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2023546194
(86)(22)【出願日】2022-01-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-01
(86)【国際出願番号】 CN2022074228
(87)【国際公開番号】W WO2022161425
(87)【国際公開日】2022-08-04
【審査請求日】2023-08-07
(31)【優先権主張番号】202110140980.5
(32)【優先日】2021-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111016307.7
(32)【優先日】2021-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523287713
【氏名又は名称】シャンドン シムセラ バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＳＩＭＣＥＲＥ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハオ，シャオフェン
(72)【発明者】
【氏名】ル，シークァン
(72)【発明者】
【氏名】カオ，ジュオシァオ
(72)【発明者】
【氏名】タン，レンホン
(72)【発明者】
【氏名】レン，チンシェン
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／０８９４７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特許第７３７８５０９（ＪＰ，Ｂ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １５／１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＮＦＲ２に特異的に結合するヒト化抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、（１）前記重鎖可変領域は、配列番号２１、２２、２３、２４及び２５から選ばれるいずれかに示されるＶＨ配列
を含み、
（２）前記軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されるＶＬ配列
を含む、ことを特徴とする、
ＴＮＦＲ２に特異的に結合するヒト化抗体又は抗原結合断片。
【請求項2】
ヒト重鎖定常領域及び／又はヒト軽鎖定常領域を含む、ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗体またはその抗原結合断片は、治療剤又はトレーサーと結合している、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項4】
少なくとも第１の抗原結合モジュール及び第２の抗原結合モジュールを含み、前記第１の抗原結合モジュールは請求項１記載の抗体又は抗原結合断片を含み、前記第２の抗原結合モジュールはＴＮＦＲ２以外の他の抗原に特異的に結合するか、又は第１の抗原結合モジュールとは異なるＴＮＦＲ２エピトープに結合し、
前記他の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－２、ＣＴＬＡ４、ＰＲＶＩＧ、ＴＩＧＨＴ、ＨＡＳ、ＣＬＤＮ１８．２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ、Ｉａ、ＨＬＡ－ＤＲ、テネイシン、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子産物、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１又はＴＲＡＩＬ－Ｒ２から選ばれる、ことを特徴とする、
多重特異性抗原結合分子。
【請求項5】
細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞外抗原結合ドメインは、請求項１～３のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ２ヒト化抗体又は抗原結合断片を含む、ことを特徴とする、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項6】
免疫エフェクター細胞であって、前記免疫エフェクター細胞は、請求項５に記載のキメラ抗原受容体を含むか、又は請求項５に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸断片を含む、ことを特徴とする、免疫エフェクター細胞。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードする、ことを特徴とする、単離された核酸断片。
【請求項8】
請求項７に記載の免疫エフェクター細胞をインビトロで調製する方法であって、前記方法は、請求項６に記載のＣＡＲをコードする核酸断片を前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、任意に、前記方法は、前記免疫エフェクター細胞による請求項５に記載のＣＡＲの発現を開始することを更に含む、ことを特徴とする、方法。
【請求項9】
医薬組成物であって、前記組成物は、請求項１～３の何れか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、請求項４に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項５に記載のキメラ抗原受容体、請求項６に記載の免疫エフェクター細胞、又は請求項７に記載の核酸断片を含む、ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項10】
請求項１～３の何れか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、請求項４に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項５に記載のキメラ抗原受容体、請求項６に記載の免疫エフェクター細胞、又は請求項７に記載の核酸断片を含む、免疫異常に関連する疾患を治療及び／又は予防するための薬物であって、
前記疾患は、癌又は自己免疫疾患である、ことを特徴とする、
薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品分野及びバイオエンジニアリング分野に関し、具体的には、抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体又はその抗原結合断片、並びに前記抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体又はその抗原結合断片の医薬組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫は体の防御反応であり、多くの遺伝子、タンパク質、細胞の影響を受ける。免疫異常は、腫瘍、免疫不全（エイズなど）、アレルギー、関節リウマチなどの疾患を含む多くの疾患を引き起こす可能性がある。ここ数年、腫瘍免疫療法は新しい治療法として登場し、腫瘍治療研究分野で大きなホットトピックとなっている。免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体などのアンタゴニスト抗体は、複数種の種類の癌の治療に使用されており、且つ悪性腫瘍患者の生存期間を大幅に延長する革命的な結果をもたらしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかし、免疫チェックポイントタンパク質に対するアンタゴニスト抗体治療に未応答であるか、又は一時的な治療後に抵抗性や耐性を生じる癌患者はまだ多く存在している。そのため、有効性と安全性を更に向上させるために、単独で、又は免疫チェックポイントタンパク質に対するアンタゴニスト抗体を含む他の腫瘍治療法と組み合わせて使用できる、癌治療の新規薬物を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者は、ヒトＴＮＦＲ２がヒトＴｒｅｇ及び複数種のヒト腫瘍細胞の表面で過剰発現されることを発見し、ヒトＴＮＦＲ２が患者の腫瘍発生を促進し、腫瘍微小環境において免疫抑制及び免疫逃避を媒介する可能性を示唆した。ＴＮＦＲ２を介してＴｒｅｇ細胞の機能を調節し、腫瘍の発生を抑制することは、非常に潜在力がある抗腫瘍戦略であると考えられる。本発明者は、１）ＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＴＮＦＲ２とそのリガンドＴＮＦαの結合を遮断することによって、Ｔｒｅｇ細胞の増殖及びその媒介性の阻害機能を阻害し、エフェクターＴ細胞の増幅、及びエフェクターＴ細胞や他の免疫細胞媒介性抗腫瘍機能を促進することができる、２）ＴＮＦＲ２はヒト腫瘍細胞株で高度に発現されるため、この抗体もＴＮＦＲ２の高発現腫瘍細胞に対する殺傷効果を直接的に媒介することができる、３）既存の抗ＰＤ－１／Ｌ１と併用するとより良い抗腫瘍効果を持ち、持続的な免疫記憶を形成することができる、ＴＮＦＲ２に対するアンタゴニスト抗体を調製した。前記抗ＴＮＦＲ２に対するアンタゴニスト抗体の説明については、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１０６０５７を参照されたい（その全体は参照により本願に組み込まれる）。
【0005】
本発明は、抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体又はその抗原結合断片を提供し、並びに前記抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体又はその抗原結合断片の医薬組成物及びその使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】被験抗体とヒトＴＮＦＲ２組換えタンパク質との結合能を示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ＃００１、＃２１９、＃２２４被験抗体のヒト化分子とヒトＴＮＦＲ２組換えタンパク質との結合能を示し、そのうち、ＷＴはヒト－マウスキメラ野生型分子であり、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ＷＴ）アイソタイプ対照抗体は、この実験の陰性対照である。
【図2】被験抗体とカニクイザルＴＮＦＲ２組換えタンパク質との結合能を示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ＃００１、＃２１９、＃２２４被験抗体のヒト化分子とカニクイザルＴＮＦＲ２組換えタンパク質との結合能を示し、そのうち、ＷＴはヒト－マウスキメラ野生型分子であり、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ＷＴ）アイソタイプ対照抗体は、この実験の陰性対照である。
【図3】被験抗体と、ヒトＴＮＦＲ２を高度に発現するＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞との結合能を示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ＃００１、＃２１９、＃２２４被験抗体のヒト化分子とＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞との結合能を示し、そのうち、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ＷＴは陰性アイソタイプ対照抗体である。
【図4】被験抗体とＴｒｅｇ細胞との結合能を示す。Ａ及びＢは、それぞれ＃００１、＃２１９被験抗体のヒト化分子がＴｒｅｇに結合するオーバーレイグラフである。中空ピークはａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ＷＴアイソタイプ対照抗体の結合図であり、中実ピークは各抗体とＴｒｅｇ細胞との結合図であり、Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ－ＰＥ ｏｎｌｙとＵｎｓｔａｉｎｅｄ（抗体を加えていないブランク細胞対照）はいずれも陰性対照であり、抗体濃度は２００ｎｇ／ｍＬである。
【図5】被験抗体と活性化カニクイザルＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞との結合を示す。Ａは被験抗体がそれぞれ２μｇ／ｍＬ及び０．２μｇ／ｍＬの濃度でカニクイザルのＣＤ８＋Ｔに結合するオーバーレイグラフである。Ｂは被験抗体がそれぞれ２μｇ／ｍＬ及び０．２μｇ／ｍＬの濃度でカニクイザルのＣＤ８＋Ｔに結合する平均蛍光強度の倍数（被験サンプルの結合平均蛍光強度と二次抗体のみを加えた平均蛍光強度との比）である。そのうち、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ａｎｔｉ－Ｈｅｌ）アイソタイプ対照抗体は、この実験の陰性対照である。
【図6】被験抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２組換えタンパク質との相互作用を阻害することを示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ＃００１、＃２１９、＃２２４被験抗体のヒト化分子によるＴＮＦα－ＴＮＦＲ２の阻害であり、そのうち、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ａｎｔｉ－Ｈｅｌ）アイソタイプ対照抗体は、この実験の陰性対照である。
【図7】被験抗体がヒトＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞によって発現されるヒトＴＮＦＲ２との相互作用を阻害することを示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ＃００１、＃２１９、＃２２４被験抗体のヒト化分子がＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２との相互作用を阻害することであり、そのうち、ａｎｔｉ－Ｈｅｌは陰性アイソタイプ対照抗体である。
【図8】ＴＮＦα誘導ＩκＢαの分解に対する被験抗体の阻害効果を示す。Ａはこの実験のゲーティング戦略である。ＢはＴＮＦα誘導ＩκＢαの分解に対する被験抗体の阻害効果を示し、左のグラフは、様々な濃度の抗体対ＩκＢαlowのパーセントの棒グラフであり、右のグラフは、抗体濃度勾配対ＩκＢαlowのパーセントの陰性対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌの倍数に対する変化である。抗体の試験濃度はそれぞれ０．２５、２．５、及び２５μｇ／ｍＬであり、そのうち、ｃｅｌｌ ｃｏｎｔｒｏｌは何も処理していないＴｒｅｇ細胞を指し、ＴＮＦは１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで処理したＴｒｅｇ細胞を指し、Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ－ＰＥはＡｎｔｉ－ＩκＢα－ＰＥ抗体の陰性アイソタイプ対照（ａｎｔｉ－Ｈｅｌ）である。被験抗体の各濃度は、陰性アイソタイプ対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌと比較して統計学的差異を有する（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｔｗｏ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。
【図9】ＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖に対する被験抗体の阻害を示す。Ａは異なる被検抗体と陰性アイソタイプ対照ａｎｔｉ－ＨｅｌがＴｒｅｇ増殖に及ぼす影響のオーバーレイグラフであり、そのうち、破線はａｎｔｉ－Ｈｅｌであり、実線は被験抗体である。ＢはＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する異なる抗体の阻害効果を示し、縦軸はＴｒｅｇ増殖パーセントであり、横軸は被験抗体である。そのうち、Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（即ち、薬物処置なし）とａｎｔｉ－Ｈｅｌは本実験系の陰性対照である。各抗体の実験濃度は１２．５μｇ／ｍＬである。各被験抗体は、陰性アイソタイプ対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌと比較して統計学的差異を有する（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。
【図10】Ｔｃｏｎ細胞増殖に対するＴｒｅｇの阻害活性に対する被験抗体の阻害効果を示す。Ａは異なる被検抗体と陰性アイソタイプ対照ａｎｔｉ－ＨｅｌがＴｃｏｎ細胞増殖に対するＴｒｅｇの阻害に及ぼす影響のオーバーレイグラフであり、そのうち、破線はａｎｔｉ－Ｈｅｌであり、実線は被験抗体である。ＢはＴｃｏｎ細胞増殖を阻害するＴｒｅｇに対する異なる抗体の阻害効果を示し、縦軸はＴｃｏｎ細胞増殖パーセントであり、横軸は被験抗体である。そのうち、Ｎｏ ｔｒｅａｔ（即ち、薬物処置なし）とＡｎｔｉ－Ｈｅｌは本実験系の陰性対照であり、Ｔｃｏｎ＋ｂｅａｄｓはＴｒｅｇ細胞の非存在下でのＴｃｏｎ増殖であり、実験系の陽性対照である。各抗体の実験濃度は１２．５μｇ／ｍＬである。各被験抗体は、陰性アイソタイプ対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌと比較して統計学的差異を有する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。
【図11】被験抗体のＡＤＣＣ殺傷効果を示す。Ａは被験抗体のＴｒｅｇに対するＡＤＣＣ殺傷効果を示す。Ｂは被験抗体のヒトＴＮＦＲ２を高度に発現するＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果を示す。そのうち、ａｎｔｉ－Ｈｅｌは陰性対照抗体である。
【図12A】ｈＴＮＦＲ２トランスジェニックマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）の血液免疫細胞におけるｈＴＮＦＲ２及びｍＴＮＦＲ２の発現同定を示す。１２Ａは、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ（ｈＴＮＦＲ２－ＧＥＭＭとも呼ばれ）マウスの血液中の免疫細胞のＦＡＣＳゲーティング戦略、及びゲーティングされたＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞やＴｒｅｇ細胞におけるｍＴＮＦＲ２とｈＴＮＦＲ２の発現レベル、並びにゲーティングのＦＭＯ対照（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【図12B】ｈＴＮＦＲ２トランスジェニックマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）の血液免疫細胞におけるｈＴＮＦＲ２及びｍＴＮＦＲ２の発現同定を示す。１２Ｂは、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ及びＢａｌｂ／ｃ野生型マウスの血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞におけるｍＴＮＦＲ２とｈＴＮＦＲ２の発現レベルを示すヒストグラムであり、点線：ｉｓｏｔｙｐｅ、破線：ＢＡＬＢ／ｃ ｍｏｕｓｅ、実線：ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ。
【図12C】ｈＴＮＦＲ２トランスジェニックマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）の血液免疫細胞におけるｈＴＮＦＲ２及びｍＴＮＦＲ２の発現同定を示す。１２Ｃは、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ及びＢａｌｂ／ｃ野生型マウスの血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞におけるｍＴＮＦＲ２とｈＴＮＦＲ２の平均蛍光強度の統計グラフである。
【図13A】ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ（図中ＧＥＭＭと略記）マウスのｍＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖を阻害することを示す。１３Ａは、ＧＥＭＭマウス及び野生型ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓におけるヒトＴＮＦＲ２及びマウスＴＮＦＲ２を発現するＴｒｅｇ細胞のレベルを示す。
【図13B】ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ（図中ＧＥＭＭと略記）マウスのｍＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖を阻害することを示す。１３Ｂ及び１３Ｃは、活性化剤（Ｂ）の非存在下又は活性化剤（Ｃ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で、被験ＴＮＦＲ２抗体によるＧＥＭＭマウス又はＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスのｍＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖の阻害効果を示す。各抗体の実験濃度は１０μｇ／ｍＬである。各被験抗体は、陰性アイソタイプ対照と比較して統計学的差異を有する（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。
【図13C】ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ（図中ＧＥＭＭと略記）マウスのｍＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖を阻害することを示す。１３Ｂ及び１３Ｃは、活性化剤（Ｂ）の非存在下又は活性化剤（Ｃ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で、被験ＴＮＦＲ２抗体によるＧＥＭＭマウス又はＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスのｍＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ細胞増殖の阻害効果を示す。各抗体の実験濃度は１０μｇ／ｍＬである。各被験抗体は、陰性アイソタイプ対照と比較して統計学的差異を有する（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。
【図14】抗ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスの腫瘍成長を用量依存的に阻害することを示す。Ａ及びＢはそれぞれ、２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ２ａと００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ２ａが、３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの用量で投与すると、Ｖｅｈｉｃｌｅ対照群と比較して、ＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ腫瘍成長を用量依存的に阻害できることを示す。
【図15】抗ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスの腫瘍成長を阻害する一方で、マウスの体重減少を引き起こさないことを示す。Ａ～Ｂは異なる用量の２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ２ａ又は００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ２ａを投与した後のマウスの絶対体重の変化を示す。図Ｃ～Ｄは異なる用量の２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ２ａ又は００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ２ａを投与した後のマウスの体重の変化率を示す。
【図16】抗ＴＮＦＲ２抗体が、ヒトＰＢＭＣ免疫再構成ヒト化マウス結腸癌腫瘍モデルにおける２つの異なるＰＢＭＣドナーで腫瘍成長を有意に阻害することができることを示す。Ａはｄｏｎｏｒ＃１９３において、抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１が有意な有効性を有することを示す。Ｂはｄｏｎｏｒ＃２７２において、腫瘍接種後２９日目に、対照抗体群と比較して、００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１、及びＫｅｙｔｒｕｄａ群の腫瘍成長がすべて有意に阻害され、統計的差異を有する（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、ｖｓ．ｉｓｏｔｙｐｅ、Ｔｗｏ Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）ことを示す。図Ｃ～Ｄは、ｄｏｎｏｒ＃１９３とｄｏｎｏｒ＃２７２において、対照群と投与群のマウスがすべて体重減少したことを示す。
【図17】抗ＴＮＦＲ２抗体が、腫瘍浸潤免疫細胞ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ細胞の比率を顕著に増加することができることを示す。Ａは腫瘍浸潤ＴＩＬにおけるＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、及びＴｒｅｇ細胞のゲーティング戦略を示す。Ｂはｄｏｎｏｒ＃１９３において、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体、００１－Ｈｕ３抗体、及び２１９－Ｈｕ１抗体で治療した後の腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）におけるＣＤ４５＋細胞に対するＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、及びＴｒｅｇの割合を示す。Ｃはｄｏｎｏｒ＃１９３において、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体、００１－Ｈｕ３抗体、及び２１９－Ｈｕ１抗体で治療した後のＴＩＬにおける腫瘍組織１ｍｇ当たりのＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ及びＴｒｅｇの絶対数を示す。Ｄはｄｏｎｏｒ＃１９３において、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体、００１－Ｈｕ３抗体、及び２１９－Ｈｕ１抗体で治療した後のＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇの比率を示す。Ｅはｄｏｎｏｒ＃２７２において、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体、００１－Ｈｕ３抗体、及び２１９－Ｈｕ１抗体で治療した後のＴＩＬにおけるＣＤ４５＋細胞に対するＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、及びＴｒｅｇの割合を示す。Ｆはｄｏｎｏｒ＃２７２において、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体、００１－Ｈｕ３抗体、及び２１９－Ｈｕ１抗体で治療した後のＴＩＬにおける腫瘍組織１ｇ当たりのＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ及びＴｒｅｇの絶対数を示す。Ｇは、ｄｏｎｏｒ＃２７２において、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体、００１－Ｈｕ３抗体及び２１９－Ｈｕ１抗体で治療した後の腫瘍浸潤ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇの比率（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図18】ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ－ＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌モデルにおける各治療群の腫瘍体積変化曲線を示す。
【図19】ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ－ＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌モデルにおける各治療群の動物の体重変化曲線を示す。この図は異なる用量の２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体又は併用ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１抗体を投与した後のマウスの絶対体重の変化を示す。
【図20】ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ－ＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌モデルにおける各治療群の動物の体重変化率の曲線を示す。この図は異なる用量の２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体又は併用ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１抗体を投与した後のマウスの体重変化率を示す。
【図21】ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ－ＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌モデルにおける各治療群の実験終了点での腫瘍体重変化を示す。この図は異なる用量の２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体又は併用ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１抗体を投与した後、実験終了点で腫瘍を分離して重量を測定する腫瘍重量の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
第１の態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するヒト化抗体又は抗原結合断片を含み、前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
（１）前記重鎖可変領域は、
ａ．配列番号１９～２７から選ばれるいずれかに示されるＶＨ配列、
ｂ．配列番号１９～２７から選ばれるいずれかの配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列、又は、
ｃ．配列番号１９～２７から選ばれるいずれかの配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＶＨ配列、
を含み、
（２）前記軽鎖可変領域は、
ａ．配列番号２８～３７から選ばれるいずれかに示されるＶＬ配列、
ｂ．配列番号２８～３７から選ばれるいずれかの配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は、
ｃ．配列番号２８～３７から選ばれるいずれかの配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＶＬ配列、
を含み、
任意に、前記アミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換は、重鎖可変領域又は／及び軽鎖可変領域のＦＲ領域に生じ、
任意に、前記置換は保存的アミノ酸置換である。
（１）前記重鎖可変領域は、
ａ．配列番号１９～２７から選ばれるいずれかに示されるＶＨ配列、
ｂ．配列番号１９～２７から選ばれるいずれかの配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列、又は、
ｃ．配列番号１９～２７から選ばれるいずれかの配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＶＨ配列、
を含み、
（２）前記軽鎖可変領域は、
ａ．配列番号２８～３７から選ばれるいずれかに示されるＶＬ配列、
ｂ．配列番号２８～３７から選ばれるいずれかの配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は、
ｃ．配列番号２８～３７から選ばれるいずれかの配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＶＬ配列、
を含み、
任意に、前記アミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換は、重鎖可変領域又は／及び軽鎖可変領域のＦＲ領域に生じ、
任意に、前記置換は保存的アミノ酸置換である。
【0008】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、配列番号１９～２７のいずれかの配列と比較してＣＤＲが完全に一致し、ＦＲが少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２８～３７のいずれかの配列と比較してＣＤＲが完全に一致し、ＦＲが少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、
（１）配列番号１９に示されるＶＨと配列番号２８に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（２）配列番号２０に示されるＶＨと配列番号２９に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（３）配列番号１９に示されるＶＨと配列番号３０に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（４）配列番号２０に示されるＶＨと配列番号３１に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（５）配列番号１９に示されるＶＨと配列番号３１に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（６）配列番号２１に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（７）配列番号２２に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（８）配列番号２３に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（９）配列番号２４に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１０）配列番号２５に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１１）配列番号２６に示されるＶＨと配列番号３３に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１２）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３４に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１３）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３５に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１４）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３３に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１５）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３６に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１６）配列番号２６に示されるＶＨと配列番号３４に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１７）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３７に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１８）前記（１）～（１７）のいずれかの配列の組み合わせと比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨとＶＬの組み合わせ、
（１９）前記（１）～（１７）のいずれかの配列の組み合わせと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＶＨとＶＬの組み合わせ、又は、
（２０）前記（１）～（１７）のいずれかの配列の組み合わせと比較して、ＣＤＲが完全に一致し、ＦＲが少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨとＶＬの組み合わせ、
から選ばれ、
任意に、前記アミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換は、重鎖可変領域又は／及び軽鎖可変領域のＦＲ領域に生じ、
任意に、前記置換は保存的アミノ酸置換である。
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、
（１）配列番号１９に示されるＶＨと配列番号２８に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（２）配列番号２０に示されるＶＨと配列番号２９に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（３）配列番号１９に示されるＶＨと配列番号３０に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（４）配列番号２０に示されるＶＨと配列番号３１に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（５）配列番号１９に示されるＶＨと配列番号３１に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（６）配列番号２１に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（７）配列番号２２に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（８）配列番号２３に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（９）配列番号２４に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１０）配列番号２５に示されるＶＨと配列番号３２に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１１）配列番号２６に示されるＶＨと配列番号３３に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１２）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３４に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１３）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３５に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１４）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３３に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１５）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３６に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１６）配列番号２６に示されるＶＨと配列番号３４に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１７）配列番号２７に示されるＶＨと配列番号３７に示されるＶＬを有する組み合わせ、
（１８）前記（１）～（１７）のいずれかの配列の組み合わせと比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨとＶＬの組み合わせ、
（１９）前記（１）～（１７）のいずれかの配列の組み合わせと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＶＨとＶＬの組み合わせ、又は、
（２０）前記（１）～（１７）のいずれかの配列の組み合わせと比較して、ＣＤＲが完全に一致し、ＦＲが少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨとＶＬの組み合わせ、
から選ばれ、
任意に、前記アミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換は、重鎖可変領域又は／及び軽鎖可変領域のＦＲ領域に生じ、
任意に、前記置換は保存的アミノ酸置換である。
【0009】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１、７又は１３から選ばれるＣＤＲ１－ＶＨと、配列番号２、８又は１４から選ばれるＣＤＲ２－ＶＨと、配列番号３、９又は１５から選ばれるＣＤＲ３－ＶＨと、配列番号４、１０又は１６から選ばれるＣＤＲ１－ＶＬと、配列番号５、１１又は１７から選ばれるＣＤＲ２－ＶＬと、及び配列番号６、１２又は１８から選ばれるＣＤＲ３－ＶＬと、を含む。
【0010】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦＲ２に対する結合について７ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有し、カニクイザルＴＮＦＲ２に対する結合について５ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0011】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を含むか又は含まなく、好ましくは、前記重鎖定常領域は、全長重鎖定常領域又はその断片を含み、前記断片はＣＨ１ドメイン、Ｆｃドメイン又はＣＨ３ドメインから選ばれてもよく、好ましくは、前記重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域及び／又はヒト軽鎖定常領域であり、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ２重鎖定常領域、ＩｇＧ３重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域などのＩｇＧ重鎖定常領域から選ばれてもよく、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域又はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域である。
【0012】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、天然抗体、工学操作された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、全長抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）から選ばれる。
【0013】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、別の分子をリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して又は介さずに結合させ、好ましくは、前記別の分子は治療剤又はトレーサーから選ばれてもよく、好ましくは、前記治療剤は放射性同位体、化学療法剤又は免疫調節剤から選ばれ、前記トレーサーは放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤又は光増感剤から選ばれる。
【0014】
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、以下の特性を有する。
（１）細胞表面にＴＮＦＲ２を発現する細胞に特異的に結合すること、（２）Ｔｒｅｇ細胞に特異的に結合すること、（３）ＴＮＦαとＴＮＦＲ２タンパク質の結合を阻害すること、（４）ＴＮＦαと細胞表面に発現するＴＮＦＲ２の結合を阻害すること、（５）ＴＮＦα媒介Ｔｒｅｇ増殖及び／又はＴｒｅｇ機能を阻害すること、（６）ＴＮＦα媒介ＩκＢαの分解を阻害すること、（７）ＴｒｅｇによるＴｃｏｎ細胞増殖の阻害を阻害すること、（８）ＴＮＦＲ２発現細胞に対するＡＤＣＣ機能を媒介すること、（９）腫瘍浸潤免疫細胞ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ細胞の比率を増加させること、又は／及び（１０）腫瘍の成長を阻害することである。
（１）細胞表面にＴＮＦＲ２を発現する細胞に特異的に結合すること、（２）Ｔｒｅｇ細胞に特異的に結合すること、（３）ＴＮＦαとＴＮＦＲ２タンパク質の結合を阻害すること、（４）ＴＮＦαと細胞表面に発現するＴＮＦＲ２の結合を阻害すること、（５）ＴＮＦα媒介Ｔｒｅｇ増殖及び／又はＴｒｅｇ機能を阻害すること、（６）ＴＮＦα媒介ＩκＢαの分解を阻害すること、（７）ＴｒｅｇによるＴｃｏｎ細胞増殖の阻害を阻害すること、（８）ＴＮＦＲ２発現細胞に対するＡＤＣＣ機能を媒介すること、（９）腫瘍浸潤免疫細胞ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ細胞の比率を増加させること、又は／及び（１０）腫瘍の成長を阻害することである。
【0015】
第２の態様において、本発明は、少なくとも第１の抗原結合モジュール及び第２の抗原結合モジュールを含む多重特異性抗原結合分子を含み、前記第１の抗原結合モジュールは本発明に記載の抗体又は抗原結合断片を含み、前記第２の抗原結合モジュールはＴＮＦＲ２以外の他の抗原に特異的に結合するか、又は第１の抗原結合モジュールとは異なるＴＮＦＲ２エピトープに結合し、好ましくは、前記他の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－２、ＣＴＬＡ４、ＰＲＶＩＧ、ＴＩＧＨＴ、ＨＡＳ、ＣＬＤＮ１８．２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ、Ｉａ、ＨＬＡ－ＤＲ、テネイシン、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子産物、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１又はＴＲＡＩＬ－Ｒ２から選ばれ、好ましくは、前記多重特異性抗体は、「二重特異性」、「三重特異性」又は「四重特異性」である。
第３の態様において、本発明は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記細胞外抗原結合ドメインは、本発明の第１の態様に記載のＴＮＦＲ２ヒト化抗体又は抗原結合断片を含むか、又は本発明の第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子を含む。
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載のキメラ抗原受容体を含むか又は本発明の第３の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸断片を含む免疫エフェクター細胞を含み、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、ＮＫＴ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、単核細胞、マクロファージ、樹状細胞又はマスト細胞から選ばれ、前記Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はヘルパーＴ細胞から選ばれてもよく、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞又は自己免疫細胞である。
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のＴＮＦＲ２ヒト化抗体又は抗原結合断片、第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子、又は第３の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸断片を含む。
第６の態様において、本発明は、第５の態様に記載の核酸断片を含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を含む。
第７の態様において、本発明は、第６の態様に記載のベクターを含む宿主細胞を含み、好ましくは、前記細胞は、細菌（大腸菌）、真菌（酵母）、昆虫細胞又は哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞株又は２９３Ｔ細胞株）等の原核細胞又は真核細胞であり、好ましくは、前記細胞はフコシルトランスフェラーゼを欠き、より好ましくは、前記フコシルトランスフェラーゼはＦＵＴ８である。
第３の態様において、本発明は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記細胞外抗原結合ドメインは、本発明の第１の態様に記載のＴＮＦＲ２ヒト化抗体又は抗原結合断片を含むか、又は本発明の第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子を含む。
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載のキメラ抗原受容体を含むか又は本発明の第３の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸断片を含む免疫エフェクター細胞を含み、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、ＮＫＴ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、単核細胞、マクロファージ、樹状細胞又はマスト細胞から選ばれ、前記Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はヘルパーＴ細胞から選ばれてもよく、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞又は自己免疫細胞である。
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のＴＮＦＲ２ヒト化抗体又は抗原結合断片、第２の態様に記載の多重特異性抗原結合分子、又は第３の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸断片を含む。
第６の態様において、本発明は、第５の態様に記載の核酸断片を含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を含む。
第７の態様において、本発明は、第６の態様に記載のベクターを含む宿主細胞を含み、好ましくは、前記細胞は、細菌（大腸菌）、真菌（酵母）、昆虫細胞又は哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞株又は２９３Ｔ細胞株）等の原核細胞又は真核細胞であり、好ましくは、前記細胞はフコシルトランスフェラーゼを欠き、より好ましくは、前記フコシルトランスフェラーゼはＦＵＴ８である。
【0016】
第８の態様において、本発明は、本発明のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、又は本発明に記載の多重特異性抗原結合分子を調製するための方法を含み、前記方法は、第７の態様に記載の細胞を培養すること、及び前記細胞によって発現される抗体若しくは抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子を単離することを含む。
第９の態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞を調製するための方法を含み、前記方法は、前記ＣＡＲをコードする核酸断片を前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、任意に、前記方法は、前記免疫エフェクター細胞による前記ＣＡＲの発現を開始することを更に含む。
第９の態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞を調製するための方法を含み、前記方法は、前記ＣＡＲをコードする核酸断片を前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、任意に、前記方法は、前記免疫エフェクター細胞による前記ＣＡＲの発現を開始することを更に含む。
【0017】
第１０の態様において、本発明は、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片、本発明に記載の多重特異性抗原結合分子、本発明に記載のキメラ抗原受容体、本発明に記載の免疫エフェクター細胞、本発明に記載の核酸断片、本発明に記載のベクター、本発明に記載の細胞、及び本発明に記載の方法によって調製された生成物を含む医薬組成物を含み、好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容されるキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）、希釈剤又はアジュバントを更に含み、好ましくは、前記組成物は、追加の抗腫瘍剤、免疫治療剤又は免疫抑制剤を更に含み、好ましくは、前記追加の抗腫瘍剤は、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体又はＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる。
第１１の態様において、本発明は、免疫異常に関連する疾患を治療及び／又は予防するための薬物の調製における前記抗体又は抗原結合断片、前記多重特異性抗原結合分子、前記キメラ抗原受容体、前記免疫エフェクター細胞、前記核酸断片、前記ベクター、前記細胞、前記方法によって調製された生成物、及び前記医薬組成物の使用を含み、好ましくは、前記免疫異常に関連する疾患は、Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＭＤＳＣ機能に関連する疾患であり、好ましくは、前記疾患は、癌又は自己免疫疾患であり、好ましくは、前記癌は、卵巣癌、進行性表皮Ｔ細胞リンパ腫、ステージIII／IV転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び／又は転移性黒色腫などのＣＴＬＡ－４とＰＤ－１療法に対して耐性を有する進行固形腫瘍から選ばれ、好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム障害、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、ＩｇＧ４関連疾患から選ばれてもよい。
第１２の態様において、本発明は、免疫異常に関連する疾患を治療及び／又は予防するための方法を含み、前記方法は、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片、前記多重特異性抗原結合分子、前記キメラ抗原受容体、前記免疫エフェクター細胞、前記核酸断片、前記ベクター、前記細胞、前記方法によって調製された生成物、及び前記医薬組成物の有効量を受検者に投与することを含み、好ましくは、前記免疫異常に関連する疾患は、Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＭＤＳＣ機能に関連する疾患であり、好ましくは、前記疾患は、癌又は自己免疫疾患であり、好ましくは、前記癌は、卵巣癌、進行性表皮Ｔ細胞リンパ腫、ステージIII／IV転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び／又は転移性黒色腫などのＣＴＬＡ－４とＰＤ－１療法に対して耐性を有する進行固形腫瘍から選ばれ、好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム障害、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、ＩｇＧ４関連疾患から選ばれてもよい。
第１３の態様において、本発明はまた、追加の抗腫瘍治療を前記対象に投与することを含み、例えば、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療、抗ＣＴＬＡ－４抗体などの抗ＣＴＬＡ－４治療剤を含む、化学療法剤、標的治療剤及び免疫治療剤であり、好ましくは、前記追加の抗腫瘍治療はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療から選ばれ、好ましくは、前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療はＰＤ－Ｌ１抗体から選ばれる。
第１４の態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２を含有する疑いのあるサンプルを本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む、インビトロでＴＮＦＲ２を検出する方法を含む。
第１１の態様において、本発明は、免疫異常に関連する疾患を治療及び／又は予防するための薬物の調製における前記抗体又は抗原結合断片、前記多重特異性抗原結合分子、前記キメラ抗原受容体、前記免疫エフェクター細胞、前記核酸断片、前記ベクター、前記細胞、前記方法によって調製された生成物、及び前記医薬組成物の使用を含み、好ましくは、前記免疫異常に関連する疾患は、Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＭＤＳＣ機能に関連する疾患であり、好ましくは、前記疾患は、癌又は自己免疫疾患であり、好ましくは、前記癌は、卵巣癌、進行性表皮Ｔ細胞リンパ腫、ステージIII／IV転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び／又は転移性黒色腫などのＣＴＬＡ－４とＰＤ－１療法に対して耐性を有する進行固形腫瘍から選ばれ、好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム障害、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、ＩｇＧ４関連疾患から選ばれてもよい。
第１２の態様において、本発明は、免疫異常に関連する疾患を治療及び／又は予防するための方法を含み、前記方法は、本発明に記載の抗体又は抗原結合断片、前記多重特異性抗原結合分子、前記キメラ抗原受容体、前記免疫エフェクター細胞、前記核酸断片、前記ベクター、前記細胞、前記方法によって調製された生成物、及び前記医薬組成物の有効量を受検者に投与することを含み、好ましくは、前記免疫異常に関連する疾患は、Ｔｒｅｇ細胞及び／又はＭＤＳＣ機能に関連する疾患であり、好ましくは、前記疾患は、癌又は自己免疫疾患であり、好ましくは、前記癌は、卵巣癌、進行性表皮Ｔ細胞リンパ腫、ステージIII／IV転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び／又は転移性黒色腫などのＣＴＬＡ－４とＰＤ－１療法に対して耐性を有する進行固形腫瘍から選ばれ、好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム障害、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、ＩｇＧ４関連疾患から選ばれてもよい。
第１３の態様において、本発明はまた、追加の抗腫瘍治療を前記対象に投与することを含み、例えば、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療、抗ＣＴＬＡ－４抗体などの抗ＣＴＬＡ－４治療剤を含む、化学療法剤、標的治療剤及び免疫治療剤であり、好ましくは、前記追加の抗腫瘍治療はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療から選ばれ、好ましくは、前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療はＰＤ－Ｌ１抗体から選ばれる。
第１４の態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２を含有する疑いのあるサンプルを本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む、インビトロでＴＮＦＲ２を検出する方法を含む。
【0018】
（用語の定義及び説明）
特に明記しない限り、本明細書に使用される用語は、当業者に通常理解されている意味を有する。本明細書で明確に定義された用語について、その用語の意味はその定義が優先する。
本明細書に使用されるように、「ＴＮＦＲ２」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）又はＣＤ１２０ｂとしても知られる腫瘍壊死因子受容体２を指し、これは腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）に結合する膜受容体である。前記ＴＮＦＲ２は、好ましくはヒトＴＮＦＲ２である。
特に明記しない限り、本明細書に使用される用語は、当業者に通常理解されている意味を有する。本明細書で明確に定義された用語について、その用語の意味はその定義が優先する。
本明細書に使用されるように、「ＴＮＦＲ２」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）又はＣＤ１２０ｂとしても知られる腫瘍壊死因子受容体２を指し、これは腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）に結合する膜受容体である。前記ＴＮＦＲ２は、好ましくはヒトＴＮＦＲ２である。
【0019】
本明細書に使用されるように、「抗－腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２抗体」、「ＴＮＦＲ２抗体」、「抗－ＴＮＦＲ２抗体部分」及び／又は「抗－ＴＮＦＲ２抗体断片」という用語は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子の少なくとも一部（例えば重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域又はそれらの任意の部分であるが、これらに限定されない）を含むタンパク質又はペプチド含有分子を指す。ＴＮＦＲ２抗体には、抗体ＣＤＲと構造的及び溶媒露出度に類似するＢＣ、ＤＥ及びＦＧ構造ループを含有する抗体様タンパク質足場（第１０フィブロネクチンIII型ドメイン（１０Ｆｎ３）など）も含まれる。１０Ｆｎ３ドメインの三次構造は、ＩｇＧ重鎖可変領域の三次構造と類似しており、且つ１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループの残基をＴＮＦＲ２モノクローナル抗体からのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２又はＣＤＲ－Ｈ３領域の残基で置換することにより、当業者は、例えば、ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲをフィブロネクチン足場にグラフトすることができる。
本明細書に使用されるように、「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗体のポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作、及び他の修飾形態（キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ）、抗体複合体を含むが、これらに限定されない）、並びに抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖ断片を含む）を含む、標的抗原に特異的に結合するか又は免疫反応性を有する免疫グロブリン分子を指す。また、特に明記しない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合することができる完全な抗体分子、及び不完全な抗体断片（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２断片で、完全抗体のＦｃ断片を欠き（動物サイクルからより迅速に除去される）、従って、Ｆｃ媒介性エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を欠く（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６、１９８３を参照、その内容は参照により本明細書に組み込まれる））を含むことを意味する。
本明細書に使用されるように、「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の産生方法に限定されることなく、単一のクローン（任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む）に由来する抗体を指す。
本明細書に使用されるように、「抗原結合断片」及び「抗体断片」という用語は交換可能であり、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する１つ又は複数の抗体断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行することができる。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、アプタマー又はドメイン抗体であり得る。抗体の「抗原結合断片」という用語を包含する結合断片の実例は、（i）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ii）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片、（iii）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（iv）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（V）ＶＨ及びＶＬドメインを含むｄＡｂ、（vi）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６、１９８９）、（vii）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ、（viii）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（ix）任意選択で合成リンカーによって連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせを含むが、これらに限定されない。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子でコードされるが、これら２つのドメインは、そのうちのＶＬ領域とＶＨ領域がペアになって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、１９８８及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、１９８８を参照）を形成することができるリンカーを介して、組換え法を使用して連結することができる。これらの抗体断片は、当業者に知られている通常の技術により得られ、且つ、これらの断片は完全な抗体と同じ方法で使用するためにスクリーニングされる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、完全な免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断、或いは幾つかの実施形態では当技術分野で知られている化学的ペプチド合成手順によって生成することができる。
本明細書に使用されるように、「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗体のポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作、及び他の修飾形態（キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ）、抗体複合体を含むが、これらに限定されない）、並びに抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖ断片を含む）を含む、標的抗原に特異的に結合するか又は免疫反応性を有する免疫グロブリン分子を指す。また、特に明記しない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合することができる完全な抗体分子、及び不完全な抗体断片（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２断片で、完全抗体のＦｃ断片を欠き（動物サイクルからより迅速に除去される）、従って、Ｆｃ媒介性エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を欠く（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６、１９８３を参照、その内容は参照により本明細書に組み込まれる））を含むことを意味する。
本明細書に使用されるように、「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の産生方法に限定されることなく、単一のクローン（任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む）に由来する抗体を指す。
本明細書に使用されるように、「抗原結合断片」及び「抗体断片」という用語は交換可能であり、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する１つ又は複数の抗体断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行することができる。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、アプタマー又はドメイン抗体であり得る。抗体の「抗原結合断片」という用語を包含する結合断片の実例は、（i）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ii）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片、（iii）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（iv）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（V）ＶＨ及びＶＬドメインを含むｄＡｂ、（vi）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６、１９８９）、（vii）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ、（viii）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（ix）任意選択で合成リンカーによって連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせを含むが、これらに限定されない。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子でコードされるが、これら２つのドメインは、そのうちのＶＬ領域とＶＨ領域がペアになって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、１９８８及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、１９８８を参照）を形成することができるリンカーを介して、組換え法を使用して連結することができる。これらの抗体断片は、当業者に知られている通常の技術により得られ、且つ、これらの断片は完全な抗体と同じ方法で使用するためにスクリーニングされる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、完全な免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断、或いは幾つかの実施形態では当技術分野で知られている化学的ペプチド合成手順によって生成することができる。
【0020】
本明細書に使用されるように、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方に見られる超可変領域を指す。可変ドメインにおけるより保守性の高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。当技術分野で理解されているように、抗体の超可変領域を表すアミノ酸位置は、文脈や当技術分野で知られている様々な定義に従って変化し得る。可変ドメイン内の幾つかの位置は、これらの位置が基準のセット（ＩＭＧＴ又はＫＡＢＡＴなど）の中の超可変領域内にあると考えられ、異なる基準のセット（ＫＡＢＡＴ又はＩＭＧＴなど）の中の超可変領域外にあると考えられるため、ハイブリッド超可変位置と見なすことができる。これらの位置の１つ又は複数は、拡張された超可変領域でも見つけることができる。本発明は、これらのハイブリッド超可変位置に修飾を含む抗体を含む。天然の重鎖及び軽鎖可変ドメインはそれぞれ、ラメラ構造を接続するループを形成し、場合によってはラメラ構造の一部を形成する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）によって連結された主にラメラ構造をとる４つのフレームワーク領域を含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の配列でＦＲ領域によってしっかりと保持され、且つ他の抗体鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．１９８７を参照、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、本明細書では、ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、及びＣＤＲ３－ＶＨは、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）の第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲ、第３のＣＤＲを指し、これらの３つのＣＤＲは重鎖（又はその可変領域）のＣＤＲ組み合わせ（ＶＨＣＤＲ組み合わせ）を構成し、ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ、及びＣＤＲ３－ＶＬは、それぞれ軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲ、第３のＣＤＲを指し、これらの３つのＣＤＲは軽鎖（又はその可変領域）のＣＤＲ組み合わせ（ＶＬＣＤＲ組み合わせ）を構成する。
【0021】
本明細書に使用されるように、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」という用語は、一般に、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔによって提案された免疫グロブリンアラインメント及び番号付けシステムを指す（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照）。
【0022】
本明細書に使用されるように、「ＶＨ」という用語は、抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はＦａｂの重鎖を含む）の可変領域を指す。「ＶＬ」という用語は免疫グロブリン軽鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂの軽鎖を含む）の可変領域を指す。
本明細書における「重鎖定常領域」という用語は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などのエフェクター機能を示す、抗体重鎖のカルボキシ末端部分を指し、抗体の可変ドメインと比較して、より保存的アミノ酸配列を持っていることを意味する。「重鎖定常領域」は、少なくともＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はそれらの変異体若しくは断片を含む。「重鎖定常領域」には「全長重鎖定常領域」と「重鎖定常領域断片」が含まれ、前者は天然抗体定常領域と基本的に類似した構造を有し、後者は「全長重鎖定常領域の一部」のみを含む。例示的に、典型的な「全長抗体重鎖定常領域」は、ＣＨ１ドメイン－ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインからなり、抗体がＩｇＥである場合、またＣＨ４ドメインも含み、抗体が重鎖抗体である場合、ＣＨ１ドメインは含まない。例示的に、典型的な「重鎖定常領域断片」は、ＣＨ１、Ｆｃ、又はＣＨ３ドメインから選ばれてもよい。
本明細書における「軽鎖定常領域」という用語は、抗体と抗原の結合に直接関与しない、抗体軽鎖のカルボキシ末端部分を指し、前記軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定数λドメインから選ばれてもよい。
本明細書における「Ｆｃ」という用語は、完全な抗体のパパイン加水分解によって得られる抗体のカルボキシ末端部分を指し、典型的には抗体のＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む。Ｆｃ領域は、例えば天然配列Ｆｃ領域、組換えＦｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変化することができるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６でのアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシ末端まで延びるように定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵＫａｂａｔ番号付けシステムの残基４４７に基づくもの）は、例えば抗体の生産又は精製期間、又は抗体重鎖をコードする核酸に対して組換え操作を行うことによって除去することができるから、Ｆｃ領域はＬｙｓ４４７を含んでも含まなくてもよい。
本明細書における「重鎖定常領域」という用語は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などのエフェクター機能を示す、抗体重鎖のカルボキシ末端部分を指し、抗体の可変ドメインと比較して、より保存的アミノ酸配列を持っていることを意味する。「重鎖定常領域」は、少なくともＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はそれらの変異体若しくは断片を含む。「重鎖定常領域」には「全長重鎖定常領域」と「重鎖定常領域断片」が含まれ、前者は天然抗体定常領域と基本的に類似した構造を有し、後者は「全長重鎖定常領域の一部」のみを含む。例示的に、典型的な「全長抗体重鎖定常領域」は、ＣＨ１ドメイン－ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインからなり、抗体がＩｇＥである場合、またＣＨ４ドメインも含み、抗体が重鎖抗体である場合、ＣＨ１ドメインは含まない。例示的に、典型的な「重鎖定常領域断片」は、ＣＨ１、Ｆｃ、又はＣＨ３ドメインから選ばれてもよい。
本明細書における「軽鎖定常領域」という用語は、抗体と抗原の結合に直接関与しない、抗体軽鎖のカルボキシ末端部分を指し、前記軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定数λドメインから選ばれてもよい。
本明細書における「Ｆｃ」という用語は、完全な抗体のパパイン加水分解によって得られる抗体のカルボキシ末端部分を指し、典型的には抗体のＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む。Ｆｃ領域は、例えば天然配列Ｆｃ領域、組換えＦｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変化することができるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６でのアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシ末端まで延びるように定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵＫａｂａｔ番号付けシステムの残基４４７に基づくもの）は、例えば抗体の生産又は精製期間、又は抗体重鎖をコードする核酸に対して組換え操作を行うことによって除去することができるから、Ｆｃ領域はＬｙｓ４４７を含んでも含まなくてもよい。
【0023】
本明細書に使用されるように、「パーセント（％）配列一致性」及び「パーセント（％）配列同一性」という用語は交換可能であり、最大パーセント配列一致性を達成するために配列をアラインし、（必要に応じて）ギャップを導入した（例えば、最適なアラインメントのために、候補配列と参照配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較の目的のために、非相同配列を無視することができる）後、候補配列のアミノ酸（又はヌクレオチド）残基が、参照配列のアミノ酸（又はヌクレオチド）残基と同一であるパーセントを指す。パーセント配列一致性を決定するという目的のために、当業者に周知の種々の方法でアラインメントを実現させることができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＩｉ）ソフトウェアなどの公衆に取得可能なコンピュータソフトウェアを用いてもよい。当業者は、比較される配列の全長範囲内に最大アラインメントを実現する必要がある任意のアルゴリズムを含み、測定アラインメントに用いられる適当なパラメータを決定することができる。例えば、候補配列との比較のためにアラインされた参照配列は、候補配列が候補配列の全長又は候補配列の連続するアミノ酸（又はヌクレオチド）残基の選択された部分にわたって５０％～１００％の配列同一性を呈することを示すことができる。比較目的でアラインされた候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）であってもよい。候補配列中の位置が、参照配列中の対応する位置と同じアミノ酸（又はヌクレオチド）残基によって占められている場合、これらの分子は、その位置で同一である。
【0024】
本明細書における「保存的アミノ酸」という用語は、一般に同じクラスに属するアミノ酸、又は類似する特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性、親水性、主鎖の配座や剛性など）を有するアミノ酸を指す。例示的に、以下の各グループ内のアミノ酸は互いの保存的アミノ酸残基に属し、グループ内のアミノ酸残基の置換は保存的アミノ酸置換に属する。
（１）酸性アミノ酸：Ａｓｐ（Ｄ）及びＧｌｕ（Ｅ）、
（２）塩基性アミノ酸：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＨｉｓ（Ｈ）、
（３）親水性無電荷アミノ酸：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＧｌｎ（Ｑ）、
（４）脂肪族無電荷アミノ酸：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）、
（５）非極性無電荷アミノ酸：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）及びＰｒｏ（Ｐ）、
（６）芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）。
本明細書に使用されるように、「特異的結合」という用語は、例えば抗体又はその抗原結合断片によって特異的に認識されるタンパク質及び他の生体分子の不均一なグループにおける抗原の存在を決定する結合反応を指す。抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ（例えば、１ｐＭ～１００ｎＭの間）までのＫＤで抗原に結合する。特定の抗原又はそのエピトープへの特異的結合を示さない抗体又はその抗原結合断片は、その特定の抗原又はそのエピトープに対して１００ｎＭより大きい（例えば、５００ｎＭ、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ又は１ｍＭより大きい）ＫＤを示す。特定のタンパク質又は炭水化物と特異的に免疫反応する抗体は、様々なイムノアッセイを使用して選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質又は炭水化物と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９）を参照し、これには特異的免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイと条件が記載されている。
（１）酸性アミノ酸：Ａｓｐ（Ｄ）及びＧｌｕ（Ｅ）、
（２）塩基性アミノ酸：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＨｉｓ（Ｈ）、
（３）親水性無電荷アミノ酸：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＧｌｎ（Ｑ）、
（４）脂肪族無電荷アミノ酸：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）、
（５）非極性無電荷アミノ酸：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）及びＰｒｏ（Ｐ）、
（６）芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）。
本明細書に使用されるように、「特異的結合」という用語は、例えば抗体又はその抗原結合断片によって特異的に認識されるタンパク質及び他の生体分子の不均一なグループにおける抗原の存在を決定する結合反応を指す。抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ（例えば、１ｐＭ～１００ｎＭの間）までのＫＤで抗原に結合する。特定の抗原又はそのエピトープへの特異的結合を示さない抗体又はその抗原結合断片は、その特定の抗原又はそのエピトープに対して１００ｎＭより大きい（例えば、５００ｎＭ、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ又は１ｍＭより大きい）ＫＤを示す。特定のタンパク質又は炭水化物と特異的に免疫反応する抗体は、様々なイムノアッセイを使用して選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質又は炭水化物と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９）を参照し、これには特異的免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイと条件が記載されている。
【0025】
本明細書に使用されるように、「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの抗原結合部位を有することを指し、前記少なくとも２つの抗原結合部位の各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープと結合する。従って、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」などの用語は、抗体／抗原結合分子が結合できる異なるエピトープの数を指す。「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対してモノクローナル結合特異性を有する抗体であり、通常はヒト又はヒト化抗体である。本発明では、結合特異性の一方をＴＮＦＲ２の抗原エピトープに対して検出することができ、他方をＴＮＦＲ２の別の抗原エピトープ又は任意の他の抗原に対して、例えば細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスコード化エンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質又は細菌表面タンパク質などに対して検出することができる。
本明細書に使用されるように、「価」という用語は、抗体／抗原結合分子における所定数の結合部位の存在を示す。従って、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、抗体／抗原結合分子中の１つの結合部位、２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在をそれぞれ示す。
本明細書に使用されるように、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体との配列相同性を高めるためにアミノ酸配列が修飾された、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。一般的に言えば、ヒト化抗体のＣＤＲ領域の全部又は一部は、非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域の全部又は一部（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は通常、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増強する能力、免疫応答を増強する能力などを含むが、これらに限定されないドナー抗体の予想される特性を保持するか、又は部分的に保持する。
本明細書に使用されるように、「キメラ抗体」という用語は、ある供給元の生物（例えば、ラット又はマウス）の免疫グロブリンに由来する可変配列及び異なる生物（例えば、ヒト）の免疫グロブリンに由来する定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を生産する方法は、本分野で既知の内容である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ，１９８５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２を参照し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用されるように、「抗体複合体」という用語は、抗体分子が直接又は連結リンカーを介して別の分子に化学的に結合することによって形成されるコンジュゲート／複合体を指す。前記別の分子は、治療剤又はトレーサーであってもよく、好ましくは、前記治療剤は放射性同位体、化学療法剤又は免疫調節剤から選ばれ、前記トレーサーは放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤又は光増感剤から選ばれる。「抗体複合体」は、例えば、薬物分子が前記別の分子である抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。
本明細書に使用されるように、「価」という用語は、抗体／抗原結合分子における所定数の結合部位の存在を示す。従って、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、抗体／抗原結合分子中の１つの結合部位、２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在をそれぞれ示す。
本明細書に使用されるように、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体との配列相同性を高めるためにアミノ酸配列が修飾された、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。一般的に言えば、ヒト化抗体のＣＤＲ領域の全部又は一部は、非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域の全部又は一部（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は通常、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増強する能力、免疫応答を増強する能力などを含むが、これらに限定されないドナー抗体の予想される特性を保持するか、又は部分的に保持する。
本明細書に使用されるように、「キメラ抗体」という用語は、ある供給元の生物（例えば、ラット又はマウス）の免疫グロブリンに由来する可変配列及び異なる生物（例えば、ヒト）の免疫グロブリンに由来する定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を生産する方法は、本分野で既知の内容である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ，１９８５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２を参照し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に使用されるように、「抗体複合体」という用語は、抗体分子が直接又は連結リンカーを介して別の分子に化学的に結合することによって形成されるコンジュゲート／複合体を指す。前記別の分子は、治療剤又はトレーサーであってもよく、好ましくは、前記治療剤は放射性同位体、化学療法剤又は免疫調節剤から選ばれ、前記トレーサーは放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤又は光増感剤から選ばれる。「抗体複合体」は、例えば、薬物分子が前記別の分子である抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【0026】
本明細書における「抗原キメラ受容体（ＣＡＲ）」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現するように操作され、抗原に特異的に結合する人工免疫エフェクター細胞表面受容体を指し、少なくとも（１）抗体の可変重鎖又は軽鎖などの細胞外抗原結合ドメイン、（２）ＣＡＲを免疫エフェクター細胞にアンカリングする膜貫通ドメイン、及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを使用して、ＭＨＣ非制限様式で、Ｔ細胞及び他の免疫エフェクター細胞を癌細胞などの選択された標的にリダイレクトすることができる。
本明細書に使用されるように、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」という用語は、サプレッサーＴ細胞（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）とも呼ばれ、自己抗原に対する耐性を維持し、過度の免疫反応を制御し、正常細胞に対する免疫損傷を回避し、自己免疫疾患の発生を防止するために、生体免疫反応を負に制御するリンパ球のグループである。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４、ＦＯＸＰ３、及びＣＤ２５というバイオマーカーを発現し、ナイーブＣＤ４７細胞と同じ系統に由来すると考えられている。Ｔｒｅｇは腫瘍の発生に非常に重要な役割を果たしており、多くの研究によると、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌など、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の数が著しく増加すること、Ｔｒｅｇ細胞の数が腫瘍患者の生存率と密接に関係していることが分かる。また、腫瘍細胞は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、増殖したＴｒｅｇ細胞はＴＧＦ－βなどの免疫抑制因子を大量に分泌し、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫細胞の機能を阻害し、腫瘍に対する免疫細胞の殺傷効果を妨げ、多くの固形腫瘍及び血液腫瘍で免疫療法が失敗する重要な薬剤耐性機構となる。最近の研究では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫療法患者の免疫寛容もＴｒｅｇと密接に関係していることが分かる。
本明細書に使用されるように、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」という用語は、サプレッサーＴ細胞（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）とも呼ばれ、自己抗原に対する耐性を維持し、過度の免疫反応を制御し、正常細胞に対する免疫損傷を回避し、自己免疫疾患の発生を防止するために、生体免疫反応を負に制御するリンパ球のグループである。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４、ＦＯＸＰ３、及びＣＤ２５というバイオマーカーを発現し、ナイーブＣＤ４７細胞と同じ系統に由来すると考えられている。Ｔｒｅｇは腫瘍の発生に非常に重要な役割を果たしており、多くの研究によると、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌など、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の数が著しく増加すること、Ｔｒｅｇ細胞の数が腫瘍患者の生存率と密接に関係していることが分かる。また、腫瘍細胞は腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、増殖したＴｒｅｇ細胞はＴＧＦ－βなどの免疫抑制因子を大量に分泌し、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫細胞の機能を阻害し、腫瘍に対する免疫細胞の殺傷効果を妨げ、多くの固形腫瘍及び血液腫瘍で免疫療法が失敗する重要な薬剤耐性機構となる。最近の研究では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫療法患者の免疫寛容もＴｒｅｇと密接に関係していることが分かる。
【0027】
本明細書に使用されるように、「ベクター」という用語は、ＤＮＡベクター（プラスミドなど）、ＲＮＡベクター、ウイルス又は他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）などの核酸ベクターを含む。外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞又は真核細胞に送達するための様々なベクターが開発されている。本発明の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列と、例えばタンパク質の発現及び／又はこれらのポリヌクレオチド配列を哺乳動物細胞のゲノムに組み込むための追加の配列要素とを含む。本発明の抗体及び抗体断片を発現させるために使用できる特定のベクターには、遺伝子の転写を指示する調節配列（プロモーター及びエンハンサー領域など）を含むプラスミドが含まれる。抗体及び抗体断片を発現させるための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、又は遺伝子の転写によって生産されたｍＲＮＡの安定性や核出力を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素には、発現ベクターに保持される遺伝子の効率的な転写を指示するために、例えば５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本発明の発現ベクターはまた、当該ベクターを含む細胞を選択するための標識をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。適切な標識の実例には、抗生物質（アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はノーセオトリシンなど）に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【0028】
本明細書に使用されるように、「受検者」、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載される特定の疾患又は病症（癌又は感染症など）に対する治療を受けている生体を指す。対象及び患者の実例には、疾患又は病症（例えば、癌又は感染症などの細胞増殖性疾患）に対する治療を受けている、ヒト、霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（家畜のウシ、バイソン、バッファロー、シフゾウ、ヤクなど）、ウシ、ヒツジ、馬、バイソンなどの哺乳動物が含まれる。
本明細書に使用されるように、「治療」という用語は、対象における望ましくない生理的変化又は病変、例えば細胞増殖性疾患（癌又は感染症など）の進行を予防、減速（低減）することを目的とする、外科手術又は薬物処置（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指す。有益又は望ましい臨床結果には、症状の軽減、疾患程度の低下、安定した疾患状態（即ち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的寛解でも全体的寛解でも）を含むが、これらに限定されず、検出可能か検出不能かを問わない。治療を必要とする対象には、すでに病症又は疾患を患っている対象、及び病症又は疾患を患いやすい対象、或いは病症又は疾患を予防すべき対象が含まれる。減速、軽減、低下、緩和、寛解などの用語に言及する場合、解消、消失、非発生などの状況も意味として含まれる。
本明細書に使用されるように、「有効量」という用語は、細胞、組織、又は対象に単独で、又は別の治療剤と組み合わせて投与された場合に、疾患の病症又はこの疾患の進行を予防又は寛解するのに有効な治療剤の量を指す。「有効量」はまた、症状を寛解する、例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、防止若しくは寛解する、又はそのような状態の速度増加を治療、治癒、防止若しくは寛解するのに十分な化合物の量を指す。活性成分を単独で個体に投与する場合、治療有効用量とは当該成分の量だけである。組み合わせが使用される場合、治療有効用量とは、組み合わせ投与、連続投与又は同時投与に関係なく、治療効果を生じさせる活性成分の組み合わせ用量を指す。
本明細書に使用されるように、「治療」という用語は、対象における望ましくない生理的変化又は病変、例えば細胞増殖性疾患（癌又は感染症など）の進行を予防、減速（低減）することを目的とする、外科手術又は薬物処置（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指す。有益又は望ましい臨床結果には、症状の軽減、疾患程度の低下、安定した疾患状態（即ち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的寛解でも全体的寛解でも）を含むが、これらに限定されず、検出可能か検出不能かを問わない。治療を必要とする対象には、すでに病症又は疾患を患っている対象、及び病症又は疾患を患いやすい対象、或いは病症又は疾患を予防すべき対象が含まれる。減速、軽減、低下、緩和、寛解などの用語に言及する場合、解消、消失、非発生などの状況も意味として含まれる。
本明細書に使用されるように、「有効量」という用語は、細胞、組織、又は対象に単独で、又は別の治療剤と組み合わせて投与された場合に、疾患の病症又はこの疾患の進行を予防又は寛解するのに有効な治療剤の量を指す。「有効量」はまた、症状を寛解する、例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、防止若しくは寛解する、又はそのような状態の速度増加を治療、治癒、防止若しくは寛解するのに十分な化合物の量を指す。活性成分を単独で個体に投与する場合、治療有効用量とは当該成分の量だけである。組み合わせが使用される場合、治療有効用量とは、組み合わせ投与、連続投与又は同時投与に関係なく、治療効果を生じさせる活性成分の組み合わせ用量を指す。
【実施例】
【0029】
以下、具体的な実施例を参照しながら本発明を更に説明するが、本発明の利点及び特徴は、説明するにつれて明らかになる。実施例において具体的な条件が明記されていない場合、一般的な条件又はメーカーが推奨する条件を用いる。使用される試薬又は機器は、生産メーカーが明記されていない場合、いずれも市販されている一般的な製品であってもよい。
本発明の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術案の詳細と形態を修正又は置換することができるが、これらの修正及び置換はすべて本発明の保護範囲内にあることを当業者は理解すべきである。
本発明の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術案の詳細と形態を修正又は置換することができるが、これらの修正及び置換はすべて本発明の保護範囲内にあることを当業者は理解すべきである。
【0030】
実施例１ 抗ＴＮＦＲ２ヒト化モノクローナル抗体の発現及び精製
１．１ 抗ＴＮＦＲ２抗体のヒト化
「ＣＤＲｓ移植」法を用いて抗体のヒト化を行い、つまり、最も相同性の高いヒト抗体を配列に基づいて選択して抗体骨格領域（ＦＲｓ）を提供し、標的抗体におけるＫａｂａｔの命名法に基づく抗原結合断片の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を、前者に移植してＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の配列のヒト化抗体可変領域配列を形成した。次に、抗体の活性と親和性を効果的に維持するために、抗体構造モデリング（ＭＯＥソフトウェア）に基づき、以下の選択基準で潜在的な復帰突然変異点を選択した。１）．ＶＨ－ＶＬ界面に位置する、ＣＤＲｓに近接するか又はＣＤＲｓと直接相互作用する抗体骨格領域のアミノ酸残基を選択して復帰突然変異を行い、このようなアミノ酸残基はＣＤＲｓ領域の配座を維持するのに比較的重要なものでり、２）．免疫原性を考慮すると、できるだけタンパク質に埋め込まれたアミノ酸を選択して復帰突然変異を行い、３）．抗体の安定性や発現レベルを考慮すると、分子エネルギーが低下した突然変異が好ましいことである。マウス抗体と同等以上の親和性、抗体の特徴付け及び活性機能を持つヒト化抗体を、異なる突然変異を含むヒト化抗体の、ヒトＴＮＦＲ２に対する親和性及びＴＮＦＲ２を表面に発現する細胞への結合について試験することによってスクリーニングした。
そのうち、ＴＮＦＲ２抗体のＫａｂａｔ命名法の抗原結合断片の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を表１に示し、表２はヒト化抗体分子のＶＨとＶＬ配列を示し、表３はヒト化抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨとＶＬ配列のペアリング状況を示す。
１．１ 抗ＴＮＦＲ２抗体のヒト化
「ＣＤＲｓ移植」法を用いて抗体のヒト化を行い、つまり、最も相同性の高いヒト抗体を配列に基づいて選択して抗体骨格領域（ＦＲｓ）を提供し、標的抗体におけるＫａｂａｔの命名法に基づく抗原結合断片の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を、前者に移植してＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の配列のヒト化抗体可変領域配列を形成した。次に、抗体の活性と親和性を効果的に維持するために、抗体構造モデリング（ＭＯＥソフトウェア）に基づき、以下の選択基準で潜在的な復帰突然変異点を選択した。１）．ＶＨ－ＶＬ界面に位置する、ＣＤＲｓに近接するか又はＣＤＲｓと直接相互作用する抗体骨格領域のアミノ酸残基を選択して復帰突然変異を行い、このようなアミノ酸残基はＣＤＲｓ領域の配座を維持するのに比較的重要なものでり、２）．免疫原性を考慮すると、できるだけタンパク質に埋め込まれたアミノ酸を選択して復帰突然変異を行い、３）．抗体の安定性や発現レベルを考慮すると、分子エネルギーが低下した突然変異が好ましいことである。マウス抗体と同等以上の親和性、抗体の特徴付け及び活性機能を持つヒト化抗体を、異なる突然変異を含むヒト化抗体の、ヒトＴＮＦＲ２に対する親和性及びＴＮＦＲ２を表面に発現する細胞への結合について試験することによってスクリーニングした。
そのうち、ＴＮＦＲ２抗体のＫａｂａｔ命名法の抗原結合断片の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を表１に示し、表２はヒト化抗体分子のＶＨとＶＬ配列を示し、表３はヒト化抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨとＶＬ配列のペアリング状況を示す。
【0031】
【表1】
【0032】
【表2】
【0033】
【表3】
【0034】
１．２ 抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体の発現
トランスフェクションの前日、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を計数し、２．５～４(１０6細胞／ｍＬの密度で新しく予熱したＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１００２）に接種し、一晩培養した。トランスフェクション当日、一晩培養したＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞懸濁液を計数すると、細胞濃度は約７～１０(１０6細胞／ｍＬであり、トランスフェクション用細胞生存率は９５％より大きかった。トランスフェクションの数に応じて、必要な数の細胞を取り、それらをＥｘｐｉＣＨＯ発現培地で最終濃度６(１０6細胞／ｍＬに希釈し、後で使用するために３７℃、８％ＣＯ2、１００ｒｐｍのシェーカーに置いた。トランスフェクションの準備：プラスミドをＯｐｔｉＰＲＯTM ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３０９０１９）で希釈し、遠心分離管を軽く振ってよく混ぜた。よく混ぜたＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ＣＨＯ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１２９）をプラスミド希釈液に加え、遠心分離管を軽く振ってよく混ぜ、室温で２分間静置した。前記のプラスミド／ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ＣＨＯ試薬複合物をトランスフェクトする細胞懸濁液にゆっくりと滴下し、滴下中にフラスコを振った。トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を３７℃、８％ＣＯ2、１００ｒｐｍのシェーカーで培養した。トランスフェクション後１日目に、トランスフェクトされた細胞に０．６％ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１２９）と１６％ＥｘｐｉＣＨＯTM Ｆｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１２９）を追加し、追加中にフラスコを軽く振り、細胞を３２℃、５％ＣＯ2、１００ｒｐｍのシェーカーに移して培養した。トランスフェクション後５日目に、トランスフェクトされた細胞に１６％ＥｘｐｉＣＨＯTM Ｆｅｅｄを追加し、追加中にフラスコを軽く振った。トランスフェクション後１２日目に、細胞上清を回収し、４０００ｇで１０分間遠心分離して上清を吸引し、抗体を更に精製した。
トランスフェクションの前日、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を計数し、２．５～４(１０6細胞／ｍＬの密度で新しく予熱したＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１００２）に接種し、一晩培養した。トランスフェクション当日、一晩培養したＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞懸濁液を計数すると、細胞濃度は約７～１０(１０6細胞／ｍＬであり、トランスフェクション用細胞生存率は９５％より大きかった。トランスフェクションの数に応じて、必要な数の細胞を取り、それらをＥｘｐｉＣＨＯ発現培地で最終濃度６(１０6細胞／ｍＬに希釈し、後で使用するために３７℃、８％ＣＯ2、１００ｒｐｍのシェーカーに置いた。トランスフェクションの準備：プラスミドをＯｐｔｉＰＲＯTM ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３０９０１９）で希釈し、遠心分離管を軽く振ってよく混ぜた。よく混ぜたＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ＣＨＯ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１２９）をプラスミド希釈液に加え、遠心分離管を軽く振ってよく混ぜ、室温で２分間静置した。前記のプラスミド／ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ＣＨＯ試薬複合物をトランスフェクトする細胞懸濁液にゆっくりと滴下し、滴下中にフラスコを振った。トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を３７℃、８％ＣＯ2、１００ｒｐｍのシェーカーで培養した。トランスフェクション後１日目に、トランスフェクトされた細胞に０．６％ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTM ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１２９）と１６％ＥｘｐｉＣＨＯTM Ｆｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２９１２９）を追加し、追加中にフラスコを軽く振り、細胞を３２℃、５％ＣＯ2、１００ｒｐｍのシェーカーに移して培養した。トランスフェクション後５日目に、トランスフェクトされた細胞に１６％ＥｘｐｉＣＨＯTM Ｆｅｅｄを追加し、追加中にフラスコを軽く振った。トランスフェクション後１２日目に、細胞上清を回収し、４０００ｇで１０分間遠心分離して上清を吸引し、抗体を更に精製した。
【0035】
１．３ 抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体の精製
高速遠心分離により回収した細胞培養上清を、０．４５＋０．２２(Ｍのメンブレンフィルタで濾過し、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより第一段階の精製を行った。クロマトグラフィー媒体は、Ｆｃと相互作用するＰｒｏｔｅｉｎ ＡフィラーであるＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ、カタログ番号：１７５４９８０３）であり、平衡化バッファーはＰＢＳ（２．５ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4 １２Ｈ2Ｏ、０．４０８ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4、８．７６ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）であり、カラム容量の４倍に平衡化した後、細胞上清をローディングして結合させ、サンプルがカラム上に５ｍｉｎ以上の時間保持されるように流速を制御した。ローディング終了後、Ａ２８０の紫外吸収がベースラインに低下するまでカラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。次に、２０ｍＭ ＰＢ＋１Ｍ ＮａＣｌ（３．７５２ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ４・１２Ｈ2Ｏ、１．３１４ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4、５８．４４ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ｐＨ６．２）でカラム容量の２倍量で濯いた。Ａ２８０の紫外吸収とコンダクタンスがベースラインに達するまで、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で更に洗浄した。最後に、２０ｍＭクエン酸（２．１８４ｇ／Ｌクエン酸、１．０８６ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．４）の溶出バッファーでクロマトグラフィーカラムを洗浄し、Ａ２８０の紫外吸収ピークに従って溶出ピークを収集し、収集した溶出サンプルを１Ｍ Ｔｒｉｓ（１２１．１４ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ）で中和し、ｐＨメーターＳｅｖｅｎ２Ｇｏ（Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ）で中性まで検出した。収集した抗体は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって純度が９５％より大きいことが同定され、その後の研究に使用した。
高速遠心分離により回収した細胞培養上清を、０．４５＋０．２２(Ｍのメンブレンフィルタで濾過し、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより第一段階の精製を行った。クロマトグラフィー媒体は、Ｆｃと相互作用するＰｒｏｔｅｉｎ ＡフィラーであるＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ、カタログ番号：１７５４９８０３）であり、平衡化バッファーはＰＢＳ（２．５ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4 １２Ｈ2Ｏ、０．４０８ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4、８．７６ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）であり、カラム容量の４倍に平衡化した後、細胞上清をローディングして結合させ、サンプルがカラム上に５ｍｉｎ以上の時間保持されるように流速を制御した。ローディング終了後、Ａ２８０の紫外吸収がベースラインに低下するまでカラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。次に、２０ｍＭ ＰＢ＋１Ｍ ＮａＣｌ（３．７５２ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ４・１２Ｈ2Ｏ、１．３１４ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4、５８．４４ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ｐＨ６．２）でカラム容量の２倍量で濯いた。Ａ２８０の紫外吸収とコンダクタンスがベースラインに達するまで、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で更に洗浄した。最後に、２０ｍＭクエン酸（２．１８４ｇ／Ｌクエン酸、１．０８６ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．４）の溶出バッファーでクロマトグラフィーカラムを洗浄し、Ａ２８０の紫外吸収ピークに従って溶出ピークを収集し、収集した溶出サンプルを１Ｍ Ｔｒｉｓ（１２１．１４ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ）で中和し、ｐＨメーターＳｅｖｅｎ２Ｇｏ（Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ）で中性まで検出した。収集した抗体は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって純度が９５％より大きいことが同定され、その後の研究に使用した。
【0036】
実施例２ ＥＬＩＳＡによるＴＮＦＲ２ヒト化抗体とヒト及びカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質との特異的結合の検出
ヒトＴＮＦＲ２（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ １０４１７－Ｈ０８Ｈ）又はカニクイザルＴＮＦＲ２（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ ９０１０２－Ｃ０８Ｈ）を１００μＬ／ウェル、０．５μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートに予め被包し、被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体（実施例１に記載の可変領域をＩｇＧ－Ｆｃに連結して構成され、ＷＴキメラ抗体もＩｇＧ－Ｆｃ構造を取る）を３．３３倍段階希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、室温で振とうしながら１．５時間インキュベートし、プレート洗浄後、マウス抗ヒト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ標準溶液（１：１００００希釈）を加え、１００μＬ／ウェルで加え、室温で振とうしながら１．０時間インキュベートし、プレートを再度洗浄し、ＨＲＰの基質であるＴＭＢを加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＤ Ｉ３）で吸光度を読み取った。抗体濃度を横軸、対応するＯＤ値を縦軸として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がヒト／カニクイザルＴＮＦＲ２に結合する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の結合効果を、対応するヒト－マウスキメラ抗体ＷＴ（配列については配列番号３８～４３を参照）に正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の結合効果が良好であることを示した。抗ＴＮＦＲ２抗体とヒトＴＮＦＲ２タンパク質との結合結果を図１及び表４に、カニクイザルＴＮＦＲ２との結合結果を図２及び表４に示した。データによると、すべての被験抗体がヒト又はサルＴＮＦＲ２タンパク質に特異的に結合することができ、且つヒト化抗体の結合能力が基本的にヒト－マウスキメラ抗体の結合能力と同じであることが分かる。
ヒトＴＮＦＲ２（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ １０４１７－Ｈ０８Ｈ）又はカニクイザルＴＮＦＲ２（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ ９０１０２－Ｃ０８Ｈ）を１００μＬ／ウェル、０．５μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートに予め被包し、被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体（実施例１に記載の可変領域をＩｇＧ－Ｆｃに連結して構成され、ＷＴキメラ抗体もＩｇＧ－Ｆｃ構造を取る）を３．３３倍段階希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、室温で振とうしながら１．５時間インキュベートし、プレート洗浄後、マウス抗ヒト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ標準溶液（１：１００００希釈）を加え、１００μＬ／ウェルで加え、室温で振とうしながら１．０時間インキュベートし、プレートを再度洗浄し、ＨＲＰの基質であるＴＭＢを加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＤ Ｉ３）で吸光度を読み取った。抗体濃度を横軸、対応するＯＤ値を縦軸として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がヒト／カニクイザルＴＮＦＲ２に結合する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の結合効果を、対応するヒト－マウスキメラ抗体ＷＴ（配列については配列番号３８～４３を参照）に正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の結合効果が良好であることを示した。抗ＴＮＦＲ２抗体とヒトＴＮＦＲ２タンパク質との結合結果を図１及び表４に、カニクイザルＴＮＦＲ２との結合結果を図２及び表４に示した。データによると、すべての被験抗体がヒト又はサルＴＮＦＲ２タンパク質に特異的に結合することができ、且つヒト化抗体の結合能力が基本的にヒト－マウスキメラ抗体の結合能力と同じであることが分かる。
【0037】
【表4】
【0038】
００１－ＷＴ ＶＨアミノ酸配列（配列番号３８）：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＮＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＴＹＤＬＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＹＩＮＮＧＧＩＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＧＰＦＹＧＳＡＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
００１－ＷＴ ＶＬアミノ酸配列（配列番号３９）：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＳＬＳＬＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＴＳＥＳＩＹＳＮＬＰＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＤＡＴＫＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＳＥＤＦＧＴＹＹＣＱＨＦＷＶＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
２１９－ＷＴ ＶＨアミノ酸配列（配列番号４０）：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＮＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＳＤＴＥＴＲＬＮＱＮＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＳＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＥＧＬＧＡＡＲＳＶＳＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
２１９－ＷＴ ＶＬアミノ酸配列（配列番号４１）：
ＤＩＬＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＶＬＩＹＹＴＡＩＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
２２４－ＷＴ ＶＨアミノ酸配列（配列番号４２）：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＥＩＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＮＫＤＩＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＴＧＮＴＫＨＤＰＫＦＱＤＫＡＴＬＳＳＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＦＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＨＳＰＹＧＤＦＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
２２４－ＷＴ ＶＬアミノ酸配列（配列番号４３）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＮＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＰＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＨＲＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＮＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＴＹＤＬＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＹＩＮＮＧＧＩＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＧＰＦＹＧＳＡＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
００１－ＷＴ ＶＬアミノ酸配列（配列番号３９）：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＳＬＳＬＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＴＳＥＳＩＹＳＮＬＰＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＤＡＴＫＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＳＥＤＦＧＴＹＹＣＱＨＦＷＶＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
２１９－ＷＴ ＶＨアミノ酸配列（配列番号４０）：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＮＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＳＤＴＥＴＲＬＮＱＮＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＳＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＥＧＬＧＡＡＲＳＶＳＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
２１９－ＷＴ ＶＬアミノ酸配列（配列番号４１）：
ＤＩＬＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＶＬＩＹＹＴＡＩＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
２２４－ＷＴ ＶＨアミノ酸配列（配列番号４２）：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＥＩＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＮＫＤＩＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＴＧＮＴＫＨＤＰＫＦＱＤＫＡＴＬＳＳＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＦＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＨＳＰＹＧＤＦＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
２２４－ＷＴ ＶＬアミノ酸配列（配列番号４３）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＮＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＰＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＨＲＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0039】
実施例３ ＢＩＡｃｏｒｅによるＴＮＦＲ２ヒト化抗体とヒト及びカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質との親和性の検出
ＢＩＡｃｏｒｅにより被験抗ＴＮＦＲ２抗体とヒト及びカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質との特異的結合を検出した。この実験は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップを使用し、結合抗原を飽和させることができるＲｍａｘが５０ＲＵとなるように、チップが希釈された抗体を捕捉するのに必要な時間をマニュアル操作（ｍａｎｕａｌ ｒｕｎ）で測定した。ヒト（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ １０４１７－Ｈ０８Ｈ）とカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ ９０１０２－Ｃ０８Ｈ）ＴＮＦＲ２の両方を、３２、１６、８、４、２ｎＭに段階希釈した。抗原に対する抗体の親和性は、マルチサイクル速度論を使用して測定された。各サイクルで、抗体を注入した後、ＴＮＦＲ２タンパク質を勾配濃度で注入し、抗原と抗体の結合及び解離プロセスを生じさせた。各サイクルの後、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５を使用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップの再生（チップ上のタンパク質を除去する）を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００解析ソフトウェアを使用して、抗体抗原の親和性ＫＤをフィッティングした。表５の結果から、すべての被験抗ＴＮＦＲ２抗体とヒト又はカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質との間に特異的結合があり、親和性レベルが比較的高いことが分かる。
ＢＩＡｃｏｒｅにより被験抗ＴＮＦＲ２抗体とヒト及びカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質との特異的結合を検出した。この実験は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップを使用し、結合抗原を飽和させることができるＲｍａｘが５０ＲＵとなるように、チップが希釈された抗体を捕捉するのに必要な時間をマニュアル操作（ｍａｎｕａｌ ｒｕｎ）で測定した。ヒト（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ １０４１７－Ｈ０８Ｈ）とカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ ９０１０２－Ｃ０８Ｈ）ＴＮＦＲ２の両方を、３２、１６、８、４、２ｎＭに段階希釈した。抗原に対する抗体の親和性は、マルチサイクル速度論を使用して測定された。各サイクルで、抗体を注入した後、ＴＮＦＲ２タンパク質を勾配濃度で注入し、抗原と抗体の結合及び解離プロセスを生じさせた。各サイクルの後、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５を使用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップの再生（チップ上のタンパク質を除去する）を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００解析ソフトウェアを使用して、抗体抗原の親和性ＫＤをフィッティングした。表５の結果から、すべての被験抗ＴＮＦＲ２抗体とヒト又はカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質との間に特異的結合があり、親和性レベルが比較的高いことが分かる。
【0040】
【表5】
【0041】
実施例４ ＦＡＣＳによるＴＮＦＲ２抗体とＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞表面ヒトＴＮＦＲ２との結合の検出
ヒトＴＮＦＲ２高発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１安定細胞（ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２と命名）を取り、トランスフェクトしたヒトＴＮＦＲ２全長プラスミドはＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号：ＨＧ１０４１７－ＵＴ、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：ＮＭ＿００１０６６．２）から購入され、細胞密度が８０％を超えないときに実験を行った。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのトリプシンを加えて２分間消化し、１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２完全培地で消化を停止して細胞懸濁液を作った。計数後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇで遠心分離し、上清を捨て、１×１０7細胞／ｍＬの密度で、対応する量のブロッキング溶液（１０％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）を加えて細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、細胞を染色バッファー（２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）で２×１０6細胞／ｍＬの密度に再懸濁し、９６ウェルプレートに広げ、各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加え、後で使用するようにした。ＰＢＳを使用して抗体を最高濃度の２０μｇ／ｍＬ（２倍濃度）から１０倍段階希釈し、希釈した抗体を既に５０μＬの細胞懸濁液を含むウェルに加え、マイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍで１分間振とうし、抗体と細胞を完全に混合させ、４℃で１ｈインキュベートした。インキュベート終了後、細胞を染色バッファー１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。ＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１２－４９９８－８２）を染色バッファーで２５０倍希釈し、洗浄した細胞ウェルに１ウェルあたり１００μＬの量で加え、よく混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後、同様に染色バッファーで２回洗浄し、最後に２００μＬの染色バッファーで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターでシグナルを検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、シグナルが強いほど、ＴＮＦＲ２に対する抗体の結合能が強いことを示した。抗体濃度を横軸、対応する平均蛍光強度ＭＦＩの倍数を縦軸として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞に結合する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の結合効果を、対応するヒト－マウスキメラＷＴ抗体に正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の結合効果が良好であることを示した。図３及び表６に示すように、すべての被験抗ＴＮＦＲ２抗体はＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞表面ヒトＴＮＦＲ２に結合することができ、且つヒト化抗体の結合能力は基本的にヒト－マウスキメラＷＴ抗体の結合能力と同じである。
ヒトＴＮＦＲ２高発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１安定細胞（ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２と命名）を取り、トランスフェクトしたヒトＴＮＦＲ２全長プラスミドはＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号：ＨＧ１０４１７－ＵＴ、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：ＮＭ＿００１０６６．２）から購入され、細胞密度が８０％を超えないときに実験を行った。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのトリプシンを加えて２分間消化し、１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２完全培地で消化を停止して細胞懸濁液を作った。計数後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇで遠心分離し、上清を捨て、１×１０7細胞／ｍＬの密度で、対応する量のブロッキング溶液（１０％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）を加えて細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、細胞を染色バッファー（２％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）で２×１０6細胞／ｍＬの密度に再懸濁し、９６ウェルプレートに広げ、各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加え、後で使用するようにした。ＰＢＳを使用して抗体を最高濃度の２０μｇ／ｍＬ（２倍濃度）から１０倍段階希釈し、希釈した抗体を既に５０μＬの細胞懸濁液を含むウェルに加え、マイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍで１分間振とうし、抗体と細胞を完全に混合させ、４℃で１ｈインキュベートした。インキュベート終了後、細胞を染色バッファー１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。ＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１２－４９９８－８２）を染色バッファーで２５０倍希釈し、洗浄した細胞ウェルに１ウェルあたり１００μＬの量で加え、よく混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後、同様に染色バッファーで２回洗浄し、最後に２００μＬの染色バッファーで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターでシグナルを検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、シグナルが強いほど、ＴＮＦＲ２に対する抗体の結合能が強いことを示した。抗体濃度を横軸、対応する平均蛍光強度ＭＦＩの倍数を縦軸として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞に結合する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の結合効果を、対応するヒト－マウスキメラＷＴ抗体に正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の結合効果が良好であることを示した。図３及び表６に示すように、すべての被験抗ＴＮＦＲ２抗体はＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞表面ヒトＴＮＦＲ２に結合することができ、且つヒト化抗体の結合能力は基本的にヒト－マウスキメラＷＴ抗体の結合能力と同じである。
【0042】
【表6】
【0043】
実施例５ ＦＡＣＳによる抗体とヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）表面ＴＮＦＲ２との結合の検出実験
ヒトＴｒｅｇ細胞は、選別キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号：１８０６３）を使用してヒトＰＢＭＣから単離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ）によってインビトロで１５日間刺激及び増幅を行い、その後個別包装して凍結保存した。インビトロで単離増輻したＴｒｅｇ細胞を取り、一晩回復し、翌日３００×ｇで５分間遠心分離し、ＤＰＢＳで再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。実験に必要な数の細胞を遠心分離管に入れ、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、染色バッファーで細胞密度を２×１０6／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μＬで広げた。すべての被験抗体と対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ（それぞれＰＢＳで２００ｎｇ／ｍＬに希釈し、総量は１００μＬとした）を取った。各サンプルを各ウェルに５０μＬ／ウェルで添加した。細胞懸濁液と抗体を加えたプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と抗体を十分に混合した。混合後、プレートを４℃の冷蔵庫に入れ、６０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１００μＬの染色バッファーを加え、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、また、各ウェルに２００μＬの染色バッファーを加えて細胞を再懸濁し、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。染色バッファーを、２５０：１（染色バッファー：蛍光染色抗体）の割合でＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃに加え、染色液を作成し、よく混合して１ウェルあたり１００μＬで細胞ウェルに加え、プレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と染色液を十分に混合した。混合後、４℃の冷蔵庫に入れ、３０ｍｉｎインキュベートした。細胞を２回洗浄し、最後に２００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーターでシグナルを検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。図４は、すべての抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体が効果的にヒトＴｒｅｇ細胞に結合できることを示す。
ヒトＴｒｅｇ細胞は、選別キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号：１８０６３）を使用してヒトＰＢＭＣから単離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ）によってインビトロで１５日間刺激及び増幅を行い、その後個別包装して凍結保存した。インビトロで単離増輻したＴｒｅｇ細胞を取り、一晩回復し、翌日３００×ｇで５分間遠心分離し、ＤＰＢＳで再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。実験に必要な数の細胞を遠心分離管に入れ、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、染色バッファーで細胞密度を２×１０6／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μＬで広げた。すべての被験抗体と対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｉｓｏｔｙｐｅ（それぞれＰＢＳで２００ｎｇ／ｍＬに希釈し、総量は１００μＬとした）を取った。各サンプルを各ウェルに５０μＬ／ウェルで添加した。細胞懸濁液と抗体を加えたプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と抗体を十分に混合した。混合後、プレートを４℃の冷蔵庫に入れ、６０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１００μＬの染色バッファーを加え、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、また、各ウェルに２００μＬの染色バッファーを加えて細胞を再懸濁し、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。染色バッファーを、２５０：１（染色バッファー：蛍光染色抗体）の割合でＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃに加え、染色液を作成し、よく混合して１ウェルあたり１００μＬで細胞ウェルに加え、プレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と染色液を十分に混合した。混合後、４℃の冷蔵庫に入れ、３０ｍｉｎインキュベートした。細胞を２回洗浄し、最後に２００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーターでシグナルを検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。図４は、すべての抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体が効果的にヒトＴｒｅｇ細胞に結合できることを示す。
【0044】
実施例６ ＦＡＣＳによる抗体と活性化されたカニクイザルＰＢＭＣ細胞との結合の検出実験
凍結保存したカニクイザルＰＭＢＣ細胞を回復させた後、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ＋１×ＩＴＳ＋５０μＭＰＭメルカプトエタノール）に再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。計数結果に従い、細胞を５×１０6／ｍＬの密度に再懸濁し、９６ウェルＵ底プレートに１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を広げた。２０％濃度のＴ細胞活性化試薬Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１：５０）ａｃｔｉｖａｔｏｒ＋ｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、２００ＩＵ）を調製し、２０％濃度の活性化試薬を１ウェルあたり１００μＬで細胞に加え、よく混合して３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで３日間培養した。活性化された細胞を収集して計数し、染色バッファー（２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ溶液）を使用して細胞密度を４×１０6／ｍＬに調整し、９６ウェルＶ底プレートに１ウェルあたり５０μＬで広げた。すべての被験抗体とａｎｔｉ－Ｈｅｌ対照抗体（それぞれ染色バッファーで０．４μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬに希釈した）を取り、各サンプルを各ウェルに５０μＬ／ウェルで添加した。細胞懸濁液と抗体を加えたプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と抗体を十分に混合した。混合後、プレートを４℃の冷蔵庫に入れ、３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１００μＬの染色バッファーを加え、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、また、各ウェルに２００μＬの染色バッファーを加えて細胞を再懸濁し、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。抗体Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＦＴＩＣ（ＢＤ－５５５３６６、１μＬ／ｔｅｓｔ）とＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１２４９９８－８２、０．５μＬ／ｔｅｓｔ）を加え、プレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と染色液を十分に混合した。混合後、４℃の冷蔵庫に入れ、３０ｍｉｎインキュベートした。細胞を２回洗浄し、最後に２００μＬの染色バッファーを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーターでシグナルを検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。図５は、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ陰性アイソタイプ対照抗体がカニクイザルＣＤ８Ｔ細胞に結合せず、すべての被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体が活性化カニクイザルＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞に効果的に結合できることを示す。
凍結保存したカニクイザルＰＭＢＣ細胞を回復させた後、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ＋１×ＩＴＳ＋５０μＭＰＭメルカプトエタノール）に再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。計数結果に従い、細胞を５×１０6／ｍＬの密度に再懸濁し、９６ウェルＵ底プレートに１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を広げた。２０％濃度のＴ細胞活性化試薬Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１：５０）ａｃｔｉｖａｔｏｒ＋ｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、２００ＩＵ）を調製し、２０％濃度の活性化試薬を１ウェルあたり１００μＬで細胞に加え、よく混合して３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで３日間培養した。活性化された細胞を収集して計数し、染色バッファー（２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ溶液）を使用して細胞密度を４×１０6／ｍＬに調整し、９６ウェルＶ底プレートに１ウェルあたり５０μＬで広げた。すべての被験抗体とａｎｔｉ－Ｈｅｌ対照抗体（それぞれ染色バッファーで０．４μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬに希釈した）を取り、各サンプルを各ウェルに５０μＬ／ウェルで添加した。細胞懸濁液と抗体を加えたプレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と抗体を十分に混合した。混合後、プレートを４℃の冷蔵庫に入れ、３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１００μＬの染色バッファーを加え、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、また、各ウェルに２００μＬの染色バッファーを加えて細胞を再懸濁し、３５０×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。抗体Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＦＴＩＣ（ＢＤ－５５５３６６、１μＬ／ｔｅｓｔ）とＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１２４９９８－８２、０．５μＬ／ｔｅｓｔ）を加え、プレートをマイクロプレートシェーカーに置き、５００ｒｐｍの速度で１ｍｉｎ振とうし、細胞と染色液を十分に混合した。混合後、４℃の冷蔵庫に入れ、３０ｍｉｎインキュベートした。細胞を２回洗浄し、最後に２００μＬの染色バッファーを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーターでシグナルを検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。図５は、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ陰性アイソタイプ対照抗体がカニクイザルＣＤ８Ｔ細胞に結合せず、すべての被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体が活性化カニクイザルＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞に効果的に結合できることを示す。
【0045】
実施例７ ＥＬＩＳＡにより抗ＴＮＦＲ２抗体がＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合を遮断するのを検出すること
ヒトＴＮＦＲ２（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ８３０）を１００μＬ／ウェル、１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートに予め被包し、すべての被験ＴＮＦＲ２抗体を最高濃度の３０μｇ／ｍＬから２．５倍段階希釈し、希釈した抗体をそれぞれ１５ｎｇ／ｍＬのヒトＴＮＦα－Ｂｉｏｔｉｎ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＴＮＡ－Ｈ８２Ｅ３）となど量混合し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で振とうしながら２．０時間インキュベートし、プレート洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ標準溶液（１：１００００希釈）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で振とうしながら４０分間インキュベートし、プレートを再度洗浄し、ＨＲＰの基質であるＴＭＢを加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＤ Ｉ３）で吸光度を読み取った。抗体濃度を横軸、対応するＯＤ値を縦軸として抗体の阻害曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値が小さいほど、抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２の結合を阻害する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の遮断効果を、対応するヒト－マウスキメラ抗体ＷＴに正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の阻害効果が良好であることを示した。被験抗体の遮断曲線を図６に、阻害活性を表７に示す。図６及び表７から、すべての被験抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２タンパク質の結合を有意に阻害でき、且つヒト化抗体の阻害能力が基本的にヒト－マウスキメラＷＴ抗体の阻害能力と同じであることが分かる。
ヒトＴＮＦＲ２（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ８３０）を１００μＬ／ウェル、１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートに予め被包し、すべての被験ＴＮＦＲ２抗体を最高濃度の３０μｇ／ｍＬから２．５倍段階希釈し、希釈した抗体をそれぞれ１５ｎｇ／ｍＬのヒトＴＮＦα－Ｂｉｏｔｉｎ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＴＮＡ－Ｈ８２Ｅ３）となど量混合し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で振とうしながら２．０時間インキュベートし、プレート洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ標準溶液（１：１００００希釈）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で振とうしながら４０分間インキュベートし、プレートを再度洗浄し、ＨＲＰの基質であるＴＭＢを加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＤ Ｉ３）で吸光度を読み取った。抗体濃度を横軸、対応するＯＤ値を縦軸として抗体の阻害曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値が小さいほど、抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２の結合を阻害する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の遮断効果を、対応するヒト－マウスキメラ抗体ＷＴに正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の阻害効果が良好であることを示した。被験抗体の遮断曲線を図６に、阻害活性を表７に示す。図６及び表７から、すべての被験抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２タンパク質の結合を有意に阻害でき、且つヒト化抗体の阻害能力が基本的にヒト－マウスキメラＷＴ抗体の阻害能力と同じであることが分かる。
【0046】
【表7】
【0047】
実施例８ 抗ＴＮＦＲ２抗体がヒトＴＮＦＲ２を高度に発現するＣＨＯ細胞上でのＴＮＦＲ２とＴＮＦαの結合を遮断すること
ヒトＴＮＦＲ２を高度に発現するＣＨＯ安定細胞（実施例４のＣＨＯ－ＴＮＦＲ２と同じ）を用いて実験を行った。ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞を消化した後、ＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｌ／Ｄ）で染色し（室温で２０分間）、その後、１×１０5細胞／５０μＬ／ウェルでプレートに広げ、染色バッファーで被験抗ＴＮＦＲ２抗体を６μｇ／ｍＬに希釈して初期濃度とし、３．３３倍段階希釈して合計７点の濃度ポイントを設定し、希釈した抗体を５０μＬ／ウェルで播種した細胞に加え、穏やかに吹き混ぜて４℃で３０分間インキュベートした。その後、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したヒトＴＮＦα－ｂｉｏｔｉｎを１００μＬ／ウェルで加え、穏やかに吹き混ぜて、混合後４℃で３０分間インキュベートした。染色バッファーで２回洗浄した後、ＰＥ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５２０４）を１００μＬ／ウェル、０．１２μｇ／ｍＬで加え、４℃で３０分間インキュベートした。染色バッファーで２回洗浄した後、１５０μＬで再懸濁し、フローサイトメーターで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。抗体濃度を横軸、対応するＭＦＩ値を縦軸として抗体の阻害曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値が小さいほど、抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２の結合を阻害する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の遮断効果を、対応するヒト－マウスキメラＷＴ抗体に正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の阻害効果が良好であることを示した。被験抗体の遮断曲線を図７に、阻害活性を表８に示す。図７及び表８から、すべての被験抗体がＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞上でのＴＮＦＲ２の結合を有意に阻害できることが分かる。
ヒトＴＮＦＲ２を高度に発現するＣＨＯ安定細胞（実施例４のＣＨＯ－ＴＮＦＲ２と同じ）を用いて実験を行った。ＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞を消化した後、ＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｌ／Ｄ）で染色し（室温で２０分間）、その後、１×１０5細胞／５０μＬ／ウェルでプレートに広げ、染色バッファーで被験抗ＴＮＦＲ２抗体を６μｇ／ｍＬに希釈して初期濃度とし、３．３３倍段階希釈して合計７点の濃度ポイントを設定し、希釈した抗体を５０μＬ／ウェルで播種した細胞に加え、穏やかに吹き混ぜて４℃で３０分間インキュベートした。その後、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したヒトＴＮＦα－ｂｉｏｔｉｎを１００μＬ／ウェルで加え、穏やかに吹き混ぜて、混合後４℃で３０分間インキュベートした。染色バッファーで２回洗浄した後、ＰＥ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５２０４）を１００μＬ／ウェル、０．１２μｇ／ｍＬで加え、４℃で３０分間インキュベートした。染色バッファーで２回洗浄した後、１５０μＬで再懸濁し、フローサイトメーターで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。抗体濃度を横軸、対応するＭＦＩ値を縦軸として抗体の阻害曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値が小さいほど、抗体がヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦＲ２の結合を阻害する能力が強いことを示した。ヒト化抗体の遮断効果を、対応するヒト－マウスキメラＷＴ抗体に正規化し、パーセント値が高いほど、ヒト化抗体の阻害効果が良好であることを示した。被験抗体の遮断曲線を図７に、阻害活性を表８に示す。図７及び表８から、すべての被験抗体がＴＮＦαとＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞上でのＴＮＦＲ２の結合を有意に阻害できることが分かる。
【0048】
【表8】
【0049】
実施例９ ＦＡＣＳによる、ＴＮＦ(誘導ヒトＴｒｅｇ細胞ＩκＢαの分解に対する抗体の阻害の検出実験
ヒトＴｒｅｇ細胞は、選別ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号：１８０６３）を使用してヒトＰＢＭＣから単離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ）によってインビトロで１５日間刺激及び増幅を行い、その後個別包装して凍結保存した。インビトロで単離増幅したＴｒｅｇ細胞を取り、一晩回復し、翌日３００×ｇで５分間遠心分離し、ＡＩＭ－Ｖ培地（ブランドＧｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５０２５）で培養して計数し、細胞の計数結果に従って細胞密度を６×１０6細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２５μＬで広げた。すべての被験抗体とａｎｔｉ－Ｈｅｌ対照抗体（それぞれＡＩＭ－Ｖ培地で４０％濃度に希釈し、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとした）を取った。各濃度の抗体を対応する細胞ウェルに１ウェルあたり２５μＬで加えた。マルチチャンネルピペットで混合した後、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターに入れ、３０ｍｉｎプレインキュベートした。ＡＩＭ－Ｖ培地を使用してＴＮＦα（ブランドＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ００８）を作業濃度の２倍である２０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＴＮＦα活性化を必要とするウェルに５０μＬのＴＮＦαを、非活性化対照ウェルに５０μＬのＡＩＭ－Ｖ培地を、抗体の最終濃度が１倍となり、ＴＮＦαの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように加え、ピペットで吹き混ぜて、培養プレートを３７℃のインキュベーターに入れて１０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、培養プレートを取り出し、１００μＬの予冷したＤＰＢＳを加え、４℃、３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。次に、細胞について、１×ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｖｉｏｌｅｔ（予冷したＤＰＢＳで５００倍希釈）１００μＬを使用して、氷上で２０ｍｉｎ反応させた。各ウェルに１００μＬの染色バッファーを加え、４℃、３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。各ウェルに１×ｆｉｘ－ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ（ブランドＢＤ、カタログ番号５５４７１４）を１００μＬずつ加えてよく混ぜ、４℃で３０ｍｉｎ固定した。固定終了後、各ウェルに１００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて固定を停止させ、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。次に、各ウェルに２００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて、細胞を２回洗浄した。１００μＬのＩκＢα染色液（１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒで１００倍希釈）を実験ウェルに加え、１μＬのＲａｔ ＩｇＧ２ｂ ｋａｐｐａ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体を対照ウェルに加え、よく混ぜ、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて固定を停止させ、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。次に、各ウェルに２００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて、細胞を２回洗浄した。フローサイトメーターで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。生細胞中のＩκＢαlowのパーセント又は全ての生細胞のＩκＢαのＭＦＩをフローサイトメトリーにより分析した。ＩκＢαlowの割合が低いほど、抗ＴＮＦＲ２抗体がＴＮＦα誘導ＩκＢαの分解を阻害する能力が強くなった。図８の結果から、陰性対照抗体ａｎｔｉ－ＨｅｌはＩκＢαの発現に影響を及ぼさないが、被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体はいずれもＴＮＦα誘導ＩκＢαの分解を阻害することができることが分かる。
ヒトＴｒｅｇ細胞は、選別ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号：１８０６３）を使用してヒトＰＢＭＣから単離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ）によってインビトロで１５日間刺激及び増幅を行い、その後個別包装して凍結保存した。インビトロで単離増幅したＴｒｅｇ細胞を取り、一晩回復し、翌日３００×ｇで５分間遠心分離し、ＡＩＭ－Ｖ培地（ブランドＧｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５０２５）で培養して計数し、細胞の計数結果に従って細胞密度を６×１０6細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２５μＬで広げた。すべての被験抗体とａｎｔｉ－Ｈｅｌ対照抗体（それぞれＡＩＭ－Ｖ培地で４０％濃度に希釈し、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとした）を取った。各濃度の抗体を対応する細胞ウェルに１ウェルあたり２５μＬで加えた。マルチチャンネルピペットで混合した後、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターに入れ、３０ｍｉｎプレインキュベートした。ＡＩＭ－Ｖ培地を使用してＴＮＦα（ブランドＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ００８）を作業濃度の２倍である２０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＴＮＦα活性化を必要とするウェルに５０μＬのＴＮＦαを、非活性化対照ウェルに５０μＬのＡＩＭ－Ｖ培地を、抗体の最終濃度が１倍となり、ＴＮＦαの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように加え、ピペットで吹き混ぜて、培養プレートを３７℃のインキュベーターに入れて１０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、培養プレートを取り出し、１００μＬの予冷したＤＰＢＳを加え、４℃、３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。次に、細胞について、１×ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｖｉｏｌｅｔ（予冷したＤＰＢＳで５００倍希釈）１００μＬを使用して、氷上で２０ｍｉｎ反応させた。各ウェルに１００μＬの染色バッファーを加え、４℃、３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。各ウェルに１×ｆｉｘ－ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ（ブランドＢＤ、カタログ番号５５４７１４）を１００μＬずつ加えてよく混ぜ、４℃で３０ｍｉｎ固定した。固定終了後、各ウェルに１００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて固定を停止させ、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。次に、各ウェルに２００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて、細胞を２回洗浄した。１００μＬのＩκＢα染色液（１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒで１００倍希釈）を実験ウェルに加え、１μＬのＲａｔ ＩｇＧ２ｂ ｋａｐｐａ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体を対照ウェルに加え、よく混ぜ、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて固定を停止させ、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。次に、各ウェルに２００μＬの１×ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを加えて、細胞を２回洗浄した。フローサイトメーターで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。生細胞中のＩκＢαlowのパーセント又は全ての生細胞のＩκＢαのＭＦＩをフローサイトメトリーにより分析した。ＩκＢαlowの割合が低いほど、抗ＴＮＦＲ２抗体がＴＮＦα誘導ＩκＢαの分解を阻害する能力が強くなった。図８の結果から、陰性対照抗体ａｎｔｉ－ＨｅｌはＩκＢαの発現に影響を及ぼさないが、被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体はいずれもＴＮＦα誘導ＩκＢαの分解を阻害することができることが分かる。
【0050】
実施例１０ ＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖に対するＴＮＦＲ２抗体の阻害
ＴＮＦＲ２抗体の存在下でのＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖を測定することにより、ＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖に対するこの抗体の阻害効果を判断した（Ｚａｒａｇｏｚａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１６ Ｊａｎ；２２（１）：１６－７）。インビトロで増輻単離してから凍結保存したＴｒｅｇ細胞を取り、一晩回復し、翌日４００×ｇで５分間遠心分離し、培地で再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。ＴｒｅｇをＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、１×１０7細胞あたり１μＬの保存液を用いて１ｍＬの染色液を調製した。３７℃で２０ｍｉｎ染色し、少なくとも５倍量の完全培地で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。培地で細胞を再懸濁して１回洗浄し、再度遠心分離して上清を取った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5細胞の密度で広げ、１×１０5細胞あたり５０μＬの培地の密度で細胞を再懸濁し、９６ウェルプレートに移し替えた。抗体の最終濃度が１２．５μｇ／ｍＬになるように、各ウェルに５０μＬの被験抗体を加え、インキュベーターで３０分間インキュベートした。その後、ＩＬ－２（最終濃度３００ＩＵ）及びＴＮＦα（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地５０μＬと、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ、ｂｅａｄｓ／Ｔｒｅｇ細胞比１：２０）を含む培地５０μＬを各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を２００μＬとした。条件毎に２つの平行なウェルを設定し、前記のプレートを混合し、３７℃のインキュベーターに入れて３日間培養してＦＡＣＳ検出（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）を行った。ＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する本抗体の阻害効果は、Ｔｒｅｇ増殖の割合で判断した。その結果を図９に示すが、対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ抗体と比較して、すべての抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体は、いずれもＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖を効果的に阻害でき、且つ有意差があった。
ＴＮＦＲ２抗体の存在下でのＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖を測定することにより、ＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖に対するこの抗体の阻害効果を判断した（Ｚａｒａｇｏｚａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１６ Ｊａｎ；２２（１）：１６－７）。インビトロで増輻単離してから凍結保存したＴｒｅｇ細胞を取り、一晩回復し、翌日４００×ｇで５分間遠心分離し、培地で再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。ＴｒｅｇをＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、１×１０7細胞あたり１μＬの保存液を用いて１ｍＬの染色液を調製した。３７℃で２０ｍｉｎ染色し、少なくとも５倍量の完全培地で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。培地で細胞を再懸濁して１回洗浄し、再度遠心分離して上清を取った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5細胞の密度で広げ、１×１０5細胞あたり５０μＬの培地の密度で細胞を再懸濁し、９６ウェルプレートに移し替えた。抗体の最終濃度が１２．５μｇ／ｍＬになるように、各ウェルに５０μＬの被験抗体を加え、インキュベーターで３０分間インキュベートした。その後、ＩＬ－２（最終濃度３００ＩＵ）及びＴＮＦα（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地５０μＬと、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ、ｂｅａｄｓ／Ｔｒｅｇ細胞比１：２０）を含む培地５０μＬを各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を２００μＬとした。条件毎に２つの平行なウェルを設定し、前記のプレートを混合し、３７℃のインキュベーターに入れて３日間培養してＦＡＣＳ検出（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）を行った。ＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する本抗体の阻害効果は、Ｔｒｅｇ増殖の割合で判断した。その結果を図９に示すが、対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ抗体と比較して、すべての抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体は、いずれもＴＮＦα及びＩＬ－２誘導Ｔｒｅｇ細胞の増殖を効果的に阻害でき、且つ有意差があった。
【0051】
実施例１１ Ｔｒｅｇ機能に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の阻害
抗ＴＮＦＲ２抗体を含む条件下でエフェクター（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の阻害機能を測定することにより、Ｔｒｅｇ細胞の阻害機能に対する抗体の阻害効果を判断した。実験に必要なＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）とＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）エフェクター細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）を取り、一晩回復し、翌日４００×ｇで５分間遠心分離し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ＋１×ＩＴＳ＋５０μＭＰＭメルカプトエタノール）に再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。Ｔｃｏｎ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、１×１０7細胞あたり１μＬの保存液を用いて１ｍＬの染色液を調製した。３７℃で２０ｍｉｎ染色し、少なくとも５倍量の完全培地で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。培地で細胞を再懸濁して１回洗浄し、再度遠心分離して上清を捨てた。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5細胞の密度で広げ、１×１０5細胞あたり５０μＬの培地の密度で細胞を再懸濁し、５０ｍＬの遠心分離管に移し替えた。同時にＴｒｅｇ細胞を準備し、Ｔｒｅｇ細胞とＴｃｏｎ細胞を１：１の比率で共培養した。Ｔｃｏｎ細胞の数に応じて、対応するａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ）を１／１０の比率で準備した。１ウェルあたり５０μＬの容量でＴｒｅｇ及びＴｃｏｎの培地に加えた。抗体の最終濃度が１２．５μｇ／ｍＬになるように、各ウェルに被験抗体を加えた。条件毎に３つの平行なウェルを設定し、前記のプレートを混合し、３７℃のインキュベーターに入れて４日間培養してフローサイトメーターで検出を行った。Ｔｃｏｎ増殖の割合が高いほど、抗体がＴｒｅｇを阻害する能力が強くなった。阻害結果を図１０に示すが、３つの被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体は、いずれもＴｃｏｎ細胞に対するＴｒｅｇの阻害効果を有意に阻害し、Ｔｃｏｎの増殖を促進することができ、且つ統計的差異を有した。
抗ＴＮＦＲ２抗体を含む条件下でエフェクター（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の阻害機能を測定することにより、Ｔｒｅｇ細胞の阻害機能に対する抗体の阻害効果を判断した。実験に必要なＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）とＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）エフェクター細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）を取り、一晩回復し、翌日４００×ｇで５分間遠心分離し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ＋１×ＩＴＳ＋５０μＭＰＭメルカプトエタノール）に再懸濁して細胞懸濁液を得、計数した。Ｔｃｏｎ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、１×１０7細胞あたり１μＬの保存液を用いて１ｍＬの染色液を調製した。３７℃で２０ｍｉｎ染色し、少なくとも５倍量の完全培地で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。培地で細胞を再懸濁して１回洗浄し、再度遠心分離して上清を捨てた。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5細胞の密度で広げ、１×１０5細胞あたり５０μＬの培地の密度で細胞を再懸濁し、５０ｍＬの遠心分離管に移し替えた。同時にＴｒｅｇ細胞を準備し、Ｔｒｅｇ細胞とＴｃｏｎ細胞を１：１の比率で共培養した。Ｔｃｏｎ細胞の数に応じて、対応するａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１２９Ｄ）を１／１０の比率で準備した。１ウェルあたり５０μＬの容量でＴｒｅｇ及びＴｃｏｎの培地に加えた。抗体の最終濃度が１２．５μｇ／ｍＬになるように、各ウェルに被験抗体を加えた。条件毎に３つの平行なウェルを設定し、前記のプレートを混合し、３７℃のインキュベーターに入れて４日間培養してフローサイトメーターで検出を行った。Ｔｃｏｎ増殖の割合が高いほど、抗体がＴｒｅｇを阻害する能力が強くなった。阻害結果を図１０に示すが、３つの被験抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体は、いずれもＴｃｏｎ細胞に対するＴｒｅｇの阻害効果を有意に阻害し、Ｔｃｏｎの増殖を促進することができ、且つ統計的差異を有した。
【0052】
実施例１２ ＦＡＣＳによる抗ＴＮＦＲ２抗体媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の検出
ＰＢＭＣと凍結保存したＴｒｅｇ細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ＋１×ＩＴＳ＋５０μＭＰＭメルカプトエタノール）で１日前に培養し、そのうち、ＰＢＭＣはＩＬ－２を１００ＩＵ／ｍＬ添加する必要があった。実験当日、分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５５）の要件に従ってＰＢＭＣからＮＫ細胞を分離し、完全培地（ＩＬ－２を含まない）で０．８×１０6／ｍＬの密度で再懸濁した。標的細胞であるＴｒｅｇ細胞又はＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ試薬で標識し、標識後に密度を０．４×１０6／ｍＬに調整した。被験抗体を完全培地で最終濃度の４倍に段階希釈し、後で使用するようにした。実験用プレートの分布図に従って標的細胞を１ウェルあたり５０μＬで細胞プレートに播種し、希釈した薬物を対応するウェルに広げ、標的細胞とともに３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、エフェクター細胞を添加する必要のあるウェルにエフェクター細胞懸濁液を１００μＬ添加し、エフェクター細胞を添加する必要のないウェルに培地を１００μＬ補充し、３７℃で４ｈインキュベートした。反応終了後、各ウェルに１μＬのＰＩ色素を加え、機器で検出した。標的細胞におけるＰＩの陽性の割合が高いほど、より顕著なＡＤＣＣ効果を示した。ＡＤＣＣ実験の結果を図１１に示すが、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ陰性対照抗体には作用標的がないため、ＡＤＣＣ殺傷効果がなく、３つの被験ヒト化抗体は、標的細胞であるＴｒｅｇ又はＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞の両方でいずれもＡＤＣＣ活性を示した。
ＰＢＭＣと凍結保存したＴｒｅｇ細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ＋１×ＩＴＳ＋５０μＭＰＭメルカプトエタノール）で１日前に培養し、そのうち、ＰＢＭＣはＩＬ－２を１００ＩＵ／ｍＬ添加する必要があった。実験当日、分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５５）の要件に従ってＰＢＭＣからＮＫ細胞を分離し、完全培地（ＩＬ－２を含まない）で０．８×１０6／ｍＬの密度で再懸濁した。標的細胞であるＴｒｅｇ細胞又はＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ試薬で標識し、標識後に密度を０．４×１０6／ｍＬに調整した。被験抗体を完全培地で最終濃度の４倍に段階希釈し、後で使用するようにした。実験用プレートの分布図に従って標的細胞を１ウェルあたり５０μＬで細胞プレートに播種し、希釈した薬物を対応するウェルに広げ、標的細胞とともに３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、エフェクター細胞を添加する必要のあるウェルにエフェクター細胞懸濁液を１００μＬ添加し、エフェクター細胞を添加する必要のないウェルに培地を１００μＬ補充し、３７℃で４ｈインキュベートした。反応終了後、各ウェルに１μＬのＰＩ色素を加え、機器で検出した。標的細胞におけるＰＩの陽性の割合が高いほど、より顕著なＡＤＣＣ効果を示した。ＡＤＣＣ実験の結果を図１１に示すが、ａｎｔｉ－Ｈｅｌ陰性対照抗体には作用標的がないため、ＡＤＣＣ殺傷効果がなく、３つの被験ヒト化抗体は、標的細胞であるＴｒｅｇ又はＣＨＯ－ＴＮＦＲ２細胞の両方でいずれもＡＤＣＣ活性を示した。
【0053】
実施例１３ ＴＮＦＲ２トランスジェニックヒト化マウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）におけるｈＴＮＦＲ２及びｍＴＮＦＲ２発現の検出
中美冠科生物技術有限公司との協力により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて相同組換えにより、ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ－ＷＰＲＥ－ＰＡ発現枠をＴｎｆｒｓｆ１ｂ遺伝子のｅｘｏｎ２部位にノックインし、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ遺伝子がｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ－ＷＰＲＥ－ＰＡにノックインされたヘテロ接合性ＢＡＬＢ／ｃマウスを得て、次に繁殖によりヒトＴｎｆｒｓｆ１ｂ（ＴＮＦＲ２）遺伝子を発現するホモ接合性トランスジェニックマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）を得た。６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から）及びＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスから末梢血を採取し、ＡＣＫ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９２０１）を使用して赤血球を除去し、ＦＡＣＳの免疫表現型検査を実施し、マウス末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞におけるｍＴＮＦＲ２及びｈＴＮＦＲ２の発現を検出し、すべての細胞集団のゲーティングはいずれもＦＭＯ対照を基準とした（図１２Ａ）。その結果、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスはｍＴＮＦＲ２を発現せず、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞の表面におけるｈＴＮＦＲ２の発現プロファイル／発現レベルはＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドマウスのｍＴＮＦＲ２と一致し、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスがｈＴＮＦＲ２によるｍＴＮＦＲ２の置換を完了したことが示された（図１２Ｂ～１２Ｃ）。
中美冠科生物技術有限公司との協力により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて相同組換えにより、ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ－ＷＰＲＥ－ＰＡ発現枠をＴｎｆｒｓｆ１ｂ遺伝子のｅｘｏｎ２部位にノックインし、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ遺伝子がｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ－ＷＰＲＥ－ＰＡにノックインされたヘテロ接合性ＢＡＬＢ／ｃマウスを得て、次に繁殖によりヒトＴｎｆｒｓｆ１ｂ（ＴＮＦＲ２）遺伝子を発現するホモ接合性トランスジェニックマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）を得た。６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から）及びＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスから末梢血を採取し、ＡＣＫ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９２０１）を使用して赤血球を除去し、ＦＡＣＳの免疫表現型検査を実施し、マウス末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞におけるｍＴＮＦＲ２及びｈＴＮＦＲ２の発現を検出し、すべての細胞集団のゲーティングはいずれもＦＭＯ対照を基準とした（図１２Ａ）。その結果、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスはｍＴＮＦＲ２を発現せず、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞の表面におけるｈＴＮＦＲ２の発現プロファイル／発現レベルはＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドマウスのｍＴＮＦＲ２と一致し、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスがｈＴＮＦＲ２によるｍＴＮＦＲ２の置換を完了したことが示された（図１２Ｂ～１２Ｃ）。
【0054】
実施例１４ ＴＮＦα誘導ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭのＴｒｅｇ細胞増殖に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の阻害
ＴＮＦＲ２抗体の存在下でＴＮＦα誘導ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスのＴｒｅｇ細胞増殖を測定することにより、遺伝子改変後のＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスにおいてＴＮＦＲ２シグナル伝達経路と対応する機能が保存されていることが確認され、改変後のトランスジェニックマウスが候補抗ＴＮＦＲ２抗体の体内薬効評価に使用できることが確保された。ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウス５匹と野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス５匹を用意し、安全キャビネット内でマウスの脾臓を無菌的に取り出して粉砕し、粉砕した細胞懸濁液をすべて１５ｍＬ遠心分離管に移し替えて遠心分離（３２０ｇ、７分間、４℃）した。上清を捨てた。約２～３ｍＬのＡＣＫ赤血球溶解バッファー（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９２０１）を加えてよく混ぜ、赤血球が完全に溶解するまで３～５分間室温で放置し、６～８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加えて溶解を停止させ、反転してよく混ぜた。遠心分離（２００ｇ、８分間、４℃）した。遠心分離後、上清を捨て、ＥａｓｙＳｅｐ ｂｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁し、４０μｍメンブレンフィルタで細胞を濾過し、細胞の計数を行った。次に、Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｋｉｔ（ブランドＳｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１８７８３Ａ）の説明書に従って、Ｔｒｅｇ細胞を選別した。選別したＴｒｅｇ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、１×１０7細胞あたり１μＬの保存液を用いて１ｍＬの染色液を調製した。３７℃で２０ｍｉｎ染色し、少なくとも５倍量の完全培地で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。培地で細胞を再懸濁して１回洗浄し、再度遠心分離して上清を取った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5細胞の密度で広げ、１×１０5細胞あたり５０μＬの培地の密度で細胞を再懸濁し、９６ウェルプレートに移し替えた。各ウェルに５０μＬの被験抗体（３つのヒト化ＴＮＦＲ２抗体、１つの抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｌｏｎｅ＃７５－５４．７（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＢＥ０２４７）及びアイソタイプ対照抗体であるａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ｍＩｇＧ１を含む）を加え、抗体の最終濃度が１０μｇ／ｍＬであり、インキュベーターで３０分間インキュベートした。その後、マウスＩＬ－２（ブランド義翹神州、カタログ番号５１０６１－ＭＮＡＥ、最終濃度３００ＩＵ）及びマウスＴＮＦα（ブランド義翹神州、カタログ番号２０１８０５０２、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地５０μＬと、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１４５２Ｄ、ｂｅａｄｓとＴｒｅｇ細胞比１：２０）を含まないか又は含む培地５０μＬを各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を２００μＬとした。同時に、Ｔｒｅｇ細胞＋マウスＩＬ－２のみ、Ｔｒｅｇ細胞＋マウスＴＮＦαのみ、及びＴｒｅｇ細胞＋マウスＩＬ－２とヒトＴＮＦαの対照ウェルを設定した。条件毎に２つの平行なウェルを設定し、前記のプレートを混合し、３７℃のインキュベーターに入れて３日間培養してＦＡＣＳ検出（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）を行った。ＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する本抗体の阻害効果は、Ｔｒｅｇ増殖の割合で判断した。図１３Ａは、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスのＴｒｅｇ細胞がヒトＴＮＦＲ２を発現するがマウスＴＮＦＲ２を発現しないことと、ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスのＴｒｅｇ細胞がマウスＴＮＦＲ２のみを発現することを示す。図１３Ｂ及び１３Ｃは、システムにＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニストが存在するかどうかに関係なく、ｍＩＬ－２及びｍＴＮＦα又はｈＴＮＦαを添加すると、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ Ｔｒｅｇの増殖が著しく増加したことを示すが、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスの遺伝子改変後にＴＮＦＲ２媒介シグナルが保存されていると考えられる。一方、ＷＴ ｂａｌｂ／ｃでは、ｍＩＬ－２とｍＴＮＦαの添加でのみ増殖が増加したが、ｈＴＮＦαは増殖に影響を与えなかったことから、ｈＴＮＦαはｍＴＮＦＲ２に結合しないことが示唆された。ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ Ｔｒｅｇについて、ｍＩＬ－２とｍＴＮＦαの存在下で抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体を添加すると、陰性対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ｍＩｇＧ１と比較して、００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ１及び２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ１はＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ Ｔｒｅｇの増殖を有意に阻害することができた、且つ統計的差異（＊＊＊ｐ＜０．００１）を有する一方で、抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体ＴＲ７５－５４．７には阻害効果がなく、ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃ Ｔｒｅｇについて、ｍＩＬ－２とｍＴＮＦαの存在下で抗ＴＮＦＲ２抗体を添加すると、陰性対照Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧと比較して、抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体ＴＲ７５－５４．７はＷＴ Ｂａｌｂ／ｃ Ｔｒｅｇの増殖を有意に阻害することができ、且つ統計的差異（＊＊＊ ｐ＜０．００１）を有する一方で、００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ１及び２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ１には阻害効果がなかった。
ＴＮＦＲ２抗体の存在下でＴＮＦα誘導ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスのＴｒｅｇ細胞増殖を測定することにより、遺伝子改変後のＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスにおいてＴＮＦＲ２シグナル伝達経路と対応する機能が保存されていることが確認され、改変後のトランスジェニックマウスが候補抗ＴＮＦＲ２抗体の体内薬効評価に使用できることが確保された。ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウス５匹と野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス５匹を用意し、安全キャビネット内でマウスの脾臓を無菌的に取り出して粉砕し、粉砕した細胞懸濁液をすべて１５ｍＬ遠心分離管に移し替えて遠心分離（３２０ｇ、７分間、４℃）した。上清を捨てた。約２～３ｍＬのＡＣＫ赤血球溶解バッファー（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９２０１）を加えてよく混ぜ、赤血球が完全に溶解するまで３～５分間室温で放置し、６～８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加えて溶解を停止させ、反転してよく混ぜた。遠心分離（２００ｇ、８分間、４℃）した。遠心分離後、上清を捨て、ＥａｓｙＳｅｐ ｂｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁し、４０μｍメンブレンフィルタで細胞を濾過し、細胞の計数を行った。次に、Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｋｉｔ（ブランドＳｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１８７８３Ａ）の説明書に従って、Ｔｒｅｇ細胞を選別した。選別したＴｒｅｇ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、１×１０7細胞あたり１μＬの保存液を用いて１ｍＬの染色液を調製した。３７℃で２０ｍｉｎ染色し、少なくとも５倍量の完全培地で反応を中和し、５ｍｉｎ静置し、４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。培地で細胞を再懸濁して１回洗浄し、再度遠心分離して上清を取った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5細胞の密度で広げ、１×１０5細胞あたり５０μＬの培地の密度で細胞を再懸濁し、９６ウェルプレートに移し替えた。各ウェルに５０μＬの被験抗体（３つのヒト化ＴＮＦＲ２抗体、１つの抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｌｏｎｅ＃７５－５４．７（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＢＥ０２４７）及びアイソタイプ対照抗体であるａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ｍＩｇＧ１を含む）を加え、抗体の最終濃度が１０μｇ／ｍＬであり、インキュベーターで３０分間インキュベートした。その後、マウスＩＬ－２（ブランド義翹神州、カタログ番号５１０６１－ＭＮＡＥ、最終濃度３００ＩＵ）及びマウスＴＮＦα（ブランド義翹神州、カタログ番号２０１８０５０２、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地５０μＬと、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１４５２Ｄ、ｂｅａｄｓとＴｒｅｇ細胞比１：２０）を含まないか又は含む培地５０μＬを各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を２００μＬとした。同時に、Ｔｒｅｇ細胞＋マウスＩＬ－２のみ、Ｔｒｅｇ細胞＋マウスＴＮＦαのみ、及びＴｒｅｇ細胞＋マウスＩＬ－２とヒトＴＮＦαの対照ウェルを設定した。条件毎に２つの平行なウェルを設定し、前記のプレートを混合し、３７℃のインキュベーターに入れて３日間培養してＦＡＣＳ検出（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）を行った。ＴＮＦα誘導Ｔｒｅｇ増殖に対する本抗体の阻害効果は、Ｔｒｅｇ増殖の割合で判断した。図１３Ａは、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスのＴｒｅｇ細胞がヒトＴＮＦＲ２を発現するがマウスＴＮＦＲ２を発現しないことと、ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスのＴｒｅｇ細胞がマウスＴＮＦＲ２のみを発現することを示す。図１３Ｂ及び１３Ｃは、システムにＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニストが存在するかどうかに関係なく、ｍＩＬ－２及びｍＴＮＦα又はｈＴＮＦαを添加すると、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ Ｔｒｅｇの増殖が著しく増加したことを示すが、ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウスの遺伝子改変後にＴＮＦＲ２媒介シグナルが保存されていると考えられる。一方、ＷＴ ｂａｌｂ／ｃでは、ｍＩＬ－２とｍＴＮＦαの添加でのみ増殖が増加したが、ｈＴＮＦαは増殖に影響を与えなかったことから、ｈＴＮＦαはｍＴＮＦＲ２に結合しないことが示唆された。ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ Ｔｒｅｇについて、ｍＩＬ－２とｍＴＮＦαの存在下で抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体を添加すると、陰性対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ－ｍＩｇＧ１と比較して、００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ１及び２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ１はＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ Ｔｒｅｇの増殖を有意に阻害することができた、且つ統計的差異（＊＊＊ｐ＜０．００１）を有する一方で、抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体ＴＲ７５－５４．７には阻害効果がなく、ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃ Ｔｒｅｇについて、ｍＩＬ－２とｍＴＮＦαの存在下で抗ＴＮＦＲ２抗体を添加すると、陰性対照Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧと比較して、抗マウスＴＮＦＲ２置換抗体ＴＲ７５－５４．７はＷＴ Ｂａｌｂ／ｃ Ｔｒｅｇの増殖を有意に阻害することができ、且つ統計的差異（＊＊＊ ｐ＜０．００１）を有する一方で、００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ１及び２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ１には阻害効果がなかった。
【0055】
実施例１５ ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭマウス腫瘍モデルにおける抗ＴＮＦＲ２抗体の薬効評価
百奥賽図基因生物技術有限公司との協力により、同社がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいて開発したＥＧＥシステムを使用して、遺伝子ノックアウトを目的としてマウスＣＴ２６細胞株のｍＴＮＦＲ２遺伝子のＥｘｏｎ２及びＥｘｏｎ３の一部をＰｕｒｏＲ ｃａｓｓｅｔｔｅに置換し、マウス内因性ｍＴＮＦＲ２の発現を破壊し、そして、マウス細胞内領域、及び膜貫通領域をヒト細胞外領域キメラタンパク質のＣＤＳに挿入し、ｈＴＮＦＲ２遺伝子のみを発現するＣＴ２６細胞株（ＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ）を作製した。ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭを使用して、ｈＴＮＦＲ２遺伝子をノックインしたＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ細胞株結腸癌動物モデルを確立し、抗ＴＮＦＲ２抗体の薬効実験を行った。
セルバンクからＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ細胞を１個取り出し、完全１６４０培地（１６４０（Ｇｉｂｃｏ、６１８７０－０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１Ｃ）＋１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）＋１％Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１３６０－０７０）＋１６μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１１３８－０３））で細胞を回復させ、回復した細胞を細胞培養フラスコに入れ（フラスコの壁に細胞の種類、世代、日付、培養者の名前などを記載）、ＣＯ2インキュベーター（インキュベーター温度３７℃、ＣＯ2濃度５％）で培養し、細胞が培養フラスコの底部の８０％～９０％を覆った後、継代し、継代後の細胞をＣＯ2インキュベーターで培養を続け、細胞数が体内薬効実験の要件を満たすまでこのプロセスを繰り返し、その後、細胞懸濁液を調製し、全自動セルカウンター（ＢＥＣＫＭＡＮ、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ）で計数し、計数結果に従い、ＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６．０１）溶液で細胞を再懸濁し、細胞懸濁液（密度２×１０6／ｍＬ）を調製した。前記の細胞懸濁液をマウスの右側皮下に１００μＬ／匹で接種し、腫瘍体積が約１００ｍｍ3に達した時点で、腫瘍体積が中程度のマウスを選択して群に入れ、腫瘍体積に応じてＥＸＣＥＬの乱数に基づいた無作為群分け法を用いて、動物を８つの実験群に割り当て、群分けを表９に示し、同日（Ｄａｙ ０と表記）から投与を開始し、投与量は１０ｍＬ／ｋｇ、溶媒はＰＢＳとし、３日に１回、腹腔内注射により、合計４回投与した。腫瘍体積と体重を週３回、決まった時間に測定した。腫瘍体積の計算式：腫瘍体積（ｍｍ3）＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２、腫瘍抑制率の計算式：ＴＧＩ（％）＝［１－Ｔ／Ｃ］×１００％、いずれもＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡの統計的手法を用いて実験データを分析した。投与後１１日目に、対照群と比較して、実験した抗ＴＮＦＲ２抗体群の各用量群は、ＰＢＳ対照群と比較していずれも統計的差異を有し、有効性は明らかであり、また、同じ抗体の異なる用量群間にも用量依存関係があり、同時に、陽性薬ａｎｔｉ－ｍＰＤ－１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＢＥ０１４６）の１０ｍｐｋでの有効性は、３ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の用量で実験した抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ２ａと００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ２ａの有効性と同等であり、これらの結果から、実験した抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体がインビボで有意な腫瘍増殖阻害効果を有し、用量依存関係があることを示した（図１４Ａ及び図１４Ｂ、表１０）。同時に、各群の実験動物は、投与期間中に活動及び摂食の状態が良好であり、体重と体重変化率はいずれもある程度増加したから、実験した抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体のインビボでの安全性リスクが低いことを示した（図１５Ａ～Ｄ）。
百奥賽図基因生物技術有限公司との協力により、同社がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいて開発したＥＧＥシステムを使用して、遺伝子ノックアウトを目的としてマウスＣＴ２６細胞株のｍＴＮＦＲ２遺伝子のＥｘｏｎ２及びＥｘｏｎ３の一部をＰｕｒｏＲ ｃａｓｓｅｔｔｅに置換し、マウス内因性ｍＴＮＦＲ２の発現を破壊し、そして、マウス細胞内領域、及び膜貫通領域をヒト細胞外領域キメラタンパク質のＣＤＳに挿入し、ｈＴＮＦＲ２遺伝子のみを発現するＣＴ２６細胞株（ＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ）を作製した。ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭを使用して、ｈＴＮＦＲ２遺伝子をノックインしたＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ細胞株結腸癌動物モデルを確立し、抗ＴＮＦＲ２抗体の薬効実験を行った。
セルバンクからＣＴ２６－ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ細胞を１個取り出し、完全１６４０培地（１６４０（Ｇｉｂｃｏ、６１８７０－０３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１Ｃ）＋１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）＋１％Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１３６０－０７０）＋１６μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１１３８－０３））で細胞を回復させ、回復した細胞を細胞培養フラスコに入れ（フラスコの壁に細胞の種類、世代、日付、培養者の名前などを記載）、ＣＯ2インキュベーター（インキュベーター温度３７℃、ＣＯ2濃度５％）で培養し、細胞が培養フラスコの底部の８０％～９０％を覆った後、継代し、継代後の細胞をＣＯ2インキュベーターで培養を続け、細胞数が体内薬効実験の要件を満たすまでこのプロセスを繰り返し、その後、細胞懸濁液を調製し、全自動セルカウンター（ＢＥＣＫＭＡＮ、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ）で計数し、計数結果に従い、ＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６．０１）溶液で細胞を再懸濁し、細胞懸濁液（密度２×１０6／ｍＬ）を調製した。前記の細胞懸濁液をマウスの右側皮下に１００μＬ／匹で接種し、腫瘍体積が約１００ｍｍ3に達した時点で、腫瘍体積が中程度のマウスを選択して群に入れ、腫瘍体積に応じてＥＸＣＥＬの乱数に基づいた無作為群分け法を用いて、動物を８つの実験群に割り当て、群分けを表９に示し、同日（Ｄａｙ ０と表記）から投与を開始し、投与量は１０ｍＬ／ｋｇ、溶媒はＰＢＳとし、３日に１回、腹腔内注射により、合計４回投与した。腫瘍体積と体重を週３回、決まった時間に測定した。腫瘍体積の計算式：腫瘍体積（ｍｍ3）＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２、腫瘍抑制率の計算式：ＴＧＩ（％）＝［１－Ｔ／Ｃ］×１００％、いずれもＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡの統計的手法を用いて実験データを分析した。投与後１１日目に、対照群と比較して、実験した抗ＴＮＦＲ２抗体群の各用量群は、ＰＢＳ対照群と比較していずれも統計的差異を有し、有効性は明らかであり、また、同じ抗体の異なる用量群間にも用量依存関係があり、同時に、陽性薬ａｎｔｉ－ｍＰＤ－１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＢＥ０１４６）の１０ｍｐｋでの有効性は、３ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の用量で実験した抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１－ｍＩｇＧ２ａと００１－Ｈｕ３－ｍＩｇＧ２ａの有効性と同等であり、これらの結果から、実験した抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体がインビボで有意な腫瘍増殖阻害効果を有し、用量依存関係があることを示した（図１４Ａ及び図１４Ｂ、表１０）。同時に、各群の実験動物は、投与期間中に活動及び摂食の状態が良好であり、体重と体重変化率はいずれもある程度増加したから、実験した抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体のインビボでの安全性リスクが低いことを示した（図１５Ａ～Ｄ）。
【0056】
【表9】
【0057】
【表10】
【0058】
実施例１６ ヒトＰＢＭＣ免疫再構成ヒト化マウス結腸腫瘍モデルにおける抗ＴＮＦＲ２抗体の薬効評価
７～９週齢のＮＯＧ雌マウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を選択し、皮下に３．５×１０6個のＨＴ－２９細胞を接種し（実験０日目とする）、当日に腹腔内に７×１０6個のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、ｄｏｎｏｒ＃１９３及びｄｏｎｏｒ＃２７２、中美冠科生物技術（太倉）有限公司によりＳＯＰ－ＣＰ－０４２に従ってスクリーニングしたドナーの全血から抽出）を注射し、ＰＢＭＣヒト化結腸癌モデルを確立した。腫瘍体積が９５ｍｍ3に達した時点で、腫瘍体積が中程度のマウスを選択して群に入れ、腫瘍体積に応じてＳｔｕｄｙ ＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭ（バージョン番号３．１．３９９．１９、供給者Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて無作為に群分けして、動物を５つの実験群（Ｇ１はＰＢＳ対照群、Ｇ２は対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｈＩｇＧ１群、Ｇ３は抗ＴＮＦＲ２抗体００１－Ｈｕ３－ｈＩｇＧ１群、Ｇ４は抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１群、Ｇ５はＫｅｙｔｒｕｄａ群）に割り当て、２つのドナーで各群に５～７匹が割り当てられ、体内薬力学の研究に使用された。群分け（１３日目）の同日に投与を開始した。投与量はいずれも１０ｍｇ／ｋｇで、週２回、腹腔内注射で投与した。腫瘍体積と体重を週２回、決まった時間に測定した。腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算式は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ2である。そのうち、ａとｂはそれぞれ長さ、幅を示す。ｄｏｎｏｒ＃１９３において、腫瘍接種後２９日目に、対照抗体群と比較して、２１９－Ｈｕ１群の腫瘍成長は有意に阻害され、統計的差異を有し（ｐ＜０．０００１）、他の群は対照抗体群と比較して統計的差異がなかった。ｄｏｎｏｒ＃１９３において、抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１が有意な有効性を有することを示した（図１６Ａ）。ｄｏｎｏｒ＃２７２において、腫瘍接種後２９日目に、対照抗体群と比較して、００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１、及びＫｅｙｔｒｕｄａ群の腫瘍成長はすべて有意に阻害され、統計的差異を有した（ｐ＜０．０００１）。ｄｏｎｏｒ＃２７２において、Ｋｅｙｔｒｕｄａと抗ＴＮＦＲ２抗体００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１はいずれも有効性を有することを示した（図１６Ｂ）。
実験中、対照群と投与群のマウスはいずれも体重が減少し、且ついずれもマウスが死亡し、獣医の剖検結果によると、マウスはＰＢＭＣの注射によって引き起こされた宿主免疫拒絶反応（ＧｖＨＤ）が原因で死亡したと推測された。被験薬００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１及び陽性薬Ｋｅｙｔｒｕｄａの被験用量１０ｍｇ／ｋｇでは、動物は明らかな薬物毒性を示さず、治療に耐えることができた（図１６Ｃ～Ｄ）。
最後の投与から４８ｈ後に、それぞれＧ２対照抗体群、Ｇ３抗ＴＮＦＲ２抗体００１－Ｈｕ３群、及びＧ４抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１群のマウスを選択して、腫瘍浸潤免疫細胞（ＴＩＬ）を単離し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９５－９２９）、ＦＡＣＳの免疫表現型検査を実施し、そして１２３ ｃｏｕｎｔ ｅＢｅａｄｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号０１－１２３４－４２）を絶対細胞計数のために加え、すべての細胞集団のゲーティングはいずれもＦＭＯ対照を基準とした（図１７Ａ）。実験結果は、対照抗体群と比較して、ｄｏｎｏｒ＃１９３抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が減少したが、数に有意差はなく、ｄｏｎｏｒ＃２７２抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合と数に有意差はなく（図１７Ｂ～Ｃ、Ｅ～Ｆ）、対照抗体群と比較して、ｄｏｎｏｒ＃１９３抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加したが、数に有意差はなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に有意差はなく、しかし、００１－Ｈｕ３抗体治療群のＣＤ８＋Ｔ細胞の数は有意に増加し（図１７Ｂ～Ｃ、Ｅ～Ｆ）、２つのｄｏｎｏｒの結果は、抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）細胞の割合と数が対照抗体群よりも有意に低く、有意差があり（図１７Ｂ～Ｃ、Ｅ～Ｆ）、同時に、抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＴｒｅｇ細胞数に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の比率（ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ）も、対照抗体群よりも有意に高く、統計的差異を有した（図１７Ｄ、Ｇ）ことを示した。以上のデータから、抗ＴＮＦＲ２抗体の投与により、ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ比を有意に増加させ、腫瘍の成長を抑制できることが分かる。
７～９週齢のＮＯＧ雌マウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を選択し、皮下に３．５×１０6個のＨＴ－２９細胞を接種し（実験０日目とする）、当日に腹腔内に７×１０6個のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、ｄｏｎｏｒ＃１９３及びｄｏｎｏｒ＃２７２、中美冠科生物技術（太倉）有限公司によりＳＯＰ－ＣＰ－０４２に従ってスクリーニングしたドナーの全血から抽出）を注射し、ＰＢＭＣヒト化結腸癌モデルを確立した。腫瘍体積が９５ｍｍ3に達した時点で、腫瘍体積が中程度のマウスを選択して群に入れ、腫瘍体積に応じてＳｔｕｄｙ ＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭ（バージョン番号３．１．３９９．１９、供給者Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて無作為に群分けして、動物を５つの実験群（Ｇ１はＰＢＳ対照群、Ｇ２は対照抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｈＩｇＧ１群、Ｇ３は抗ＴＮＦＲ２抗体００１－Ｈｕ３－ｈＩｇＧ１群、Ｇ４は抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１群、Ｇ５はＫｅｙｔｒｕｄａ群）に割り当て、２つのドナーで各群に５～７匹が割り当てられ、体内薬力学の研究に使用された。群分け（１３日目）の同日に投与を開始した。投与量はいずれも１０ｍｇ／ｋｇで、週２回、腹腔内注射で投与した。腫瘍体積と体重を週２回、決まった時間に測定した。腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算式は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ2である。そのうち、ａとｂはそれぞれ長さ、幅を示す。ｄｏｎｏｒ＃１９３において、腫瘍接種後２９日目に、対照抗体群と比較して、２１９－Ｈｕ１群の腫瘍成長は有意に阻害され、統計的差異を有し（ｐ＜０．０００１）、他の群は対照抗体群と比較して統計的差異がなかった。ｄｏｎｏｒ＃１９３において、抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１が有意な有効性を有することを示した（図１６Ａ）。ｄｏｎｏｒ＃２７２において、腫瘍接種後２９日目に、対照抗体群と比較して、００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１、及びＫｅｙｔｒｕｄａ群の腫瘍成長はすべて有意に阻害され、統計的差異を有した（ｐ＜０．０００１）。ｄｏｎｏｒ＃２７２において、Ｋｅｙｔｒｕｄａと抗ＴＮＦＲ２抗体００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１はいずれも有効性を有することを示した（図１６Ｂ）。
実験中、対照群と投与群のマウスはいずれも体重が減少し、且ついずれもマウスが死亡し、獣医の剖検結果によると、マウスはＰＢＭＣの注射によって引き起こされた宿主免疫拒絶反応（ＧｖＨＤ）が原因で死亡したと推測された。被験薬００１－Ｈｕ３、２１９－Ｈｕ１及び陽性薬Ｋｅｙｔｒｕｄａの被験用量１０ｍｇ／ｋｇでは、動物は明らかな薬物毒性を示さず、治療に耐えることができた（図１６Ｃ～Ｄ）。
最後の投与から４８ｈ後に、それぞれＧ２対照抗体群、Ｇ３抗ＴＮＦＲ２抗体００１－Ｈｕ３群、及びＧ４抗ＴＮＦＲ２抗体２１９－Ｈｕ１群のマウスを選択して、腫瘍浸潤免疫細胞（ＴＩＬ）を単離し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９５－９２９）、ＦＡＣＳの免疫表現型検査を実施し、そして１２３ ｃｏｕｎｔ ｅＢｅａｄｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号０１－１２３４－４２）を絶対細胞計数のために加え、すべての細胞集団のゲーティングはいずれもＦＭＯ対照を基準とした（図１７Ａ）。実験結果は、対照抗体群と比較して、ｄｏｎｏｒ＃１９３抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が減少したが、数に有意差はなく、ｄｏｎｏｒ＃２７２抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合と数に有意差はなく（図１７Ｂ～Ｃ、Ｅ～Ｆ）、対照抗体群と比較して、ｄｏｎｏｒ＃１９３抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加したが、数に有意差はなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に有意差はなく、しかし、００１－Ｈｕ３抗体治療群のＣＤ８＋Ｔ細胞の数は有意に増加し（図１７Ｂ～Ｃ、Ｅ～Ｆ）、２つのｄｏｎｏｒの結果は、抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）細胞の割合と数が対照抗体群よりも有意に低く、有意差があり（図１７Ｂ～Ｃ、Ｅ～Ｆ）、同時に、抗ＴＮＦＲ２抗体治療群のＴｒｅｇ細胞数に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の比率（ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ）も、対照抗体群よりも有意に高く、統計的差異を有した（図１７Ｄ、Ｇ）ことを示した。以上のデータから、抗ＴＮＦＲ２抗体の投与により、ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ比を有意に増加させ、腫瘍の成長を抑制できることが分かる。
【0059】
実施例１７ ＴＮＦＲ２ヒト化ＢＡＬＢｃマウスモデルにおける２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１モノクローナル抗体と抗マウスＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の併用効果の検出
ヒトＴＮＦＲ２遺伝子改変ＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌細胞（ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ－ＣＴ２６）をヒトＴＮＦＲ２発現遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）に皮下接種する動物モデルにより、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体と抗マウスＰＤ－Ｌ１（ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＢＥ０１０１）の併用効果を評価した。マウスの右側皮下に５×１０5のＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌細胞を接種した（実験０日目とする）。腫瘍体積が１００ｍｍ3に達した時点で、腫瘍体積が中程度のマウスを選択して群に入れ、腫瘍体積に応じてＥＸＣＥＬの乱数に基づいた無作為群分け法を用いて、動物を５つの実験群（Ｇ１は対照群、Ｇ２はａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体群、Ｇ３は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体群、Ｇ４は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ抗体群、Ｇ５は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体併用群）に割り当て、各群に１０匹の動物が割り当てられ、体内薬力学の研究に使用され、群分け（１０日目）の同日に投与を開始した。週２回、腹腔内注射で投与した。腫瘍体積と体重を週３回、決まった時間に測定した。
腫瘍接種後１８日目（即ち、投与８日目）に、対照群（Ｇ１）と比較して、Ｇ２ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群、Ｇ３ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群及びＧ４ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩTV値は、それぞれ３５．１％、２８．２％、６３．８％であり、腫瘍体積の増加は、これら３つの治療群で有意に抑制され（Ｇ２ ｖｓ．Ｇ１、ｐ値＜０．０００１；Ｇ３ ｖｓ．Ｇ１、ｐ値＝０．０００２；Ｇ４ ｖｓ．Ｇ１、Ｐ値＜０．０００１）、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩTV値は同等であり、しかし、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩTV値は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群よりも有意に高かった（Ｇ２ ｖｓ．Ｇ４、Ｐ値＝０．０００２；Ｇ３ ｖｓ．Ｇ４、Ｐ値＜０．０００１）。前記の結果は、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１が１０～３０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で用量依存的な効果を示し、用量の増加とともに腫瘍体積が減少したことを示す。詳細は、表１１及び図１８に示す。
腫瘍接種後１８日目に、対照群（Ｇ１）と比較して、Ｇ５ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ併用群では、腫瘍体積の増加も有意に抑制され（ＴＧＩTV値＝６６．５、ｖｓ．Ｇ１、Ｐ値＜０．０００１）、そして、Ｇ５ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ併用群の平均腫瘍体積も、Ｇ３ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ及びＧ２ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇの単剤群よりも有意に小さく（ＴＧＩTV Ｇ５ ｖｓ．Ｇ３ ｖｓ．Ｇ２＝６６．５％ ｖｓ．２８．２％ ｖｓ．３５．１％；Ｐ値Ｇ５ ｖｓ．Ｇ２＜０．０００１、Ｐ値Ｇ５ ｖｓ．Ｇ３＜０．０００１）、これは、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１抗体を併用すると、２つの単剤群と比較して、腫瘍成長をより抑制でき、統計的差異を有すること（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、単剤群ｖｓ．併用群）を示した。具体的には表１１、図１８に示す。
ヒトＴＮＦＲ２遺伝子改変ＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌細胞（ｈＴＮＦＲ２ ＫＩ－ＣＴ２６）をヒトＴＮＦＲ２発現遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＴＮＦＲ２ ＨｕＧＥＭＭ）に皮下接種する動物モデルにより、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体と抗マウスＰＤ－Ｌ１（ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＢＥ０１０１）の併用効果を評価した。マウスの右側皮下に５×１０5のＣＴ２６．１Ｃ０３結腸癌細胞を接種した（実験０日目とする）。腫瘍体積が１００ｍｍ3に達した時点で、腫瘍体積が中程度のマウスを選択して群に入れ、腫瘍体積に応じてＥＸＣＥＬの乱数に基づいた無作為群分け法を用いて、動物を５つの実験群（Ｇ１は対照群、Ｇ２はａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体群、Ｇ３は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体群、Ｇ４は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ抗体群、Ｇ５は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体併用群）に割り当て、各群に１０匹の動物が割り当てられ、体内薬力学の研究に使用され、群分け（１０日目）の同日に投与を開始した。週２回、腹腔内注射で投与した。腫瘍体積と体重を週３回、決まった時間に測定した。
腫瘍接種後１８日目（即ち、投与８日目）に、対照群（Ｇ１）と比較して、Ｇ２ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群、Ｇ３ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群及びＧ４ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩTV値は、それぞれ３５．１％、２８．２％、６３．８％であり、腫瘍体積の増加は、これら３つの治療群で有意に抑制され（Ｇ２ ｖｓ．Ｇ１、ｐ値＜０．０００１；Ｇ３ ｖｓ．Ｇ１、ｐ値＝０．０００２；Ｇ４ ｖｓ．Ｇ１、Ｐ値＜０．０００１）、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩTV値は同等であり、しかし、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩTV値は２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群よりも有意に高かった（Ｇ２ ｖｓ．Ｇ４、Ｐ値＝０．０００２；Ｇ３ ｖｓ．Ｇ４、Ｐ値＜０．０００１）。前記の結果は、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１が１０～３０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で用量依存的な効果を示し、用量の増加とともに腫瘍体積が減少したことを示す。詳細は、表１１及び図１８に示す。
腫瘍接種後１８日目に、対照群（Ｇ１）と比較して、Ｇ５ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ併用群では、腫瘍体積の増加も有意に抑制され（ＴＧＩTV値＝６６．５、ｖｓ．Ｇ１、Ｐ値＜０．０００１）、そして、Ｇ５ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ併用群の平均腫瘍体積も、Ｇ３ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ及びＧ２ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇの単剤群よりも有意に小さく（ＴＧＩTV Ｇ５ ｖｓ．Ｇ３ ｖｓ．Ｇ２＝６６．５％ ｖｓ．２８．２％ ｖｓ．３５．１％；Ｐ値Ｇ５ ｖｓ．Ｇ２＜０．０００１、Ｐ値Ｇ５ ｖｓ．Ｇ３＜０．０００１）、これは、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体とａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１抗体を併用すると、２つの単剤群と比較して、腫瘍成長をより抑制でき、統計的差異を有すること（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、単剤群ｖｓ．併用群）を示した。具体的には表１１、図１８に示す。
【0060】
【表11】
【0061】
注記：
a.平均値±ＳＤ。
b.相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝ＴRTV／ＣRTV×１００％（ＴRTV：治療群の平均ＲＴＶ、ＣRTV：陰 性対照群の平均ＲＴＶ）。相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ ）は、腫瘍測定の結果に従って計算され、計算式はＲＴＶ＝Ｖt／Ｖ0であり、そのうち、Ｖ0は 群分けして投与した時（即ちＰＯ－Ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖtはある時に測定した腫 瘍体積である。
c.ＴＧＩTV（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％計算（Ｔｉ：投与ｉ日目の 治療群の平均腫瘍体積、Ｔ０：投与０日目の治療群の平均腫瘍体積、Ｖｉ：投与ｉ日目の溶媒対照 群の平均腫瘍体積、Ｖ０：投与０日目の溶媒対照群の平均腫瘍体積）。
d.データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析され、ｖｓ．Ｇ１ Ｖｅｈ、ｐ＜０．０５は 有意差があることを意味し、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
e.データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析され、ｖｓ．Ｇ５併用群、ｐ＜０．０５は有 意差があることを意味し、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
ｆ．データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析され、ｖｓ．Ｇ４ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｐｋ、ｐ＜０．０５は有意差があることを意味し、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
a.平均値±ＳＤ。
b.相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝ＴRTV／ＣRTV×１００％（ＴRTV：治療群の平均ＲＴＶ、ＣRTV：陰 性対照群の平均ＲＴＶ）。相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ ）は、腫瘍測定の結果に従って計算され、計算式はＲＴＶ＝Ｖt／Ｖ0であり、そのうち、Ｖ0は 群分けして投与した時（即ちＰＯ－Ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖtはある時に測定した腫 瘍体積である。
c.ＴＧＩTV（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％計算（Ｔｉ：投与ｉ日目の 治療群の平均腫瘍体積、Ｔ０：投与０日目の治療群の平均腫瘍体積、Ｖｉ：投与ｉ日目の溶媒対照 群の平均腫瘍体積、Ｖ０：投与０日目の溶媒対照群の平均腫瘍体積）。
d.データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析され、ｖｓ．Ｇ１ Ｖｅｈ、ｐ＜０．０５は 有意差があることを意味し、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
e.データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析され、ｖｓ．Ｇ５併用群、ｐ＜０．０５は有 意差があることを意味し、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
ｆ．データは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析され、ｖｓ．Ｇ４ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｐｋ、ｐ＜０．０５は有意差があることを意味し、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【0062】
各群の実験動物は、投与期間中に、活動及び摂食の状態が良好であり、体重には一定の程度の上昇が認められた。実験期間中の観察において、各群には動物の精神状態、活動状態、及び体表観察の悪化はいずれも認められず、動物は薬物毒性を示さず、安全性は良好であり、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１抗体及び２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１抗体の併用は高い安全性を有することを示した。詳細は、図１９～２０及び表１２に示す。
【0063】
【表12】
【0064】
腫瘍接種後１８日目に、各群の動物を安楽死させた後、腫瘍を分離して重量を測定し、対照群（Ｇ１）と比較して、Ｇ２ ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍重量は有意に減少し（ＴＧＩTW＝３７．３％、Ｐ値０．００８７）、Ｇ３ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍重量は対照群よりも低かったが、統計的差異はなく（ＴＧＩTW＝２５．９％、Ｐ値０．０８３０）、Ｇ４ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ ３０ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍重量も対照群よりも有意に低く（ＴＧＩTW＝４７．９％、Ｐ値０．００１３）、Ｇ５ ２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ａｎｔｉ－ｍＰＤ－Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ併用群の腫瘍重量も対照群よりも有意に低く（ＴＧＩTW＝４３．０％、Ｐ値０．００４２）、２１９－Ｈｕ１－ｈＩｇＧ１の２つの用量での腫瘍重量は用量依存的な効果を示し、腫瘍重量は用量の増加とともに減少し、併用群の腫瘍重量は各単剤群（Ｇ２、Ｇ３）の腫瘍重量よりも小さかったが、統計的差異はなかった（図２１、表１３）。
【0065】
【表13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】