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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-18
(45)【発行日】2025-02-27
(54)【発明の名称】二重特異性抗ＣＤ２８Ｘ抗ＣＤ２２抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20250219BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250219BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250219BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250219BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250219BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K45/00
A61P35/00
A61P43/00 121
A61P35/02
A61K39/395 T
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021531128
(86)(22)【出願日】2019-12-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-28
(86)【国際出願番号】 US2019067173
(87)【国際公開番号】W WO2020132066
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2022-12-14
(31)【優先権主張番号】62/781,689
(32)【優先日】2018-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】マーフィー， アンドリュー ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】スココス， ディミトリス
(72)【発明者】
【氏名】ウェイト， ジャネール
(72)【発明者】
【氏名】ウルマン， エリカ
(72)【発明者】
【氏名】ハーマン， アイヌール
(72)【発明者】
【氏名】スミス， エリック
(72)【発明者】
【氏名】オルソン， カラ
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ， ジョイス
(72)【発明者】
【氏名】ヤンコポーロス， ジョージ ディー．
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００７９３５３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／０４４７９３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２００８／０３８５８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】CANCER RESEARCH，1993年， 53，4310-4314
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ａ）ヒトＣＤ２８と結合する第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）であって、
前記第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み、
前記ＨＣＶＲが、配列番号２８を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３０を含むＨＣＤＲ２、及び、配列番号３２を含むＨＣＤＲ３を含み、
前記ＬＣＶＲが、配列番号１２を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１４を含むＬＣＤＲ２、及び、配列番号１６を含むＬＣＤＲ３を含む、第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、
ｂ）標的腫瘍細胞上のヒトＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）であって、
前記第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み、
前記ＨＣＶＲが、配列番号４を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６を含むＨＣＤＲ２、及び、配列番号８を含むＨＣＤＲ３を含み、
前記ＬＣＶＲが、配列番号１２を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１４を含むＬＣＤＲ２、及び、配列番号１６を含むＬＣＤＲ３を含む、第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）が、配列番号５７及び／又は配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ２２上のエピトープと結合する、請求項１に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して１５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２２と結合する、請求項１又は２に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して６０μＭ未満のＫＤでＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＣＤ２２と結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して４５μＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２８と結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイによって測定して、２．１×１０－８Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＣＤ２８を発現する細胞の表面と結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイによって測定して、１．３×１０－８Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＣＤ２２を発現する細胞の表面と結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体と併用した場合に共刺激効果を示す、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
前記共刺激効果が：Ｔ細胞を活性化すること、ＩＬ－２放出を誘導すること、ヒトＰＢＭＣにおいてＣＤ２５＋上方調節を誘導すること、及びＣＤ２２発現細胞株に関するヒトＴ細胞媒介性細胞傷害を増大させること、の一つ以上である、請求項８に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
ａ）配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第一抗原結合ドメインと、ｂ）配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬剤的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のヒト二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコード化するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項14】
請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１８年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／７８１，６８９号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
配列表
本願は、２０１８年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／７８１，６８９号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
配列表
【0002】
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる、配列表を含む。２０１９年１２月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１８００３＿４９２２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、１０４，３５３バイトのサイズである。
【0003】
本発明は、ＣＤ２８及び標的分子、例えばＣＤ２２と結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上に発現されたＩ型膜貫通タンパク質であって、ホモ二量体として構築された単一の細胞外Ｉｇ－Ｖ様ドメインを有する。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現されたＣＤ８０又はＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８のＣＤ８０又はＣＤ８６に対する結合によって、Ｔ細胞活性化及び生存にとって重要な刺激シグナルが提供される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えて、ＣＤ２８によるＴ細胞刺激によって、様々なインターロイキンの産生のための強力なシグナルが提供される。ＣＤ２８はまた、ＴＣＲ活性化後にＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナル（ｃｏ－ｓｉｇｎａｌ）は、Ｔ細胞分化、増殖、サイトカイン放出及び細胞死などの有効なＴ細胞活性化にとって重要である。
【0005】
抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞の活性化に関連する治療目的について提案されてきた。抗ＣＤ２８抗体の一つであるＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト）は２００６年に臨床試験で使用された。６人の健常なボランティアにＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト）を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。２時間以内に、６人の患者すべてで著しい炎症反応（サイトカインストーム）があり、すべての患者が１６時間以内に多臓器不全となった。対象をコルチコステロイドで治療し、サイトカインレベルは２～３日以内に正常レベルに戻った。第１相研究（ＣＲＳに関連する）における０．１ｍｇ／ｋｇの開始用量は、カニクイザル「ＮＯＡＥＬ」の５０ｍｇ／ｋｇの５００倍に基づいていた（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２，ＮＥＪＭ ３５５：１０１８－１０２８（２００６））。残念なことに、ＴＧＮ１４１２はサイトカインストームを誘導し、これは、カニクイザルにおける毒性研究又はエクスビボヒトＰＢＭＣ研究によって予想されなかった。
【0006】
ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ－２とも呼ばれる）は、Ｓｉｇｌｅｃファミリーのメンバーであり、α２，６シアル酸を特異的に認識し、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）上で選択的に発現される膜貫通タンパク質である。
【0007】
ＣＤ２２は、例えば、Ｂ細胞ホメオスタシス、Ｂ細胞生存及び遊走、ＴＬＲ及びＣＤ４０シグナリングの減衰、及び細胞質領域における免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化によるＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼの動員を介してＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナリングを阻害すること、並びにＢ細胞と他の細胞型との間の接着の促進をはじめとする多くの本来の機能を有する。
【0008】
ＣＤ２２は、発生の初期段階ではＢ細胞の表面で見いだされず、幹細胞でも発現されない。しかしながら、すべてのＢ細胞リンパ腫及び白血病の６０～７０％はＣＤ２２を発現する。
【0009】
Ｂ細胞リンパ腫及び白血病を治療するために抗ＣＤ２２抗体が調査されてきた。しかしながら、モノクローナル抗体であるＥｐｒａｔｕｚｕｍａｂは限られた成果しか上げられなかった。（Ｇｒａｎｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）がん １１９（２１）：１０．１００２／ｃｎｃｒ．２８２９９）
したがって、当該技術分野では改善された抗ＣＤ２２－抗体が必要とされる。医薬組成物における使用について安全な抗ＣＤ２８抗体も必要とされている。さらに、ＣＤ２８及び標的抗原（例えば、ＣＤ２２）の両方と結合する二重特異性抗原結合分子は、標的抗原を発現する細胞の、特異的標的化及びＴ細胞媒介性殺滅が望ましい治療状況において有用である。
したがって、当該技術分野では改善された抗ＣＤ２２－抗体が必要とされる。医薬組成物における使用について安全な抗ＣＤ２８抗体も必要とされている。さらに、ＣＤ２８及び標的抗原（例えば、ＣＤ２２）の両方と結合する二重特異性抗原結合分子は、標的抗原を発現する細胞の、特異的標的化及びＴ細胞媒介性殺滅が望ましい治療状況において有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２，ＮＥＪＭ ３５５：１０１８－１０２８（２００６）
【文献】Ｇｒａｎｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）がん １１９（２１）：１０．１００２／ｃｎｃｒ．２８２９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
第一の態様において、本発明は、ＣＤ２８及び標的抗原と結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。ある例示的実施形態によると、二重特異性抗原結合分子はＣＤ２８及びＣＤ２２と結合する；そのような二重特異性抗原結合分子は、本明細書中では「抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子」とも称する。抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子の抗ＣＤ２２部分は、ＣＤ２２（例えば、がん性Ｂ細胞）を発現するがん細胞の標的化に有用であり、二重特異性分子の抗ＣＤ２８部分は、Ｔ細胞の活性化に有用である。がん細胞上のＣＤ２２及びＴ細胞上のＣＤ２８の同時結合は、例えば、Ｔ細胞のＴＣＲ活性化後、活性化されたＴ細胞による標的化がん細胞の選択性殺滅（細胞溶解）を促進する。したがって、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子は、とりわけ、ＣＤ２２発現腫瘍によって引き起こされる疾患及び障害（例えば、Ｂ細胞増殖性障害、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫）の治療に有用である。
【0012】
本発明のこの態様に係る二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインと、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインとを含む。本発明は、各抗原結合ドメインが軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対になった重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。本発明のある特定の例示的実施形態において、抗ＣＤ２８抗原結合ドメイン及び抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、各々、共通のＬＣＶＲと対になった、異なる別個のＨＣＶＲを含む。
【0013】
本発明は、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインが、表６に記載するようなＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子を提供する。ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインは、表６に記載するようなＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかも含み得る。ある特定の実施形態によると、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインは、表６に記載するようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のいずれかを含む。本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供し、ここで、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインは、表６に記載するような重鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、及び／又は表６に記載するような軽鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む。
【0014】
ある特定の実施形態によると、本発明は、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインが、配列番号２８及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子を提供する。
【0015】
本発明はまた、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0016】
本発明はまた、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合が、配列番号２８／１０及び２６／１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0017】
本発明はまた、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0018】
ある特定の実施形態において、ＣＤ２８と特異的に結合する第一抗原結合ドメインは、配列番号３２／１６のＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【0019】
本発明はまた、ＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号３０のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号１４のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0020】
本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子のある特定の非限定例としては、それぞれ：配列番号２８－３０－３２－１２－１４－１６のアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含むＣＤ２８に特異的に結合する第一抗原結合ドメインが挙げられる。
【0021】
本発明はまた、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが、配列番号２及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0022】
本発明はまた、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが、配列番号１０から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0023】
本発明はまた、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが、配列番号２／１０及び１８／１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0024】
本発明はまた、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが、配列番号８及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号１６から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性分子も提供する。
【0025】
ある特定の実施形態において、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインは、配列番号８／１６及び２４／１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【0026】
本発明はまた、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが、配列番号４及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号１４のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0027】
本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子のある特定の非限定例としては、それぞれ：配列番号４－６－８－１２－１４－１６及び２０－２２－２４－１２－１４－１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが挙げられる。
【0028】
関連する実施形態において、本発明は、ＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインが、配列番号２／１０及び１８／１０からなる群から選択される重及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含まれる重及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む。
【0029】
別の態様において、本発明は、本明細書中の表７で記載するようなポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、並びに表７で記載するようなポリヌクレオチド配列の二つ以上を、その任意の機能的組み合わせ又は配置で含む核酸分子を含む、本明細書中で開示する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列のいずれかをコード化する核酸分子を提供する。本発明の核酸を有する組換え発現ベクター、及びそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、そして産生された抗体を回収することによって抗体を産生する方法と同様に、本発明に含まれる。
【0030】
本発明は、ＣＤ２８と特異的に結合する前記抗原結合ドメインのいずれかが、ＣＤ２２と特異的に結合して、前記抗原結合ドメインのいずれかと、組み合わされるか、接続されるか、又は他の方法で結合されてＣＤ２８及びＣＤ２２と結合する二重特異性抗原結合分子を形成する、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む。
【0031】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位、又はオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分が欠失した抗体を除去して、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を増加させる修飾が有用であり得る，（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００２） ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照）。他の用途では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するためにガラクトシル化の修飾を行うことができる。
【0032】
別の態様において、本発明は、本明細書中で開示する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子と、薬剤的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子と第二の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態において、第二の治療薬は、有利には、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子と組み合わせられる任意の薬剤である。抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わせられる薬剤の例は、本明細書中の他の箇所で詳細に議論する。
【0033】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を使用するＣＤ２２を発現するがん細胞の標的化／殺滅のための治療法であって、治療上有効な量の、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む治療法を提供する。
【0034】
本発明はまた、ＣＤ２２発現に関連するか又はＣＤ２２発現によって引き起こされる疾患又は障害の治療用薬剤の製造における本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子の使用も含む。
【0035】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を使用した、ＣＤ２２を発現するがん細胞の標的化／殺滅のための治療法であって、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３と結合する他の抗腫瘍二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０抗体と組み合わせられた抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２）と組み合わせられる治療法を提供する。
【0036】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を使用して、ＣＤ２２を発現するがん細胞を標的化／殺滅するための治療法を提供し、ここで、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ－４を標的とするチェックポイント阻害剤と組み合わされている（例えば、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＣＤ２８／抗ＣＤ－２２）。例えば、ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体を、ＰＤ－１を標的とする薬剤、例えば、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、又はセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））と組み合わせることができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体は、ＰＤ－Ｌ１を標的とする薬剤、例えば、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））Ａｖｅｌｕｍａｂ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、又はＤｕｒｖａｌｕｍａｂ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））と組み合わせることができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体は、ＣＴＬＡ－４を標的とする薬剤、例えば、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））と組み合わせることができる。
【0037】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を使用して、ＣＤ２２を発現するがん細胞を標的化／殺滅するための治療法を提供し、ここで、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３と結合する他の抗腫瘍二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、例えば、ＲＥＧＮ１９７９（抗ＣＤ２０アームが配列番号１２４２／１２５８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸対を含み、抗ＣＤ３アームが配列番号１２５０／１２５８のアミノ酸対を含む、米国特許第９，６５７，１０２号を参照）と組み合わされた抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２）及び／又はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ－４（例えば、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせられた抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２）を標的とするチェックポイント阻害剤と組み合わされている。例えば、ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体は、ＰＤ－１を標的とする薬剤、例えば、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、又はセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標）、例えば、セミプリマブが配列番号１６２／１７０）のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸対を含む、米国特許第９，９８７，５００号を参照）と組み合わせることができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体は、ＰＤ－Ｌ１を標的とする薬剤、例えば、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、Ａｖｅｌｕｍａｂ （Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、又はＤｕｒｖａｌｕｍａｂ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））と組み合わせることができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体は、ＣＴＬＡを標的とする薬剤、例えば、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））と組み合わせることができる。
【0038】
他の実施形態は、以下の詳細な説明の再検討から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図2】図２Ａ及び２Ｂは、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗体が、一次Ｔ細胞刺激及びＣＤ２２標的発現の存在下でルシフェラーゼ産生の増加を示すことを表す一組のグラフである。図２Ａは、ルシフェラーゼ産生によって評価される、一定の２００ｐＭ ＲＥＧＮ１９４５（ｈＩｇＧ４アイソタイプ陰性対照）に加えてＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞とともに同時インキュベートした操作されたレポータＴ細胞の活性化を表す一組のグラフである。図２Ｂは、ルシフェラーゼ産生によって評価される、一定の２００ｐＭ ＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）に加えてＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞とともに同時インキュベートした操作されたレポータＴ細胞の活性化を表す一組のグラフである。
【図3】図３Ａ及び３Ｂは、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗体が、一次Ｔ細胞刺激及びＣＤ２２標的発現の存在下でＩＬ－２産生を増大させることを表す一組のグラフである。さらに具体的には、図３Ａは、ＩＬ－２産生によって評価される、一定の２ｎＭ ＲＥＧＮ１９４５（ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照）の存在下でのＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞とともに同時インキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を表す一組のグラフである。図３Ｂは、ＩＬ－２産生によって評価される、一定の２ｎＭ ＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）の存在下でＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、又はＲａｊｉ／ＣＤ８０ 及び ＣＤ８６陰性細胞とともに同時インキュベートされたＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を表す一組のグラフである。
【図4】図４は、ＲＥＧＮ５８３７とセミプリマブとの組み合わせが、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作された細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強することを示す一組のグラフである。
【図5B】図５Ｂは、ＲＥＧＮ５８３７とセミプリマブとの組み合わせが、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＲＡＪＩ細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強することを示す一組のグラフである。
【図6】図６は、ＲＥＧＮ１９７９（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）の存在下でＲＥＧＮ５８３７を用いたＮＡＬＭ－６－Ｌｕｃ腫瘍を有するＮＳＧマウスの治療が、有意な腫瘍抑制と関連することを示すグラフである。簡単に説明すると、ＮＳＧマウス（１群あたりｎ＝６～９）にヒトＰＢＭＣをグラフトし、次いでＮＡＬＭ－６－ｌｕｃＢ細胞白血病細胞をグラフト後１２日（第０日）に移植した。マウスに４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７＋０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９（ハッチング付き円）、０．４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７＋０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９（閉じた上向きの三角）、０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７＋０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９（菱形）、４ｍｇ／ｋｇの非ＴＡＡｘＣＤ２８＋０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９（正方形）、４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７＋０．４ｍｇ／ｋｇの非ＴＡＡｘＣＤ３（白丸）、又は４ｍｇ／ｋｇの非ＴＡＡｘＣＤ２８＋０．４ｍｇ／ｋｇの非ＴＡＡｘＣＤ３（黒の逆三角形）を移植後８日、１５日、及び２２日（矢印）で投与した。腫瘍成長を、移植後６、１０、１４、１７、２０、及び２３日の腫瘍体積の生物発画像化によりモニタリングした。総合データを群平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの事後試験を用いて決定した。以下の記号を使用して、非ＴＡＡｘＣＤ２８＋非ＴＡＡｘＣＤ３対照に対する統計的有意性を示した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図7】図７Ａ～７Ｃは、ＲＥＧＮ１９７９がヒトＴ細胞を活性化して用量に依存してＮａｌｍ６細胞を殺滅させたことを示すグラフである。さらに具体的には、図７Ａは、表示した抗体の存在下でのＮａｌｍ６細胞の％生存を表すグラフである。図７Ｂは、表示した抗体の存在下でのＣＤ２５を発現する（ＣＤ２５＋）ＣＤ８＋細胞のパーセントを表すグラフである。図７Ｃは、表示した抗体の存在下でのＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって評価したＣＤ２５＋ＣＤ８＋細胞の増殖を表すグラフである。
【図8】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、ＲＥＧＮ１９７９が、ヒトＴ細胞を活性化し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用量に依存して殺滅されることを示すグラフである。さらに具体的には、図８Ａは、表示した抗体の存在下でのＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の％生存を表すグラフである。図８Ｂは、表示した抗体の存在下でＣＤ２５を発現する（ＣＤ２５＋）ＣＤ８＋細胞のパーセントを表すグラフである。図８Ｃは、％分裂率で表した、表示した抗体の存在下でのＣＤ８＋細胞の増殖を表すグラフである。
【図9】図９は、ヒトＰＢＭＣ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用いたアッセイにおいて、ＲＥＧＮ１９７９が、ヒトサイトカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０の放出を誘導したことを示すグラフである。ＲＥＧＮ１９７９で観察されるサイトカイン放出は、ＲＥＧＮ１９７９単独によって誘導されたサイトカイン放出と比較して、固定濃度のＣＤ２２ＸＣＤ２８の存在下で増強された。
【図10】図１０Ａ～１０Ｅは、ＲＥＧＮ１９７９がヒトＴ細胞を活性化し、用量依存的にＮＨＬを枯渇させたことを示すグラフである。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、ＲＥＧＮ１９７９の細胞傷害効力（ＥＣ５０）が、１アームＣＤ２８対照抗体又は無共刺激対照を伴うＲＥＧＮ１９７９と比較した場合に２．３及び３．５倍増強した。ＲＥＧＮ１９７９によって媒介される、観察された標的細胞溶解は、それぞれ、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞又はＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって測定して、Ｔ細胞活性化及び増殖に関するＣＤ２５上方調節と関連していた。さらに具体的には、図１０Ａは、表示した抗体の存在下で患者骨髄からのＮＨＬ細胞の％生存を表すグラフである。図１０Ｂは、表示した抗体の存在下でＣＤ２５を発現する（ＣＤ２５＋）ＣＤ８＋細胞のパーセントを表すグラフである。図１０Ｃは、表示した抗体の存在下でＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって評価したＣＤ８＋細胞の増殖を表すグラフである。図１０Ｄは、表示した抗体の存在下でＣＤ２５（ＣＤ２５＋）ＣＤ４＋細胞のパーセントを表すグラフである。図１０Ｅは、表示した抗体の存在下でＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって評価したＣＤ４＋細胞の増殖を表すグラフである。
【図11】図１１Ａ～１１Ｅは、ＲＥＧＮ５８３７が、ＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、ＣＤ２５の細胞表面発現、及びＴ細胞増殖の可能性を濃度に依存して増強することを示すグラフである。簡単に説明すると、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を、標的細胞対ＰＢＭＣ比１：５のリンパ球を多く含むヒトＰＢＭＣとともに、そして単剤として（すなわち、ＲＥＧＮ５８３７無し）又は固定濃度のＲＥＧＮ５８３７（０．０１～１５μｇ／ｍＬの範囲）の存在下、濃度（４．８ｆＭ～１０ｎＭ）の範囲の抗ＣＤ２０ｘＣＤ３（ＲＥＧＮ１９７９）とともに、７２時間３７℃にてインキュベートした。ＲＥＧＮ１９７９を欠いた条件は、表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７のみを含み、０．０４ｐＭとしてプロットする。生存細胞は、生／死細胞染色を用いてフローサイトメトリによって検出された（１１Ａ）。Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ色素並びにＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５に対するフルオロフォア標識抗体のフェノタイピングカクテルを使用して、Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５発現として測定される；１１Ｂ、１１Ｄ）を、そしてフローサイトメトリによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖（１１Ｃ、１１Ｅ）を検出した。 さらに具体的には、図１１Ａは、死細胞のパーセントと表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７を表すグラフである。図１１Ｂは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞のパーセントと表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７を表すグラフである。図１１Ｃは、表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７を用いたＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって評価されたＣＤ４＋細胞の増殖を表すグラフである。図１１Ｄは、ＣＤ２５＋ＣＤ８＋細胞のパーセントを表すグラフである。図１１Ｅは、表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７を用いたＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって評価されたＣＤ８＋細胞の増殖を表すグラフである。
【図12】図１２Ａ～１２Ｇは、ＲＥＧＮ５８３７が、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２Ｂ細胞リンパ腫細胞の存在下で、濃度に依存して、ヒトＴ細胞からのＲＥＧＮ１９７９媒介性サイトカイン放出の可能性及び最大レベルを増強することを示すグラフである。簡単に説明すると、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を標的細胞対ＰＢＭＣ比１：５でリンパ球を多く含むヒトＰＢＭＣと、単剤として（すなわち、ＲＥＧＮ５８３７無し）又は固定濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下（０．０１～１５μｇ／ｍＬの範囲）濃度範囲（４．８ｆＭ～１０ｎＭ）の抗ＣＤ２０ｘＣＤ３（ＲＥＧＮ１９７９）と、７２時間３７℃にてインキュベートした。ＲＥＧＮ１９７９を欠いた状態はＲＥＧＮ５８３７のみを表示された濃度で含み、０．０４ｐＭとしてプロットする。上清を、（１２Ａ）ＩＬ－２、（１２Ｂ）ＩＬ－４、（１２Ｃ）ＩＬ－６、（１２Ｄ）ＩＬ－１０、（１２Ｅ）ＴＮＦ－α、（１２Ｆ）ＩＦＮ－γ、及び（１２Ｇ）ＩＬ－１７αのサイトカイン放出について、ＢＤサイトメトリックビーズアレイヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを使用して評価した。 さらに具体的には、図１２Ａは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＩＬ－２のレベルを表すグラフである。図１２Ｂは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＩＬ－４のレベルを表すグラフである。図１２Ｃは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＩＬ－６のレベルを表すグラフである。図１２Ｄは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＩＬ－１０のレベルを表すグラフである。図１２Ｅは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＴＮＦ－αのレベルを表すグラフである。図１２Ｆは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＩＦＮ－γのレベルを表すグラフである。図１２Ｇは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と表示された濃度のＲＥＧＮ５８３７の存在下でヒトＴ細胞から放出されたＩＬ－１７αのレベルを表すグラフである。
【図13】図１３Ａ及び１３Ｂは、０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の存在下でＲＥＧＮ５８３７を用いたＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍を有するＮＳＧマウスの治療は、有意な腫瘍抑制と関連することを示すグラフである。簡単に説明すると、メスのＮＳＧマウス（群あたりｎ＝６～７）にＷＳＵ－ＤＬＣＬ２Ｂ細胞リンパ腫細胞及びヒトＰＢＭＣの１：１混合物を移植した（第０日）。移植後１、８、及び１５日（矢印）に、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７及び０．４ｍｇ／ｋｇ（１３Ａ）又は４ｍｇ／ｋｇ（１３Ｂ）のＲＥＧＮ１９７９（又は非架橋対照）の組み合わせをマウスに投与した。腫瘍成長は、移植後７、１０、１４、１６、２８、３１、３５、３８、４３、４６、４９、５３、５７、及び６３日に、キャリパー測定によってモニタリングした。総合データは群平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの事後試験を用いて決定した。以下の記号を使用して群間の統計的有意性を示した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。星印は、ＲＥＧＮ１９７９単剤療法とアイソタイプ対照との間の統計的有意性を示し、ハッシュマークは、ＲＥＧＮ５８３７とＲＥＧＮ１９７９の組み合わせと、アイソタイプ対照との間の有意性を示し、カレットは、ＲＥＧＮ１９７９単剤療法と、ＲＥＧＮ５８３７とＲＥＧＮ１９７９の組み合わせとの間の有意差を示す。 さらに具体的には、図１３Ａは、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７及び０．４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９（又は非架橋対照、非ＴＡＡｘＣＤ３）を投与したマウスにおける腫瘍成長を表すグラフである。図１３Ｂは、１ｍｇ／ｋｇ ＲＥＧＮ５８３７及び４ｍｇ／ｋｇ（又は非架橋対照、非ＴＡＡｘＣＤ３）を投与したマウスにおける腫瘍成長を表すグラフである。
【図14】図１４は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍を有するＮＳＧマウスの有効量以下の量（ｓｕｂ－ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）のＲＥＧＮ１９７９の存在下、ＲＥＧＮ５８３７での治療は、ＲＥＧＮ５８３７又はＲＥＧＮ１９７９単剤療法よりも有意に高い生存率と関連することを示すグラフである。簡単に説明すると、メスのＮＳＧマウス（群あたりｎ＝６～７）にＷＳＵ－ＤＬＣＬ２Ｂ細胞リンパ腫細胞及びヒトＰＢＭＣの１：１混合物（第０日）を移植した。マウスにＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９の組み合わせ又は対照を移植後１、８、及び１５日（矢印）を投与した。統計的有意性はＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を使用して決定した。群間の統計的有意性を示すために以下の記号を使用した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。カレットはアイソタイプ対照と比較した統計的有意性を示し、星印は０．４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９単剤療法と比較した有意性を示し、ハッシュマークは４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９単剤療法と比較した有意性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本発明を説明する前に、記載された特定の方法及び実験条件は変わり得るので、本発明は、そのような方法及び条件に限定されないと理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用する専門用語は特定の実施形態を説明するためだけであり、限定的ではないことも理解すべきである。
【0041】
別段の定めのない限り、本明細書中で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書中で使用する場合、「約」という語は、特定の記載された数値に関して使用される場合、値が記載された値から１％以下で変わり得ることを意味する。例えば、本明細書中で使用する場合、「約１００」という表現は、９９及び１０１と、その間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【0042】
本明細書中に記載するものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験で使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで記載する。本明細書で言及するすべての特許、出願及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【0043】
定義
「ＣＤ２８」という表現は、本明細書中で使用する場合、共刺激受容体としてＴ細胞上に発現される抗原を指す。ヒトＣＤ２８は、配列番号７４に記載されているアミノ酸配列を含み、及び／又はＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００６１３０．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質フラグメントについてのすべての言及は、非ヒト種由来であると明示的に指定されていない限り、各タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「ＣＤ２８」という表現は、例えば、「マウスＣＤ２８」、「サルＣＤ２８」など、非ヒト種由来であると特定されていない限り、ヒトＣＤ２８を意味する。
「ＣＤ２８」という表現は、本明細書中で使用する場合、共刺激受容体としてＴ細胞上に発現される抗原を指す。ヒトＣＤ２８は、配列番号７４に記載されているアミノ酸配列を含み、及び／又はＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００６１３０．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質フラグメントについてのすべての言及は、非ヒト種由来であると明示的に指定されていない限り、各タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「ＣＤ２８」という表現は、例えば、「マウスＣＤ２８」、「サルＣＤ２８」など、非ヒト種由来であると特定されていない限り、ヒトＣＤ２８を意味する。
【0044】
本明細書中で使用する場合、「ＣＤ２８と結合する抗体」又は「抗ＣＤ２８抗体」には、ＣＤ２８を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに二量体ＣＤ２８を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ２８及び／又は細胞表面発現ＣＤ２８と結合し得る。可溶性ＣＤ２８としては、天然のＣＤ２８タンパク質並びに組換えＣＤ２８タンパク質変異体、例えば、単量体及び二量体ＣＤ２８構築物などが挙げられ、これらは膜貫通ドメインが欠けているか、さもなければ細胞膜と結合していない。
【0045】
本明細書中で使用する場合、「細胞表面発現ＣＤ２８」という表現は、ＣＤ２８タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に露出し、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロ又はインビボで細胞の表面上に発現されている一つ以上のＣＤ２８タンパク質を意味する。「細胞表面発現ＣＤ２８」には、細胞の膜における機能的Ｔ細胞共刺激受容体の文脈に含まれるＣＤ２８タンパク質が含まれる。「細胞表面発現ＣＤ２８」という表現には、細胞の表面上でホモ二量体の一部として発現されたＣＤ２８タンパク質が含まれる。「細胞表面発現ＣＤ２８」は、通常、ＣＤ２８タンパク質を発現する細胞の表面上で発現されたＣＤ２８タンパク質を含み得るか、又はこれらからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ２８」は、通常、その表面上でヒトＣＤ２８を発現しないが、その表面上でＣＤ２８を発現するように人工的に操作された、細胞の表面上で発現されたＣＤ２８タンパク質を含み得るか、又はこれらからなり得る。
【0046】
本明細書中で使用する場合、「抗ＣＤ２８抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、並びにＣＤ２８に結合する第一アームと第二（標的）抗原に結合する第二アームとを含む二重特異性抗体の両方を含み、ここで、抗ＣＤ２８アームは、本明細書中の表１に記載したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列のいずれかを含む。抗ＣＤ２８二重特異性抗体の例は本明細書中の別の箇所で記載する。「抗原結合分子」という語は、例えば、二重特異性抗体を含む、抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0047】
「ＣＤ２２」という語は、本明細書中で使用する場合、非ヒト種由来（例えば、「マウスＣＤ２２」、「サルＣＤ２２」など）であると特定されていない限り、ヒトＣＤ２２タンパク質を指す。ヒトＣＤ２２タンパク質は、受入番号ＣＡＡ４２００６で記載されるアミノ酸配列を有する。ｍｙｃ ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ（配列番号６０として開示される「ヘキサヒスチジン」）を有する組換えヒトＣＤ２２ｅｃｔｏ（Ｄ２０－Ｒ６８７）の配列は、受入番号ＮＰ＿００１７６２．２で、また配列番号５０として示される。ｈＣＤ２２ｅｃｔｏドメイン（Ｄ２０－Ｒ６８７）．ｈＦｃは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１９６８－ＳＬ－０５０から購入することもできる。
【0048】
本明細書中で使用する場合、「ＣＤ２２と結合する抗体」又は「抗ＣＤ２２抗体」は、可溶性ＣＤ２２及び／又は細胞表面発現ＣＤ２２と結合し得る抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。可溶性ＣＤ２２は、天然ＣＤ２２タンパク質並びに組換えＣＤ２２タンパク質変異体、例えば、膜貫通ドメインを欠いているか又は細胞膜と結合していないＣＤ２２構築物を含む。
【0049】
本明細書中で使用する場合、「抗ＣＤ２２抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、並びにＣＤ２２に結合する第一アームと第二（標的）抗原に結合する第二アームとを含む二重特異性抗体の両方を含み、ここで、抗ＣＤ２２アームは、本明細書中の表１に記載したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列のいずれかを含む。抗ＣＤ２２二重特異性抗体の例は本明細書中の別の箇所で記載する。「抗原結合分子」という語は、例えば、二重特異性抗体を含む、抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0050】
「抗原結合分子」という語は、例えば、二重特異性抗体を含む、抗体及び抗体の抗原結合フラグメントも含む。
【0051】
「抗体」という語は、本明細書中で使用する場合、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８）と特異的に結合するか、又は相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という語は、ジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（Ｈ）鎖及び二つの軽（Ｌ）鎖である四つのポリペプチド鎖を含むイムノグロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲ又はＶＨと略記する）と、重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の三つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲ又はＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は一つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）という名称の領域が組み込まれている、相補性決定領域（ＣＤＲ）という名称の超可変性領域にさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かって：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列された、三つのＣＤＲと四つのＦＲとから構成される。本発明の異なる実施形態において、抗ＣＤ２８抗体及び／又は抗ＣＤ２２抗体（又はそれらの抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいし、又は自然に若しくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義することができる。
【0052】
「抗体」という語は、本明細書中で使用する場合、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの語は、本明細書中で使用する場合、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質であって、抗原と特異的に結合して複合体を形成するものを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば完全抗体分子から、任意の好適な標準的技術、例えば、抗体可変及び任意選択的に定常ドメインをコード化するＤＮＡの操作及び発現を含むタンパク質消化又は遺伝子組換え操作技術を用いて、誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知である、及び／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能である、又は合成することができる。ＤＮＡは、配列させ、化学的に若しくは分子生物学技術を用いることによって操作して、例えば、一つ以上の可変及び／又は定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入するか、システイン残基を創出するか、アミノ酸を修飾、添加若しくは欠失させるなどが可能である。
【0053】
抗原結合フラグメントの非限定例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）、又は拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドの超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。他の操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トライアオボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール免疫医薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインも、本明細書中で使用する「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。
【0054】
抗体の抗原結合は、典型的には、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズアミノ酸組成のものであってよく、概して、一つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、又はフレーム内にある少なくとも一つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに相対的に配置することができる。例えば、可変領域は、二量体であってよく、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＬ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨ又はＶＬドメインを含み得る。
【0055】
ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも一つ定常ドメインと共有結合した少なくとも一つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見いだされ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的例示的立体配置としては：（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。前記例示的立体配置のいずれかを含む可変ドメイン及び定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結することができるか、又は完全若しくは部分的ヒンジ若しくはリンカー領域によって連結することができる。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸からなっていてもよく、これにより単一のポリペプチド分子中の隣接する可変及び／又は定常ドメイン間の柔軟性又は半柔軟性リンケージが得られる。さらに、抗原結合フラグメントは、互いに、及び／又は一つ以上の単量体ＶＨ若しくはＶＬドメインと（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）非共有結合した、前記の可変及び定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
【0056】
完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性又は多特異性（例えば、二重特異性）であってよい。抗体の多特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも二つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原と、又は同じ抗原上の異なるエピトープと、特異的に結合することができる。本明細書中で開示する例示的二重特異性抗体フォーマットをはじめとする任意の多特異性抗体フォーマットを、当該技術分野で利用可能なルーチン技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの関連での使用に適応させることができる。
【0057】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下で本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異性細胞傷害性（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解に至る細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、周知であり、当該技術分野で利用可能なアッセイを使用して測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、並びにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６を参照）。抗体の定常領域は、抗体が補体を固定する能力において重要であり、細胞依存性細胞傷害を媒介する。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体にとって細胞傷害性を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択することができる。
【0058】
本発明のある特定の実施形態によると、本発明の抗ＣＤ２８抗体及び／又は抗ＣＤ２２抗体（単一特異性又は二重特異性）はヒト抗体である。「ヒト抗体」という語は、本明細書中で使用する場合、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ及び特定のＣＤＲ３において、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコード化されないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム若しくは部位特異的変異誘発によって、又はインビボの体細胞突然変異によって、導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という語は、本明細書中で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことを意図しない。
【0059】
本発明の抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であってよい。「組換えヒト抗体」という語は、本明細書中で使用する場合、宿主細胞にされた組換え発現トランスフェクトベクターを用いて発現された抗体（さらに後述する）、組換え型コンナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（さらに後述する）、ヒトイムノグロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照）又はヒトイムノグロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、創出又は単離された抗体などの組換え手段によって、調製、発現、創出又は単離されたすべてのヒト抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体をインビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、インビボ体細胞変異誘発）に供し、したがって、組換え体抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連する一方で、天然では、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に存在しない場合がある配列である。
【0060】
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性と関連する二つの形態で存在し得る。一形態では、イムノグロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって結合している、約１５０～１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第二の形態では、二量体は、鎖間ジスルフィド結合によって連結されず、共有結合した軽及び重鎖（半抗体）から構成された、約７５～８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、親和性精製後でさえも、分離するのが非常に困難であった。
【0061】
様々なインタクトＩｇＧアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプと関連する構造差によるが、これに限定されるものではない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第二の形態の出現（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルまで有意に減少させることができる。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３領域に一つ以上の突然変異を有する抗体を含み、これは、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するために望ましい場合がある。
【0062】
本発明の抗体は単離された抗体であり得る。「単離された抗体」は、本明細書中で使用する場合、その自然環境の少なくとも一つの成分から同定及び分離、並びに／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも一つの成分から、又は抗体が天然に存在するか若しくは自然に産生される組織若しくは細胞から、分離若しくは除去された抗体が、本発明に関する「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内にインサイチュで抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも一つの精製または単離ステップに供された抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0063】
本発明はまた、ＣＤ２８及び／又はＣＤ２２と結合する１アーム（ｏｎｅ－ａｒｍ）抗体も含む。本明細書中で使用する場合、「１アーム抗体」は、単一抗体重鎖及び単一抗体軽鎖を含む抗原結合分子を意味する。本発明の１アーム抗体は、表１に記載するようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
【0064】
本明細書における抗ＣＤ２８抗体及び／又は抗ＣＤ２２抗体、又はその抗原結合ドメインは、抗原結合タンパク質又は抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域中に一つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書中で開示するアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に核にすることができる。本発明は、本明細書中で開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する、抗体、及びその抗原結合ドメインを含み、ここで、一つ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸を変異させて、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基（複数可）と、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）と、又は対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換（そのような配列変化は、本明細書中で「生殖系列突然変異」として総称される）と、変異させる。当業者は、本明細書中で開示する重及び軽鎖可変領域配列から始めて、一つ以上の個々の生殖系列突然変異又はその組み合わせを含む、多くの抗体及び抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基をすべて、抗体が誘導された元の生殖系列配列で見いだされる残基に変異させる。他の実施形態において、ある特定の残基のみを、例えばＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内で、又はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内で、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内で見いだされる変異した残基のみを、元の生殖系列配列に変異させる。他の実施形態において、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基（複数可）の一つ以上を、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体がもともと誘導された生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）に変異させる。さらに、本発明の抗体、又はその抗原結合ドメインは、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の二つ以上の生殖系列突然変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ここで、ある特定の個々の残基を特定の生殖系列配列の対応する残基と変異させ、その一方で、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基を、異なる生殖系列配列の対応する残基と変異させる。一旦得られたら、一つ以上の生殖系列突然変異を含む、抗体、又はその抗原結合フラグメントは、例えば、改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善若しくは増強されたアンタゴニスト若しくはアゴニスト生物学的特性（場合によっては）、低下した免疫原性などの、一つ以上の望ましい特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明に含まれる。
【0065】
本発明はまた、抗ＣＤ２８抗体及び／又は抗ＣＤ２２抗体、並びに本明細書中で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗原結合分子も含む。本発明のこの態様に含まれる例示的変異体は、一つ以上の保存的置換を有する、本明細書中で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書中で表６に記載されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２８抗体及び抗原結合分子を含む。
【0066】
「エピトープ」という語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一抗原が複数のエピトープを有する場合がある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する可能性があり、異なる生物学的効果を有する可能性がある。エピトープは、立体構造的又は線形のいずれかであり得る。立体構造的エピトープは、線形ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線形エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【0067】
「実質的同一性」または「実質的に同一」という語は、核酸またはそのフラグメントについて言及する場合、別の核酸（またはその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列される場合、以下で議論するようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの任意の周知の配列同一性アルゴリズムによって測定した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％でヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参考核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、場合によっては、参考核酸分子によってコード化されるポリペプチドと同一または実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化し得る。
【0068】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的類似性」又は「実質的に類似した」という語は、二つのペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを使用した例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによるなど、最適にアラインされた場合、少なくとも９５％の配列同一性、なお一層好ましくは、少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、％配列同一性又は類似度は、置換の保存的性質について修正するために上方調節することができる。この調節を行うための手段は、当業者には周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２４：３０７－３３１を参照。類似した化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アルパルテート及びグルタメート、並びに（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタメート－アルパルテート、及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５で開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「やや保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において非負値を有する任意の変化である。
【0069】
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換をはじめとする、さまざまな置換、欠失、およびその他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を使用して、類似の配列を照合する。たとえば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧａｐやＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含み、これらは、デフォルトパラメーターと使用して、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテイン間の配列相同性または配列同一性を決定できる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるデフォルトまたは推奨パラメータを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアラインメントおよび％配列同一性を提供する（上記のピアソン（２０００））。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照。
【0070】
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という語は、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子または本発明の方法を用いた治療から利益を得るであろうある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。これには、問題の障害に哺乳動物がかかりやすくなるようにさせる病的状態を含む慢性および急性障害が含まれる。一実施形態において、細胞増殖性障害はがんであり、これは、典型的には無秩序な細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態である。
【0071】
「腫瘍」は、本明細書中で使用する場合、悪性であろうと良性であろうと、すべての腫瘍性細胞成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という語は、本明細書で言及される場合、相互に排他的ではない。
【0072】
「Ｂ細胞増殖性障害」としては、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えば、侵攻性ＮＨＬ、再発性侵攻性ＮＨＬ、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球型（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ及びリツキシマブ－難治性無痛性ＮＨＬをはじめとする無痛性ＮＨＬ；難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ球優位型ホジキンリンパ腫（ＬＰＨＤ）、小リンパ球型リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病を含む白血病；及び他の血液学的悪性腫瘍が挙げられる。
【0073】
「非ホジキンリンパ腫」又は「ＮＨＬ」という語は、本明細書中で使用する場合、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系のがんを指す。ホジキンリンパ腫は、概して、ホジキンリンパ腫ではＲｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞が存在すること及び非ホジキンリンパ腫では前記細胞が存在しないことによって、非ホジキンリンパ腫から区別することができる。本明細書で使用される用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例には、Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａ．Ｖｉｃｔｏｒ Ｈｏｆｆｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｐｅｔｔｉｔ（ｅｄｓ．）（Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ．，２０００）に記載されているようなＲｅｖｉｓｅｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ－Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＲＥＡＬ）スキームなどの、当業者（例えば、腫瘍学者または病理学者）によって、当該技術分野で知られている分類スキームに従ってそのように特定される任意のものが含まれる。特に、図１１．５７、１１．５８及び１１．５９のリストを参照。より具体的な例には、限定されるものではないが、再発性又は難治性ＮＨＬ、最前線の低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶのＮＨＬ、化学療法抵抗性ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、小リンパ球型リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び／又は前リンパ球性白血病及び／又は小リンパ球型リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫及び／又はリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、節外性辺縁帯－ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病、形質細胞腫及び／又は形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、侵攻性ＮＨＬ（侵攻性最前線ＮＨＬ及び侵攻性再発性ＮＨＬを含む）、自己幹細胞移植後に再発するか又は自己幹細胞移植が無効なＮＨＬ、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆（末梢）大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／又はセザリー症候群、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫が含まれる。
二重特異性抗原結合分子
二重特異性抗原結合分子
【0074】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多特異性であり得る。多特異性抗体は、一つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、又は複数の標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照。本発明の抗ＣＤ２８抗体及び／又は抗ＣＤ２２抗体を、別の機能的分子、例えば別のペプチドもしくはタンパク質と連結させるか、又は同時発現することができる。例えば、抗体又はそのフラグメントを、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合又は他の方法により）一つ以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体フラグメントと機能的に連結させて、第二結合特異性を有する二重特異性又は多特異性抗体を産生することができる。
【0075】
本明細書中での「抗ＣＤ２８抗体」及び／又は「抗ＣＤ－２２抗体」という表現の使用は、単一特異性抗ＣＤ２８抗体及び／又は単一特異性抗ＣＤ２２抗体、並びにＣＤ２８結合アーム又はＣＤ２２結合アームと、標的抗原と結合するアームとを含む二重特異性抗体の両方を含むことが意図される。したがって、本発明は、イムノグロブリンの一方のアームがヒトＣＤ２８又はＣＤ２２と結合し、イムノグロブリンの多方のアームが標的抗原に対して特異的である二重特異性抗体を含む。ＣＤ２８又はＣＤ２２二重特異性抗体の他のアームが結合する標的抗原は、標的化免疫応答が望まれる細胞、組織、臓器、微生物又はウイルス上又はその近辺で発現される任意の抗原であり得る。ＣＤ２８結合アームは、本明細書中の表１に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。ＣＤ２２結合アームは、本明細書中の表１に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。ある特定の実施形態において、ＣＤ２８結合アームはヒトＣＤ２８と結合し、ヒトＴ細胞増殖を誘導する。
【0076】
抗体の一本のアームがＣＤ２８と結合し、他のアームが標的抗原と結合する本発明の二重特異性抗体の関連で、標的抗原は腫瘍関連抗原、例えばＣＤ２２であり得る。
【0077】
ある例示的実施形態によると、本発明は、ＣＤ２８及びＣＤ２２と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書中では、例えば、「抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２」、又は「抗ＣＤ２８ｘＣＤ２２」、又は「ＣＤ２８ｘＣＤ２２」もしくは「抗ＣＤ２２／抗ＣＤ２８」、又は「抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８」、又は「ＣＤ２２ｘＣＤ２８」二重特異性分子、又は「αＣＤ２２ｘαＣＤ２８」、又は「αＣＤ２８ｘαＣＤ２２」、又は他の類似した名称で称される場合がある。
【0078】
ある例示的実施形態によると、二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）は、エフェクタアームと標的化アームとを有し得る。エフェクタアームは、エフェクタ細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原に結合する第一抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ２８抗体）であり得る。標的化アームは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の抗原に結合する第二抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ２２抗体）であり得る。ある例示的実施形態によると、エフェクタアームはＣＤ２８に結合し、標的化アームはＣＤ２２に結合する。二重特異性抗ＣＤ２８／ＣＤ２２は、エフェクタ細胞（例えば、Ｔ細胞）に対して共刺激シグナルを提供し得る。エフェクタアームは、クラスタ化なしのＴ細胞の刺激に効果はない。エフェクタアーム単独では、標的化アームと組み合わせない限り、Ｔ細胞の刺激にほとんど効果はない。腫瘍標的化アームは、不完全な腫瘍特異性を有し得る。標的化アームの標的である抗原（例えば、ＣＤ２２）は腫瘍細胞のフラクション上で発現することができる。腫瘍標的化アームの特異性は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２０二重特異性抗体）との組み合わせとオーバーラップさせることによって増加させることができる。
【0079】
本明細書中で使用する場合、「抗原結合分子」という表現は、単独、又は一つ以上のさらなるＣＤＲ及び／若しくはフレームワーク領域（ＦＲ）との組み合わせで、特定の抗原と特異的に結合する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、又はこれらからなる、タンパク質、ポリペプチド又は分子複合体を意味する。ある特定の実施形態において、抗原結合分子は、これらの用語が本明細書中の他の場所で定義されるように、抗体又は抗体のフラグメントである。
【0080】
本明細書中で使用する場合、「二重特異性抗原結合分子」という表現は、少なくとも第一抗原結合ドメインと第二抗原結合ドメインとを含む、タンパク質、ポリペプチド又は分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独又は一つ以上のさらなるＣＤＲ及び／若しくはＦＲとの組み合わせで、特定の抗原と特異的に結合する少なくとも一つのＣＤＲを含む。本発明の関連で、第一抗原結合ドメインは第一抗原（例えば、ＣＤ２８）と特異的に結合し、第二抗原結合ドメイン第二の別の抗原（例えば、ＣＤ２２）と特異的に結合する。
【0081】
本発明のある特定の例示的実施形態において、二重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）とを含む。第一及び第二抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）の関連で、第一抗原結合ドメインのＣＤＲを接頭辞「Ｄ１」で指定する場合があり、また第二抗原結合ドメインのＣＤＲを接頭辞「Ｄ２」で指定する場合がある。したがって、第一抗原結合ドメインのＣＤＲを、本明細書中では、Ｄ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、及びＤ１－ＨＣＤＲ３と称する場合があり；第二抗原結合ドメインのＣＤＲを、本明細書中では、Ｄ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、及びＤ２－ＨＣＤＲ３と称する場合がある。
【0082】
第一抗原結合ドメイン及び第二抗原結合ドメインを直接的又は間接的に互いに接続して、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成することができる。あるいは、第一抗原結合ドメイン及び第二抗原結合ドメインをそれぞれ別の多量体化ドメインと結合させることができる。一つの多量体化ドメインと別の多量体化ドメインとの結合によって、二つの抗原結合ドメイン間の結合が促進され、それによって二重特異性抗原結合分子が形成される。本明細書中で使用する場合、「多量体化ドメイン」は、同じかまたは類似した構造又は構成の第二の多量体化ドメインと結合する能力を有する任意の巨大分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、イムノグロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであり得る。多量体化成分の非限定例は、イムノグロブリンのＦｃ部分（ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む）、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、並びに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。
【0083】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には、二つの多量体化ドメイン、例えば各々独立した抗体重鎖の一部である二つのＦｃドメインを含む。第一及び第二多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプのものであってよい。あるいは、第一及び第二多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。
【0084】
ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメント又は少なくとも一つのシステイン残基を含む１～約２００アミノ酸長のアミノ酸配列である。他の実施形態において、多量体化ドメインはシステイン残基、又は短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックス－ループモチーフ、又はコイルドコイルモチーフを含むか又はこれらからなるペプチド又はポリペプチドが含まれる。
【0085】
任意の二重特異性抗体フォーマット又は技術を使用して本発明の二重特異性抗原結合分子を作製することができる。例えば、第一抗原結合特異性を有する抗体又はそのフラグメントは、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合又は他の方法により）一つ以上の他の分子実体、例えば第二抗原結合特異性を有する別の抗体又は抗体フラグメントに対して機能的に連結させて、二重特異性抗原結合分子を産生することができる。本発明の関連で使用することができる二重特異性フォーマットの具体例としては、限定されるものではないが、例えば、ｓｃＦｖベース又はダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合物、二重可変ドメイン（ＯＶＯ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブ・イントゥ・ホール、共通の軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＯ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｏｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＯＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異性フォーマットが挙げられる（前記フォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、及びその中で言及されている参考文献を参照）。
【0086】
本発明の二重特異性抗原結合分子の関連で、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの野生型、天然に存在するバージョンと比較して、一つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み得る。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間で修飾された結合相互作用（例えば、増強又は減少）を有する修飾されたＦｃドメインをもたらす、Ｆｃドメインにおける一つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０の範囲であるエンドソーム中）でＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる修飾をＣＨ２又はＣＨ３領域中に含む。そのようなＦｃ修飾の非限定例には、例えば、位置２５０（例えば、Ｅ若しくはＱ）；２５０及び４２８（例えば、Ｌ若しくはＦ）；２５２（例えば、ＬＮ／ＦＩＷ若しくはＴ）、２５４（例えば、Ｓ若しくはＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／ＥＩＤ若しくはＴ）での修飾；又は位置４２８及び／又は４３３（例えば、ＵＲ／Ｓ／Ｐ／Ｑ若しくはＫ）及び／又は４３４（例えば、Ｈ／Ｆ若しくはＶ）での修飾；又は位置２５０及び／又は４２８での修飾；又は位置３０７若しくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９１）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２，２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；並びに３０７及び／又は３０８修飾（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。
【0087】
本発明はまた、第一ＣＨ３ドメインと第二Ｉｇ ＣＨ３ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第一及び第二Ｉｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸で互いに異なり、少なくとも一つのアミノ酸の違いにより、そのアミノ酸の違いを欠いた二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａに対する二重特異性抗体の結合が減少する。一実施形態において、第一Ｉｇ ＣＨ３ドメインはタンパク質Ａと結合し、第二Ｉｇ ＣＨ３ドメインは、例えば、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるとＨ４３５Ｒ）などの、タンパク質Ａ結合を低減又は無効にする突然変異を含む。第二のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第二のＣＨ３内で見出すことができるさらなる修飾には：ＩｇＧ１抗体の場合は、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２１（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２１）；ＩｇＧ２抗体の場合は、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２１（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２１）；並びにＩｇＧ４抗体の場合は、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２１（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２１）が含まれる。
【0088】
ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、複数のイムノグロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域由来のＣＨ２配列の一部又は全部と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４由来のＣＨ３配列の一部又は全部とを含み得る。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域も含み得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「下部ヒンジ」配列と組み合わせられたヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「上部ヒンジ」配列を含み得る。本明細書中に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって：［ＩｇＧ４ＣＨ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ＣＨ３］を含む。本明細書中に記載する抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって：［ＩｇＧ１ＣＨ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ＣＨ２］－［ＩｇＧ１ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれらや他の例は、国際公開第２０１４／０２２５４０Ａ１号に記載されており、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。これらの一般的構造配置、及びその変異体を有するキメラＦｃドメインは、Ｆｃ受容体結合を変化させる可能性があり、これは次にＦｃエフェクタ機能に影響を及ぼす。
配列変異体
配列変異体
【0089】
本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域において一つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書中で開示するアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗原結合分子は、本明細書中で開示する例示的アミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合フラグメントを含み得、一つ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、又は対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換（そのような配列変化は、まとめて「生殖系列突然変異」と称される）に、変異される。当業者は、本明細書中で開示する重及び軽鎖可変領域配列から始めて、一つ以上の個々の生殖系列突然変異又はその組み合わせを含む多くの抗体及び抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基はすべて、抗原結合ドメインがもともと由来した元の生殖系列配列で見いだされる残基に変異される。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内で見いだされる変異残基のみ又はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内で見いだされる変異残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内で見いだされる変異残基のみが、元の生殖系列配列に変異して戻される。他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基（複数可）の一つ以上が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインがもともと由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）に変異される。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の二つ以上の生殖系列突然変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異され、その一方で、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持されるか又は異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される。一旦得られたら、一つ以上の生殖系列突然変異を含む抗原結合ドメインは、一つ以上の所望の特性、例えば、改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善若しくは増強されたアンタゴニスト若しくはアゴニスト生物学的特性（場合によっては）、低下した免疫原性などについて容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた一つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は本発明に含まれる。
【0090】
本発明はまた、抗原結合ドメインの一方又は両方が、本明細書中で開示する、一つ以上の保存的置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む、抗原結合分子も含む。例えば、本発明は、本明細書中で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。類似した化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アルパルテート及びグルタメートが含まれ、（７）硫黄含有側鎖は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタメート－アルパルテート、及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５で開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「やや保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において非負値を有する任意の変化である。
【0091】
本発明はまた、本明細書中で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「実質的同一性」又は「実質的に同一の」という語は、アミノ酸配列について言及する場合、二つのアミノ酸配列が、例えばデフォルトのギャップウェイトを使用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列させた場合に、少なくとも９５％の配列同一性、なお一層好ましくは、少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、％配列同一性又は類似度は、置換の保存的性質について補正するように上方に調節することができる。この調節を行うための手段は、当業者には周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２４：３０７－３３１を参照。
【0092】
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換をはじめとする、さまざまな置換、欠失、およびその他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を使用して、類似の配列を照合する。たとえば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧａｐやＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含み、これらはデフォルトパラメーターと使用して、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテイン間の配列相同性または配列同一性を決定できる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるデフォルトまたは推奨パラメータを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアラインメント及び％配列同一性を提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ （２０００））。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照。
ｐＨ依存性結合
ｐＨ依存性結合
【0093】
本発明は、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の抗ＣＤ２８抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＣＤ２８に対する結合の低下を示し得る。あるいは、本発明の抗ＣＤ２２抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＣＤ２２に対する結合の増強を示し得る。「酸性ｐＨ」という表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０以下のｐＨ値を含む。本明細書中で使用する場合、「中性ｐＨ」という表現は、約７．０～約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
【0094】
場合によっては、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでの．．．の結合の低下」は、酸性ｐＨでのその抗原に対する抗体結合のＫＤ値の、中性ｐＨでのその抗原に対する抗体結合のＫＤ値に対する比（又はその逆）で表される。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を示すならば、本発明に関して、抗体又はその抗原結合フラグメントは、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＣＤ２８に対して結合の低下」を示すとみなすことができる。ある特定の例示的実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０又はそれ以上であり得る。
【0095】
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで特定の抗原に対する結合の低下（又は増強）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾により、ｐＨ依存特性を有する抗体が得られる可能性がある。例えば、（例えば、ＣＤＲ内の）抗原結合ドメインの一つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することによって、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで抗原結合が低下した抗体が得られる可能性がある。
Ｆｃ変異体を含む抗体
Ｆｃ変異体を含む抗体
【0096】
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体に対する抗体結合を増強または低下させる一つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、突然変異（複数可）が酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０の範囲であるエンドソーム中）でＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる突然変異を、ＦｃドメインのＣＨ２又はＣＨ３領域において含む抗体及び抗原結合分子を含む。そのような突然変異は、動物に投与されると抗体の血清半減期の増加をもたらす可能性がある。そのようなＦｃ修飾の非限定例には、例えば、位置２５０での修飾（例えば、Ｅ若しくはＱ）；２５０及び４２８（例えば、Ｌ若しくはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ若しくはＴ）、２５４（例えば、Ｓ若しくはＴ）、並びに２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ若しくはＴ）；又は位置４２８及び／又は４３３での修飾（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ若しくはＫ）及び／又は４３４（例えば、Ｈ／Ｆ若しくはＹ）；又は位置２５０及び／又は４２８での修飾；又は位置３０７若しくは３０８での修飾（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、並びに４３４が含まれる。一実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；並びに３０７及び／又は３０８修飾（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。
【0097】
例えば、本発明は、２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）；並びに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される突然変異の一つ以上の対又は群を含むＦｃドメインを含む抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む。前記Ｆｃドメイン突然変異、及び本明細書中で開示する抗体可変ドメイン内の他の突然変異のあらゆる可能な組み合わせが、本発明の範囲内で企図される。
【0098】
抗体及び抗原結合分子の生物学的特性
本発明は、ヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ２２に高親和性で結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、治療状況及び望ましい特定の標的化特性に応じて中又は低親和性でヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ２２に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。例えば、一つのアームがＣＤ２８に結合し、別のアームが標的抗原（例えば、ＣＤ２２）に結合する二重特異性抗原結合分子の状況では、標的抗原結合アームが標的抗原と高親和性で結合し、その一方で、抗ＣＤ２８アームがＣＤ２８と中又は低親和性でしか結合しないのが望ましい場合がある。このようにして、標的抗原を発現する細胞に対する抗原結合分子の選択的標的化は、全体的／非標的化ＣＤ２８結合及びこれに関連する結果としての有害な副作用を回避しつつ達成することができる。
本発明は、ヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ２２に高親和性で結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、治療状況及び望ましい特定の標的化特性に応じて中又は低親和性でヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ２２に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。例えば、一つのアームがＣＤ２８に結合し、別のアームが標的抗原（例えば、ＣＤ２２）に結合する二重特異性抗原結合分子の状況では、標的抗原結合アームが標的抗原と高親和性で結合し、その一方で、抗ＣＤ２８アームがＣＤ２８と中又は低親和性でしか結合しないのが望ましい場合がある。このようにして、標的抗原を発現する細胞に対する抗原結合分子の選択的標的化は、全体的／非標的化ＣＤ２８結合及びこれに関連する結果としての有害な副作用を回避しつつ達成することができる。
【0099】
ある特定の実施形態によると、本発明は、ヒトＣＤ２２（例えば、２５℃で）と、表面プラズモン共鳴によって、例えば本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用して測定して、約１５ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ２２と、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマット、又は実質的に類似したアッセイを使用して測定して、約１５ｎＭ未満、約１４ｎＭ未満、約１３ｎＭ未満、約１２ｎＭ未満、約１１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満のＫＤで結合する。
【0100】
ある特定の実施形態によると、本発明は、サルＣＤ２２（例えば、２５℃で）と、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用して測定して、約６０μＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、サルＣＤ２２と、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマット、又は実質的に類似したアッセイを使用して測定して、約６０μＭ未満、約５９μＭ未満、約５８μＭ未満、約５７μＭ未満、約５６μＭ未満、約５５μＭ未満、約５４μＭ未満、約５３μＭ未満、約５２μＭ未満、約５１μＭ未満、約５０μＭ未満、約４９μＭ未満、約４８μＭ未満、約４７μＭ未満、約４６μＭ未満、約４５μＭ未満、約４４μＭ未満、約４３μＭ未満、約４２μＭ未満、約４１μＭ未満、約４０μＭ未満、約３９μＭ未満、約３８μＭ未満、約３７μＭ未満、約３６μＭ未満、約３５μＭ未満、約３４μＭ未満、約３３μＭ未満、約３２μＭ未満、約３１μＭ未満、約３０μＭ未満、約２５μＭ未満、約２０μＭ未満、約１５μＭ、又は約１０μＭ未満のＫＤで結合する。
【0101】
ある特定の実施形態によると、本発明は、ヒトＣＤ２８（例えば、２５℃）と、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用する表面プラズモン共鳴によって測定して約４５μＭ未満のＫＤを有する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマット、又は実質的に類似したアッセイを使用して測定して、ヒトＣＤ２８と、約４５μＭ未満、約４４μＭ未満、約４３μＭ未満、約４２μＭ未満、約４１μＭ未満、約４０μＭ未満、約３９μＭ未満、約３８μＭ未満、約３７μＭ未満、約３６μＭ未満、約３５μＭ未満、約３４μＭ未満、約３３μＭ未満、約３２μＭ未満、約３１μＭ未満、約３０μＭ未満、約２５μＭ未満、約２０μＭ未満、約１５μＭ未満、約１０μＭ未満のＫＤで結合する。
【0102】
本発明はまた、ヒトＣＤ２２と、２５℃にて表面プラズモン共鳴により、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用して、又は実質的に類似したアッセイにより測定して、約７．５分超の解離半減期（ｔ１／２）で結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ２２と、２５℃にて表面プラズモン共鳴により、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用して、又は実質的に類似したアッセイにより測定して、約７分超、約１０分超、約１５分超、約２０分超、約２５分超、約３０分超、約３５分超、約４０分超、約４５分超、約５０分超、約５５分超、約６０分超、約６５分超、約７０分超、約７５分超、又は約１００分超のｔ１／２で結合する。
【0103】
本発明はまた、サルＣＤ２２と、３７℃にて表面プラズモン共鳴により、例えば、本明細書中の実施例で定義するようなアッセイフォーマットを使用して、又は実質的に類似したアッセイにより測定して、約４．３分超の解離半減期（ｔ１／２）で結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＤ２８と、２５℃にて表面プラズモン共鳴により、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用して、又は実質的に類似したアッセイにより測定して、約４分超、約５分超、約６分超、約７分超、約８分超、約９分超、約１０分超、約１５分超、約２０分超、約２５分超、約３０分超、約３５分超、約４０分超、約４５分、又は約５０分超のｔ１／２で結合する。
【0104】
本発明はまた、ヒトＣＤ２８と、２５℃にて表面プラズモン共鳴により、例えば、本明細書中の実施例５で定義するようなアッセイフォーマットを使用して、又は実質的に類似したアッセイにより測定して、約２．３分超の解離半減期（ｔ１／２）で結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＤ２８と、２５℃又は３７℃にて表面プラズモン共鳴により、例えば、本明細書中の実施例で定義するようなアッセイフォーマットを使用して、又は実質的に類似したアッセイにより測定して、約２分超、約５分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、約７０分超、約８０分超、約９０分超、約１００分超、約２００分超、約３００分超、約４００分超、約５００分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、約１０００分超、又は約１２００分超のｔ１／２で結合する。
【0105】
本発明はまた、ヒトＣＤ２８並びにヒト及びサルＣＤ２２に対して結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）も含む。ある特定の実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８および／またはＣＤ２２を発現する細胞と特異的に相互作用する。二重特異性抗原結合分子がＣＤ２８および／またはＣＤ２２を発現する細胞に結合する程度は、本明細書中の実施例６に示されるように、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。例えば、本発明は、ＣＤ２８を発現するが、ＣＤ２２を発現しないヒト細胞株又はカニクイザル細胞（例えば、Ｔ細胞）、及びＣＤ２２を発現するが、ＣＤ２８を発現しないヒト細胞株又はカニクイザル細胞（例えば、Ｂ細胞又はＮａｌｍ６細胞）と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、前記細胞及び細胞株のいずれかと、実施例６で記載するようなＦＡＣＳアッセイ又は実質的に類似したアッセイを用いて測定して、約１．３×１０－６～約２．３×１０－８Ｍ、又はそれ以下のＥＣ５０値で結合する二重特異性抗原結合分子を含む。
【0106】
本発明は、ヒトＣＤ２８及び／又はヒトＣＤ２２と結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。ある特定の実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８及び／又はＣＤ２２を発現する細胞と特異的に相互作用する。二重特異性抗原結合分子がＣＤ２８および／またはＣＤ２２を発現する細胞に結合する程度は、本明細書中の実施例７に示されるように、フローサイトメトリによって評価することができる。例えば、本発明は、ＣＤ２８を発現するが、ＣＤ２２を発現しないヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、及びＣＤ２２を発現するが、ＣＤ２８を発現しないヒト細胞株（例えば、ＣＤ８０及びＣＤ８６を欠失する様に遺伝子改変されたヒトＣＤ２２及びＲａｊｉ Ｂ細胞で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞）と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、前記細胞及び細胞株のいずれかと、実施例７に記載するフローサイトメトリ又は実質的に類似したアッセイによって測定して、約１．１４×１０－８～約９．７６×１０－９Ｍ、又はそれ以下のＥＣ５０値で結合する二重特異性抗原結合分子を含む。
【0107】
本発明はまた、腫瘍細胞のＣＤ２０ｘＣＤ３Ｔ細胞媒介性殺滅の効力を誘導又は増強する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子も提供する。例えば、本発明は、インビトロＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイで、例えば、本明細書中の実施例８で定義されるようなアッセイフォーマット（例えば、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｘＣＤ２２抗体の存在下でのヒトＰＢＭＣによるＲａｊｉ細胞殺滅の程度を評価する）、又は実質的に類似したアッセイを使用して測定して、約１．４８×１０－１０Ｍ未満のＥＣ５０での腫瘍細胞のＣＤ２０ｘＣＤ３Ｔ細胞媒介性殺滅の効力を誘導または増大させる抗ＣＤ２８ｘＣＤ２２抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅（例えば、Ｒａｊｉ細胞のＰＢＭＣ媒介性殺滅）を、インビトロＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイにより、例えば、本明細書中の実施例８で定義されるようなアッセイフォーマット、又は実質的に類似したアッセイを使用して測定して、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５．０ｐＭ未満、約４．０ｐＭ未満、約３．０ｐＭ未満、約２．５ｐＭ未満、約２．０ｐＭ未満、又は約１．５ｐＭ未満のＥＣ５０値で誘導する。
【0108】
本発明はまた、Ｔ細胞の活性化、ＩＬ－２放出の誘導、ヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ２５＋上方調節の誘導；及びＣＤ２２発現細胞株に関するヒトＴ細胞媒介性細胞傷害の増大からなる群から選択される一つ以上を示す抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子も含む（例えば、本明細書中の実施例９を参照）。本発明はまた、ＣＤ２０及びＣＤ３、例えば、限定されるものではないが、ＲＥＧＮ１９７９などと結合する二重特異性抗体と組み合わせた場合、ＣＤ２２を発現する腫瘍細胞の殺滅を増強する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子も含む。本発明はまた、ＰＤ－１、例えば、限定されるものではないが、セミプリマブと結合する抗体と組み合わせた場合、ＣＤ２２を発現する腫瘍細胞の殺滅を増強する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子も含む（実施例１０～１５を参照）。
【0109】
エピトープマッピング及び関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ２８又はＣＤ２２上のエピトープは、ＣＤ２８タンパク質又はＣＤ２２タンパク質の３以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなり得る。あるいは、エピトープは、ＣＤ２８又はＣＤ２２の複数の非隣接アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなり得る。本発明の抗体は、ＣＤ２８単量体内に含まれるアミノ酸と相互作用し得るか、又はＣＤ２８二量体の二本の異なるＣＤ２８鎖上のアミノ酸と相互作用し得る。「エピトープ」という語は、本明細書中で使用する場合、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一抗原が複数のエピトープを有する場合がある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する可能性があり、異なる生物学的効果を有する可能性がある。エピトープは、立体構造的又は線形のいずれかであり得る。立体構造的エピトープは、線形ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線形エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ２８又はＣＤ２２上のエピトープは、ＣＤ２８タンパク質又はＣＤ２２タンパク質の３以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなり得る。あるいは、エピトープは、ＣＤ２８又はＣＤ２２の複数の非隣接アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなり得る。本発明の抗体は、ＣＤ２８単量体内に含まれるアミノ酸と相互作用し得るか、又はＣＤ２８二量体の二本の異なるＣＤ２８鎖上のアミノ酸と相互作用し得る。「エピトープ」という語は、本明細書中で使用する場合、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一抗原が複数のエピトープを有する場合がある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する可能性があり、異なる生物学的効果を有する可能性がある。エピトープは、立体構造的又は線形のいずれかであり得る。立体構造的エピトープは、線形ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線形エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【0110】
当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチド又はタンパク質内の「一つ以上のアミノ酸と相互作用する」か否かを判定することができる。特定の抗体又は抗原結合ドメインのエピトープ又は結合ドメインを決定するために使用できる例示的技術としては、例えば、ルーチンのクロスブロッキングアッセイ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）で記載されているもの、点変異誘発（例えば、アラニンスキャニング変異誘発、アルギニンスキャニング変異誘発など）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、プロテアーゼ保護、及びペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するために使用できる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。概して、水素／重水素交換法では、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質に結合させる。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護された残基（重水素標識されたまま）を除くすべての残基で水素－重水素交換が起こるようにする。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断および質量分析に供され、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照。Ｘ線結晶構造分析を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定することもできる。
【0111】
本発明はさらに、本明細書に記載の特定の例示的抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＣＤ２８および抗ＣＤ２２抗体（例えば、本明細書の表６に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）を含む。
【0112】
ある特定の実施形態によると、本発明は、実施例３及び４に記載されるような質量分析によって検出される水素／重水素交換によって決定される、配列番号３４、配列番号３５、及び／又は配列番号３６の一つ以上のアミノ酸を含むヒトＣＤ２２上のエピトープと結合する抗体の抗体及び抗原結合フラグメントを提供する。
【0113】
同様に、本発明はまた、ＣＤ２８及び／又はＣＤ２２に対する結合について本明細書中に記載の特定の例示的抗体のいずれかと競合する抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ２２抗体（例えば、本明細書中の表６に記載のアミノ酸配列を含む抗体）も含む。
【0114】
本発明はまた、ヒトＣＤ２８と特異的に結合する第一抗原結合ドメインと、ヒトＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合フラグメントとを含む二重特異性抗原結合分子も含み、ここで、第一抗原結合ドメインは、本明細書中で記載する特定の例示的ＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じ、ＣＤ２８上のエピトープと結合する、及び／又は第二抗原結合ドメインは、本明細書中に記載する特定の例示的ＣＤ２２特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じ、ＣＤ２２上のエピトープと結合する。
【0115】
同様に、本発明はまた、ヒトＣＤ２８と特異的に結合する第一抗原結合ドメインと、ヒトＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合フラグメントとを含む二重特異性抗原結合分子も含み、ここで、第一抗原結合ドメインは、本明細書中で記載する特定の例示的ＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのいずれかとＣＤ２８に対する結合について競合し、及び／又は第二抗原結合ドメインは、本明細書中に記載する特定の例示的ＣＤ２２特異的抗原結合ドメインのいずれかとＣＤ２２に対する結合について競合する。
【0116】
特定の抗原結合分子（例えば、抗体）又はその抗原結合ドメインが、当該技術分野で公知のルーチン法を使用することによって、本発明の参考抗原結合分子と、同じエピトープと結合するか、又は結合について競合するか否かを容易に判定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参考二重特異性抗原結合分子と同じ、ＣＤ２８（又はＣＤ２２）上のエピトープと結合するか否かを判定するために、参考二重特異性分子をまず、ＣＤ２８タンパク質（又はＣＤ２２タンパク質）と結合させる。次に、試験抗体がＣＤ２８（又はＣＤ２２）分子と結合する能力を評価する。参考二重特異性抗原結合分子との飽和結合後に試験抗体がＣＤ２８（又はＣＤ２２）と結合できる場合、試験抗体は参考二重特異性抗原結合分子とは異なるＣＤ２８（又はＣＤ２２）のエピトープと結合すると結論づけることができる。一方、試験抗体が参考二重特異性抗原結合分子との飽和結合後にＣＤ２８（又はＣＤ２２）分子と結合できないならば、試験抗体は、本発明の参考二重特異性抗原結合分子によって結合されるエピトープと同じＣＤ２８（又はＣＤ２２）のエピトープと結合することができる。次に、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド突然変異及び結合分析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠如が実際に参考二重特異性抗原結合分子と同じエピトープに対する結合によるものか否か、又は立体遮蔽（若しくは別の現象）が観察される結合の欠如の原因であるか否かを確認することができる。この種類の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリ又は当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明のある特定の実施形態によると、例えば、競合的結合アッセイで測定して、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の一つの抗原結合タンパク質が他の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％又はさらには９９％阻害する場合、二つの抗原結合タンパク質は同じ（又はオーバーラップする）エピトープと結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａＩ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照）。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を低減又は排除する抗原における本質的にすべてのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減又は排除するならば、二つの抗原結合タンパク質は同じエピトープとみなされる。一方の抗原結合タンパク質の結合を低減又は排除するアミノ酸突然変異のサブセットのみが他方の結合を低減又は排除するならば、二つの抗原結合タンパク質は「オーバーラップするエピトープ」を有するとみなされる。
【0117】
抗体又はその抗原結合ドメインが参考抗原結合分子と結合について競合するか否かを判定するために、前記結合法を二つの方向で実施する：第一の方向では、参考抗原結合分子を飽和条件下でＣＤ２８タンパク質（又はＣＤ２２タンパク質）と結合させ、続いてＣＤ２８（又はＣＤ２２）分子に対する試験抗体の結合を評価する。第二の方向では、試験抗体を飽和条件下でＣＤ２８（又はＣＤ２２）分子と結合させ、続いてＣＤ２８（又はＣＤ２２）分子に対する参考抗原結合分子の結合を評価する。両方の方向で、第一（飽和）抗原結合分子のみがＣＤ２８（又はＣＤ２２）分子と結合できるならば、試験抗体及び参考抗原結合分子はＣＤ２８（又はＣＤ２２）に対する結合について競合すると結論づけられる。当業者には理解されるように、参考抗原結合分子と結合について競合する抗体は、必ずしも参考抗体と同じエピトープと結合する必要はないが、オーバーラップ又は隣接エピトープと結合することによって、参考抗体の結合を立体的に遮蔽することができる。
【0118】
抗原結合ドメインの調製及び二重特異性分子の構築
特定の抗原に対して特異的な抗原結合ドメインは、当技術分野で公知の任意の抗体生成技術によって調製できる。一旦得られたら、二つの異なる抗原（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ２２）について特異的な、二つの異なる抗原結合ドメインを、互いに対して適切に配置させて、ルーチン方法を用いて本発明の二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる例示的二重特異性抗体フォーマットについては本明細書中の他の箇所で考察する）。ある特定の実施形態において、本発明の多特異性抗原結合分子の一つ以上の個々の成分（例えば、重及び軽鎖）は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体由来である。そのような抗体を作製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の一つ以上の重及び／又は軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を用いて調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（又は任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ２２）に対する高親和性キメラ抗体がまず単離される。抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性について特徴づけ、選択する。マウス定常領域を望ましいヒト定常領域で置換して、本発明の二重特異性抗原結合分子中に組み入れることができる完全ヒト重及び／又は軽鎖を生成する。
特定の抗原に対して特異的な抗原結合ドメインは、当技術分野で公知の任意の抗体生成技術によって調製できる。一旦得られたら、二つの異なる抗原（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ２２）について特異的な、二つの異なる抗原結合ドメインを、互いに対して適切に配置させて、ルーチン方法を用いて本発明の二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる例示的二重特異性抗体フォーマットについては本明細書中の他の箇所で考察する）。ある特定の実施形態において、本発明の多特異性抗原結合分子の一つ以上の個々の成分（例えば、重及び軽鎖）は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体由来である。そのような抗体を作製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の一つ以上の重及び／又は軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を用いて調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（又は任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ２２）に対する高親和性キメラ抗体がまず単離される。抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性について特徴づけ、選択する。マウス定常領域を望ましいヒト定常領域で置換して、本発明の二重特異性抗原結合分子中に組み入れることができる完全ヒト重及び／又は軽鎖を生成する。
【0119】
遺伝子組換え動物を使用してヒト二重特異性抗原結合分子を作製することができる。例えば、内在性マウスイムノグロブリン軽鎖可変配列を再配列して発現することができない遺伝子改変マウスを使用することができ、このマウスは、内在性マウスκ座におけるマウスκ定常遺伝子と機能的に連結されたヒトイムノグロブリン配列によってコード化される一つ又は二つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。そのような遺伝子改変マウスを使用して、二つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの一方に由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と結合する二本の異なる重鎖を含む完全ヒト二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（例えば、そのような組換えマウス及び二重特異性抗原結合分子を産生するためのその使用の詳細な考察については、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれる、米国出願第２０１１／０１９５４５４号を参照）。
【0120】
生物学的に同等
本発明は、記載された抗体のものとは異なるが、ＣＤ２８及び／又はＣＤ２２と結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのような変異体分子は、親配列と比較した場合、アミノ酸の一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗原結合分子コード化ＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の記載された抗原結合分子ものと本質的に生物学的に同等である抗原結合分子をコード化する配列を包含する。そのような変異体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は上で議論されている。
本発明は、記載された抗体のものとは異なるが、ＣＤ２８及び／又はＣＤ２２と結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのような変異体分子は、親配列と比較した場合、アミノ酸の一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗原結合分子コード化ＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の記載された抗原結合分子ものと本質的に生物学的に同等である抗原結合分子をコード化する配列を包含する。そのような変異体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は上で議論されている。
【0121】
本発明は、本明細書に記載の例示的抗原結合分子のいずれかと生物学的に同等である抗原結合分子を含む。二つの抗原結合タンパク質、または抗体は、たとえば、それらが薬剤的同等物又は薬剤的代替物であって、類似した実験条件下、同じモル用量で、単回投与（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｅｓ）又は複数回投与のいずれかで投与した場合に、その吸収速度及び吸収程度が有意差を示さないならば、生物学的に同等と見なされる。一部の抗体は、吸収の程度は同等であるが吸収速度は同等ではないならば、同等または薬剤的代替物とみなされるが、それでも、吸収速度のそのような違いは意図的であり、標識に反映され、例えば、慢性的使用などで有効な体内薬物濃度を達成するために必須ではなく、調査される特定の医薬品にとって医学的に重要でないため、生物学的に同等であると見なされ得る。
【0122】
一実施形態において、二つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、および効力において臨床的有意差がない場合、生物学的に同等である。
【0123】
一実施形態において、二つの抗原結合タンパク質は、患者が参照製品と生物学的製品との間で１回以上切り替えることができ、そのような切り替えなしの継続的な治療と比較した場合に、免疫原性の臨床的に有意な変化、または有効性の減少を含む、副作用のリスクの予想される増加がないならば、生物学的に同等である。
【0124】
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、そのようなメカニズムが知られている範囲で、それらが両方とも共通のメカニズムまたは使用条件に対する作用メカニズムによって作用する場合、生物学的に同等である。
【0125】
生物学的同等性は、インビボ法及びインビトロ法によって実証することができる。生物学的同等性の測定としては、例えば、（ａ）抗体又はその代謝物の濃度を血液、血漿、血清、又は他の生体液における時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関し、合理的に予想するインビトロ試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理学的効果を時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；並びに（ｄ）抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティ若しくは生物学的同等性を確立する、充分に管理された臨床試験が挙げられる。
【0126】
本明細書中に記載する例示的二重特異性抗原結合分子の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を行うことによって、又は生物学的活性に必要のない末端若しくは内部残基若しくは配列を除去することによって、構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を除去するか又は他のアミノ酸と置換して、再生時に不必要または誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを防止することができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する突然変異を含む、本明細書中に記載する例示的二重特異性抗原結合分子を含み得る。
【0127】
種の選択性と種の交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトＣＤ２８と結合するが、他の種からのＣＤ２８とは結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はまた、ヒトＣＤ２２と結合するが、他の種からのＣＤ２２とは結合しない抗原結合分子も提供する。本発明はまた、ヒトＣＤ２８及び一つ以上の非ヒト種からのＣＤ２８と結合する抗原結合分子；並びに／又はヒトＣＤ２２及び一つ以上の非ヒト種からのＣＤ２２と結合する抗原結合分子も含む。
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトＣＤ２８と結合するが、他の種からのＣＤ２８とは結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はまた、ヒトＣＤ２２と結合するが、他の種からのＣＤ２２とは結合しない抗原結合分子も提供する。本発明はまた、ヒトＣＤ２８及び一つ以上の非ヒト種からのＣＤ２８と結合する抗原結合分子；並びに／又はヒトＣＤ２２及び一つ以上の非ヒト種からのＣＤ２２と結合する抗原結合分子も含む。
【0128】
本発明のある特定の例示的実施形態によると、ヒトＣＤ２８及び／又はヒトＣＤ２２と結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーＣＤ２８及び又はＣＤ２２の一つ以上と結合する可能性があるか又は結合しない可能性がある、抗原結合分子が提供される。例えば、本発明の特定の例示的実施形態において、ヒトＣＤ２８及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）ＣＤ２８と結合する第一抗原結合ドメインと、ヒトＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【0129】
免疫複合体
本発明は、例えば、サイトトキシン、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体などの治療部分と複合体化した抗原結合分子（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒性薬には、細胞にとって有害な薬剤が含まれる。免疫複合体の形成に好適な細胞毒性薬及び化学療法剤の例は当該技術分野で公知である（例えば、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第０５／１０３０８１号を参照）。
本発明は、例えば、サイトトキシン、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体などの治療部分と複合体化した抗原結合分子（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒性薬には、細胞にとって有害な薬剤が含まれる。免疫複合体の形成に好適な細胞毒性薬及び化学療法剤の例は当該技術分野で公知である（例えば、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第０５／１０３０８１号を参照）。
【0130】
治療製剤及び投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、及び改善された移動、送達、寛容性などを提供する多の薬剤と用いて処方される。多数の適切な処方は、すべての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見出すことができる。これらの処方としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル（例えば、ＬｌＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照。
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、及び改善された移動、送達、寛容性などを提供する多の薬剤と用いて処方される。多数の適切な処方は、すべての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見出すことができる。これらの処方としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル（例えば、ＬｌＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照。
【0131】
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢及び体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。好ましい用量は、典型的には、体重又は体表面積にしたがって算出される。本発明の二重特異性抗原結合分子を成人患者において治療目的で使用する場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を、通常、約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約０．０２～約７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３～約５ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で静脈内投与するのが有利であり得る。状態の重篤度に応じて、治療の頻度及び期間を調節することができる。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投与量及びスケジュールは経験的に決定することができる；例えば、患者の進行は定期評価によってモニタリングすることができ、それに応じて用量を調節することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野で周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【0132】
例えば、リポソーム中への封入、微小粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現できる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシスなど、様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用できる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａＩ．，１９８７，Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照）。導入の方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与でき、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与できる。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜裏層（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）からの吸収によって投与することができ、他の生物学的活性剤と共に投与してもよい。投与は全身的又は局所的であってよい。
【0133】
本発明の医薬組成物は、標準的注射針及び注射器を用いて皮下的又は静脈内的に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達器具は、本発明の医薬組成物の送達に容易に適用される。そのようなペン型送達器具は、再使用可能又は使い捨てであり得る。再使用可能なペン型送達器具は、概して、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物が全部投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に廃棄することができ、そして医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換することができる。ペン型送達器具は再使用することができる。使い捨てペン型送達器具には交換可能なカートリッジがない。むしろ、使い捨てペン型送達器具は、器具内のリザーバーに保持された医薬組成物があらかじめ充填されている。リザーバーの医薬組成物が空になったら、器具全体を廃棄する。
【0134】
多数の再使用可能なペン及び自己注射器送達装置が、本発明の医薬組成物の日か送達に適用される。例としては、ほんの数例として、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬｌＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達器具の例としては、ほんの数例として、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬｌＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0135】
ある特定の状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用できる；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照。さらに別の実施形態においては、制御放出系を組成物の標的付近に配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３の総説で議論されている。
【0136】
注射可能な製剤には、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴用の投薬形態が含まれ得る。これらの注射可能な製剤は、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射可能な製剤は、例えば、注射に従来使用されている無菌水性媒体又は油性媒体中に上記抗体又はその塩を、溶解、懸濁、又は乳化させることによって調製することができる。したがって、注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含む等張液などがあり、これらは、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコールグリコール、ポリエチレングリコール）、ノニオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、水素化ヒマシ油のＨＣＯ－５０（ポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油等が用いられ、これらは、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用することができる。このように調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【0137】
有利には、上述の経口又は非経口的に使用するための医薬組成物は、一回分の活性成分に適した単位用量で投薬形態に調製される。単位用量のそのような投薬形態としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前記抗体の量は、概して、単位用量で投薬形態あたり約５～約５００ｍｇであり；特に、注射の形態では、前記抗体が約５～約１００ｍｇで含まれ、他の投薬形態については約１０～約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。
【0138】
抗原結合分子の治療上の使用
本発明は、それを必要とする対象に、抗ＣＤ２８抗体、又はＣＤ２８と標的抗原（例えば、ＣＤ２２）とに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書中で開示する抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと薬剤的に許容される担体又は希釈剤とを含み得る。本明細書中で使用する場合、「それを必要とする対象」という表現は、がんの一つ以上の症状又は兆候を示すヒト若しくは非ヒト動物（例えば、腫瘍を発現するか、若しくは以下に記載するがんのいずれかに罹っている対象）、あるいはＣＤ２２活性の阻害若しくは低下又はＣＤ２２＋細胞の枯渇から恩恵を受けるヒト若しくは非ヒト動物を意味する。
本発明は、それを必要とする対象に、抗ＣＤ２８抗体、又はＣＤ２８と標的抗原（例えば、ＣＤ２２）とに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書中で開示する抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと薬剤的に許容される担体又は希釈剤とを含み得る。本明細書中で使用する場合、「それを必要とする対象」という表現は、がんの一つ以上の症状又は兆候を示すヒト若しくは非ヒト動物（例えば、腫瘍を発現するか、若しくは以下に記載するがんのいずれかに罹っている対象）、あるいはＣＤ２２活性の阻害若しくは低下又はＣＤ２２＋細胞の枯渇から恩恵を受けるヒト若しくは非ヒト動物を意味する。
【0139】
本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子（並びにこれを含む治療用組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化及び／又は標的化が有益である任意の疾患又は障害を治療するために有用である。特に、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２２発現若しくは活性又はＣＤ２２＋細胞の増殖と関連するかはこれらによって媒介される任意の疾患若しくは障害の治療、予防及び／又は改善のために使用することができる。本発明の治療法が達成される作用メカニズムには、エフェクタ細胞、例えば、Ｔ細胞の存在下でＣＤ２２を発現する細胞の殺滅が含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて阻害又は殺滅することができる、ＣＤ２２を発現する細胞には、例えば、がん性Ｂ細胞が含まれる。
【0140】
本発明の抗原結合分子は、例えば、血液、骨髄、リンパ節（例えば、胸腺、脾臓）、結腸、肝臓、肺、乳房、直腸がん、中枢神経系、及び膀胱がんで生じる原発性及び／又は転移性腫瘍を治療するために使用することができる。ある例示的実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｂ細胞増殖性障害を治療するために使用される。
【0141】
本発明はまた、対象における残存がんを治療するための方法も包含する。本明細書中で使用する場合、「残存がん」という語は、抗がん療法での治療後の対象における一つ以上のがん性細胞の存在又は持続を意味する。
【0142】
ある特定の態様によると、本発明は、ＣＤ２２発現と関連する疾患又は障害（例えば、Ｂ細胞増殖性障害）を治療する方法であって、対象が他の種類の抗がん療法に対して非反応性であることが示された後に、本明細書中の他の箇所で記載する二重特異性抗原結合分子の一つ以上を当該対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本発明は、Ｂ細胞増殖性障害を治療する方法であって、がん、例えば、対象がＢ細胞増殖性障害に罹っている患者に対する標準治療を受けた後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週又は４週、２ヵ月、４ヵ月、６ヵ月、８ヵ月、１年、又はそれ以上で、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を当該患者に投与することを含む方法を包含する。他の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子（抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子）をまず、（例えば、前立腺がん細胞の堅固な初期枯渇を提供するために）一つ以上の時点で対象に投与し、続いて、異なるＩｇＧドメイン、例えばＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同等の二重特異性抗原結合分子を、その後の時点で投与する。本発明の抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２抗体を他の二重特異性抗原結合分子と、例えば、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用し得ることが想定される。本発明の二重特異性抗体は、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４、並びに他の標的を標的とするものと組み合わせて使用されることも想定される。同じ腫瘍抗原（例えば、ＣＤ２２）を標的とするが、二重特異性抗体の一方はＴ細胞上のＣＤ３を標的とし、他方の二重特異性抗体が共刺激分子様ＣＤ２８を標的とする、二つの二重特異性抗体を組み合わせることが有利であり得る。この組み合わせは、腫瘍細胞殺滅を増強するために単独で使用してもよいし、又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用してもよい。
【0143】
併用療法及び処方
本発明は、本明細書中に記載する例示的抗体及び二重特異性抗原結合分子のいずれかを、一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて含む組成物及び治療製剤、並びにそれを必要とする対象にそのような組み合わせを投与することを含む治療方法を包含する。
本発明は、本明細書中に記載する例示的抗体及び二重特異性抗原結合分子のいずれかを、一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて含む組成物及び治療製剤、並びにそれを必要とする対象にそのような組み合わせを投与することを含む治療方法を包含する。
【0144】
本発明の抗原結合分子と併用又は組み合わせて投与することができる例示的な追加の治療薬としては、例えば、化学療法、放射線療法、ＰＤ－１を標的とするチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、又はセミプリマブ、米国特許第９，９８７，５００号を参照、配列番号１６２／１７０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３など、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４－１ＢＢなどの分子を標的とする共刺激アゴニスト二価抗体、ＣＤ３ｘ二重特異性抗体（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号（ＲＥＧＮ１９７９）、国際公開第２０１７／０５３８５６Ａ１号、国際公開第２０１４／０４７２３１Ａ１号、国際公開第２０１８／０６７３３１Ａ１号及び国際公開第２０１８／０５８００１Ａ１号を参照）、ＣＤ２２ＸＣＤ３、ＣＤ２２ＸＣＤ２８を標的とするか、又はＣＤ２０ＸＣＤ３を標的とする他の抗体及び他の共刺激ＣＤ２８ｘ二重特異性抗体が挙げられる。
【0145】
本発明の抗体と組み合わせて有益に投与し得る他の薬剤としては、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、及び小分子サイトカイン阻害剤を含むサイトカイン阻害剤並びにサイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、又はそれらの各受容体に結合する抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物（例えば、本明細書中で開示する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２２二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物）はまた、「ＩＣＥ」：イホスファミド（例えば、Ｉｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（例えば、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）；「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、シタラビン（例えば、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ａｒａ－Ｃ）、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）；及び「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）、メチルプレドニゾロン（例えば、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）から選択される一つ以上の治療薬組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与することもできる。
【0146】
本発明はまた、本明細書中に記載の抗原結合分子のいずれかと、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１ Ｒ、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－ｏ、ＰＤＧＦＲ－Ｉ３、ＦＯＬＨ１、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキン、又は前記サイトカインのいずれかの一つ以上の阻害剤とを含む治療組み合わせも包含し、ここで、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ若しくは抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；又は他の操作された分子、例えば、ダイアボディ、トライアオボディ、テトラボディ、ミニボディ及び 最小認識単位）である。本発明の抗原結合分子はまた、組み合わせ ｗｉｔｈ 抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド及び／又はＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／又は同時処方することもできる。本発明の抗原結合分子はまた、放射線治療及び／又は従来型化学療法、又はチェックポイント阻害剤又は他の二重特異性抗体を含む生物学的製剤を用いた治療も含む治療レジメンの一部として投与することもできる。
【0147】
本発明は、本明細書中に記載する抗原結合分子のいずれかを一つ以上の化学療法剤と組み合わせて含む組成物及び治療製剤を包含する。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレクタル、例えば、アミノグルテチミド、マイトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダラキセート；デフォファミン；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジクオン；エルフオルニチン；エリプチニウムアセタート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び前記のいずれかの薬剤的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調整又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェンを含む抗エストロゲン、４（５）－イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；並びに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリン；並びに前記のいずれかの薬剤的に許容される塩、酸又は誘導体も含まれる。
【0148】
追加の治療活性成分は、本発明の抗原結合分子の投与直前に、投与と同時に、又は投与直後に、投与することができる；（本開示に関して、そのような投与レジメンは、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗原結合分子の投与とみなされる）。
【0149】
本発明は、本発明の抗原結合分子を、本明細書中の他の箇所で記載する追加の治療活性成分（複数可）の一つ以上と同時処方される医薬組成物を包含する。
投与レジメン
投与レジメン
【0150】
本発明のある特定の実施形態によると、抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体又はＣＤ２２及びＣＤ２８と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）の複数用量を対象に対して所定の期間にわたって投与することができる。本発明のこの態様にかかる方法は、対象に対して本発明の抗原結合分子の複数用量を連続して投与することを含む。本明細書中で使用する場合、「連続して投与する」とは、抗原結合分子の各用量を対象に対して異なる時点で、例えば、あらかじめ決められた間隔（例えば、数時間、数日、数週、または数カ月）をあけた異なる日に投与することを意味する。本発明は、抗原結合分子の単一の初回用量、続いて抗原結合分子の一つ以上の第二用量、続いて任意選択的に抗原結合分子の一つ以上の第三用量を、連続して投与することを含む方法を包含する。
【0151】
「初回用量」、「第二用量」、及び「第三用量」という語は、本発明の抗原結合分子の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量である（「ベースライン用量」とも呼ばれる）；「第二用量」は、初回用量の後に投与される用量である；そして「第三用量」は第二用量の後に投与される用量である。初回用量、第二用量、及び第三用量は、すべて同じ量の抗原結合分子を含んでいてもよいが、概して、投与の頻度に関して互いに異なっていてもよい。しかしながら、ある特定の実施形態において、初回用量、第二用量及び／又は第三用量に含まれる抗原結合分子の量は、治療の過程で互いに変わる（例えば、必要に応じて上方又は下方調節される）。ある特定の実施形態では、２以上（例えば、２、３、４、又は５）の用量を治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与し、続いてより低頻度で投与される後続の用量（例えば、「維持用量」）を投与する。
【0152】
本発明の例示的一実施形態では、第二及び／又は第三用量の各々は、直前の投薬後１～２６（例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、方はそれ以上）週で投与される。「直前の投薬」という表現は、本明細書中で使用する場合、一連の複数回投与において、介在する投薬がなく配列中の次の用量を投与する前に患者に投与される抗原結合分子の用量を意味する。
【0153】
本発明のこの態様にかかる方法は、患者に対して、抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体又はＣＤ２２及びＣＤ２８と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）の任意の数の第二及び／又は第三用量を投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の第二用量のみを患者に投与する。他の実施形態では、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の）第二用量を患者に投与する。同様に、ある特定の実施形態において、単一の第三用量のみを患者に投与する。他の実施形態において、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の）第三用量を患者に投与する。
【0154】
複数の第二用量を含む実施形態では、各第二用量を他の第二用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、各第二用量は、直前の投薬の１～２週間後に患者に投与してもよい。同様に、複数の第三用量を含む実施形態では、各第三用量を他の第三用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、各第三用量は、直前の投薬の２～４週間後に患者に投与してもよい。あるいは、第二および／または第三用量を患者に投与する頻度は、治療レジメンの過程にわたって変化し得る。投与の頻度は、臨床検査の後、個々の患者のニーズに応じて医師が治療の過程で調節することもできる。
【0155】
一実施形態において、抗原結合分子（例えば、ＣＤ２２及びＣＤ２８と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）を対象に対して重量基準の用量として投与する。「重量基準の用量」（例えば、ｍｇ／ｋｇで表した用量）は、抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は対象の体重に応じて変化するであろう二重特異性抗原結合分子の用量である。
【0156】
別の実施形態では、抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は二重特異性抗原結合分子は対象に固定用量として投与される。「固定用量」（例えば、ｍｇ単位の用量）とは、抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は二重特異性抗原結合分子の一回量が、任意の特定の対象関連因子、例えば重量に関係なくすべての対象に使用されることを意味する。特定の一実施形態において、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は二重特異性抗原結合分子の固定用量は、所定の体重又は年齢に基づく。
【0157】
概して、本発明の抗原結合分子の好適な用量は、レシピエントの体重１キログラムあたり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲内であり、概して、体重１キログラムあたり約１～５０ｍｇの範囲内であり得る。例えば、抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は二重特異性抗原結合分子は、単回用量につき約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。また、記載されている値の中間の値や範囲も本発明の一部であることが意図される。
【0158】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、約２５ｍｇ～約２５００ｍｇの固定用量で投与される。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約２０００ｍｇ、又は約２５００ｍｇの固定用量として投与される。また、記載されている値の中間の値や範囲も本発明の一部であることが意図される。
【0159】
抗体の診断用途
本発明の二重特異性抗体はまた、例えば、診断目的で、サンプル中のＣＤ２８若しくはＣＤ２２、又はＣＤ２８発現細胞若しくはＣＤ２２発現細胞を検出及び／又は測定するために使用できる。例えば、抗－抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２抗体、又はそのフラグメントを使用して、ＣＤ２８又はＣＤ２２の異常な発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現不足など）によって特徴づけられる状態又は疾患を診断することができる。ＣＤ２８又はＣＤ２２の例示的診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを、本発明の抗体と接触させることを含み得、ここで、抗体は、検出可能な標識又はレポータ分子で標識されている。あるいは、標識されていない抗体を、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて、診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポータ分子は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉ；蛍光又は化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、若しくはローダミン；又は酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又はルシフェラーゼであり得る。サンプル中のＣＤ２８又はＣＤ２２を検出又は測定するために使用できる特定の例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。本発明によるＣＤ２８又はＣＤ２２診断アッセイにおいて使用できるサンプルには、正常又は病的状態で、検出可能な量のＣＤ２８若しくはＣＤ２２タンパク質、又はそのフラグメントを含む、患者から得ることができる任意の組織又は流体サンプルが含まれる。概して、健常な患者（例えば、異常なＣＤ２８又はＣＤ２２レベル又は活性と関連する疾患又は状態に罹患していない患者）から得られる特定のサンプル中のＣＤ２８又はＣＤ２２のレベルを測定して、ＣＤ２８又はＣＤ２２のベースライン又は標準レベルをまず確立する。ＣＤ２８又はＣＤ２２のこのベースラインレベルを次に、ＣＤ２８又はＣＤ２２関連疾患又は状態に罹っている疑いのある個体から得られたサンプルにおいて測定されたＣＤ２８又はＣＤ２２のレベルと比較することができる。
本発明の二重特異性抗体はまた、例えば、診断目的で、サンプル中のＣＤ２８若しくはＣＤ２２、又はＣＤ２８発現細胞若しくはＣＤ２２発現細胞を検出及び／又は測定するために使用できる。例えば、抗－抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２抗体、又はそのフラグメントを使用して、ＣＤ２８又はＣＤ２２の異常な発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現不足など）によって特徴づけられる状態又は疾患を診断することができる。ＣＤ２８又はＣＤ２２の例示的診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを、本発明の抗体と接触させることを含み得、ここで、抗体は、検出可能な標識又はレポータ分子で標識されている。あるいは、標識されていない抗体を、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて、診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポータ分子は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉ；蛍光又は化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、若しくはローダミン；又は酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又はルシフェラーゼであり得る。サンプル中のＣＤ２８又はＣＤ２２を検出又は測定するために使用できる特定の例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。本発明によるＣＤ２８又はＣＤ２２診断アッセイにおいて使用できるサンプルには、正常又は病的状態で、検出可能な量のＣＤ２８若しくはＣＤ２２タンパク質、又はそのフラグメントを含む、患者から得ることができる任意の組織又は流体サンプルが含まれる。概して、健常な患者（例えば、異常なＣＤ２８又はＣＤ２２レベル又は活性と関連する疾患又は状態に罹患していない患者）から得られる特定のサンプル中のＣＤ２８又はＣＤ２２のレベルを測定して、ＣＤ２８又はＣＤ２２のベースライン又は標準レベルをまず確立する。ＣＤ２８又はＣＤ２２のこのベースラインレベルを次に、ＣＤ２８又はＣＤ２２関連疾患又は状態に罹っている疑いのある個体から得られたサンプルにおいて測定されたＣＤ２８又はＣＤ２２のレベルと比較することができる。
【実施例】
【0160】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのように作成し使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが自身の発明の想定する範囲を限定することを意図するものではない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力をしたが、多少の実験誤差及び偏差を考慮する必要がある。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【0161】
実施例１ 抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８抗体の構築
抗ＣＤ２８抗体の生成
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒトイムノグロブリン重及びκ軽鎖可変領域をコード化するＤＮＡを含む遺伝子操作マウス）を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に融合させたヒトＣＤ２８タンパク質、又はＣＤ２８を発現する細胞若しくはＣＤ２８をコード化するＤＮＡで免疫かすることによって、抗ＣＤ２８抗体を得た。抗体免疫応答をＣＤ２８特異的イムノアッセイによってモニタリングした。所望の免疫応答が達成されたら、脾臓細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、ＣＤ２８特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を使用して、いくつかの抗ＣＤ２８キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。加えて、米国出願第２００７／０２８０９４５Ａ１号で記載されているように、いくつかの完全ヒト抗ＣＤ２８抗体を、骨髄腫細胞への融合なしに、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。
抗ＣＤ２８抗体の生成
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒトイムノグロブリン重及びκ軽鎖可変領域をコード化するＤＮＡを含む遺伝子操作マウス）を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に融合させたヒトＣＤ２８タンパク質、又はＣＤ２８を発現する細胞若しくはＣＤ２８をコード化するＤＮＡで免疫かすることによって、抗ＣＤ２８抗体を得た。抗体免疫応答をＣＤ２８特異的イムノアッセイによってモニタリングした。所望の免疫応答が達成されたら、脾臓細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、ＣＤ２８特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を使用して、いくつかの抗ＣＤ２８キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。加えて、米国出願第２００７／０２８０９４５Ａ１号で記載されているように、いくつかの完全ヒト抗ＣＤ２８抗体を、骨髄腫細胞への融合なしに、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。
【0162】
本実施例の方法に従って生成した例示的抗ＣＤ２８抗体のある特定の生物学的特性を以下に記載する実施例で詳細に記載する。
【0163】
抗ＣＤ２２抗体の生成
遺伝子改変マウス（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、前記参照）をヒトＣＤ２２抗原（例えば、ｈＣＤ２２ ｅｃｔｏ（Ｄ２０－Ｒ６８７）を参照。ｈＦｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１９６８－ＳＬ－０５０；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ ＣＡＡ４２００６（図３も参照）で免疫化することによるか、又はヒトイムノグロブリン重及びκ軽鎖可変領域をコード化するＤＮＡを含む遺伝子操作マウスをヒトＣＤ２２抗原で免疫化することによって、抗ＣＤ２２抗体を得た。
遺伝子改変マウス（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、前記参照）をヒトＣＤ２２抗原（例えば、ｈＣＤ２２ ｅｃｔｏ（Ｄ２０－Ｒ６８７）を参照。ｈＦｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１９６８－ＳＬ－０５０；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ ＣＡＡ４２００６（図３も参照）で免疫化することによるか、又はヒトイムノグロブリン重及びκ軽鎖可変領域をコード化するＤＮＡを含む遺伝子操作マウスをヒトＣＤ２２抗原で免疫化することによって、抗ＣＤ２２抗体を得た。
【0164】
免疫化後、脾臓細胞を各マウスから収集し、（１）マウス骨髄腫細胞を融合させてそれらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞を形成し、そしてＣＤ２２特異性についてスクリーニングするか、又は（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）と結合し特定するソーティング試薬としてヒトＣＤ２２フラグメントを使用して、Ｂ細胞をソーティングした（米国出願第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載のとおり）。
【0165】
ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＣＤ２２に対するキメラ抗体をまず単離した。抗体を特徴づけし、親和性、選択性などをはじめとする所望の特性について選択した。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば、野生型又は修飾ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４定常領域と置換して、完全ヒト抗ＣＤ２２抗体を生成した。選択された定常領域は特定用途に応じて変わり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性特性は可変領域にある。
【0166】
ＣＤ２８及びＣＤ２２と結合する二重特異性抗体の生成
抗ＣＤ２２特異的結合ドメインと抗ＣＤ２８特異的結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、標準的方法を使用して構築し、ここで、抗ＣＤ２２抗原結合ドメイン及び抗ＣＤ２８抗原結合ドメインは、各々、共通のＬＣＶＲと対になった、異なる別個のＨＣＶＲを含む。場合によっては、抗ＣＤ２８抗体からの重鎖、抗ＣＤ２２抗体からの重鎖及び共通の軽鎖を利用して二重特異性抗体を構築した（表１を参照）。
抗ＣＤ２２特異的結合ドメインと抗ＣＤ２８特異的結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、標準的方法を使用して構築し、ここで、抗ＣＤ２２抗原結合ドメイン及び抗ＣＤ２８抗原結合ドメインは、各々、共通のＬＣＶＲと対になった、異なる別個のＨＣＶＲを含む。場合によっては、抗ＣＤ２８抗体からの重鎖、抗ＣＤ２２抗体からの重鎖及び共通の軽鎖を利用して二重特異性抗体を構築した（表１を参照）。
【0167】
本実施例にしたがって創出された二重特異性抗体は、二つの独立した抗原結合ドメイン（すなわち、結合アーム）を含む。第一抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２８抗体由来の重鎖可変領域（「ＣＤ２８－ＶＨ」）を含み、第二抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２２抗体由来の重鎖可変領域（「ＣＤ２２－ＶＨ」）を含む。抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２８の両方は共通の軽鎖を共有する。ＣＤ２８－ＶＨ／ＣＤ２２－ＶＨ対合によって、Ｔ細胞上のＣＤ２８及び腫瘍細胞上のＣＤ２２を特異的に認識する抗原結合ドメインを創出する。
【0168】
実施例２ 重及び軽鎖可変領域アミノ酸及び核酸配列
表１は、本発明の選択された抗ＣＤ２２抗体の重及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。
表１：ＣＤ２２抗体のアミノ酸配列識別子
表２：ＣＤ２２抗体の核酸配列識別子
表１は、本発明の選択された抗ＣＤ２２抗体の重及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。
表１：ＣＤ２２抗体のアミノ酸配列識別子
【表1】
【表2】
【0169】
表３は、本発明の選択された抗ＣＤ２８抗体の重及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ）、ＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列識別子を表４に記載する。
表３：ＣＤ２８抗体のアミノ酸配列識別子
表４：ＣＤ２８抗体の核酸配列識別子
表３：ＣＤ２８抗体のアミノ酸配列識別子
【表3】
【表4】
【0170】
構築された様々な抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の成分部分のまとめを表５に記載する。表６及び７は、二重特異性抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＣＤＲ及び重鎖及び軽鎖配列識別子を記載する。
表５：抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の成分部分のまとめ
表５：抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の成分部分のまとめ
【表5】
【0171】
表６は、本明細書中で励磁される二重特異性抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８抗体のアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表７に記載する。
表６：抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体のアミノ酸配列
表７：抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の核酸配列
実施例３：水素重水素交換によるＣＤ２２に対するＲＥＧＮ５８３７結合のエピトープマッピング
表６：抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体のアミノ酸配列
【表6】
【表7】
【0172】
質量分析を伴うＨ／Ｄ交換エピトープマッピング（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施して、Ｈ４ｓＨ３３０３７Ｐ２と相互作用するＣＤ２２のアミノ酸残基（組換えヒトＣＤ２２、配列番号５０）を決定した（表１、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対参照）（抗ｈＣＤ２２モノクローナル抗体；ＲＥＧＮ５８３７の親抗ｈＣＤ２２抗体）。Ｈ／Ｄ交換法の概要は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；及びＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。
【0173】
ＨＤＸ－ＭＳ実験は、重水素標識及びクエンチング用のＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステムと、サンプル消化及びローディング用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）と、解析的勾配用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）と、ペプチド質量測定用のＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計とから構成された統合ＨＤＸ／ＭＳプラットフォームで実施した。
【0174】
標識溶液は、ｐＤ７．０（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４に相当）にてＤ２Ｏ中ＰＢＳ緩衝液として調製した。重水素標識については、１１μｌのＣＤ２２．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ５１４０（配列番号５０）、５６．７μＭ）又は１：０．６モル比でＨ４ｓＨ３３０３７Ｐ２（上記参照）とプレミックスしたＣＤ２２．ｍｍＨ（Ａｇ－Ａｂ複合体）を２０℃にて４４μｌのＤ２Ｏ標識溶液とともに様々な時点で、二連でインキュベートした（例えば、非重水素化対照＝０秒；５分及び１０分間重水素標識）。５５μｌの予め冷却したクエンチ緩衝液（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素及び１％ギ酸）を各サンプルに添加することによって重水素化反応をクエンチして、２０℃で５分間インキュベートした。次に、クエンチしたサンプルをＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入し、オンラインペプシン／プロテアーゼ ＸＩＩＩ消化を行った。消化したペプチドは、１０％－３２％Ｂ（移動相Ａ：０．５％水中ギ酸、移動相Ｂ：０．１％アセトニトリル中ギ酸）の１３分勾配を用いたＣ８カラム（１．０ｍｍ×５０ｍｍ、ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ）によりにより分離した。溶出したペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ又はＬＣ－ＭＳモードでＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析によって分析した。
【0175】
Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して、ＣＤ２２及びそのランダム化配列を含むデータベースについて非重水素化ＣＤ２２サンプルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを検索した。検索パラメータ（単位はＥＬＮ）は、非特異的酵素消化をデフォルトとして、ヒトグリコシル化を共通の変数修飾として使用して設定した。次に、同定されたペプチドのリストをＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（第３．３版）にインポートして、全ての重水素化サンプルからＬＣ－ＭＳによって検出された各ペプチドの重水素取り込みを計算した。所与のペプチドについて、各時点での重心質量（強度加重平均質量）を使用して、重水素取り込み（Ｄ）及び重水素取り込みのパーセンテージ（％Ｄ）を計算した（下記参照）。
【数1】
【0176】
ｈＣＤ２２．ｍｍＨ（配列番号５０）からの合計４２７のペプチドが、ｈＣＤ２２．ｍｍＨ単独及びＨ４ｓＨ３３０３７Ｐ２との複合体中のｈＣＤ２２．ｍｍＨ（配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対）サンプルの両方から同定され、ｈＣＤ２２の９２．０％配列カバレージであった。５％を上回るＤ取り込みパーセント差を示すペプチドは有意に保護されたと定義された表８）。ｈＣＤ２２．ｍｍＨについて、アミノ酸４８１～５０５（ＮＶＱＹＡＰＲＤＶＲＶＲＫＩＫＰＬＳＥＩＨＳＧＮＳ；配列番号５７）及び５２３～５３７（ＦＷＥＫＮＧＲＬＬＧＫＥＳＱＬＮＦ；配列番号５８）に相当するペプチドはＨ４ｓＨ３３０３７Ｐ２により有意に保護された。
表８：Ｈ４ｓＨ３３０３７Ｐ２に対する結合により有意に保護された、選択されたＣＤ２２．ｍｍＨペプチド
実施例４：ＣＤ２２に対して結合するＨ４ｓＨ３３０４１Ｐ２の水素重水素交換によるエピトープマッピング
表８：Ｈ４ｓＨ３３０３７Ｐ２に対する結合により有意に保護された、選択されたＣＤ２２．ｍｍＨペプチド
【表8-1】
【表8-2】
【0177】
質量分析を伴うＨ／Ｄ交換エピトープマッピング（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施して、Ｈ４ｓＨ３３０４１Ｐ２と相互作用するＣＤ２２のアミノ酸残基（組換えヒトＣＤ２２、配列番号５０）を決定した（配列番号１８／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する抗ｈＣＤ２２モノクローナル抗体）、ＲＥＧＮ５８３８の親抗ｈＣＤ２２）。Ｈ／Ｄ交換法の概要は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；及びＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。
【0178】
ＨＤＸ－ＭＳ実験は、重水素標識及びクエンチング用のＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステムと、サンプル消化及びローディング用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）と、解析的勾配用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）と、ペプチド質量測定用のＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計とから構成された統合ＨＤＸ／ＭＳプラットフォームで実施した。
【0179】
標識溶液は、ｐＤ７．０（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４に相当）にてＤ２Ｏ中ＰＢＳ緩衝液として調製した。重水素標識については、１１μｌのＣＤ２２．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ５１４０（配列番号５０）、５６．７μＭ）又は１：０．６モル比でＨ４ｓＨ３３０４１Ｐ２とプレミックスしたＣＤ２２．ｍｍＨ（Ａｇ－Ａｂ複合体）を、２０℃にて４４μｌのＤ２Ｏ標識溶液と共に様々な時点で、二連でインキュベートした（例えば、非重水素化対照＝０秒；５分及び１０分間重水素標識）。５５μｌの予め冷却したクエンチ緩衝液（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素及び１％ギ酸）を各サンプルに添加することによって重水素化反応をクエンチして、２０℃で５分間インキュベートした。次に、クエンチしたサンプルをＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入し、オンラインペプシン／プロテアーゼ ＸＩＩＩ消化を行った。消化したペプチドは、１０％－３２％Ｂ（移動相Ａ：０．５％水中ギ酸、移動相Ｂ：０．１％アセトニトリル中ギ酸）の１３分勾配を用いたＣ８カラム（１．０ｍｍ×５０ｍｍ、ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ）によりにより分離した。溶出したペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ又はＬＣ－ＭＳモードでＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析によって分析した。
【0180】
Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して、ＣＤ２２及びそのランダム化配列を含むデータベースについて非重水素化ＣＤ２２サンプルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを検索した。検索パラメータ（単位はＥＬＮ）は、非特異的酵素消化をデフォルトとして、ヒトグリコシル化を共通の変数修飾として使用して設定した。次に、同定されたペプチドのリストをＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（第３．３版）にインポートして、全ての重水素化サンプルからＬＣ－ＭＳによって検出された各ペプチドの重水素取り込みを計算した。所与のペプチドについて、各時点での重心質量（強度加重平均質量）を使用して、重水素取り込み（Ｄ）及び重水素取り込みのパーセンテージ（％Ｄ）を後述するように計算した。
【数2】
【0181】
ｈＣＤ２２．ｍｍＨ（配列番号５０）から合計４５４のペプチドが、ｈＣＤ２２．ｍｍＨ単独及びＨ４ｓＨ３３０４１Ｐ２サンプルとの複合体中ｈＣＤ２２．ｍｍＨの両方から同定され、ｈＣＤ２２の９０．５％配列カバレージであった。５％を上回るＤ取り込み値パーセント差を示すペプチドは、有意に保護されたと定義された。ｈＣＤ２２．ｍｍＨについて、アミノ酸２４６～２７７（ＣＥＶＳＳＳＮＰＥＹＴＴＶＳＷＬＫＤＧＴＳＬＫＫＱＮＴＦＴＬＮＬ；配列番号５９）に相当するペプチドは、Ｈ４ｓＨ３３０４１Ｐ２により有意に保護された。表９は、Ｈ４ｓＨ３３０４１Ｐ２に対する結合により有意に保護された、選択されたペプチドからの結果を提示する。
表９：Ｈ４ｓＨ３３０４１Ｐ２に対する結合に際して著しい保護を伴う選択されたＣＤ２２．ｍｍＨペプチド
実施例５：表面プラズモン共鳴によって誘導されたＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合親和性及び速度定数
表９：Ｈ４ｓＨ３３０４１Ｐ２に対する結合に際して著しい保護を伴う選択されたＣＤ２２．ｍｍＨペプチド
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【0182】
精製された抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂ又は抗ＣＤ２２二価親ｍＡｂと結合するｈＣＤ２２．ｍｍＨ（配列番号５０）及びｍｆＣＤ２２．ｍｍＨ（配列番号５１）の平衡解離定数（ＫＤ値）（表１参照、ｍＡＢ３３０３７Ｐ２；ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ：配列番号２／１０）及びｍＡｂ３３０４１Ｐ２；ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ：配列番号１８／１０）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００又はＢｉａｃｏｒｅ ４０００装置を用いたリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサを用いて決定した。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサ表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＲＥＧＮ２５６７：ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ：配列番号３３／３４）とのアミンカップリングにより誘導体化して、精製された抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異又は抗ＣＤ２２親ｍＡｂを捕捉した（ｍＡｂ３３０３７Ｐ２及びｍＡｂ３３０４１Ｐ２について表１及び２を参照）。このＢｉａｃｏｒｅ結合試験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）から構成される緩衝液中で実施した。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製されたＣ末端ｍｙｃ．ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ（配列番号６０として開示される「ヘキサヒスチジン」）を有する、異なる濃度のｈＣＤ２２（配列番号５０）及びｍｆＣＤ２２（配列番号５１）（９０ｎＭ～３．３３又は０．３７ｎＭの範囲、３倍希釈）をｍＡｂ捕捉表面上に３０μｌ／分の流量で注入した。ＣＤ２２．ｍｍＨ（配列番号５０）の捕捉したモノクローナル抗体に対する結合を５分間モニタリングし、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中のＣＤ２２．ｍｍＨの解離を１０分間モニタリングした。結合反応速度実験のすべてを２５℃で実施した。速度論的結合（Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数は、リアルタイムセンサグラムを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線のフィッティングソフトウェアを使用した１：１結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）は、運動速度定数から以下のようにして計算した：
ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ、及びｔ１／２（ｍｉｎ）＝０．６９３／ｋｄ／６０
ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ、及びｔ１／２（ｍｉｎ）＝０．６９３／ｋｄ／６０
【0183】
２５℃での精製ｍＡｂと結合するヒト及びｃｙｎｏＣＤ２２の結合反応速度パラメータを表１０～１２で後述する。
【0184】
ｈＣＤ２８．ｍｍＨ（配列番号５４）精製抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂ又は抗ＣＤ２８二価親ｍＡｂ（ｍＡｂ１４２２６Ｐ２については表３及び４を参照）の平衡解離定数（ＫＤ値）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００装置を用いるリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサを使用して決定した。ＣＭ４ Ｂｉａｃｏｒｅセンサ表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＲＥＧＮ２５６７；ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ 配列番号３３／３４）とのアミンカップリングにより誘導体化して、精製抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性又は抗ＣＤ２８親ｍＡｂを捕捉した（上記参照）。このＢｉａｃｏｒｅ結合試験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）から構成される緩衝液中で実施した。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製されたＣ末端ｍｙｃ．ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ（配列番号６０として開示される「ヘキサヒスチジン」）を有する、異なる濃度のｈＣＤ２８（６００ｎＭ～２．４７ｎＭの範囲、３倍希釈）をｍＡｂ捕捉表面上に５０μｌ／の流量で注入した。ＣＤ２８．ｍｍＨ（配列番号５４）の捕捉したモノクローナル抗体に対する結合を５分間モニタリングし、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中のＣＤ２８．ｍｍＨの解離を１０分間モニタリングした。結合反応速度実験のすべてを２５℃で実施した。速度論的結合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数は、リアルタイムセンサグラムを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線のフィッティングソフトウェアを使用した１：１結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）は、運動速度定数から以下のようにして計算した：
ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ、及びｔ１／２（ｍｉｎ）＝０．６９３／ｋｄ／６０
ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ、及びｔ１／２（ｍｉｎ）＝０．６９３／ｋｄ／６０
【0185】
２５℃での精製ｍＡｂに結合するヒトＣＤ２８の結合反応速度パラメータを表１３で後述する。
表１０：２５℃での抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂに対するヒトＣＤ２２．ｍｍＨ結合反応速度
表１１：２５℃での抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂに対するサルＣＤ２２．ｍｍＨ（ＸＰ＿００５５８８８９９．１）結合反応速度
表１２：２５℃での抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂに対するサルＣＤ２２．ｍｍＨ（ＥＨＨ５９４６３．１）結合反応速度
表１３：２５℃での抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂに対するヒトＣＤ２８．ｍｍＨ結合反応速度
実施例６ フローサイトメトリを使用した、標的細胞株（Ｎａｌｍ６）、エフェクタ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）、並びにカニクイザルＴ及びＢ細胞に対する抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合特異性
【表10】
表１１：２５℃での抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性ｍＡｂに対するサルＣＤ２２．ｍｍＨ（ＸＰ＿００５５８８８９９．１）結合反応速度
【表11】
【表12-1】
【表12-2】
【表13】
【0186】
フローサイトメトリ分析を利用して、ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の、ヒトＣＤ２２発現Ｎａｌｍ６細胞及びヒトＣＤ２８発現ＪｕｒｋａＴ細胞並びにカニクイザルＴ（ＣＤ２８＋）及びＢ（ＣＤ２２＋）細胞に対する結合を決定した。簡単に説明すると、１×１０５細胞／ウェルを３０分間４℃にて、ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体又はＨ４ｓＨ１５２６０Ｐ（ヒト又はカニクイザルＣＤ２８又はＣＤ２２に対する交差反応性がなくヒト抗原と結合するアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ４抗体）の、Ｊｕｒｋａｔ及びＮａｌｍ６細胞について１３３ｎＭから６１ｐＭの範囲の段階希釈とインキュベートした。カニクイザルＰＢＭＣを単一の６７ｎＭ濃度の抗体とインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、１％ろ過ＦＢＳを含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒト二次抗体を細胞に添加し、さらに３０分間インキュベートした。カニクイザルＰＢＣＭを含むウェルにさらなるフェノタイピング抗体カクテル（抗ＣＤ２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１４）を添加した。抗体を含まないか又は二次抗体のみを含むウェルを対照として使用した。
【0187】
二次抗体とインキュベートした後、細胞を洗浄し、１％ろ過ＦＢＳを含む２００μｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＢＤ ＬＳＲ＿Ｆｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリにより分析した。カニクイザルＴ細胞はＣＤ２＋／ＣＤ１６－と同定され、Ｂ細胞はＣＤ２０＋と同定された。ＦＡＣＳ結合のＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
【0188】
表１４は、フローサイトメトリによって決定される、ＣＤ２２を発現する細胞株の表面に対するＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合データを提示する。表１４はまた、フローサイトメトリによって決定される、ヒトＣＤ２８を発現する細胞株の表面に対するＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合データも提示する。
【0189】
ＲＥＧＮ５８３７はＮａｌｍ６細胞と結合した ＥＣ５０値１．３Ｅ－０８Ｍ。ＲＥＧＮ５８３８はＮａｌｍ６細胞と結合した ＥＣ５０値１．８Ｅ－０８Ｍ。アイソタイプ対照抗体はＣＤ２２を発現する細胞株に対する結合を示さなかった。
【0190】
ＲＥＧＮ５８３７はＪｕｒｋａＴ細胞と結合した ＥＣ５０値２．１Ｅ－０８Ｍ。ＲＥＧＮ５８３８はＪｕｒｋａＴ細胞と結合した ＥＣ５０値２．３Ｅ－０８Ｍ。アイソタイプ対照抗体はＣＤ２８を発現する細胞株に対する結合を示さなかった。
【0191】
表１５は、フローサイトメトリによって決定される、カニクイザル（Ｃａｍｂｏｄｉａｎ起源）Ｔ及びＢ細胞の表面に対するＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合データを提示する。
【0192】
ＲＥＧＮ５８３７は、試験した１２匹のカニクイザルのうち１２匹のＢ細胞と、１２匹のうち１１匹のＴ細胞と結合した。ＣＤ２０＋Ｂ細胞に対する結合は、二次細胞の１２．６～３０．３倍の範囲であり、メジアンは１５．７倍であった。ＣＤ２＋／ＣＤ１６－Ｔ細胞に対する結合は二次細胞の１．２～５．２倍であり、メジアンは３．５倍であった。正の結合は二次細胞の１．２倍超として定義された。ＲＥＧＮ５８３８は、試験した１２匹のカニクイザルのうち１２匹のＢ細胞と、１２匹のうち１１匹のＴ細胞と結合した。ＣＤ２０＋Ｂ細胞に対する結合は、二次細胞の６．５～１３．５倍の範囲であり、メジアンは９．３倍であった。ＣＤ２＋／ＣＤ１６－Ｔ細胞に対する結合は二次細胞の１．２～４．７倍であり、メジアンは３．８倍であった。正の結合は二次細胞の１．２倍超として定義された。アイソタイプ対照抗体はカニクイザルＴ又はＢ細胞に対して結合を示さなかった。
表１４：組換え標的及びエフェクタ細胞に対するフローサイトメトリ実験の結合及び結合倍数結果
表１５：カニクイザル（Ｃａｍｂｏｄｉａｎ起源）Ｔ及びＢ細胞に対するフローサイトメトリ実験の結合倍数結果。
表１４：組換え標的及びエフェクタ細胞に対するフローサイトメトリ実験の結合及び結合倍数結果
【表14】
【表15-1】
【表15-2】
【0193】
実施例７ フローサイトメトリを使用した、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び組換え標的細胞に対する抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合特異性
フローサイトメトリ分析を使用して、ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５８３７；ＲＥＧＮ５８３８）及び対照抗体のヒトＣＤ２８を発現するエフェクタ細胞（ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞）及びヒトＣＤ２２を発現する標的細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２及びＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性Ｂ－細胞）に対する結合を調査した。ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞は、ＣＤ２８及びＣＤ２２の陰性細胞株として含まれていた。
フローサイトメトリ分析を使用して、ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５８３７；ＲＥＧＮ５８３８）及び対照抗体のヒトＣＤ２８を発現するエフェクタ細胞（ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞）及びヒトＣＤ２２を発現する標的細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２及びＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性Ｂ－細胞）に対する結合を調査した。ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞は、ＣＤ２８及びＣＤ２２の陰性細胞株として含まれていた。
【0194】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、健常ドナー白血球パックから得られたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された。ＰＢＭＣ単離は、５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを製造業者の推奨するプロトコルにしたがって使用する密度勾配遠心分離法により実施した。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに積層し、続いてＤ－ＰＢＳ＋２％のＦＢＳで１：２に希釈した３０ｍＬの白血球を添加した。その後のステップは、ＳｅｐＭａｔｅ製造業者のプロトコルにしたがって実施した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を続いて、製造業者の指示に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのヒトＣＤ４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄキットを使用してＰＢＭＣから単離した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、バイアルあたり５×１０６細胞の濃度で１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。
【0195】
ＨＥＫ２９３細胞株及びヒトＲａｊｉ Ｂ細胞を含む標的細胞は以下のようにして調製した。
【0196】
ヒトＣＤ２０（受入番号ＮＰ＿０６８７６９．２のアミノ酸Ｍ１～Ｐ２９７）を発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１５７３）にヒトＣＤ２２（受入番号ＮＰ＿００１７６２．２のアミノ酸Ｍ１～Ａ８４７）を形質導入した。ヒトＣＤ２２陽性細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離し、単一クローン化した。結果として得られるクローン細胞株（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２クローンＥ４）を、５００ｇ／ｍＬのＧ４１８を追加したＤＭＥＭ＋１０％＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。
【0197】
細胞表面上にＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、ＣＤ８０及びＣＤ８６を内因的に発現するヒトＲａｊｉ Ｂ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－８６）は、ＣＲＩＰＳＲ技術を使用してＣＤ８０及びＣＤ８６を欠失させることによって遺伝子組み換えた。ＣＤ８０及びＣＤ８６はＣＤ２８の公知リガンドである。操作されたＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞を、ＨＥＰＥＳ及びピルビン酸ナトリウムを追加したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミン中で維持した。
【0198】
細胞を以下のようにして染色した。
【0199】
簡単に説明すると、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２及びＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞を、Ｄ－ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを含む染色緩衝液中に再懸濁させた。Ｒａｊｉ細胞をマウスＩｇＧ（最終６２５ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートして、内在性ＦｃΓ受容体をブロックした）。簡単に説明すると、９６ウェルプレート中、２×１０５細胞／ウェルを、３０～６０分間４℃にて６．１ｐＭ～１００ｎＭの範囲の抗体の段階希釈でインキュベートした。抗体を含まない陰性対照サンプルが含まれていた。細胞を冷染色緩衝液で一回洗浄し、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗ヒト二次抗体と３０～４５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＦＢＳを含まない冷Ｄ－ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と製造業者の指示に従ってインキュベートして、生細胞と死細胞とを区別した。次に、細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ中で製造業者の指示に従って固定し、洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメータでフローサイトメトリによって分析した。ＥＣ５０決定のために、幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して９ポイント応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式を使用して分析した。以下の式を使用して結合倍数を算出した：
結合倍数＝試験した用量範囲内の最大幾何ＭＦＩ値
バックグラウンドの幾何ＭＦＩ値［０ｎＭ］
結合倍数＝試験した用量範囲内の最大幾何ＭＦＩ値
バックグラウンドの幾何ＭＦＩ値［０ｎＭ］
【0200】
ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体がヒトＣＤ２２及びＣＤ２８と結合する能力をＣＤ２２（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２）を又は内因的に（Ｒａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性）を過剰発現する一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び操作細胞に関してフローサイトメトリにより評価した。陰性細胞株が対照として含まれていた（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０）。
【0201】
ＥＣ５０／倍数結合値を図１及び表１６にまとめる。
表１６：ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び操作標的細胞に関するフローサイトメトリ実験のＥＣ５０及び倍数結合結果：
略号：ＮＣ＝計算可能でない（結合が飽和に達しなかった曲線について表示）；ＮＤ＝測定せず
表１６ ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び操作細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性Ｂ細胞に対する抗体のＥＣ５０及び倍数結合値の表。
表１６：ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び操作標的細胞に関するフローサイトメトリ実験のＥＣ５０及び倍数結合結果：
【表16】
表１６ ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び操作細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性Ｂ細胞に対する抗体のＥＣ５０及び倍数結合値の表。
【0202】
予想通り、ＣＤ２８抗体、親（ＲＥＧＮ５７０５；ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列番号３５／３６）又はその二重特異性フォーマット（ＲＥＧＮ５８３７、ＲＥＧＮ５８３８及び１アームＣＤ２８対照（配列番号４８）のいずれも陰性ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞に結合しなかった。非特異的結合のためにアイソタイプ対照抗体で最高濃度にて約１．８ｘの弱い結合が検出された（図１及び表１６）。
【0203】
抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８抗体の結合は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、（ＲＥＧＮ５８３７については１６．４４ｘ、ＲＥＧＮ５８３８については３４．９ｘ、ＥＣ５０は約１１．４ｎＭ）並びにＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞（ＲＥＧＮ５８３７については３８．３５ｘ、ＥＣ５０約９．７６ｎＭ、ＲＥＧＮ５８３８については８１．７４ｘ、ＥＣ５０約１４．９ｎＭ）で観察された。１アームＣＤ２８及びアイソタイプ対照では有意な結合は検出されなかった（図１及び表１６）。
【0204】
ヒトＣＤ２８を標的とする抗体の結合が一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞で検出された。親ＣＤ２８抗体であるＲＥＧＮ５７０５はバックグラウンドを越えて約４．１３ｎＭのＥＣ５０で３７．４８ｘと結合し、一方、二重特異性抗体であるＲＥＧＮ５８３７、ＲＥＧＮ５８３８及び１アーム対照は、それぞれ、９．２５ｘ、１０．６３ｘ及び１０．９７ｘの結合を示した。予想通り、アイソタイプ対照は細胞と結合しなかった（図１及び表１６）。
実施例８ 抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体共刺激は、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体による標的化細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン放出を増強する
実施例８ 抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体共刺激は、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体による標的化細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン放出を増強する
【0205】
ＣＤ２０ｘＣＤ３標的化殺滅のＣＤ２２ｘＣＤ２８増強を、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現が欠失するように操作されたＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－８０／８６ＤＫＯ）を標的とする９６時間細胞傷害性アッセイで評価した。簡単に説明すると、ヒトＰＢＭＣを補充ＲＰＭＩ培地中に１×１０６細胞／ｍＬで蒔き、３７℃で一晩インキュベートして、付着したマクロファージ、樹状細胞、及び一部の単球を除去することによって、リンパ球について濃縮した。翌日、Ｒａｊｉ－８０／８６ＤＫＯ細胞を１ｕＭの蛍光追跡色素ＣＦＤＡ－ＳＥで標識し、付着細胞枯渇ナイーブＰＢＭＣを１ｕＭの蛍光追跡色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。標識した標的細胞及びＰＢＭＣ（エフェクタ／標的細胞１０：１比）を、配列番号４２から構成される一方の重鎖アームと、配列番号４３から構成される他方の重鎖アームと、配列番号４４の軽鎖とを有する、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体、ＲＥＧＮ１９７９の段階希釈（濃度範囲：５ｎＭ～０．６４ｐＭ）及び固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８共刺激分子ＲＥＧＮ５８３７又はＲＥＧＮ５８３８、１アーム対照ＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５６７８）、又は２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）のＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照（Ｈ４ｓＨ１０１５４Ｐ３、配列番号３７／３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有するアイソタイプ対照）と、９６時間３７℃で同時インキュベートした。細胞をプレートから収集し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でのＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆａｒ Ｒｅｄ反応性（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素で染色した。２０，０００個のカウンティングビーズをＦＡＣＳ分析の直前に各ウェルに添加し、サンプルごとに１０，０００個のビーズを集めた。殺滅の特異性を評価するために、細胞を生ＣＦＤＡ－ＳＥ標識集団で細胞をゲートした。生集団のパーセントを記録し、生存率の計算に使用した。
【0206】
Ｔ細胞活性化は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５と直接コンジュゲートした抗体と細胞をインキュベートすることによって評価した。ＣＤ２５を発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージをＴ細胞活性化の尺度として報告した。さらに、Ｔ細胞が増殖するにつれて、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔが希釈され、ＦＡＣＳによって測定されるＭＦＩが低下する。したがって、Ｔ細胞増殖は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔのＭＦＩにおける減少として報告された。ＣＤ８０及びＣＤ８６発現及び結合を欠いた標的Ｒａｊｉ細胞のＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメータ非線形回帰分析を用いて計算した。
【0207】
このアッセイからの上清をサイトカインレベルの分析のために集めた。ＩＬ１７ａ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４、及びＩＬ－２の濃度は、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キットを製造業者の指示にしたがって使用して分析した。サイトカインレベルは、キット標準によって作成した曲線から内挿し、ｐｇ／ｍＬとして報告した。最大サイトカインレベルは、Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
【0208】
抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９（上記参照）が非刺激ヒトＴ細胞に、共刺激ＣＤ２２ｘＣＤ２８抗体又は１アームＣＤ２８又はアイソタイプ対照抗体と組み合わせてヒトＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する標的細胞を殺滅させる能力を評価するアッセイの結果を試験した。
【0209】
ＲＥＧＮ１９７９は、ヒトＴ細胞を活性化して、ＣＤ８０及びＣＤ８６発現を欠いたＲａｊｉ細胞を用量依存的に枯渇させた。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、１アームＣＤ２８又はアイソタイプ対照抗体を伴うＲＥＧＮ１９７９と比較した場合、ＲＥＧＮ１９７９の細胞傷害効力（ＥＣ５０）が３．５～６．４倍増強された（表１７）．
【0210】
観察される、ＲＥＧＮ１９７９により媒介される標的細胞溶解は、それぞれ、ＣＤ８＋細胞に関するＣＤ２５上方調節又はＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって測定されるように、Ｔ細胞活性化及び増殖と関連していた。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、ＲＥＧＮ１９７９誘導性Ｔ細胞活性化及び増殖の可能性が、１アームＣＤ２８又はアイソタイプ対照抗体を伴うＲＥＧＮ１９７９と比較した場合に、それぞれ２．１～２．６倍及び７．４～８．４倍増強された（表１７）。
【0211】
ＲＥＧＮ１９７９はヒトサイトカインの放出を誘導した。ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体とＲＥＧＮ１９７９で観察される、放出されたサイトカインは、固定濃度の１アームＣＤ２８又はアイソタイプ対照抗体を伴う固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８共刺激分子との存在下で増強された（表１８）。
【0212】
まとめると、共刺激により、対照抗体と組み合わせたＣＤ２０ｘＣＤ３で観察されたものと比較して、標的化細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン放出の可能性が増大した。
表１７：細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値（３回の実験の平均）
表１８：サイトカイン放出（ｐｇ／ｍＬ）
表１７：細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値（３回の実験の平均）
【表17-1】
【表17-2】
【表18】
【0213】
実施例９：ＣＤ２２二重特異性抗体のバイオアッセイ
Ｔ細胞活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で腫瘍組織適合複合体クラスＩ又はＩＩ（ＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩ）タンパク質によって提示される特定のペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激することによって達成される（Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９９）。活性化されたＴＣＲは、次に、シグナリング事象のカスケードを開始し、これは、様々な転写因子、例えば、アクチベータ－タンパク質１（ＡＰ－１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）又は活性化Ｂ細胞の核因子κ－軽鎖エンハンサ（ＮＦκＢ）によってモニタリングすることができる。Ｔ細胞応答はその後、Ｔ細胞上で構成的又は誘導的に発現される共受容体、例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラムされた細胞死タンパク質１）、ＬＡＧ－３（リンパ球－活性化遺伝子３）又は他の分子の関与によりさらに精緻化される（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。共刺激分子であるＣＤ２８は、その内在性リガンドである、ＡＰＣ上に発現されたＣＤ８０又はＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８は、ＴＣＲ活性化後にＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナルは、Ｔ細胞分化、増殖、サイトカイン放出及び細胞死などの有効なＴ細胞活性化に重要である（Ｓｍｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）。
Ｔ細胞活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で腫瘍組織適合複合体クラスＩ又はＩＩ（ＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩ）タンパク質によって提示される特定のペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激することによって達成される（Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９９）。活性化されたＴＣＲは、次に、シグナリング事象のカスケードを開始し、これは、様々な転写因子、例えば、アクチベータ－タンパク質１（ＡＰ－１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）又は活性化Ｂ細胞の核因子κ－軽鎖エンハンサ（ＮＦκＢ）によってモニタリングすることができる。Ｔ細胞応答はその後、Ｔ細胞上で構成的又は誘導的に発現される共受容体、例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラムされた細胞死タンパク質１）、ＬＡＧ－３（リンパ球－活性化遺伝子３）又は他の分子の関与によりさらに精緻化される（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。共刺激分子であるＣＤ２８は、その内在性リガンドである、ＡＰＣ上に発現されたＣＤ８０又はＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８は、ＴＣＲ活性化後にＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナルは、Ｔ細胞分化、増殖、サイトカイン放出及び細胞死などの有効なＴ細胞活性化に重要である（Ｓｍｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）。
【0214】
抗ＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体を、ルシフェラーゼベースのレポータバイオアッセイ及び一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたＩＬ－２機能的アッセイで特徴づけた。
【0215】
ルシフェラーゼベースのレポータアッセイ：
Ｔ細胞／ＡＰＣ（抗原提示細胞）ルシフェラーゼベースのレポータアッセイは、抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体の関与によるＮＦκＢ活性に対するＣＤ２８活性化の効果を評価するために開発された。
Ｔ細胞／ＡＰＣ（抗原提示細胞）ルシフェラーゼベースのレポータアッセイは、抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体の関与によるＮＦκＢ活性に対するＣＤ２８活性化の効果を評価するために開発された。
【0216】
レポータＴ細胞の操作：
クローナルレポータＴ細胞株は、不死ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ－１５２）にＮＦκＢ－ルシフェラーゼ（ＮＦκＢ－Ｌｕｃ）レンチウイルスレポータ（Ｑｉａｇｅｎ製）を製造業者の指示どおりに形質導入することによって操作した。クローナルレポータ株（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢ－Ｌｕｃクローン１Ｃ１１）を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを追加したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミン中で維持した。
クローナルレポータＴ細胞株は、不死ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ－１５２）にＮＦκＢ－ルシフェラーゼ（ＮＦκＢ－Ｌｕｃ）レンチウイルスレポータ（Ｑｉａｇｅｎ製）を製造業者の指示どおりに形質導入することによって操作した。クローナルレポータ株（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢ－Ｌｕｃクローン１Ｃ１１）を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを追加したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミン中で維持した。
【0217】
ＡＰＣの操作：
ヒトＣＤ２０（受入番号ＮＰ＿０６８７６９．２のアミノ酸Ｍ１～Ｐ２９７）を発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１５７３）にヒトＣＤ２２（受入番号ＮＰ＿００１７６２．２のアミノ酸Ｍ１～Ａ８４７）を形質導入した。ヒトＣＤ２２陽性細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離し、単一クローン化した。結果として得られるクローン細胞株（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２クローンＥ４）を、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を追加したＤＭＥＭ＋１０％＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。
ヒトＣＤ２０（受入番号ＮＰ＿０６８７６９．２のアミノ酸Ｍ１～Ｐ２９７）を発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１５７３）にヒトＣＤ２２（受入番号ＮＰ＿００１７６２．２のアミノ酸Ｍ１～Ａ８４７）を形質導入した。ヒトＣＤ２２陽性細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離し、単一クローン化した。結果として得られるクローン細胞株（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２クローンＥ４）を、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を追加したＤＭＥＭ＋１０％＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮＥＡＡ中で維持した。
【0218】
細胞表面上にＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、ＣＤ８０及びＣＤ８６を内因的に発現するヒトＲａｊｉ Ｂ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－８６）は、ＣＲＩＰＳＲ技術を使用してＣＤ８０及びＣＤ８６を欠失させることによって遺伝子組み換えた。ＣＤ８０及びＣＤ８６はＣＤ２８の公知リガンドである。操作されたＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞を、ＨＥＰＥＳ及びピルビン酸ナトリウムを追加したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミン中で維持した。
【0219】
Ｔ細胞／ＡＰＣ刺激：
この実験では、操作されたレポータＴ細胞を二つの二重特異性抗体によって刺激した。第一刺激は、二重特異性抗体ＲＥＧＮ２２８１である、配列番号３９で構成される一本の重鎖アームと、配列番号４０で構成される一本の重鎖アームと、配列番号４１の軽鎖アームとを有する抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３抗体）を活性化するＴ細胞によって送達され、操作されたレポータＴ細胞上のＣＤ３分子と、ＨＥＫ２９３上又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性Ｂ細胞上のＣＤ２０とを標的とする。第一刺激は、ＭＨＣ分子上に提示された特異的ペプチドであるそれらのリガンドによりＴＣＲの活性化の必要性を回避する。第二刺激は、ＣＤ２８二重特異性抗体（すなわち、抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体）によって駆動される。この抗体は、ＡＰＣ上で発現されるそのリガンドであるＣＤ８０／ＣＤ８６によるＴ細胞のＣＤ２８活性化を模倣する。これは、Ｔ細胞上のＣＤ２８及びＨＥＫ２９３細胞上又はＲａｊｉ／ＣＤ８０上及びＣＤ８６陰性Ｂ－細胞上のＣＤ２２と相互作用し、操作されたレポータＴ細胞上のＣＤ２８の活性化を駆動する。ＴＣＲ及びＣＤ２８同時活性化は、ＮＦκＢの転写活性の増強に至り、これによりレポータ遺伝子、ルシフェラーゼの産生が増大する。
この実験では、操作されたレポータＴ細胞を二つの二重特異性抗体によって刺激した。第一刺激は、二重特異性抗体ＲＥＧＮ２２８１である、配列番号３９で構成される一本の重鎖アームと、配列番号４０で構成される一本の重鎖アームと、配列番号４１の軽鎖アームとを有する抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３抗体）を活性化するＴ細胞によって送達され、操作されたレポータＴ細胞上のＣＤ３分子と、ＨＥＫ２９３上又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性Ｂ細胞上のＣＤ２０とを標的とする。第一刺激は、ＭＨＣ分子上に提示された特異的ペプチドであるそれらのリガンドによりＴＣＲの活性化の必要性を回避する。第二刺激は、ＣＤ２８二重特異性抗体（すなわち、抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体）によって駆動される。この抗体は、ＡＰＣ上で発現されるそのリガンドであるＣＤ８０／ＣＤ８６によるＴ細胞のＣＤ２８活性化を模倣する。これは、Ｔ細胞上のＣＤ２８及びＨＥＫ２９３細胞上又はＲａｊｉ／ＣＤ８０上及びＣＤ８６陰性Ｂ－細胞上のＣＤ２２と相互作用し、操作されたレポータＴ細胞上のＣＤ２８の活性化を駆動する。ＴＣＲ及びＣＤ２８同時活性化は、ＮＦκＢの転写活性の増強に至り、これによりレポータ遺伝子、ルシフェラーゼの産生が増大する。
【0220】
ルシフェラーゼアッセイのセットアップ：
１０％ＦＢＳ及びＰ／Ｓ／Ｇを追加したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用して、抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体のスクリーニング用の細胞懸濁液及び抗体希釈液を調製した。
１０％ＦＢＳ及びＰ／Ｓ／Ｇを追加したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用して、抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体のスクリーニング用の細胞懸濁液及び抗体希釈液を調製した。
【0221】
スクリーニングの一日前に、操作されたレポータＴ細胞を細胞培養培地中で０．５×１０６細胞／ｍＬに培養した。１：３に段階希釈された抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体及び対照を一定の２００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３、上記参照）又はＲＥＧＮ１９４５（配列番号４５／４６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有するｈＩｇＧ４アイソタイプ対照）の存在下で試験した。１０点希釈は１５ｐＭ～１００ｎＭの範囲であり、最終希釈液はＣＤ２８抗体を含まない。
【0222】
試薬を以下の順序で添加した：１）固定濃度の最終２００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３、上記参照）又はＲＥＧＮ１９４５（ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照、上記参照）を９６ウェル白色平底プレートの各ウェルに添加した；２）４×１０５細胞／ｍＬ（最終細胞濃度１×１０４細胞／ウェル）に再懸濁させたＨＥＫ２９３細胞又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及び２×１０６細胞／ｍＬ（最終細胞濃度５×１０４細胞／ウェル）に再懸濁させたＣＤ８６陰性Ｂ細胞を対応するプレートに添加した；３）段階希釈された抗体を対応するウェルに添加した；４）一晩培養したレポータＴ細胞を２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、最終濃度５×１０４細胞／ウェルでプレートに添加した。プレートを４～６時間３７℃／５％ＣＯ２にてインキュベートした後、１００μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ(商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を添加して、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を検出した。放射された光をマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、相対光単位（ＲＬＵ）で捕捉した。すべての段階希釈は二連で試験した。
テストされた。
テストされた。
【0223】
抗体のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して１０点用量応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式にデータを適合させることによって決定した。誘導倍数は次式を用いて算出した：
【数3】
【0224】
一次ヒトＣＤ４
＋
Ｔ細胞を用いたＩＬ－２機能的アッセイ：
一次ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＡＰＣ機能的アッセイは、抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体との関与によるＩＬ－２産生に対するＣＤ２８活性化の効果を評価するために開発された。
一次ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＡＰＣ機能的アッセイは、抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体との関与によるＩＬ－２産生に対するＣＤ２８活性化の効果を評価するために開発された。
【0225】
ヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞単離：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は健常ドナー白血球パックから単離した。ＰＢＭＣ単離は、製造業者推奨のプロトコルに従って５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを使用した密度勾配遠心分離法により達成された。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに積層し、続いてＤ－ＰＢＳ＋２％のＦＢＳで１：２に希釈した３０ｍＬの白血球を添加した。その後のステップは、ＳｅｐＭａｔｅ製造業者のプロトコルにしたがって実施した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を続いて、製造業者の指示に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのヒトＣＤ４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄキットを使用してＰＢＭＣから単離した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、バイアルあたり５×１０６細胞の濃度で１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は健常ドナー白血球パックから単離した。ＰＢＭＣ単離は、製造業者推奨のプロトコルに従って５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを使用した密度勾配遠心分離法により達成された。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに積層し、続いてＤ－ＰＢＳ＋２％のＦＢＳで１：２に希釈した３０ｍＬの白血球を添加した。その後のステップは、ＳｅｐＭａｔｅ製造業者のプロトコルにしたがって実施した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を続いて、製造業者の指示に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのヒトＣＤ４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄキットを使用してＰＢＭＣから単離した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、バイアルあたり５×１０６細胞の濃度で１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。
【0226】
ＣＤ２８抗体で処理した一次ＣＤ４
＋
Ｔ細胞からのＩＬ－２放出：
このアッセイにおいて、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ２０を発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞又は内在性ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞のいずれかと組み合わせた抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＲＥＧＮ２２８１、上記参照）を使用して、それらの表面上のＣＤ３の架橋により活性化され、ここで、ＣＤ８０及びＣＤ８６はＣＲＩＳＰＲ技術を用いてサイレンシングされている（Ｒａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞）。ＲＥＧＮ２２８１のＣＤ２０アームをＣＤ２０発現細胞に結合させることで、ＣＤ３受容体のクラスタ化が駆動され、Ｔ細胞刺激に必要な第一シグナルが提供される。重要なことに、場合によっては、一次白血球を遺伝的に異なる細胞と同時培養することで、同種異系の決定因子が不適合となり、結果としてＴ細胞が活性化される可能性がある。これにより、抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体を外因的に添加することなく充分な一次刺激を提供することができる。一次刺激にかかわらず、定量可能なＩＬ－２放出を検出するために、ＣＤ２８分子を架橋することによって提供できる共刺激が必要である。ここで、二重特異性ＣＤ２８抗体（すなわち、抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体）はＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８並びにＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０又はＲＡＪＩ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞上のＣＤ２２と相互作用し、ＣＤ２８のクラスタ化－活性化を駆動する。組み合わせたＴＣＲ及びＣＤ２８の関与により、ＩＬ－２産生が増強され、細胞培養培地中に放出される。ＩＬ－２は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製の均質な無洗ＡｌｐｈａＬｉｓａキットを用いて細胞上清から検出し定量される。
このアッセイにおいて、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ２０を発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞又は内在性ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞のいずれかと組み合わせた抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＲＥＧＮ２２８１、上記参照）を使用して、それらの表面上のＣＤ３の架橋により活性化され、ここで、ＣＤ８０及びＣＤ８６はＣＲＩＳＰＲ技術を用いてサイレンシングされている（Ｒａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞）。ＲＥＧＮ２２８１のＣＤ２０アームをＣＤ２０発現細胞に結合させることで、ＣＤ３受容体のクラスタ化が駆動され、Ｔ細胞刺激に必要な第一シグナルが提供される。重要なことに、場合によっては、一次白血球を遺伝的に異なる細胞と同時培養することで、同種異系の決定因子が不適合となり、結果としてＴ細胞が活性化される可能性がある。これにより、抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体を外因的に添加することなく充分な一次刺激を提供することができる。一次刺激にかかわらず、定量可能なＩＬ－２放出を検出するために、ＣＤ２８分子を架橋することによって提供できる共刺激が必要である。ここで、二重特異性ＣＤ２８抗体（すなわち、抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性抗体）はＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８並びにＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０又はＲＡＪＩ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞上のＣＤ２２と相互作用し、ＣＤ２８のクラスタ化－活性化を駆動する。組み合わせたＴＣＲ及びＣＤ２８の関与により、ＩＬ－２産生が増強され、細胞培養培地中に放出される。ＩＬ－２は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製の均質な無洗ＡｌｐｈａＬｉｓａキットを用いて細胞上清から検出し定量される。
【0227】
事前に単離され凍結されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）中でアッセイ当日に解凍した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、刺激培地中に再懸濁させ、９６ウェル丸底プレート中に１×１０５細胞／ウェルの濃度で蒔いた。ヒトＣＤ２０を単独又はヒトＣＤ２２と組み合わせて発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞を一次刺激培地中１０×１０６細胞／ｍＬの濃度にて１５μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで処理した。Ｒａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞を一次刺激培地中１０×１０６細胞／ｍＬの濃度にて２０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで処理した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３及びＲａｊｉ細胞を、２％ＦＢＳを含むＤ－ＰＢＳで３回洗浄し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むウェルに１×１０４細胞／ウェルのＨＥＫ２９３細胞又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞については５×１０４細胞／ウェルの最終濃度で添加した。その後、１５ｐＭ～１００ｎＭの範囲の１：３に段階希釈された抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ２２二重特異性又は対照抗体を２ｎＭ ＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）又はＲＥＧＮ１９４５（陰性ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照、上記参照）の存在下でウェルに添加した。最終時点の１０点希釈液はＣＤ２８抗体を含んでいなかった。プレートを７２時間３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした後、遠心分離して、細胞をペレット化し、４０μＬの培地上清を集めた。これから、５μＬをヒトＩＬ－２ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて製造業者のプロトコルにしたがって試験した。測定は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで取得し、生ＲＦＵ（相対蛍光単位）値をプロットした。すべての段階希釈は二連で試験した。
【0228】
抗体のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して１０点用量応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式にデータを適合させることによって決定した。誘導倍数は次式を用いて算出した：
結果のまとめと結論：
ルシフェラーゼベースのレポータアッセイ：
【数4】
ルシフェラーゼベースのレポータアッセイ：
【0229】
ＣＤ２２標的発現の非存在下又は存在下でＴ細胞上のＣＤ２８を介して共刺激を提供する抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の能力は、ルシフェラーゼ活性を読み出しとして使用するレポータ細胞ベースのバイオアッセイで評価した。
【0230】
一定の２００ｐＭ ＲＥＧＮ１９４５（ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照）又はＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）に加えてＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０又はＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２細胞と同時インキュベートした操作されたレポータＴ細胞について、活性化曲線を図２（Ａ及びＢ）に示し、ＥＣ５０及び誘導倍数値を表１９及び２０にまとめる。
【0231】
レポータＴ細胞及びＨＥＫ２９３由来ＡＰＣを２００ｐＭのＲＥＧＮ１９４５で処理した場合、アッセイで使用したＨＥＫ２９３株に関係なく、ＣＤ２８二重特異性抗体のいずれもＴＣＲ刺激の非存在下でルシフェラーゼ活性において増加を示さなかった。ルシフェラーゼ活性化の増加は、親ＣＤ２８抗体（ＲＥＧＮ５７０５）とＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞（２．１８ｘ）及びＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２細胞（２．０５ｘ）でのみ観察された。１アームＣＤ２８及びアイソタイプ対照抗体はこの設定でルシフェラーゼ応答を起こさなかった（表１９及び図２）。
【0232】
レポータＴ細胞及びＨＥＫ２９３由来ＡＰＣを２００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１で処理した場合、両方の抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体（ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ５８３８）は、ＥＣ５０及び誘導倍数値の増加で示される、ＣＤ２２発現ＨＥＫ２９３細胞での強いルシフェラーゼ活性を誘導した。１アームＣＤ２８対照抗体及び親ＣＤ２８抗体（ＲＥＧＮ５７０５；ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列番号３５／３６を参照）は、両ＨＥＫ２９３株に対して類似した活性を示した。アイソタイプ対照抗体はこの設定でルシフェラーゼ応答を起こさなかった（表２０及び図２）。
【0233】
レポータＴ細胞及びＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性を２００ｐＭのＲＥＧＮ１９４５で処理した場合、両方の抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体（ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ５８３８）並びに親ＣＤ２８抗体はルシフェラーゼ活性を誘導し、その一方で、１アームＣＤ２８対照抗体及びアイソタイプ対照は活性を示さなかった（表１９及び図２）。
【0234】
レポータＴ細胞及びＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性を２００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１で処理した場合、親ＣＤ２８抗体を含むすべてのＣＤ２８二重特異性抗体（ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ５８３８）並びに１アームＣＤ２８対照抗体はルシフェラーゼ活性を誘導した。抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８及び親ＣＤ２８抗体についてのみＥＣ５０値を決定することができ、飽和レベルに達しなかったため、１アームＣＤ２８対照については決定できなかった。アイソタイプ対照で活性化は検出されなかった（表２０及び図２）。
一次ヒトＣＤ４ ＋ Ｔ細胞を用いたＩＬ－２機能的アッセイ：
一次ヒトＣＤ４ ＋ Ｔ細胞を用いたＩＬ－２機能的アッセイ：
【0235】
抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＣＤ２２標的発現の非存在下又は存在下でＴ細胞上のＣＤ２８を介して共刺激を提供する能力を、ＩＬ－２サイトカイン産生を測定する機能的一次ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイで評価した。
【0236】
活性化曲線を図３（Ａ及びＢ）に示し、ＥＣ５０及び誘導倍数値は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、又はＲａｊｉ／ＣＤ８０ 及びＣＤ８６陰性細胞と、一定の２ｎＭ ＲＥＧＮ１９４５（ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照）又はＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）いずれかの存在下で同時インキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞について表２１にまとめる。
【0237】
ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０又はＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ＣＤ２２細胞と一定量のＲＥＧＮ１９４５を含むウェルでは、充分な同種異系の一次Ｔ細胞刺激が存在しないため、測定可能なＩＬ－２放出は観察されなかった（図３）。しかしながら、Ｒａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞と一定量のＲＥＧＮ１９４５を含むウェルでは、抗体媒介性ＣＤ３クラスタ化がない場合でも、充分な一次刺激を提供する有意な同種異形応答のために、ＩＬ－２放出が検出された（図３及び表２１）。
【0238】
一定の２ｎＭ濃度のＲＥＧＮ２２８１及び親ＣＤ２８ｍａｂ（ＲＥＧＮ５７０５、上記参照）を添加した場合、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０又はＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ＣＤ２２細胞を含むサンプルにおいて、測定可能なＩＬ－２レベルが検出された。二価ＣＤ２８ｍＡｂとは対照的に、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞及びＲＥＧＮ２２８１を含むウェルに抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性ｍＡｂを添加した場合、ＩＬ２放出は劇的に増強されなかった。ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ＣＤ２２細胞及びＲＥＧＮ２２８１の存在下でのみ、抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性ｍＡｂはＩＬ－２放出を有意に増強した（図３及び表２２）。
【0239】
表１９～２２を以下に記載する。
【0240】
表１９は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２又はＲＡＪＩ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞並びに一定の２００ｐＭ ＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照）と同時インキュベートした操作されたＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値の表を提示する。
【0241】
表２０は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２又はＲａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞並びに一定の２００ｐＭ ＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）と同時インキュベートした、操作されたＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値の表を提示する。
【0242】
表２１は、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、又はＲＡＪＩ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞並びに一定の２ｎＭ ＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照）と同時インキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値の表を提示する。
【0243】
表２２ ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ２２、Ｒａｊｉ／ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性細胞並びに一定の２ｎＭ ＲＥＧＮ２２８１（抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３）と同時インキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値の表を提示する。
表１９：２００ｐＭ ＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照）でのＴＣＲ刺激の非存在下での操作されたレポータＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値:
略号：ＮＤ＝測定せず
表２０：２００ｐＭ ＲＥＧＮ２２８１（αＣＤ２０ｘαＣＤ３）でのＴＣＲ刺激の存在下での操作されたレポータＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値：
略号：ＮＣ＝計算可能でない（応答が飽和に到達しなかった曲線について表示）；ＮＤ＝測定せず。
表２１：２ｎＭ ＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照）の存在下での一次ヒトＣＤ４＋細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値
略号：ＮＣ＝計算可能でない（応答が飽和に到達しなかった曲線について表示）；ＮＤ＝測定せず。
表２２：２ｎＭ ＲＥＧＮ２２８１（αＣＤ２０ｘαＣＤ３）の存在下での一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値
略号：ＮＣ＝計算可能でない（応答が飽和に到達しなかった曲線について表示）；ＮＤ＝測定せず。
実施例１０：ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作された細胞からのＩＬ－２放出に対する抗ＣＤ２２Ｘ抗ＣＤ２８抗体＋セミプリマブの組み合わせの効果
表１９：２００ｐＭ ＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照）でのＴＣＲ刺激の非存在下での操作されたレポータＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値:
【表19】
表２０：２００ｐＭ ＲＥＧＮ２２８１（αＣＤ２０ｘαＣＤ３）でのＴＣＲ刺激の存在下での操作されたレポータＴ細胞におけるルシフェラーゼ活性のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値：
【表20】
表２１：２ｎＭ ＲＥＧＮ１９４５（アイソタイプ対照）の存在下での一次ヒトＣＤ４＋細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値
【表21】
表２２：２ｎＭ ＲＥＧＮ２２８１（αＣＤ２０ｘαＣＤ３）の存在下での一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値、最大値及び誘導倍数値
【表22】
実施例１０：ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作された細胞からのＩＬ－２放出に対する抗ＣＤ２２Ｘ抗ＣＤ２８抗体＋セミプリマブの組み合わせの効果
【0244】
材料及び方法
ＡＰＣの操作：
ＲＡＪＩ細胞
ＲＡＪＩは、（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８６（商標））の１１歳の男性から単離されたＢリンパ球細胞株である。ＲＡＪＩをＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮａＰｙｒ＋ＨＥＰＥＳ中で維持する。
ＡＰＣの操作：
ＲＡＪＩ細胞
ＲＡＪＩは、（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８６（商標））の１１歳の男性から単離されたＢリンパ球細胞株である。ＲＡＪＩをＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋ＮａＰｙｒ＋ＨＥＰＥＳ中で維持する。
【0245】
ＲＡＪＩ ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性
ＲＡＪＩ細胞におけるＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて排除した。
ＲＡＪＩ細胞におけるＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて排除した。
【0246】
ＮＡＬＭ６クローンＧ５
ＮＡＬＭ６クローンは、［ＮＡＬＭ６クローンＧ５（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－３２７３）］の１９歳の男性から単離された急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株である。ＮＡＬＭ６細胞をＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ中で維持する。
ＮＡＬＭ６クローンは、［ＮＡＬＭ６クローンＧ５（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－３２７３）］の１９歳の男性から単離された急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株である。ＮＡＬＭ６細胞をＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ中で維持する。
【0247】
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２は、４１歳の白色人種男性の胸水から単離されたヒトＤＬＢＣＬ細胞株である（Ｌｅｉｂｎｉｔｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ＤＳＭＺ、Ｃａｔ．＃ＡＣＣ５７５）。
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２は、４１歳の白色人種男性の胸水から単離されたヒトＤＬＢＣＬ細胞株である（Ｌｅｉｂｎｉｔｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ＤＳＭＺ、Ｃａｔ．＃ＡＣＣ５７５）。
【0248】
ＰＤ－Ｌ１操作細胞株
ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性（ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－）、並びにＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞株は、ヒトＰＤ－Ｌ１（受入番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸Ｍ１－Ｔ２９０）を安定して発現するように遺伝子操作した。得られた細胞株ＮＡＬＭ６／ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－／ＰＤ－Ｌ１、及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１は、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－については０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン、ＮＡＬＭ－６／ＰＤ－Ｌ１及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１細胞については１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを追加したそれらの各培地中で維持した。
ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ ＣＤ８０及びＣＤ８６陰性（ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－）、並びにＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞株は、ヒトＰＤ－Ｌ１（受入番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸Ｍ１－Ｔ２９０）を安定して発現するように遺伝子操作した。得られた細胞株ＮＡＬＭ６／ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－／ＰＤ－Ｌ１、及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１は、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－については０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン、ＮＡＬＭ－６／ＰＤ－Ｌ１及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１細胞については１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを追加したそれらの各培地中で維持した。
【0249】
Ｔ細胞増殖及びＩＬ－２放出についてのＴ細胞活性化アッセイ
ヒト一次Ｔ細胞及び同種異系のヒトＢ細胞リンパ腫細胞株［ＮＡＬＭ－６、ＮＡＬＭ－６／ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－／ＰＤ－Ｌ１、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１］）を使用し、固定濃度のセミプリマブの存在下で、ＩＬ－２放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。一次白血球を遺伝的に異なる細胞と同時培養することで、同種異系の決定因子が不適合となり、結果としてＴ細胞が活性化される可能性がある。ＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を用いたアッセイについては、Ｔ細胞活性化アッセイは３人のドナーからの濃縮ヒト一次Ｔ細胞を用いて実施し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を利用するアッセイは、１人のドナーからのＴ細胞を使用した。
ヒト一次Ｔ細胞及び同種異系のヒトＢ細胞リンパ腫細胞株［ＮＡＬＭ－６、ＮＡＬＭ－６／ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－／ＰＤ－Ｌ１、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１］）を使用し、固定濃度のセミプリマブの存在下で、ＩＬ－２放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。一次白血球を遺伝的に異なる細胞と同時培養することで、同種異系の決定因子が不適合となり、結果としてＴ細胞が活性化される可能性がある。ＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を用いたアッセイについては、Ｔ細胞活性化アッセイは３人のドナーからの濃縮ヒト一次Ｔ細胞を用いて実施し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を利用するアッセイは、１人のドナーからのＴ細胞を使用した。
【0250】
ＲＥＧＮ５８３７＋ＲＥＧＮ２８１０の併用治療を試験するためにＴ細胞活性化アッセイで使用するＴ細胞の単離。
ＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－細胞を利用する実験のために、ＣＤ３＋Ｔ細胞を３人のドナーのＰＢＭＣ（５５５１０９、５５５１３０、及び５５５１３１）から単離し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用いたアッセイについては１人のドナー（５５５１７５）からのＰＢＭＣを使用した。ドナー５５５１０９に関しては、密度勾配遠心分離法を使用して末梢血からＰＢＭＣを単離した。簡単に説明すると、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍｌのコニカルチューブに添加し、続いて、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１に希釈した３０ｍｌの血液をその上に重ねる。ブレーキをかけずに４００ｘｇで３０分間遠心分離した後、単核細胞層を新しいチューブに移し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで５ｘに希釈し、３００ｘｇで８分間遠心分離する。ドナー５５５１３０、５５５１３１、及び５５５１７５については、ＰＢＭＣは、健常なドナーの末梢血からＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて製造業者のプロトコルにしたがって単離した。単離したＰＢＭＣを、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。ＣＤ３＋Ｔ細胞単離については、ＰＢＭＣの凍結バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）中で希釈した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＥａｓｙＳｅｐ緩衝液中に再懸濁させ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥａｓｙＳｅｐ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用し、製造業者のプロトコルにしたがって単離した。
ＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－細胞を利用する実験のために、ＣＤ３＋Ｔ細胞を３人のドナーのＰＢＭＣ（５５５１０９、５５５１３０、及び５５５１３１）から単離し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用いたアッセイについては１人のドナー（５５５１７５）からのＰＢＭＣを使用した。ドナー５５５１０９に関しては、密度勾配遠心分離法を使用して末梢血からＰＢＭＣを単離した。簡単に説明すると、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍｌのコニカルチューブに添加し、続いて、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１に希釈した３０ｍｌの血液をその上に重ねる。ブレーキをかけずに４００ｘｇで３０分間遠心分離した後、単核細胞層を新しいチューブに移し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで５ｘに希釈し、３００ｘｇで８分間遠心分離する。ドナー５５５１３０、５５５１３１、及び５５５１７５については、ＰＢＭＣは、健常なドナーの末梢血からＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて製造業者のプロトコルにしたがって単離した。単離したＰＢＭＣを、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。ＣＤ３＋Ｔ細胞単離については、ＰＢＭＣの凍結バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）中で希釈した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＥａｓｙＳｅｐ緩衝液中に再懸濁させ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥａｓｙＳｅｐ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用し、製造業者のプロトコルにしたがって単離した。
【0251】
ＣＤ２８抗体で処理した一次ＣＤ３
＋
Ｔ細胞からのＩＬ－２放出：
ヒトＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（＋／－ＰＤ－Ｌ１）を用いたＴ細胞活性化アッセイ
刺激培地（１０％ ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）中に再懸濁させたＣＤ３＋Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレートに１×１０５細胞／ウェルの濃度で蒔いた。ＰＤ－Ｌ１を含むか又は含まない（＋／－ＰＤ－Ｌ１）、ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を、２０μｇ／ｍＬ（ＲＡＪＩ）又は１５μｇ／ｍＬ（ＮＡＬＭ－６及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２）、マイトマイシンＣで処理して、増殖を停止させた。３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、マイトマイシンＣで処理した細胞は、２％ＦＢＳを含むＤ－ＰＢＳで３回洗浄した後、刺激培地中に再懸濁させた。ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を、ＲＡＪＩ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞については２．５×１０４細胞／ウェル、ＮＡＬＭ－６細胞については５×１０４細胞／ウェルの最終濃度でＣＤ３＋Ｔ細胞を含むウェルに添加した。一定濃度のセミプリマブ又は非結合性ＩｇＧ４Ｐ対照（２０ｎＭ）をウェルに添加した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を使用するアッセイでは、一定濃度のベラタセプト（ｈＣＴＬＡ４．ｈＩｇＧ１）又は非結合性ＩｇＧ１対照（５０ｎＭ）をウェルに添加した。その後、ＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体を、ＮＡＬＭ－６（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞については１：４希釈シリーズで３．１ｐＭから２００ｎＭまで、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞については１：６希釈シリーズで０．６ｐＭから１０００ｎＭまで滴定し、ウェルに添加した。１０点濃度曲線の最終点には、ＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体は含まれていなかった。プレートを７２時間（ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１））又は９６時間（ＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１））３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした後、５０μＬの培地上清を集めて、ＩＬ－２放出を測定した。
ヒトＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（＋／－ＰＤ－Ｌ１）を用いたＴ細胞活性化アッセイ
刺激培地（１０％ ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）中に再懸濁させたＣＤ３＋Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレートに１×１０５細胞／ウェルの濃度で蒔いた。ＰＤ－Ｌ１を含むか又は含まない（＋／－ＰＤ－Ｌ１）、ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を、２０μｇ／ｍＬ（ＲＡＪＩ）又は１５μｇ／ｍＬ（ＮＡＬＭ－６及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２）、マイトマイシンＣで処理して、増殖を停止させた。３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、マイトマイシンＣで処理した細胞は、２％ＦＢＳを含むＤ－ＰＢＳで３回洗浄した後、刺激培地中に再懸濁させた。ＮＡＬＭ－６、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－、及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を、ＲＡＪＩ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞については２．５×１０４細胞／ウェル、ＮＡＬＭ－６細胞については５×１０４細胞／ウェルの最終濃度でＣＤ３＋Ｔ細胞を含むウェルに添加した。一定濃度のセミプリマブ又は非結合性ＩｇＧ４Ｐ対照（２０ｎＭ）をウェルに添加した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞を使用するアッセイでは、一定濃度のベラタセプト（ｈＣＴＬＡ４．ｈＩｇＧ１）又は非結合性ＩｇＧ１対照（５０ｎＭ）をウェルに添加した。その後、ＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体を、ＮＡＬＭ－６（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞については１：４希釈シリーズで３．１ｐＭから２００ｎＭまで、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞については１：６希釈シリーズで０．６ｐＭから１０００ｎＭまで滴定し、ウェルに添加した。１０点濃度曲線の最終点には、ＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体は含まれていなかった。プレートを７２時間（ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１））又は９６時間（ＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１））３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした後、５０μＬの培地上清を集めて、ＩＬ－２放出を測定した。
【0252】
ＩＬ－２放出については、５μＬの上清を、ヒトＩＬ－２ＡｌｐｈａＬＩＳＡキットを製造業者のプロトコルにしたがって使用して試験した。ＩＬ－２測定値は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで取得した。既知ＩＬ－２濃度の標準曲線が含まれ、ｐｇ／ｍｌ値を誘導するために使用した。
【0253】
全ての段階希釈をＩＬ－２放出について三連で試験した。抗体のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して１０点用量応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式から求めた。ＩＬ－２放出の最大レベルは、試験した用量範囲内で検出される平均最大応答として与えられる。さらに、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を使用するアッセイについて報告されるデータには、非ＴＡＡｘＣＤ２８抗体の濃度を増加させると観察されるＩＬ－２の減少をとらえるために、１０００ｎＭの滴定抗体の非存在下又は存在下で生成したＩＬ－２が含まれる。
【0254】
結果のまとめと結論
一次ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を使用するＩＬ－２機能的アッセイ：
内因的にＣＤ２２を発現するＢ細胞リンパ球細胞株の存在下でＴ細胞上のＣＤ２８を介して共刺激を提供する抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の能力を、ＩＬ－２サイトカイン産生を測定する機能的一次ＣＤ３＋Ｔ細胞アッセイで評価した。
一次ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を使用するＩＬ－２機能的アッセイ：
内因的にＣＤ２２を発現するＢ細胞リンパ球細胞株の存在下でＴ細胞上のＣＤ２８を介して共刺激を提供する抗ＣＤ２２ｘ抗ＣＤ２８二重特異性抗体の能力を、ＩＬ－２サイトカイン産生を測定する機能的一次ＣＤ３＋Ｔ細胞アッセイで評価した。
【0255】
ＮＡＬＭ－６（＋／－ＰＤ－Ｌ１）（図５Ａ）又はＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）（図５Ｂ）とインキュベートしたＴ細胞の活性化曲線を図５Ａ及び５Ｂに示す。
ＥＣ５０及びＭａｘ ＩＬ－２値は、一定の２０ｎＭ ｈＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照又はセミプリマブのいずれかの存在下で、ＮＡＬＭ－６（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞とインキュベートしたＣＤ３＋Ｔ細胞については表２３Ａに、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）とインキュベートしたＣＤ３＋Ｔ細胞については表２３Ｂにまとめる。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞とインキュベートしたＣＤ３＋Ｔ細胞について、活性化曲線を図４に示す。一定の２０ｎＭ ｈＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照又はセミプリマブのいずれかの存在下、及び一定の５０ｎＭ ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照又はＣＴＬＡ－４受容体、ベラタセプトのいずれかの存在下、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ （＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞とインキュベートしたＴ細胞については、ＥＣ５０及びＩＬ－２値（０ｎＭ又は１０００ｎＭのＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８について報告）を表２４にまとめる。
ＥＣ５０及びＭａｘ ＩＬ－２値は、一定の２０ｎＭ ｈＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照又はセミプリマブのいずれかの存在下で、ＮＡＬＭ－６（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞とインキュベートしたＣＤ３＋Ｔ細胞については表２３Ａに、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－（＋／－ＰＤ－Ｌ１）とインキュベートしたＣＤ３＋Ｔ細胞については表２３Ｂにまとめる。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞とインキュベートしたＣＤ３＋Ｔ細胞について、活性化曲線を図４に示す。一定の２０ｎＭ ｈＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照又はセミプリマブのいずれかの存在下、及び一定の５０ｎＭ ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照又はＣＴＬＡ－４受容体、ベラタセプトのいずれかの存在下、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ （＋／－ＰＤ－Ｌ１）細胞とインキュベートしたＴ細胞については、ＥＣ５０及びＩＬ－２値（０ｎＭ又は１０００ｎＭのＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８について報告）を表２４にまとめる。
【0256】
ヒト一次Ｔ細胞並びに同種異系のＢ細胞リンパ球細胞株ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－及びＮＡＬＭ－６の存在下で、ＲＥＧＮ５８３７はＩＬ－２放出を濃度依存的に増加させた。非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体は高い抗体濃度でＩＬ－２をわずかに増加させる。ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－又はＮＡＬＭ－６細胞上にＰＤ－Ｌ１が存在しない場合、２０ｎＭセミプリマブの添加は、ＩＬ－２放出に対して影響を及ぼさない。ＰＤ－Ｌ１を発現するＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－又はＮＡＬＭ－６細胞が存在する場合、ＲＥＧＮ５８３７単独での治療に応答して放出される最大ＩＬ－２は、非ＰＤ－Ｌ１発現細胞とインキュベートしたＴ細胞と比較して減少する。セミプリマブの添加は、ＮＡＬＭ－６／ＰＤ－Ｌ１細胞を伴う条件では、ＲＥＧＮ５８３７媒介性ＩＬ－２放出をわずかに増強するが、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－／ＰＤ－Ｌ１細胞の存在下では、ＰＤ－Ｌ１が欠失した、ＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－細胞を伴う条件で観察されるレベルまで、ＩＬ－２放出を有意に増強させる。
【0257】
ヒト一次Ｔ細胞及び同種異系のＢ細胞リンパ球細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２の存在下で、ＩＬ－２放出の濃度に依存した増加は見られなかった。反対に、非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体は、ＩＬ－２放出を濃度に依存して減少させることが観察された。ＣＤ２８リガンドをほとんど又は全く発現しないＮＡＬＭ－６及びＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－細胞とは異なり、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞株はＣＤ２８リガンドを発現することが知られている。ＲＥＧＮ５８３７のＣＤ２８結合アーム、したがって非ＴＡＡｘＣＤ２８抗体のＣＤ２８アームは、ＣＤ２８に対する結合に関してＣＤ２８リガンドと競合することが知られているので、非ＴＡＡｘＣＤ２８対照抗体は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞上に発現されたＣＤ２８リガンドによるＣＤ２８活性化をブロックし、ＩＬ－２放出を減少させる。非ＴＡＡｘＣＤ２８対照とは異なり、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞にそのＣＤ２２結合アームを介して固定して、ＣＤ２８リガンドと同様に挙動させ、本質的にそれらを置換する能力のために、ＩＬ－２はＲＥＧＮ５８３７によって減少しない。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１細胞の存在下で、基礎的ＩＬ－２放出は、ＰＤ－Ｌ１を発現しないＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と比べて減少する。ＲＥＧＮ５８３７をセミプリマブの非存在下で添加することで、ＩＬ－２放出が若干増強される。２０ｎＭセミプリマブを添加すると、基礎活性が増強され、ＲＥＧＮ５８３７の用量漸増でさらにわずかに増強することができ、ｍａｘ ＩＬ－２放出が、ＲＥＧＮ５８３７及びセミプリマブの組み合わせについて、いずれかの治療単独よりも高くなる。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞で観察されるように、非ＴＡＡｘＣＤ２８の存在下でのＷＳＵ－ＤＬＣＬ２／ＰＤ－Ｌ１細胞のインキュベーションにより、セミプリマブ又はｈＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照が存在するか否かにかかわらず、ＩＬ－２レベルが低下する。ＲＥＧＮ５８３７の影響のマスキングに対するＣＤ２８リガンド発現の影響をさらに調査するために、可溶性ＣＴＬＡ－４受容体ベラタセプト、又はｈＩｇＧ１適合アイソタイプ対照を５０ｎＭで添加した。ベラタセプトは高親和性でＣＤ２８リガンド、ＣＤ８０及びＣＤ８６と結合し、それらの相互作用を、したがってＣＤ２８の活性化をブロックする。５０ｎＭ ベラタセプトの存在下で、ＣＤ２８リガンドがＣＤ２８と結合して共刺激シグナリングを提供することができないために、基礎ＩＬ－２放出は劇的に減少する。このような条件下でも、ＩＬ－２放出の用量依存性増強によって認められるように、ＲＥＧＮ５８３７はＣＤ２８と結合して共刺激を提供することができる。２０ｎＭセミプリマブ単独の添加は、ベラタセプトの存在下でＩＬ－２放出を増強しないが、セミプリマブを、用量を増加させたＲＥＧＮ５８３７と組み合わせると、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように操作された細胞の存在下で、ＲＥＧＮ５８３７単独と比べてｍａｘ ＩＬ－２放出が増加する。
表２３Ａ：ＲＥＧＮ５８３７のセミプリマブとの組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＮＡＬＭ－６細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強する。
ＮＤ：濃度依存性応答が観察されなかったので測定しなかった。
表２３Ｂ：ＲＥＧＮ５８３７のセミプリマブとの組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強する。
ＮＣ：データが４パラメータロジスティック方程式と適合しなかったので計算しなかった。
表２４：ＲＥＧＮ５８３７のセミプリマブとの組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強する。
ＮＤ：濃度依存性応答が観察されなかったので測定しなかった。
ＮＣ：データが４パラメータロジスティック方程式と適合しなかったので計算しなかった。
表２３Ａ：ＲＥＧＮ５８３７のセミプリマブとの組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＮＡＬＭ－６細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強する。
【表23A-1】
【表23A-2】
表２３Ｂ：ＲＥＧＮ５８３７のセミプリマブとの組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＲＡＪＩ／ＣＤ８０－ＣＤ８６－細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強する。
【表23B-1】
【表23B-2】
表２４：ＲＥＧＮ５８３７のセミプリマブとの組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞において、ＲＥＧＮ５８３７治療単独を上回ってＩＬ－２放出を増強する。
【表24】
ＮＣ：データが４パラメータロジスティック方程式と適合しなかったので計算しなかった。
【0258】
実施例１１ ＲＥＧＮ１９７９の存在下及び非存在下でのＲＥＧＮ５８３７投与の抗腫瘍有効性
導入
ＲＥＧＮ５８３７は、ＣＤ２２＋Ｂ細胞とＣＤ２８＋Ｔ細胞を架橋することによって、Ｂ細胞ＮＨＬ（例えば、ＤＬＢＣＬ）を標的とするように設計されたヒトＩｇＧ４ベースの二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）である。「シグナル１」を提供する（，例えば、ＴＣＲ又はＣＤ３クラスタ化を介して一次Ｔ細胞刺激によりシグナルを送達する）他の薬剤、例えば、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）ＲＥＧＮ１９７９と組み合わせてＲＥＧＮ５８３７によって提供される「シグナル２」は、増幅されたＴ細胞活性化及びＴ細胞に媒介されたＢ細胞ＮＨＬの殺滅を提供し、ＣＤ２０ｘＣＤ３に対する応答を深めることができる。さらに、ＲＥＧＮ５８３７は、ＣＤ２０ｘＣＤ３単剤療法に反応しない患者において有効性を増大させる可能性がある。
導入
ＲＥＧＮ５８３７は、ＣＤ２２＋Ｂ細胞とＣＤ２８＋Ｔ細胞を架橋することによって、Ｂ細胞ＮＨＬ（例えば、ＤＬＢＣＬ）を標的とするように設計されたヒトＩｇＧ４ベースの二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）である。「シグナル１」を提供する（，例えば、ＴＣＲ又はＣＤ３クラスタ化を介して一次Ｔ細胞刺激によりシグナルを送達する）他の薬剤、例えば、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）ＲＥＧＮ１９７９と組み合わせてＲＥＧＮ５８３７によって提供される「シグナル２」は、増幅されたＴ細胞活性化及びＴ細胞に媒介されたＢ細胞ＮＨＬの殺滅を提供し、ＣＤ２０ｘＣＤ３に対する応答を深めることができる。さらに、ＲＥＧＮ５８３７は、ＣＤ２０ｘＣＤ３単剤療法に反応しない患者において有効性を増大させる可能性がある。
【0259】
後述する研究では、８日目の確立されたＢ細胞白血病腫瘍を有する免疫不全ＮＳＧマウスに対して投与された、有効量以下の量のＣＤ２０ｘＣＤ３ ｂｓＡｂ（ＲＥＧＮ１９７９）の存在下又は非存在下でのＣＤ２２ｘＣＤ２８ｂｓＡｂ ＲＥＧＮ５８３７の抗腫瘍有効性を評価した。
【0260】
簡単に説明すると、マウス（群あたりｎ＝６～９）にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を腹腔内（ＩＰ）でグラフトし、生物発光画像化（ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ）を可能にするためにルシフェラーゼを発現するように操作されたヒトＮＡＬＭ－６ Ｂ細胞白血病細胞を１２日後に静脈内（ＩＶ）移植した。０．０４ｍｇ／ｋｇ固定用量のＲＥＧＮ１９７９と組み合わせた、０．０４、０．４、及び４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７の抗腫瘍有効性を、ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９単剤療法並びに非架橋ＩｇＧ４Ｐ－ＰＶＡ対照ｂｓＡｂと比較した。ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ細胞の移植後８、１５、及び２２日に、マウスに抗体を腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。実験期間中、腫瘍量を週に二回評価した。
【0261】
材料及び方法
ヒト由来の細胞株
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ：ＮＡＬＭ－６細胞株は、１９歳男性患者（ＤＳＭＺ、ｃａｔ＃ＡＣＣ１２８）から単離された急性リンパ芽球性白血病細胞株であり；この株をＥＦ１ａ－ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰ－Ｐｕｒｏレンチウイルス（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）で修飾して、インビボの腫瘍細胞成長の画像化を容易にした。
ヒト由来の細胞株
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ：ＮＡＬＭ－６細胞株は、１９歳男性患者（ＤＳＭＺ、ｃａｔ＃ＡＣＣ１２８）から単離された急性リンパ芽球性白血病細胞株であり；この株をＥＦ１ａ－ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰ－Ｐｕｒｏレンチウイルス（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）で修飾して、インビボの腫瘍細胞成長の画像化を容易にした。
【0262】
ＰＢＭＣ：ヒトＰＢＭＣはＲｅａｃｈＢｉｏ，Ｃａｔ．＃０５００－４０１、ドナー＃０１８０９０５（腫瘍成長実験）及び０１８０６２１（血清抗体実験）から入手した。
【0263】
実験設計
試験システム
メスＮＳＧマウス（８～９週令）をすべての実験で使用した。すべてのマウスにヒトＰＢＭＣをＩＰ生着させ、次に生着後１２日にＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ Ｂ細胞白血病細胞をＩＶ移植した。実験設計は表２５で詳述する。研究期間にわたって週に二回、生物発光画像化により腫瘍成長をモニタリングした。全ての実験について、マウスをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ動物施設中に標準的条件下で収容した。すべての実験は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ動物管理使用委員会のガイドラインにしたがって実施した。
試験システム
メスＮＳＧマウス（８～９週令）をすべての実験で使用した。すべてのマウスにヒトＰＢＭＣをＩＰ生着させ、次に生着後１２日にＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ Ｂ細胞白血病細胞をＩＶ移植した。実験設計は表２５で詳述する。研究期間にわたって週に二回、生物発光画像化により腫瘍成長をモニタリングした。全ての実験について、マウスをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ動物施設中に標準的条件下で収容した。すべての実験は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ動物管理使用委員会のガイドラインにしたがって実施した。
【0264】
ＮＳＧマウスの生着
メスの免疫不全ＮＳＧマウスに４×１０７ヒトＰＢＭＣをＩＰ生着させた。血液の後眼窩収集及びフローサイトメトリによる全血中のすべての生細胞におけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントの評価後１１日にＴ細胞レベルをチェックした；生着レベルは０．１６～１６％ｈＣＤ４５＋細胞の範囲であった。ＰＢＭＣ生着ＮＳＧマウスに続いてＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ細胞を移植した。
メスの免疫不全ＮＳＧマウスに４×１０７ヒトＰＢＭＣをＩＰ生着させた。血液の後眼窩収集及びフローサイトメトリによる全血中のすべての生細胞におけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントの評価後１１日にＴ細胞レベルをチェックした；生着レベルは０．１６～１６％ｈＣＤ４５＋細胞の範囲であった。ＰＢＭＣ生着ＮＳＧマウスに続いてＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ細胞を移植した。
【0265】
ＮＡＬＭ－６－Ｌｕｃ培養条件及び腫瘍移植
ＮＡＬＭ－６細胞株をＥＦ１ａ－ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰ－Ｐｕｒｏレンチウイルス（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）で修飾して、インビボでの腫瘍細胞成長の画像化を促進した。細胞株は、ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミン）を追加した１０％ＦＢＳ中、ピューロマイシン選択下で、ＲＰＭＩ中に維持した。
ＮＡＬＭ－６細胞株をＥＦ１ａ－ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰ－Ｐｕｒｏレンチウイルス（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）で修飾して、インビボでの腫瘍細胞成長の画像化を促進した。細胞株は、ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミン）を追加した１０％ＦＢＳ中、ピューロマイシン選択下で、ＲＰＭＩ中に維持した。
【0266】
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ細胞を遠心分離によって集め、ＰＢＳ中に２．５×１０７細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＮＳＧマウスに、ＰＢＭＣの生着後１２日で２００μｌ（５×１０６細胞）のＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ細胞をＩＶ注射した。
【0267】
腫瘍測定のための抗体投与
被験物質又は対照を投与する前に、マウスを腫瘍量及びＴ細胞生着レベルにしたがって階層化した群に割り当てた。被験物質または対照物質を投与する前に、マウスを、腫瘍の大きさとT細胞の生着レベルに応じて層別した群に割り当てた。抗体（ＲＥＧＮ５８３７、ＲＥＧＮ１９７９、ＲＥＧＮ５６７１［非ＴＡＡｘＣＤ２８非架橋対照ｂｓＡｂ］、又はＨ４ｓＨ１７６６４Ｄ［非ＴＡＡｘＣＤ３非架橋対照ｂｓＡｂ］）を単剤療法として、又は組み合わせで、ＩＰ注射により、移植後８、１５、及び２２日（インビボ有効性について）に、表に記載する用量で投与した。
表２５：腫瘍成長を評価するための実験設計
ａ この群の一匹のマウスが実験中早期に死亡し、除外した。この死は、腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｏｎ）によるものではなく、対照群において一匹のマウスが死亡したので、被験物質の投薬に関連する可能性は低かった。
被験物質又は対照を投与する前に、マウスを腫瘍量及びＴ細胞生着レベルにしたがって階層化した群に割り当てた。被験物質または対照物質を投与する前に、マウスを、腫瘍の大きさとT細胞の生着レベルに応じて層別した群に割り当てた。抗体（ＲＥＧＮ５８３７、ＲＥＧＮ１９７９、ＲＥＧＮ５６７１［非ＴＡＡｘＣＤ２８非架橋対照ｂｓＡｂ］、又はＨ４ｓＨ１７６６４Ｄ［非ＴＡＡｘＣＤ３非架橋対照ｂｓＡｂ］）を単剤療法として、又は組み合わせで、ＩＰ注射により、移植後８、１５、及び２２日（インビボ有効性について）に、表に記載する用量で投与した。
表２５：腫瘍成長を評価するための実験設計
【表25】
【0268】
腫瘍測定及び指定されたエンドポイント
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ腫瘍を移植したマウスは、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ装置を用いて週に２回撮影し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いてデータを解析した。画像化に先立って、マウスにルシフェリン基質をＩＰ注射した。１０分後、マウスをイソフルランで麻酔し、生物発光（全光束、光子／秒［ｐ／ｓ］で表す）を定量した。ＩＡＣＵＣ基準に従い、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（２０％以上の体重減少として評価）の兆候をマウスが示し始めた時点で実験を終了した。
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ腫瘍を移植したマウスは、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ装置を用いて週に２回撮影し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いてデータを解析した。画像化に先立って、マウスにルシフェリン基質をＩＰ注射した。１０分後、マウスをイソフルランで麻酔し、生物発光（全光束、光子／秒［ｐ／ｓ］で表す）を定量した。ＩＡＣＵＣ基準に従い、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（２０％以上の体重減少として評価）の兆候をマウスが示し始めた時点で実験を終了した。
【0269】
腫瘍成長の統計的分析
腫瘍体積の経時的結果を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して解析し、続いてＴｕｋｅｙの事後試験を行って、多重比較を行った。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であるとみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（第８版）を使用して統計的解析を実施した。
結果
ＲＥＧＮ１９７９の存在下及び非存在下でのＲＥＧＮ５８３７投与の抗腫瘍有効性
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ腫瘍を有する免疫不全ＮＳＧマウスに上記のような抗体又は非架橋対照をＩＰ注射した。
腫瘍体積の経時的結果を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して解析し、続いてＴｕｋｅｙの事後試験を行って、多重比較を行った。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であるとみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（第８版）を使用して統計的解析を実施した。
結果
ＲＥＧＮ１９７９の存在下及び非存在下でのＲＥＧＮ５８３７投与の抗腫瘍有効性
ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ腫瘍を有する免疫不全ＮＳＧマウスに上記のような抗体又は非架橋対照をＩＰ注射した。
【0270】
担癌マウスにおいて、０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の存在下での０．０４、０．４、及び４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７を用いた治療の結果、移植後２３日に、非架橋対照ｂｓＡｂ（非ＴＡＡｘＣＤ２８及び非ＴＡＡｘＣＤ３ｂｓＡｂ）と比較して、腫瘍成長の統計的に有意な抑制がもたらされた（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）（図６）。移植後２０日に、０．４及び４ｍｇ／ｋｇ群について腫瘍成長の有意な抑制が観察された（両群についてｐ＜０．０５）。ＲＥＧＮ５８３７（４ｍｇ／ｋｇ）単剤療法もＲＥＧＮ１９７９（０．０４ｍｇ／ｋｇ）単剤療法いずれも非架橋対照ｂｓＡｂと比較して腫瘍成長を有意に低下させなかった。ＲＥＧＮ５８３７＋ＲＥＧＮ１９７９の併用療法といずれかのｂｓＡｂ単剤療法との間に差はなく、統計的有意性に達した。投薬期間全体にわたって非架橋対照ｂｓＡｂを投与すると急速な腫瘍成長が観察され、すべてのマウスを第２３日に安楽死させた。全ての群において、実験終了時に少なくとも一匹のマウスでＧＶＨＤが観察された（２０％以上の体重減少として評価)。
【0271】
異なるマウスのセットを使用した独立した実験において、以下の時点で血液を採取し、血清抗体濃度を測定した：第７日の投薬後１及び４時間、第１４日及び第２１日の投薬前１時間と投薬後４時間、第２９日に１回。投薬期間中、血清中の抗体のトラフ濃度を第１４日及び第２１日の投薬前１時間に測定した。投与期間中の血清中の抗体のトラフ濃度は、１４日目および２１日目の投与の1時間前に測定した。０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の存在下での０．０４、０．４、及び４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７用量の投与は、それぞれ定量限界以下（ＢＬＱ）から０．１、１．６～２．３、及び１６．５～２１．１μｇ／ｍＬまでの範囲のＲＥＧＮ５８３７のトラフ濃度と関連していた。
血清中のＲＥＧＮ１９７９のトラフ濃度はすべての場合でＢＬＱであった（データは不掲載）。
血清中のＲＥＧＮ１９７９のトラフ濃度はすべての場合でＢＬＱであった（データは不掲載）。
【0272】
結論
０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９存在下での０．０４、０．４、及び４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７の用量は、マウスにおいてＮＡＬＭ－６ Ｂ細胞白血病腫瘍成長の抑制に有効であった。４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７又は０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９単剤療法のいずれかで、対照と比べて有意な腫瘍抑制は観察されなかった。
０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９存在下での０．０４、０．４、及び４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７の用量は、マウスにおいてＮＡＬＭ－６ Ｂ細胞白血病腫瘍成長の抑制に有効であった。４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７又は０．０４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９単剤療法のいずれかで、対照と比べて有意な腫瘍抑制は観察されなかった。
【0273】
実施例１２：ＣＤ２２細胞＋ヒトＰＢＭＣ＋／－ＣＤ２２ｘＣＤ２８共刺激二重特異性抗体（固定ＣＤ２２ｘＣＤ２８、滴定ＣＤ２０ｘＣＤ３）に対するＦＡＣＳベースの細胞傷害性
材料及び方法
ＣＤ２０ｘＣＤ３標的化殺滅のＣＤ２２ｘＣＤ２８増強を、９６時間細胞傷害性アッセイ標的化Ｎａｌｍ６又はＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞で評価した。簡単に説明すると、ヒトＰＢＭＣを補充ＲＰＭＩ培地中に１×１０６細胞／ｍＬで蒔き、３７℃で一晩インキュベートして、付着したマクロファージ、樹状細胞、及び一部の単球を除去することによって、リンパ球について濃縮した。翌日、Ｎａｌｍ６又はＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を１ｕＭの蛍光追跡色素ＣＦＤＡ－ＳＥで標識し、付着細胞枯渇ナイーブＰＢＭＣを１ｕＭの蛍光追跡色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。標識された標的細胞及びＰＢＭＣ（Ｎａｌｍ６についてはエフェクタ／標的細胞４：１比、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２については５：１）をＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９（濃度範囲：５ｎＭ～０．６４ｐＭ）の段階希釈液を、２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）の固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８ＲＥＧＮ５８３７と共に、又はなしで同時インキュベートした。Ｎａｌｍ６細胞を標的とするアッセイにおいて、一定量のＣＤ２２ｘＣＤ２８ＲＥＧＮ５８３８、２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）の１アーム対照ＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５６７８）又はＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照（Ｈ４ｓＨ１０１５４Ｐ３）を添加した。３７℃で９６時間インキュベートした後、細胞をプレートから収集し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でのＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆａｒ Ｒｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素で染色した。２０，０００個のカウンティングビーズをＦＡＣＳ分析の直前に各ウェルに添加し、サンプルごとに１０，０００個のビーズを集めた。殺滅の特異性を評価するために、細胞を生ＣＦＤＡ－ＳＥ標識集団で細胞をゲートした。生標的細胞のパーセント又は数を記録し、生存率の計算に使用した。
材料及び方法
ＣＤ２０ｘＣＤ３標的化殺滅のＣＤ２２ｘＣＤ２８増強を、９６時間細胞傷害性アッセイ標的化Ｎａｌｍ６又はＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞で評価した。簡単に説明すると、ヒトＰＢＭＣを補充ＲＰＭＩ培地中に１×１０６細胞／ｍＬで蒔き、３７℃で一晩インキュベートして、付着したマクロファージ、樹状細胞、及び一部の単球を除去することによって、リンパ球について濃縮した。翌日、Ｎａｌｍ６又はＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を１ｕＭの蛍光追跡色素ＣＦＤＡ－ＳＥで標識し、付着細胞枯渇ナイーブＰＢＭＣを１ｕＭの蛍光追跡色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。標識された標的細胞及びＰＢＭＣ（Ｎａｌｍ６についてはエフェクタ／標的細胞４：１比、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２については５：１）をＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９（濃度範囲：５ｎＭ～０．６４ｐＭ）の段階希釈液を、２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）の固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８ＲＥＧＮ５８３７と共に、又はなしで同時インキュベートした。Ｎａｌｍ６細胞を標的とするアッセイにおいて、一定量のＣＤ２２ｘＣＤ２８ＲＥＧＮ５８３８、２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）の１アーム対照ＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５６７８）又はＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照（Ｈ４ｓＨ１０１５４Ｐ３）を添加した。３７℃で９６時間インキュベートした後、細胞をプレートから収集し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でのＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆａｒ Ｒｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素で染色した。２０，０００個のカウンティングビーズをＦＡＣＳ分析の直前に各ウェルに添加し、サンプルごとに１０，０００個のビーズを集めた。殺滅の特異性を評価するために、細胞を生ＣＦＤＡ－ＳＥ標識集団で細胞をゲートした。生標的細胞のパーセント又は数を記録し、生存率の計算に使用した。
【0274】
Ｔ細胞活性化は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５と直接コンジュゲートした抗体と細胞をインキュベートすることによって評価した。ＣＤ２５を発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージをＴ細胞活性化の尺度として報告した。さらに、Ｔ細胞が増殖するにつて、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔが希釈され、ＦＡＣＳによって測定されるＭＦＩが低下する。Ｔ細胞増殖は、したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔのＭＦＩの減少として、又はＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ ＭＦＩを減少させたＣＤ８＋細胞のパーセンテージとして報告された。
【0275】
このアッセイからの上清をサイトカインレベルの分析のために集めた。ＩＬ１７ａ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４、及びＩＬ－２の濃度は、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キットを製造業者の指示にしたがって使用して分析した。サイトカインレベルは、キット標準によって作成した曲線から内挿し、ｐｇ／ｍＬとして報告した。標的細胞殺滅、Ｔ細胞活性化、増殖、及びサイトカインレベルのＥＣ５０値、並びに最大サイトカインレベルは、Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
【0276】
結果、まとめ、及び結論：
ナイーブヒトＴ細胞に、共刺激ＣＤ２２ｘＣＤ２８抗体又は１アームＣＤ２８若しくはアイソタイプ対照抗体と組み合わせてヒトＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する標的細胞を殺滅させるその能力について、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９を試験した。
ナイーブヒトＴ細胞に、共刺激ＣＤ２２ｘＣＤ２８抗体又は１アームＣＤ２８若しくはアイソタイプ対照抗体と組み合わせてヒトＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する標的細胞を殺滅させるその能力について、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９を試験した。
【0277】
ＲＥＧＮ１９７９を活性化し、ヒトＴ細胞に、Ｎａｌｍ６（図７）又はＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（図８）細胞を用量依存的に殺滅させた。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、ＲＥＧＮ１９７９の細胞傷害効力（ＥＣ５０）を、ＲＥＧＮ１９７９と１アームＣＤ２８若しくはアイソタイプ対照抗体と比較した場合、Ｎａｌｍ６細胞に対して４．７～５．２倍（表２６）又はＲＥＧＮ１９７９単独と比較した場合、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対して１７．５倍（表２７）増強した。
【0278】
観察される、ＲＥＧＮ１９７９によって媒介される標的細胞溶解は、それぞれ、ＣＤ８＋細胞に関するＣＤ２５上方調節又はＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって測定されるように、Ｔ細胞活性化及び増殖と関連していた（図７、図８）。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、ＲＥＧＮ１９７９誘導性Ｔ細胞活性化及び増殖の可能性を、ＲＥＧＮ１９７９と１アームＣＤ２８若しくはアイソタイプ対照抗体と比べた場合、Ｎａｌｍ６細胞の存在下で、それぞれ２．３～２．６倍及び５．４～７．１倍（表２６）、又はＲＥＧＮ１９７９単独と比較した場合、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の存在下で、８．２及び１６．１倍（表２７）増強した。
【0279】
ヒトＰＢＭＣ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用いたアッセイにおいて、ＲＥＧＮ１９７９はヒトサイトカインの放出を誘導した。ＲＥＧＮ１９７９で観察される、放出したサイトカインは、ＲＥＧＮ１９７９単独で誘導されるサイトカイン放出と比較して、固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８の存在下で増強された（表２８、図９）。
【0280】
まとめると、共刺激により、対照抗体と組み合わせるか又は単独のＣＤ２０ｘＣＤ３で観察されたものと比較して、標的化細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン放出の可能性が増大した。
データのまとめの表：
表２６：Ｎａｌｍ６標的での細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値（１回の実験）
表２７：ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的での細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値（２回の実験の平均）
表２８：ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞傷害性細胞傷害性アッセイからのサイトカイン放出（２回の実験の平均）
データのまとめの表：
表２６：Ｎａｌｍ６標的での細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値（１回の実験）
【表26】
【表27-1】
【表27-2】
【表28】
【0281】
実施例１３：ＮＨＬ＋ヒトＰＢＭＣ＋／－ＣＤ２２ｘＣＤ２８刺激（固定ＣＤ２２ｘＣＤ２８、ＣＤ２０ｘＣＤ３）に対するＦＡＣＳベースの細胞傷害性
実験手順
ＣＤ２０ｘＣＤ３標的化殺滅のＣＤ２２ｘＣＤ２８増強を、ヒト間質細胞（ＨＳ－５）の存在下で自己ＰＢＭＣを含む初代ＮＨＬ患者生検から単離されたＮＨＬ細胞を標的とする９６時間細胞傷害性アッセイで評価した。簡単に説明すると、ＨＳ－５細胞を５０００細胞／ウェルで平底９６ウェルプレート中に蒔き、一晩インキュベートした。翌日、ＮＨＬ患者からのＰＢＭＣを１ｕＭの蛍光追跡色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。骨髄及び標識されたＰＢＭＣ（エフェクタ／標的細胞１０：１比）を、間質細胞を含むウェルに蒔き、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９の段階希釈（濃度範囲：６．７ｎＭ～１０．７ｐＭ）及び固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８共刺激分子ＲＥＧＮ５８３７又は１アーム対照ＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５６７８）と２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）で９６時間３７℃にて同時インキュベートした。細胞をプレートから収集し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でのＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞を抗体カクテル（ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ近ＩＲ反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。２０，０００個のカウンティングビーズをＦＡＣＳ分析の直前に各ウェルに添加し、サンプルごとに１０，０００個のビーズを集めた。殺滅の特異性を評価するために、標的細胞を生ＣＤ４５＋バイオレット陰性ＣＤ１９＋集団でゲートした。生存率は、未処理ウェル中の標的細胞数に対して正規化された処理ウェル中の標的細胞数に基づいて計算した。
実験手順
ＣＤ２０ｘＣＤ３標的化殺滅のＣＤ２２ｘＣＤ２８増強を、ヒト間質細胞（ＨＳ－５）の存在下で自己ＰＢＭＣを含む初代ＮＨＬ患者生検から単離されたＮＨＬ細胞を標的とする９６時間細胞傷害性アッセイで評価した。簡単に説明すると、ＨＳ－５細胞を５０００細胞／ウェルで平底９６ウェルプレート中に蒔き、一晩インキュベートした。翌日、ＮＨＬ患者からのＰＢＭＣを１ｕＭの蛍光追跡色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。骨髄及び標識されたＰＢＭＣ（エフェクタ／標的細胞１０：１比）を、間質細胞を含むウェルに蒔き、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９の段階希釈（濃度範囲：６．７ｎＭ～１０．７ｐＭ）及び固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８共刺激分子ＲＥＧＮ５８３７又は１アーム対照ＣＤ２８二重特異性（ＲＥＧＮ５６７８）と２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）で９６時間３７℃にて同時インキュベートした。細胞をプレートから収集し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でのＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞を抗体カクテル（ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ近ＩＲ反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。２０，０００個のカウンティングビーズをＦＡＣＳ分析の直前に各ウェルに添加し、サンプルごとに１０，０００個のビーズを集めた。殺滅の特異性を評価するために、標的細胞を生ＣＤ４５＋バイオレット陰性ＣＤ１９＋集団でゲートした。生存率は、未処理ウェル中の標的細胞数に対して正規化された処理ウェル中の標的細胞数に基づいて計算した。
【0282】
Ｔ細胞は、生ＣＤ４５＋バイオレットで標識されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋集団としてゲートされた。ＣＤ２５を発現するＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞のパーセンテージをＴ細胞活性化の尺度として報告した。さらに、Ｔ細胞が増殖するにつれ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔが希釈され、ＦＡＣＳによって測定されるＭＦＩが低下する。Ｔ細胞増殖は、したがって、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔのＭＦＩにおける減少として報告された。
【0283】
標的殺滅並びにＴ細胞活性化及び増殖のＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアの４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
【0284】
結果、まとめ、及び結論：
ナイーブ自己Ｔ細胞に、共刺激ＣＤ２２ｘＣＤ２８抗体又は１アームＣＤ２８対照抗体と組み合わせて患者骨髄からのＮＨＬ細胞を殺滅させるその能力について、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９を試験した。
ナイーブ自己Ｔ細胞に、共刺激ＣＤ２２ｘＣＤ２８抗体又は１アームＣＤ２８対照抗体と組み合わせて患者骨髄からのＮＨＬ細胞を殺滅させるその能力について、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９を試験した。
【0285】
ＲＥＧＮ１９７９は、ヒトＴ細胞を活性化して、ＮＨＬを用量依存的に枯渇させた。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、ＲＥＧＮ１９７９の細胞傷害効力（ＥＣ５０）が、ＲＥＧＮ１９７９と１アームＣＤ２８対照抗体又は共刺激なしの対照と比較した場合、２．３及び３．５倍増強された（表２９）。
【0286】
観察される、ＲＥＧＮ１９７９により媒介される標的細胞溶解は、それぞれ、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞に関するＣＤ２５上方調節又はＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット希釈によって測定されるように、Ｔ細胞活性化及び増殖と関連していた。固定濃度のＣＤ２２ｘＣＤ２８二重特異性抗体をＲＥＧＮ１９７９に添加することで、ＲＥＧＮ１９７９誘導性Ｔ細胞活性化及び増殖の可能性が、１アームＣＤ２８又はアイソタイプ対照抗体を伴うＲＥＧＮ１９７９と比較した場合に、それぞれ２．８～４．８倍及び２．８～４．２倍増強された（表２９及び図１０）。
【0287】
まとめると、共刺激により、対照抗体と組み合わせたＣＤ２０ｘＣＤ３で観察されたものと比較して、標的化細胞傷害性及びＴ細胞活性化の可能性が増大した。
データのまとめの表：
表２９：細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値
実施例１４ びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）のモデルにおける、ＲＥＧＮ５８３７単独またはＲＥＧＮ１９７９との組み合わせの抗腫瘍有効性のインビトロ特性評価及びインビボ評価
材料及び方法－研究の紹介及び結果のまとめ
インビトロ及びインビボ研究を行って評価した：
データのまとめの表：
表２９：細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値
【表29-1】
【表29-2】
材料及び方法－研究の紹介及び結果のまとめ
インビトロ及びインビボ研究を行って評価した：
【0288】
（１）ＣＤ２８＋Ｔ細胞をＣＤ２２＋標的細胞と架橋することによって一次Ｔ細胞の活性化を増強するＲＥＧＮ５８３７の能力。Ｔ細胞活性化は、読み出しとして、標的細胞に対する細胞傷害性、Ｔ細胞活性化の細胞－表面マーカーの発現、Ｔ細胞増殖、及びサイトカイン放出のレベルを使用して評価した。ＲＥＧＮ１９７９、Ｔ細胞上のＣＤ３分子及びＣＤ２０＋標的細胞を架橋してＴ細胞活性化をもたらすＣＤ２０ｘＣＤ３ｂｓＡｂの存在下又は非存在下で実験を実施した。
【0289】
（２）ＤＬＢＣＬ腫瘍を有する免疫不全ＮＳＧマウスに投与された、０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の存在下でのＣＤ２２ｘＣＤ２８ｂｓＡｂＲＥＧＮ５８３７の抗腫瘍有効性。
【0290】
ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９を、様々な濃度で組み合わせて試験して、ヒトＤＬＢＣＬ細胞株に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞傷害性（ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２）、後期Ｔ細胞活性化のマーカー（ＣＤ２５）の上方調節、Ｔ細胞増殖、及び一次ヒトＴ細胞からのサイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。ＲＥＧＮ５８３７は、Ｔ細胞傷害性、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５細胞－表面発現、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を媒介するＲＥＧＮ１９７９の可能性を濃度に依存して増強した。同様に、ＲＥＧＮ５８３７は、ＲＥＧＮ１９７９がサイトカイン放出を媒介する可能性を濃度に依存して増強した。７７．２ｐＭ～１００ｎＭの範囲の濃度で、ＲＥＧＮ５８３７は標的細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞傷害性の可能性を増大させた；７７．２ｐＭ～２．７８ｎＭの範囲の濃度で、ＲＥＧＮ５８３７は、ＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化及び増殖の可能性を増大させたが、さらに高濃度のＲＥＧＮ５８３７はＲＥＧＮ１９７９の可能性をさらに増大させなかった（表３０）。ＲＥＧＮ５８３７の添加により、ＲＥＧＮ１９７９媒介性標的細胞殺滅及びＴ細胞増殖の最大量は、実質的に増加しなかったが、ＲＥＧＮ５８３７は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７αのＲＥＧＮ１９７９媒介性放出の最大レベルを濃度に依存して増強した。
【0291】
免疫不全ＮＳＧマウス（群あたりｎ＝６～７）に１：１比のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞及びヒトＰＢＭＣを皮下（ＳＣ）移植した。０．４又は４ｍｇ／ｋｇ用量のＲＥＧＮ１９７９と組み合わせた、１ｍｇ／ｋｇでのＲＥＧＮ５８３７の抗腫瘍有効性を、ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９単剤療法と、並びに非架橋ＩｇＧ４Ｐ－ＰＶＡ対照ｂｓＡｂと比較した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の移植後１、８、及び１５日に、マウスに抗体を腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の存在下で１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７を用いた治療の結果、移植後２８日までに、ＲＥＧＮ５８３７又はＲＥＧＮ１９７９単剤療法及び非架橋対照ｂｓＡｂと比較して、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍成長が統計的に有意に抑制された。ＲＥＧＮ１９７９単剤療法の結果、腫瘍成長がわずかに抑制されたが、ＲＥＧＮ５８３７単剤療法は非架橋対照と比べて効果がなかった。
【0292】
まとめると、ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９をインビトロで様々な濃度で組み合わせて試験した場合、ＲＥＧＮ５８３７はＣＤ２２＋ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の存在下でヒトＴ細胞活性化を媒介するＲＥＧＮ１９７９の可能性を増強した。細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、又は増殖ではなく、ＲＥＧＮ１９７９媒介性サイトカイン放出の最大レベルが、ＲＥＧＮ５８３７の存在下で増大した。インビボで、０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９いずれかの存在下での１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７は、ＲＥＧＮ５８３７又はＲＥＧＮ１９７９単剤療法単独と比べて、マウスにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍成長の抑制に有効であった。
表３０：ヒトＰＢＭＣを用いたＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化（標的細胞、ＣＤ２５発現、及びＴ細胞増殖に対する細胞傷害性により測定）に対するＲＥＧＮ５８３７の効果のまとめ
ａＲＥＧＮ１９７９は４．８ｆＭ～１０ｎＭの濃度範囲で試験した。
ｂＥＣ５０の倍数変化はＥＣ５０（ＲＥＧＮ５８３７無し）／ＥＣ５０（［Ｍ］ＲＥＧＮ５８３７）として算出した。
表３０：ヒトＰＢＭＣを用いたＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化（標的細胞、ＣＤ２５発現、及びＴ細胞増殖に対する細胞傷害性により測定）に対するＲＥＧＮ５８３７の効果のまとめ
【表30-1】
【表30-2】
ｂＥＣ５０の倍数変化はＥＣ５０（ＲＥＧＮ５８３７無し）／ＥＣ５０（［Ｍ］ＲＥＧＮ５８３７）として算出した。
【0293】
実施例１５：ＲＥＧＮ１９７９媒介性ヒトＴ細胞活性化に対するＲＥＧＮ５８３７の効果の評価並びにＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の存在下、様々な濃度で組み合わせたＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９の試験
ヒトＰＢＭＣ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を移植したあとのＮＳＧマウスにおいて、以下のパラメータを測定することにより、インビトロ及びインビボ研究の両方を実施して、有効量以下の量のヒトＣＤ２０ｘＣＤ３ ｂｓＡｂ（ＲＥＧＮ１９７９）の存在下又は非存在下でのヒトＣＤ２２ｘＣＤ２８ｂｓＡｂ ＲＥＧＮ５８３７の抗腫瘍有効性を評価した
ａ）ＣＤ２２＋標的細胞に対するＴ細胞傷害性；
ｂ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ２５、Ｔ細胞活性化のマーカーの上方調節；
ｃ）Ｔ細胞増殖；
ｄ）サイトカイン放出（ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７Α）。
ヒトＰＢＭＣ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を移植したあとのＮＳＧマウスにおいて、以下のパラメータを測定することにより、インビトロ及びインビボ研究の両方を実施して、有効量以下の量のヒトＣＤ２０ｘＣＤ３ ｂｓＡｂ（ＲＥＧＮ１９７９）の存在下又は非存在下でのヒトＣＤ２２ｘＣＤ２８ｂｓＡｂ ＲＥＧＮ５８３７の抗腫瘍有効性を評価した
ａ）ＣＤ２２＋標的細胞に対するＴ細胞傷害性；
ｂ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ２５、Ｔ細胞活性化のマーカーの上方調節；
ｃ）Ｔ細胞増殖；
ｄ）サイトカイン放出（ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７Α）。
【0294】
材料及び方法
細胞株
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２：ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２は、４１歳の白色人種男性の胸水から単離されたヒトＤＬＢＣＬ細胞株である（Ｌｅｉｂｎｉｔｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ＤＳＭＺ、Ｃａｔ．＃ＡＣＣ５７５）。
細胞株
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２：ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２は、４１歳の白色人種男性の胸水から単離されたヒトＤＬＢＣＬ細胞株である（Ｌｅｉｂｎｉｔｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ＤＳＭＺ、Ｃａｔ．＃ＡＣＣ５７５）。
【0295】
ヒトＰＢＭＣ
細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、及びサイトカイン放出アッセイのために、ヒトドナーからのｌｅｕｋｏｐａｋをＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから入手した（ドナー＃１５００Ａ）。
細胞傷害性、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、及びサイトカイン放出アッセイのために、ヒトドナーからのｌｅｕｋｏｐａｋをＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから入手した（ドナー＃１５００Ａ）。
【0296】
インビボマウス実験のために、ヒトＰＢＭＣをＲｅａｃｈＢｉｏから入手した（Ｃａｔ．＃０５００－４０１）。
【0297】
実験設計
ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９を、様々な濃度で組み合わせて試験して、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞傷害性、Ｔ細胞増殖、後期Ｔ細胞活性化のマーカー（ＣＤ２５）の細胞－表面発現、及びヒトＴ細胞からのサイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。標的細胞殺滅のパーセンテージ、Ｔ細胞活性化、及びＴ細胞増殖を本明細書中で記載するように測定した。
ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９を、様々な濃度で組み合わせて試験して、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞傷害性、Ｔ細胞増殖、後期Ｔ細胞活性化のマーカー（ＣＤ２５）の細胞－表面発現、及びヒトＴ細胞からのサイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。標的細胞殺滅のパーセンテージ、Ｔ細胞活性化、及びＴ細胞増殖を本明細書中で記載するように測定した。
【0298】
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞及びＰＢＭＣを使用したＤＬＢＣＬのモデルにおけるＲＥＧＮ５８３７単独及びＲＥＧＮ１９７９との組み合わせの抗腫瘍有効性を本明細書中で記載したように評価した。表３１を参照。
【0299】
ＲＥＧＮ１９７９のＴ細胞活性化を媒介する可能性に対するＲＥＧＮ５８３７の効果のインビトロ評価
ヒト一次Ｔ細胞単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを製造業者推奨のプロトコルにしたがって使用して、密度勾配遠心分離法により健常ドナー白血球パックから単離した。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに積層し、続いてＤ－ＰＢＳで１：２に希釈した３０ｍＬの全血を添加した。チューブを室温で１２００ｘｇにて１０分間、ブレーキを外して遠心分離した。血漿及びＰＢＭＣを含む最上層を、新しいチューブにデカンテーションした。その後のステップは、ＳｅｐＭａｔｅ製造業者のプロトコルにしたがって実施した。単離したＰＢＭＣを、５ｍＬのクリオバイアル中、２５０×１０６細胞／ｍＬの濃度で、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。ＰＢＭＣを３７℃の水浴中で解凍し、１０ｍＬ／１００ミリオンＰＢＭＣで５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む、刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）で再懸濁させ、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ(商標）ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キットを製造業者の推奨する指示に従ってペレット化されたＰＢＭＣから単離した。
ＰＢＭＣを用いたＰＢＭＣフローサイトメトリベースのＴ細胞活性化アッセイ
ヒト一次Ｔ細胞単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを製造業者推奨のプロトコルにしたがって使用して、密度勾配遠心分離法により健常ドナー白血球パックから単離した。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに積層し、続いてＤ－ＰＢＳで１：２に希釈した３０ｍＬの全血を添加した。チューブを室温で１２００ｘｇにて１０分間、ブレーキを外して遠心分離した。血漿及びＰＢＭＣを含む最上層を、新しいチューブにデカンテーションした。その後のステップは、ＳｅｐＭａｔｅ製造業者のプロトコルにしたがって実施した。単離したＰＢＭＣを、５ｍＬのクリオバイアル中、２５０×１０６細胞／ｍＬの濃度で、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。ＰＢＭＣを３７℃の水浴中で解凍し、１０ｍＬ／１００ミリオンＰＢＭＣで５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む、刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、及び０．０１ｍＭ ＢＭＥを追加したＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培養培地）で再懸濁させ、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ(商標）ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キットを製造業者の推奨する指示に従ってペレット化されたＰＢＭＣから単離した。
ＰＢＭＣを用いたＰＢＭＣフローサイトメトリベースのＴ細胞活性化アッセイ
【0300】
同種異系の一次刺激、又はＲＥＧＮ１９７９によって提供される「シグナル１」によって媒介されるＴ細胞活性化を増強するＲＥＧＮ５８３７の能力は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞及びヒトＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用して評価した。ＰＢＭＣを本明細書中で記載されるようにリンパ球について濃縮した。標的及びエフェクタ細胞を本明細書中で記載されているように、被験物質及び対照抗体とインキュベートした。フローサイトメトリを実施して、本明細書中で記載されているように、Ｔ細胞傷害性、増殖、及びＴ細胞活性化のマーカーの上方調節を評価した。さらに、ＲＥＧＮ１９７９媒介性サイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を本明細書中で記載するようにして評価した。非ＴＡＡｘＣＤ２８ ｂｓＡｂ（ＲＥＧＮ５８３７と同じＣＤ２８結合アーム、及び非結合アームを含む）をＲＥＧＮ５８３７の非架橋対照として試験した。
【0301】
ＰＢＭＣのリンパ球濃縮
ヒトＰＢＭＣを完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミンを追加したＲＰＭＩ細胞培養培地）中に１×１０６細胞／ｍＬで蒔き、３７℃で一晩インキュベートして、付着細胞、例えば、マクロファージ、樹状細胞、及び一部の単球を除去することにより、リンパ球について濃縮した。
ヒトＰＢＭＣを完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミンを追加したＲＰＭＩ細胞培養培地）中に１×１０６細胞／ｍＬで蒔き、３７℃で一晩インキュベートして、付着細胞、例えば、マクロファージ、樹状細胞、及び一部の単球を除去することにより、リンパ球について濃縮した。
【0302】
ＰＢＭＣ及び標的細胞の被験物質とのインキュベーション
リンパ球を多く含むＰＢＭＣを収集し、１μＭのＶｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ蛍光追跡色素で標識した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞を１μＭの蛍光色素Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ－ＳＥで標識した。
リンパ球を多く含むＰＢＭＣを収集し、１μＭのＶｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ蛍光追跡色素で標識した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞を１μＭの蛍光色素Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ－ＳＥで標識した。
【0303】
その後、色素で標識されたＰＢＭＣを、５：１の比にて色素で標識された標的細胞（５×１０３標的細胞／ウェルのＷＳＵ－ＤＬＣＬ２）を含む９６ウェル丸底プレート中に蒔いた。
【0304】
蒔かれたＰＢＭＣ及び標的細胞を７２時間、３７℃にて１２．９ｐＭ～１００ｎＭ（ＲＥＧＮ５８３７又は非ＴＡＡｘＣＤ２８）及び４．８ｆＭ～１０ｎＭ（ＲＥＧＮ１９７９又は非ＴＡＡｘＣＤ３）の範囲の最終濃度の被験物質又はそれらの各対照とインキュベートした。
【0305】
フローサイトメトリ分析
被験物質及び対照と共にインキュベートした後、色素で標識された細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色並びにフルオロフォア標識ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５に対する抗体のカクテルで染色した。カウンティングビーズ（２０μｌ／ウェル）をＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａフローサイトメータでのサンプル分析の直前に添加した。フローサイトメトリデータを使用して、標的細胞生存、Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞活性化のマーカーの上方調節を測定した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して９点用量応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式から求めた。細胞傷害性、Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５上方調節）、及び増殖についての最大応答はＰｒｉｓｍ曲線の当嵌によって得られるＰｒｉｓｍ曲線の当嵌n最大応答プラトーとして求められた。対照と比較したＥＣ５０の相対的変化ｗａをＥＣ５０Ｎｏ ＲＥＧＮ５８３７／ＥＣ５０［Ｍ］ ＲＥＧＮ５８３７ａｎとして算出し、ｄ ｔｈｅ 最大サイトカイン放出の相対的変化をＭａｘ［Ｍ］ ＲＥＧＮ５８３７／ＭａｘＮｏ ＲＥＧＮ５８３７として算出した。
被験物質及び対照と共にインキュベートした後、色素で標識された細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色並びにフルオロフォア標識ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５に対する抗体のカクテルで染色した。カウンティングビーズ（２０μｌ／ウェル）をＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａフローサイトメータでのサンプル分析の直前に添加した。フローサイトメトリデータを使用して、標的細胞生存、Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞活性化のマーカーの上方調節を測定した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して９点用量応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式から求めた。細胞傷害性、Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５上方調節）、及び増殖についての最大応答はＰｒｉｓｍ曲線の当嵌によって得られるＰｒｉｓｍ曲線の当嵌n最大応答プラトーとして求められた。対照と比較したＥＣ５０の相対的変化ｗａをＥＣ５０Ｎｏ ＲＥＧＮ５８３７／ＥＣ５０［Ｍ］ ＲＥＧＮ５８３７ａｎとして算出し、ｄ ｔｈｅ 最大サイトカイン放出の相対的変化をＭａｘ［Ｍ］ ＲＥＧＮ５８３７／ＭａｘＮｏ ＲＥＧＮ５８３７として算出した。
【0306】
標的細胞生存
各実験条件における生存標的細胞のパーセンテージを収集したビーズの数／ウェルに対して正規化した、ＣＦＤＡ－ＳＥで標識された生標的細胞の数／ウェルとして算出した。標的細胞生存率のパーセンテージは、任意の実験条件における生存標的細胞数と、無抗体対照条件における生存標的細胞数（ＰＢＭＣのみの存在下での標的細胞）との比として求めた。
各実験条件における生存標的細胞のパーセンテージを収集したビーズの数／ウェルに対して正規化した、ＣＦＤＡ－ＳＥで標識された生標的細胞の数／ウェルとして算出した。標的細胞生存率のパーセンテージは、任意の実験条件における生存標的細胞数と、無抗体対照条件における生存標的細胞数（ＰＢＭＣのみの存在下での標的細胞）との比として求めた。
【0307】
このように報告された各実験条件における標的細胞に対する細胞傷害性のパーセンテージは、１００から生存率パーセント（上述のようにして算出）を差し引いたものとして求められた。
【0308】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現
ＣＤ２５（後期活性化Ｔ細胞のマーカー）の上方調節は、生の、ＣＤ２＋、及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞上でゲートすることによって評価した。ＣＤ４又はＣＤ８のいずれかを発現する全Ｔ細胞のうち、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞のパーセンテージを報告した。
ＣＤ２５（後期活性化Ｔ細胞のマーカー）の上方調節は、生の、ＣＤ２＋、及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞上でゲートすることによって評価した。ＣＤ４又はＣＤ８のいずれかを発現する全Ｔ細胞のうち、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞のパーセンテージを報告した。
【0309】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖
一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、全ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のうち分裂した細胞のパーセンテージを算出することにより、フローサイトメトリを用いて評価した。各細胞の蛍光強度は分裂ごとに２倍減少するので、Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで染色された細胞の蛍光強度を細胞分裂の読み出しとして使用した。
一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、全ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のうち分裂した細胞のパーセンテージを算出することにより、フローサイトメトリを用いて評価した。各細胞の蛍光強度は分裂ごとに２倍減少するので、Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで染色された細胞の蛍光強度を細胞分裂の読み出しとして使用した。
【0310】
サイトカイン放出分析
細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７Α）のレベルは、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ ＡｒｒａｙヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを製造業者の指示にしたがって使用して定量した。
細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７Α）のレベルは、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ ＡｒｒａｙヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを製造業者の指示にしたがって使用して定量した。
【0311】
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ Ｃｅｌｌ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓを使用したＤＬＢＣＬのインビボモデル
メスＮＳＧマウスをすべての実験で使用した。すべてのマウスにＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ Ｂ細胞リンパ腫細胞をＳＣ移植し、抗体をＩＰ投与した。試験期間中、週に数回キャリパーを使用して腫瘍成長を測定した。すべての実験について、マウスをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ標準的条件下で動物施設中に収容した。すべての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従い、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎで実施した。
メスＮＳＧマウスをすべての実験で使用した。すべてのマウスにＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ Ｂ細胞リンパ腫細胞をＳＣ移植し、抗体をＩＰ投与した。試験期間中、週に数回キャリパーを使用して腫瘍成長を測定した。すべての実験について、マウスをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ標準的条件下で動物施設中に収容した。すべての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従い、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎで実施した。
【0312】
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞培養条件及び腫瘍移植
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞株はＬｅｉｂｎｉｔｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ＤＳＭＺから入手し、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、及び１ｍＭのＨＥＰＥＳを追加した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中に維持した。
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞株はＬｅｉｂｎｉｔｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ＤＳＭＺから入手し、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、及び１ｍＭのＨＥＰＥＳを追加した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中に維持した。
【0313】
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（３×１０６細胞ｓ）を収集し、５×１０５ＰＢＭＣと混合し、ＰＢＳ及びＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌの１：１混合物中に再懸濁させた。メスのＮＳＧマウスの右脇腹に１００μｌの細胞混合物をＳＣ注射した。
【0314】
腫瘍測定のための抗体投与
被験物質又は対照を投与する前に、マウスを腫瘍量にしたがって階層化した群に割り当てた。
被験物質又は対照を投与する前に、マウスを腫瘍量にしたがって階層化した群に割り当てた。
【0315】
抗体（ＲＥＧＮ５８３７、ＲＥＧＮ１９７９、ＲＥＧＮ５６７１［非ＴＡＡｘＣＤ２８非架橋対照ｂｓＡｂ］、又はＨ４ｓＨ１７６６４Ｄ［非ＴＡＡｘＣＤ３非架橋対照ｂｓＡｂ］）を単剤療法として、又は組み合わせで、ＩＰ注射により、移植後１、８、及び１５日に、表３１に記載する用量で投与した。
表３１：腫瘍成長及び生存を評価するための実験設計
ａ一匹のマウスが実験の間に死亡し、除外した。
表３１：腫瘍成長及び生存を評価するための実験設計
【表31-1】
【表31-2】
【0316】
腫瘍測定及び指定されたエンドポイント
腫瘍成長は、腫瘍のキャリパー測定値Ｘ及び直径Ｙ（長さの垂直方向の測定値及び幅）を用いて経時的にモニタリングした。腫瘍体積を算出した（Ｘ＊Ｙ＊［Ｘ／２］、式中、Ｘは短径である）。腫瘍が指定の腫瘍エンドポイント（腫瘍直径＞２０ｍｍ又は腫瘍潰瘍）に達した時にマウスを安楽死させた。このエンドポイントはＩＡＣＵＣ基準に従うものであった。
腫瘍成長は、腫瘍のキャリパー測定値Ｘ及び直径Ｙ（長さの垂直方向の測定値及び幅）を用いて経時的にモニタリングした。腫瘍体積を算出した（Ｘ＊Ｙ＊［Ｘ／２］、式中、Ｘは短径である）。腫瘍が指定の腫瘍エンドポイント（腫瘍直径＞２０ｍｍ又は腫瘍潰瘍）に達した時にマウスを安楽死させた。このエンドポイントはＩＡＣＵＣ基準に従うものであった。
【0317】
腫瘍成長及び生存の統計的分析
腫瘍体積の経時的結果を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して解析し、続いてＴｕｋｅｙの事後試験を行って、多重比較を行った。経時的な生存率の結果を、全ての群でＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を用いて分析し、さらに各群ごとにＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を実施して比較した。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であるとみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して統計的解析を実施した。
腫瘍体積の経時的結果を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して解析し、続いてＴｕｋｅｙの事後試験を行って、多重比較を行った。経時的な生存率の結果を、全ての群でＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を用いて分析し、さらに各群ごとにＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を実施して比較した。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であるとみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して統計的解析を実施した。
【0318】
結果
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞に対するＴ細胞傷害性及びヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出を媒介するＲＥＧＮ１９７９の能力に対するＲＥＧＮ５８３７の効果
ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９を様々な濃度で組み合わせて試験して、すでに記載したように、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、及びヒトＰＢＭＣ由来のＴ細胞からのサイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。表３０は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、Ｔ細胞活性化、及びＴ細胞増殖に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を示す。サイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を示す２人のヒトドナーからの数値結果を表３２にまとめる。
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞に対するＴ細胞傷害性及びヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出を媒介するＲＥＧＮ１９７９の能力に対するＲＥＧＮ５８３７の効果
ＲＥＧＮ５８３７及びＲＥＧＮ１９７９を様々な濃度で組み合わせて試験して、すでに記載したように、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、及びヒトＰＢＭＣ由来のＴ細胞からのサイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を評価した。表３０は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、Ｔ細胞活性化、及びＴ細胞増殖に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を示す。サイトカイン放出に対するＲＥＧＮ５８３７の効果を示す２人のヒトドナーからの数値結果を表３２にまとめる。
【0319】
ＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害及びヒトＴ細胞増殖に対するＲＥＧＮ５８３７の効果
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、ＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化、並びにヒトＰＢＭＣ由来のヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＥＧＮ１９７９媒介性増殖を評価することによって、ＲＥＧＮ１９７９の効力（ＥＣ５０）及び有効性（最大応答）に対するＲＥＧＮ５８３７の濃度増加の効果を評価した。ＲＥＧＮ５８３７は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対する細胞傷害性、Ｔ細胞活性化（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現として測定）、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を媒介するＲＥＧＮ１９７９の可能性を濃度に依存して増強した。７７．２ｐＭ～１００ｎＭの範囲の濃度で、ＲＥＧＮ５８３７は標的細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞傷害性の可能性を増大させた；７７．２ｐＭ～２．７８ｎＭの範囲の濃度で、ＲＥＧＮ５８３７は、ＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化及び増殖の可能性を増大させたが、さらに高濃度のＲＥＧＮ５８３７はＲＥＧＮ１９７９の可能性をさらに増大させなかった。これらのデータを図１１のグラフ及び表３０に提示する。
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性細胞傷害、ＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化、並びにヒトＰＢＭＣ由来のヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＥＧＮ１９７９媒介性増殖を評価することによって、ＲＥＧＮ１９７９の効力（ＥＣ５０）及び有効性（最大応答）に対するＲＥＧＮ５８３７の濃度増加の効果を評価した。ＲＥＧＮ５８３７は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対する細胞傷害性、Ｔ細胞活性化（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現として測定）、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を媒介するＲＥＧＮ１９７９の可能性を濃度に依存して増強した。７７．２ｐＭ～１００ｎＭの範囲の濃度で、ＲＥＧＮ５８３７は標的細胞に対するＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞傷害性の可能性を増大させた；７７．２ｐＭ～２．７８ｎＭの範囲の濃度で、ＲＥＧＮ５８３７は、ＲＥＧＮ１９７９媒介性Ｔ細胞活性化及び増殖の可能性を増大させたが、さらに高濃度のＲＥＧＮ５８３７はＲＥＧＮ１９７９の可能性をさらに増大させなかった。これらのデータを図１１のグラフ及び表３０に提示する。
【0320】
ＲＥＧＮ５８３７の存在下でのヒトＰＢＭＣからのＲＥＧＮ１９７９媒介性サイトカイン放出
ヒトＰＢＭＣからのＲＥＧＮ１９７９媒介性サイトカイン放出の可能性及び最大応答に対するＲＥＧＮ５８３７の濃度増大の効果を評価した。ヒトＰＢＭＣ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の存在下で、ＲＥＧＮ５８３７の濃度を増大させることで、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７ＡのＲＥＧＮ１９７９媒介性放出の最大レベルが濃度に依存して増強された（図１２）。さらに、ＲＥＧＮ５８３７の濃度を増大させることで、ＲＥＧＮ１９７９がサイトカイン放出を媒介する可能性を増強する傾向が示された。ＲＥＧＮ１９７９によって媒介される、ＥＣ５０値、最大サイトカインレベル、及びバックグラウンドサイトカインレベルを上回る相対的増加（ＲＥＧＮ５８３７無し）を図１２及び表３２にまとめる。
表３２
有効量以下の量のＲＥＧＮ１９７９の存在下及び非存在下でのＲＥＧＮ５８３７投与の抗腫瘍有効性
ヒトＰＢＭＣからのＲＥＧＮ１９７９媒介性サイトカイン放出の可能性及び最大応答に対するＲＥＧＮ５８３７の濃度増大の効果を評価した。ヒトＰＢＭＣ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の存在下で、ＲＥＧＮ５８３７の濃度を増大させることで、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１７ＡのＲＥＧＮ１９７９媒介性放出の最大レベルが濃度に依存して増強された（図１２）。さらに、ＲＥＧＮ５８３７の濃度を増大させることで、ＲＥＧＮ１９７９がサイトカイン放出を媒介する可能性を増強する傾向が示された。ＲＥＧＮ１９７９によって媒介される、ＥＣ５０値、最大サイトカインレベル、及びバックグラウンドサイトカインレベルを上回る相対的増加（ＲＥＧＮ５８３７無し）を図１２及び表３２にまとめる。
表３２
【表32-1】
【表32-2】
【0321】
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍を有する免疫不全ＮＳＧマウスに、本明細書中で既に記載した抗体又は非架橋対照をＩＰ注射した。
【0322】
担癌マウスにおいて、０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の何れかの存在下で１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７を用いた治療の結果、第２８日（最終抗体投与後６日までに、非架橋対照ｂｓＡｂ（非ＴＡＡｘＣＤ２８及び非ＴＡＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂ）と比較して、腫瘍成長の統計的に有意な抑制がもたらされた（図１３Ａ及び１３Ｂ）。１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７及び０．４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の組み合わせの結果、第４６日までにＲＥＧＮ１９７９単剤療法と比べて腫瘍体積が有意に減少した。
【0323】
０．４及び４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９単剤療法はどちらも、第２８日までに非架橋対照と比べて低度の腫瘍抑制をもたらしたが、ＲＥＧＮ５８３７単剤療法は効果がなかった。投薬期間全体にわたって非架橋対照ｂｓＡｂを投与すると急速な腫瘍成長が観察され、すべてのマウスを第１２５日に安楽死させた。
【0324】
Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験により、すべての群にわたって生存において統計的有意差が検出された（ｐ＝０．０００１）、追加のＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を群ごとの比較のために実施した。非架橋対照抗体を投与されたマウス（生存無）と比較して、０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９の何れかと組み合わせて１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７を投与されたマウスについて、生存において有意な増加が観察された（それぞれ、８５％及び７０％生存）（図１４）。
【0325】
さらに、ＲＥＧＮ５８３７又はＲＥＧＮ１９７９いずれかの単剤療法を投与したマウスと比較して、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５８３７を０．４又は４ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１９７９のいずれかと組み合わせて施したマウスで、生存における有意な増加が観察された。
【0326】
本発明は本明細書中に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の記載事項と添付の図面とから当業者には明らかになるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ａ）ヒトＣＤ２８と結合する第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、
ｂ）標的腫瘍細胞上のヒトＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２)
前記第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）が、配列番号５７、配列番号５８、及び／又は配列番号５９の一つ以上のアミノ酸を含むヒトＣＤ２２上のエピトープと結合する、項目１に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目３)
前記二重特異性抗原結合分子が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して約１５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２２と結合する、項目１又は２に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目４)
前記二重特異性抗原結合分子が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して約６０μＭ未満のＫＤでＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＣＤ２２と結合する、項目１～３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目５)
前記二重特異性抗原結合分子が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して約４５μＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２８と結合する、項目１～４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目６)
前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイによって測定して、約１×１０－８Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＣＤ２８を発現する細胞の前記表面と結合する、項目１～５のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目７)
前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイによって測定して、約１×１０－８Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＣＤ２２を発現する細胞の前記表面と結合する、項目１～６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目８)
前記二重特異性抗原結合分子が、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体と併用した場合に共刺激効果を示す、項目１～７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目９)
前記共刺激効果が：（Ｔ細胞を活性化すること、ＩＬ－２放出を誘導すること、ヒトＰＢＭＣにおいてＣＤ２５＋上方調節を誘導すること；及びＣＤ２２発現細胞株に関するヒトＴ細胞媒介性細胞傷害を増大させること、の一つ以上である、項目８に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１０)
前記第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）が：
ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）と、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）と、
を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１１)
ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む、項目１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１２)
ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、項目１２に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１３)
前記第一抗原結合ドメインが：
ａ）ＨＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）であって、配列番号２８、３０、及び３２の前記アミノ酸配列を含むセットと、ＬＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）であって、配列番号１２、１４、及び１６の前記アミノ酸配列を含むセットと、
を含む、項目１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１４)
前記第一抗原結合ドメインが、配列番号２６／１０の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、項目１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１５)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）配列番号２及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含まれる三つのＨＣＤＲと、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含まれる三つのＬＣＤＲと、
を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１６)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）配列番号４及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号８及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含む、項目１５に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１７)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、項目１６に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１８)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）ＨＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）であって、配列番号４、６、８；及び２０、２２、２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセットと、ＬＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）であって、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むセットと、
を含む、項目１７に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１９)
ａ）配列番号２８、３０、３２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲと、を含む第一抗原結合ドメインと、
ｂ）配列番号４、６、８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲと、を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２０)
ａ）配列番号２８、３０、３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲとを含む第一抗原結合ドメインと、
ｂ）配列番号２０、２２、２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲと、を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２１)
ａ）配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第一抗原結合ドメインと、
ｂ）配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２２)
ａ）前記第一抗原結合ドメインが、配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含み；
ｂ）前記第二抗原結合ドメインが、配列番号１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２３)
ＣＤ２２に対する結合について競合するか、又は参考抗体と同じ、ＣＤ２２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参考抗体が、前記配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第一抗原結合ドメインと、配列番号２／１０の又は１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第二抗原結合ドメインと、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２４)
ヒトＣＤ２８に対する結合について競合するか、又は参考抗体と同じ、ヒトＣＤ２８上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参考抗体が、配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第一抗原結合ドメインと、配列番号２／１０又は１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第二抗原結合ドメインと、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２５)
項目１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬剤的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
(項目２６)
項目１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコード化するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
(項目２７)
項目２６に記載の核酸を含む発現ベクター。
(項目２８)
項目２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目２９)
対象におけるＢ細胞増殖障害を阻害する方法であって、項目１～２４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又は項目２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象における前記Ｂ細胞リンパ腫の成長を阻害することを含む、方法。(項目３０)
第二の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記第二の治療薬が、抗腫瘍剤、放射線治療、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤とコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はその組み合わせを含む、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
Ｂ細胞増殖性障害、又は別のＣＤ２２発現細胞悪性腫瘍に罹っている患者を治療する方法であって、項目１～２４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又は項目２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによってＢ細胞リンパ腫又は別のＣＤ－２２発現細胞悪性腫瘍に罹っている前記患者を治療することを含む、方法。
(項目３３)
第二の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記第二の治療薬が、抗腫瘍剤、放射線治療、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤とコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はその組み合わせを含む、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記第二の治療薬が、前記同じ腫瘍標的抗原と結合する第一抗原結合ドメインと、Ｔ細胞上のＣＤ３と結合する第二抗原結合ドメインとを含む、異なる二重特異性抗体である、項目３１又は３４のいずれか一項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ａ）ヒトＣＤ２８と結合する第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、
ｂ）標的腫瘍細胞上のヒトＣＤ２２と特異的に結合する第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２)
前記第二抗原結合ドメイン（Ｄ２）が、配列番号５７、配列番号５８、及び／又は配列番号５９の一つ以上のアミノ酸を含むヒトＣＤ２２上のエピトープと結合する、項目１に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目３)
前記二重特異性抗原結合分子が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して約１５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２２と結合する、項目１又は２に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目４)
前記二重特異性抗原結合分子が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して約６０μＭ未満のＫＤでＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＣＤ２２と結合する、項目１～３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目５)
前記二重特異性抗原結合分子が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって測定して約４５μＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２８と結合する、項目１～４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目６)
前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイによって測定して、約１×１０－８Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＣＤ２８を発現する細胞の前記表面と結合する、項目１～５のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目７)
前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイによって測定して、約１×１０－８Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＣＤ２２を発現する細胞の前記表面と結合する、項目１～６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目８)
前記二重特異性抗原結合分子が、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体と併用した場合に共刺激効果を示す、項目１～７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目９)
前記共刺激効果が：（Ｔ細胞を活性化すること、ＩＬ－２放出を誘導すること、ヒトＰＢＭＣにおいてＣＤ２５＋上方調節を誘導すること；及びＣＤ２２発現細胞株に関するヒトＴ細胞媒介性細胞傷害を増大させること、の一つ以上である、項目８に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１０)
前記第一抗原結合ドメイン（Ｄ１）が：
ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）と、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）と、
を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１１)
ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む、項目１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１２)
ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、項目１２に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１３)
前記第一抗原結合ドメインが：
ａ）ＨＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）であって、配列番号２８、３０、及び３２の前記アミノ酸配列を含むセットと、ＬＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）であって、配列番号１２、１４、及び１６の前記アミノ酸配列を含むセットと、
を含む、項目１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１４)
前記第一抗原結合ドメインが、配列番号２６／１０の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、項目１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１５)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）配列番号２及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含まれる三つのＨＣＤＲと、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含まれる三つのＬＣＤＲと、
を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１６)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）配列番号４及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号８及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含む、項目１５に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１７)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、項目１６に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１８)
前記第二抗原結合ドメインが：
ａ）ＨＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）であって、配列番号４、６、８；及び２０、２２、２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセットと、ＬＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）であって、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むセットと、
を含む、項目１７に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目１９)
ａ）配列番号２８、３０、３２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲと、を含む第一抗原結合ドメインと、
ｂ）配列番号４、６、８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲと、を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２０)
ａ）配列番号２８、３０、３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲとを含む第一抗原結合ドメインと、
ｂ）配列番号２０、２２、２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲと、配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲと、を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２１)
ａ）配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第一抗原結合ドメインと、
ｂ）配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第二抗原結合ドメインと、
を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２２)
ａ）前記第一抗原結合ドメインが、配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含み；
ｂ）前記第二抗原結合ドメインが、配列番号１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２３)
ＣＤ２２に対する結合について競合するか、又は参考抗体と同じ、ＣＤ２２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参考抗体が、前記配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第一抗原結合ドメインと、配列番号２／１０の又は１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第二抗原結合ドメインと、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２４)
ヒトＣＤ２８に対する結合について競合するか、又は参考抗体と同じ、ヒトＣＤ２８上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参考抗体が、配列番号２６／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第一抗原結合ドメインと、配列番号２／１０又は１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第二抗原結合ドメインと、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
(項目２５)
項目１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬剤的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
(項目２６)
項目１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコード化するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
(項目２７)
項目２６に記載の核酸を含む発現ベクター。
(項目２８)
項目２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目２９)
対象におけるＢ細胞増殖障害を阻害する方法であって、項目１～２４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又は項目２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象における前記Ｂ細胞リンパ腫の成長を阻害することを含む、方法。(項目３０)
第二の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記第二の治療薬が、抗腫瘍剤、放射線治療、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤とコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はその組み合わせを含む、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
Ｂ細胞増殖性障害、又は別のＣＤ２２発現細胞悪性腫瘍に罹っている患者を治療する方法であって、項目１～２４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体又は項目２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによってＢ細胞リンパ腫又は別のＣＤ－２２発現細胞悪性腫瘍に罹っている前記患者を治療することを含む、方法。
(項目３３)
第二の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記第二の治療薬が、抗腫瘍剤、放射線治療、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤とコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はその組み合わせを含む、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記第二の治療薬が、前記同じ腫瘍標的抗原と結合する第一抗原結合ドメインと、Ｔ細胞上のＣＤ３と結合する第二抗原結合ドメインとを含む、異なる二重特異性抗体である、項目３１又は３４のいずれか一項に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】