知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ セルラー・バイオメディシン・グループ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-19
(45)【発行日】2025-02-28
(54)【発明の名称】ＲＮＡウイルスベクターの力価決定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20250220BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20250220BHJP
C12N 15/49 20060101ALN20250220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
C12Q1/06 ZNA
C12N15/49
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2023514828
(86)(22)【出願日】2021-09-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-25
(86)【国際出願番号】 US2021049110
(87)【国際公開番号】W WO2022051648
(87)【国際公開日】2022-03-10
【審査請求日】2023-11-06
(31)【優先権主張番号】202010922956.2
(32)【優先日】2020-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522043220
【氏名又は名称】アベルゼータ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ゼファ
(72)【発明者】
【氏名】リー，リー
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ハニング
(72)【発明者】
【氏名】カオ，イーラン
(72)【発明者】
【氏名】ハン，ティン
(72)【発明者】
【氏名】ルー，ジシュン
(72)【発明者】
【氏名】ホン，イー
(72)【発明者】
【氏名】チャン，リー
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５２００７５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のＲＮＡウイルスベクターの力価を決定する方法であって、（ａ）ＲＮＡウイルスベクターおよびＤＮＡ分子を含む試料を提供する、またはＲＮＡウイルスベクターを含む試料にＤＮＡ分子を添加する工程であって、前記ＲＮＡウイルスベクターおよび前記ＤＮＡ分子の両方が配列要素を含む工程；
（ｂ）前記試料から第１の部分および第２の部分を得る工程；および
（ｃ）前記第１の部分に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、前記第１の部分における前記配列要素のコピー数（ｎ１）を決定し、前記第２の部分に対して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を実施して、前記第２の部分における前記配列要素のコピー数（ｎ２）を決定する工程であって、前記試料中の前記ＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数が、ｎ１とｎ２との差、すなわちｎ２－ｎ１によって決定される工程を含む、方法。
【請求項2】
前記試料中の前記ＲＮＡウイルスベクターの前記ＲＮＡコピー数に基づいて前記ＲＮＡウイルスベクターの感染力価を決定する工程（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＡウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記配列要素が調節要素である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記調節要素がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記配列要素が、長い末端反復（ＬＴＲ）またはプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ＰＣＲが、プライマー対を使用して前記配列要素の領域を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＲＴ－ＰＣＲが、プライマー対を使用して前記配列要素の領域を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＰＣＲおよび前記ＲＴ－ＰＣＲが、それぞれプライマー対を使用して前記配列要素の領域を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記プライマー対が、（ｉ）配列番号１および配列番号２、それぞれ；（ｉｉ）配列番号３および配列番号４、それぞれ；または（ｉｉｉ）配列番号５および配列番号６、それぞれに示されるヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを含む、請求項８～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記ＰＣＲが定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり、前記ＲＴ－ＰＣＲがＲＴ－ｑＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記力価が物理的力価または感染力価である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記ＤＮＡ分子がＤＮＡプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ＤＮＡプラスミドがパッケージングプラスミドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ＲＮＡウイルスベクターの前記感染力価が、（前記ＲＮＡウイルスベクターの前記ＲＮＡコピー数×陽性対照の感染力価）／前記陽性対照のＲＮＡコピー数によって決定され、前記陽性対照は、既知の感染力価を有するＲＮＡウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項17】
前記ＲＮＡウイルスベクターの前記力価が２時間以内に決定される、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月４日に出願された中国特許出願第２０２０１０９２２９５６２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年９月４日に出願された中国特許出願第２０２０１０９２２９５６２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年９月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１２９９－００９９４１－ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、２ＫＢのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年９月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１２９９－００９９４１－ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、２ＫＢのサイズである。
【0003】
本開示は、レンチウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスベクターの力価を迅速に決定する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
遺伝子治療は、外因性治療用遺伝子を標的細胞へ導入して、遺伝子の欠陥または異常によって引き起こされる疾患を矯正または補正することを指す。あるいは、外因性遺伝子によって発現される産物は、治療標的において治療のために作用することができる。
【0005】
外因性遺伝子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介して形質導入または送達され得る。一般的に使用される非ウイルスベクターには、リポソーム、デンドリマー、非天然カチオン性ポリマー、天然多糖類などが含まれる。非ウイルス遺伝子送達ベクターは比較的安全で安定であるが、それらのトランスフェクション効率は通常低い。ウイルスベクターは、外来遺伝子を天然ウイルスのキャプシドにパッケージングし、ウイルスの感染力を使用して外来遺伝子を細胞に導入することができる。一般的なウイルスベクターには、レトロウイルス（組換えレトロウイルス、ｒＲＶ）、組換えレンチウイルス（ｒＬＶ）、アデノウイルス（組換えアデノウイルス、ｒＡｄ）、およびアデノ随伴ウイルス（組換えアデノ随伴ウイルス、ｒＡＡＶ）が含まれる。ウイルスベクターの形質導入効率は、非ウイルスベクターの形質導入効率よりもはるかに高い。したがって、ウイルスベクターは、リンパ球などの感染しにくい標的細胞を感染させるのに特に適している。
【0006】
組換えレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１（ヒト免疫不全Ｉ型ウイルス）に基づくことができる。他のレトロウイルスベクターとは異なり、レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。組換えレンチウイルスベクターは、生物学的力価が高く、インビボおよびインビトロでの免疫原性が低いので、ＣＡＲ－Ｔ細胞および遺伝子治療のための第一選択のトランスジェニックベクターになっている。
【0007】
現在、組換えレンチウイルスベクターの力価を決定するための最も一般的なアッセイには、ｐ２４ Ｅｌｉｓａ法および機能的力価定量法が含まれる。ｐ２４ Ｅｌｉｓａ法は結果を得るのに１日かかるが、後者は少なくとも７日を必要とし、非特異的であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、レンチウイルスベクターの力価を迅速に評価するための方法を開発する緊急の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示は、試料中のＲＮＡウイルスベクターの力価を決定する方法を提供する。方法は、（ａ）ＲＮＡウイルスベクターおよびＤＮＡ分子を含む試料を提供する、またはＲＮＡウイルスベクターを含む試料にＤＮＡ分子を添加する工程であって、ＲＮＡウイルスベクターとＤＮＡ分子の両方が配列要素を含む工程；（ｂ）試料から第１の部分および第２の部分を得る工程；および（ｃ）第１の部分に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、第１の部分における配列要素のコピー数（ｎ１）を決定し、第２の部分に対して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を実施して、第２の部分における配列要素のコピー数（ｎ２）を決定する工程であって、試料中のＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数が、ｎ１とｎ２との差、すなわちｎ２－ｎ１によって決定される工程を含む。
【0010】
方法は、試料中のＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数に基づいてＲＮＡウイルスベクターの感染力価を決定する工程（ｄ）をさらに含み得る。
【0011】
方法は、試料中のＲＮＡコピー数に基づいてＲＮＡウイルスベクターの力価を決定する工程（ｄ）をさらに含み得る。
【0012】
ＲＮＡウイルスベクターは、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターであり得る。
【0013】
配列要素は、調節要素、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）であり得る。
【0014】
配列要素は、長い末端反復（ＬＴＲ）またはプロモーターであり得る。
【0015】
ＰＣＲは、プライマー対を使用して配列要素の領域を増幅することができる。ＲＴ－ＰＣＲは、プライマー対を使用して配列要素の領域を増幅することができる。
【0016】
ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲは、プライマー対を使用して、それぞれ配列要素の領域を増幅することができる。
【0017】
プライマー対は、（ｉ）配列番号１および配列番号２、それぞれ；（ｉｉ）配列番号３および配列番号４、それぞれ；または（ｉｉｉ）配列番号５および配列番号６、それぞれに示されるヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを含み得る。
【0018】
ＰＣＲは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり得る。ＲＴ－ＰＣＲは、ＲＴ－ｑＰＣＲ（リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ）であり得る。
【0019】
ＤＮＡ分子はＤＮＡプラスミドであり得る。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、パッケージングプラスミド、エンベローププラスミド、および／またはトランスファープラスミドである。
【0020】
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスベクターの感染力価は、（ＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数×陽性対照の感染力価）／陽性対照のＲＮＡコピー数によって決定され、陽性対照は、既知の感染力価を有するＲＮＡウイルスベクターである。
【0021】
ＲＮＡウイルスベクターの力価は、２時間以内に決定され得る。
【0022】
力価は、物理的力価または感染力価であり得る。
【0023】
本開示は、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を迅速に決定する方法を提供する。
【0024】
本開示の第１の態様は、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価（例えば、感染力価または物理的力価）を迅速に決定する方法を提供し、方法は、 （ａ）試験される試料であって、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）およびＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）を含む試料を提供する工程；
（ｂ）試料中の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のコピー数であって、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含有するＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数および配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含有するＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）のコピー数を含む配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のコピー数を得るために、試料に対してＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ反応をそれぞれ実行する工程；および
（ｃ）試料中の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含有するＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数に基づいてＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を決定する工程を含む。
（ｂ）試料中の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のコピー数であって、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含有するＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数および配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含有するＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）のコピー数を含む配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のコピー数を得るために、試料に対してＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ反応をそれぞれ実行する工程；および
（ｃ）試料中の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含有するＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数に基づいてＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を決定する工程を含む。
【0025】
一実施形態では、試料中の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数は、以下の式：配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数と、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）のコピー数との合計コピー数－配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）のコピー数、を使用して計算することができる。合計コピー数がＲＴ－ＰＣＲを用いて得られるのに対して、ＤＮＡ分子のコピー数はＰＣＲを用いて得られる。
【0026】
記号「－」は、差分を得るための減算を指す。
【0027】
一実施形態では、工程（ｃ）における「ＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数に基づいて」は、式Ｑ１を使用して計算を実行してＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を得ることを含む。
【0028】
Ｑ１＝（試料中のウイルスベクターＲＮＡのコピー数＊陽性対照の力価）／陽性対照中のウイルスベクターＲＮＡのコピー数
陽性対照は、既知の力価（例えば、感染力価または物理的力価）を有するＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を指す。陽性対照の力価および陽性対照のＲＮＡコピー数をアッセイする方法は、試験される試料のそれらをアッセイする方法と同じであってもよい。
陽性対照は、既知の力価（例えば、感染力価または物理的力価）を有するＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を指す。陽性対照の力価および陽性対照のＲＮＡコピー数をアッセイする方法は、試験される試料のそれらをアッセイする方法と同じであってもよい。
【0029】
試験される試料中のＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数は、以下の式：配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数と、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）のコピー数との合計コピー数－配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）のコピー数、を用いて得られ得る。合計コピー数がＲＴ－ＰＣＲを用いて得られるのに対して、ＤＮＡ分子のコピー数はＰＣＲを用いて得られる。
【0030】
一実施形態では、力価は感染力価または機能的力価である。別の実施形態では、力価は物理的力価である。
【0031】
特定の実施形態では、試験される試料は、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）パッケージング上清、精製中間産物、またはＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の研究開発および製造プロセスにおける最終産物からのものであるか、またはそれらに由来する。
【0032】
一実施形態では、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲまたはｑＰＣＲを含む。定量ＰＣＲは、例えば、ＳＹＢＲ緑色色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する。ｑＰＣＲは、レポーターとして二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いるリアルタイムＰＣＲであり得る（非特異的検出）。１つの実施形態において、ＰＣＲは、ＳＹＢＲ緑色色素を使用する定量ＰＣＲである。ｑＰＣＲは、蛍光レポータープローブ法を用いたリアルタイムＰＣＲであり得る（特異的検出）。一実施形態では、ＰＣＲはＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲである。
【0033】
特定の実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲは、本明細書中に記載されるＲＴ－ｑＰＣＲと同様であり得る。
【0034】
一実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ反応において、プライマー対（例えば、上流プライマーおよび下流プライマー）を使用して、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）およびＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）上の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を特異的に増幅し、それによってＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）およびＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）上の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を特異的に増幅するためのサイクル閾値（Ｃｔ）値を得る。
【0035】
一実施形態において、上流プライマーおよび下流プライマーは、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲにおいて配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を増幅するために使用される。
【0036】
特定の実施形態において、上流プライマーおよび下流プライマーは、以下に示される通りである。
【0037】
プライマー対１：
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号１）；
下流プライマー：ａｃａａｃａｃｃａｃｇｇａａｔｔｇｔｃａ（配列番号２）。
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号１）；
下流プライマー：ａｃａａｃａｃｃａｃｇｇａａｔｔｇｔｃａ（配列番号２）。
【0038】
プライマー対２：
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号３）；
下流プライマー：ｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｃｇａｃａａｃａｃ（配列番号４）。
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号３）；
下流プライマー：ｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｃｇａｃａａｃａｃ（配列番号４）。
【0039】
プライマー対３：
上流プライマー：ｇｔｇｔｔｇｔｃｇｇｇｇａａａｔｃａｔｃ（配列番号５）；
下流プライマー：ｇａｇａｔｃｃｇａｃｔｃｇｔｃｔｇａｇｇ（配列番号６）。
上流プライマー：ｇｔｇｔｔｇｔｃｇｇｇｇａａａｔｃａｔｃ（配列番号５）；
下流プライマー：ｇａｇａｔｃｃｇａｃｔｃｇｔｃｔｇａｇｇ（配列番号６）。
【0040】
一実施形態では、ＰＣＲ反応において、プライマー対（例えば、上流プライマーおよび下流プライマー）を使用して、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）上の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を特異的に増幅し、それによってＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）上の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を特異的に増幅するためのＣｔ値を得る。
【0041】
特定の実施形態において、上流プライマーおよび下流プライマーは、以下に示される通りである。
【0042】
プライマー対１：
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号１）；
下流プライマー：ａｃａａｃａｃｃａｃｇｇａａｔｔｇｔｃａ（配列番号２）。
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号１）；
下流プライマー：ａｃａａｃａｃｃａｃｇｇａａｔｔｇｔｃａ（配列番号２）。
【0043】
プライマー対２：
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号３）；
下流プライマー：ｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｃｇａｃａａｃａｃ（配列番号４）。
上流プライマー：ａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃ（配列番号３）；
下流プライマー：ｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｃｇａｃａａｃａｃ（配列番号４）。
【0044】
プライマー対３：
上流プライマー：ｇｔｇｔｔｇｔｃｇｇｇｇａａａｔｃａｔｃ（配列番号５）；
下流プライマー：ｇａｇａｔｃｃｇａｃｔｃｇｔｃｔｇａｇｇ（配列番号６）。
上流プライマー：ｇｔｇｔｔｇｔｃｇｇｇｇａａａｔｃａｔｃ（配列番号５）；
下流プライマー：ｇａｇａｔｃｃｇａｃｔｃｇｔｃｔｇａｇｇ（配列番号６）。
【0045】
一実施形態では、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）の特異的増幅のＣｔ値に基づいて、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数が得られる。
【0046】
特定の実施形態では、ＰＣＲ後に得られる配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のコピー数は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数と同一（または実質的に同一）である。
【0047】
特定の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ後に得られる配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のコピー数は、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数およびＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数の合計と同一（または実質的に同一）である。
【0048】
一実施形態では、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）およびＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）上の配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）の特異的増幅のＣｔ値を使用して、式Ｑ２を使用してＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）ＲＮＡおよびＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）の合計コピー数を計算する。
【0049】
Ｑ２＝ＲＮＡおよび／またはＤＮＡのコピー数＝（各反応ウェルにおける試料の核酸のコピー数×１０００×希釈係数）／各反応ウェルに添加された試料の量。
【0050】
各反応ウェル中の試料の核酸のコピー数＝１０＾（ａＸ＋ｂ）、式中、Ｘは試料のＣｔ値の平均であり、ａは、標準曲線フィッティングによって得られた係数であり、ｂは、標準曲線フィッティングによって得られた切片である。
【0051】
一実施形態では、（ｉ）ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）ＲＮＡおよびＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）の合計コピー数、ならびに（ｉｉ）ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数に基づいて、式Ｑ３を使用して、試験される試料中のＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）ＲＮＡのコピー数を計算する。
【0052】
Ｑ３＝ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）ＲＮＡおよびＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）の合計コピー数－ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数。
【0053】
一実施形態において、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を特異的に増幅するために使用される上流および下流プライマーは、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の検出キットからのものである。
【0054】
一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、パッケージングプラスミドであるか、またはそれに由来する。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、エンベローププラスミドであるか、またはそれに由来する。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、トランスファープラスミドであるか、またはそれに由来する。
【0055】
一実施形態では、方法はまた、陽性対照を使用する。
【0056】
一実施形態では、方法は、非診断的かつ非治療的方法である。
【0057】
一実施形態では、方法はインビトロ法である。
【0058】
一実施形態では、試験される試料中のＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の濃度は、５×１０５～５×１０９形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）、１×１０６～８×１０８ＴＵ／ｍｌ、または５×１０６～５×１０８ＴＵ／ｍｌである。
【0059】
本開示の範囲内で、上記の技術的特徴および以下に具体的に記載される技術的特徴（実施形態など）を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】レンチウイルス標準（既知のコピー数を有する；左パネル）および試料（右パネル）の段階的希釈物の調製プロセスを示す。左パネルにおいて、キットによって提供されたレンチウイルス標準は、５×１０８コピー／μｌの濃度を有した。最初に、２μｌの５×１０８コピー／μｌレンチウイルス標準を清潔なＥＰチューブに移し、次いで１８μｌのＥＡＳＹ希釈緩衝液を添加し、十分に混合した。次いで、３μｌの混合溶液（５×１０７コピー／μｌの濃度を有する）を２７μｌのＥＡＳＹ希釈緩衝液に添加し、十分に混合した。上記の手順に従って、５つのレンチウイルス標準濃度を調製した。ＮＴＣはＥＡＳＹ希釈緩衝液のみであった。右側のパネルは、試験される試料の希釈プロセスを示す。
【図2】ｑＰＣＲのパラメータであり、温度および時間設定を示している。
【図3】レンチウイルス標準の段階的続希釈試料から得られたＣｔ平均値をｘ軸、レンチウイルス標準の対応するコピー数の対数（底１０）をｙ軸としてプロットした標準曲線である。計算式：ｙ＝－０．５８８３ｘ＋１０．９７、Ｒ２＝０．９９９９を得た。この式から、この検出方法では、レンチウイルスＲＮＡコピー数の対数値が、対応するＣｔ値と良好な線形相関を有していたことが分かる。試験方法は安定で信頼性があった。標準曲線は、レンチウイルス試料のコピー数を計算するために使用することができる。
【図4】本明細書に記載の上流および下流プライマーを使用した、ＷＰＲＥ要素およびプラスミドＤＮＡの特異的増幅によって得られた産物の解離曲線である。解離曲線はただ１つの鋭いピークを有し、プライマーが良好な特異性を有することを示している。
【図5】リアルタイム定量ＰＣＲ反応の増幅曲線である。増幅曲線は、類似／同一の勾配を有し、実質的に平行であり、プライマーの一貫した効率を示している。反応ウェルでＰＣＲを阻害する汚染はなかった（ＮＴＣ曲線を除く）。
【図6】反応チューブ（ＲＴ－ＰＣＲ）および対照チューブ（ＰＣＲ）のセットアップであり、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ反応がそれぞれ行われる。核酸のコピー数は、絶対定量によって算出することができる。反応チューブ（ＲＴ－ＰＣＲ）内の試料の核酸コピー数（ＲＮＡ＋ＤＮＡ）をｎ２（核酸の総コピー数）と表記する。対照チューブ内の核酸（ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ）のコピー数はｎ１（ＤＮＡのコピー数）と表記され、ｎ２－ｎ１＝ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数である。
【発明を実施するための形態】
【0061】
本開示は、試料中のＲＮＡウイルスベクターの力価を決定する方法を提供する。方法は、（ａ）ＲＮＡウイルスベクターおよびＤＮＡ分子を含む試料を提供する、またはＲＮＡウイルスベクターを含む試料にＤＮＡ分子を添加する工程であって、ＲＮＡウイルスベクターとＤＮＡ分子の両方が配列要素を含む工程；（ｂ）試料から第１の部分および第２の部分を得る工程；および（ｃ）第１の部分に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、第１の部分における配列要素のコピー数（ｎ１）を決定し、第２の部分に対して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を実施して、第２の部分における配列要素のコピー数（ｎ２）を決定する工程であって、試料中のＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数が、ｎ１とｎ２との差、すなわちｎ２－ｎ１によって決定される工程を含む。
【0062】
方法は、試料中のＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数に基づいてＲＮＡウイルスベクターの感染力価を決定する工程（ｄ）をさらに含み得る。
【0063】
方法は、試料中のＲＮＡコピー数に基づいてＲＮＡウイルスベクターの力価を決定する工程（ｄ）をさらに含み得る。
【0064】
ＲＮＡウイルスベクターは、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターであり得る。
【0065】
配列要素は、調節要素、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）であり得る。
【0066】
配列要素は、長い末端反復（ＬＴＲ）またはプロモーターであり得る。
【0067】
ＰＣＲは、プライマー対を使用して配列要素の領域を増幅することができる。ＲＴ－ＰＣＲは、プライマー対を使用して配列要素の領域を増幅することができる。
【0068】
ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲは、プライマー対を使用して、それぞれ配列要素の領域を増幅することができる。
【0069】
プライマー対は、（ｉ）配列番号１および配列番号２、それぞれ；（ｉｉ）配列番号３および配列番号４、それぞれ；または（ｉｉｉ）配列番号５および配列番号６、それぞれに示されるヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを含み得る。
【0070】
ＰＣＲは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり得る。ＲＴ－ＰＣＲは、ＲＴ－ｑＰＣＲであり得る。
【0071】
ＤＮＡ分子はＤＮＡプラスミドであり得る。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、パッケージングプラスミド、エンベローププラスミド、および／またはトランスファープラスミドである。
【0072】
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスベクターの感染力価は、（ＲＮＡウイルスベクターのＲＮＡコピー数×陽性対照の感染力価）／陽性対照のＲＮＡコピー数によって決定され、陽性対照は、既知の感染力価を有するＲＮＡウイルスベクターである。
【0073】
ＲＮＡウイルスベクターの力価は、２時間以内に決定され得る。
【0074】
力価は、物理的力価または感染力価であり得る。
【0075】
物理的力価は、試料中のウイルス粒子の量を測定し、ウイルス核酸またはウイルスタンパク質、例えばｐ２４の存在に基づいてもよい。機能的力価または感染力価は、作製されたウイルス粒子のうちどれだけが実際に細胞に感染し得るかを測定する。感染力価についてのアッセイは、標的細胞株にウイルスを感染させること、および遺伝子の発現についてアッセイすること、または標的細胞のゲノムに組み込まれたウイルスコピーの数を定量することを含み得る。
【0076】
特定の実施形態において、物理的力価は、ウイルスＲＮＡコピー数に基づいて評価され得る。一実施形態では、物理的力価は、１ｍｌまたは１μｌ当たりのウイルスＲＮＡコピー数である。物理的力価は、定量ＰＣＲによって、例えばＳＹＢＲ緑色色素を使用して、またはＴａｑＭａｎ ＰＣＲによって決定することができる。１ｍｌ試料中のウイルスゲノムコピー数は、例えば既知のコピー数を有する標準核酸（例えば、ＲＮＡ標準、レンチウイルス標準などのＲＮＡウイルス標準）の段階的希釈から生成された標準曲線から計算することができる。
【0077】
特定の実施形態では、感染力価は、プロウイルス組み込み力価アッセイによって決定された感染単位に基づいて決定され得る。例えば、感染力価は、ＲＮＡウイルスベクターの段階的希釈を用いた細胞の形質導入、および細胞あたりの組み込みベクターのコピーの、定量ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）による計算を通して決定され得る。
【0078】
特定の実施形態では、バイオセーフティの理由から、ＲＮＡウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスゲノム）は修飾されており、シスおよびトランス作用性ウイルス配列は、３～４個の異なるプラスミドにわたって分離されている。例えば、ウイルスの構造タンパク質および機能タンパク質は、トランスで提供され得、１つまたは２つのパッケージングプラスミドによってコードされる一方、エンベローププラスミドは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ（ＶＳＶ－Ｇ）の糖タンパク質をコードし、トランスファープラスミドは、ＲＮＡゲノムのパッケージングに必要なすべてのシス作用性ウイルス配列に隣接する目的の導入遺伝子をコードする。レンチウイルスベクターの作製は、高濃度の種々のプラスミドを使用して、細胞、例えばヒト胎児腎臓（２９３Ｔ）細胞の一過性トランスフェクションによって達成され得、これは、濃縮後でも、ベクター調製物中に残留プラスミドＤＮＡが存在することを意味する。
【0079】
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）試料はまた、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）を含有し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）試料はまた、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）を含有しない。
【0080】
特定の実施形態では、方法は、ＲＮＡウイルスベクターを含む試料にＤＮＡ分子を添加することを含み得る。試料に添加される場合、ＤＮＡ分子は、約１０２コピー／μｌ～約１０８コピー／μｌ、約１０３コピー／μｌ～約１０８コピー／μｌ、約１０４コピー／μｌ～約１０８コピー／μｌ、約１０５コピー／μｌ～約１０８コピー／μｌ、約１０６コピー／μｌ～約１０８コピー／μｌ、約１０３コピー／μｌ～約１０７コピー／μｌ、約１０４コピー／μｌ～約１０７コピー／μｌ、約１０５コピー／μｌ～約１０７コピー／μｌ、約１０６コピー／μｌ～約１０７コピー／μｌ、約１０３コピー／μｌ～約１０６コピー／μｌ、約１０４コピー／μｌ～約１０６コピー／μｌ、約１０５コピー／μｌ～約１０６コピー／μｌ、約１０２コピー／μｌ～約１０３コピー／μｌ、約１０２コピー／μｌ～約１０４コピー／μｌ、約１０２コピー／μｌ～約１０５コピー／μｌ、約１０２コピー／μｌ～約１０６コピー／μｌ、約１０３コピー／μｌ～約１０４コピー／μｌ、約１０３コピー／μｌ～約１０５コピー／μｌ、約１０３コピー／μｌ～約１０６コピー／μｌ、約１０４コピー／μｌ～約１０７コピー／μｌ、約１０４コピー／μｌ～約１０６コピー／μｌ、約１０４コピー／μｌ～約１０５コピー／μｌの範囲の濃度を有し得る。
【0081】
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスベクターの力価（感染力価または物理的力価）は、（試料中のＲＮＡコピー数＊陽性対照の力価）／陽性対照のＲＮＡコピー数に等しく、式中、陽性対照は、既知の力価（感染力価または物理的力価）を有するＲＮＡウイルスベクターである。記号「＊」は、乗算を指す。記号「／」は、除算を指す。
【0082】
本開示は、試料中のＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）および遊離プラスミドＤＮＡを含む試料を提供すること；（ｂ）試料に対してＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ反応をそれぞれ行って、ＷＰＲＥ要素を含有するレンチウイルスベクターＲＮＡのコピー数およびＷＰＲＥ要素を含有する遊離プラスミドＤＮＡのコピー数を含む、試料中のＷＰＲＥ要素のコピー数を得ること；ならびに（ｃ）レンチウイルスベクターＲＮＡのコピー数に基づいてレンチウイルスベクターの力価を決定することを含み得る。
【0083】
本方法は、いくつかの利点を提供する。本方法は、例えば２時間以内に、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を迅速に決定することができる。
【0084】
それは、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）作製プロセスにおける中間産物の力価を迅速かつ定量的に評価するために使用することができ、ウイルスベクターの最終産物の量を制御するのに役立つことができる。配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）は、定量的方法、例えばＲＴ－ＰＣＲによって増幅され得る。試料中のＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数およびＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）ＲＮＡのコピー数を決定することができる。ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）およびＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）ＲＮＡの合計コピー数からＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数を減算することにより、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価を迅速かつ特異的に決定することができる。加えて、本方法の実験設計および操作は単純であるしたがって、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価のアッセイは、迅速、効率的かつ特異的に２時間以内で実施され得る。本方法は、陽性対照の力価を使用して試料の力価を計算することができ、これは、ウイルスベクターの量を迅速に調整するのに役立つ。本方法は、簡単な操作工程、短い検出時間、検出結果の速いフィードバック、および信頼性の高い結果を提供する。それは、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の開発または作製プロセスの様々な段階における、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価の決定に非常に適している。
【0085】
特定の実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲは、ＲＮＡウイルスベクターを含有する試料に対してそれぞれ行われる。ＲＴ－ＰＣＲはベクターＲＮＡおよびＤＮＡの両方を増幅するが、ＰＣＲ（逆転写酵素なし）はＤＮＡのみを増幅する。ウイルスベクター（ＲＮＡ）のコピー数は、（ｉ）ＲＴ－ＰＣＲにより得られた、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むウイルスベクター（ＲＮＡ）およびＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数の合計コピー数と、（ｉｉ）ＰＣＲにより得られた、配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）を含むＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数との差により算出することができる。
【0086】
試料中のＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数に基づいて、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の力価（例えば、感染力価）を決定することができる。
【0087】
さらに、本方法は、プラスミドまたは他の核酸からの非特異的干渉を実質的に減少させ、迅速に定量化を達成することができる。さらに、本方法は、２時間以内に特異的な定量結果をもたらすことができ、これを使用して、レンチウイルスベクター作製プロセスにおいて中間産物の力価を迅速かつ定量的に評価することができる。さらに、実施において、最終産物の物理的力価または機能的力価を制御することができる。
【0088】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結される、例えば挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を指示する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
【0089】
「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の移入もしくは細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来核酸要素を含む核酸分子（例えば、トランスファープラスミド）、または核酸移入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用される。ウイルス粒子は、核酸に加えて、様々なウイルス成分および時には、宿主細胞成分をも含み得る。「ウイルスベクター」という用語は、核酸を細胞に移入することができるウイルスまたはウイルス粒子、または移入された核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターおよびトランスファープラスミドは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝子要素を含む。
【0090】
サイクル閾値（Ｃｔ）は、ベースライン信号を超える蛍光の有意な増加が検出されるサイクル数を指すことができる。
【0091】
数値に関する「約」という用語は、記載された数値の±１０％を指す。換言すれば、数値は、記載値の９０％～記載値の１１０％の範囲内であり得る。
【0092】
ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルス
ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡ（リボ核酸）をその遺伝物質として有するウイルスである。
ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡ（リボ核酸）をその遺伝物質として有するウイルスである。
【0093】
この核酸は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。
【0094】
ＲＮＡウイルスには、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科、アルファテトラウイルス科、ビルナウイルス科、シストウイルス科、ノダウイルス科、およびペルムトレトラウイルス科およびフラビウイルス科が含まれるが、これらに限定されない。例として、アストロウイルス科にはヒトアストロウイルスが含まれ、カリシウイルス科にはノーウォークウイルスが含まれ、ピコルナウイルス科には、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、ビモウイルス、コモウイルス、ネポウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、ポチウイルス、ソベモウイルス、およびルテオウイルスのサブセット（ビート西部萎黄病ウイルスおよびジャガイモ葉巻ウイルスなど）が含まれ、コロナウイルス科には、コロナウイルスおよびＳＡＲウイルスが含まれ、レトロウイルス科には、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスが含まれ、トガウイルス科には、風疹ウイルスおよびアルファウイルスが含まれ、フラビウイルス科には、Ｃ型肝炎ウイルス、フラビウイルス、カルモウイルス、ダイアンソウイルス属（ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ペスチウイルス属、ステートウイルス属（ｓｔａｔｏｖｉｒｕｓｅｓ）、トンブスウイルス属、一本鎖ＲＮＡバクテリオファージ、およびルテオウイルス属のサブセット（オオムギ黄色萎縮ウイルス）が含まれる。
【0095】
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、コロナウイルス科ウイルス、ニューモウイルス科ウイルス、パラミクソウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、またはオルトミクソウイルス科ウイルスであり得る。特定の実施形態では、コロナウイルス科ウイルスはコロナウイルスまたはＳＡＲＳであり、ニューモウイルス科ウイルスはヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）であり、パラミクソウイルス科ウイルスはヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルスまたは流行性耳下腺炎ウイルスであり、ピコルナウイルス科ウイルスはライノウイルスであり、オルトミクソウイルス科ウイルスはインフルエンザウイルスである。特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ニューモウイルス科ウイルスである。一実施形態では、ＲＮＡウイルスはＨＲＳＶである。
【0096】
ＲＮＡウイルスの非限定的な例には、ヒト呼吸器多核体ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、ピコビルナウイルス、ブルータングウイルス、アルファウイルス、カラウイルス、フロウイルス、ホルデイウイルス、ポテックスウイルス、ルビウイルス、トブラウイルス、トリコルナウイルス、チモウイルス、リンゴクロロティックリーフスポットウイルス（ａｐｐｌｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、ビート萎黄ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、セリウイルス、デルタウイルス、エマラウイルス、ヒグレウイルス、イダエウイルス、ウルミアウイルス、ポレモウイルス、ソベモウイルス、テヌイウイルス、アンブラウイルス、バリコサウイルスなども含まれる。ＲＮＡウイルスは、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス目およびティモウイルス目などのウイルス分類目に由来し得る。
【0097】
レトロウイルス
レトロウイルスは、そのゲノムＲＮＡをＤＮＡコピーに逆転写し、続いてそのＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むＲＮＡウイルスである。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それはプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として機能し、新しいウイルス粒子を作製するのに必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指令する。
レトロウイルスは、そのゲノムＲＮＡをＤＮＡコピーに逆転写し、続いてそのＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むＲＮＡウイルスである。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それはプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として機能し、新しいウイルス粒子を作製するのに必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指令する。
【0098】
レトロウイルス科は、オルソレトロウイルス亜科およびスピューマレトロウイルス亜科の２つの亜科に分けることができる。オルソレトロウイルス亜科には、以下の属：アルファレトロウイルス（鳥白血病ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスなど）；ベータレトロウイルス（マウス乳腺腫瘍ウイルスなど）；ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルスおよびネコ白血病ウイルスなど）；デルタレトロウイルス（ウシ白血病ウイルスおよび癌を引き起こすヒトＴリンパ球向性ウイルスなど）；エプシロンレトロウイルス；およびレンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１型ならびにサルおよびネコ免疫不全ウイルスなど）が含まれる。スピューマレトロウイルス亜科には、以下の属：ボビスピューマウイルス（Ｂｏｖｉｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）；エクイスピューマウイルス（Ｅｑｕｉｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）；フェリスピューマウイルス（Ｆｅｌｉｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）；プロシミイスピューマウイルス（Ｐｒｏｓｉｍｉｉｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）；およびシミイスピューマウイルス（Ｓｉｍｉｉｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）が含まれる。
【0099】
レトロウイルスの非限定的な例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）およびレンチウイルスが挙げられる。
【0100】
「レトロウイルスベクター」という用語は、構造的および機能的遺伝子要素またはそれらの部分を含む、主にレトロウイルスに由来するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レトロウイルスベクター」および「レトロウイルス」という用語は互換的に使用され得る。
【0101】
本明細書で使用される「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。
【0102】
レンチウイルス
レンチウイルスとしては、限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）；ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる
「レンチウイルスベクター」という用語は、長い末端反復（ＬＴＲ）を含む、主にレンチウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子要素またはそれらの部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを指す。特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルストランスファープラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用され得る。
レンチウイルスとしては、限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）；ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる
「レンチウイルスベクター」という用語は、長い末端反復（ＬＴＲ）を含む、主にレンチウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子要素またはそれらの部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを指す。特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルストランスファープラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用され得る。
【0103】
「レンチウイルスベクター」および「レンチウイルス」という用語は、互換的に使用され得る。
【0104】
配列要素
ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲでは、配列要素を増幅するために、配列要素を標的とするプライマーが使用され得る。配列要素には、特定のウイルス成分、クローニング部位、プロモーター、制御要素、調節要素、異種核酸（例えば、導入遺伝子自体）などが含まれる。
ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲでは、配列要素を増幅するために、配列要素を標的とするプライマーが使用され得る。配列要素には、特定のウイルス成分、クローニング部位、プロモーター、制御要素、調節要素、異種核酸（例えば、導入遺伝子自体）などが含まれる。
【0105】
配列要素の非限定的な例には、ＬＴＲ、ＷＰＲＥ、プロモーターなどが含まれる。プロモーターには、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが含まれる。
【0106】
本明細書において配列要素に言及する場合、これらの要素の配列は、ＲＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルス（例えば、レンチウイルスベクターまたはレンチウイルス）中にＲＮＡ形態で存在し、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）中にＤＮＡ形態で存在することを理解されたい。
【0107】
「制御要素」または「調節要素」は、ベクターの非翻訳領域、例えば複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、シャインダルガルノ配列、コザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域であり得、これらは宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および／または翻訳を行う。
【0108】
特定の実施形態では、配列要素は、調節要素、例えば転写後調節要素、ポリアデニル化部位、転写終結シグナルなどであり得る。特定の実施形態では、配列要素は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）であり得る。特定の実施形態では、配列要素は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）に存在する転写後調節要素であり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および場合により転写終結シグナルをベクターに組み込むことによって増加する。様々な転写後調節要素、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）に存在する転写後調節要素（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）；およびその他（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）は、タンパク質における異種核酸の発現を増加させ得る。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節要素を含む。
【0109】
例えば、ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスのゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｊ０４５１４）中に存在するヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＢＶＰＲＥ）に類似する領域を指すことができ、このゲノム配列の１０９３から１６８４位までの５９２ヌクレオチドは、転写後調節領域に相当する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２，ｐ．５０８５－５０９２，１９９８）。レトロウイルスベクターを用いた分析により、目的の遺伝子の３’末端非翻訳領域に挿入されたＷＰＲＥが、産生されるタンパク質の量を増加させることが明らかになった。また、ＷＰＲＥの導入により、ｍＲＮＡの分解が抑制されることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，ｐ．２８８６－２８９２，１９９９）。
【0110】
特定の実施形態では、配列要素は調節要素、例えばイントロン、エンハンサー要素などであり得る。本明細書で有用な調節配列はまた、イントロン、例えばプロモーター／エンハンサー配列とコード配列との間に位置するものを含み得る。１つの例示的なイントロン配列はＳＶ４０に由来し、ＳＶ４０イントロンと呼ばれる。
【0111】
ベクターにおいて使用され得る他のエンハンサー要素としては、例えば、ユビキチンエンハンサーおよびＣＭＢエンハンサーが挙げられる。使用され得るさらなる調節要素としては、例えば、アプタザイム（ａｐｔａｚｙｍｅ）、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ結合要素が挙げられる。
【0112】
特定の実施形態において、配列要素は、ＬＴＲであり得る。プロウイルスの各末端は、「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造である。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況において直接反復であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含むレトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）およびウイルス複製にとって基本的な機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御要素を含む多数の調節シグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みに必要な配列を含む。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーター要素を含有する。
【0113】
Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３およびＵ５領域に隣接している。ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域から構成され、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端の両方に現れる。５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（Ｐｓｉ部位）である。様々な実施形態では、ベクターは、修飾５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれかまたは両方は、これらに限定されないが、１つ以上の欠失、挿入または置換を含む、１つ以上の修飾を含み得る。３’ＬＴＲの修飾は、ウイルスに複製欠損を与えることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われることが多い。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、Ｕ３領域として知られている右（３’）ＬＴＲエンハンサープロモーター領域が（例えば、欠失または置換によって）修飾されて、最初のウイルス複製ラウンドを超えるウイルス転写を防止する複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、右（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域がウイルス複製中に左（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルス転写物はＵ３エンハンサープロモーターなしで作製することができないからである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列で置き換えられるように修飾される。ＬＴＲに対する修飾、例えば３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲまたは３’および５’ＬＴＲの両方に対する修飾も本開示に含まれることに留意されたい。
【0114】
ウイルス粒子の作製中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって安全性がさらに増強される。使用され得る異種プロモーターの例は、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、サイトメガロウイルス（例えば、最初期）、モロニ－マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存的様式で高レベルの転写を駆動することができる。ウイルス産生システムに完全なＵ３配列が存在しないため、この置換によって、複製コンピテントウイルスを生成するための組換えの可能性が低下する。
【0115】
特定の実施形態において、配列要素はパッケージング配列であり得る。本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスキャプシドまたは粒子に挿入するために必要なレトロウイルスゲノム内に位置する配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に必要な最小パッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ψ］配列とも呼ばれる）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、用語「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「ｐｓｉ」および記号「Ψ」は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要な非コード配列に関して使用される。
【0116】
特定の実施形態では、配列要素はＴＡＲ要素であり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列要素であり得るＴＡＲ要素を含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝子要素を指す。この要素は、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子要素と相互作用してウイルス複製を増強する。
【0117】
特定の実施形態において、配列要素は、Ｒ領域であり得る。「Ｒ領域」は、キャッピング基の開始（すなわち、転写の開始）時に始まり、ポリＡトラクトの開始直前に終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３およびＵ５領域に隣接するものとして定義される。Ｒ領域は、逆転写中に、発生期ＤＮＡをゲノムの一端から他端へ移動させる役割を果たす。
【0118】
特定の実施形態において、配列要素は、ＦＬＡＰ要素であり得る。本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ要素」という用語は核酸を指し、その配列はレトロウイルス、例えばＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２のセントラルポリプリントラクトおよびセントラル終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む。適切なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号、およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ－１の逆転写中、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）でのプラス鎖ＤＮＡのセントラル開始およびセントラル終結配列（ＣＴＳ）でのセントラル終結は、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ－１セントラルＤＮＡフラップの形成をもたらす。特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター骨格は、ベクター中の目的の異種遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰ要素を含む。例えば、特定の実施形態において、トランスファープラスミドはＦＬＡＰ要素を含む。一実施形態では、本開示のベクターは、ＨＩＶ－１から単離されたＦＬＡＰ要素を含む。
【0119】
特定の実施形態において、配列要素は、エクスポート要素であり得る。一実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスのトランスファーベクターは、１つ以上のエクスポート要素を含む。「エクスポート要素」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節する、シス作用転写後調節要素を指す。ＲＮＡエクスポート要素の例としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡエクスポート要素は、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入され得る。
【0120】
特定の実施形態において、配列要素は、転写終結シグナルまたはポリアデニル化配列であり得る。効率的な終結および異種核酸転写物のポリアデニル化を指示する要素は、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、終結、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩによる発生期ＲＮＡ転写物のポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を表す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、したがって翻訳効率の向上に寄与する。ポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギベータグロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種または内因性ポリＡ配列が挙げられる。ポリアデニル化配列には、ＳＶ４０ ポリＡ、ｂＧＨ ポリＡおよび合成ポリＡテールも含まれる。
【0121】
特定の実施形態において、配列要素は、インシュレーター要素であり得る。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインシュレーター要素をさらに含む。インシュレーター要素は、ゲノムＤＮＡ中に存在するシス作用性要素によって媒介され、移入された配列の発現の調節解除をもたらし得る組み込み部位効果（すなわち、位置効果；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３；およびＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照）から、レンチウイルス発現配列、例えば治療用ポリペプチドを保護するのに寄与し得る。いくつかの実施形態において、トランスファーベクターは、３’ＬＴＲの１つ以上のインシュレーター要素を含み、プロウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、プロウイルスは、３’ＬＴＲを複製することによって、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの両方に１つ以上のインシュレーターを含む。本発明での使用に適したインシュレーターには、限定されないが、ニワトリベータグロビンインシュレーターが含まれる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ ７４：５０５；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＰＮＡＳ ９４：５７５；およびＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ ９８：３８７を参照されたい）。インシュレーター要素の例には、ニワトリＨＳ４などのベータグロビン遺伝子座由来のインシュレーターが含まれるが、これらに限定されない。
【0122】
特定の実施形態では、配列要素は、抗生物質耐性遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、導入遺伝子などの異種核酸であり得る。
【0123】
レトロウイルス配列および／またはレンチウイルス配列の多様な供給源が使用され得、または組み合わされ得、本明細書に記載の機能を実行するためのトランスファーベクターの能力を損なうことなく、一定のレンチウイルス配列における多くの置換および変化が順応され得ることを理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当技術分野で知られており、それらの多くは、本開示のウイルスベクターまたはトランスファープラスミドを作製するように適合され得る。Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，米国特許第６，０１３，５１６号；および５，９９４，１３６号を参照されたい。
【0124】
ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）とｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖増幅（ＰＣＲ）とを組み合わせた技術である。まず、ＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって標的断片を増幅合成する。ＲＴ－ＰＣＲ技術は、高感度で汎用性があり、細胞における遺伝子発現レベル、および細胞または培養上清中のＲＮＡウイルスの含有量を検出するために使用することができる。特定の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ反応システムは、プライマー、逆転写酵素、ＰＣＲ酵素、緩衝液、ｄＮＴＰおよび他の構成要素を含み得る。
ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）とｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖増幅（ＰＣＲ）とを組み合わせた技術である。まず、ＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって標的断片を増幅合成する。ＲＴ－ＰＣＲ技術は、高感度で汎用性があり、細胞における遺伝子発現レベル、および細胞または培養上清中のＲＮＡウイルスの含有量を検出するために使用することができる。特定の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ反応システムは、プライマー、逆転写酵素、ＰＣＲ酵素、緩衝液、ｄＮＴＰおよび他の構成要素を含み得る。
【0125】
ＲＴ－ＰＣＲでは、ウイルスＲＮＡを最初にｃＤＮＡに変換し、次いでＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲまたはｑＰＣＲ）を用いて定量する。
【0126】
本開示では、ＲＴ－ＰＣＲを使用して、同じ試料中のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を検出することができる。
【0127】
一実施形態では、反応チューブおよび対照チューブが提供される。反応チューブは、試験される試料およびＲＴ－ＰＣＲのすべての反応システムを含む。対照チューブは、反応チューブと同じ試料、およびＰＣＲ反応システム（例えば、逆転写酵素を除くＲＴ－ＰＣＲ反応システム）を含有する。反応チューブ内で、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を増幅して、特異的に増幅された配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のＣｔ値を得る。反応チューブについて計算されたコピー数は、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数＋ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のコピー数である。
【0128】
対照チューブでは、逆転写酵素がなければ、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡを増幅することができず、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のみを増幅して、特定の増幅された配列要素（例えば、ＷＰＲＥ要素）のＣｔ値を得る。そこから得られたコピー数は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）のＤＮＡコピー数である。次に、ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数が、反応チューブ内のＲＮＡおよびＤＮＡのコピー数（ｎ２）から対照チューブ内のＤＮＡのコピー数（ｎ１）を差し引くことによって得られ得る、すなわち、ｎ２－ｎ１＝ＲＮＡウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のＲＮＡコピー数（図６に示す）。
【0129】
陽性対照
陽性対照は、既知の力価、感染力価または物理的力価を有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスベクター）であり得る（例えば、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣＢＭＧ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能なＬＶ－ＣＡＲ００１）。
陽性対照は、既知の力価、感染力価または物理的力価を有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスベクター）であり得る（例えば、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣＢＭＧ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能なＬＶ－ＣＡＲ００１）。
【0130】
特定の実施形態では、陽性対照はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、陽性対照のコピー数および力価の計算方法は、試験される試料の計算式と同じである。
【0131】
本発明は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される以下の非限定的な実施例を参照することによって、よりよく理解され得る。本開示は、特定の具体的な実施形態に関連して、以下でさらに説明される。これらの実施形態は、本発明を例示するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するために使用されないことを理解されたい。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常、対応する従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件に基づくか、または製造業者によって推奨される条件に従う。特に明記しない限り、パーセンテージおよび部は重量で計算される。
【0132】
特に明記しない限り、本開示の実施例で使用される試薬および材料はすべて市販品である。
【0133】
［実施例１］
装置：Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ（商標）ＤＸ（ＡＢＩ）
１．試薬調製
実験は氷上で行った。十分な体積のマスター反応混合物（ＭＲＭ）を調製した。
装置：Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ（商標）ＤＸ（ＡＢＩ）
１．試薬調製
実験は氷上で行った。十分な体積のマスター反応混合物（ＭＲＭ）を調製した。
【表1】
【0134】
２．試料希釈
試験される試料をＥＡＳＹ希釈緩衝液で適切な濃度（１０５～１０９ＴＵ／ｍｌ）に希釈した。
試験される試料をＥＡＳＹ希釈緩衝液で適切な濃度（１０５～１０９ＴＵ／ｍｌ）に希釈した。
【0135】
３．試料溶解
２μｌの希釈ウイルスおよび１８μｌのウイルス溶解緩衝液を添加し、よく混合し、室温で１～５分間インキュベートした。
２μｌの希釈ウイルスおよび１８μｌのウイルス溶解緩衝液を添加し、よく混合し、室温で１～５分間インキュベートした。
【0136】
４．Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＲＮＡ対照希釈鋳型を用いた標準曲線の確立
標準希釈は、清浄な０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ内で行った。図１を参照して、ＲＮＡ標準の段階的希釈を行った。各チューブを十分に混合した後、次のチューブを希釈した。
標準希釈は、清浄な０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ内で行った。図１を参照して、ＲＮＡ標準の段階的希釈を行った。各チューブを十分に混合した後、次のチューブを希釈した。
【0137】
５×１０７コピー／μｌを標準曲線の最高点として使用し、ＥＡＳＹ希釈緩衝液を陰性対照（ＮＴＣ、０コピー／μｌ）として使用した。
【0138】
５．９６ウェルＰＣＲプレートを氷上に置いた。１８．４μｌのＭＲＭ（３つの並行試料）をピペットで適切なウェルに移した。
【0139】
６．ピペットを使用して、１．６μｌの標準希釈物、ＮＴＣ、および試料（３つの並行試料）を９６ウェルＰＣＲプレートに移した。
【0140】
７．４℃で２分間、２０００ｒｐｍで遠心分離して気泡を除去する。
【0141】
８．ＰＣＲプログラムを図２に従って設定した。９６ウェルプレートを充填してプログラムを開始した。
【0142】
９．データ処理
１）標準曲線：Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＲＮＡ対照勾配希釈物の平均Ｃｔ値は、ＲＮＡコピー数（対数スケール）と線形関係にあった。
１）標準曲線：Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＲＮＡ対照勾配希釈物の平均Ｃｔ値は、ＲＮＡコピー数（対数スケール）と線形関係にあった。
【0143】
２）各反応ウェル中の試料のＲＮＡコピー数は、希釈試料の平均Ｃｔ値に基づいて計算した。キット中のレンチウイルス標準の段階的希釈試料から得られたＣｔ平均値をＸ軸として使用した。レンチウイルス標準ＲＮＡコピー数の対応する対数値をＹ軸として使用した。標準曲線は、Ｙ＝ａＸ＋ｂである計算式にフィッティングすることによって得られた。
【0144】
Ｙ：ＲＮＡ標準または試験されるレンチウイルスベクターのＲＮＡコピー数の対数値（底１０）
Ｘ：標準または試料から得られたＣｔ値の平均
ａ：標準曲線フィッティングにより得られる係数
ｂ：標準曲線フィッティングにより得られる切片
Ａ（各反応ウェルの核酸のコピー数）＝１０＾（ａＸ＋ｂ）
３）元の試料のＲＮＡのコピー数（コピー／ｍｌ）＝５×１０７コピー／ｕｌ
結果：
１．標準曲線
既知のコピー数の標準（例えば、ＲＮＡ標準）を用いて標準曲線を作成し、未知試料のコピー数を算出した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＲＮＡ標準の希釈およびウイルス試料の希釈は、図１に示すように行った。図２に示すプログラムをＰＣＲ増幅に使用した。標準曲線を、Ｃｔ値および対応するウイルスコピー数に基づいてプロットした（図３）。標準品を測定することにより、得られた検出値をフィッティングすることができる。フィッティングされたデータは、良好な線形相関を示し（Ｒ２≧０．９９９９）、検出方法が良好な安定性および精度を有することを示している。
Ｘ：標準または試料から得られたＣｔ値の平均
ａ：標準曲線フィッティングにより得られる係数
ｂ：標準曲線フィッティングにより得られる切片
Ａ（各反応ウェルの核酸のコピー数）＝１０＾（ａＸ＋ｂ）
３）元の試料のＲＮＡのコピー数（コピー／ｍｌ）＝５×１０７コピー／ｕｌ
結果：
１．標準曲線
既知のコピー数の標準（例えば、ＲＮＡ標準）を用いて標準曲線を作成し、未知試料のコピー数を算出した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＲＮＡ標準の希釈およびウイルス試料の希釈は、図１に示すように行った。図２に示すプログラムをＰＣＲ増幅に使用した。標準曲線を、Ｃｔ値および対応するウイルスコピー数に基づいてプロットした（図３）。標準品を測定することにより、得られた検出値をフィッティングすることができる。フィッティングされたデータは、良好な線形相関を示し（Ｒ２≧０．９９９９）、検出方法が良好な安定性および精度を有することを示している。
【0145】
２．解離曲線
解離曲線（図４）は、ピークの数およびピークの位置を調べることによって、増幅産物の特異性および産物の状態を検証することができる。異なるピークは異なる産物を表す。
解離曲線（図４）は、ピークの数およびピークの位置を調べることによって、増幅産物の特異性および産物の状態を検証することができる。異なるピークは異なる産物を表す。
【0146】
２つのピークまたはさらには複数のピークが存在する場合、それはプライマーの特異性が高くないこと、すなわち、得られたＣｔ値が信頼できないことを示す。ここで、リアルタイム定量ＰＣＲ反応により得られた解離曲線は、唯一の鋭いピークを有し、この反応システムにおけるプライマーが高い特異性を有することを示した。本方法によって増幅された産物は安定で正確であり、検出データは信頼性があった。
【0147】
３．増幅曲線（図５）
リアルタイム定量ＰＣＲの増幅曲線は、反応の増幅効率を反映することができる。高い一貫した増幅効率が、検出を成功させる鍵である。増幅効率が一貫していない場合、増幅効率曲線の勾配は同じ勾配を有さず、平行ではなく、プライマーの効率が同じではないこと、または個々の試料もしくは反応ウェルにおいてＰＣＲを阻害する汚染があることを示している。図５から、本方法を用いて得られた増幅曲線は実質的に平行であり、傾斜度は相似または実質的に同一であることが見られ、本発明の方法が高い増幅効率を有することを示している。
リアルタイム定量ＰＣＲの増幅曲線は、反応の増幅効率を反映することができる。高い一貫した増幅効率が、検出を成功させる鍵である。増幅効率が一貫していない場合、増幅効率曲線の勾配は同じ勾配を有さず、平行ではなく、プライマーの効率が同じではないこと、または個々の試料もしくは反応ウェルにおいてＰＣＲを阻害する汚染があることを示している。図５から、本方法を用いて得られた増幅曲線は実質的に平行であり、傾斜度は相似または実質的に同一であることが見られ、本発明の方法が高い増幅効率を有することを示している。
【0148】
４．計算結果
【表2】
【0149】
Ｃｔ ＳＤ値から、試験される試料が互いに実質的に平行であったことが分かる。特異的増幅後の産物の融解温度（Ｔｍ）はいずれも７５℃前後であり、良好なプライマー増幅効率を示し、非特異的増幅はなかった。既知の感染力価を有する陽性対照と比較することによって、試料の感染力価も迅速に計算／推定することができる。試料のレンチウイルス力価を適時に得ることは非常に重要である。この方法は、レンチウイルス力価の迅速な検出に良好な適用性を有することを示している。
【0150】
ｑＰＣＲプログラムのパラメータを図２に示す。プログラムの開始から終了までの合計時間は、１時間２０分である。試料調製時間およびｑＰＣＲプログラム後のデータ処理時間を合わせると、合計時間は２時間以内であることが可能である。
【0151】
結論
通常、レンチウイルスベクターの感染力価を決定するのに３～７日かかることがある。
通常、レンチウイルスベクターの感染力価を決定するのに３～７日かかることがある。
【0152】
レンチウイルスベクターは脆弱であり、分解されやすいため、レンチウイルスベクター製造中の進行中監視のための、高速力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）方法を開発する必要がある。本方法を使用して、レンチウイルスベクターの感染力価（または物理的力価）を効率的、迅速（例えば、２時間以内）かつ特異的に決定することができる。方法を使用して、作製プロセスにおける中間試料の力価を迅速に決定し、中間産物の量を決定し、最終産物の濃度を制御することができる。
【0153】
本開示の範囲は、上記で具体的に示され説明されたものによって限定されない。当業者は、材料、構成、構造および寸法の図示された例に対する適切な代替物があることを認識するであろう。特許および様々な刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の説明において引用され、議論される。そのような参考文献の引用および議論は、単に本開示の説明を明確にするために提供されており、いかなる参考文献も本明細書に記載の本発明の先行技術であることを認めるものではない。本明細書で引用および議論されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているものの変形、修正、および他の実施は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本開示の特定の実施形態を示し説明したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。前述の説明および添付の図面に記載された事項は、例示としてのみ提供され、限定として提供されるものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】