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特許7637948Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-20
(45)【発行日】2025-03-03
(54)【発明の名称】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬
(51)【国際特許分類】
C08F 120/36 20060101AFI20250221BHJP
A61K 31/78 20060101ALI20250221BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250221BHJP
【ＦＩ】
C08F120/36
A61K31/78
A61P29/00
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021556161
(86)(22)【出願日】2020-11-13
(86)【国際出願番号】 JP2020042362
(87)【国際公開番号】W WO2021095828
(87)【国際公開日】2021-05-20
【審査請求日】2023-10-23
(31)【優先権主張番号】P 2019206265
(32)【優先日】2019-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000108454
【氏名又は名称】ソマール株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100178847
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 映美
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(72)【発明者】
【氏名】伊勢 裕彦
(72)【発明者】
【氏名】松尾 早織
【審査官】赤澤 高之
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００４／０９９２７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００６－２７６２３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２３５７９０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００４－５２６６９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】A. L.PARRY et al.，Glycopolymer-Functionalised Gold Nanoparticles : A New Strategy Towards Synthetic Anti-Cancer Vaccines，PMSE preprints，2009年，101，1331-1332，ISSN:0743-0515
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｆ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位とを有し、前記Ｎ－アセチルグルコサミン基を１分子当たり３～１００個含むポリマーのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としての使用方法。
【請求項2】
前記カルボキシ基含有ラジカル重合性単位が、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、アクリル酸２－カルボキシエチル及びメタクリル酸２－カルボキシエチルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としての使用方法。
【請求項3】
前記ポリマーが、アルキル鎖を有しないことを特徴とする請求項１又は２に記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としての使用方法。
【請求項4】
前記ポリマーが、次の化学式（１）又は（２）で表される化合物であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としての使用方法。【化1】
【化2】
【請求項5】
Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位とを有し、前記Ｎ－アセチルグルコサミン基を１分子当たり３～１００個含むポリマーを有効成分として含有する線維症治療薬。
【請求項6】
前記カルボキシ基含有ラジカル重合性単位が、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、アクリル酸２－カルボキシエチル及びメタクリル酸２－カルボキシエチルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の線維症治療薬。
【請求項7】
前記ポリマーが、アルキル鎖を有しないことを特徴とする請求項５又は６に記載の線維症治療薬。
【請求項8】
前記ポリマーが、次の化学式（１）又は（２）で表される化合物であることを特徴とする請求項５～７のいずれかに記載の線維症治療薬。
【化3】
【化4】
【請求項9】
次の化学式（１）又は（２）で表される化合物であることを特徴とする、Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位とを有し、前記Ｎ－アセチルグルコサミン基を１分子当たり３～１００個含むＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。【化5】
【化6】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬に関する。
本願は、２０１９年１１月１４日に、日本に出願された特願２０１９－２０６２６５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年１１月１４日に、日本に出願された特願２０１９－２０６２６５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
内臓などの組織を構成している結合組織と呼ばれる部分が異常増殖や活性化した線維芽細胞が線維化部位に集積し、コラーゲンや他のタンパク質を大量に生産しそれが組織に付着することによりその組織の線維化が発生する。線維化は各組織で起こりうるものであり、例えば、肝臓の線維化である肝線維症は、肝炎ウィルスの持続感染やアルコールの過剰摂取、非アルコール性脂肪肝炎の他にも、自己免疫学的機序、肝内胆汁うっ滞、薬剤性、金属代謝異常、うっ血肝など、様々な原因により引き起こされる共通の病態であり、活性化した星細胞が筋線維芽様細胞に形質転換し、細胞外基質を産生することによって進行する。線維化進展に伴って、肝組織中にはコラーゲンをはじめとする細胞外マトリックスが過剰に沈着し、その結果、肝硬変では肝細胞機能不全や門脈亢進症が進行する。
肝臓以外の組織としては、例えば、腎臓、肺、心臓、膵臓等の臓器においても、筋線維芽細胞による線維化に起因して各種疾患に至ることが知られている。このように各種臓器の線維化状態からさらなる疾患へと進行することから、線維化を防止する又は線維化を改善することで、肝硬変や肝臓がん、その他臓器の線維化に関連する各種疾患に対する有効な治療に繋がることが期待され、いくつかの改善方法が提案されている。
例えば、特許文献１では組織線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分として、金属キレート化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする組織線維化疾患の予防又は治療剤が提案されている。
また、特許文献２では線維化の発症を防止し、線維化の進行を遅らせ、或いは線維化を改善するために、Sema6ファミリーに属するタンパク質又はその部分断片をコードするポリヌクレオチド；Sema6ファミリーに属するタンパク質又はその部分断片；若しくは当該タンパク質又はその部分断片をリガンドとする受容体に対するアゴニストを有効成分として含有する線維化抑制剤が提案されている。
しかしながら、培養細胞を用いた試験や動物実験によって多くの抗線維化作用物質が同定・報告させているものの、臨床の現場では肝線維症に対する特異的かつ効果的な治療薬はいまだ提案されていない。
また近時、ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５（以下、単にＧＤＦ１５という）は様々な悪性腫瘍の患者において血中濃度が上昇していることが知られている。このＧＤＦ１５はＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する多彩な生物学的特性を示すサイトカインであり、胎盤、腎臓、腸、前立腺、脈絡叢などで顕著に発現している。またこれらの組織又は細胞以外でもＧＤＦ１５は低酸素、炎症、ＵＶ暴露、組織傷害などのストレスに応答して遺伝子発現が誘導される（非特許文献１）。さらにＧＤＦ１５は抗炎症性、心筋保護、神経保護、食欲・代謝調整作用の他、がん細胞の増殖、転移、治療耐性などに関与することも知られている（非特許文献２）。例えばｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞は、ＧＤＦ１５を分泌することでドキソルビシン誘導心障害を改善することが報告されている（非特許文献３）。また、アルコール及び四塩化炭素誘導肝障害モデルマウスにおいてＧＤＦ１５の欠損は、これらの病態を悪化させるが、ＧＤＦ１５の投与により改善すること（非特許文献４）、ＧＤＦ１５は非アルコール性脂肪肝炎（以下、ＮＡＳＨという）を改善すること（非特許文献５）、ＧＤＦ１５を高発現するトランスジェニックマウスでは、関節リウマチの進行が抑制さていること（非特許文献６）、膵臓がんは、ＮＦ－κＢの活性化によりＧＤＦ１５を分泌し、周囲のマクロファージにＧＤＦ１５を作用させ、マクロファージのＮＦ－κＢを抑制してＴＮＦαの産生を止めており、このマクロファージのＴＮＦα分泌抑制により、膵臓がん自身はマクロファージの攻撃を回避して増殖すること（非特許文献７）等が報告されている。
このようにＧＤＦ１５は心筋梗塞や線維症、自己免疫疾患において血中に増加し、病態に対して抗炎症作用による傷害保護作用があることが知られている。
肝臓以外の組織としては、例えば、腎臓、肺、心臓、膵臓等の臓器においても、筋線維芽細胞による線維化に起因して各種疾患に至ることが知られている。このように各種臓器の線維化状態からさらなる疾患へと進行することから、線維化を防止する又は線維化を改善することで、肝硬変や肝臓がん、その他臓器の線維化に関連する各種疾患に対する有効な治療に繋がることが期待され、いくつかの改善方法が提案されている。
例えば、特許文献１では組織線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分として、金属キレート化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする組織線維化疾患の予防又は治療剤が提案されている。
また、特許文献２では線維化の発症を防止し、線維化の進行を遅らせ、或いは線維化を改善するために、Sema6ファミリーに属するタンパク質又はその部分断片をコードするポリヌクレオチド；Sema6ファミリーに属するタンパク質又はその部分断片；若しくは当該タンパク質又はその部分断片をリガンドとする受容体に対するアゴニストを有効成分として含有する線維化抑制剤が提案されている。
しかしながら、培養細胞を用いた試験や動物実験によって多くの抗線維化作用物質が同定・報告させているものの、臨床の現場では肝線維症に対する特異的かつ効果的な治療薬はいまだ提案されていない。
また近時、ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５（以下、単にＧＤＦ１５という）は様々な悪性腫瘍の患者において血中濃度が上昇していることが知られている。このＧＤＦ１５はＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する多彩な生物学的特性を示すサイトカインであり、胎盤、腎臓、腸、前立腺、脈絡叢などで顕著に発現している。またこれらの組織又は細胞以外でもＧＤＦ１５は低酸素、炎症、ＵＶ暴露、組織傷害などのストレスに応答して遺伝子発現が誘導される（非特許文献１）。さらにＧＤＦ１５は抗炎症性、心筋保護、神経保護、食欲・代謝調整作用の他、がん細胞の増殖、転移、治療耐性などに関与することも知られている（非特許文献２）。例えばｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞は、ＧＤＦ１５を分泌することでドキソルビシン誘導心障害を改善することが報告されている（非特許文献３）。また、アルコール及び四塩化炭素誘導肝障害モデルマウスにおいてＧＤＦ１５の欠損は、これらの病態を悪化させるが、ＧＤＦ１５の投与により改善すること（非特許文献４）、ＧＤＦ１５は非アルコール性脂肪肝炎（以下、ＮＡＳＨという）を改善すること（非特許文献５）、ＧＤＦ１５を高発現するトランスジェニックマウスでは、関節リウマチの進行が抑制さていること（非特許文献６）、膵臓がんは、ＮＦ－κＢの活性化によりＧＤＦ１５を分泌し、周囲のマクロファージにＧＤＦ１５を作用させ、マクロファージのＮＦ－κＢを抑制してＴＮＦαの産生を止めており、このマクロファージのＴＮＦα分泌抑制により、膵臓がん自身はマクロファージの攻撃を回避して増殖すること（非特許文献７）等が報告されている。
このようにＧＤＦ１５は心筋梗塞や線維症、自己免疫疾患において血中に増加し、病態に対して抗炎症作用による傷害保護作用があることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１１－１９０２５７号公報
【文献】特開２０１８－２１０２６号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Unsicker K, Spittau B, Krieglstein K: The multiple facets of the TGF-beta family cytokine growth/differentiation factor-15/macrophage inhibitory cytokine-1. Cytokine Growth Factor Rev 2013, 24（4）:373-384.
【文献】Wang X, Baek SJ, Eling TE: The diverse roles of nonsteroidal anti-inflammatory drug activated gene（NAG-1/GDF15）in cancer. Biochem Pharmacol 2013, 85（5）:597-606.
【文献】Zhang Y, Liang X, Liao S, Wang W, Wang J, Li X, Ding Y, Liang Y, Gao F, Yang M, Fu Q, Xu A, Chai YH, He J, Tse HF, Lian Q. Potent Paracrine Effects of human induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesenchymal Stem Cells Attenuate Doxorubicin-induced Cardiomyopathy. Sci Rep. 2015 Jun 9;5:11235. doi: 10.1038/srep11235
【文献】Chung HK, Kim JT, Kim HW, Kwon M, Kim SY, Shong M, Kim KS, Yi HS. GDF15 deficiency exacerbates chronic alcohol- and carbon tetrachloride-induced liver injury. Sci Rep. 2017 Dec 8;7(1):17238. doi: 10.1038/s41598-017-17574-w.
【文献】Kim KH, Kim SH, Han DH, Jo YS, Lee YH, Lee MS. Growth differentiation factor 15 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis and related metabolic disorders in mice. Sci Rep. 2018 May 1;8(1):6789. doi: 10.1038/s41598-018-25098-0.
【文献】Breit SN, Johnen H, Cook AD, Tsai VW, Mohammad MG, Kuffner T, Zhang HP, Marquis CP, Jiang L, Lockwood G, Lee-Ng M, Husaini Y, Wu L, Hamilton JA, Brown DA. The TGF-β superfamily cytokine, MIC-1/GDF15: a pleotrophic cytokine with roles in inflammation, cancer and metabolism. Growth Factors. 2011 Oct;29(5):187-95. doi: 10.3109/08977194.2011.607137. Epub 2011 Aug 11.
【文献】Ratnam NM, Peterson JM, Talbert EE, Ladner KJ, Rajasekera PV, Schmidt CR, Dillhoff ME, Swanson BJ, Haverick E, Kladney RD, Williams TM, Leone GW, Wang DJ, Guttridge DC. NF-κB regulates GDF-15 to suppress macrophage surveillance during early tumor development. J Clin Invest. 2017 Oct 2;127(10):3796-3809. doi: 10.1172/JCI91561. Epub 2017 Sep 11.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記のような知見はあるものの、組織の線維化の効果的な予防または治療剤はまだ開発されておらず、またＧＤＦ１５は病態に対して抗炎症作用による傷害保護作用を有することは知られているが、疾患部又はその付近でＧＤＦ１５発現を増加させ、効果的に抗炎症作用や増殖抑制する方法が無いのが現状であった。
【0006】
そこで、本発明の目的は、このＧＤＦ１５発現増加に寄与するＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
細胞の傷害時に放出されたＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質が他の細胞表面のビメンチンに結合することから、本発明者らは、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質と同様に機能するポリマー、及びこのポリマーを用いることで傷害組織又は細胞に効率的にそのポリマーを結合させ、ＧＤＦ１５発現増加による抗炎症作用や増殖抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
即ち、本発明はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬に関する、以下の［１］～［５］である。
［１］ Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位、スチレン単位、ポリエチレンイミン単位、ポリＬ－リジン単位及びビオチン単位からなる群から選ばれる少なくとも１種の単位とを有するＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［２］ 前記カルボキシ基含有ラジカル重合性単位が、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、アクリル酸２－カルボキシエチル及びメタクリル酸２－カルボキシエチルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］に記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［３］ 前記Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質が、アルキル鎖を有しないことを特徴とする［１］又は［２］に記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［４］ 次の化学式（１）又は（２）で表される化合物であることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［１］ Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位、スチレン単位、ポリエチレンイミン単位、ポリＬ－リジン単位及びビオチン単位からなる群から選ばれる少なくとも１種の単位とを有するＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［２］ 前記カルボキシ基含有ラジカル重合性単位が、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、アクリル酸２－カルボキシエチル及びメタクリル酸２－カルボキシエチルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］に記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［３］ 前記Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質が、アルキル鎖を有しないことを特徴とする［１］又は［２］に記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
［４］ 次の化学式（１）又は（２）で表される化合物であることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質。
【0009】
【化1】
【0010】
【化2】
［５］ 前記［１］～［４］のいずれかに記載のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を有効成分として含有する線維症治療薬。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、これのヒト線維芽細胞（以下、ＮＨＤＦともいう）に対する影響をＤＮＡマイクロアレイで検討した結果をグラフで示したものである。
【図3A】上図は、ＮＨＤＦにＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（４０量体）、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（モノマー）、ＧｌｃＮＡｃを添加し、２４時間培養後、ＧＤＦ１５のタンパク質レベルでの発現増加とβ－アクチンの発現を示すウエスタンブロットである。なお、コントロールはＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加しないものである。 また、下図は、ＧＤＦ１５とβ－アクチンとの比（ＧＤＦ１５／β－アクチン）をグラフで示したものである。
【図3B】上図は、ＮＨＤＦにＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（６２量体）、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（６９量体）を添加し、２４時間培養後、ＧＤＦ１５のタンパク質レベルでの発現増加とβ－アクチンの発現を示すウエスタンブロットである。なお、コントロールはＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加しないものである。 また、下図は、ＧＤＦ１５とβ－アクチンとの比（ＧＤＦ１５／β－アクチン）をグラフで示したものである。
【図3C】上図は、ＮＨＤＦにＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ添加し、２４時間培養後、ＧＤＦ１５のタンパク質レベルでの発現増加とβ－アクチンの発現を示すウエスタンブロットである。 また、下図は、ＧＤＦ１５とβ－アクチンとの比（ＧＤＦ１５／β－アクチン）をグラフで示したものである。
【図5】ＮＨＤＦに５０ｍＬのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質〔ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）及びＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（４０量体）〕とその他との成分として、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー及びＮ－アセチルグルコサミンを添加し、６日間培養した際のＮＨＤＦの増殖率を示す。コントロールはＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加しないものである。
【図6A】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を添加し、２４時間後に５μｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（以下、ＬＰＳともいう）を添加し、８時間後の細胞内のＴＮＦαの産生をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図6B】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を添加し、２４時間後の細胞内のＧＤＦ１５、ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びβ－アクチンの産生をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図6C】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を添加し、２４時間後に５μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し、８時間後の細胞内のＴＮＦαとβ－アクチンとの比（ＴＮＦα／β－アクチン）の値をグラフで示したものである。
【図7】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を添加し、２４時間後に５μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し、２４時間後の培地中のＴＮＦαの分泌量をＥＬＩＳＡで検出した結果を示す。
【図8】シャーレの中にガラス板を入れ、その上にＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を混合したアガロースゲルを滴下し、さらにＮＨＤＦをガラス板全体に播種した後、１日間インキュベートしたときのＮＨＤＦの状態を位相差顕微鏡で観察し、アガロースゲル底面に細胞への侵入状態を観察した結果を示す。コントロールは、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）の代わりにＰＢＳを用いた結果を示す。
【図9】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質のアガロースゲルへの配合量を５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬとしたときのＮＨＤＦの状態を位相差顕微鏡で観察し、アガロースゲル底面に細胞への侵入状態を観察した結果を示す。
【図10】重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー、実施例２で用いたＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はＰＢＳを用いたときのＮＨＤＦの状態を位相差顕微鏡で観察し、アガロースゲル底面に細胞への侵入状態を観察した結果を示す。
【図11】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質として、重合例１で調製したものと重合例２で調製したものとを用いたときのＮＨＤＦの状態を位相差顕微鏡で観察し、アガロースゲル底面に細胞への侵入状態を観察した結果を示す。
【図12】アガロースゲルに重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含有したゲルを滴下したシャーレを用い、培地中に重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を１０μｇ／ｍＬ含有させてＮＨＤＦの走化性を評価した結果を示す。
【図13】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の５０μｇ／ｍＬをＮＨＤＦに添加した１０分後、３０分後、６０分後、１２０分後のビメンチンのリン酸化を抗リン酸化ビメンチンセリン３８抗体でウエスタンブロッティングにて検出した結果を示す。
【図14A】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞に５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を添加し２４時間培養を行い、細胞内のＧＤＦ１５及びβ－アクチンの産生をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図14B】Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞に１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを添加して、６時間後の、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ－кＢ ｌｉｇａｎｄ（以下、ＲＡＮＫＬという）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びβ－アクチンの発現をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質とは、タンパク質のセリン及びスレオニン残基の水酸基にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミンが結合する翻訳後の修飾の一つで、細胞内のタンパク質がＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化されたタンパク質で、例えば下記一般式で表されるものである。このＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質は傷害細胞から漏出してアラーミン分子の様に働くことが予想される。すなわち、核内タンパク質や細胞骨格など４０００種類以上のタンパク質がＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化され、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質は細胞内に恒常的に多量に存在する。細胞に傷害、例えば線維化等が発生すると、このＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質が細胞外に大量に放出され、他の細胞の細胞表面のビメンチンに結合・作用し、細胞内の変動遺伝子に影響を与えＧＤＦ１５を発現させる。
【0014】
【化3】
【0015】
本発明のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は前述のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質と同様の働きをする化合物で特定のＮ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーからなる。線維症治療薬はこのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含有するものであり、この治療薬を疾患組織・細胞等の患部に結合・作用させることで線維症を改善することができる。
【0016】
以下、本発明のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質及びこれを含有する線維症治療薬について詳述する。
【0017】
［Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質］
本発明において、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位、スチレン単位、ポリエチレンイミン単位、ポリＬ－リジン単位及びビオチン単位からなる群から選ばれる少なくとも１種の単位とを有するポリマーである。これらＮ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーの質量平均分子量は３，０００～３０，０００、数平均分子量は２，５００～２５，０００の範囲のものが好ましく、Ｎ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーの質量平均分子量が３，０００以上、３０，０００以下、又は数平均分子量が２，５００以上、２５，０００以下であると細胞への作用が向上するためより好ましい。
Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質として用いられるＮ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーとしては重合による化合物の収率性面から質量平均分子量は４，０００～２０，０００の範囲が好ましく、数平均分子量は３，０００～１０，０００の範囲が好ましく、ＧＤＦ１５の発現性の面から質量平均分子量は４，０００～１５，０００の範囲が好ましく、数平均分子量は３，０００～８，０００の範囲が好ましい。
また、質量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比率（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．０～２．５の範囲が好ましく、ＧＤＦ１５の発現性やＲＡＮＫＬ及びＳｕｒｖｉｖｉｎ発現の抑制の面から１．２～２．２の範囲とすることがより好ましい。
本発明において、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位、スチレン単位、ポリエチレンイミン単位、ポリＬ－リジン単位及びビオチン単位からなる群から選ばれる少なくとも１種の単位とを有するポリマーである。これらＮ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーの質量平均分子量は３，０００～３０，０００、数平均分子量は２，５００～２５，０００の範囲のものが好ましく、Ｎ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーの質量平均分子量が３，０００以上、３０，０００以下、又は数平均分子量が２，５００以上、２５，０００以下であると細胞への作用が向上するためより好ましい。
Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質として用いられるＮ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーとしては重合による化合物の収率性面から質量平均分子量は４，０００～２０，０００の範囲が好ましく、数平均分子量は３，０００～１０，０００の範囲が好ましく、ＧＤＦ１５の発現性の面から質量平均分子量は４，０００～１５，０００の範囲が好ましく、数平均分子量は３，０００～８，０００の範囲が好ましい。
また、質量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比率（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．０～２．５の範囲が好ましく、ＧＤＦ１５の発現性やＲＡＮＫＬ及びＳｕｒｖｉｖｉｎ発現の抑制の面から１．２～２．２の範囲とすることがより好ましい。
【0018】
Ｎ－アセチルグルコサミン単位としては、Ｎ－アセチルグルコサミン、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、またはキトヘキサオース等が挙げられる。また、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖基含有有機樹脂化合物としては、例えばＮ－アセチルグルコサミン糖鎖基としてＮ－アセチルグルコサミン基や、それが２～６個結合したキトポリオース基を含有する化合物などが挙げられる。
また、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位としてはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、アクリル酸２－カルボキシエチル、メタクリル酸２－カルボキシエチル等が挙げられる。
Ｎ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーの製造方法は特に限定はなく、ラジカル重合やリビングラジカル重合、連鎖移動剤（ＲＡＦＴ剤）を用いた可逆的付加－開裂連鎖移動型重合法（ＲＡＦＴ重合法）等を用いることができる。例えば、前記Ｎ－アセチルグルコサミン基を有するモノマーを重合して得られるポリマーの製造方法としては、Ｎ－アセチルグルコサミンの還元末端に、アクリル酸２－カルボキシエチル等の疎水性基を有する化合物が結合したモノマーを重合する方法等が挙げられる。より詳しい製造方法としては、疎水性基を有する化合物であるアクリル酸２－カルボキシエチルとアミノ化したＮ－アセチルグルコサミンとをＤＭＴ－ＭＭにより縮合反応することによって、Ｎ－アセチルグルコサミン基を導入したアクリル系モノマーを得た後、該モノマーを重合させて製造する方法等が挙げられる。また、前記高分子化合物にＮ－アセチルグルコサミンを結合させたポリマーの製造方法としては、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端でカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンやポリＬ－リジン等の疎水性基を有するポリマー化合物とを結合する方法等が挙げられる。
ここで、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖を化合物に結合させる方法は、特に限定されないが、例えば、アミノ基を有する化合物のアミノ基と、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端とを、還元アミノ化法で結合することができる。また、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖のヒドロキシ基をカルボキシル基で置換し、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング法等によって、アミノ基を有する化合物のアミノ基と結合させてもよい。
また、分子量を制御するためにＲＡＦＴ重合法を用いると分子量分布を狭くすることができるので好ましい。分子量の制御においては重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比率（Ｍｗ／Ｍｎ）を１．０以上、１．５未満とするようにすることで細胞培養材料表面にＮ－アセチルグルコサミンを多く存在させることができ、細胞集団中の間葉系幹細胞をより多く捉えることができるようになるため、好ましい。
重合方法の具体例としてはＮ－アセチルグルコサミン、疎水性基を有する化合物としてアクリル酸２－カルボキシエチルとをモル比で１：１の割合で混合し、ＤＭＴ－ＭＭ、ＤＭＳＯ又は水などの溶液中で縮合反応させＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを調製する。ＲＡＦＴ重合法によりpoly(N-ethylacrylic acid-O-2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranosylamine)（以下、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーという）を得ることができる。また、本発明のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は細胞との作用性を向上させるためＲＡＦＴ重合法由来のアルキル鎖を除去することが好ましい。アルキル鎖を除去する方法としてはＲＡＦＴ重合法で得たポリマーの末端を還元剤等を用いてチオール化した後、マレイミドを反応させる方法などが挙げられる。
また、カルボキシ基含有ラジカル重合性単位としてはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、アクリル酸２－カルボキシエチル、メタクリル酸２－カルボキシエチル等が挙げられる。
Ｎ－アセチルグルコサミン基含有ポリマーの製造方法は特に限定はなく、ラジカル重合やリビングラジカル重合、連鎖移動剤（ＲＡＦＴ剤）を用いた可逆的付加－開裂連鎖移動型重合法（ＲＡＦＴ重合法）等を用いることができる。例えば、前記Ｎ－アセチルグルコサミン基を有するモノマーを重合して得られるポリマーの製造方法としては、Ｎ－アセチルグルコサミンの還元末端に、アクリル酸２－カルボキシエチル等の疎水性基を有する化合物が結合したモノマーを重合する方法等が挙げられる。より詳しい製造方法としては、疎水性基を有する化合物であるアクリル酸２－カルボキシエチルとアミノ化したＮ－アセチルグルコサミンとをＤＭＴ－ＭＭにより縮合反応することによって、Ｎ－アセチルグルコサミン基を導入したアクリル系モノマーを得た後、該モノマーを重合させて製造する方法等が挙げられる。また、前記高分子化合物にＮ－アセチルグルコサミンを結合させたポリマーの製造方法としては、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端でカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンやポリＬ－リジン等の疎水性基を有するポリマー化合物とを結合する方法等が挙げられる。
ここで、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖を化合物に結合させる方法は、特に限定されないが、例えば、アミノ基を有する化合物のアミノ基と、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端とを、還元アミノ化法で結合することができる。また、Ｎ－アセチルグルコサミン糖鎖のヒドロキシ基をカルボキシル基で置換し、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング法等によって、アミノ基を有する化合物のアミノ基と結合させてもよい。
また、分子量を制御するためにＲＡＦＴ重合法を用いると分子量分布を狭くすることができるので好ましい。分子量の制御においては重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比率（Ｍｗ／Ｍｎ）を１．０以上、１．５未満とするようにすることで細胞培養材料表面にＮ－アセチルグルコサミンを多く存在させることができ、細胞集団中の間葉系幹細胞をより多く捉えることができるようになるため、好ましい。
重合方法の具体例としてはＮ－アセチルグルコサミン、疎水性基を有する化合物としてアクリル酸２－カルボキシエチルとをモル比で１：１の割合で混合し、ＤＭＴ－ＭＭ、ＤＭＳＯ又は水などの溶液中で縮合反応させＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを調製する。ＲＡＦＴ重合法によりpoly(N-ethylacrylic acid-O-2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranosylamine)（以下、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーという）を得ることができる。また、本発明のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は細胞との作用性を向上させるためＲＡＦＴ重合法由来のアルキル鎖を除去することが好ましい。アルキル鎖を除去する方法としてはＲＡＦＴ重合法で得たポリマーの末端を還元剤等を用いてチオール化した後、マレイミドを反応させる方法などが挙げられる。
【0019】
また、本発明のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、前記Ｎ－アセチルグルコサミン基を１分子当たり３～１００個含むことが好ましい。この数より少ないとビメンチンとの結合性が低下する傾向にあり、この数を超えると単位面積当たりのＮ－アセチルグルコサミン量が少なくなるため、ビメンチンとの結合性が低下する傾向となる。したがってより好ましい個数は８～８０個の範囲であり、さらに好ましい個数は１０～７０個の範囲であり、特に好ましい個数は１０～６９個の範囲であり、最も好ましい個数は１０～５０個の範囲である。
【0020】
＜線維症治療薬＞
本発明の線維症治療薬は前述のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含有するものであり、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サルなど）に経口的にあるいは非経口的（静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与、直腸投与など）に投与することができる。本発明の線維症治療薬は、前記のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を経口または非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤、貼付剤、坐剤などの所望の形態に製剤化することにより調製することができる。線維症治療薬中のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の含有量はＧＤＦ１５の発現増加による抗炎症採用や細胞増殖抑制が得られれば特に限定はないが、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは１０％以上である。
本発明の線維症治療薬は前述のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含有するものであり、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サルなど）に経口的にあるいは非経口的（静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与、直腸投与など）に投与することができる。本発明の線維症治療薬は、前記のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を経口または非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤、貼付剤、坐剤などの所望の形態に製剤化することにより調製することができる。線維症治療薬中のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の含有量はＧＤＦ１５の発現増加による抗炎症採用や細胞増殖抑制が得られれば特に限定はないが、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは１０％以上である。
【0021】
＜線維症＞
本発明でいう線維症とは、薬物等の化学的刺激、過度の圧負荷、炎症反応等のストレスにより組織実質細胞の脱落や組織の機能低下が起こり、それを補う過程で生じた過剰な線維芽細胞の遊走増殖、並びにその後の細胞間マトリックス蛋白質の合成沈着による組織の機能障害を伴った硬直化を意味し、誘発刺激の別や発症部位は特に限定されない。このような組織線維化疾患としては、例えば肺、膀胱、腎臓、心臓、肝臓等の内臓組織の線維症が挙げられる。本発明が対象とする線維症には、抗腫瘍剤、抗生物質、抗菌剤、抗不整脈剤、消炎剤、抗リウマチ剤、インターフェロンまたは小柴胡湯などの薬剤の投与により引き起こされる組織線維化疾患、並びに慢性腎炎、間質性心筋炎および間質性膀胱炎などの疾患に伴う組織線維化疾患も含まれる。具体的には、ブレオマイシン投与の副作用で生じる肺の線維症や、間質性肺炎の際またはその後に生じる肺線維症；間質性膀胱炎の際に生じる膀胱の線維症や膀胱頚部硬化症；遺伝子異常等によって生じる腎線維症、および腎不全（腎硬化症）；心筋梗塞後のリモデリングによって生じる心内膜線維症；肝細胞の損傷によって生じる肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、それに伴う門脈圧亢進症及び肝硬変；過剰な組織修復によって生じるケロイド、その他、硬化性腹膜炎、前立腺肥大症、強皮症、子宮平滑筋腫、後腹膜線維症、及び骨髄線維症等を例示することができる。
本発明の線維症治療薬のなかでも、線維化抑制薬は、星細胞が活性化して筋線維芽様細胞に形質転換する線維化シグナルを阻害することで、線維化を改善するものである。したがって星細胞が活性化して筋線維芽様細胞となる線維症、例えば肝臓の場合、活性化した星細胞が筋線維芽様細胞に形質転換し、細胞外基質を産生することによって線維化が進行するが、本発明の線維症治療薬を用いることで肝線維化を改善させ、肝機能の改善と肝癌発生を抑制することが可能となる。同様に膵線維化などに対して用いることも可能である。
本発明でいう線維症とは、薬物等の化学的刺激、過度の圧負荷、炎症反応等のストレスにより組織実質細胞の脱落や組織の機能低下が起こり、それを補う過程で生じた過剰な線維芽細胞の遊走増殖、並びにその後の細胞間マトリックス蛋白質の合成沈着による組織の機能障害を伴った硬直化を意味し、誘発刺激の別や発症部位は特に限定されない。このような組織線維化疾患としては、例えば肺、膀胱、腎臓、心臓、肝臓等の内臓組織の線維症が挙げられる。本発明が対象とする線維症には、抗腫瘍剤、抗生物質、抗菌剤、抗不整脈剤、消炎剤、抗リウマチ剤、インターフェロンまたは小柴胡湯などの薬剤の投与により引き起こされる組織線維化疾患、並びに慢性腎炎、間質性心筋炎および間質性膀胱炎などの疾患に伴う組織線維化疾患も含まれる。具体的には、ブレオマイシン投与の副作用で生じる肺の線維症や、間質性肺炎の際またはその後に生じる肺線維症；間質性膀胱炎の際に生じる膀胱の線維症や膀胱頚部硬化症；遺伝子異常等によって生じる腎線維症、および腎不全（腎硬化症）；心筋梗塞後のリモデリングによって生じる心内膜線維症；肝細胞の損傷によって生じる肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、それに伴う門脈圧亢進症及び肝硬変；過剰な組織修復によって生じるケロイド、その他、硬化性腹膜炎、前立腺肥大症、強皮症、子宮平滑筋腫、後腹膜線維症、及び骨髄線維症等を例示することができる。
本発明の線維症治療薬のなかでも、線維化抑制薬は、星細胞が活性化して筋線維芽様細胞に形質転換する線維化シグナルを阻害することで、線維化を改善するものである。したがって星細胞が活性化して筋線維芽様細胞となる線維症、例えば肝臓の場合、活性化した星細胞が筋線維芽様細胞に形質転換し、細胞外基質を産生することによって線維化が進行するが、本発明の線維症治療薬を用いることで肝線維化を改善させ、肝機能の改善と肝癌発生を抑制することが可能となる。同様に膵線維化などに対して用いることも可能である。
【0022】
＜線維症の治療方法＞
本発明の線維症の治療方法は、本発明の上記治療薬を線維化組織・細胞に結合させることを特徴とするものである。結合の方法は特に限定されないが、線維化組織・細胞に直接治療薬を添加したり、製剤化した線維症治療薬を経口的にあるいは非経口的に投与し、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質が患部及びその付近に到達させるなどの方法等が挙げられる。
本発明の線維症の治療方法は、本発明の上記治療薬を線維化組織・細胞に結合させることを特徴とするものである。結合の方法は特に限定されないが、線維化組織・細胞に直接治療薬を添加したり、製剤化した線維症治療薬を経口的にあるいは非経口的に投与し、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質が患部及びその付近に到達させるなどの方法等が挙げられる。
【実施例】
【0023】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。なお、以下において「％」とあるのは、特に断りのない限り、すべて質量基準である。
【0024】
［Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の重合］
〔重合例１〕
＜ＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ２の作製＞
５ｇのＧｌｃＮＡｃを５０ｍＬの水に溶解し、ＮＨ４ＨＣＯ３を飽和させるまで加えた。ナスフラスコで攪拌し、３０～３７℃で４～５日間、蓋を開けた開放系でインキュベーションしＮＨ４ＨＣＯ３の沈澱がなくなったら適宜加えた。ＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ２の合成を薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてethyl acetate / acetic acid / methanol / water = 4:3:3:1 (v/v/v/v)、GlcNAc Rf値：0.71にて確認した。４～５日後、水を反応液に加えエバポレーター（３０℃）を行うことで、余分なＮＨ４ＨＣＯ３を取り除いた。なお、この操作は匂いがしなくなるまで、何度も繰り返し行った。エバポレーター後、凍結乾燥を行った。
＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの作製＞
ＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ２（４．５ｍｍｏｌ：約１ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解して、2-carboxyethyl acrylate（４．５ｍｍｏｌ：約０．６５ｇ）を加えた。溶解後に、ＤＭＴ－ＭＭ（６．８ｍｍｏｌ） を加えて１８時間、室温でインキュベーションを行った。インキュベーション後、反応物を２００～３００ｍＬのクロロホルムに滴下した。沈澱が得られるので、桐山ロートで回収した。回収した沈澱をメタノールで溶解させ、不溶物を桐山ロートで取り除き、メタノールで溶解したものを回収した。エバポレーターを行い、メタノールを除去した。メタノールを除去した固形物を水で溶解し、その後、分取型ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製を行い、さらにエバポレーターでアセトニトリルを除去後、凍結乾燥を行い下記化学式のＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを得た。
〔重合例１〕
＜ＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ２の作製＞
５ｇのＧｌｃＮＡｃを５０ｍＬの水に溶解し、ＮＨ４ＨＣＯ３を飽和させるまで加えた。ナスフラスコで攪拌し、３０～３７℃で４～５日間、蓋を開けた開放系でインキュベーションしＮＨ４ＨＣＯ３の沈澱がなくなったら適宜加えた。ＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ２の合成を薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてethyl acetate / acetic acid / methanol / water = 4:3:3:1 (v/v/v/v)、GlcNAc Rf値：0.71にて確認した。４～５日後、水を反応液に加えエバポレーター（３０℃）を行うことで、余分なＮＨ４ＨＣＯ３を取り除いた。なお、この操作は匂いがしなくなるまで、何度も繰り返し行った。エバポレーター後、凍結乾燥を行った。
＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの作製＞
ＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ２（４．５ｍｍｏｌ：約１ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解して、2-carboxyethyl acrylate（４．５ｍｍｏｌ：約０．６５ｇ）を加えた。溶解後に、ＤＭＴ－ＭＭ（６．８ｍｍｏｌ） を加えて１８時間、室温でインキュベーションを行った。インキュベーション後、反応物を２００～３００ｍＬのクロロホルムに滴下した。沈澱が得られるので、桐山ロートで回収した。回収した沈澱をメタノールで溶解させ、不溶物を桐山ロートで取り除き、メタノールで溶解したものを回収した。エバポレーターを行い、メタノールを除去した。メタノールを除去した固形物を水で溶解し、その後、分取型ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製を行い、さらにエバポレーターでアセトニトリルを除去後、凍結乾燥を行い下記化学式のＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを得た。
【0025】
【化4】
（１）ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー ５０ｍｇを１ｍＬのマイクロチューブに量り取り、２５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。（２）ＲＡＦＴ剤（２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロパン酸（ＤＴＭＰＡ：シグマ社製）を約５．２６ｍｇ（モノマーの１／１０モル当量）を１ｍＬのマイクロチューブに量り取り、２００μＬに溶解した。さらに（３）アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）の１ｍｇ（モノマーに対して２％）をマイクロチューブに量り取り、ＡＩＢＮの１ｍｇがＤＭＳＯ５０μＬに溶解するようにＤＭＳＯを加えた。（１）の溶液２５０μＬに（２）の溶液２００μＬを混合した後、（３）の溶液５０μＬを混合し、脱気後（凍結融解脱気を三回程度繰り返す）、６５℃で約１８時間インキュベーションを行ない重合した。重合後、イソプロパノールで重合物を沈澱させ、遠心分離後回収して水に溶解し、透析（ＭＷ１００－５００）を約１日行い、未反応のモノマーを除いた。透析後、凍結乾燥を行い、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマー（１０量体、以下、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０という）を作製した。
このＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０の１０ｍｇを１ｍＬマイクロチューブに量り取り、水１００μＬに溶解した。還元剤として水素化ほう素ナトリウム１ｍｇを１ｍＬマイクロチューブに量り取り、水１００μＬに還元剤１ｍｇが溶解するように水を加えた。これら各溶液１００μＬを混合し、末端をチオール化後、イソプロパノール（ＩＰＡ）に滴下し沈殿（反応物）を回収した。
ついで、水に１～３Ｍ酢酸ナトリウムを加えｐＨ７～８になるように調整した溶媒１００μＬを準備し、これに反応物を溶解した。ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０と等量のモル数のマレイミドを、ｐＨを調整した溶媒１００μＬに溶解し、前記反応物を溶解した溶液とこの溶液とを混合し、１～２時間放置した。この溶液をＩＰＡに滴下し沈殿を回収後、反応物を水に溶解し、凍結乾燥を行いＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を得た。
こののもの質量平均分子量は４０００、数平均分子量は３１００であり、この各平均分子量はGel Permeation Chromatography（ＧＰＣ）装置（製品名：ＬＣ－９１１０Ｇ ＮＥＸＴ、日本分析工業（株）社製）を用いて、次の条件で測定した。カラムは、ＪＡＩＧＥＬ－ＧＳ５１０を用いて、溶離液は、２００ｍＭ 硝酸ナトリウム／アセトニトリル＝８０／２０で行った。流量は１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器はＲＩ検出器、カラム温度は４０℃で行った。分子量の標準曲線はプルランで実施した。
【0026】
［重合例２］
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約１ｍｇ（モノマーの１／５０モル当量）とした以外は全て重合例１と同様にしてＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０という）を作製した。
このものの質量平均分子量は１４，０００、数平均分子量は６８００であった。
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約１ｍｇ（モノマーの１／５０モル当量）とした以外は全て重合例１と同様にしてＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０という）を作製した。
このものの質量平均分子量は１４，０００、数平均分子量は６８００であった。
【0027】
［重合例３］
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．７５ｍｇ（モノマーの１／７０モル当量）とした以外はすべて重合例１と同様にしてＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６２という）を作製した。
このものの質量平均分子量は２１，８００、数平均分子量は１２，５００であった。
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．７５ｍｇ（モノマーの１／７０モル当量）とした以外はすべて重合例１と同様にしてＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６２という）を作製した。
このものの質量平均分子量は２１，８００、数平均分子量は１２，５００であった。
【0028】
［重合例４］
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．５２ｍｇ（モノマーの１／１００モル当量）とした以外はすべて重合例１と同様にしてＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６９という）を作製した。
このものの質量平均分子量は２４，４５０、数平均分子量は１２，８００であった。
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．５２ｍｇ（モノマーの１／１００モル当量）とした以外はすべて重合例１と同様にしてＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６９という）を作製した。
このものの質量平均分子量は２４，４５０、数平均分子量は１２，８００であった。
【0029】
〔重合例５〕
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの作製＞までの重合を行いＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを作製した。このものの質量平均分子量及び数平均分子量のいずれも３４６であった。
重合例１の＜ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの作製＞までの重合を行いＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを作製した。このものの質量平均分子量及び数平均分子量のいずれも３４６であった。
【0030】
［実施例１］
重合例１で得たＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）のヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対する影響をＤＮＡマイクロアレイを用いて確認した。
ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬの重合例１で得たＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ｍＲＮＡを回収しＤＮＡマイクロアレイを実施し、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の遺伝子発現変化を確認した。ＤＮＡマイクロアレイは、Agilent Technologies社のマイクロアレイシステムを使用し実施した。その結果を図１及び図２に示す。
図１は、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を刺激したＮＨＤＦの遺伝子発現レベル（縦軸）と無刺激のＮＨＤＦの遺伝子発現レベル（横軸）をプロットしたものである。左図は、解析した遺伝子全てを示した。右図は、有意に発現レベルの差のあった遺伝子群をプロットした（両者の発現レベルの差が１．５倍以上あるもの及び０．６６倍以下のもの）。
図２に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の刺激により、ＧＤＦ１５及びアディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）の発現が高かった。これらの結果からＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質はＮＨＤＦに作用させることによりＧＤＦ１５及びアディポネクチンのタンパク質レベルでの発現を上昇させることが分かる。
重合例１で得たＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）のヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対する影響をＤＮＡマイクロアレイを用いて確認した。
ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬの重合例１で得たＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ｍＲＮＡを回収しＤＮＡマイクロアレイを実施し、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の遺伝子発現変化を確認した。ＤＮＡマイクロアレイは、Agilent Technologies社のマイクロアレイシステムを使用し実施した。その結果を図１及び図２に示す。
図１は、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を刺激したＮＨＤＦの遺伝子発現レベル（縦軸）と無刺激のＮＨＤＦの遺伝子発現レベル（横軸）をプロットしたものである。左図は、解析した遺伝子全てを示した。右図は、有意に発現レベルの差のあった遺伝子群をプロットした（両者の発現レベルの差が１．５倍以上あるもの及び０．６６倍以下のもの）。
図２に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の刺激により、ＧＤＦ１５及びアディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）の発現が高かった。これらの結果からＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質はＮＨＤＦに作用させることによりＧＤＦ１５及びアディポネクチンのタンパク質レベルでの発現を上昇させることが分かる。
【0031】
［実施例２］
ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬの重合例１～５で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー又はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ＮＨＤＦのＧＤＦ１５の発現をウエスタンブロッティングにより調べた。その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。なお、コントロールは何も添加しないものである。
この結果から重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０、質量平均分子量４０００、数平均分子量３１００）、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０、質量平均分子量１４，０００、数平均分子量６８００）、重合例３で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６２、質量平均分子量２１，８００、数平均分子量１２，５００）及び重合例４で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６９、質量平均分子量２４，４５０、数平均分子量１２，８００）はＧＤＦ１５の発現が増加しているが、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーやＧｌｃＮＡｃはコントロールとほぼ同等の効果であることが分かる。
さらに、ＮＨＤＦに１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０、質量平均分子量４０００、数平均分子量３１００）を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ＮＨＤＦのＧＤＦ１５の発現をウエスタンブロティングにより観察した。その結果を図３Ｃに示す。なお、コントロールは何も添加しないものである。
この結果から重合例１で調製したＯ結合型Ｎ-アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０、質量平均分子量４０００、数平均分子量３１００）は添加量に比例しＧＤＦ１５の発現が増加していることが分かる。
ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬの重合例１～５で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー又はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ＮＨＤＦのＧＤＦ１５の発現をウエスタンブロッティングにより調べた。その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。なお、コントロールは何も添加しないものである。
この結果から重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０、質量平均分子量４０００、数平均分子量３１００）、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０、質量平均分子量１４，０００、数平均分子量６８００）、重合例３で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６２、質量平均分子量２１，８００、数平均分子量１２，５００）及び重合例４で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ６９、質量平均分子量２４，４５０、数平均分子量１２，８００）はＧＤＦ１５の発現が増加しているが、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーやＧｌｃＮＡｃはコントロールとほぼ同等の効果であることが分かる。
さらに、ＮＨＤＦに１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０、質量平均分子量４０００、数平均分子量３１００）を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ＮＨＤＦのＧＤＦ１５の発現をウエスタンブロティングにより観察した。その結果を図３Ｃに示す。なお、コントロールは何も添加しないものである。
この結果から重合例１で調製したＯ結合型Ｎ-アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０、質量平均分子量４０００、数平均分子量３１００）は添加量に比例しＧＤＦ１５の発現が増加していることが分かる。
【0032】
［実施例３］
実施例１のマイクロアレイの結果から重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）による変動遺伝子のパスウェイ解析を行った。その結果を図４に示す。発現変動の大きかった全遺伝子群（図１の右図に示したもの）をパスウェイ解析ソフトであるDAVID Bioinformatics Resources 6.8に入力し、パスウェイ解析を実施した。
この結果から、細胞増殖の停止が重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質によって引き起こされていることが分かる。特に細胞周期のＧ２、Ｍ期を進行する遺伝子の低下が観察された。
これはＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は細胞表面のビメンチンに相互作用することから、ビメンチンの細胞分裂に関する機能の抑制から細胞周期の停止が引き起こされたが、何も添加しないコントロールではそのようなことが発生していないため、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を作用されたＮＨＤＦに比べ増殖率が高くなっていると考えられる。
実施例１のマイクロアレイの結果から重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）による変動遺伝子のパスウェイ解析を行った。その結果を図４に示す。発現変動の大きかった全遺伝子群（図１の右図に示したもの）をパスウェイ解析ソフトであるDAVID Bioinformatics Resources 6.8に入力し、パスウェイ解析を実施した。
この結果から、細胞増殖の停止が重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質によって引き起こされていることが分かる。特に細胞周期のＧ２、Ｍ期を進行する遺伝子の低下が観察された。
これはＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は細胞表面のビメンチンに相互作用することから、ビメンチンの細胞分裂に関する機能の抑制から細胞周期の停止が引き起こされたが、何も添加しないコントロールではそのようなことが発生していないため、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を作用されたＮＨＤＦに比べ増殖率が高くなっていると考えられる。
【0033】
［実施例４］
ＮＨＤＦを４８ウェルプレートに播種し、５０μｇ／ｍＬの重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０）、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー及びＮ－アセチルグルコサミンを添加した。その後６日間培養し、各々の日毎の細胞生存率をCell Counting Kit-8 (CCK-8)（同仁化学社製）で測定した。その結果を図５に示す。
この結果から、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０及びＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０）で処理したＮＨＤＦの増殖性が低下していることが分かる。
ＮＨＤＦを４８ウェルプレートに播種し、５０μｇ／ｍＬの重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０）、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー及びＮ－アセチルグルコサミンを添加した。その後６日間培養し、各々の日毎の細胞生存率をCell Counting Kit-8 (CCK-8)（同仁化学社製）で測定した。その結果を図５に示す。
この結果から、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０及びＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０）で処理したＮＨＤＦの増殖性が低下していることが分かる。
【0034】
［実施例５］
Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質による抗炎症作用を以下のようにして検討した。
５０μｇ／ｍＬの重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）をＮＨＤＦに添加し、２４時間培養を行った。このＮＨＤＦにlipopolysaccharide(LPS)を添加して、ＴＮＦαの発現変化を観察した。また、ＬＰＳ添加後８時間後の細胞内のＴＮＦαの発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図６Ａに示す。また、ＬＰＳ添加後８時間後の細胞内のＧＤＦ１５、ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びβ－アクチンの発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図６Ｂに示す。さらに、ＬＰＳ添加後８時間後の細胞内のＴＮＦαとβ－アクチンとの比（ＴＮＦα／β－アクチン）を検討した。その結果を図６Ｃに示す。
図６Ａ及び図６Ｃに示したように、重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質で処理したＮＨＤＦにＬＰＳを作用させたところ、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦαの発現上昇の抑制が観察された。また、図６Ｂに示したように、重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質で処理したＮＨＤＦはＧＤＦ１５の発現が上昇し、ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現の抑制が観察された。ＧＤＦ１５は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一種でありＮＦ－κＢの転写活性を阻害することが知られている。従って、ＮＨＤＦのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質処理によるＧＤＦ１５の発現上昇によってＮＦ－κＢの活性化が抑制され、ＴＮＦαの発現が減少したと推察される。
次に、ＮＨＤＦにＬＰＳ添加後２４時間後の培地中へのＴＮＦ－αの分泌量をＥＬＩＳＡで測定した。ＮＨＤＦは、ＤＭＥＭ（無血清）に培地交換して、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を５０μｇ／ｍＬで添加した。ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０を添加２４時間後にＬＰＳを５μｇ／ｍＬ添加し、さらに２４時間後に培養上清を回収し、培養上清中に含まれるＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡで測定した。このとき、ＮＨＤＦのＤＭＥＭ培養上清（コントロール）、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＭＡｃ１０を添加し４８時間後の培養上清（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）及びＮＨＤＦに５μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し２４時間後の培養上清中に含まれるＴＮＦαも合わせて測定した。その結果を図７に示す。図７に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加していないもの（コントロール）とＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加したものはＴＮＦαの分泌量に変化がなかったが、コントロールにＬＰＳを添加したものはＴＮＦαの分泌量の増加が観察され、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加したものにＬＰＳを添加したものはＬＰＳによるＴＮＦαの分泌量増加の抑制が観察された。
Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質による抗炎症作用を以下のようにして検討した。
５０μｇ／ｍＬの重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）をＮＨＤＦに添加し、２４時間培養を行った。このＮＨＤＦにlipopolysaccharide(LPS)を添加して、ＴＮＦαの発現変化を観察した。また、ＬＰＳ添加後８時間後の細胞内のＴＮＦαの発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図６Ａに示す。また、ＬＰＳ添加後８時間後の細胞内のＧＤＦ１５、ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びβ－アクチンの発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図６Ｂに示す。さらに、ＬＰＳ添加後８時間後の細胞内のＴＮＦαとβ－アクチンとの比（ＴＮＦα／β－アクチン）を検討した。その結果を図６Ｃに示す。
図６Ａ及び図６Ｃに示したように、重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質で処理したＮＨＤＦにＬＰＳを作用させたところ、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦαの発現上昇の抑制が観察された。また、図６Ｂに示したように、重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質で処理したＮＨＤＦはＧＤＦ１５の発現が上昇し、ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現の抑制が観察された。ＧＤＦ１５は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一種でありＮＦ－κＢの転写活性を阻害することが知られている。従って、ＮＨＤＦのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質処理によるＧＤＦ１５の発現上昇によってＮＦ－κＢの活性化が抑制され、ＴＮＦαの発現が減少したと推察される。
次に、ＮＨＤＦにＬＰＳ添加後２４時間後の培地中へのＴＮＦ－αの分泌量をＥＬＩＳＡで測定した。ＮＨＤＦは、ＤＭＥＭ（無血清）に培地交換して、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を５０μｇ／ｍＬで添加した。ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０を添加２４時間後にＬＰＳを５μｇ／ｍＬ添加し、さらに２４時間後に培養上清を回収し、培養上清中に含まれるＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡで測定した。このとき、ＮＨＤＦのＤＭＥＭ培養上清（コントロール）、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＭＡｃ１０を添加し４８時間後の培養上清（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）及びＮＨＤＦに５μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し２４時間後の培養上清中に含まれるＴＮＦαも合わせて測定した。その結果を図７に示す。図７に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加していないもの（コントロール）とＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加したものはＴＮＦαの分泌量に変化がなかったが、コントロールにＬＰＳを添加したものはＴＮＦαの分泌量の増加が観察され、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を添加したものにＬＰＳを添加したものはＬＰＳによるＴＮＦαの分泌量増加の抑制が観察された。
【0035】
［実施例６］
ＮＨＤＦへのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質添加による刺激が細胞遊走能に影響があるかを以下のようにして検討した。
Ｏ結合型Ｎ-アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、アガロースゲルに２５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を混合し、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質含有アガロースゲルを調製した。また、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質に変えてＰＢＳを用いてＰＢＳ含有アガロースゲルを調製した。シャーレの中にガラス板を入れ、その上に各々のアガロースゲルを滴下し、さらにＮＨＤＦをガラス板全体に播種後、１日間インキュベートした。
図８に、このときのＮＨＤＦの状態を位相差顕微鏡で観察しアガロースゲル底面に細胞への侵入状態を観察した結果を示す。図８の結果から重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を含有したアガロースゲルの下にＮＨＤＦが入り込んでいることからＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質はＮＨＤＦに走化性を与えていることが分かる。
次に、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質のアガロースゲルへの配合量を５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬとしたものを用意し、上記と同様にＮＨＤＦの走化性評価をした。その結果を図９に示す。図９の結果から、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度によりＮＨＤＦの走化性が変化した。具体的には、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度が２５０μｇ／ｍＬでは細胞がゲル内に入り込んだ距離は７５０μｍ、ゲル内に入り込んだ細胞数は６０個程度であった。Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度が１００μｇ／ｍＬでは前述の距離は４５０μｍ、前述の細胞数は１２個程度となった。Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度が５０μｇ／ｍＬでは前述の距離は２８０μｍ、前述の細胞数は１０個程度であり、ＰＢＳを含有するアガロースゲルでは前述の距離及び細胞数ともに０であった。このことからＮＨＤＦの走化性はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度に依存していることが分かる。
次に、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質によるＮＨＤＦの走化性について評価した。使用した材料は重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー、実施例２で用いたＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＰＢＳであり、上記と同様にＮＨＤＦの走化性を評価した。その結果を図１０に示す。図１０に示したように、ポリマーである重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質でのみアガロースゲルの下に細胞が侵入し、ＮＨＤＦが入り込んだ距離は４２０μｍ、ＮＨＤＦが入り込んだ数は２９個であった。このことからＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質はポリマーであることでＮＨＤＦを作用することが分かる。
次に、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の重合度の違いによるＮＨＤＦの走化性の違いがあるか否かを上記と同様の方法で評価した。評価ではＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としては重合例１（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）と重合例２（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０）のものを用いた。その結果を図１１に示す。図１１の結果からいずれのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質もアガロースゲルの下に細胞が侵入しているが、ＮＨＤＦが入り込んだ距離は重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質では７８０μｍ、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質では６００μｍであり、ＮＨＤＦがゲル内に入り込んだ数は重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は６０個、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は５０個であった。
また、アガロースゲルに重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を含有したゲルを滴下したシャーレを２つ用意し、その一つに培地中に重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を１０μｇ／ｍＬ含有させて、ＮＨＤＦの走化性を評価した。その結果を図１２に示す。図１２の結果から培地中にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含有した場合、アガロースゲルの下に侵入するＮＨＤＦが減少していることが分かる。具体的にはＮＨＤＦが入り込んだ距離はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含む培地を用いたものは１０００μｍであるが、培地にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含まないものでは１２５０μｍであった。ＮＨＤＦが入り込んだ数はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含む培地を用いたものでは８０個、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含まないものでは１４０個であった。なお、ＰＢＳを含有するアガロースゲルではＮＨＤＦはゲル内に侵入していない。
さらに重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）によるＮＨＤＦの遊走性の刺激について、ビメンチンのリン酸化を検出することで検討した。Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、細胞表面上に出現したビメンチンに結合することから、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質添加によるビメンチンへのシグナル伝達をビメンチンのアミノ酸配列の３８番目のセリンのリン酸化によって検討した。ビメンチンの３８番目のセリンがリン酸化されることで細胞遊走性が刺激されることが明らかになっている。そこで、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質をＮＨＤＦに添加した１０分後、３０分後、６０分後、１２０分後のビメンチンのリン酸化を抗リン酸化ビメンチンセリン３８抗体でウエスタンブロッティングにて検出した。その結果を図１３に示す。図１３に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質添加後の１０分後には、ビメンチンのリン酸化が観察され、１２０分後には低下が観察された。このことから、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質がＮＨＤＦの細胞表面のビメンチンに結合してＧＤＦ１５の発現や細胞遊走性を刺激していることが明らかになった。
以上の結果からＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質で処理されたＮＨＤＦに高い細胞遊走能があることが確認された。また、図１３に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）の細胞表面ビメンチンの刺激に伴うビメンチンのリン酸化も観察されたことから、ビメンチンの脱重合及びそれに伴うシグナル伝達によって細胞遊走能の刺激がなされたと考えられる。
ＮＨＤＦへのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質添加による刺激が細胞遊走能に影響があるかを以下のようにして検討した。
Ｏ結合型Ｎ-アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としてＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を用い、アガロースゲルに２５０μｇ／ｍＬのＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ（１０量体）を混合し、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質含有アガロースゲルを調製した。また、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質に変えてＰＢＳを用いてＰＢＳ含有アガロースゲルを調製した。シャーレの中にガラス板を入れ、その上に各々のアガロースゲルを滴下し、さらにＮＨＤＦをガラス板全体に播種後、１日間インキュベートした。
図８に、このときのＮＨＤＦの状態を位相差顕微鏡で観察しアガロースゲル底面に細胞への侵入状態を観察した結果を示す。図８の結果から重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を含有したアガロースゲルの下にＮＨＤＦが入り込んでいることからＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質はＮＨＤＦに走化性を与えていることが分かる。
次に、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質のアガロースゲルへの配合量を５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬとしたものを用意し、上記と同様にＮＨＤＦの走化性評価をした。その結果を図９に示す。図９の結果から、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度によりＮＨＤＦの走化性が変化した。具体的には、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度が２５０μｇ／ｍＬでは細胞がゲル内に入り込んだ距離は７５０μｍ、ゲル内に入り込んだ細胞数は６０個程度であった。Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度が１００μｇ／ｍＬでは前述の距離は４５０μｍ、前述の細胞数は１２個程度となった。Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度が５０μｇ／ｍＬでは前述の距離は２８０μｍ、前述の細胞数は１０個程度であり、ＰＢＳを含有するアガロースゲルでは前述の距離及び細胞数ともに０であった。このことからＮＨＤＦの走化性はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の濃度に依存していることが分かる。
次に、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質によるＮＨＤＦの走化性について評価した。使用した材料は重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質、重合例５で調製したＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー、実施例２で用いたＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＰＢＳであり、上記と同様にＮＨＤＦの走化性を評価した。その結果を図１０に示す。図１０に示したように、ポリマーである重合例１のＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質でのみアガロースゲルの下に細胞が侵入し、ＮＨＤＦが入り込んだ距離は４２０μｍ、ＮＨＤＦが入り込んだ数は２９個であった。このことからＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質はポリマーであることでＮＨＤＦを作用することが分かる。
次に、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の重合度の違いによるＮＨＤＦの走化性の違いがあるか否かを上記と同様の方法で評価した。評価ではＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質としては重合例１（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）と重合例２（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ４０）のものを用いた。その結果を図１１に示す。図１１の結果からいずれのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質もアガロースゲルの下に細胞が侵入しているが、ＮＨＤＦが入り込んだ距離は重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質では７８０μｍ、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質では６００μｍであり、ＮＨＤＦがゲル内に入り込んだ数は重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は６０個、重合例２で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は５０個であった。
また、アガロースゲルに重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を含有したゲルを滴下したシャーレを２つ用意し、その一つに培地中に重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を１０μｇ／ｍＬ含有させて、ＮＨＤＦの走化性を評価した。その結果を図１２に示す。図１２の結果から培地中にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含有した場合、アガロースゲルの下に侵入するＮＨＤＦが減少していることが分かる。具体的にはＮＨＤＦが入り込んだ距離はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含む培地を用いたものは１０００μｍであるが、培地にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含まないものでは１２５０μｍであった。ＮＨＤＦが入り込んだ数はＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含む培地を用いたものでは８０個、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を含まないものでは１４０個であった。なお、ＰＢＳを含有するアガロースゲルではＮＨＤＦはゲル内に侵入していない。
さらに重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）によるＮＨＤＦの遊走性の刺激について、ビメンチンのリン酸化を検出することで検討した。Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、細胞表面上に出現したビメンチンに結合することから、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質添加によるビメンチンへのシグナル伝達をビメンチンのアミノ酸配列の３８番目のセリンのリン酸化によって検討した。ビメンチンの３８番目のセリンがリン酸化されることで細胞遊走性が刺激されることが明らかになっている。そこで、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質をＮＨＤＦに添加した１０分後、３０分後、６０分後、１２０分後のビメンチンのリン酸化を抗リン酸化ビメンチンセリン３８抗体でウエスタンブロッティングにて検出した。その結果を図１３に示す。図１３に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質添加後の１０分後には、ビメンチンのリン酸化が観察され、１２０分後には低下が観察された。このことから、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質がＮＨＤＦの細胞表面のビメンチンに結合してＧＤＦ１５の発現や細胞遊走性を刺激していることが明らかになった。
以上の結果からＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質で処理されたＮＨＤＦに高い細胞遊走能があることが確認された。また、図１３に示したように、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）の細胞表面ビメンチンの刺激に伴うビメンチンのリン酸化も観察されたことから、ビメンチンの脱重合及びそれに伴うシグナル伝達によって細胞遊走能の刺激がなされたと考えられる。
【0036】
［実施例７］
重合例１で調製した５０μｇ／ｍＬのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞に添加し、２４時間培養を行った。この時の細胞内のＧＤＦ１５の発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図１４Ａに示す。また、この変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞に１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを添加して、ＴＮＦα添加後６時間後の、ＲＡＮＫＬ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びβ－アクチンの発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図１４Ｂに示す
図１４Ａに示したように、重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を処理した変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞はいずれもるＧＤＦ１５の発現上昇が観察され、図１４Ｂに示したようにＴＮＦα刺激によるＲＡＮＫＬ及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇の抑制が観察された。
慢性炎症性疾患の一つである関節リウマチの疾患部位においては滑膜線維芽細胞が増勢してＲＡＮＫＬを発現し破骨細胞を活性化して、疾患の増悪が進行する。また、ＲＡＮＫＬが慢性炎症時のＴＮＦαやインターロイキンー１７（以下、ＩＬ－１７という）の刺激を受けた滑膜線維芽細胞から分泌され、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へと分化させ、その破骨細胞によって骨破壊が起こり、関節リウマチでの骨変形の原因となる。図１４Ａ及び図１４Ｂに示した通り、関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を作用させ、ＴＮＦαを作用させたところ、ＧＤＦ１５の発現上昇とＲＡＮＫＬ及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇の抑制とが観察された。このことからＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を作用させた骨膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞はＲＡＮＫＬの発現上昇を抑制した結果、破骨細胞への分化も抑制することができ、関節リウマチ発症を抑制することができると推察される。
さらに、ｓｕｒｖｉｖｉｎは、細胞死を抑制する分子で滑膜線維芽細胞の活性化に関与することが知られており、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）により、これらの細胞でのＲＡＮＫＬやｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇の抑制が観察されたことから、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、関節リウマチ症の治療効果やがん治療薬を含む各種薬剤への薬物耐性の抑制にも効果があると推察される。
これら実施例１～６の結果から、筋線維芽細胞（ＮＨＤＦ）における細胞表面ビメンチンのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の刺激により、ＧＤＦ１５産生と抗炎症作用や増殖抑制、細胞遊走能が上昇することが分かった。このことによりＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は線維症に対する治療効果があることが推察される。
さらに実施例７の結果から、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を作用させた骨膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞はＴＮＦαを作用されてもＲＡＮＫＬとｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇を抑制することが分かった。このことによりＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、関節リウマチ症に対する治療効果や薬物耐性への抑制効果があることが推察される。
重合例１で調製した５０μｇ／ｍＬのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞に添加し、２４時間培養を行った。この時の細胞内のＧＤＦ１５の発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図１４Ａに示す。また、この変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞に１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを添加して、ＴＮＦα添加後６時間後の、ＲＡＮＫＬ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びβ－アクチンの発現をウエスタンブロッティングで検討した。その結果を図１４Ｂに示す
図１４Ａに示したように、重合例１で調製したＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を処理した変形性関節症由来滑膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞はいずれもるＧＤＦ１５の発現上昇が観察され、図１４Ｂに示したようにＴＮＦα刺激によるＲＡＮＫＬ及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇の抑制が観察された。
慢性炎症性疾患の一つである関節リウマチの疾患部位においては滑膜線維芽細胞が増勢してＲＡＮＫＬを発現し破骨細胞を活性化して、疾患の増悪が進行する。また、ＲＡＮＫＬが慢性炎症時のＴＮＦαやインターロイキンー１７（以下、ＩＬ－１７という）の刺激を受けた滑膜線維芽細胞から分泌され、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へと分化させ、その破骨細胞によって骨破壊が起こり、関節リウマチでの骨変形の原因となる。図１４Ａ及び図１４Ｂに示した通り、関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞にＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を作用させ、ＴＮＦαを作用させたところ、ＧＤＦ１５の発現上昇とＲＡＮＫＬ及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇の抑制とが観察された。このことからＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を作用させた骨膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞はＲＡＮＫＬの発現上昇を抑制した結果、破骨細胞への分化も抑制することができ、関節リウマチ発症を抑制することができると推察される。
さらに、ｓｕｒｖｉｖｉｎは、細胞死を抑制する分子で滑膜線維芽細胞の活性化に関与することが知られており、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）により、これらの細胞でのＲＡＮＫＬやｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇の抑制が観察されたことから、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、関節リウマチ症の治療効果やがん治療薬を含む各種薬剤への薬物耐性の抑制にも効果があると推察される。
これら実施例１～６の結果から、筋線維芽細胞（ＮＨＤＦ）における細胞表面ビメンチンのＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質の刺激により、ＧＤＦ１５産生と抗炎症作用や増殖抑制、細胞遊走能が上昇することが分かった。このことによりＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は線維症に対する治療効果があることが推察される。
さらに実施例７の結果から、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃ１０）を作用させた骨膜線維芽細胞及び関節リウマチ症由来滑膜線維芽細胞はＴＮＦαを作用されてもＲＡＮＫＬとｓｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇を抑制することが分かった。このことによりＯ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質は、関節リウマチ症に対する治療効果や薬物耐性への抑制効果があることが推察される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
