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7638025高い増幅、生存能力及び殺腫瘍作用を有するＣＡＲ－ｉＮＫＴ及びその使用
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-20
(45)【発行日】2025-03-03
(54)【発明の名称】高い増幅、生存能力及び殺腫瘍作用を有するＣＡＲ－ｉＮＫＴ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20250221BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250221BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250221BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250221BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250221BHJP
A61K 40/15 20250101ALI20250221BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250221BHJP
A61K 40/31 20250101ALI20250221BHJP
A61K 40/35 20250101ALI20250221BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20250221BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20250221BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20250221BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N5/10
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/13
A61K31/7088
A61K40/15
A61P35/00
A61K40/31
A61K40/35
C07K19/00
C07K14/705
C07K16/28
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2023530665
(86)(22)【出願日】2021-10-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-29
(86)【国際出願番号】 CN2021125615
(87)【国際公開番号】W WO2022127372
(87)【国際公開日】2022-06-23
【審査請求日】2023-05-18
(31)【優先権主張番号】202011461635.3
(32)【優先日】2020-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523185822
【氏名又は名称】北京基因▲啓▼明生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲閭▼ ▲軍▼
(72)【発明者】
【氏名】熊 福▲銀▼
(72)【発明者】
【氏名】▲馮▼ ▲紀▼▲開▼
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１５９１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２２５６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２９８５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２０／０４５６１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／２３２４７７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Drug Delivery System，2013年，28-1，35-44
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体、及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記キメラ抗原受容体はＧＰＣ３抗原結合ドメイン及び細胞内シグナルドメインを含み、前記細胞内シグナルドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナルドメインと、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９であるＩＣＤ１又はアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３であるＩＣＤ３と、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記細胞内シグナルドメインはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３であるＩＣＤ３である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記ＧＰＣ３抗原結合ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９と１１のアミノ酸配列を含むＧＣ３３ ＳｃＦｖである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ＧＰＣ３抗原結合ドメインはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３を含むＧＣ３３ ＳｃＦｖである請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記キメラ抗原受容体は、順次連結されたＧＣ３３ ＳｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナルドメイン、ＩＣＤ１又はＩＣＤ３、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナルドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、１９、２３、３５である請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが形質導入されていることを特徴とする免疫細胞であって、免疫細胞はｉＮＫＴである免疫細胞。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項８に記載の免疫細胞の、癌治療薬の製造における使用であって、前記癌は肝癌である使用。
【請求項10】
前記癌はＧＰＣ３過剰発現癌である請求項９に記載の使用。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか１項に記載されたキメラ抗原受容体の発現ベクターであって、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０であるＩＣＤ１の核酸配列又はヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４であるＩＣＤ３の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項12】
ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８であるＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質の核酸配列をさらに含む請求項１１に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、癌免疫療法の分野に属する。具体的には、本願は、ＧＰＣ３抗原結合ドメインと、細胞内シグナル刺激ドメインと、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質とを含むキメラ抗原受容体を提供し、また、対応する発現ベクター、形質導入システム、製薬用途などを提供する。
【背景技術】
【0002】
２０１８年の世界腫瘍報告によると、全世界の肝癌の新発症例は８４１０８０人で、７８１６３１人が肝癌で死亡している［１］。その中、中国の肝癌の新発病例は３９２８６８人であり、３６８９６０人が肝癌で死亡し［２］、ほぼ全世界の肝癌の新発病例と死亡のそれぞれの割合の半分を占めている。
【0003】
既存の肝癌治療には、手術切除、肝移植、局所治療（ＲＦＡ、ＴＡＣＥ、ＴＡＥ、ＨＩＦＡなど）、全身的治療（ソラフェニブ、レンバチニブなど）を含む。手術切除は治癒を実現することができるが、大多数の肝癌は発見されると最適な手術期を逃し、手術切除の治療方式は満足のいくものとは言えない。研究によると、中国の肝癌患者のメディアン生存時間はわずか２３月、日本は６０月、北米は３３月、韓国は３１月、欧州は２４月、エジプトは１１月、その他のアフリカ諸国は３月にすぎない［３］。肝癌の治療には、より安全で有効な治療方法を急が必要とする。
【0004】
キメラ抗原受容体技術は血液腫瘍の治療に顕著な治療効果を遂げており、Ｋｙｍｒｉａｈ［４］とＹｅｓｃａｒｔａ［５］は２０１７年にＦＤＡからＢ細胞急性リンパ白血病、びまん性大Ｂリンパ腫の治療に承認された。ＧＰＣ３は肝細胞癌細胞の７０％に高発現しているが、正常成人組織細胞には発現していない［６］。ＧＰＣ３は肝芽細胞腫、扁平上皮細胞肺癌、睾丸と卵巣卵黄嚢腫瘍、黒色腫、卵巣透明細胞癌などの腫瘍においても過剰発現状態を呈し［７］、キメラ抗原受容体技術による標的治療に好適な標的である。
【0005】
ＧＰＣ３遺伝子はＸ染色体にあり、１１個のエクソンを持つ。転写本は２１３０ｂｐであり、５８０個のアミノ酸をコードし、約７０ｋＤａの分子量を有する。ＧＰＣ３ポリペプチドはＦｕｒｉｎ制限酵素の切断部位を１つ含み、Ａｒｇ３５８とＣｙｓ３５９の間でポリペプチドを２つのフラグメントに切断し、ここで、Ｎ－末端は４０ｋＤａ、Ｃ－末端は３０ｋＤａである。これら２つのサブユニットは、１つ又は複数のジスルフィド結合によって連結されていてもよい。Ｎ－末端サブユニットはさらに切断されて末梢血行中の可溶性ＧＰＣ３となりうる。ＧＰＣ３はＣｙｓ４９５とＣｙｓ５０８でヘパリン硫酸修飾を起こすことができる。ＧＰＣ３ Ｓｅｒ５６０はホスファチジルイノシトールを介して細胞膜の脂質層に固着されている［８］。
【0006】
正常な生理条件下で、ＧＰＣ３は様々な胚胎細胞膜に広く発現したが、正常成人肝組織には発現しなかった。ヒトＧＰＣ３突然変異はＳＧＢＳ（ｓｉｍｐｓｏｎ ｇｏｌａｂｉ ｂｅｈｍｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こし、多臓器や骨の異形成を伴う巨大児として示す。ＧＰＣ３は細胞膜に固着されており、細胞内領域を持たないが、異なる成長因子、ケモカイン、サイトカインと相互作用してもよく、それにより細胞膜表面に濃度勾配を形成し、さらにこれらのリガンドとそれらの受容体との結合を促進する［８］。
【0007】
不変ナチュラルキラーＴ細胞（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ、ｉＮＫＴ）は、胸腺由来Ｔ細胞のユニークな亜群であり、ＣＤ１ｄ制限性を持ち、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＮＫ）の両方の系統に特徴的な表面受容体を発現しており、Ｔ細胞とＮＫ細胞の共通の生物学的特徴と、先天的免疫と養子免疫を橋渡するような重要な役割を持っている。ヒトｉＮＫＴ細胞において、Ｖα２４－Ｊα１８はＴＣＲα鎖を形成した後、Ｖβ１１ ＴＣＲβ鎖とＴＣＲを形成する［９］。
【0008】
ｉＮＫＴ細胞は、胸腺において少なくとも３つのエフェクター亜群に分化し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の亜群に類似し、また、先天的リンパ球（ＩＬＣｓ）の亜群に類似してもよい［１０－１２］。機能的ｉＮＫＴ細胞亜群は、様々な細胞表面マーカーと特徴的な転写因子の発現によって区別される。ＮＫＴ１細胞はＴｈ１細胞やＩＬＣ１ｓに類似しており、いずれも転写因子Ｔ－ｂｅｔを高発現し、活性化後にＩＦＮ－γを分泌するからである。ＮＫＴ１細胞も他のｉＮＫＴ細胞亜群よりも大きな細胞毒性機能を示した。ＮＫＴ１細胞がＴｈ１細胞やＩＬＣ１ｓと異なる点は、ＴＣＲ活性化によりＩＦＮ－γを産生するほか、ＩＬ－４などの因子を産生することである。ＮＫＴ２細胞から分泌されるサイトカインには、Ｔｈ２細胞と同様にＩＬ－４及びＩＬ－１３が含まれる。一方、ＮＫＴ１７細胞はサイトカイン分泌においてＴｈ１７細胞と類似している［１３－１５］。
【0009】
異なるｉＮＫＴ細胞亜群は異なる組織で濃縮されている。ＮＫＴ１細胞は肝臓で高度に濃縮され、一方、ＮＫＴ１７細胞は主にリンパ節、皮膚や肺に存在し、脾臓にも少量の細胞がある［１６］。ＮＫＴ２細胞は肺や脾臓を含む複数の部位に存在するが、腸間膜リンパ節に特に豊富である［１６］。周囲リンパ節において、ｉＮＫＴ細胞は迅速に活性化され、病原体との闘いにおいて重要な役割を果たす可能性がある［１７］。
【0010】
ヒト血液中のｉＮＫＴ細胞は、ＤＮ ｉＮＫＴ（ｄｏｕｂｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ、ＤＮ）細胞、ＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞、及びＣＤ８＋ｉＮＫＴ（ＣＤ８αα又はＣＤ８αβ）に分類される［９］。特にＣＤ８＋ｉＮＫＴ細胞は現在ヒトでしか発見されていない。ある研究によると、ＤＮ ｉＮＫＴとＣＤ８＋ｉＮＫＴ細胞が活性化する時、そのＩＦＮ－γ分泌と細胞毒性機能が顕著に増加することを示した［９］。
【0011】
現在のＧＰＣ３キメラ抗原受容体、例えば、本特許に近いＵＳ １０７３１１２７Ｂ２、ＣＮ １０９４６８２７９ Ａにおいて、遺伝子修飾により、Ｔ細胞にＧＰＣ３抗原に対するキメラ受容体を発現させ、そのうち、ＣＡＲはＧＰＣ３抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ＧＰＣ３抗原を持つ肝癌細胞に対して殺傷作用を示す。しかし、通常のＴ細胞が固形腫瘍に効果的に浸潤することができないこと、固形腫瘍の腫瘍微小環境が低酸素でより酸性であることを考慮すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増幅と長期生存に非常に不利であり、それによりＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果に深刻な影響を与える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
以上の問題を解決するために、出願人はｉＮＫＴ細胞のホーミング特性及び非特異的殺傷機能を利用して、ＧＰＣ３抗原に結合できるキメラ抗原受容体を持つように遺伝子修飾することにより、ＧＰＣ３抗原を持つ肝癌細胞を特異的に殺傷できるａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を構築する。
【0013】
遺伝子修飾により、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が活性化したときに、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞をＣＤ８+ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞及びＣＤ４-ＣＤ８-ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に分化させるサイトカインを特異的に発現するようにし、それにより、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の肝癌細胞に対する特異的及び非特異的な殺傷機能を発揮するのにより有利である。
【0014】
共刺激ドメインの組み合わせを最適化することにより、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増幅と長期生存能力を高め、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のアポトーシスを低下させ、患者体内におけるａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍機能を十分に発揮する。
【0015】
ＴＲＡＦファミリー分子はＲＩＰ、ＴＲＡＤＤなどの下流分子に結合することにより、最終的にＮＦ－κＢ経路を活性化し、細胞増殖を促進し、アポトーシスを防止することができる。ＴＲＡＦファミリー分子と結合したｍｏｔｉｆを参考することにより、ＩＣＤ１、ＩＣＤ２、ＩＣＤ３の３つの細胞内シグナルドメインを設計し、それぞれＣＡＲ分子に構築し、細胞内シグナルドメインがそれぞれＩＣＤ１、ＩＣＤ２、ＩＣＤ３である場合のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増殖、細胞亜群及び腫瘍細胞に対する殺傷能力の変化を観察する。
【0016】
ＩＬ－１５はＴ細胞が増殖し、ＣＤ８＋Ｔ細胞亜群に分化することを促進し、それによってＴ細胞の細胞傷害効果を向上させることができる。しかし、ＩＬ－１５が機能するには必ずＩＬ－１５Ｒαと結合してからＩＬ－１５Ｒγと結合でき、それにより、細胞増殖と分化シグナルを刺激する。本発明では、ＣＡＲ分子中にＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を構築して共発現することにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＣＤ８＋ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞亜群への分化を促進し、そしてＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増殖を促進し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの腫瘍細胞に対する殺傷により有利であり、臨床適用のニーズを満たす。
【0017】
従来技術に比べ、本願の技術的解決手段は腫瘍の殺傷効率が向上し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増殖速度が速く、細胞の生体外培養周期を短縮させ、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の生体内での生存時間を増加させ、治療効果を大幅に向上させ、再発を減少させ、毒性や副作用を軽減することができる。
【課題を解決するための手段】
【0018】
一態様において、本願は、ＧＰＣ３抗原結合ドメイン、細胞内シグナル刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
【0019】
さらに、前記キメラ抗原受容体はＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質をさらに含む。
【0020】
さらに、前記細胞内シグナル刺激ドメインはアミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、３１、３３であるＩＣＤ１、ＩＣＤ２又はＩＣＤ３である。
【0021】
さらに、前記細胞内シグナル刺激ドメインはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３であるＩＣＤ３である。
【0022】
さらに、前記ＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７である。
【0023】
さらに、前記ＧＰＣ３抗原結合ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９と１１のアミノ酸配列を含むＧＣ３３ ＳｃＦｖである。
【0024】
さらに、前記ＧＰＣ３抗原結合ドメインはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３であるＧＣ３３ ＳｃＦｖである。
【0025】
さらに、前記キメラ抗原受容体は、順次連結されたＧＣ３３ ＳｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナルドメイン、ＩＣＤ１、ＩＣＤ２又はＩＣＤ３、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質を含む。
【0026】
さらに、前記ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナルドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、１９、２３、３５である。
【0027】
別の態様において、本願は、上記キメラ抗原受容体が形質導入されている免疫細胞を提供する。
【0028】
さらに、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はｉＮＫＴ細胞である。
【0029】
さらに、前記免疫細胞はｉＮＫＴ細胞である。
【0030】
別の態様において、本願は、上記キメラ抗原受容体又は免疫細胞の、癌治療薬の製造における使用を提供する。
【0031】
別の態様において、本願は、上記キメラ抗原受容体又は免疫細胞を使用する癌の治療方法を提供する。
【0032】
さらに、前記癌はＣＰＧ３過剰発現癌である。
【0033】
さらに、前記癌は肝癌である。
【0034】
別の態様において、本願は、上記キメラ抗原受容体の発現ベクターを提供する。
【0035】
さらに、発現ベクターは、ヌクレオチド配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、３２、３４であるＩＣＤ１、ＩＣＤ２又はＩＣＤ３核酸配列を含む。
【0036】
さらに、発現ベクターは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８であるＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質核酸配列を含む。
【0037】
別の態様において、本願は、上記発現ベクターを含む形質導入システムを提供する。
【0038】
さらに、前記形質導入システムは、ウイルス形質導入システム及び非ウイルス形質導入システムである。
【0039】
さらに、前記形質導入システムは、レンチウイルス形質導入システムである。
【0040】
別の態様において、本願は、アミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、３１又は３３である細胞内シグナル刺激分子を提供する。
【0041】
別の態様において、本願は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、３２又は３４である上記細胞内シグナル刺激分子の核酸コード配列を提供する。
【0042】
別の態様において、本願は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７であるＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質を提供する。
【0043】
別の態様において、本願は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８である上記ＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質の核酸コード配列を提供する。
【0044】
別の態様において、本願は、上記細胞内シグナル刺激分子又はその核酸コード配列、又は上記ＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質又はその核酸コード配列の、癌を治療するキメラ抗原受容体の製造における使用を提供する。
【0045】
本発明におけるＣＰＧ３過剰発現癌の種類は、出願日前の先行技術及びその後の研究から当業者が知ることができる。
【0046】
本発明の最適化改変後の細胞内シグナル刺激ドメイン（本発明ではＩＣＤ１、ＩＣＤ２、ＩＣＤ３を実施例とする）は、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの増殖速度を速め、ＣＡＲ－ｉＮＫＴからのＩＦＮ－γの分泌の増加を促進し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺腫瘍効果を向上させ、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の枯渇状態を軽減し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの生体内での生存期間を延長することができる。
【0047】
本発明のＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質核酸は、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合の増加を促進し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴからのＩＦＮ－γ分泌の増加を促進し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺腫瘍効果を向上させ、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の枯渇状態を軽減し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの生体内での生存期間を延長することができる。
【0048】
本発明は、上記の１つ又は複数の要素を含み、且つ同時にＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞の表面に発現するキメラ抗原受容体タンパク質を構築するために用いられる核酸発現ベクターを含む。必要に応じて種々の市販のベクターを選択してもよいし、分子生物学分野の従来技術に基づいてベクターを構築してもよい。１つの具体的な実施形態において、本発明が使用するベクターは、レンチウイルスプラスミドベクターｐＬＶ３００である。このプラスミドは第４世代自己不活化レンチウイルスベクターシステムであり、このシステムは合計４つのプラスミド、すなわちＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、Ｒｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミド、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をコードするエンベローププラスミド、及び空のベクターｐＬＶ３００を含み、標的核酸配列、すなわちキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸配列を組み換えて形質導入するために使用することができる。ベクターｐＬＶ３００では、キメラ抗原受容体タンパク質の発現は、ｐＧＫ－３００プロモーターによって調節される。
【0049】
本発明は、上記ベクターを含むウイルスであって、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等を含むが、これらに限定されないウイルスを含む。本発明のウイルスには、パッケージシングされた感染力を有するウイルスが含まれ、また、パッケージシングされた感染力を有するウイルスに必要な成分を含むパッケージシング対象ウイルスも含まれる。Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞をトランスフェクションする当技術分野で知られている他のウイルス及びそれに対応するプラスミドベクターもまた、本発明に使用することができる。本発明の一実施形態において、前記ウイルスは、上記のｐＬＶ３００－ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ組換えベクターを含むレンチウイルスである。
【0050】
本発明は、本発明の核酸、又は該核酸を含む前記組換えプラスミドを含む、若しくは該プラスミドを含む本発明の上記ウイルスシステムが形質導入されているトランスジェニックＴリンパ球、ＮＫ細胞又はｉＮＫＴ細胞を含む。非ウイルス及びウイルスを含む、本分野の従来の核酸形質導入方法は、いずれも本発明に使用することができる。非ウイルスシステムによる形質導入方法はエレクトロポレーション法とトランスポゾン法とを含む。最近、Ａｍａｘａ社が研究開発したｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ核トランスフェクション装置は外来遺伝子を細胞核に直接形質導入し、標的遺伝子の効率的な形質導入を実現することができる。また、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｓｙｓｔｅｍ）又はＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンなどのトランスポゾンサブシステムによる形質導入効率は通常のエレクトロポレーションよりも大きく向上し、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒトランスフェクション装置とＳＢトランスポゾンサブシステムを併用することはすでに報告されており、この方法は高い形質導入効率を持つだけでなく、標的遺伝子の特異的部位への組み込みを実現することができる。本発明の一実施形態において、キメラ抗原受容体遺伝子修飾を実現するｉＮＫＴ細胞の形質導入方法は、レンチウイルスによる形質導入方法である。この方法は形質導入効率が高く、外来遺伝子が安定して発現でき、ｉＮＫＴリンパ球を臨床レベルに到達するまでの生体外の培養時間を短縮できるなどの利点がある。レンチウイルストランスフェクションにより導入した核酸は転写、翻訳によりｉＮＫＴ細胞膜表面に発現する。キメラ抗原受容体を表面に発現する本発明のトランスジェニックｉＮＫＴ細胞は、種々の異なる培養腫瘍細胞の生体外での細胞毒性実験により、腫瘍細胞に対して高度に特異的な殺傷効果（細胞毒性とも呼ばれる）を有することが証明されている。従って、キメラ抗原受容体タンパク質をコードする本発明の核酸、該核酸を含むプラスミド、該プラスミドを含むウイルス、及び上記核酸、プラスミド又はウイルスをトランスフェクションしたトランスジェニックｉＮＫＴ細胞、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞は、腫瘍の免疫療法に有効に使用することができる。
【0051】
キメラ抗原受容体タンパク質が本発明の細胞内シグナルドメインを細胞外標的結合領域に結合させて構築される場合、細胞外結合領域は、対応する標的（既存の既知標的を含むがこれに限定されない）を特異的に認識する受容体（リガンド）、特異的一本鎖抗体ｓｃＦｖ、ＴＣＲｍ、ＶＬＲ（本発明ではヒトＧＰＣ３標的を例として探索する）を含む。受容体（リガンド）、特異的一本鎖抗体ｓｃＦｖ、ＴＣＲｍ又はＶＬＲは、上記文献に開示された配列に従って、遺伝子工学的方法又は化学的合成方法により製造され得る。
【0052】
本発明の核酸は、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であってもよい。キメラ抗原受容体タンパク質のアミノ酸配列をコードする本発明の核酸コドンは縮退可能であり、すなわち、同一のアミノ酸配列をコードする複数の縮退核酸配列がいずれも本発明の範囲内に含まれる。対応するアミノ酸をコードする縮退核酸コドンは、当該分野に公知である。本発明はまた、本発明と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はポリペプチドのフラグメント、アナログ及び誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は、天然に発生する等位変異体であってもよいし、天然に発生しない変異体であってもよい。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体、及び挿入変異体を含む。当該分野で知られているように、等位変異体は、ポリヌクレオチドの置換形態であり、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入であってもよいが、それがコードするポリペプチドの機能を実質的に変化させることはない。
【0053】
現在のＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫによる固形腫瘍の治療技術において、通常のＴ細胞、ＮＫ細胞は固形腫瘍に効果的に浸潤できないため、ＮＫ細胞は生体外での増幅が制限され、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫによる固形腫瘍の治療効果は制限される。本発明では、細胞内シグナルドメインの最適化により、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの効率的な増幅を促進し、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの枯渇状態を減少させ、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの生体内での生存期間を延長することができ、また、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαの共発現の作用で、ＣＡＲ－ｉＮＫＴは腫瘍の殺傷により有利なＣＤ８＋ＣＡＲ－ｉＮＫＴ及びＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ表現型に分化し、これにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの腫瘍細胞に対する殺傷作用を増強する。これは現在固形腫瘍を治療するＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ技術にはない利点である。本発明の細胞内シグナルドメインの組み合わせ及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質の共発現は、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ－ｉＮＫＴ技術の使用を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】ｉＮＫＴの総細胞増殖の曲線図である。
【図2(A)】ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の各培養時間におけるＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。
【図2(B)】ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の各培養時間におけるＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。
【図2(C)】ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の各培養時間におけるＣＤ４＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。
【図2(D)】ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の各培養時間におけるＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞亜群の割合である。
【図3(A)】各エフェクター／ターゲット比におけるａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ｉＮＫＴの肝癌細胞Ｈｕｈ－７に対する殺傷効果である。
【図3(B)】細胞内シグナルドメインが４－１ＢＢのａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ｉＮＫＴと比べる場合の、各エフェクター／ターゲット比における各群のａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ｉＮＫＴの肝癌細胞Ｈｕｈ－７に対する殺傷効果の上昇倍数である。
【図4(A)】ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と肝癌細胞を２４時間共培養した後の細胞培養上清中のＩＦＮ－γ含有量である。
【図4(B)】各群のａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と肝癌細胞Ｈｕｈ－７を３：１で接種し、２４時間共培養した後の、細胞培養上清中のＩＦＮ－γ含有量が、細胞内シグナルドメインが４－１ＢＢのａｎｔｉ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ群に比べる場合のＩＦＮ－γの変化倍数である。
【図5】ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と肝癌細胞を２４時間共培養した後のＬＡＧ－３の発現状況である。
【図6】ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲの構造概略図である。
【図7】レンチウイルスベクターの構造概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0055】
【表1】
【0056】
実施例１ キメラ抗原受容体分子を含むレンチウイルスの製造
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を継代し、細胞が６０～７０％融合するまで成長した後、ＣＡＲ分子を含む発現ベクターをパッケージングプラスミドと共にｐＥＩ試薬を用いてＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション４時間後、新鮮な培地を交換した。トランスフェクション４８～７２時間後、細胞培養上清を収集した。上清を超遠心分離することにより、パッケージング後にＣＡＲ分子を含むレンチウイルスを濃縮した。濃縮後のレンチウイルスについてウイルス力価を測定し、－８０℃で使用時まで凍結保存した。
キメラ抗原受容体の各部分の具体的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、各部分の名称が表記された配列表を参照すればよい。
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を継代し、細胞が６０～７０％融合するまで成長した後、ＣＡＲ分子を含む発現ベクターをパッケージングプラスミドと共にｐＥＩ試薬を用いてＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション４時間後、新鮮な培地を交換した。トランスフェクション４８～７２時間後、細胞培養上清を収集した。上清を超遠心分離することにより、パッケージング後にＣＡＲ分子を含むレンチウイルスを濃縮した。濃縮後のレンチウイルスについてウイルス力価を測定し、－８０℃で使用時まで凍結保存した。
キメラ抗原受容体の各部分の具体的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、各部分の名称が表記された配列表を参照すればよい。
【0057】
実施例２ ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ＣＡＲにおける異なる細胞内シグナル刺激ドメインによる構築及びＩＬ－１５－ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質の発現の有無の、総ｉＮＫＴ細胞増殖への影響
ａｎｔｉ－ｉＮＫＴ ｍｉｒｃｒｏｂｅａｄｓでヒト末梢血単核球からｉＮＫＴ細胞を単離した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０5個の細胞を接種し、１ウェル当たりＸ－ＶＩＶＯ完全培地（１００ＩＵ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ α－Ｇａｌｃｅｒを含む）を加えて４８時間培養した後、各ウェルから細胞を収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた後、新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を加えて再懸濁させた後、再び２４ウェルプレートに接種し、各ウェルの細胞にそれぞれ４－１ＢＢ、ＩＣＤ１、ＩＣＤ２、ＩＣＤ３、４－１ＢＢ－ＩＬ－１５、ＩＣＤ１－ＩＬ－１５、ＩＣＤ２－ＩＬ－１５、ＩＣＤ３－ＩＬ－１５ＣＡＲを含む異なるレンチウイルスを加えて感染させた。２４時間後、各ウェルの細胞を遠心分離管に収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離した後、計数し、５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌで新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を加えて培養し、４８時間ごとに液を交換した。７日目、１４日目、２１日目まで培養した際に、サンプリングしてそれぞれ計数及びフローサイトメトリー検出を行って、キメラ抗原受容体分子の発現状況を証明した。
その結果、細胞内シグナル刺激ドメインＩＣＤ１、ＩＣＤ３及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質はｉＮＫＴ細胞の増殖を明らかに促進し（図１を参照）、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の増加を促進することができ、培養７日目に、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞では、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合が最も高く、細胞内シグナルドメインがＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ群では、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は２０％～３０％に達することができる（ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα共発現か、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαを発現しない）。その後、培養時間が長くなるにつれて、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は徐々に低下していくが、細胞内シグナル刺激ドメインが４－１ＢＢのＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に比べて、細胞内シグナル刺激ドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴでは、同時刻のＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合が２～３倍増加している（図２（ａ）、図２（ｂ））。
培養中、各群のＣＤ４＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は徐々に増加したが（図２（ｃ））、細胞内シグナル刺激ドメインが４－１ＢＢのＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に比べ、細胞内シグナル刺激ドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴでは、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合の増加は少なかった。一方、各群の細胞では、ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は培養時間とともに減少し、細胞内シグナルドメインがＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ群では、ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合が同時点の各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴの中で最も低かった（図２（ｄ））。
ａｎｔｉ－ｉＮＫＴ ｍｉｒｃｒｏｂｅａｄｓでヒト末梢血単核球からｉＮＫＴ細胞を単離した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０5個の細胞を接種し、１ウェル当たりＸ－ＶＩＶＯ完全培地（１００ＩＵ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ α－Ｇａｌｃｅｒを含む）を加えて４８時間培養した後、各ウェルから細胞を収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた後、新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を加えて再懸濁させた後、再び２４ウェルプレートに接種し、各ウェルの細胞にそれぞれ４－１ＢＢ、ＩＣＤ１、ＩＣＤ２、ＩＣＤ３、４－１ＢＢ－ＩＬ－１５、ＩＣＤ１－ＩＬ－１５、ＩＣＤ２－ＩＬ－１５、ＩＣＤ３－ＩＬ－１５ＣＡＲを含む異なるレンチウイルスを加えて感染させた。２４時間後、各ウェルの細胞を遠心分離管に収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離した後、計数し、５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌで新鮮なＸ－ＶＩＶＯ完全培地を加えて培養し、４８時間ごとに液を交換した。７日目、１４日目、２１日目まで培養した際に、サンプリングしてそれぞれ計数及びフローサイトメトリー検出を行って、キメラ抗原受容体分子の発現状況を証明した。
その結果、細胞内シグナル刺激ドメインＩＣＤ１、ＩＣＤ３及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５α融合タンパク質はｉＮＫＴ細胞の増殖を明らかに促進し（図１を参照）、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の増加を促進することができ、培養７日目に、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞では、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合が最も高く、細胞内シグナルドメインがＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ群では、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は２０％～３０％に達することができる（ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα共発現か、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαを発現しない）。その後、培養時間が長くなるにつれて、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は徐々に低下していくが、細胞内シグナル刺激ドメインが４－１ＢＢのＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に比べて、細胞内シグナル刺激ドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴでは、同時刻のＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合が２～３倍増加している（図２（ａ）、図２（ｂ））。
培養中、各群のＣＤ４＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は徐々に増加したが（図２（ｃ））、細胞内シグナル刺激ドメインが４－１ＢＢのＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に比べ、細胞内シグナル刺激ドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴでは、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合の増加は少なかった。一方、各群の細胞では、ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合は培養時間とともに減少し、細胞内シグナルドメインがＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ群では、ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＡＲ＋ｉＮＫＴ細胞の割合が同時点の各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴの中で最も低かった（図２（ｄ））。
【0058】
実施例３ 各細胞内シグナルドメイン及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質の発現の有無の、ＣＡＲ－ｉＮＫＴの腫瘍殺傷能力への影響
各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養したとき、エフェクター細胞とターゲット細胞の比をそれぞれ１：３、１：１、３：１とし、各群からそれぞれ０．３３×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、１×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、３×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、１×１０5個のＨｕｈ－７細胞を取って６時間共培養した後、各群の培養上清について上清中の蛍光強度（ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷能力が高いほどＨｕｈ－７細胞内に放出されるＣＦＳＥが多く、蛍光強度が高い）をマイクロプレートリーダーで測定し、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷効率を計算した（図３）。細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、肝癌細胞Ｈｕｈ－７に対する殺傷効果が明らかに向上し、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαの共発現は細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷効果を明らかに向上させた（図３（ａ）、図３（ｂ））。
各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養したとき、エフェクター細胞とターゲット細胞の比をそれぞれ１：３、１：１、３：１とし、各群からそれぞれ０．３３×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、１×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、３×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、１×１０5個のＨｕｈ－７細胞を取って６時間共培養した後、各群の培養上清について上清中の蛍光強度（ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷能力が高いほどＨｕｈ－７細胞内に放出されるＣＦＳＥが多く、蛍光強度が高い）をマイクロプレートリーダーで測定し、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷効率を計算した（図３）。細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、肝癌細胞Ｈｕｈ－７に対する殺傷効果が明らかに向上し、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαの共発現は細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の殺傷効果を明らかに向上させた（図３（ａ）、図３（ｂ））。
【0059】
実施例４ 各細胞内シグナルドメイン及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質の発現の有無の、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞からのＩＦＮ－γ分泌への影響
各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養した後、エフェクター細胞とターゲット細胞の比を３：１とし、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（各群の３×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞）をそれぞれ１×１０5個のＨｕｈ－７細胞とともにＸ－ＶＩＶＯ（ＩＬ－２とα－ＧａｌＣｅｒを含まない）０．５ｍｌで２４時間培養した後、細胞を収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を取り、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＩＦＮ－γ含有量を測定した。以上から分かるように、細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３の場合、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌量が明らかに増加し（図４（Ａ））、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞はＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を共発現することでＩＦＮ－γ分泌能力を向上させることができ、特にＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の細胞内シグナルドメインがＩＣＤ３の場合、そのＩＦＮ－γ分泌能力は細胞内シグナルドメインが４－１ＢＢのＣＡＲ－ｉＮＫＴの約２倍であった（図４（Ｂ））。
各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養した後、エフェクター細胞とターゲット細胞の比を３：１とし、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（各群の３×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞）をそれぞれ１×１０5個のＨｕｈ－７細胞とともにＸ－ＶＩＶＯ（ＩＬ－２とα－ＧａｌＣｅｒを含まない）０．５ｍｌで２４時間培養した後、細胞を収集し、４００ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を取り、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＩＦＮ－γ含有量を測定した。以上から分かるように、細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３の場合、ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌量が明らかに増加し（図４（Ａ））、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞はＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を共発現することでＩＦＮ－γ分泌能力を向上させることができ、特にＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の細胞内シグナルドメインがＩＣＤ３の場合、そのＩＦＮ－γ分泌能力は細胞内シグナルドメインが４－１ＢＢのＣＡＲ－ｉＮＫＴの約２倍であった（図４（Ｂ））。
【0060】
実施例５ 各細胞内シグナルドメイン及びＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質の発現の有無の、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の免疫チェックポイントＬＡＧ－３発現への影響
研究によれば、ｉＮＫＴ細胞では、ＬＡＧ３（ＰＤ－１ではない）の発現が増加すると、ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γの分泌能力が損なわれることが示されている。各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養した後、エフェクター細胞とターゲット細胞の比を１：１とし、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（各群の１×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞）をそれぞれ１×１０5個のＨｕｈ－７細胞とともにＸ－ＶＩＶＯ（ＩＬ－２とα－ＧａｌＣｅｒを含まない）０．５ｍｌで４８時間培養した後、４００ｘｇで５分間遠心分離した後に、上清を捨てて、細胞を収集し、ＬＡＧ－３抗体を標識した後、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ表面のＬＡＧ３発現状況をフローサイトメトリーにより検出した。細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３の場合、ＬＡＧ－３を発現する細胞の割合が低下し、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαを共発現すると、ＬＡＧ－３を発現する細胞の割合が低下した（図５）。これは、ＩＣＤ１、ＩＣＤ３を用いて細胞内シグナルドメインとし、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を共発現することで共阻害分子ＬＡＧ３の発現を低下させることができることを示しており、これにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γ発現能力を向上させる可能性があり、これは、前述したように、細胞内シグナルドメインとしてＩＣＤ１、ＩＣＤ３を用い、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を共発現することにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌を増加させることができることと一致し（図４（Ａ））、それにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷能力が向上した（図３（Ａ））。
研究によれば、ｉＮＫＴ細胞では、ＬＡＧ３（ＰＤ－１ではない）の発現が増加すると、ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γの分泌能力が損なわれることが示されている。各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を２１日目まで培養した後、エフェクター細胞とターゲット細胞の比を１：１とし、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（各群の１×１０5個のＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞）をそれぞれ１×１０5個のＨｕｈ－７細胞とともにＸ－ＶＩＶＯ（ＩＬ－２とα－ＧａｌＣｅｒを含まない）０．５ｍｌで４８時間培養した後、４００ｘｇで５分間遠心分離した後に、上清を捨てて、細胞を収集し、ＬＡＧ－３抗体を標識した後、各群のＣＡＲ－ｉＮＫＴ表面のＬＡＧ３発現状況をフローサイトメトリーにより検出した。細胞内シグナルドメインがＩＣＤ１、ＩＣＤ３の場合、ＬＡＧ－３を発現する細胞の割合が低下し、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒαを共発現すると、ＬＡＧ－３を発現する細胞の割合が低下した（図５）。これは、ＩＣＤ１、ＩＣＤ３を用いて細胞内シグナルドメインとし、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を共発現することで共阻害分子ＬＡＧ３の発現を低下させることができることを示しており、これにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γ発現能力を向上させる可能性があり、これは、前述したように、細胞内シグナルドメインとしてＩＣＤ１、ＩＣＤ３を用い、ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を共発現することにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌を増加させることができることと一致し（図４（Ａ））、それにより、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷能力が向上した（図３（Ａ））。
【0061】
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【図1】
【図2(A)】
【図2(B)】
【図2(C)】
【図2(D)】
【図3(A)】
【図3(B)】
【図4(A)】
【図4(B)】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】