特許 7638970 生体試料中の銅濃度を測定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-21

(45)【発行日】2025-03-04

(54)【発明の名称】生体試料中の銅濃度を測定する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/84 20060101AFI20250225BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20250225BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20250225BHJP

【ＦＩ】

G01N33/84 Z

G01N30/72 C

G01N27/62 V

G01N27/62 X

【請求項の数】 38

(21)【出願番号】P 2022516059

(86)(22)【出願日】2020-09-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-16

(86)【国際出願番号】 US2020050368

(87)【国際公開番号】W WO2021050850

(87)【国際公開日】2021-03-18

【審査請求日】2023-09-06

(31)【優先権主張番号】62/944,498

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/899,498

(32)【優先日】2019-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/958,432

(32)【優先日】2020-01-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503102674

【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】マ， マーク

(72)【発明者】

【氏名】リャン， タオ

(72)【発明者】

【氏名】ペルト， ライアン

【審査官】三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０８８０２３６０（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０１１－０１３１９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３５３４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０１６１１２０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】France Woimant，New tools for Wilson’s disease diagnosis: exchangeable copper fraction，Ann Transl Med，2019年04月30日，Vol.7 Supplement 2，Page.S70

【文献】Bogdan Bernevic，Online immunocapture ICP-MS for the determination of the metalloprotein ceruloplasmin in human serum，BMC Res Notes，2018年04月02日，Vol.11 No.1，Page.213

【文献】Souleiman El Balkhi，Determination of ultrafiltrable and exchangeable copper in plasma: stability and reference values in healthy subjects，Anal Bioanal Chem，2009年05月07日，Vol.394 No.5，Page.1477-1484

【文献】Marta Costas-Rodriguez，Isotopic analysis of Cu in blood serum by multi-collector ICP-mass spectrometry: a new approach for the diagnosis and prognosis of liver cirrhosis?，Metallomics，2015年03月，Vol.7 No.3，Page.491-498

【文献】Andrew Duncan，The role of calculated non-caeruloplasmin-bound copper in Wilson's disease，Ann Clin Biochem，2016年10月13日，Vol.54 No.6，Page.649-654

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／８４

Ｇ０１Ｎ ３０／７２

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料中の不安定結合銅濃度を測定する方法であって、
前記生体試料を、セルロプラスミンに結合して免疫捕捉されたセルロプラスミンを形成する免疫捕捉試薬と接触させること；
前記免疫捕捉されたセルロプラスミンを取り出して、非セルロプラスミン試料を得ること；
前記非セルロプラスミン試料を、不安定結合銅に結合するキレート剤と接触させること；非不安定結合銅を取り出して、不安定結合銅試料を得ること；及び
前記不安定結合銅試料中の銅濃度を測定すること
を含む、方法。

【請求項2】

前記試料が、ヒト血漿又はヒト血清を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記免疫捕捉試薬が、免疫沈降試薬を含む、請求項１又は請求項２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

前記免疫捕捉試薬が、セルロプラスミン捕捉試薬を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、ペプチド、及びそれらの抗原結合フラグメントから選択される少なくとも１つの試薬を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル又はポリクローナルヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体の少なくとも１つを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記免疫捕捉試薬が、抗セルロプラスミン固定化固体支持体を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記免疫沈降試薬が、セルロプラスミンと複合体を形成した後、固体支持体上に固定化するように構成された遊離の抗セルロプラスミン試薬を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記固体支持体が、磁性ビーズを含む、請求項７又は請求項８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記固体支持体が、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの固体支持体を含む、請求項７又は請求項８のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記不安定結合銅試料中の銅濃度の測定が、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）の使用を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記銅濃度を測定する前に、前記不安定結合銅試料に内部標準を導入することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記内部標準が、銅及びロジウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記免疫捕捉されたセルロプラスミンの取り出しが、免疫捕捉されたセルロプラスミン試料を得ることをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記免疫捕捉されたセルロプラスミン試料中のセルロプラスミン濃度を測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記セルロプラスミン濃度を測定することが、質量分析法の使用を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記質量分析が、少なくとも５μｇ／ｍＬの分析物検出限界を有する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記セルロプラスミン濃度を測定することが、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の使用を含む、請求項１６又は請求項１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

前記生体試料中の前記セルロプラスミン濃度が、２００μｇ／ｍＬ未満である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記免疫捕捉されたセルロプラスミン試料中の銅濃度を測定することをさらに含む、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記免疫捕捉されたセルロプラスミン試料中の銅濃度の測定が、誘導結合プラズマ質量分析の使用を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記キレート剤が、ペニシラミン、トリエンチン塩酸塩、トリエンチン四塩酸塩、及びＥＤＴＡのうち少なくとも１つを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記キレート剤が、ＥＤＴＡを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記非不安定結合銅の取り出しが、非不安定結合銅試料を得ることをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記非不安定結合銅試料中の銅濃度を測定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記非不安定結合銅試料が、モリブデンを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記非不安定結合銅試料中のモリブデン濃度を測定することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

請求項１に記載の方法を行うためのキットであって、前記キットは：
免疫捕捉ためにセルロプラスミンに結合する、前記免疫捕捉試薬；
不安定結合銅に結合する前記キレート剤：及び、
使用説明書
を含む、キット。

【請求項29】

前記免疫捕捉試薬が、免疫沈降試薬を含む、請求項２８に記載のキット。

【請求項30】

前記免疫捕捉試薬が、セルロプラスミン捕捉試薬を含む、請求項２８又は請求項２９のいずれかに記載のキット。

【請求項31】

前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、ペプチド、及びそれらの抗原結合フラグメントから選択される少なくとも１つの試薬を含む、請求項３０に記載のキット。

【請求項32】

前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル又はポリクローナルヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体の少なくとも１つを含む、請求項３０に記載のキット。

【請求項33】

前記免疫捕捉試薬が、抗セルロプラスミン固定化固体支持体を含む、請求項３０に記載のキット。

【請求項34】

前記免疫沈降試薬が、セルロプラスミンと複合体を形成した後、固体支持体上に固定化するように構成された遊離の抗セルロプラスミン試薬を含む、請求項３０に記載のキット。

【請求項35】

前記固体支持体が、磁性ビーズを含む、請求項３３又は請求項３４のいずれかに記載のキット。

【請求項36】

前記固体支持体が、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの固体支持体を含む、請求項３３又は請求項３４のいずれかに記載のキット。

【請求項37】

前記キレート剤が、ペニシラミン、トリエンチン塩酸塩、トリエンチン四塩酸塩、及びＥＤＴＡのうち少なくとも１つを含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項38】

前記キレート剤が、ＥＤＴＡを含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年９月１２日に出願された米国出願第６２／８９９４９８号、２０１９年１２月６日に出願された米国出願第６２／９４４４９８号、及び２０２０年１月８日に出願された米国出願第６２／９５８４３２号に対する優先権を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

開示の分野
本開示は、生体試料中の銅濃度を測定する方法に関する。より具体的には、本開示は、生体試料中の遊離銅（例えば、非セルロプラスミン結合銅濃度、不安定結合銅濃度、又はその両方）を測定する方法に関する。そのような方法は、ウィルソン病を含むがそれに限定されない代謝関連の疾患又は障害の管理及び処置において特に有用である。

【0003】

背景
銅（Ｃｕ）は、全ての生物の生化学において重要な役割を果たす必須元素であり、主に重要な代謝経路における特定のキュプロ酵素（ｃｕｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）による電子の移動に関与している。銅の反応性も銅の毒性に寄与するため、銅の輸送及び細胞の区画化が特異的に調節される。そのような調節因子の１つはセルロプラスミン（ＣＰ）であり、これは哺乳動物の鉄ホメオスタシスに不可欠な役割を果たす銅含有血漿フェロキシダーゼである。このタンパク質は、結合した銅イオンの電子化学を利用するマルチ銅オキシダーゼファミリーの酵素のメンバーである。これは血漿銅の９０％以上を運搬し、末梢組織への血漿銅の送達及び胆汁への銅の排出を可能にする。一般に、正常な成人の血清セルロプラスミンレベルは２００μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬである。参照下限である２００μｇ／ｍＬ未満の血清セルロプラスミンレベルは、伝統的にウィルソン病（ＷＤ）に特徴的であると見なされている。

【0004】

ウィルソン病（肝レンズ核不全とも呼ばれる）は、銅輸送の遺伝性疾患である。ウィルソン病は、Ｃｕ充填酵素ＡＴＰ７Ｂ（ヒト）の様々な遺伝子変異によって引き起こされる。ＡＴＰ７Ｂは、毛細胆管を介したＣＰへのＣｕの移動及びＣｕの排出を促進する。結果として生じる肝臓の排出経路の欠陥は、肝臓、腎臓、中枢神経系／脳、及び角膜などの組織内の銅蓄積につながり、銅レベルは処置なしでは上昇したままである。具体的には、銅蓄積はＣＰの能力を超え、血液中を循環し組織及び臓器に蓄積する、遊離の非セルロプラスミン結合銅（「ＮＣＣ」）を生じさせる。このＮＣＣは、血漿タンパク質（例えば、アルブミン、トランスキュプレイン（ｔｒａｎｓｃｕｐｒｅｉｎ）、及び低分子量ペプチド又はアミノ酸など）と緩く結合して、複合体（「不安定結合銅」又は「ＬＢＣ」）を形成し得る。ＮＣＣ及びＬＢＣは「遊離銅」を含み、ウィルソン病で観察される銅毒性に寄与し、それを示唆し得る。

【0005】

したがって、ウィルソン病などの銅代謝関連障害を有する患者を管理及び処置するためのツールは、遊離銅レベルの測定である。ＮＣＣは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＡＡＳＬＤ）及び欧州ウィルソン病診療ガイドラインに従って銅制御を評価するためのバイオマーカー及び認識されたエンドポイントである。しかし、これらの歴史的に認められた処置ガイドラインの下では、ＮＣＣは直接測定されなかった。むしろ、総血中銅及びＣＰレベルのみが直接測定され、次いでＮＣＣが次の計算から推定された。

【数1】

【0006】

計算は、６つの銅原子が常に単一のＣＰ分子に結合し、ＮＣＣ及びセルロプラスミンの濃度が直接相関していることを前提としている。実際には、ＣＰは、ＣＰ分子ごとに会合した銅原子の数において相当の不均一性を示し得る。ＮＣＣを計算するこの式は、１つのＣＰあたり６つの銅原子が結合することを想定しているが、銅／ＣＰ比は病状によって異なる。実際、６～８個の銅原子がＣＰに実質的に結合することができ、ウィルソン病では通常、ＣＰ分子あたり６個未満の銅原子が会合している。

【0007】

結果として、ＮＣＣを決定するこの推定方法は、臨床環境で問題があることが明らかになり、その固有の欠点が批判されている。例えば、この方法及び式を使用すると、生理学的及び数値的に不可能な負のＮＣＣという結果が生成され得る。しかし、ＮＣＣの負の値は無意味であるにもかかわらず、この方法で評価された患者の２０～５０％で負の値が計算され、報告された。

【0008】

したがって、生体試料中の遊離銅の濃度を決定するための効率的且つ正確な方法が依然として必要とされている。

【0009】

特に、ウィルソン病を含むがこれに限定されない銅代謝関連の疾患及び障害を有する患者の非セルロプラスミン結合銅（ＮＣＣ）、セルロプラスミン結合銅（ＣＰ－Ｃｕ、ＣＰＣとも呼ばれる）、及び不安定結合銅（ＬＢＣ）の濃度を直接測定する方法が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示は、生体試料中の銅濃度を測定する効率的且つ正確な方法を提供する。したがって、本開示の一態様は、生体試料中の不安定結合銅を測定する方法を提供する。そのような方法は、
非セルロプラスミン試料を得るために生体試料からセルロプラスミンを取り出すこと；
非セルロプラスミン試料を、不安定結合銅に結合するキレート剤と接触させること；
非不安定結合銅を取り出して、不安定結合銅試料を得ること；及び
不安定結合銅試料中の銅濃度を測定すること
を含む。

【0011】

少なくとも１つの実施形態において、生体試料中の不安定結合銅を測定する方法は、
生体試料をセルロプラスミンに結合する免疫捕捉試薬と接触させること；
捕捉されたセルロプラスミンを取り出して、非セルロプラスミン試料を得ること；
非セルロプラスミン試料を、不安定結合銅に結合するキレート剤と接触させること；
非不安定結合銅を取り出して、不安定結合銅試料を得ること；及び
不安定結合銅試料中の銅濃度を測定すること
を含む。

【0012】

本開示のさらなる態様は、生体試料中の銅濃度を測定するためのキットを提供する。この態様の特定の実施形態において、キットは、免疫捕捉試薬及び使用説明書を含む。この態様の特定の他の実施形態において、キットは、免疫捕捉試薬、キレート剤、及び使用説明書を含む。

【0013】

添付の図面は、本開示の方法及び材料のさらなる理解を提供するために含まれており、それらは本明細書に組み込まれ、その一部を構成する。図面は、本開示の１つ以上の実施形態を示し、説明とともに、本開示の原理及び実施を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】血液、血清、又は血漿などの生体試料中の銅の異なる測定値を示す。「総銅」は、生体試料中の全ての銅である。「総Ｍｏ」は、総モリブデンであり、Ｍｏ含有薬物を直接測定することは困難であるため、一般にＭｏ含有薬物（ＢＣ－ＴＴＭなど）の濃度を推定するための代理として機能し得る。「ＣＰ－Ｃｕ」（「ＣＰＣ」としても知られる）は、銅－セルロプラスミン複合体である。「ＡＬＢ－Ｃｕ」（「Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｕ」としても知られる）は、銅－アルブミン複合体である。「ＰＵＦ－Ｃｕ」（「Ｐｅｐ－Ｃｕ」としても知られる）は、血漿限外ろ過銅であり、一般に、例えば限外ろ過によって、抽出された試料（例えば、銅が緩く結合する低分子量ペプチドを含有する）中の遊離銅の測定値である。

【図2】本開示の少なくとも１つの実施形態による、生体試料中の銅の直接測定を示す。

【図3-1】本開示の少なくとも１つの実施形態による、生体試料中の銅の直接測定を示す。「Ｐｅｐ－ＣＵ」（「ＰＵＦ－Ｃｕ」としても知られる）は、低分子量のペプチド又はアミノ酸に緩く結合する遊離銅である。「ＭＡＣ」は、Ｍｏ－アルブミン三分子結合銅である。

【図3-2】本開示の少なくとも１つの実施形態による、生体試料中の銅の直接測定を示す。「ＵＦ」は、Ｐｅｐ－Ｃｕを取り出すための限外ろ過である。「ＩＰ」は、Ｐｅｐ－Ｃｕを取り出すための免疫沈降である。

【図3-3】本開示の少なくとも１つの実施形態による、生体試料中の不安定結合銅（Ｐｅｐ－Ｃｕ及びＡＬＢ－Ｃｕを含む）の直接測定を示す。

【図4】ウィルソン病のベースライン（未処理）血漿試料に対して、旧ＮＣＣ推定法（「旧」）及び即時法（「新」）を使用して測定されたＮＣＣ（非セルロプラスミン結合銅）を示す。

【図5】ウィルソン病のベースライン血漿試料のＣＰＣとＣＰの比率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

開示される方法及び材料が記載される前に、本明細書に記載される態様は、特定の実施形態に限定されず、当然ながらそれ自体変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、本明細書で具体的に定義されない限り、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0016】

定義
本明細書全体を通して、文脈上別段の定めがない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語並びにその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）は、記載される成分、機能、要素、若しくはステップ、又は成分、機能、要素、若しくはステップのグループを包含することを示唆するが、他のいかなる整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップのグループを除外するものではないと理解される。

【0017】

明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明示がない限り、複数の指示対象を含む。

【0018】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原を認識し、それに特異的に結合することができるタンパク質を指す。通常又は従来の哺乳動物抗体は、典型的にポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成される四量体を含み、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（典型的には約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）からなる。本明細書で使用される「重鎖」及び「軽鎖」という用語は、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖及び重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に典型的に関与する約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変ドメインを含む。抗体が非ヒト供給源に由来する場合、可変ドメインをさらなるタンパク質工学に供して、フレームワーク領域をヒト化してもよい。各鎖のカルボキシル末端部分は、典型的には、エフェクター機能の原因である定常ドメインを定義する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３）、並びにＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２の間のヒンジ領域を含み、ここで、Ｖ_Ｈドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈ３ドメインはカルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及び定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含み、ここで、Ｖ_Ｌドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｌドメインはカルボキシル末端にある。本明細書で使用される抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化又はキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、及び完全ヒト抗体が含まれ得る。抗体は、様々な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、チンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、及びマウスなどの哺乳動物のいずれかにおいて作製でき、又はそこから誘導することができる。抗体は、精製又は組換え抗体であり得る。抗体はまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する操作されたタンパク質又は抗体様タンパク質（例えば、融合タンパク質）であり得る。操作されたタンパク質又は抗体様タンパク質はまた、二重特異性抗体若しくは三重特異性抗体、又は二量体、三量体、若しくは多量体抗体、又はダイアボディ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－Ｉｇ、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（登録商標）分子抗体模倣物、又はナノボディであり得る。

【0019】

「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」という用語は、無傷又は完全長の鎖又は抗体の一部、一般に、標的結合又は可変領域を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’、Ｆ_{（ａｂ’）２}及びＦ_ｖフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「機能的フラグメント」という用語は、一般に「抗体フラグメント」と同義であり、抗体に関しては、Ｆ_ｖ、Ｆ_ａｂ、Ｆ_{（ａｂ’）２}などの抗体フラグメントを指し得る。

【0020】

本明細書で使用される「患者」という用語は、ヒト及び動物の対象を含む。

【0021】

本明細書で使用される「治療剤」又は「治療組成物」という用語は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘発することができる化合物又は組成物を指す。

【0022】

治療剤又は組成物に関して使用される場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を生み出すのに十分な量又は投与量を指す。より具体的には、有効量は、処置されている状態に関連する臨床的に定義された病理学的プロセスの１つ以上を一定期間にわたって阻害するのに十分なものである。有効量は、使用されている特定の治療剤に応じて変化し得、処置される患者及び障害の重症度に関連する様々な要因及び条件にも依存する。

【0023】

本明細書で使用される「遊離銅」という用語は、患者の体内に存在する遊離の非セルロプラスミン結合銅を指し、ＮＣＣ及びＬＢＣを包含する。

【0024】

ウィルソン病の症状及び処置
ウィルソン病を有する患者は、肝臓、神経、精神、及び眼の症状の組み合わせを経験し得る。例えば、肝症状は、最初は９～１３歳の患者に見られ、急性肝不全及び慢性肝疾患の両方が含まれ得る。神経学的徴候及び症状には、例えば構音障害、ジストニア、振戦、及び運動失調が含まれ得る。精神症状は、例えば、過敏性から人格変化及びうつにまで及び得る。カイザー・フライシャー輪としても知られる角膜の銅沈着も存在し得る。ウィルソン病の症状は、患者の皮膚、関節、腎臓などの他の位置にも存在し得る。さらに、ウィルソン病患者の亜集団は「発症前」に分類される。発症前の患者は、ウィルソン病の遺伝子変異及びそれに伴う生化学的異常を有するが、それ以外は無症候性である。

【0025】

処置なしでは、ウィルソン病は致死的であるが、処置を行う場合、及び患者が処置に十分に準拠している場合、平均余命は正常であり得る。

【0026】

ウィルソン病の処置は、体組織に蓄積された銅を取り除き、その後、銅の再蓄積を防ぐことを目的とする。Ｄ－ペニシラミン及びトリエンチンは、症候性ウィルソン病の処置に使用され得る２つのキレート剤である。Ｄ－ペニシラミンは第一選択治療とみなし得るが、一部の患者は、有害事象を経験した後、トリエンチンへの切り替えを要する。ペニシラミンの非限定的な例には、ＣＵＰＲＩＭＩＮＥ（登録商標）（Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）及びＤＥＰＥＮ（登録商標）（Ｍｙｌａｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ ＬＰ）が含まれる。トリエンチンは第一選択治療としても使用され得る。トリエンチンの非限定的な例には、トリエンチン塩酸塩（ＳＹＰＲＩＮＥ（登録商標）（Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）など）及びトリエンチン四塩酸塩（ＣＵＰＲＩＯＲ（登録商標）（ｇｍｐ－ｏｒｐｈａｎ ＳＡ）など）が含まれる。患者の銅レベルが低下すると、処置の目標は銅の再蓄積の防止及び維持療法となる。亜鉛塩（非限定的な例には、ＧＡＬＺＩＮ（登録商標）（酢酸亜鉛）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＷＩＬＺＩＮ（登録商標）（酢酸亜鉛二水和物）（Ｒｅｃｏｒｄａｔｉ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）が含まれる）は、維持処置に使用され得、また、銅吸収を減少させるために、例えば無症候性の患者を含む患者の第一選択治療としても使用され得る。過去に、テトラチオモリブデン酸アンモニウムが潜在的な処置選択肢として研究されてきた。銅－タンパク質結合剤であるビスコリンテトラチオモリブデート（ＢＣ－ＴＴＭ）も、ウィルソン病の処置に使用され得る。ＢＣ－ＴＴＭは、特異性の高い銅タンパク質複合体を迅速に形成し、肝臓及び血液中の遊離銅を無害化し、銅の胆汁排出を促進することができる。最後に、急性肝不全、非代償性肝疾患を呈している患者、又は処置に応答しない患者は、肝移植を要する場合がある。

【0027】

ウィルソン病を有する患者は、患者の銅消費及び銅蓄積を制限することを意図とした食事制限の対象となり得る。例えば、肝臓は、動物の食餌の高ミネラル含有量のために銅が非常に高くなり得るため、脱銅期間中は摂取してはならない。貝類（ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ）は銅レベルが中程度に高く、飲料水も高い銅レベルを有する場合がある。患者の飲料水に１リットルあたり０．１ｍｇを超える銅が含まれている場合、蒸留水又は脱塩水を使用する必要がある。患者の食事は、毎日１又は２ミリグラム以下の銅を摂取するように調整する必要がある可能性がある。銅制限食は、チョコレート、ナッツ、貝類（ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ）、キノコ、肝臓、糖蜜、ブロッコリー、及び銅が豊富なシリアル及び栄養補助食品を除外し、低銅含有量の食品で構成され得る。

【0028】

遊離銅の測定方法
本開示を考慮して、本明細書に記載の方法は、所望の需要を満たすために当業者によって構成され得る。一般に、開示された方法は、生体試料中の銅濃度の測定における改善を提供する。例えば、開示された方法は、試料中の遊離銅の効率的且つ正確な測定を提供し、計算されたＮＣＣの生物学的に不可能な負の値（これは、完全に機能する非ウィルソン病のＣＰ値の特徴からの誤った仮定に基づいている）などの、現在使用されている方法に関連する問題の一部を排除する。本開示の方法の特定の実施形態は、本開示の方法が遊離銅の直接測定である（すなわち、計算された推定値ではない）ため、遊離銅の正確且つ信頼できる定量化を提供する。

【0029】

したがって、本開示の一態様は、生体試料中の不安定結合銅濃度を測定する方法を提供する。この方法では、試料をセルロプラスミンに結合する免疫捕捉試薬と接触させ、免疫捕捉されたセルロプラスミンを取り出して、非セルロプラスミン試料を得；非セルロプラスミン試料を、不安定結合銅に結合するキレート剤と接触させ；非不安定結合銅を取り出して、不安定結合銅試料を得る。銅濃度は、不安定結合銅試料で測定される。

【0030】

本開示の別の態様において、生体試料中のＮＣＣ濃度を測定する方法が提供される。このような方法は、図２に模式的に示されている。この方法では、試料をセルロプラスミンに結合する免疫捕捉試薬と接触させ、捕捉されたセルロプラスミンを取り出して、非セルロプラスミン試料を得る。ＮＣＣ濃度は、非セルロプラスミン試料で測定される。

【0031】

一般に、セルロプラスミンを含有する任意の試料は生体試料であり、本開示の方法で使用することができる。ウィルソン病の特徴の１つは、２００μｇ／ｍＬ未満の血清セルロプラスミン濃度である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用される生体試料は、セルロプラスミン濃度が約２００μｇ／ｍＬ未満のものである。いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用される試料は、セルロプラスミン濃度が約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬの範囲内である。

【0032】

特定の実施形態において、試料は、ヒト血漿又はヒト血清である。いくつかの実施形態において、試料はヒト血漿である。いくつかの実施形態において、試料はヒト血清である。いくつかの実施形態において、試料は、哺乳動物血漿又は哺乳動物血清である。

【0033】

上記のように、本明細書に記載の本開示の方法の特定の実施形態において、試料は、セルロプラスミンに結合する免疫捕捉試薬と接触される。捕捉されたセルロプラスミンを取り出すと、非セルロプラスミン試料が得られる。例えば、特定の実施形態において、免疫捕捉試薬は、セルロプラスミン捕捉試薬である。

【0034】

本明細書に記載される本開示の方法の特定の実施形態において、免疫捕捉試薬は、免疫沈降試薬である。例えば、特定の実施形態において、抗セルロプラスミン固定化固体支持体を免疫沈降試薬として使用することができる。いくつかの実施形態において、免疫沈降試薬は、セルロプラスミンと複合体を形成した後、固体支持体上に固定化するように構成された遊離の抗セルロプラスミン結合部分である。当技術分野で公知の任意の適切な固体支持体を使用することができる。例えば、特定の実施形態において、固体支持体は、磁性ビーズ、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートから選択される少なくとも１つの固体支持体である。少なくとも１つの実施形態において、固体支持体は磁性ビーズである。別の実施形態において、固体支持体は、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートから選択される。

【0035】

固体支持体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ化又はキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、完全ヒト抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、その抗原結合フラグメント、及びペプチドから選択される１つ以上の抗セルロプラスミン試薬で機能化することができる。本明細書に記載の本開示の方法の特定の実施形態において、免疫捕捉試薬は、モノクローナル又はポリクローナルヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体の少なくとも１つである。

【0036】

抗セルロプラスミン抗体などの特定の抗セルロプラスミン試薬は、ＣＰに結合する試薬の効率を評価することによって選択され得る。例えば、抗セルロプラスミン試薬は、生体試料からＣＰを枯渇させるその効率に基づいて選択され得る。特定の実施形態において、免疫捕捉後の生体試料中のセルロプラスミンを測定することによってＣＰ枯渇の高効率を示す抗ＣＰ抗体は、本開示の方法において使用され得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、表１に提供されるＭＳパラメーターを有する抗体は、高効率のＣＰ枯渇（例えば、高ＣＰ結合）を有するものとして分類され得る。したがって、特定の実施形態において、抗セルロプラスミン試薬（例えば、抗セルロプラスミン抗体）は、生体試料中、ＣＰの少なくとも９０％、例えば、ＣＰの少なくとも９２％又は少なくとも９４％を、総ＣＰから枯渇させることができる。特定の実施形態において、抗セルロプラスミン試薬は、生体試料中、ＣＰの少なくとも９５％、例えば、ＣＰの少なくとも９６％又は少なくとも９７％を、総ＣＰから枯渇させることができる。特定の実施形態において、抗セルロプラスミン試薬は、生体試料中、ＣＰの少なくとも９８％、例えば、ＣＰの少なくとも９８．５％若しくは少なくとも９９％を、又は９９％超でさえ、総ＣＰから枯渇させることができる。

【0037】

【表1】

【0038】

一般に、銅濃度の測定は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して実施され得る。誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ－ＯＥＳ）、及びＺｅｅｍａｎグラファイト炉原子吸光分析（ＧＦＡＡＳ）が含まれるがこれらに限定されない、銅濃度の測定に適した他の分析方法を使用できる。

【0039】

本明細書に記載の本開示の方法の特定の実施形態において、銅濃度を測定する前に、内部標準（ＩＳ）が不安定結合銅試料又は非セルロプラスミン試料に導入される。特定の実施形態において、内部標準は、銅、ロジウム、及びインジウムのうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態において、内部標準は、銅及びロジウムのうちの少なくとも１つを含む。

【0040】

ウィルソン病の処置に使用される治療剤の１つは、ビスコリンテトラチオモリブデート（ＢＣ－ＴＴＭ）であり、これは、血清銅をテトラチオモリブデートアニオンと結合させて取り出すことによって作用する。テトラチオモリブデートが組織又は血液中のタンパク質に関連する銅に結合すると、タンパク質／銅（典型的にはアルブミン／銅）との堅く結合した三分子複合体が形成される。このテトラチオモリブデート－銅－アルブミン三分子複合体の形成は、ＢＣ－ＴＴＭの作用機序の特徴であり、銅とタンパク質複合体を形成しないキレート剤からＢＣ－ＴＴＭを区別する。その結果、モリブデン（Ｍｏ）は、ＢＣ－ＴＴＭ曝露を推定し、有効治療用量を調整するための代理測定として使用されてきた。ＢＣ－ＴＴＭで処置された患者のＮＣＣを評価するために、ＮＣＣ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}の概念がＢＣ－ＴＴＭ研究に組み込まれ、これは、テトラチオモリブデート－銅－アルブミン三分子複合体の測定値として血漿Ｍｏを使用する。ＮＣＣ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}は次のように計算される。

【数2】

式中、ＮＣＣは、現在の手順に従って計算された推定ＮＣＣである。

【0041】

本開示の方法はさらに、ＢＣ－ＴＴＭを受けている患者においてさえＮＣＣの直接定量化を可能にする。例えば、本開示の方法はまた、テトラチオモリブデート－銅－アルブミン三分子複合体（ＭＡＣ又はＭｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ）中の銅濃度の直接測定を可能にする。このような実施形態は、図３Ａ及び３Ｂに模式的に示されている。

【0042】

したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載の本開示の方法は、非セルロプラスミン試料をモリブデン捕捉試薬と接触させてモリブデン試料を得ることをさらに含む。モリブデン捕捉試薬は、キレート競合試薬又は界面活性剤であってもよい。特定の実施形態において、方法は、モリブデン試料中のモリブデン結合銅濃度を測定することをさらに含む。銅濃度は、非セルロプラスミン試料中の銅の測定に関して上記のように測定することができる。例えば、モリブデン試料の銅濃度は、誘導結合プラズマ質量分析を使用して測定される。正確な非セルロプラスミン結合銅濃度は、非セルロプラスミン試料の銅濃度からモリブデン試料の銅濃度を差し引くことによって得られ得る。いくつかの実施形態において、非セルロプラスミン試料は、モリブデン捕捉試薬と接触する前に、限外ろ過に供されるか、又は免疫捕捉試薬に接触されて、血漿限外ろ過銅が取り出される。

【0043】

本明細書に記載の本開示の方法において、セルロプラスミンは、免疫捕捉試薬によって取り出されて、非セルロプラスミン試料及び免疫捕捉セルロプラスミン試料が得られる。特定の実施形態において、免疫捕捉されたセルロプラスミン試料をさらに評価することができる。例えば、特定の実施形態において、本開示の方法は、免疫捕捉されたセルロプラスミン試料のセルロプラスミン濃度を測定することをさらに含む。一般的に、セルロプラスミン濃度は質量分析法を使用して測定される。試料中のタンパク質濃度を測定するのに適した他の分析方法も使用できる。特定の実施形態において、質量分析又は他の分析方法は、少なくとも約５μｇ／ｍＬの分析物（すなわち、セルロプラスミン）検出限界を有する。特定の実施形態において、セルロプラスミン濃度の測定は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して実施される。他の実施形態において、本開示の方法は、免疫捕捉されたセルロプラスミン試料の銅濃度を測定することをさらに含む。銅濃度は、非セルロプラスミン試料中の銅の測定に関して上記のように測定することができる。例えば、免疫捕捉されたセルロプラスミン試料の銅濃度は、誘導結合プラズマ質量分析を使用して測定される。

【0044】

特定の実施形態において、本明細書に記載される本開示の方法は、非セルロプラスミン試料を、試料中に存在する不安定結合銅に結合するキレート剤と接触させることをさらに含む。少なくとも１つの実施形態において、そのようなキレート剤は、ＭＡＣに存在する銅に結合しない。次に、ＭＡＣを試料から取り出し、不安定結合銅を含む試料（「不安定結合銅試料」）を残すことができる。

【0045】

このような実施形態は、図３Ｃに模式的に示されている。図３Ｃにおいて、１行目は、例えば、Ｐｅｐ－Ｃｕ、アルブミン－Ｃｕ、Ｍｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ三分子複合体、及びＣＰ－Ｃｕなどの、生体試料に存在する様々な結合形態の銅を示す。２行目は、ＣＰ－Ｃｕ画分をＮＣＣ画分（Ｐｅｐ－Ｃｕ、アルブミン－Ｃｕ、及びＭｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ三分子複合体を含む）から分離するために、ＣＰの免疫捕捉を実施する。少なくとも１つの実施形態において、ＣＰ－Ｃｕ画分中のＣＰ－Ｃｕ及び／又はＣＰの量が測定され得る。図３Ｃの３行目に示されているＮＣＣ画分は、Ｍｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ三分子複合体をＬＢＣ画分（Ｐｅｐ－Ｃｕ及びアルブミン－Ｃｕを含む）から分離するために、キレート化及びろ過に供され得る。少なくとも１つの実施形態において、Ｍｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ画分中のＭｏ及び／又はＣｕの量が測定され得る。少なくとも１つの実施形態において、ＬＢＣ画分中のＣｕの量は、試料中の不安定結合銅の量を得るために、本明細書に記載の方法に従って測定され得る。

【0046】

本明細書に記載の方法で使用されるキレート剤は、非限定的な例として、トリエンチン塩酸塩、トリエンチン四塩酸塩、ペニシラミン、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡとしても知られる）などの不安定結合銅に結合する任意のキレート剤から選択され得る。少なくとも１つの実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡを含む。

【0047】

キレート剤の添加後、得られた試料は、任意選択により混合及び／又はインキュベートされ得る。ＭＡＣは、非限定的な例としてろ過を含む、当業者に公知の任意の適切な技術によって、非セルロプラスミン試料から取り出され得る。少なくとも１つの実施形態において、試料は、ＭＡＣの取り出し後、遠心分離される。

【0048】

銅代謝のバイオマーカー
本開示は、銅代謝のバイオマーカーを提供する。生体試料中の遊離銅濃度は、患者の血液中を循環し、患者の組織及び臓器に蓄積している可能性のある遊離銅濃度の濃度を示す。したがって、本明細書に記載の方法によって測定されるＮＣＣ及び／又はＬＢＣは、患者の銅代謝のバイオマーカーを含む。より具体的には、本明細書に記載の銅代謝関連障害又は疾患を有する患者を診断、特定、又はモニタリングするために、本明細書に記載の方法によって測定されるＮＣＣ及び／又はＬＢＣが使用され得る。少なくとも１つのそのような実施形態において、銅代謝関連障害又は疾患は、ウィルソン病である。

【0049】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるバイオマーカーは、本明細書に開示されるＮＣＣ及び／又はＬＢＣを測定するための方法を使用して測定され得る。

【0050】

本明細書に開示されるバイオマーカーは、患者における遊離銅濃度について特定の有効参照範囲と比較され得る。少なくとも１つの実施形態において、バイオマーカーは、例えば、民族、年齢、性別、併存疾患、及びその他の要因などの、対象の特定の患者集団の亜集団における遊離銅濃度について、特定の有効参照範囲のセットと比較される。

【0051】

銅濃度を測定するためのキット
本開示の別の態様は、生体試料中の銅濃度を測定するためのキットを提供する。より具体的には、本開示は、生体試料中の遊離銅濃度（例えば、ＮＣＣ及び／又はＬＢＣ）を測定するためのキットを提供する。

【0052】

この態様の特定の実施形態において、生体試料中のＮＣＣを測定するためのキットは、本明細書に記載の免疫捕捉試薬及び使用説明書を含む。少なくとも１つの実施形態において、使用説明書は、遊離銅濃度について特定の有効参照範囲を含む。少なくとも１つのさらなる実施形態において、使用説明書は、例えば、民族、年齢、性別、併存疾患、及びその他の要因などの、対象の特定の集団の亜集団における遊離銅濃度について、特定の有効参照範囲を含む。

【0053】

この態様の特定の他の実施形態において、生体試料中のＬＢＣを測定するためのキットは、本明細書に記載の免疫捕捉試薬、本明細書に記載のキレート剤、及び本明細書に記載の使用説明書を含む。

【0054】

この態様の特定の他の実施形態において、生体試料中のＬＢＣを測定するためのキットは、本明細書に記載の免疫捕捉試薬、及び本明細書に記載の使用説明書を含む。そのような特定の他の実施形態において、例えば、使用説明書は、不安定結合銅試料を得るために本明細書に記載のキレート剤を使用するための説明書を含む。

【0055】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるキットは、銅代謝関連の障害又は疾患を有する患者を特定又は診断するために使用され得る。他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるキットを使用して、患者の遊離銅を経時的にモニタリングしてもよい。

【実施例】

【0056】

本開示の特定の態様は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは、範囲又は精神について、開示を、それらに記載されている特定の方法及び材料に限定するものと解釈されるべきではない。

【0057】

実施例１：非セルロプラスミン銅（ＮＣＣ）生物分析アッセイの直接測定
ヒト血清／血漿中の非セルロプラスミン銅濃度は、連続ダイノード検出器を使用した誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して決定された。

【0058】

１１４の血漿試料は、ＢＣ－ＴＴＭによる処置前のウィルソン病患者の第３相臨床試験から得られた（投与前試料）。血漿試料は、１２０人の健常ボランティア（１８歳以下６０人（「小児」）及び１９歳以上６０人（「成人」））からも得た。

【0059】

トシル活性化磁気ビーズは市販されており（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、以前はＤｙｎａｂｅａｄｓ）、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）製のヤギ抗ヒトセルロプラスミンポリクローナル抗体で被覆される。２０マイクロリットルのヒト血漿試料を、ＰＢＳＴ溶液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）に懸濁した２００μＬの被覆磁気ビーズで希釈した。希釈は、１０００ｒｐｍで振とうしながら室温で、９０分間丸底プレートで実施した。インキュベーション後、磁気ビーズを磁気スタンドによって室温で５分間、上清から分離し、続いて得られたＣＰを含まない上清２００μＬを１５ｍＬの無金属プラスチック遠心分離管に移した。

【0060】

以下に説明されるように、上清のＣｕ濃度を直接測定した。ＣＰ／磁性ビーズ画分を簡単に洗浄し、ＣＰ及びＣＰ－Ｃｕ（免疫捕捉ＣＰ試料）の溶液を提供するために、標準的な手順に従ってＣＰを定量的に溶出した。

【0061】

１００μＬの銅（Ｃｕ－ＳＴＤ）及びセルロプラスミン（ＣＰ－ＳＴＤ）を含む標準試料、銅（Ｃｕ－ＱＣ）及びセルロプラスミン（ＣＰ－ＱＣ）を含む品質管理試料、及びブランク試料を、それぞれ１５ｍＬの無金属プラスチック遠心分離チューブに加えた。血漿試料、ブランク、ＳＴＤ、又はＱＣを含有する各チューブに、銅（ＣＵ－ＩＳ）及びセルロプラスミン（ＣＰ－ＩＳ）を含む２０μＬの内部標準並びに９００μＬの０．１％硝酸を加え、チューブを約５分間ボルテックスした。次に、チューブを１２，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離し、上清を、Ａｇｉｌｅｎｔ ７８００／７９００若しくはＡｇｉｌｅｎｔ ８９００でのＩＣＰ－ＭＳ分析又はＬＳ－ＭＳ分析用のオートサンプラーに適した無金属プラスチックチューブに移した。

【0062】

銅について、データ取得はＭａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒソフトウェア（Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ ４．２ ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎソフトウェアバージョンＣ．０１．０２）を使用して実行した。セルロプラスミンについて、データ取得はＡｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．６．２又は同等物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ）を使用して実行され、クロマトグラムはＡｎａｌｙｓｔを使用して統合された。血漿試料の結果は、適切な生物分析法で特定された濃度の単位で報告される。

【0063】

ＣＰを含まない上清の分析により、非セルロプラスミン結合銅濃度（ＮＣＣ）が得られた。免疫捕捉されたＣＰ試料の分析により、ＣＰ－Ｃｕ濃度及びＣＰ濃度が得られた。

【0064】

第３相臨床試験からの１１４の投与前試料では、全ての投与前試料で検出可能なＮＣＣレベルが得られ、負のＮＣＣ値を有する試料はなく、定量限界未満（ＢＱＬ）のＮＣＣ値を有する試料はなかった。検出された最低のＮＣＣは０．２μＭであり、アッセイ感度は０．０８μＭであると決定された。以前の分析では、試料の４０％で負のＮＣＣという結果が報告された。

【0065】

１２０人の健常ボランティア（１８歳以下６０人（「小児」）及び１９歳以上６０人（「成人」））から得た血漿試料について、検出された最低のＮＣＣは０．２μＭであり、ベースラインの臨床試験試料（つまり、未処置のウィルソン病患者からの試料）からの全体的な範囲は０．０８μＭ～１５．７μＭであり、５ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬに相当するものであった。

【0066】

方法の正確性及び精度を検証するために、ＮＣＣ法は、異なる日に、異なる分析官によって、濃度レベルごとに複数のＱＣ試料（ｎ＝１８）を使用して実施された。この方法は、評価した全ての濃度で精度及び正確性の両方を示した。

【0067】

実施例２：非セルロプラスミン銅（ＮＣＣ）生物分析アッセイの直接測定
（未処置の）ウィルソン病患者からの臨床試験血液試料は、無菌静脈穿刺（又は静脈内投与）によって得られ、２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離して血漿を得るまで、４℃又は氷上で保存された。血漿試料は、分析が実施されるまで－７０℃で保存された。試料は、実施例１のプロセスに従って分析された。データは図４に示され、以前の推定方法によって得られた、過去報告されたＮＣＣと対になっている。旧ＮＣＣ推定法によると、対象のおよそ４０％が負のベースラインＮＣＣレベルを有すると判断され、これは生物学的に不可能であり、ウィルソン病処置の評価を複雑化する。比較すると、実施例１による方法は、ＮＣＣの負の値を排除し、遊離Ｃｕの減少を定量化するためのより高い感度を示した。

【0068】

ベースライン（未処置）のウィルソン病血漿試料（ｎ＝４２）についても、ＣＰ－ＣｕとＣＰの比率を評価して、銅とセルロプラスミンタンパク質のモル比を決定した（図５）。平均ＣＰ－Ｃｕ／ＣＰは４．２９であり、標準偏差は０．９２であった。これは、セルロプラスミンあたり６Ｃｕという歴史的に想定されている値とは対照的である。（Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ，ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｓｔａｔｕｓ，Ｂｉｏｌ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍ Ｒｅｓ，２００８ Ｓｕｍｍｅｒ；１２３（１－３）：２６１－９を参照。）

【0069】

実施例３：不安定結合銅（ＬＢＣ）バイオアッセイ
この２ステップバイオアッセイでは、血漿試料を最初にＣＰのビーズ免疫捕捉に供し、次にキレート化に供し、続いてろ過してＭｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ三分子複合体を取り出した。この方法は、（初めて）遊離Ｃｕ種ＬＢＣを直接測定するものである。

【0070】

免疫捕捉試薬の調製
ステップ１：２０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（微量銅）の調製
水中の約２０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡは、約０．４ｇのＢＳＡを無金属チューブ内の約２０ｍＬの精製Ｈ_２Ｏに溶解することによって調製した。約４０００μＬの２０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液を３０Ｋフィルター（４ｍＬフィルター容量）に加え、約４０００ｘｇで約２５分間遠心分離した。ろ液を廃棄した。約３６００μＬの１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を各フィルターに加え、得られた溶液を約３０秒間ボルテックスした後、約４０００ｘｇで約２５分間回転させた。ろ液を廃棄し、ＥＤＴＡを加え、ボルテックスし、次に回転させるステップをさらに４回繰り返した。

【0071】

次に、ろ液を廃棄し、約３６００μＬの精製水をフィルターに加え、得られた溶液を約３０秒間ボルテックスした後、約４０００ｘｇで約１５分間遠心分離した。ろ液を廃棄し、精製水を加え、ボルテックスし、次に遠心分離するステップをさらに４回繰り返した。得られた溶液を約－８０℃で保存した。

【0072】

ステップ２：ブロッキングバッファーの調製：０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含む１Ｘ ＰＢＳ
約０．１ｍＬのＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を約１０００ｍＬの１ＸＰＢＳバッファーに加えた。得られた溶液をよく混合し、略室温で保存した。

【0073】

ステップ３：カップリングバッファーの調製
カップリングバッファーＡ：０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５。約１００ｍＬの０．５Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９．５を約４００ｍＬのＨ_２Ｏで希釈した。溶液をよく混合し、約４℃で保存した。

【0074】

カップリングバッファーＣ：カップリングバッファーＡ中の３Ｍ硫酸アンモニウム。約３９．６ｇの硫酸アンモニウム（ＭＷ１３２．１４）を約７０～８０ｍＬのカップリングバッファーＡに溶解した。１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨを９．５に調整した。最終容量が約１００ｍＬになるように、カップリングバッファーＡの量を加えた。溶液をよく混合し、約４℃で保存した。

【0075】

カップリングバッファーＤ（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ中の５ｍｇ／ｍＬ微量銅ＢＳＡ、ｐＨ８．５）。約５ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬ（微量銅）ＢＳＡ及び１ｍＬの１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．５を１４ｍＬの水に加えた。溶液をよく混合し、約４℃で保存した。

【0076】

ステップ４：ヤギ抗ヒトセルロプラスミン被覆５０ｍｇビーズの調製
約３０ｍｇ／ｍＬのＭ－２８０トシル活性化磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）をよく混合した。約１６７０μＬ（約５０ｍｇに相当）のビーズを２ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。チューブを磁気スタンドに置き、約３０秒でビーズを沈降させた。上清を除去した。ビーズは、磁気スタンドを備えた１．５ｍＬのカップリングバッファーＡで洗浄した。ビーズ懸濁液をボルテックスして完全に懸濁させた。約５００μＬのカップリングバッファーＡ及び約６００μＬの抗体（０．６ｍｇ １ ｍｇ／ｍＬヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ））をビーズに加えた。次に、約５００μＬのカップリングバッファーＣを抗体－ビーズ混合物に加えた。混合物をよくボルテックスした。混合物を回転させながら３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートした。チューブを磁気スタンドに置き、上清を除去した。約１ｍＬのカップリングバッファーＤを加え、溶液を約３７℃で約１時間、回転させながらインキュベートした。チューブを磁気スタンドに置き、上清を除去した。磁気スタンドを使用して、ビーズを約１．５ｍＬのブロッキングバッファーで３回洗浄した。ビーズを約１．２５ｍＬのブロッキングバッファーに再懸濁して、最終ビーズ濃度を約４０ｍｇ／ｍＬとした。

【0077】

血漿試料の調製
ヒト血漿（リチウムヘパリン）試料はＢｉｏＩＶＴから入手した。ヒト血漿試料は本質的に内因性ＬＢＣを含んでいたため、ＬＢＣ含有量を決定するために予めスクリーニングされた。次に、希釈された血漿試料は、従来の方法を使用して調製された。

【0078】

【表2】

【0079】

【表3】

【0080】

【表4】

【0081】

ＣＰの免疫捕捉
分析する各血漿試料を、必要に応じて略室温まで解凍し、次に穏やかによくボルテックスした。各試料約２０μＬを、９６ウェルタンパク質低結合プレート上のウェルに入れた。上記のように調製したブロッキングバッファー中の抗ヒトセルロプラスミン抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で予め被覆した約２００μＬのＭ－２８０トシル活性化ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を各ウェルに加えた。プレートを密封し、約５００ｒｐｍでおよそ１分間遠心分離した。プレートをプレートシェーカー上、約１０００ｒｐｍの速度で、およそ２５℃で約１．５時間インキュベートした。次に、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘによって各ウェルからビーズを除去した。９６ウェルプレートの各ウェル上の残存溶液は、ＮＣＣ（ＣＰを含まない）上清を含んでいた。

【0082】

キレート化－ろ過
各試料の約２００μＬのＮＣＣ上清を、清浄な無金属チューブに移し、次に、約６０μＬのキレートスパイク溶液（４３．３ｍＭ ＥＤＴＡ及び４３３．３μＭ Ｌ－ヒスチジン）を各試料に加えた。試料を穏やかによく混合し、およそ３７℃で約１時間インキュベートした。任意選択により、チューブを遠心分離することができた。インキュベートした各試料を、洗浄した３０Ｋ ＭＷＣＯ遠心フィルター（再生セルロース膜）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ）に移し、約１４，０００ｘｇで約３５分間、約２５℃で遠心分離した。約２００μＬのろ液を新しい清浄な無金属プラスチックチューブに移し、約６００μＬのＨ_２Ｏ中０．１％ＨＮＯ_３を無金属プラスチックチューブに加えた。上記の各無金属チューブに、約１０μＬの１００ｎｇ／ｍＬロジウム内部標準（「ロジウムＩＳスパイク」）を加えた。次に、各チューブをおよそ３５００ｒｐｍで約１分間遠心分離し、ボルテックスしてよく混合した。

【0083】

希釈剤中の較正標準及び希釈ＱＣ試料の調製
以下の表５及び６に記載されている質量分析（ＭＳ）用の希釈剤（０．１％ＨＮＯ_３）中の較正標準試料及びＱＣ試料は、当技術分野における従来の方法を使用して調製した。

【0084】

【表5】

【0085】

Ｃｕ標準ストック溶液：
・Ｃｕ標準ストック（１０００μｇ／ｍＬ）
・Ｃｕ標準ストック１（１０μｇ／ｍＬ）
・Ｃｕ標準ストック２（１μｇ／ｍＬ）
・Ｃｕ標準ストック３（１００ｎｇ／ｍＬ）

【0086】

Ｍｏ標準ストック溶液
・Ｍｏ標準ストック（１００１μｇ／ｍＬ）
・Ｍｏ標準ストック１（１００μｇ／ｍＬ）
・Ｍｏ標準ストック２（５μｇ／ｍＬ）
・Ｍｏ標準ストック３（１０００ｎｇ／ｍＬ）
・Ｍｏ標準ストック４（６０ｎｇ／ｍＬ）

【0087】

【表6】

【0088】

較正標準試料は、約１００μＬの各較正標準を約１２６５μＬの希釈剤に加え、よく混合することにより希釈した。希釈剤（０．１％ＨＮＯ_３）中のＱＣ試料は、希釈剤（０．１％ＨＮＯ_３）中の各ＱＣ試料約１００μＬを約１２６５μＬの希釈剤に加え、よく混合することにより、希釈した。次の各試料の約２００μＬを無金属プラスチックチューブに入れ、よくボルテックスした。ダブルブランク試料（２００μＬ ０．１％ＨＮＯ_３）、ブランク試料（２００μＬ ０．１％ＨＮＯ_３）、希釈剤（０．１％ＨＮＯ_３）で希釈した較正標準の各試料、及び希釈した各ＱＣ試料。Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＨＮＯ_３約６００μＬ（ダブルブランクの場合は６１０μＬ）を、各無金属プラスチックチューブに加えた。ダブルブランクを除く、無金属各チューブに、約１０μＬのロジウムＩＳスパイクを加えた。各チューブを約３５００ｒｐｍで約１分間遠心分離した。遠心分離後、各無金属チューブをボルテックスしてよく混合した。

【0089】

試料分析及び結果
試料は、Ａｕｔｏ Ｔｕｎｅを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ８９００を使用して、表７及び８に要約された条件及びパラメーターで動作するＩＣＰ－ＭＳ分析によって分析された。集中式ＭｉｃｒｏＭｉｓｔネブライザーを使用し、スプレーチャンバーの温度を約２℃に維持した。分析はＨｅモードで実施された。

【0090】

【表7】

【0091】

【表8】

【0092】

ＬＢＣバイオアッセイ手順は、各タイプの試料で６回繰り返された（ただし、較正標準試料では２回のみ）。試料の測定されたＬＢＣ濃度及びＭｏ濃度の値を以下の表９に示す。

【0093】

【表9-1】

【0094】

【表9-2】

【0095】

【表9-3】

【0096】

実施例４：ＮＣＣ及びＬＢＣ生物分析アッセイの検証
ＩＣＰ－ＭＳによるリチウムヘパリンヒト血漿中の非セルロプラスミン銅（ＮＣＣ）及びセルロプラスミン銅（ＣＰＣ）を測定するためのＮＣＣ生物分析アッセイの検証を実施した。ＩＣＰ－ＭＳによってリチウムヘパリンヒト血漿中の不安定結合銅（ＬＢＣ）を測定するためのＬＢＣ生物分析アッセイの検証も実施された。

【0097】

試料の調製
銅はヒト血液の内因性成分であり、通常のヒト血漿では総濃度がおよそ８００～およそ１２００ｎｇ／ｍＬの範囲であるため（非セルロプラスミン銅の場合は約２０～１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒト血漿中の較正標準は、銅の内因性レベルからの有意な干渉なしには調製できなかった。したがって、水中の０．１％硝酸（「希釈剤」）を使用して、較正標準を調製した。同じ理由で、ＱＣ試料も希釈剤で調製した。ただし、免疫捕捉プロセスを含むアッセイ法の正確性及び精度を確保するために、マトリックスＱＣ試料は、（確立された銅濃度の）血漿をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈することによって、又はＬＬＯＱ ＱＣ、低ＱＣ、中ＱＣ、及び高ＱＣ試料と同じＣｕレベルを有する試料を達成するために、平均内因性濃度レベルを考慮して、予めスクリーニングされたリチウムヘパリンヒト血漿に追加の銅をスパイクすることによって調製された。

【0098】

銅は、酵素的補助により、生きた対象のセルロプラスミンにのみ輸送することができる。したがって、ＣＰＣの検証試料の調製は困難であろう。ＣＰＣ試料については、マトリックス効果の評価のみが実施された。

【0099】

生体マトリックス：ブランクリチウムヘパリンヒト血漿、１００％溶血ブランクリチウムヘパリンヒト血漿、及びブランクリチウムヒト全血をＢＩＯＩＶＴから得た。

【0100】

ブランクのヒト血漿を調製し、方法検証中に使用した。プールされた血漿は、非セルロプラスミン銅の内因性濃度レベルを決定するために予めスクリーニングされた。マトリックスＱＣ試料を調製する際に、プールされた予めスクリーニングされた血漿中の平均内因性濃度が考慮された。

【0101】

溶血評価のために、プールした非溶血血漿で５０倍に希釈された１００％溶血リチウムヘパリンヒト血漿から２％溶血血漿を調製した。溶血評価のために中及び高ＱＣ試料を調製する際、予めスクリーニングされた２％溶血血漿中の平均内因性濃度が考慮された。血漿（プール及び個別ロット）は－２０℃±８℃で保存された。全血ロットは４℃±４℃で保存された。

【0102】

較正標準の濃度：較正標準は、表１０に記載されている銅濃度レベルで、希釈剤で調製した。さらに、較正標準には、希釈剤中の「ダブルブランク」（内部標準なし）試料及び希釈剤中の「ブランク」（内部標準あり）試料が含まれていた。

【0103】

【表10】

【0104】

ＱＣ試料の濃度：ＱＣ試料は、表１１に記載されている銅濃度レベルで調製された。ＬＬＯＱ ＱＣ、低ＱＣ、中１ ＱＣ、中２ ＱＣ、及び高ＱＣ試料は、希釈剤で調製した（総称して「希釈剤ＱＣ試料」）。マトリックスＬＬＯＱ ＱＣ、マトリックス低ＱＣ、マトリックス中ＱＣ、及びマトリックス高ＱＣ試料（総称して「マトリックスＱＣ試料」）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーで希釈された血漿中で、又は平均内因性濃度レベルを考慮して、予めスクリーニングされたリチウムヘパリンヒト血漿に銅をスパイクすることによって調製された。

【0105】

追加のマトリックス中ＱＣ及びマトリックス高ＱＣ試料（３００ｎｇ／ｍＬ及び７５０ｎｇ／ｍＬ）は、溶血効果の評価のために、予めスクリーニングされた２％溶血血漿で調製された。１００％溶血リチウムヘパリンヒト血漿（プールした非溶血血漿で５０倍に希釈されたブランクヒト血漿）から２％溶血血漿を調製した。追加のマトリックス中ＱＣ及びマトリックス高ＱＣ試料を調製する際、予めスクリーニングされた２％溶血血漿中の平均内因性濃度が考慮された。

【0106】

【表11】

【0107】

セルロプラスミンの免疫捕捉：ヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体は、実施例３のステップ４に記載された方法を使用して、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に固定化した。ただし、最後の再懸濁ステップでは、ブロッキングバッファーの代わりにＢＳＡバッファー（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）を使用した。各マトリックスＱＣ試料は、実施例３に記載の「ＣＰの免疫捕捉」方法に従ってＣＰの免疫捕捉に供された。ただし、ＬＢＣアッセイでは、約１．５時間のインキュベーション後、試料プレートをさらに約５００ｒｐｍで約１分間遠心分離した後、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍを使用してビーズを除去した。各マトリックスＱＣ試料のＮＣＣ上清を保持し、ＮＣＣアッセイにおいて、以下に説明するようにＮＣＣ定量化に供した。

【0108】

ＮＣＣアッセイでは、被覆されたビーズに固定化されたＣＰ及びＣＰＣが、ＣＰ定量化及びＣＰＣ定量化のために溶出された。溶出を実施するために、除去したビーズを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含む約３００μＬのＰＢＳ（「ブロッキングバッファー」）で２回洗浄した後、約３００μＬの水で洗浄した。ビーズ上のＣＰは、約２００μＬの３０ｍＭ ＨＣｌで約１０分間溶出した。

【0109】

約１０μＬのＧＡＹＰＬＳＩＥＰＩＧ［（^１３Ｃ_５、^１５Ｎ）Ｖａｌ］Ｒ内部標準スパイク（水中２μｇ／ｍＬ ＧＡＹＰペプチド）を、代わりに約１０μＬの水を加えたダブルブランク試料を除く各試料に加えた。得られた試料を約５００ｒｐｍで約１分間遠心分離し、低設定で約１分間ボルテックスした。約５０μＬの各試料を、さらなる評価のために新しいプレートの新しいウェルに移し、残りの溶液を以下に説明するようにＣＰＣ定量化のために約－７０℃で保存した。ＣＰＣの計算には、約１．２９の希釈係数を考慮することができた。

【0110】

ＬＢＣアッセイでは、免疫捕捉ステップから保持された各ＮＣＣ上清を、実施例３に記載の「キレート化－ろ過」方法に従ってキレート化及びろ過に供した。

【0111】

ＮＣＣ、ＣＰＣ、及びＬＢＣの定量化：ＮＣＣ、ＣＰＣ、及びＬＢＣの定量化は、内部標準（又は「ＩＳ」）としてロジウムを使用するＩＣＰ－ＭＳ法により実施された。定量化の準備として、較正標準及び希釈剤ＱＣ試料を、希釈剤で希釈した。約１００μＬの各較正標準を希釈剤に加え、よく混合して、希釈された較正標準試料を作製した（希釈はおよそ１３．５の希釈係数でスケールアップ又はスケールダウンできる）。同じ手順を各希釈剤ＱＣ試料で繰り返して、希釈した希釈剤ＱＣ試料を作製した。

【0112】

各試料（ダブルブランク、ブランク、希釈した較正標準、希釈した希釈剤ＱＣ試料、免疫捕捉ステップからのＮＣＣ上清試料、及び免疫捕捉ステップからの溶出ＣＰＣ溶液（ただし、１５５μＬは溶出ＣＰＣ溶液に使用））は、ピペットで無金属プラスチックチューブに入れ、よくボルテックスした。

【0113】

無金属プラスチックチューブのそれぞれに希釈剤を加えた。ダブルブランク試料を除いて、約１０μＬの１００ｎｇ／ｍＬロジウム内部標準（「ロジウムＩＳスパイク」）を各チューブに加えた。各チューブを約３５００ｒｐｍで約１分間遠心分離した。

【0114】

ＮＣＣ及びＣＰＣの定量化のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ７７００ｘ ＩＣＰ－ＭＳのオートチューン及びチューンチェックを、チューニング溶液（Ａｇｉｌｅｎｔ、２８－１ＧＳＸ２）を使用して実施した。ＬＢＣの定量化のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ８９００ｘ ＩＣＰ－ＭＳのオートチューン及びチューンチェックを、チューニング溶液（Ａｇｉｌｅｎｔ、３０－１８２ＧＳＸ２）を使用して実施した。集中式ＭｉｃｒｏＭｉｓｔネブライザーを使用し、スプレーチャンバーの温度を約２℃に維持した。分析はＨｅモードで実施された。

【0115】

データ評価
次の検証パラメーターを評価した：直線性、感度、試行内及び試行間の正確性及び精度、安定性、マトリックス効果（選択性）、溶血効果、バッチ容量、注入キャリーオーバー、並びにキレートの堅牢性。

【0116】

評価を実施するために、１秒あたりのカウント（ＣＰＳ）はＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（登録商標）データ取得／処理ソフトウェア４．２によって決定された。分析物の濃度は、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（バージョン７．３）を使用して、濃度に対するＣＰＳをプロットすることにより構成した較正曲線から得た。

【0117】

濃度は、次の式に従い、線形回帰を使用して計算された。
ｙ＝ａｘ＋ｂ
式中：
ｙ＝分析物／内部標準のＣＰＳ比
ａ＝対応する標準曲線の勾配
ｘ＝分析物の濃度（ｎｇ／ｍＬ）
ｂ＝対応する標準曲線の切片
１／ｘ^２が重み係数として使用される。

【0118】

正確性及び精度の計算には、次の式を使用した。
正確性：

【数3】

精度：

【数4】

精度及び正確性は、小数点第１位まで報告された。全ての濃度データは有効数字３桁まで報告された。

【0119】

方法の直線性は、銅の５．００～１０００ｎｇ／ｍＬの直線範囲で評価された。線形回帰（重み係数１／ｘ^２）を使用して、希釈剤中の銅の濃度－検出器反応関係に最もよく適合するものを作成した。全ての較正曲線は、決定係数（Ｒ^２）≧０．９８で予め定義された許容基準を満たしていた。

【0120】

感度：検証は、希釈剤中の銅につき標的ＬＬＯＱが５．００ｎｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ ＱＣ）、ヒト血漿中の銅につき測定バックグラウンド濃度が５．００ｎｇ／ｍＬ＋（マトリックスＬＬＯＱ ＱＣ）で実施された。感度を評価するために、ＬＬＯＱの濃度レベルで調製された６つのＱＣ試料（希釈剤ＬＬＯＱ ＱＣ試料及びマトリックスＬＬＯＱ ＱＣ試料のそれぞれについて）を、試行内の個々の正確性及び精度の一部として分析し、濃度を較正曲線で計算した。さらに、マトリックスＬＬＯＱ ＱＣ試料の名目濃度を計算するために、マトリックスＬＬＯＱ ＱＣ試料の調製に使用した希釈マトリックスも同一バッチ試行で分析し（ｎ＝６）、平均内因性濃度を決定した。結果は、方法が希釈剤の感度について予め定義された許容基準（±２０．０％以内の正確性、２０．０％以下の％ＣＶ）を満たし、ヒト血漿の感度について予め定義された許容基準（±２５．０％以内の正確性、２５．０％以下の％ＣＶ）を満たすことを示した。したがって、方法は、希釈剤又はヒト血漿のいずれかでＬＬＯＱ濃度の分析物を測定するのに十分な感度であった。

【0121】

試行内及び試行間の正確性及び精度は、異なる日の異なる試行で異なる濃度レベルのＱＣ試料を分析することによって検証された。６つの複製試料調製物を各濃度レベルで分析した。方法の試行内及び試行間の正確性及び精度は、次のＱＣ濃度レベルで検証された。
－希釈剤で調製された５つのＱＣ濃度レベル：５．００ｎｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ ＱＣ）、１５．０ｎｇ／ｍＬ（低ＱＣ）、２５０ｎｇ／ｍＬ（中ＱＣ）、１５０ｎｇ／ｍＬ（中１ＱＣ）、３００ｎｇ／ｍＬ（中２ＱＣ）、及び７５０ｎｇ／ｍＬ（高ＱＣ）。
－スクリーニングされたヒト血漿で調製された４つのＱＣ濃度レベル：５．００ｎｇ／ｍＬ＋平均測定バックグラウンド濃度（マトリックスＬＬＯＱ ＱＣ）、１５．０ｎｇ／ｍＬ＋平均測定バックグラウンド濃度（マトリックス低ＱＣ）、２５０～３００ｎｇ／ｍＬ（マトリックス中ＱＣ）、及び７５０ｎｇ／ｍＬ（マトリックス高ＱＣ）。

【0122】

結果は、方法の試行内及び試行間の正確性及び精度が、希釈剤中の予め定義された許容基準（％バイアスが±１５．０％以内（ＬＬＯＱの場合は±２０．０％以内）且つ％ＣＶが１５．０％以下（ＬＬＯＱの場合は２０．０％））及びヒト血漿中の予め定義された許容基準（％バイアスが±２０．０％以内（ＬＬＯＱの場合は±２５．０％以内）且つ％ＣＶが２０．０％以下（ＬＬＯＱの場合は２５．０％））を満たすことを示した。

【0123】

マトリックス効果（選択性）は、生体試料中のマトリックス成分の存在による分析物のイオン化の抑制又は増強として定義される。マトリックス効果は、ブランクヒト血漿の単一の複製を抽出し、抽出後の内因性濃度レベル（同一バッチ試行中に測定）に加えて各ロットを中ＱＣ濃度レベル（２５０ｎｇ／ｍＬ）及び／又は高ＱＣ濃度レベル（銅につき７５０ｎｇ／ｍＬ）でスパイクすることによってＣＰＣ、ＮＣＣ、及びＬＢＣについて評価された。マトリックス係数は、次の式に従って計算された。

【数5】

測定値の平均の精度（％ＣＶ）は２０．０％以下でなければならなかった。結果は、予め定義された許容基準を満たしていた。

【0124】

溶血効果：定量化の結果に対する溶血効果を評価するために、マトリックス中及びマトリックス高ＱＣ試料を予めスクリーニングした２％溶血血漿で調製した。溶血血漿中のマトリックス中及びマトリックス高ＱＣ試料の３つの複製を抽出し、分析した。結果は、予め定義された許容基準：平均濃度は名目濃度の±２０．０％以内、且つ％ＣＶは２０．０％以下、を満たしていた。

【0125】

ベンチトップ及び短期の安定性：ベンチトップ及び短期の安定性を評価するために、複数の濃度レベルのＱＣ試料を最初に－７０℃±１０℃でおよそ５～１１日間保存した。次に、冷凍ＱＣ試料の各レベルの３つのアリコートをベンチトップで、周囲室温で解凍し、冷凍ＱＣ試料の各レベルの別個の３つのアリコートを、４℃±４℃の冷蔵庫で１７．５～１９時間解凍した。各アリコートは、較正標準に対してアッセイされた。各レベルで得られた濃度の平均が名目濃度の±２０．０％以内、且つ％ＣＶが２０．０％以下である場合、非セルロプラスミン銅及び不安定結合銅は安定であると見なされた。

【0126】

結果は、ＮＣＣ ＱＣ試料が周囲室温及び４℃±４℃で１９時間安定であることを示した。結果はさらに、ＬＢＣ ＱＣ試料が周囲室温及び約４℃で１７．５時間安定であることを示した。

【0127】

ＱＣ凍結／解凍の安定性：４回の凍結／解凍サイクルを通じた安定性は、各濃度レベルで２つのＱＣレベル（予めスクリーニングされたヒト血漿で調製されたマトリックス中ＱＣ及びマトリックス高ＱＣ）で評価された。ＱＣ試料は－７０℃±１０℃で保存され、４回の凍結／解凍（周囲温度）サイクルに供され、濃度は較正標準に対して測定された。第１の凍結サイクルの試料は、周囲室温で６０分間解凍する前に、少なくとも２４時間冷凍庫に保管した。その後の凍結期間は、最初のサイクルと同じ条件下で解凍する前に、最低１２時間の期間であった。各レベルで得られた濃度の平均が名目濃度の±２０．０％以内、且つ％ＣＶが２０．０％以下である場合、ＱＣ試料は安定であると見なされた。サイクル４の結果は、ＱＣ試料が少なくとも４回の凍結／解凍サイクルで安定していることを示した。

【0128】

全血の安定性：氷水浴（濡れた氷）中及び周囲室温で、３つの時点（０、６０、及び１２０分）でのヒト全血（抗凝固剤としてのリチウムヘパリン）におけるＮＣＣの安定性を内因性レベルで評価した。血液試料を氷水浴中及び周囲室温で０、６０、及び１２０分間保存した後、約３５００ｒｐｍ、約４℃で、約１５分間遠心分離して血漿を分離した。次に、試料（ｎ＝保管条件ごと／時点ごとに３つの別個のチューブ）を、この実施例４に記載されているＮＣＣ生物分析アッセイ法に従ってアッセイした。氷水浴中で保存され、周囲室温で最大１２０分間保存された全血試料の平均ＣＰＳ比は、±２０．０％の許容基準内であった。したがって、ヒト全血中のＮＣＣは、氷水浴及び周囲室温で１２０分間安定であったと結論付けることができる。

【0129】

注入キャリーオーバー試験は、各分析実行で１つの試料から次の試料への目的分析物のキャリーオーバーの程度を評価するために使用される。各検証実行中に、較正器のセットからの高標準に従って、複製ダブルブランク試料（希釈剤で調製）を注入した。結果が許容されるためには、注入されたキャリーオーバー試料の分析物ＣＰＳが、ＮＣＣにつきＬＬＯＱ（標準１試料）の平均分析物ＣＰＳの２５％以下、且つＬＢＣにつきＬＬＯＱの平均分析物ＣＰＳの２０％以下でなければならない。同じキャリーオーバー試料の場合、ＩＳのＣＰＳは、ＮＣＣにつき平均ＩＳ ＣＰＳの１０％以下、且つＬＢＣＣにつき平均ＩＳ ＣＰＳの５％以下、且つ許容されるバッチ較正標準及びＱＣ試料からのものでなければならない。全ての評価は、予め定義された許容基準を満たしていた。

【0130】

バッチサイズのロバスト性：検証試行を使用して、試料分析試行のバッチサイズを模倣した。標準曲線及びブラケットＱＣ試料の両方を含む、合計１５０～１９９の試料がバッチで実行された。マトリックス低、中、高ＱＣ試料は、予めスクリーニングされたヒト血漿で調製され、最大バッチサイズを評価するために使用した。

【0131】

マトリックス低ＱＣ試料の名目濃度（このバッチ試行中にｎ＝６マトリックス低ＱＣ試料の注入サイクルごとに測定された）を計算するために、マトリックス低いＱＣ試料の調製に使用した希釈マトリックスも分析し（ｎ＝６）、平均内因性濃度を決定した。

【0132】

標準及びＱＣ試料は、試料分析実行の一般的なバッチ許容基準を満たしていた（全体的な正確性は、血漿又は希釈血漿で調製されたＱＣの名目値の２０％以内でなければならず；血漿又は希釈血漿で調製されたＱＣのＣＶは２０％以下でなければならず；ＱＣ試料の少なくとも５０％は、血漿又は希釈血漿で調製されたＱＣの各濃度レベルで名目濃度の２０％以内でなければならず、全てのＱＣ試料の１／３を超えて仕様外であってはならない）。

【0133】

選択性は、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｉｄ ＱＣレベル濃度（２５０ｎｇ／ｍＬ）を、ＬＢＣ内因性レベルの上に一重項を有する６つの個別ロットのヒト血漿中にスパイクすることによって評価された。スパイクされていない血漿試料６ロットは、一重項を有する同じバッチ試行で分析された。スパイクされたマトリックス中ＱＣのＬＢＣ回収率を計算する式は次の通りである。

【数6】

６つの個別の血漿ロットのうち少なくとも５つは、名目濃度の１００±２０％以内で回復すべきであった。全ての血漿ロットは許容基準を満たしていた。

【0134】

キレート堅牢度試験（Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ Ｔｅｓｔ）では、キレート化ステップ中のインキュベーション時間が長くなると、Ｍｏ－Ａｌｂ－Ｃｕ三分子複合体（「ＴＰＣ」）の安定性に影響を与え、その結果ＬＢＣ画分に銅が放出されるかを調べた。ＴＰＣでスパイクしたマトリックス中及びマトリックス高ＱＣ試料の６つの複製を評価した。試料調製中、次のステップの前に、試験した試料をキレート溶液に２時間保持した（現在、ＬＢＣ法では１時間のインキュベーション時間が使用されている）。抽出された試料は、新たに調製された較正標準に対して測定された。

【0135】

マトリックス中及びマトリックス高ＱＣ試料（ＴＰＣスパイクなし）の６つの複製を同一バッチ試行で分析し、銅の回収率に対するより長いキレート化ステップ（少なくとも２時間、ただし同じ濃度のＥＤＴＡを使用）の影響を評価した。結果は、キレート化ステップの少なくとも２時間のインキュベーション時間は、ＴＰＣの安定性に影響を与えないことを示す。

【0136】

方法検証から得られた結果は、適切な試行内及び試行間の正確性及び精度、感度、直線性、ベンチトップ安定性、短期安定性（４℃±４℃）、マトリックス効果、最大バッチサイズ評価、凍結／解凍安定性、キャリーオーバー評価、全血安定性、及びＩＳでの分析物干渉を示した。直接ＮＣＣ及びＣＰＣ定量化は、リチウムヘパリンヒト血漿中の非セルロプラスミン銅及びセルロプラスミン銅の測定に適していると判断された。ＬＢＣバイオアッセイ法は、リチウムヘパリンヒト血漿中の不安定結合銅の測定にも適していると判断された。

【0137】

実施例５：２４人の健常ボランティアからの血漿試料中の非セルロプラスミン銅（ＮＣＣ）の直接測定
血漿試料は、２４人の成人健常ボランティアの第１相臨床試験から得られた。試料は、実施例４に概説されているＮＣＣバイオアッセイプロセスに従ってアッセイされた。２４人の成人健常ボランティアのＮＣＣ濃度の結果を以下の表１２に示す。

【0138】

【表12】

【0139】

実施例６：健常Ｃｕ血漿レベルの完全検証
罹患していない健常な個人は、前の実施例の１つ以上に従って採血及び検査を受ける。結果として得られるＣｕレベルは、民族、年齢、性別、併存疾患、及びその他の要因に従って評価及び細分化される。参照レベルは、各亜集団の標準偏差を使用して決定される。サブグループごとに最低１２０人の個人が評価される。

【0140】

実施例７：ウィルソン病診断用キット
フレボトミストは、銅を含まない無菌の採血遠心分離チューブ（つまり、標準的なバキュテナー）及び静脈穿刺を提供し、個人から血液の試料を採取する。試料を遠心沈殿して血漿を分離し、無細胞プラズマを、Ｃｕ測定キットを供給している試験研究所に提供する。キットの構成要素には、標準濃度の抗セルロプラスミン抗体被覆磁気ビーズ、ＥＤＴＡ標準濃度溶液、及び使用説明書が含まれる。特定の有効参照範囲は、目的の特定のサブグループについて提供される。

【0141】

実施例８：ウィルソン病の処置
銅代謝に関連すると思われる症状を呈している患者は、前の実施例の１つ以上に従って血液試料を採取され、分析される。
ウィルソン病の患者は、ＢＣ－ＴＴＭ、トリエンチン塩酸塩、トリエンチン四塩酸塩、亜鉛（又はその塩）、及び／又はペニシラミンの少なくとも１つから選択される少なくとも１つの治療剤で処置され、処置中、経時的に（毎週、隔週、毎月など）、前述の実施例の１つ以上に従って血液検査を実施し、その投与量は、治療剤の治療レベル及び満足なＣｕ／ＮＣＣ／ＬＢＣレベルを維持するために調節される。

【0142】

本開示の様々な態様は、以下の特許請求の範囲に記載される非限定的な実施形態によってさらに例示される。それぞれの場合において、複数の請求項の特徴は、明細書と矛盾せず、論理的に矛盾しない方法で組み合わせることができる。

【0143】

本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみを目的としており、その観点からの様々な修正又は変更は、当技術分野の当業者に提案され、本出願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に組み込まれるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
生体試料中の不安定結合銅濃度を測定する方法であって、
前記生体試料をセルロプラスミンに結合して免疫捕捉されたセルロプラスミンを形成する免疫捕捉試薬と接触させること；
前記免疫捕捉されたセルロプラスミンを取り出して、非セルロプラスミン試料を得ること；
前記非セルロプラスミン試料を、不安定結合銅に結合するキレート剤と接触させること；非不安定結合銅を取り出して、不安定結合銅試料を得ること；及び
前記不安定結合銅試料中の銅濃度を測定すること
を含む、方法。
（項目２）
前記試料が、ヒト血漿又はヒト血清を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記免疫捕捉試薬が、免疫沈降試薬を含む、項目２又は３に記載の方法。
（項目４）
前記免疫捕捉試薬が、セルロプラスミン捕捉試薬を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、ペプチド、及びそれらの抗原結合フラグメントから選択される少なくとも１つの試薬を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル又はポリクローナルヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体の少なくとも１つを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記免疫捕捉試薬が、抗セルロプラスミン固定化固体支持体を含む、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記免疫沈降試薬が、セルロプラスミンと複合体を形成した後、固体支持体上に固定化するように構成された遊離の抗セルロプラスミン試薬を含む、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記固体支持体が、磁性ビーズを含む、項目７又は８に記載の方法。
（項目１０）
前記固体支持体が、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの固体支持体を含む、項目７又は８に記載の方法。
（項目１１）
前記不安定結合銅試料中の銅濃度の測定が、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）の使用を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記銅濃度を測定する前に、前記不安定結合銅試料に内部標準を導入することをさらに含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記内部標準が、銅及びロジウムのうちの少なくとも１つを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記免疫捕捉されたセルロプラスミンの取り出しが、免疫捕捉されたセルロプラスミン試料を得ることをさらに含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記免疫捕捉されたセルロプラスミン試料中のセルロプラスミン濃度を測定することをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記セルロプラスミン濃度を測定することが、質量分析法の使用を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記質量分析が、少なくとも約５μｇ／ｍＬの分析物検出限界を有する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記セルロプラスミン濃度を測定することが、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の使用を含む、項目１６又は１７に記載の方法。
（項目１９）
前記生体試料中の前記セルロプラスミン濃度が、約２００μｇ／ｍＬ未満である、項目１５～１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記免疫捕捉されたセルロプラスミン試料中の銅濃度を測定することをさらに含む、項目１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記免疫捕捉されたセルロプラスミン試料中の銅濃度の測定が、誘導結合プラズマ質量分析の使用を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記キレート剤が、ペニシラミン、トリエンチン塩酸塩、トリエンチン四塩酸塩、及びＥＤＴＡのうち少なくとも１つを含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記キレート剤が、ＥＤＴＡを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記非不安定結合銅の取り出しが、非不安定結合銅試料を得ることをさらに含む、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記非不安定結合銅試料中の銅濃度を測定することをさらに含む、項目２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記非不安定結合銅試料が、モリブデンを含む、項目２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記非不安定結合銅試料中のモリブデン濃度を測定することをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
生体試料中の銅濃度を測定するためのキットであって、免疫捕捉試薬、及び使用説明書を含む、キット。
（項目２９）
前記免疫捕捉試薬が、免疫沈降試薬を含む、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
前記免疫捕捉試薬が、セルロプラスミン捕捉試薬を含む、項目２８～２９のいずれか一項に記載のキット。
（項目３１）
前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、ペプチド、及びそれらの抗原結合フラグメントから選択される少なくとも１つの試薬を含む、項目３０に記載のキット。
（項目３２）
前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル又はポリクローナルヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体の少なくとも１つを含む、項目３０に記載のキット。
（項目３３）
前記免疫捕捉試薬が、抗セルロプラスミン固定化固体支持体を含む、項目３０に記載のキット。
（項目３４）
前記免疫沈降試薬が、セルロプラスミンと複合体を形成した後、固体支持体上に固定化するように構成された遊離の抗セルロプラスミン試薬を含む、項目３０に記載のキット。
（項目３５）
前記固体支持体が、磁性ビーズを含む、項目３３又は３４に記載のキット。
（項目３６）
前記固体支持体が、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの固体支持体を含む、項目３３又は３４に記載のキット。
（項目３７）
生体試料中の銅濃度を測定するためのキットであって、免疫捕捉試薬、キレート剤、及び使用説明書を含む、キット。
（項目３８）
前記免疫捕捉試薬が、免疫沈降試薬を含む、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
前記免疫捕捉試薬が、セルロプラスミン捕捉試薬を含む、項目３７～３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目４０）
前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、ペプチド、及びそれらの抗原結合フラグメントから選択される少なくとも１つの試薬を含む、項目３９に記載のキット。
（項目４１）
前記セルロプラスミン捕捉試薬が、モノクローナル又はポリクローナルヤギ抗ヒトセルロプラスミン抗体の少なくとも１つを含む、項目３９に記載のキット。
（項目４２）
前記免疫捕捉試薬が、抗セルロプラスミン固定化固体支持体を含む、項目３９に記載のキット。
（項目４３）
前記免疫沈降試薬が、セルロプラスミンと複合体を形成した後、固体支持体上に固定化するように構成された遊離の抗セルロプラスミン試薬を含む、項目３９に記載のキット。
（項目４４）
前記固体支持体が、磁性ビーズを含む、項目４２又は４３に記載のキット。
（項目４５）
前記固体支持体が、アガロース樹脂、クロマトグラフィープレート、ストレプトアビジンプレート、及びタイタープレートの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの固体支持体を含む、項目４２又は４３に記載のキット。
（項目４６）
前記キレート剤が、ペニシラミン、トリエンチン塩酸塩、トリエンチン四塩酸塩、及びＥＤＴＡのうち少なくとも１つを含む、項目３７～４５のいずれか一項に記載のキット。
（項目４７）
前記キレート剤が、ＥＤＴＡを含む、項目３７～４５のいずれか一項に記載のキット。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5】