特許 7641033 ヒト組織幹細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-26

(45)【発行日】2025-03-06

(54)【発明の名称】ヒト組織幹細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/095 20100101AFI20250227BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20250227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250227BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250227BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20250227BHJP

【ＦＩ】

C12N5/095

C12Q1/02

C12N5/10

C12N15/09 100

C12Q1/6897 Z

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2023108239

(22)【出願日】2023-06-30

(62)【分割の表示】P 2019509868の分割

【原出願日】2018-03-27

(65)【公開番号】P2023126873

(43)【公開日】2023-09-12

【審査請求日】2023-06-30

(31)【優先権主張番号】P 2017063171

(32)【優先日】2017-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、次世代がん医療創生研究事業、「がん多階層フェノタイプの理解に基づいた先端的創薬システムの開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】598121341

【氏名又は名称】慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 俊朗

(72)【発明者】

【氏名】下川 真理子

【審査官】吉岡 沙織

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０４５９３５１２（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１７３６０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００９／１４２２７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２７５２８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】下川真理子 他，ヒト大腸がんオルガノイドを用いたがん幹細胞の可視化と遺伝学的細胞系譜解析，再生医療 増刊号，2015年，Vol. 14 Suppl，p. 278, O-62-5

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）－目的遺伝子を含む遺伝子構築物が導入されたヒト組織幹細胞であって、
前記幹細胞マーカー遺伝子がＬｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５（ＬＧＲ５）遺伝子であり、
ＬＧＲ５遺伝子座の第１８エクソンに前記遺伝子構築物が安定的に導入され、自己複製能と分化能を有する、ヒト組織幹細胞。

【請求項2】

前記目的遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１に記載のヒト組織幹細胞。

【請求項3】

前記目的遺伝子が第１のレポーター遺伝子であり、強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が更に導入された、請求項１又は２に記載のヒト組織幹細胞。

【請求項4】

前記第２のレポーター遺伝子が細胞系譜マーカーをコードする遺伝子である、請求項３に記載のヒト組織幹細胞。

【請求項5】

癌組織由来の幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト組織幹細胞。

【請求項6】

目的遺伝子が安定的に導入されたヒト組織幹細胞の製造方法であって、
培養オルガノイド中のヒト組織幹細胞のＬＧＲ５遺伝子座の第１８エクソンに、ＩＲＥＳ－目的遺伝子を含む遺伝子構築物をゲノム編集により導入する工程であって、前記遺伝子構築物は、前記ＩＲＥＳ－目的遺伝子の下流に、ＬｏｘＰで挟まれた、別のプロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子が組み込まれた遺伝子カセットを更に含んでいる、培養オルガノイドに前記遺伝子構築物を導入する工程（１）と、
薬剤耐性オルガノイドクローンを選択する工程（２）と、
ＬｏｘＰで挟まれた、別のプロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子が組み込まれた前記遺伝子カセットを除去する工程（３）と、を含み、
その結果、目的遺伝子が安定的に導入されたヒト組織幹細胞が得られる、製造方法。

【請求項7】

前記工程（１）がエレクトロポレーションにより行われ、前記工程（１）の後に前記培養オルガノイドを３０℃で２日間培養する工程を更に備える、請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

前記目的遺伝子が、細胞系譜標識誘導タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項６又は７に記載の製造方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法で作製されたヒト組織幹細胞が幹細胞であるか否かを試験する方法であって、前記ヒト組織幹細胞の細胞系譜解析により１個の細胞に由来する細胞を追跡して解析し、前記ヒト組織幹細胞の自己複製及び分化を検出する工程を備え、前記ヒト組織幹細胞の自己複製及び分化の双方が検出されることが、前記ヒト組織幹細胞が幹細胞であることを示す、方法。

【請求項10】

前記ヒト組織幹細胞が癌組織由来の幹細胞である、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ヒト癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、ヒト癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動するレポーター遺伝子が導入されたヒト癌幹細胞を培養する工程であって、前記ヒト癌幹細胞が、幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に、ＩＲＥＳ－レポーター遺伝子を含む遺伝子構築物が導入されたヒト癌幹細胞である工程と、
前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記レポーター遺伝子の発現量の低下が、前記被験物質がヒト癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示す、方法。

【請求項12】

ヒト癌幹細胞及びヒト癌細胞に対する抗癌剤の有効性を試験する方法であって、
前記抗癌剤の存在下で、ヒト癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動する第１のレポーター遺伝子及び強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が導入されたヒト癌幹細胞を培養する工程と、
前記第１及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程であって、前記第１のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤がヒト癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示し、前記第２のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤がヒト癌幹細胞及びヒト癌細胞に有効な抗癌剤であることを示す、工程と、を備え、
前記第１のレポーター遺伝子は、前記ヒト癌幹細胞の癌幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に、ＩＲＥＳ－第１のレポーター遺伝子を含む遺伝子構築物として導入されている方法。

【請求項13】

前記目的遺伝子がレポーター遺伝子及び薬剤誘導型自殺遺伝子を含み、前記ヒト組織幹細胞が癌組織由来である、請求項１に記載のヒト組織幹細胞。

【請求項14】

前記レポーター遺伝子が第１のレポーター遺伝子であり、強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が更に導入された、請求項１３に記載のヒト組織幹細胞。

【請求項15】

ヒト癌幹細胞及びヒト癌細胞に対する抗癌剤の有効性を検証する方法であって、
前記抗癌剤の存在下で、請求項１４に記載のヒト組織幹細胞を培養する工程と、
前記第１及び前記第２のレポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、前記第１のレポーター遺伝子の発現のみが検出された場合には、前記抗癌剤が癌細胞にのみ有効な抗癌剤であることを示し、前記第２のレポーターの発現のみが検出された場合には、前記抗癌剤が癌幹細胞にのみ有効な抗癌剤であることを示し、前記第１のレポーター遺伝子の発現も前記第２のレポーター遺伝子の発現も検出されない場合には、前記抗癌剤がヒト癌幹細胞及びヒト癌細胞に有効な抗癌剤であることを示す工程と、を備える、方法。

【請求項16】

ヒト癌幹細胞及び／又はヒト癌細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、請求項１４に記載のヒト組織幹細胞を培養する工程と、
前記第１及び前記第２のレポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、前記第１のレポーター遺伝子の発現のみが検出された場合には、前記抗癌剤が癌細胞にのみ有効な抗癌剤であることを示し、前記第２のレポーターの発現のみが検出された場合には、前記抗癌剤が癌幹細胞にのみ有効な抗癌剤であることを示し、前記第１のレポーター遺伝子の発現も前記第２のレポーター遺伝子の発現も検出されない場合には、前記抗癌剤がヒト癌幹細胞及びヒト癌細胞に有効な抗癌剤であることを示す工程と、を備える、スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト組織幹細胞及びその使用に関する。より具体的には、ヒト組織幹細胞、ヒト組織幹細胞の幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に目的遺伝子を導入する方法、ヒト組織幹細胞が幹細胞であるか否かを試験する方法、癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法、並びに癌幹細胞及び癌細胞に対する抗癌剤の有効性を試験する方法に関する。本願は、２０１７年３月２８日に、日本に出願された特願２０１７－０６３１７１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

癌幹細胞理論は、腫瘍の成長を支持し自己複製する、癌細胞の亜集団に着目したものである（例えば非特許文献１を参照。）。癌幹細胞理論によれば、腫瘍組織中に少数の癌幹細胞が発癌初期から存在し、癌幹細胞が自己複製及び分化を繰り返すことにより腫瘍組織が形成されると考えられている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】Kreso A. and Dick J. E., Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell, 4 (14), 275-291, 2014.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、癌幹細胞等の幹細胞に、遺伝子座特異的な遺伝子操作を行う技術は確立されていない。このため、特にヒトの組織幹細胞を細胞系譜的に解析し、１個の細胞が自己複製能と分化能を有していることを確認することは困難であった。そこで、本発明は、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行う技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は以下の態様を含む。
［１］幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に目的遺伝子が導入されたヒト組織幹細胞。
［２］前記幹細胞マーカー遺伝子がＬｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５（ＬＧＲ５）遺伝子である、［１］に記載のヒト組織幹細胞。
［３］Ｌｇｒ５遺伝子座の第１８エクソンに目的遺伝子が導入された、［２］に記載のヒト組織幹細胞。
［４］前記目的遺伝子がレポーター遺伝子である、［１］又は［２］に記載のヒト組織幹細胞。
［５］前記目的遺伝子が第１のレポーター遺伝子であり、強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が更に導入された、［１］～［４］のいずれかに記載のヒト組織幹細胞。
［６］癌組織由来の幹細胞である、［１］～［５］のいずれかに記載のヒト組織幹細胞。
［７］ヒト組織幹細胞の幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に目的遺伝子を導入する方法であって、ヒト組織幹細胞を含む培養オルガノイドの前記幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に前記目的遺伝子をゲノム編集により導入する工程を備える方法。
［８］前記目的遺伝子を導入する前記工程がエレクトロポレーションにより行われ、前記目的遺伝子を導入した後に前記培養オルガノイドを３０℃で２日間培養する工程を更に備える、［７］に記載の方法。
［９］前記幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座がＬｇｒ５遺伝子座である、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］Ｌｇｒ５遺伝子座の第１８エクソンに前記目的遺伝子を導入する、［９］に記載の方法。
［１１］前記目的遺伝子が、細胞系譜標識誘導タンパク質をコードする遺伝子である、［７］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］［１１］に記載の方法で作製されたヒト組織幹細胞が幹細胞であるか否かを試験する方法であって、前記ヒト組織幹細胞の細胞系譜解析により前記ヒト組織幹細胞の自己複製及び分化を検出する工程を備え、前記ヒト組織幹細胞の自己複製及び分化の双方が検出されることが、前記ヒト組織幹細胞が幹細胞であることを示す、方法。
［１３］前記ヒト組織幹細胞が癌組織由来の幹細胞である、［７］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動するレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞を培養する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記レポーター遺伝子の発現量の低下が、前記被験物質が癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示す、方法。
［１５］癌幹細胞及び癌細胞に対する抗癌剤の有効性を試験する方法であって、前記抗癌剤の存在下で、癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動する第１のレポーター遺伝子及び強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞を培養する工程と、前記第１及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記第１のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤が癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示し、前記第２のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤が癌幹細胞及び癌細胞に有効な抗癌剤であることを示す、方法。

【0006】

本発明は以下の態様を含むということもできる。
［Ｐ１］目的遺伝子座に目的遺伝子が導入された組織幹細胞。
［Ｐ２］前記目的遺伝子座が幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座である、［Ｐ１］に記載の組織幹細胞。
［Ｐ３］前記幹細胞マーカー遺伝子がＬｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５（ＬＧＲ５）遺伝子である、［Ｐ２］に記載の組織幹細胞。
［Ｐ４］前記目的遺伝子がレポーター遺伝子である、［Ｐ３］に記載の組織幹細胞。
［Ｐ５］前記目的遺伝子が第１のレポーター遺伝子であり、強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が更に導入された、［Ｐ１］～［Ｐ４］のいずれかに記載の組織幹細胞。
［Ｐ６］癌組織由来の幹細胞である、［Ｐ１］～［Ｐ５］のいずれかに記載の組織幹細胞。
［Ｐ７］組織幹細胞の目的遺伝子座に目的遺伝子を導入する方法であって、組織幹細胞を含む培養オルガノイドの前記目的遺伝子座に前記目的遺伝子を導入する工程を備える方法。
［Ｐ８］前記目的遺伝子を導入する前記工程がエレクトロポレーションにより行われ、前記目的遺伝子を導入した後に前記培養オルガノイドを３０℃で２日間培養する工程を更に備える、［Ｐ７］に記載の方法。
［Ｐ９］前記目的遺伝子座が幹細胞マーカーの遺伝子座である、［７］又は［８］に記載の方法。
［Ｐ１０］前記目的遺伝子が、細胞系譜標識誘導タンパク質をコードする遺伝子である、［Ｐ９］に記載の方法。
［Ｐ１１］［Ｐ１０］に記載の方法で作製された組織幹細胞が幹細胞であるか否かを試験する方法であって、前記組織幹細胞の細胞系譜解析により前記組織幹細胞の自己複製及び分化を検出する工程を備え、前記組織幹細胞の自己複製及び分化の双方が検出されることが、組織幹細胞が幹細胞であることを示す、方法。
［Ｐ１２］前記組織幹細胞が癌組織由来の幹細胞である、［Ｐ７］～［Ｐ１１］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ１３］癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動するレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞を培養する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記レポーター遺伝子の発現量の低下が、前記被験物質が癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示す、方法。
［Ｐ１４］癌幹細胞及び癌細胞に対する抗癌剤の有効性を試験する方法であって、前記抗癌剤の存在下で、癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動する第１のレポーター遺伝子及び強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞を培養する工程と、前記第１及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記第１のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤が癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示し、前記第２のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤が癌幹細胞及び癌細胞に有効な抗癌剤であることを示す、方法。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行う技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】（ａ）は、ヒトＬＧＲ５遺伝子座の模式図である。（ｂ）は、実験例１で作製したターゲッティングコンストラクトの構造を示す模式図である。（ｃ）は、実験例１で作製したオルガノイドのＬＧＲ５遺伝子座の構造を示す模式図である。

【図2】（ａ）～（ｃ）は、実験例２でマウスに移植したオルガノイドに由来する腫瘍組織の組織切片の蛍光顕微鏡写真である。（ｄ）～（ｆ）は、実験例２において、オルガノイドクローンを樹立するもととなった患者由来の大腸癌組織の切片を観察した蛍光顕微鏡写真である。

【図3】（ａ）～（ｃ）は、細胞系譜マーカーによる標識を説明する図である。

【図4】実験例４で作製したオルガノイドのＬＧＲ５遺伝子座の構造及び薬剤誘導型自殺遺伝子の挙動を説明する図である。

【図5】（ａ）は、実験例４において、対照マウスの腫瘍組織切片を観察した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例４において、ＡＰ２０１８７を投与したマウスの腫瘍組織切片を観察した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図6】実験例４において、ＡＰ２０１８７を投与したマウス（Ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）及び対照マウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）の腫瘍サイズを経時的に測定した結果を示すグラフである。

【図7】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５において、オルガノイドに由来する腫瘍組織のサイズを経時的に測定した結果を示すグラフである。

【図8】実験例６の代表的な結果を示すオルガノイドの顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

［組織幹細胞］
１実施形態において、本発明は、目的遺伝子座に目的遺伝子が導入された組織幹細胞を提供する。

【0010】

本実施形態において、組織幹細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよい。幹細胞は自己複製能と分化能を有する細胞である。組織幹細胞は、体性幹細胞とも呼ばれる、組織中に存在する幹細胞であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）とは異なる。本明細書において、組織幹細胞は、癌幹細胞を含む。また、本実施形態の組織幹細胞は、細胞の可塑性により、幹細胞に脱分化することができる細胞を含むものとする。

【0011】

従来、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うことは困難であった。これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、組織幹細胞を含む培養オルガノイドに遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うことにより、目的遺伝子座に目的遺伝子が導入された組織幹細胞を作製することができることを明らかにした。

【0012】

本実施形態の組織幹細胞において、目的遺伝子座は着目する任意の遺伝子座であってよく、例えば、幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座であってもよい。より詳細には、本実施形態の組織幹細胞は癌幹細胞であり、目的遺伝子座は癌幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座であってもよい。癌幹細胞マーカー遺伝子としては、例えば、ＬＧＲ５、ＳＰＡＲＣ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ ２（ＳＭＯＣ２）、Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ Ｂ（ＲＧＭＢ）、ＡＸＩＮ２、Ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ ４（ＯＬＦＭ４）、Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ７（ＣＤＣＡ７）、Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １（ＬＲＩＧ１）、Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４３（ＲＮＦ４３）、Ａｃｈａｅｔｅ－Ｓｃｕｔｅ Ｆａｍｉｌｙ ＢＨＬＨ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ２（ＡＳＣＬ２）等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0013】

また、癌幹細胞が由来する癌は特に限定されず、例えば、大腸癌、胃癌、膵臓癌の癌幹細胞であってもよい。発明者らは、これらの癌幹細胞において、ＬＧＲ５遺伝子を癌幹細胞マーカーとして用いることができることを確認している。

【0014】

発明者らはまた、正常細胞由来の培養オルガノイドに遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うことにより、正常細胞の組織幹細胞の目的遺伝子座に目的遺伝子を導入することができることを明らかにしている。

【0015】

ここで、正常細胞由来の培養オルガノイドであるか、癌細胞由来の培養オルガノイドであるかは、オルガノイドの培養に必要な増殖因子の要求性、シークエンシングによる遺伝子変異確認、染色体異常の確認等により判断することができる。

【0016】

また、本実施形態の幹細胞において、目的遺伝子は、任意の遺伝子であってよい。例えば目的遺伝子はレポーター遺伝子であってもよい。また、レポーター遺伝子は、目的遺伝子座に位置する遺伝子の第１エクソン以外の領域に導入されていてもよい。例えば、レポーター遺伝子がＬＧＲ５遺伝子の第１８エクソンに導入されていてもよい。ここで、レポーター遺伝子としては特に限定されず、例えば、各種の蛍光タンパク質、酵素等が挙げられる。

【0017】

ゲノム編集等による遺伝子座特異的な遺伝子操作においては、対象遺伝子の第１エクソンに目的遺伝子を導入する場合が多い。発明者らは、まず、大腸癌幹細胞のＬＧＲ５遺伝子の第１エクソンにレポーター遺伝子を導入することを試みた。しかしながら、この遺伝子導入はなかなかうまくいかなかった。これに対し、実施例において後述するように、ＬＧ５遺伝子の第１８エクソンにレポーター遺伝子を導入したところ、所望の遺伝子導入を効率よく行うことができた。

【0018】

目的遺伝子座に導入する目的遺伝子は、プロモーター配列を有していなくてもよい。すなわち、目的遺伝子は、目的遺伝子座のプロモーターにより発現するように構成されていてもよい。

【0019】

例えば、目的遺伝子の５’側にＩｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）、Ｔ２Ａ若しくはＰ２Ａ等のｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｋｉｐ ｓｉｔｅ等を連結することにより、目的遺伝子を目的遺伝子座のプロモーターで発現させることができる。

【0020】

本実施形態の組織幹細胞は、癌幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座に導入され、当該マーカー遺伝子のプロモーターで作動する第１のレポーター遺伝子に加えて、強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞であってもよい。ここで、第２のレポーター遺伝子は遺伝子座特異的に導入されていなくてもよい。また、強制発現用プロモーターとしては、動物細胞における遺伝子の強制発現に通常利用されているプロモーターを用いることができ、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0021】

ここで、第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子は、互いに識別可能なものであることが好ましい。例えば、第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子は、互いに波長が異なる蛍光を発する蛍光タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

【0022】

ここで、第１のレポーター遺伝子は、癌幹細胞マーカー遺伝子が発現しているとき、すなわち、細胞が癌幹細胞性を維持している時に発現する。一方、第２のレポーター遺伝子は、癌幹細胞マーカー遺伝子の発現に関わらず、すなわち、癌幹細胞が癌幹細胞性を維持している場合においても癌幹細胞性を喪失した場合においても発現する。このため、第１のレポーター遺伝子の発現は癌幹細胞の存在を示し、第２のレポーター遺伝子の発現は癌幹細胞の存在又は癌細胞の存在の双方を示す。ここで、癌細胞は、癌幹細胞マーカー遺伝子を発現していない癌細胞を意味する。

【0023】

実施例において後述するように、このような癌幹細胞を被験物質の存在下で培養し、第１のレポーター及び第２のレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定することにより、癌幹細胞及び癌細胞に与える影響を区別して評価することができる。このため、このような癌幹細胞は、癌幹細胞に有効な抗癌剤等のスクリーニングに用いることができる。

【0024】

［組織幹細胞の目的遺伝子座に目的遺伝子を導入する方法］
１実施形態において、本発明は、組織幹細胞の目的遺伝子座に目的遺伝子を導入する方法であって、組織幹細胞を含む培養オルガノイドの前記目的遺伝子座に前記目的遺伝子を導入する工程を備える方法を提供する。本実施形態の方法は、培養オルガノイドを構成する細胞の目的遺伝子座に目的遺伝子を導入する工程を備える方法であるということができる。

【0025】

本実施形態の方法において、幹細胞としては、上述したものと同様であり、癌幹細胞、体性幹細胞等が挙げられる。

【0026】

従来、癌幹細胞や組織幹細胞等の幹細胞に遺伝子操作を行うことは困難であった。特に、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うことは困難であった。これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、組織幹細胞を含む培養オルガノイドの遺伝子を改変することにより、目的遺伝子が導入された培養オルガノイドを作製することができることを明らかにした。

【0027】

また、実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うこともできる。これにより、目的遺伝子座に目的遺伝子が導入された組織幹細胞を作製することができる。

【0028】

本明細書において、オルガノイドとは、細胞を３次元培養することにより得られる臓器様組織を意味する。また、本明細書では、細胞塊もオルガノイドに含めるものとする。３次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。

【0029】

本実施形態の方法において、培養オルガノイドとしては、組織幹細胞を含むオルガノイドであれば特に限定されず、例えば、上皮細胞のオルガノイド、上皮腫瘍細胞のオルガノイド等が挙げられる。また、上皮細胞としては、胃・小腸・大腸・胆管・膵管上皮等の消化器上皮細胞、乳腺、前立腺等の消化器以外の組織の上皮細胞等が挙げられる。

【0030】

オルガノイドの培養方法としては、公知の培養方法を使用することができる。特に、癌組織由来の幹細胞の培養方法においては、癌組織によって個別に最適化された培養方法を選択することができる（例えば、Fujii M., et al., Nature Protocols, Vol.10, 1474-1485, 2015; Mihara E., et al., eLIFE, Vol.5, E11621, 2016; Fujii M., et al., Cell Stem Cell, Vol.18, 827-838, 2016等を参照。）。

【0031】

本実施形態の方法において、培養オルガノイドに目的遺伝子を導入する工程は、公知の遺伝子導入方法を使用することができる。特に、実施例で示すように、エレクトロポレーションにより行うことが好ましい。更に、エレクトロポレーション後に培養オルガノイドを３０℃で２日間培養する工程を備えることが好ましい。発明者らは、上記の工程を備えることにより、オルガノイドへの遺伝子導入効率を格段に向上させることができることを明らかにした。

【0032】

［組織幹細胞が幹細胞であるか否かを試験する方法］
１実施形態において、本発明は、対象遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜マーカーで標識された組織幹細胞が幹細胞であるか否かを試験する方法であって、前記組織幹細胞の細胞系譜解析により前記組織幹細胞の自己複製及び分化を検出する工程を備え、前記組織幹細胞の自己複製及び分化の双方が検出されることが、組織幹細胞が幹細胞であることを示す方法を提供する。細胞系譜マーカーについては後述する。

【0033】

本実施形態の方法は、組織幹細胞であると考えられる細胞が、幹細胞であることを証明する方法であるということもできる。また、本実施形態の方法は、対象遺伝子が幹細胞マーカーであるか否かを試験する方法であるということもできる。すなわち、本実施形態の方法は、対象遺伝子が幹細胞マーカーであるか否かを試験する方法であって、前記対象遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜マーカーで標識された細胞を培養する工程と、前記細胞の細胞系譜解析により前記細胞の自己複製及び分化を検出する工程と、を備え、前記細胞の自己複製及び分化の双方が検出されることが、前記対象遺伝子が幹細胞マーカーであることを示す方法であるということもできる。

【0034】

幹細胞は、自己複製能及び分化能を有する細胞である。このため、対象細胞が幹細胞であることを証明するためには、１個の対象細胞が自己複製及び分化の双方を行うことを示す必要がある。あるいは、対象遺伝子が幹細胞マーカーであることを証明するためには、対象遺伝子を発現する１個の細胞が自己複製及び分化の双方を行うことを示す必要がある。

【0035】

１個の細胞が自己複製及び分化の双方を行うことを示すためには、１個の細胞に由来する細胞を追跡して観察する細胞系譜解析により、１個の細胞に由来する細胞が自己複製及び分化の双方を行うことを示す必要がある。細胞系譜解析とは、対象の１個の細胞が、細胞分裂を繰り返しても、分化して性質が変化しても、対象の１個の細胞の子孫にあたる細胞を特定して追跡する解析手法である。

【0036】

本明細書において、細胞系譜マーカーとは、対象の１個の細胞が、細胞分裂を繰り返しても、分化して性質が変化しても、対象の１個の細胞の子孫にあたる細胞であることを特定することができる標識を意味する。

【0037】

本実施形態の方法では、対象遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜マーカーで、対象遺伝子を発現した細胞を標識する。その結果、対象遺伝子を発現した細胞及びその子孫を特定して観察することができる。その結果、標識された細胞が自己複製及び分化の双方を行ったことが確認された場合、対象遺伝子は幹細胞マーカーであると証明することができる。細胞系譜マーカーは、対象遺伝子座における対象遺伝子のプロモーターで作動することが好ましい。

【0038】

細胞系譜マーカーは、細胞をその子孫を追跡可能に標識することができれば特に限定されないが、例えば、対象遺伝子のプロモーターで発現する細胞系譜標識誘導タンパク質と、これとは別に細胞に導入された細胞系譜標識コンストラクトとを組み合わせたものを使用することができる。ここで、細胞系譜標識誘導タンパク質は、細胞系譜標識コンストラクトに作用し、細胞を細胞系譜的に標識する。

【0039】

より具体的な細胞系譜マーカーとしては、例えば、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰシステム、及びＶＣｒｅ－ＶＬｏｘＰシステム、ＳＣｒｅ－ＳｌｏｘＰシステム等のＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムのバリアントを利用したもの；出芽酵母由来の組換え酵素を用いたＦｌｐ－Ｆｒｔシステムを利用したもの；これらを組み合わせたもの等が挙げられる。

【0040】

細胞系譜標識誘導タンパク質としては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＶＣｒｅリコンビナーゼ、ＳＣｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ等が挙げられる。

【0041】

細胞系譜標識コンストラクトとしては、例えば、使用した細胞系譜標識誘導タンパク質によって細胞系譜標識を行うことができるものを使用することができる。例えば、細胞系譜標識誘導タンパク質がＣｒｅリコンビナーゼである場合には、ｌｏｘＰ配列を有し遺伝子組換えが起こった場合に検出可能となるコンストラクトが挙げられる。細胞系譜標識コンストラクトは、例えば、遺伝子組換えが起こった場合に蛍光タンパク質を発現するように構成されていてもよい。

【0042】

このようなシステムによれば、対象遺伝子が発現した場合に遺伝子組換えが生じ、細胞が、例えば蛍光タンパク質を発現するようになる。この細胞は分裂しても蛍光タンパク質を発現するため、細胞系譜解析を行うことができる。

【0043】

本実施形態の方法において、対象遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜標識誘導タンパク質を導入した組織幹細胞は、上述した方法により作製することができる。一方、細胞系譜標識コンストラクトは、遺伝子座特異的に導入されていなくてもよい。

【0044】

従来は、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うことは困難であった。そのため、組織幹細胞に、対象遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜標識誘導タンパク質を導入することは困難であった。しかしながら、上述したように、発明者らは、培養オルガノイドに遺伝子導入する方法により、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行うことができることを明らかにした。

【0045】

その結果、組織幹細胞に、対象遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜標識誘導タンパク質を導入し、これとは別に細胞系譜標識コンストラクトを導入して、組織幹細胞を細胞系譜マーカーで標識し、対象遺伝子が幹細胞マーカーであるか否かを試験することが可能となった。

【0046】

［癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、癌幹細胞に有効な抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動するレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞を培養する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記レポーター遺伝子の発現量の低下が、前記被験物質が癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示す方法を提供する。

【0047】

本実施形態のスクリーニング方法において、癌幹細胞は、癌幹細胞を含むオルガノイドの形態で培養してもよい。また、癌幹細胞は、上述した方法により、癌幹細胞であることが証明されたものであることが好ましい。すなわち、癌幹細胞マーカー遺伝子は、上述した方法により、癌幹細胞マーカーであることが証明されたものであることが好ましい。

【0048】

また、レポーター遺伝子としては特に限定されず、例えば、各種の蛍光タンパク質、酵素等が挙げられる。レポーター遺伝子は、癌幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座におけるプロモーターで作動することが好ましい。

【0049】

実施例において後述するように、本実施形態のスクリーニング方法により、被験物質が癌幹細胞に与える影響を測定することができる。その結果、癌幹細胞に有効な抗癌剤をスクリーニングすることができる。被験物質としては、特に限定されず、例えば化合物ライブラリーであってもよいし、抗体医薬を含む既存薬のライブラリー等であってもよい。

【0050】

別の実施形態において、本発明は、癌幹細胞及び癌細胞に対する抗癌剤の有効性を試験する方法であって、前記抗癌剤の存在下で、癌幹細胞マーカー遺伝子のプロモーターで作動する第１のレポーター遺伝子及び強制発現用プロモーターで作動する第２のレポーター遺伝子が導入された癌幹細胞を培養する工程と、前記第１及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、前記第１のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤が癌幹細胞に有効な抗癌剤であることを示し、前記第２のレポーター遺伝子の発現量の低下が、前記抗癌剤が癌幹細胞及び癌細胞に有効な抗癌剤であることを示す方法を提供する。

【0051】

本実施形態の方法は、抗癌剤のスクリーニング方法であるということもできる。強制発現用プロモーターとしては、動物細胞における遺伝子の強制発現に通常利用されているプロモーターを用いることができ、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0052】

本実施形態の方法において、第１のレポーター遺伝子は、癌幹細胞マーカー遺伝子の遺伝子座におけるプロモーターで作動することが好ましい。また、第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子は、互いに識別可能なものであることが好ましい。例えば、第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子は、互いに波長が異なる蛍光を発する蛍光タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

【0053】

実施例において後述するように、本実施形態の方法により、対象の抗癌剤が、癌幹細胞と癌細胞に与える影響をそれぞれ評価することができる。したがって、本実施形態の方法を、癌幹細胞に有効な抗癌剤等のスクリーニング等に利用することができる。

【実施例】

【0054】

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0055】

［実験例１］
（大腸癌幹細胞のＬＧＲ５遺伝子座へのレポーター遺伝子の導入）
《コンストラクトの作製》
ＬＧＲ５遺伝子の第１８エクソンを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミドを定法により作製した。図１（ａ）は、ヒトＬＧＲ５遺伝子座の模式図である。また、ＬＧＲ５遺伝子の第１８エクソンにレポーター遺伝子を導入するターゲッティングコンストラクトを作製した。レポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を用いた。図１（ｂ）は、作製したターゲッティングコンストラクトの構造を示す模式図である。

【0056】

ターゲッティングコンストラクトは、ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－ｌｏｘＰ－ＥＦ１－ＲＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ－ｌｏｘＰプラスミド（型式「ＨＲ１８０ＰＡ－１」、システムバイオサイエンス社）にそれぞれ１ｋｂｐの長さを有する５’アーム及び３’アームを連結して作製した。

【0057】

《オルガノイド培養》
慶應大学医学部の倫理委員会により承認を受けて実験を行った。患者から摘出した大腸癌組織を小さな断片に切断し、氷冷したリン酸バッファー（ＰＢＳ）で少なくとも１０回洗浄した。続いて、リベラーゼ（型式「ＴＨ」、ロシュ・ライフサイエンス社）を添加し、１５分ごとに激しくピペッティングしながら３７℃で６０分間消化した。続いて、残った断片を、酵素（型式「ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ」、インビトロジェン社）を用いて３７℃で２０分間更に消化した。

【0058】

続いて、上清を回収し、４℃、２００×ｇで３分間遠心した。続いて、沈殿をマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）で懸濁し、２５μＬ／ウェルずつ２４ウェルプレートに分注した。続いて、マトリゲルがポリメライズした後に培地を添加した。

【0059】

培地としては、ダルベッコ改変イーグル／Ｆ１２培地に、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×Ｂ２７（ライフテクノロジーズ社）、１０ｎＭガストリンＩ（シグマ社）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（和光純薬）を添加した培地を基本培地として使用した。また、場合により、５０ｎｇ／ｍＬマウスリコンビナントＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬマウスリコンビナントＮｏｇｇｉｎ、５００ｎＭ Ａ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社）を培地に添加した。

【0060】

発明者らは、以前に、上述した培養方法により、大腸癌オルガノイドを長期間培養することができること、大腸癌オルガノイドが大腸癌幹細胞を含むことを明らかにしている。

【0061】

《遺伝子導入》
エレクトロポレーション法により、上記の培養オルガノイドに遺伝子を導入した。遺伝子導入の後、培養オルガノイドを３０℃で２日間培養した。続いて、遺伝子導入から３日後に、２μｇ／ｍＬピューロマイシンの存在下で３日間選択培養を行った。

【0062】

続いて、薬剤耐性オルガノイドクローンを選別し、個別に増殖させた。各オルガノイドクローンからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ及びサザンブロッティングにより目的の遺伝子導入が行われたことを確認した。

【0063】

続いて、ｌｏｘＰ配列で挟まれたＲＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ選択カセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを一過性に感染させることにより除去した。続いて、ＲＦＰ陰性のオルガノイドを選別してクローニングした。続いて、ＰＣＲによりＲＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ選択カセットが除去されていることを確認した。

【0064】

以上の方法により、ＣＲＣ７、ＣＲＣ１２、ＣＲＣ２８とそれぞれ命名した、３クローンのオルガノイドを得た。図１（ｃ）は、得られたオルガノイドのＬＧＲ５遺伝子座の構造を示す模式図である。以下、これらのオルガノイドを「ＬＧＲ５－ＧＦＰオルガノイド」という場合がある。

【0065】

［実験例２］
（幹細胞ヒエラルキーの確認）
《オルガノイドの異種移植》
動物実験は、慶應大学医学部の動物実験委員会により承認を受けて行った。実験例１で作製した３クローンのＬＧＲ５－ＧＦＰオルガノイドを、免疫不全マウスの腎被膜下にそれぞれ異種移植した。免疫不全マウスとしては、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（７～１２週齢、オス）を使用した。

【0066】

《癌幹細胞及び分化した癌細胞の検出》
各マウスから、形成された腫瘍を摘出し、直ちに４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結組織切片を作製した。続いて、作製した組織切片において、癌幹細胞の存在を示すＧＦＰの蛍光を検出した。また、分化マーカーであるＫｅｒａｔｉｎ ２０（ＫＲＴ２０）を免疫染色により検出した。

【0067】

図２（ａ）～（ｃ）は、移植したオルガノイドに由来する腫瘍組織の組織切片の蛍光顕微鏡写真である。図２中、「Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ」は、異種移植したオルガノイドに由来する腫瘍組織であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ」は、後述する患者由来の腫瘍組織であることを示す。また、スケールバーは１００μｍを示す。図２（ａ）はＬＧＲ５－ＧＦＰオルガノイドのクローンＣＲＣ７に由来する腫瘍組織の結果であり、図２（ｂ）はクローンＣＲＣ１２に由来する腫瘍組織の結果であり、図２（ｃ）はクローンＣＲＣ２８に由来する腫瘍組織の結果である。

【0068】

その結果、ＧＦＰ陽性細胞（癌幹細胞）は、腫瘍の最も外側の領域に存在し、ＫＲＴ２０（分化した細胞）は腫瘍の内部に存在することが明らかとなった。

【0069】

また、図２（ｄ）～（ｆ）は、各オルガノイドクローンを樹立するもととなった患者由来の大腸癌組織の切片において、ＬＧＲ５のｍＲＮＡをインサイチューハイブリダイゼーションにより検出し、ＫＲＴ２０を免疫染色により検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

【0070】

図２（ｄ）はクローンＣＲＣ７の樹立に用いた患者の腫瘍組織の結果であり、図２（ｅ）はクローンＣＲＣ１２の樹立に用いた患者の腫瘍組織の結果であり、図２（ｆ）はクローンＣＲＣ２８の樹立に用いた患者の腫瘍組織の結果である。

【0071】

その結果、患者の腫瘍組織においても、ＬＧＲ５発現細胞（癌幹細胞）は腫瘍の最も外側の領域に存在し、ＫＲＴ２０（分化した細胞）は腫瘍の内部に存在することが明らかとなった。

【0072】

以上の結果から、オルガノイドに由来する腫瘍組織において、患者の腫瘍組織における幹細胞ヒエラルキーが再現されていることが確認された。

【0073】

［実験例３］
（ＬＧＲ５遺伝子発現細胞が癌幹細胞であることの証明）
癌幹細胞を細胞系譜マーカーで標識し、細胞系譜解析を行うことにより、１個の細胞が自己複製及び分化の双方を行っているか否かを検討した。

【0074】

《細胞系譜マーカーによる標識》
まず、癌幹細胞をＬＧＲ５遺伝子のプロモーターで作動する細胞系譜マーカーで標識した。図３（ａ）～（ｃ）は、細胞系譜マーカーによる標識を説明する図である。

【0075】

まず、実験例１と同様の手法により、大腸癌由来の培養オルガノイドのＬＧＲ５遺伝子座にＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲコンストラクトを導入した。なお、ＣｒｅＥＲタンパク質は、通常細胞質に存在するが、タモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こすリコンビナーゼである。図３（ａ）は、完成したＬＧＲ５遺伝子座の模式図を示す図である。

【0076】

また、実験例１と同様の手法により、ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲを導入したオルガノイドに、レポーターカセットを更に導入した。レポーターカセットとしては、ＣＭＶ－Ｂｒａｉｎｂｏｗ－２．１Ｒプラスミド（型式「＃１８７２３」、アドジーン社）から切り出したレインボーカセットを使用した。図３（ｂ）は、レインボーカセットの模式図を示す図である。

【0077】

ここで、図３（ａ）及び（ｂ）に示す細胞系譜マーカーで標識したオルガノイドについて説明する。上記の細胞系譜マーカーで標識したオルガノイド中に存在する癌幹細胞はＬＧＲ５遺伝子を発現するため、ＣｒｅＥＲタンパク質を発現する。タモキシフェンの非存在下においては、ＣｒｅＥＲが細胞質に存在するため、レインボーカセットの組換えは起きない。このため、ｎｕｃｌｅａｒ ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）が発現し、核内でＧＦＰの蛍光が観察される。

【0078】

ここで、細胞にタモキシフェンを投与すると、ＣｒｅＥＲが核内に移行し、レインボーカセットに存在する複数のｌｏｘＰ配列において、ランダムな組み合わせで組み換えが起きる。その結果、例えば、図３（ｃ）に示す遺伝子配列が形成される。その結果、場合により、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ｍＣＦＰ）のいずれかを発現する細胞になる。

【0079】

一度いずれかの蛍光タンパク質を発現する組換えを起こした細胞及びその子孫は同じ蛍光タンパク質を発現し続ける。このため、１個の細胞に由来する細胞を追跡して解析することができる。以下、上記の細胞系譜マーカーで標識したオルガノイドを「ＬＧＲ５－ＣｒｅＥＲ／Ｒａｉｎｂｏｗオルガノイド」という場合がある。

【0080】

《癌幹細胞の細胞系譜解析》
癌幹細胞は、ＬＧＲ５遺伝子を発現する。このため、ＬＧＲ５－ＣｒｅＥＲ／Ｒａｉｎｂｏｗオルガノイドに含まれる癌幹細胞はＣｒｅＥＲを発現し、タモキシフェンの存在下で、ｎＧＦＰの蛍光を発する細胞から、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣＦＰの蛍光を発する細胞に変化する。

【0081】

このシステムを用いて、癌幹細胞の細胞系譜解析を行った。具体的には、まず、実験例２と同様の方法により、ＮＯＧマウス（７～１２週齢、オス）の腎被膜下に、ＬＧＲ５－ＣｒｅＥＲ／Ｒａｉｎｂｏｗオルガノイドを異種移植した。続いて、移植から１ヶ月後に、マウスにタモキシフェンを投与した。続いて、タモキシフェンの投与から３日後及び２８日後にマウスから腫瘍を摘出し、直ちに４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結組織切片を作製した。

【0082】

続いて、作製した組織切片の蛍光観察、ＬＧＲ５ ｍＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーション、ＫＲＴ２０の免疫染色を行い、癌幹細胞の挙動を観察した。

【0083】

その結果、タモキシフェンの投与の直後、癌幹細胞は腫瘍組織の最も外側の領域に存在することが確認された。その後、細胞系譜標識された細胞クローンにより、継続的に腫瘍組織が形成されることが確認された。

【0084】

また、当初ＬＧＲ５遺伝子を発現していた細胞が、ＬＧＲ５陽性細胞とＬＧＲ５陰性細胞を含むクローナルな構造を形成することが明らかとなった。また、ＬＧＲ５遺伝子を発現していた細胞は、当初ＫＲＴ２０を発現していなかったが、タモキシフェン投与の１週間後に、ＫＲＴ２０陽性細胞に分化したことが確認された。

【0085】

以上の結果から、ヒトにおいて、ＬＧＲ５陽性細胞は癌幹細胞であり、長期間にわたる自己複製能と分化能を備えることが証明された。すなわち、ヒトにおいて、ＬＧＲ５遺伝子は癌幹細胞マーカーであることが証明された。

【0086】

［実験例４］
（癌幹細胞を標的とした癌治療の有効性の検討）
癌幹細胞に薬剤誘導型自殺遺伝子を組み込み、癌幹細胞を標的とした癌治療の有効性を検討した。

【0087】

《薬剤誘導型自殺遺伝子を導入した癌幹細胞の作製》
まず、実験例１と同様の手法により、大腸癌由来の培養オルガノイドのＬＧＲ５遺伝子座にＩＲＥＳ－ｉＣａｓｐａｓｅ９－Ｔ２Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏコンストラクトを導入した。以下、このオルガノイドを「ＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイド」という場合がある。

【0088】

なお、ｉＣａｓｐａｓｅ９は薬剤誘導型自殺遺伝子である。ｉＣａｓｐａｓｅ９は、単量体では活性を有しないが、ＡＰ２０１８７（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ、ＡＰＥｘＢＩＯ社）の存在下では２量体を形成し、アポトーシスを誘導する。また、ｔｄＴｏｍａｔｏは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の一種である。

【0089】

図４は、完成したＬＧＲ５遺伝子座の構造及び薬剤誘導型自殺遺伝子の挙動を説明する図である。本システムでは、ＬＧＲ５遺伝子のプロモーターにより、ｉＣａｓｐａｓｅ及びｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質が発現する。このため、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を観察することにより、ＬＧＲ５陽性細胞の存在を確認することができる。そして、ＡＰ２０１８７の存在下では、ＬＧＲ５陽性細胞がアポトーシスを誘導して死滅する。その結果、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光が観察されなくなる。

【0090】

《ＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドの挙動の確認》
実験例２と同様の方法により、ＮＯＧマウス（７～１２週齢、オス）の腎被膜下に、ＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドを異種移植した。続いて、腫瘍が形成された後、マウスにＡＰ２０１８７を５日間毎日投与した。また、対照マウスには溶媒のみを５日間毎日投与した。その後、各マウスの腫瘍サイズを経時的に測定した。

【0091】

図５（ａ）及び（ｂ）は、ＡＰ２０１８７の投与開始から５日目に各マウスの腫瘍を摘出して組織切片を作製し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光、及び分化マーカーであるＫＲＴ２０を免疫染色により検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

【0092】

図５（ａ）中、「＋Ｖｅｈｉｃｌｅ」は、溶媒のみを投与した対照マウスの結果であることを示す。また、図５（ｂ）中、「＋Ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ」は、ＡＰ２０１８７を投与したマウスの結果であることを示す。図５（ａ）及び（ｂ）中、スケールバーは１００μｍを示す。

【0093】

その結果、図５（ｂ）に示すように、ＡＰ２０１８７の投与によりアポトーシスが誘導され、ＬＧＲ５陽性の癌幹細胞が完全に死滅したことが明らかとなった。一方、ＬＧＲ５陰性の細胞は無傷のまま残存していた。

【0094】

また、図６は、ＡＰ２０１８７を投与したマウス（Ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）及び対照マウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）の腫瘍サイズを経時的に測定した結果を示すグラフである。その結果、ＡＰ２０１８７の投与による腫瘍サイズの減少が確認された。しかしながら、最終的には、腫瘍サイズが再度増大することが明らかとなった。

【0095】

また、発明者らは、ＡＰ２０１８７を投与後の腫瘍組織におけるＬＧＲ５遺伝子の発現を検討した。その結果、一度消失したＬＧＲ５遺伝子の発現が再度認められることが明らかとなった。また、腫瘍サイズの再度の増大が、ＬＧＲ５遺伝子の再発現と対応していることが明らかとなった。

【0096】

以上の結果から、ＬＧＲ５陽性癌幹細胞は腫瘍の増大に関わっており、また、ＬＧＲ５陰性癌細胞はＬＧＲ５陽性癌幹細胞に脱分化する能力を有することが明らかとなった。本実験例の、ＡＰ２０１８７を用いた癌幹細胞治療モデルから、癌幹細胞のみを標的とする、単独薬剤を用いた短期治療では、腫瘍再発を引き起こすことが明らかとなった。更に、継続的な癌幹細胞治療により、腫瘍は根治はしないものの、腫瘍増大の抑制が可能であることが明らかとなった。

【0097】

［実験例５］
（癌幹細胞特異的抗癌剤と抗癌剤との併用モデルの検討）
実験例４で作製したＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドの異種移植により作製した腫瘍において、ＡＰ２０１８７は仮想的な癌幹細胞特異的抗癌剤であるといえる。そこで、ＡＰ２０１８７と既存の抗癌剤との組み合わせによる癌治療の効果を検討した。

【0098】

具体的には、実験例２と同様の方法により、ＮＯＧマウス（７～１２週齢、オス）の腎被膜下に、実験例４で作製したＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドを異種移植した。ＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドとしては、クローンＣＣＯ７及びクローンＣＣＯ２５の２クローンを使用した。

【0099】

続いて、腫瘍が形成された後、マウスに既存の抗癌剤を投与した。既存の抗癌剤としては、抗ＥＧＦレセプター抗体であるセツキシマブ（ＣＴＸ）を使用した。セツキシマブの投与は薬物投与開始時（０日目）及び７日目の２回行った。また、対照マウスにはセツキシマブの代わりに溶媒のみを投与した。

【0100】

その後、セツキシマブを投与したマウスに、薬物投与開始後８～１２日目の５日間、ＡＰ２０１８７を毎日投与した。また、比較のために、セツキシマブを投与したマウスに、薬物投与開始後８～１２日目の５日間、溶媒のみを毎日投与したマウスを用いた。

【0101】

続いて、各マウスの腫瘍サイズを経時的に測定した。図７（ａ）及び（ｂ）は、腫瘍サイズを経時的に測定した結果を示すグラフである。図７（ａ）はＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドクローンＣＣＯ７に由来する腫瘍の結果であり、図７（ｂ）はＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドクローンＣＣＯ２５に由来する腫瘍の結果である。

【0102】

図７（ａ）及び（ｂ）中、「Ｖ」は対照マウスの結果を示し、「ＣＴＸ」はセツキシマブ及び溶媒を投与したマウスの結果を示し、「ＣＴＸ＋Ｄ」はセツキシマブ及びＡＰ２０１８７を投与した結果を示す。

【0103】

その結果、いずれのオルガノイドクローンを使用した場合においても、セツキシマブ及びＡＰ２０１８７を併用して投与することにより、腫瘍サイズが顕著に縮小したことが明らかとなった。また、セツキシマブ及びＡＰ２０１８７を併用して投与した、ＣＣＯ７クローンを移植したマウスの６匹中５匹に９５％以上の腫瘍縮小が観察され、ＣＣＯ２５クローンを移植したマウスの１４匹中５匹において、癌組織の完全な消失が観察された。

【0104】

以上の結果は、癌幹細胞特異的抗癌剤と既存の抗癌剤との併用が癌治療に有効であることを示す。なお、併用効果のある薬剤は癌により異なると考えられ、薬剤によるＬＧＲ５の発現量からその併用効果が予測できると考えられた。

【0105】

［実験例６］
（癌幹細胞及び癌細胞に対する抗癌剤の有効性の検討）
実験例４で作製したＬＧＲ５－ｉＣＴオルガノイドに、ＣＭＶ－ＧＦＰコンストラクトを更に導入した。ＣＭＶ－ＧＦＰコンストラクトでは、強制発現用プロモーターであるＣＭＶプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子が連結されていた。このため、ＬＧＲ５遺伝子を発現しているか否かに関わらず、全ての細胞でＧＦＰ遺伝子が発現し、ＧＦＰタンパク質の蛍光を発する。以下、このオルガノイドを「ＬＧＲ５－ｉＣＴ／ＣＭＶ－ＧＦＰオルガノイド」という場合がある。

【0106】

ＬＧＲ５－ｉＣＴ／ＣＭＶ－ＧＦＰオルガノイドでは、ＧＦＰの蛍光により癌細胞の生存活性を観察し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光により癌幹細胞の生存活性を観察することができる。

【0107】

ＬＧＲ５－ｉＣＴ／ＣＭＶ－ＧＦＰオルガノイドを用いて、大腸癌の治療に用いられる既存の抗癌剤をハイスループットスクリーニングし、癌細胞及び癌幹細胞に対する影響を検討した。

【0108】

図８は、代表的な結果を示すオルガノイドの顕微鏡写真である。図８中、「明視野」は明視野観察画像であることを示し、「ＣＭＶ－ＧＦＰ」はＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であることを示し、「ＬＧＲ５－ｔｄＴｏｍａｔｏ」はｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であることを示し、「マージ」は、明視野観察画像、ＧＦＰの蛍光顕微鏡写真、及びｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光顕微鏡写真を合成した結果であることを示す。また、イリノテカン、セツキシマブ、オキサリプラチンは既存の抗癌剤である。各抗癌剤は、図８に示す終濃度でオルガノイドの培地に添加した。また、「ＤＭＳＯ」は対照として抗癌剤の代わりに培地に添加したジメチルスルホキシドを意味する。

【0109】

その結果、イリノテカンは癌細胞の増殖抑制効果を示したが、癌幹細胞に対する有効性は認められなかった。また、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブが癌幹細胞の生存活性を顕著に上昇させることが明らかとなった。また、オキサリプラチンは、癌幹細胞及び癌細胞の双方を殺傷することが明らかとなった。

【0110】

この結果は、本実験例の方法を、癌幹細胞に有効な抗癌剤等のスクリーニングに利用できることを実証するものである。

【産業上の利用可能性】

【0111】

本発明によれば、組織幹細胞に遺伝子座特異的な遺伝子操作を行う技術を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】