特許 7641223 ＣＡＲ細胞上の非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に、結合した異種分子を選択的に送達する改変非天然ＮＫＧ２Ｄリガンド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-26

(45)【発行日】2025-03-06

(54)【発明の名称】ＣＡＲ細胞上の非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に、結合した異種分子を選択的に送達する改変非天然ＮＫＧ２Ｄリガンド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/705 20060101AFI20250227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250227BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20250227BHJP

   C07K 14/16 20060101ALN20250227BHJP

   C12N 15/49 20060101ALN20250227BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250227BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250227BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250227BHJP

   C07K 16/10 20060101ALN20250227BHJP

【ＦＩ】

C07K14/705

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C07K14/16

C12N15/49

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K16/10

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021543465

(86)(22)【出願日】2020-01-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-26

(86)【国際出願番号】 US2020015341

(87)【国際公開番号】W WO2020159941

(87)【国際公開日】2020-08-06

【審査請求日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】62/797,644

(32)【優先日】2019-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518455871

【氏名又は名称】サイフォス、バイオサイエンシズ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＸＹＰＨＯＳ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ．

(73)【特許権者】

【識別番号】517352418

【氏名又は名称】ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】キム、カマン

(72)【発明者】

【氏名】キリーン、ナイジェル

(72)【発明者】

【氏名】ヘルツィヒ、エイタン

(72)【発明者】

【氏名】グリーン、ワーナー

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５２９７５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０００６２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５２７０１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２６９１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０５－５０７４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０４－５０６２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５０８７８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１５６０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０１９８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３４９８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２１０７８６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体への改変非天然リガンドであって、
前記リガンドが、（ａ）（ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列又はその変異体（変異体は１５４位にＴを；１５５位にＭ、Ｋ、Ｗ、Ｌ又はＴを；１５６位にＬ又はＭを；１５７位にＥ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｙ又はＲを；１５８位にＬ、Ｖ、Ｉ又はＴを；及び／又は１５９位にＷ又はＩを有する）、又は（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列又はその変異体（変異体は１５５位にＤ、Ｗ、Ｒ、Ｙ又はＬを；１５６位にＬ又はＭを；１５７位にＩ、Ｙ、Ｖ又はＬを；１５８位にＲ、Ｌ又はＴを；及び／又は１５９位にＲ、Ｉ、Ｗ又はＫを有する）を含み、（ｂ）ＨＩＶに感染した細胞の表面上に存在するＨＩＶタンパク質に選択的に結合する異種分子に結合し、
前記異種分子が、配列番号１６９及び配列番号１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエピトープ配列に選択的に結合し、
その結合している異種分子を有する前記改変リガンドが、ＣＡＲ細胞の改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に選択的に結合して、ＨＩＶ感染細胞の破壊を引き起こすことができる、改変非天然リガンド。

【請求項2】

配列番号６８、６９、７０、７１、又は７２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変非天然リガンド。

【請求項3】

前記改変非天然リガンドが、配列番号５４及び１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する、請求項１に記載の改変非天然ＮＫＧ２Ｄリガンド。

【請求項4】

ＨＩＶ感染細胞の表面上の異なるエピトープ、タンパク質、又は他の分子に結合する異なる別個の異種分子を有する複数の改変非天然リガンドに結合している、請求項１に記載の改変非天然リガンドに結合したＣＡＲ細胞。

【請求項5】

前記ＣＡＲ細胞が、配列番号５４及び配列番号１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を含み、
前記ＣＡＲ細胞が、さらに、ＨＩＶタンパク質に結合しない異種分子又は原子が結合している配列番号６８～７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む改変非天然リガンドに結合する、請求項４に記載のＣＡＲ細胞。

【請求項6】

ＨＩＶタンパク質に結合しない前記異種分子又は原子が、ＣＡＲ細胞の機能を調節する、請求項４又は５に記載のＣＡＲ細胞。

【請求項7】

前記機能がＨＩＶに感染していない細胞の増殖、分化、除去、イメージング、免疫抑制の拮抗、ホーミング及び細胞溶解からなる群から選択される機能である、請求項６に記載のＣＡＲ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、一般に、遺伝子操作を受けた哺乳類細胞上の改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体で構成されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に選択的に送達される、特異的標的結合特性を有するポリペプチド、例えば抗体又は抗体の断片が結合したＮＫＧ２Ｄリガンドの改変非天然α１－α２ドメインに関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトを含む多くの哺乳類における免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られている抗体（Ａｂ）（図１）は、細菌及びウイルス等の異物を特定し、中和するために免疫系によって使用される、大きなＹ字型のタンパク質である（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｊａｎｅｗａｙ（２００１）．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．（５ｔｈ ｅｄ．），Ｃｈａｐｔｅｒ ３．Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．ＩＳＢＮ０－８１５３－３６４２－Ｘ．（ＮＣＢＩ Ｂｏｏｋｓｈｅｌｆを介した電子フルテキスト）。抗体は、抗原と呼ばれる異物標的の固有の部分を認識する。抗体の「Ｙ」の２本のアームの各先端は、抗原結合部位、すなわち、パラトープ（錠に類似の構造）を含み、これは抗原のある特定のエピトープ（同様に鍵に類似）に特異的であるので、これら２つの構造は互いに正確に結合することができる。この結合機序を使用して、抗体は、免疫系の他の部分によって攻撃するために微生物又は感染細胞にタグを付けることができたり、例えば微生物の侵入及び生存に不可欠な微生物の部分をブロックすることによってその標的を直接中和することができたりする。抗体の産生は、体液性又は「適応」免疫系の主な機能である。抗体は、形質細胞によって分泌される。自然界における抗体は、細胞から分泌される可溶性形態及びＹの「ステム」を介してＢ細胞の表面に結合している膜結合形態の２つの物理的形態で存在し得る。

【0003】

抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、典型的には、それぞれ２本の大きな重鎖及び２本の小さな軽鎖を有する基本構造単位で構成されている。幾つかの異なる種類の抗体の重鎖、及びどの重鎖を保有しているかに基づいて異なるアイソタイプに分類される幾つかの異なる種類の抗体が存在する。哺乳類では、５つの異なる抗体アイソタイプが知られている（Ｍａｒｋｅｔ Ｅ，Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕ ＦＮ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００３）．”Ｖ（Ｄ）Ｊ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ”．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．１（１）：Ｅ１６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．０００００１６．ＰＭＣ２１２６９５．ＰＭＩＤ１４５５１９１３）。全ての抗体の一般的な構造は非常に類似しているが、Ｙ字型タンパク質の各アームの先端における小さな領域は非常に変化に富んでいるので、わずかに異なる先端構造、すなわち、抗原結合部位を有する数百万の抗体が存在することが可能になる。この領域は、超可変領域又は可変領域として知られている。これら天然バリアントはそれぞれ、異なる抗原に結合することができる。このように抗体の多様性が非常に高いことから、免疫系が、同様に多種多様な抗原に適応し、認識することが可能になる（Ｈｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｓ（１９７６）．”Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７３（１０）：３６２８－３６３２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．７３．１０．３６２８．ＰＭＣ４３１１７１．ＰＭＩＤ ８２４６４７．）

【0004】

天然「Ｙ」字型Ｉｇ分子は、４本のポリペプチド鎖；ジスルフィド結合によって連結された２本の同一重鎖及び２本の同一軽鎖からなる。各重鎖は、２つの主な領域、定常領域（ＣＨ）及び可変領域（ＶＨ）を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において本質的に同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。また、軽鎖は、２つの連続したドメイン：より小さな定常領域（ＣＬ）及び可変領域（ＶＬ）を有する（Ｗｏｏｆ Ｊ，Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ（２００４）．”Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４（２）：８９－９９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ１２６６．ＰＭＩＤ１５０４０５８２）。

【0005】

抗体の幾つかの部分は、同じ機能を有する。例えば、Ｙの２本のアームはそれぞれ、抗原に結合し、したがって、特定の異物を認識することができる部位を有する。抗体のこの領域は、Ｆｖ（可変断片）領域と呼ばれる。これは、抗体の重鎖からの１つの可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖からの１つの可変領域（Ｖ_Ｌ）で構成されている（Ｈｏｃｈｍａｎ Ｊ，Ｉｎｂａｒ Ｄ，Ｇｉｖｏｌ Ｄ（１９７３）．Ａｎ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆｖ）ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２（６）：１１３０－１１３５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ００７３０ａ０１８．ＰＭＩＤ４５６９７６９）。パラトープは、Ｆｖの一端を形作っており、抗原に結合するための領域である。これは、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈにそれぞれ３つずつあるβ鎖の可変ループで構成されており、抗原への結合に関与している。これら６つのループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される（Ｎｏｒｔｈ Ｂ，Ｌｅｈｍａｎｎ Ａ，Ｄｕｎｂｒａｃｋ ＲＬ（２０１０）．“Ａ ｎｅｗ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ ｌｏｏｐ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０６（２）：２２８－２５６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１０．１０．０３０．ＰＭＣ３０６５９６７．ＰＭＩＤ２１０３５４５９）。

【0006】

特異的抗原結合機能を保有する有用なポリペプチドは、抗体の可変領域のＣＤＲに由来し得る。これら２つの抗体可変ドメイン、それぞれ３つのＣＤＲを有する軽鎖（ＶＬ）の１つ及び重鎖（Ｖ_Ｈ）からの１つは、１０～約２５アミノ酸の単一の短いリンカーペプチドを使用していずれかの順序でタンデムに融合させて、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのそれぞれ１つを含む線状一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ポリペプチドを作製することができる（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，Ｈａｒｄｍａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｔ．，Ｐｏｐｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｇ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．（１９８８）Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｄ，Ｍｕｄｇｅｔｔ－Ｈｕｎｔｅｒ，Ｍ，Ｔａｉ，Ｍ－Ｓ，Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｊ，Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ，Ｍ．Ｎ．，Ｒｉｄｇｅ，Ｒ．，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，ＲＥ．，Ｈａｂｅｒ，Ｅ．，Ｃｒｅａ，Ｒ．，ａｎｄ Ｏｐｐｅｒｍａｎ，Ｈ．（１９８８）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ－ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＰＮＡＳ ８５：５８７９－５８８３）。

【0007】

リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンリッチであり、加えて、溶解性のためにセリン、スレオニン、又は荷電アミノ酸リッチであり、そして、Ｖ_ＨのＮ末端をＶ_ＬのＣ末端に連結させることができ、逆もまた同様である。このタンパク質は、定常領域が除去され、単一リンカーが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。このフォーマットにより、組換えＤＮＡ技術の当業者であれば、親タンパク質にｓｃＦｖの抗原結合特性を付与するために、親タンパク質のＮ末端又はＣ末端に線状ｓｃＦｖを遺伝学的に融合させることが可能になる。他にも多数の多価及びタンデムｓｃＦｖ領域の配置が提案又は作製されているが、重要なことは、下記の通り、全てが少なくとも２つの空間的に離れた末端を有していることである（Ｌｅ Ｇａｌｌ，Ｆ．；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ＳＭ；Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ，Ｇ；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ（１９９９）．”Ｄｉ－，ｔｒｉ－ ａｎｄ ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ＣＤ１９：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｌｅｎｃｙ ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ”．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５３（１）：１６４－１６８．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００１４－５７９３（９９）００７１３－９．ＰＭＩＤ１０４０３３９５）。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、異種ポリペプチド、幾つかの実施形態では抗体又は抗体の断片に結合するＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１－α２ドメインに関する。改変リガンドは、同種の非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に選択的に結合し、これは、次に、その同種改変リガンドに選択的に結合する。非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体は、免疫系の細胞の表面上で発現し、そのエフェクター細胞の表面上にキメラ受容体を作製することができる。また、リガンドに結合する異種分子は、標的細胞の表面上の特定の分子に結合し、それによって、免疫エフェクター細胞を標的細胞に送達することもできる。このようなエフェクター細胞としては、リンパ球、Ｂ細胞、形質細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞が挙げられる。

【0009】

幾つかの実施形態では、本開示は、改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体のための改変非天然リガンドであって、該リガンドが、ＨＩＶに感染した細胞の表面上に存在するＨＩＶタンパク質に選択的に結合する、結合している異種分子を有し、その異種分子を有する該改変リガンドが、ＣＡＲ細胞の改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に選択的に結合して、ＨＩＶ感染細胞の破壊を引き起こすことができる、改変非天然リガンドに関する。

【0010】

更なる実施形態では、異種分子が選択的に結合するＨＩＶタンパク質は、ＨＩＶエンベロープタンパク質である。

【0011】

更に別の実施形態では、異種分子が選択的に結合するエンベロープタンパク質のエピトープは、配列番号１６９又は配列番号１７０を含む。

【0012】

本開示の幾つかの実施形態では、改変非天然リガンドは、配列番号６８、６９、７０、７１、又は７２を含む。

【0013】

更なる実施形態では、改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体は、配列番号５４又は１５４を含む。

【0014】

本開示の幾つかの実施形態では、ＨＩＶタンパク質は、潜伏ＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶタンパク質の発現を誘発することが知られている機序又は剤、すなわち、潜伏感染再活性化剤によってショックを与えられた又は活性化されたＨＩＶ感染細胞で発現する。

【0015】

本開示の幾つかの実施形態では、ＣＡＲ細胞には、異なる別個の異種分子がＨＩＶ感染細胞の表面上の異なるエピトープ、タンパク質、又は他の分子に結合している複数の改変非天然リガンドが結合している。

【0016】

本開示の幾つかの実施形態では、配列番号５４又は１５４を含む改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体がＣＡＲ細胞上に存在し、該改変ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＨＩＶタンパク質に結合しない異種分子又は原子が結合している、配列番号６８、６９、７０、７１、又は７２で構成される改変非天然リガンドに結合する。

【0017】

更なる実施形態では、異種分子又は原子は、ＣＡＲ細胞の機能を調節する。なお更なる実施形態では、細胞機能としては、ＨＩＶに感染していない細胞の増殖、分化、除去、イメージング、免疫抑制の拮抗、ホーミング、又は細胞溶解が挙げられる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

特許又は出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも１枚の図面を含む。このカラー図面（複数可）付き特許又は特許出願公開のコピーは、請求して必要な手数料を支払えば特許庁によって提供される。

【図1】そのＹ字型構造及び構造要素を示す、典型的な哺乳類抗体の図。

【図2】典型的なＣＡＲの解剖学的形態（Ｇｉｌｌ ＆ Ｊｕｎｅ，２０１５，前喝）。

【図3】ＮＫＧ２Ｄに対する親和性を強化するための、ＭＩＣＡのα１－α２ドメインの構造特異的変異誘発。５７箇所の特定のアミノ酸部位が広範囲に変異誘発されたＮＫＧ２Ｄ結合面が濃い灰色で着色されている、ＭＩＣＡのα１－α２ドメイン（ＰＤＢ １ＨＹＲ）の構造。

【図4】天然ＮＫＧ２Ｄホモダイマー内のチロシン残基Ｙ１５２及びＹ１９９。

【図5】ＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ１～６からのα１－α２ドメインのタンパク質配列アラインメント。ＵＬＢＰ２（６０アミノ酸）及びＵＬＢＰ３（３６アミノ酸）におけるＮＮＫ変異誘発のために、灰色でハイライトされているアミノ酸を選択した。黒色でハイライトされている残基は、選択のための鍵となる位置として同定され、ＮＫＧ２Ｄとの結合親和性を調節する変異として同定された（表６及び７）。

【図6】Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃへの結合について選択された非天然α１－α２ドメインに対するＲ３抗体融合体のＥＬＩＳＡ結果。（Ａ）Ｒ３ ＨＣ２５抗体融合体は、Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対して選択的ではない。（Ｂ）Ｒ３ ＨＣ２５．１７（配列番号７３）抗体融合体は、天然ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに比べてＹ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対して選択的である。（Ｃ）Ｒ３ ＨＣ．Ｕ２ＲＷ抗体融合体は、天然ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに比べてＹ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対して選択的ではない。（Ｄ）Ｒ３ ＨＣ．Ｕ２Ｓ３（配列番号７４）抗体融合体は、天然ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに比べてＹ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対して選択的である。

【図7】異なる濃度の特異的にＨＩＶを標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙを有するＣＡＲ－Ｔ細胞によるＨＩＶに感染した初代ＣＤ４ Ｔ細胞の殺傷についてのエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比の評価。Ｂａｌ－ＧＦＰ Ｒ５ウイルスに感染した初代扁桃腺由来細胞１００万個（約１０％感染；１×１０^４個の感染細胞）を、異なる濃度の４つの異なる広域中和ＨＩＶ ＭｉｃＡｂｏｄｙの存在下で、１×１０^５個の形質導入されていないＣＤ８（０：１）、又は１×１０^４個（１：１）若しくは２×１０^５個（２０：１）のＣＡＲ－Ｔ細胞と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を染色し、フローサイトメトリーによって評価した。細胞を、ＧＦＰを発現しているか又は発現していない単一細胞／生／ＣＤ３＋／ＣＤ８－細胞をゲーティングした。３回の試験を平均した結果を示す。

【図8】特異的ＨＩＶ ＭｉｃＡｂｏｄｙと組み合わせたＣＡＲ－ＴによるＲ５ウイルスに感染した初代ＣＤ４細胞の特異的殺傷。Ｂａｌ－ＧＦＰ Ｒ５ウイルスに感染した初代扁桃腺由来細胞１００万個（約１×１０^４個の感染細胞）を、異なる濃度のＨＩＶ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙ又はＢ細胞特異的ＣＤ２０を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ又はＨＥＲ２を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｈｅｒ２）の存在下で、１×１０^５個のＣＡＲ－Ｔ細胞と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を単一細胞／生／ＣＤ３＋／ＣＤ８－及びＧＦＰ＋又はＧＦＰ－のいずれかでゲーティングした。４回の試験を平均した結果を示す。

【図9】特異的ＨＩＶ ＭｉｃＡｂｏｄｙと組み合わせたＣＡＲ－ＴによるＦ４ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ／ｆｏｕｎｄｅｒウイルスに感染した初代ＣＤ４細胞の特異的殺傷。Ｆ４－ＧＦＰ（Ｔ／Ｆ）ウイルスに感染した初代扁桃腺由来細胞１００万個（約１×１０^４個の感染細胞）を、異なる濃度の４つの別個のＨＩＶ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙ、ＣＤ２０を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｒｉｔｕｘ）、又はＨＥＲ２を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｈｅｒ２）の存在下で、１×１０^５個のｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を染色し、続いて、フローサイトメトリーを行った。細胞を単一細胞／生／ＣＤ３＋／ＣＤ８－及びＧＦＰ＋又はＧＦＰ－のいずれかでゲーティングした。

【図10】ＨＩＶに慢性的に感染し、ＡＲＴを受けている非ウイルス血症患者からの再活性化した潜伏感染リザーバ細胞のＣＡＲ－Ｔ及びＭｉｃＡｂｏｄｙによる殺傷。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＡＲＴを受けている既知のＨＩＶ感染患者から回収したＰＢＭＣからノータッチネガティブセレクションによって単離し、１００ｎＭ 酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）＋１ｕＭ イオノマイシンで７２時間再活性化した。次いで、細胞を２回洗浄し、ＭＩＸと表記された、０．１ｎＭ又は１ｎＭの等濃度のＨＩＶ ｂＮＡｂベースのＭｉｃＡｂｏｄｙ（３ＢＮＣ６０、３ＢＮＣ１１７、ＰＧＴ１２１、及び１０－１０７４）の混合物の存在下で、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞又は形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞と共に４８時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、細胞ペレットからＲＮＡを抽出した。細胞に結合しているＨＩＶ ＲＮＡをｄｄＰＣＲによって測定した。

【発明を実施するための形態】

【0019】

免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球－マクロファージ系列の細胞、及び特定の（ＣＤ８＋αβ及びγδ）Ｔ細胞は、新生物細胞及びウイルス感染細胞に対する第一選択の先天的防御としてヒト及び他の哺乳類において重要な役割を果たしている（Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．，ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００１．ＮＫ ｃｅｌｌｓ，ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：４１－４９）。ＮＫ細胞及び特定のＴ細胞は、標的細胞の認識及び病的細胞に対する先天的防御の活性化に関与する突起ホモ二量体表面免疫受容体であるＮＫＧ２Ｄをその表面に提示する（Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ，１９９８．ＮＫ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３５９－３９３；Ｈｏｕｃｈｉｎｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．１９９１．ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＫＧ２，ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｙｐｅ ＩＩ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７－１０２０；Ｂａｕｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ，ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩＣＡ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：７２７－７３０）。ヒトＮＫＧ２Ｄ分子は、８４％の配列が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連糖タンパク質（ＭＩＣ）の多型類似体である単量体のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢと同一又は相同である、その同種リガンドに結合するＣ型レクチン様細胞外ドメインを保有する（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｔｈｅ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：１９－３４；Ｂａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅｓ．ＰＮＡＳ ９１：６２５９－６２６３；Ｂａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９９６ａ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＩＣＡ ｇｅｎｅ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４：８０－８１；Ｂａｈｒａｍ ａｎｄ Ｓｐｉｅｓ ＴＡ．１９９６．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＩＣＢ ｃＤＮＡ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：２３０－２３３）。ＭＩＣタンパク質の非病的な発現は、一般に、腸管上皮、ケラチノサイト、内皮細胞、及び単球に限られるが、増殖、酸化、ウイルス感染、及びヒートショック等の多くの種類の細胞ストレスに応答して、これらＭＩＣタンパク質の異常な表面発現が生じ、該細胞を病的なものであると特徴付ける（Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＧＩ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＰＮＡＳ ９３：１２４４５－１２４５０；Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ γδＴ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１７３７－１７４０；Ｚｗｉｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣＡ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：３２３－３３０）。また、ＭＩＣタンパク質の病的な発現は、幾つかの自己免疫疾患に関与していると考えられる（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ．２０００．Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：８４－８９；Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＳＪ．２００８．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．４０：１８－３４）。多型のＭＩＣＡやＭＩＣＢ等のＮＫＧ２Ｄリガンドの差次的な制御は、健常細胞を望ましくない攻撃から保護しつつ、広範囲にわたる緊急事態の合図を同定し、応答する手段を免疫系に提供するために重要である（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＨＡ，（２００１）ＭＩＣＡ ａｎｄ ＭＩＣＢ ｇｅｎｅｓ：ｃａｎ ｔｈｅ ｅｎｉｇｍａ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ？ Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３７８－８５；Ｓｐｉｅｓ，Ｔ．２００８．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ：ａ ｐｕｒｐｏｓｅｆｕｌ ｂｕｔ ｄｅｌｉｃａｔｅ ａｆｆａｉｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０１３－１０１５）。

【0020】

ウイルス感染は、ＭＩＣタンパク質発現の一般的な誘導因子であり、ＮＫ細胞又はＴ細胞の攻撃対象としてウイルス感染細胞を同定する（Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ αβＴ－ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ ｖｉａ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ ＭＩＣ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｎ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２５５－２６０；Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．，ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００１）。実際、その宿主細胞に対するこのような攻撃から逃れるために、サイトメガロウイルス及び他のウイルスは、自然免疫系の報復を回避するために、感染した細胞の表面上でＭＩＣタンパク質が発現するのを防ぐ機序を進化させてきた（Ｌｏｄｏｅｎ，Ｍ．，Ｋ．Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｊ．Ａ．Ｈａｍｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａｒａｓｅ，Ｊ．Ｐ．Ｈｏｕｃｈｉｎｓ，Ｅ．Ｓ．Ｍｏｃａｒｓｋｉ，ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００３． ＮＫＧ２Ｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ ｇｐ４０ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＥ－１ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１２４５－１２５３；Ｓｔｅｒｎ－Ｇｉｎｏｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ｖｉｒａｌ ｍｉＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７：３７６－３８１；Ｓｔｅｒｎ－Ｇｉｎｏｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：１０６５－７３；Ｓｌａｖｕｌｊｉｃａ，Ｉ Ａ Ｂｕｓｃｈｅ，Ｍ Ｂａｂｉｃ ，Ｍ Ｍｉｔｒｏｖｉｃ，Ｉ Ｇａｓｐａｒｏｖｉｃ，Ｄ Ｃｅｋｉｎｏｖｉｃ，Ｅ Ｍａｒｋｏｖａ Ｃａｒ，ＥＰ Ｐｕｇｅｌ，Ａ Ｃｉｋｏｖｉｃ，ＶＪ Ｌｉｓｎｉｃ，ＷＪ Ｂｒｉｔｔ，Ｕ Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ，Ｍ Ｍｅｓｓｅｒｌｅ，Ａ Ｋｒｍｐｏｔｉｃ ａｎｄ Ｓ Ｊｏｎｊｉｃ．２０１０．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｎｄ ｈａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：４５３２－４５４５）。

【0021】

そのストレスにもかかわらず、肺がん及び膠芽腫脳腫瘍のもの等の多くの悪性細胞もＭＩＣタンパク質の発現を逃れ、その結果、特に高悪性度になる場合があるが、それは自然免疫系を過度に回避するためである（Ｂｕｓｃｈｅ，Ａ ｅｔ ａｌ．２００６，ＮＫ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｈａｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１３５－１４６；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａ，ＥＳ，ＭＭ Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎ，Ｅ Ｖｉｄｅｒ，ＲＢ Ｓｉｓｓｏｎ，ＲＪ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｂ Ｄｕｐｏｎｔ，ａｎｄ ＹＭ Ｖｙａｓ，２００３．Ｅｖａｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｃｈａｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｌｏｎ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６８９１－９９；Ｆｒｉｅｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００３．ＭＩＣＡ／ＮＫＧ２Ｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：８９９６－９００６；Ｆｕｅｒｔｅｓ，ＭＢ， ＭＶ Ｇｉｒａｒｔ，ＬＬ Ｍｏｌｉｎｅｒｏ，ＣＩ Ｄｏｍａｉｃａ，ＬＥ Ｒｏｓｓｉ，ＭＭ Ｂａｒｒｉｏ，Ｊ Ｍｏｒｄｏｈ，ＧＡ Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ａｎｄ ＮＷ Ｚｗｉｒｎｅｒ．（２００８）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｃｈａｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＮＫ Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８０：４６０６ －４６１４）。

【0022】

ＮＫＧ２Ｄに結合したヒトＭＩＣＡの高分解能構造は解析されており、ＭＩＣＡのα３ドメインがＮＫＧ２Ｄと直接相互作用しないことが実証されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ＭＩＣＡ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３－４５１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ １ＨＹＲ）。ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＭＩＣＢのそれと同様に、短く柔軟なリンカーペプチドによってα１－α２プラットフォームドメインに接続されており、それ自体が該プラットフォームとＭＩＣ発現細胞の表面との間の「スペーサー」として天然では配置されている。ヒトのＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのα３ドメインの三次元構造はほぼ同一であり（９４個のＣ－ααにおいて二乗平均平方根距離が１Å未満）、機能的に互換性がある（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｈｏｍｏｌｏｇ ＭＩＣＢ，ａ Ｓｔｒｅｓｓ－Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１３９５－１４００）。

【0023】

天然α１－α２ドメインよりも高い親和性で天然ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するように改変されたＮＫＧ２Ｄリガンドの特定の非天然α１－α２ドメインが記載されている（Ｃａｎｄｉｃｅ Ｓ．Ｅ．Ｌｅｎｇｙｅｌ，Ｌｉｎｄｓｅｙ Ｊ．Ｗｉｌｌｉｓ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ｍａｎｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂａｋｅｒ，Ｔａｎｊａ Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｒｏｌａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｔｈｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｂｏｕｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ＭＩＣＡ－ＮＫＧ２Ｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２８２，ｎｏ．４２，ｐｐ．３０６５８－３０６６６，２００７；Ｓａｍｕｅｌ Ｈ．Ｈｅｎａｇｅｒ，Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．Ｈａｌｅ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｊ．Ｍａｕｒｉｃｅ，Ｅｒｉｎ Ｃ．Ｄｕｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｒｔｅｒ Ｊ．Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｍｅｇａｎ Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｊ．Ｂａｎ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ，Ｌｕｋｅ Ｄ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｌｉｓａ Ｋ．Ｓａｎｄｅｒｓ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｎａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＩＣＡ－ＮＫＧ２Ｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ ＶＯＬ ２１：１３９６-１４０２。本明細書では、本発明者らは、結果的にＮＫＧ２Ｄリガンドの天然α１－α２ドメインへの結合が損なわれるか又は失われる部位でそれ自体が変異している、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体と結合するように改変されたＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１－α２ドメインについて説明する（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋ．Ｍａｄｄｏｘ，Ａｎｄｒｅｗ Ｂ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐａｉｒｓ ｉｎ ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｊａｎｕａｒｙ；４８（４）：５１６－５２３；米国特許出願第１４／５６２，５３４号；米国特許仮出願第６２／０８８，４５６号））。本発明は、特異的に改変された非天然α１－α２ドメインで構成され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合する異種ペプチド又はポリペプチドを含むがこれらに限定されない異種分子を特異的に標的とする二重特異性分子であって、該ＣＡＲの受容体が、天然α１－α２ドメインよりも高い親和性で改変α１－α２ドメインに結合する非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインで構成されている二重特異性分子を作製する。次に、このようなＣＡＲで構成された免疫系の遺伝子操作された細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージは、下記の通り、現行のＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＮＫ細胞治療薬の既知の重篤な全身毒性及び抗原回避を含む問題点の多くを克服することができる（Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｌｅｖｉｎｅ，ＢＬ，Ｐｏｒｔｅｒ，ＤＬ，Ｋａｔｚ，Ｓ，Ｇｒｕｐｐ，ＳＡ，Ｂａｇｇ，Ａ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｃ．．Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１１；３：９５ｒａ７３；Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｋｉｔａｎｏ Ｍ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ，Ｌａｕｒｅｎｃｏｔ ＣＭ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．Ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ＥＲＢＢ２．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１０，１８：８４３－８５１；Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｊｕｎｅ ２０１５）。

【0024】

遺伝子導入技術を用いてＴ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを改変して、新規抗原特異性を付与する抗体の結合ドメインを直接かつ安定的にその表面上で発現させることができる（Ｓａａｒ Ｇｉｌｌ ＆ Ｃａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ．Ｇｏｉｎｇ ｖｉｒａｌ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１５．Ｖｏｌ．２６３：６８－８９；Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｇｌｉｅｎｋｅ，Ｒｕｔｈ Ｅｓｓｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｐｒｉｅｓｎｅｒ，Ｊｕｌｉａ Ｄ．Ｓｕｅｒｔｈ，Ａｘｅｌ Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ｗｉｎｆｒｉｅｄ Ｓ．Ｗｅｌｓ，Ｍａｎｕｅｌ Ｇｒｅｚ，Ｓｔｅｐｈａｎ Ｋｌｏｅｓｓ，Ｌｕｂｏｍｉｒ Ａｒｓｅｎｉｅｖ ａｎｄ Ｕｌｒｉｋｅ Ｋｏｅｈｌ．２０１５．Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＡＲ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１５．０００２１）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメインを、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３－ζ鎖の細胞内ドメインと組み合わせて、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０等の共刺激分子と共に単一のキメラタンパク質にするこのアプローチの用途である、図２。このように構築されたＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体と同様であるが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に依存しない方法で、標的とする抗原に結合した際にＴ細胞の活性化を惹起することができる。

【0025】

本明細書で使用するとき、「可溶性ＭＩＣタンパク質」、「可溶性ＭＩＣＡ」、及び「可溶性ＭＩＣＢ」とは、ＭＩＣタンパク質のα３ドメインの有無にかかわらずα１－α２ドメインを含有するが、膜結合モチーフ、膜貫通ドメイン、又は細胞内ドメインは含まないＭＩＣタンパク質を指す。ＮＫＧ２ＤリガンドであるＵＬＢＰ１～６は、天然ではα３ドメインを保有していない（Ｃｅｒｗｅｎｋａ Ａ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ．２００４．ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ：ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６１（５）：３３５－４３．ｄｏｉ：１０．１０３４／ｊ．１３９９－００３９．２００３．０００７０．ｘ．ＰＭＩＤ１２７５３６５２）。ＮＫＧ２Ｄリガンドの「α１－α２ドメイン」とは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するリガンドのタンパク質ドメインを指す。

【0026】

幾つかの実施形態では、本発明の非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質のα１－α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄリガンドのネイティブ又は天然のα１－α２ドメイン、配列番号１～１９と少なくとも８０％同一又は相同である。他の実施形態では、改変α１－α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄリガンドのネイティブ又は天然のα１－α２ドメインと８５％同一である。更に他の実施形態では、改変α１－α２ドメインは、天然ＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質のネイティブ又は天然のα１－α２ドメインと９０％同一であり、非天然ＮＫＧ２Ｄに結合する。

【0027】

可溶性ＭＩＣタンパク質のα１－α２プラットフォームドメインは、哺乳類の細胞間又は血管内の空間で拡散可能である。好ましくは、本発明の非天然ＭＩＣタンパク質のα１－α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡ又はＭＩＣＢタンパク質のネイティブ又は天然のα１－α２ドメインと少なくとも８０％同一又は相同であり、天然ＮＫＧ２Ｄに結合するか、又は特定の例では、改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。幾つかの実施形態では、α１－α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡ、ヒトＭＩＣＢ、又はヒトＵＬＢＰ１～６タンパク質のネイティブ又は天然のα１－α２プラットフォームドメインと８５％同一であり、天然ＮＫＧ２Ｄ又は改変非天然ＮＫＧ２Ｄに結合する。他の実施形態では、α１－α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡ、ヒトＭＩＣＢ、又はヒトＵＬＢＰ１～６タンパク質のネイティブ又は天然のα１－α２プラットフォームドメインと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体又は改変非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。

【0028】

幾つかの実施形態では、可溶性ＭＩＣタンパク質の精製を支援するために、α１－α２ドメイン又は別の可溶性ＭＩＣタンパク質のＮ末端又はＣ末端に異種ペプチドタグを融合させてもよい。タグ配列は、ポリヒスチジン、ｍｙｃ－ペプチド、又はＦＬＡＧタグ等のペプチドを含む。このようなタグは、当業者に公知の方法によってＭＩＣ分子の単離後に除去することができる。

【0029】

本発明の他の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１－α２ドメインに特定の変異を加えて、それ自体が天然ＮＫＧ２Ｄリガンドに対してより低い親和性を有するように遺伝子操作されている非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する非天然α１－α２ドメインを作製することができる。これは、例えば、遺伝子操作を通して行うことができる。このように改変された非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を用いて、免疫系のＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、又は幹細胞の表面上に、本発明の非天然α１－α２ドメインで構成される分子に優先的に結合し、そして、それによって活性化され得る非天然ＮＫＧ２Ｄベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製することができる。非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体とその本発明の同種非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドとのこれら対は、下記の通り、現行のＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞と比較して、がん及びウイルス感染症を治療するために重要な安全性、有効性、及び製造上の利点をもたらすであろう。

【0030】

ＣＡＲによるＴ細胞の遺伝子操作は、がんに対する養子Ｔ細胞療法の有望なアプローチとして浮上してきており、多くの異なる分子を標的とするＣＡＲが、悪性腫瘍の治療薬としてＣＡＲ－Ｔ細胞で試験されている（Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａｌｏｓ Ｍ，，Ｂａｇｇ Ａ，Ｊｕｎｅ ＣＨ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６５：７２５－７３３．）。ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入を受けた何百人もの患者において顕著な臨床的有効性が観察されているが、特定の抗原を標的とするＣＡＲのカスタム遺伝子操作、患者からの自己Ｔ細胞の単離、個別化されたＣＡＲを発現させるための自己Ｔ細胞の遺伝学的操作、インビトロにおける改変細胞の増殖、及び品質の制御、その生成のプロセスは、全て煩雑かつ高価であった。現在、これは、豊富な専門知識及び資源を有する大規模な学術センターの状況でのみ実現可能である（Ｇｉｌｌ ＆ Ｊｕｎｅ，２０１５）。

【0031】

自己ＣＡＲ－Ｔ細胞がドナー患者に再注入されると、そのインビボにおける増殖を制御することはできず－－－「リビング・セラピー」、有効性との用量応答関係は存在しない（Ｇｉｌｌ ＆ Ｊｕｎｅ，２０１５）。更に、抗原喪失回避を通してＣＡＲ Ｔ細胞からの腫瘍回避が生じ得（Ｓｔｅｐｈａｎ Ａ．Ｇｒｕｐｐ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｈ．Ｄ．，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋａｌｏｓ，Ｐｈ．Ｄ．，Ｄａｖｉｄ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｈ．Ｄ．，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｐｌｅｎｃ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｈ．Ｄ．，Ｄａｖｉｄ Ｌ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｕｓａｎ Ｒ．Ｒｈｅｉｎｇｏｌｄ，Ｍ．Ｄ．，Ｄａｖｉｄ Ｔ．Ｔｅａｃｈｅｙ，Ｍ．Ｄ．，Ａｎｎｅ Ｃｈｅｗ，Ｐｈ．Ｄ．，Ｂｅｒｎｄ Ｈａｕｃｋ，Ｐｈ．Ｄ．，Ｊ．Ｆｒａｓｅｒ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐｈ．Ｄ．，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｈ．Ｄ．，Ｂｒｕｃｅ Ｌ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｈ．Ｄ．，ａｎｄ Ｃａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｍ．Ｄ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６８：１５０９－１５１８）、この回避経路は、異なって標的化されるＣＡＲ－Ｔ細胞による連続治療によって又は２つ以上の特異性を有するＣＡＲを含有するＴ細胞製品を最初に注入することによって最も容易に対処することができるが、製造プロセス及び品質管理が更に複雑になる。

【0032】

一本鎖抗体結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を用いて腫瘍を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞に加えて、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド結合ドメインを用いるＣＡＲ－Ｔ細胞が動物で、そして最近ではヒトでも研究されている（Ｓｅｎｔｍａｎ ＣＬ，Ｍｅｅｈａｎ ＫＲ．ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲｓ ａｓ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４ Ｍａｒ－Ａｐｒ；２０（２）：１５６－９．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＰＰＯ．００００００００００００００２９；Ｍａｎｆｒｅｄ Ｌｅｈｎｅｒ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｇoｔｚ，Ｊｕｌｉａ Ｐｒｏｆｆ，Ｎｉｅｌｓ Ｓｃｈａｆｔ，Ｊａｎ Ｄoｒｒｉｅ，Ｆｌｏｒｉａｎ Ｆｕｌｌ，Ａｒｍｉｎ Ｅｎｓｓｅｒ，Ｙｖｅｓ Ａ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ａｄｅｌｈｅｉｄ Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ｈｉｎｒｉｃｈ Ａｂｋｅｎ，Ｏｒｎｅｌｌａ Ｐａｒｏｌｉｎｉ，Ｐｅｔｅｒ Ｆ．Ａｍｂｒｏｓ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｋｏｖａｒ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｈｏｌｔｅｒ．Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｅｗｉｎｇ’ｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＮＫＧ２Ｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｒ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｒｔｉｃｌｅ ｜ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ １５ Ｆｅｂ ２０１２ ｜ ＰＬＯＳ ＯＮＥ １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３１２１０；ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０２２０３８２５）。ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、腫瘍細胞及びウイルスに感染した細胞等のストレスを受けた細胞の表面上で増加することから、この天然ＮＫＧ２Ｄリガンドのファミリーは、ウイルス感染症及びがん免疫療法の標的として大きな関心を集めている（Ｓｐｅａｒ Ｐ，Ｗｕ ＭＲ，Ｓｅｎｔｍａｎ ＭＬ，Ｓｅｎｔｍａｎ ＣＬ．ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．２０１３ Ｍａｙ １；１３：８．；Ｓｏｎｇ ＤＧ，Ｙｅ Ｑ，Ｓａｎｔｏｒｏ Ｓ，Ｆａｎｇ Ｃ，Ｂｅｓｔ Ａ，Ｐｏｗｅｌｌ ＤＪ Ｊｒ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｔｔａｃｋ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ｍａｒ；２４（３）：２９５－３０５）。あるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、完全長ＮＫＧ２Ｄ受容体とＣＤ３ζとの融合体（ＮＫＧ２Ｄζ）であり；別のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、ＣＤ２８からの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインとＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとで構成される第２世代ＣＡＲスカフォールドに逆の配向で融合したＮＫＧ２Ｄの外部ドメインのみを有していた（ＮＫＧ２Ｄ２８ζ）。ＮＫＧ２Ｄの活性化はＤＡＰ１０の存在に依存しているため、ＤＡＰ１０をＮＫＧ２Ｄζと共発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞も構築した（ＮＫＧ２Ｄζ１０）。上記ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄリガンドの刺激に応答して

【0033】

【0034】

及びＴＮＦαを産生し、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍標的をインビトロで効率的に殺傷した（Ｈｅａｔｈｅｒ ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ，Ｊｏａｎｎｅ Ａ．Ｈａｍｍｉｌｌ，Ａｎｎａ Ｄｖｏｒｋｉｎ－Ｇｈｅｖａ，Ｄａｎｉｅｌａ Ｇ．Ｍ．Ｔａｎｔａｌｏ，Ｊａｃｅｋ Ｍ．Ｋｗｉｅｃｉｅｎ，Ｇａｌｉｎａ Ｆ．Ｄｅｎｉｓｏｖａ，Ｂｒｉａｎ Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｙｏｎｇｈｏｎｇ Ｗａｎ，Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｌ．Ｂｒａｍｓｏｎ，Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｅｔｈａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｃｃｅｐｔｅｄ ａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｅｖｉｅｗ ｏｎｌｉｎｅ ３０ Ｊｕｎｅ ２０１５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１１９）。また、ＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζをベースにしたＣＡＲを発現させることによって、広範囲の腫瘍サブタイプに対するＮＫ細胞の細胞傷害能を顕著に強化することもできた（Ｙｕ－Ｈｓｉａｎｇ Ｃｈａｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｏｒｉｋｏ Ｓｈｉｍａｓａｋｉ，Ｋｏｕｓａｋｕ Ｍｉｍｕｒａ，Ｋｏｊｉ Ｋｏｎｏ，ａｎｄ Ｄａｒｉｏ Ｃａｍｐａｎａ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ＮＫＧ２Ｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７３（６）Ｍａｒｃｈ １５，２０１３）。

【0035】

しかし、同系マウス宿主に注入した後、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の天然リガンドに結合し、それによって活性化されるこれらＣＡＲ－Ｔコンストラクトでは重度の毒性が生じた。ＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲ－Ｔ細胞で処理した担癌マウス及び非担癌マウスでは、未処理の対照マウスと比較して、体調不良、猫背の姿勢、努力呼吸、及び深部体温の低下を含む毒性の徴候が観察された。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の毒性の重篤度は様々であり、ＮＫＧ２Ｄζ１０は重度に毒性であり、ＮＫＧ２Ｄ２８ζは中等度の毒性を示し、ＮＫＧ２Ｄζは許容可能であった。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞を養子移入する前にマウスが化学療法を受けた場合、毒性の臨床症状及び死亡率が悪化した（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。化学療法及び放射線は、それを行わなければ健常な組織においてＮＫＧ２Ｄリガンドを誘導することが知られている（Ｘｉｕｌｏｎｇ Ｘｕ，Ｇｅｅｔｈａ Ｓ Ｒａｏ，Ｖｅｒｏｎｉｋａ Ｇｒｏｈ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｐｉｅｓ，Ｐａｏｌｏ Ｇａｔｔｕｓｏ，Ｈｏｗａｒｄ Ｌ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｊａｎｅｔ Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ Ｐｒｉｎｚ． Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ａ／Ｂ（ＭＩＣＡ／Ｂ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ｕｒｉｃ ａｃｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＩＣＡ／Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１，１１：１９４ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２４０７－１１－１９４；Ｇａｎｎａｇe Ｍ，Ｂｕｚｙｎ Ａ，Ｂｏｇｉａｔｚｉ ＳＩ，Ｌａｍｂｅｒｔ Ｍ，Ｓｏｕｍｅｌｉｓ Ｖ，Ｄａｌ Ｃｏｒｔｉｖｏ Ｌ，Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ Ｍ，Ｂｒｏｕｓｓｅ Ｎ，Ｃａｉｌｌａｔ－Ｚｕｃｍａｎ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｇａｍｍａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ ｍａｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄａｍａｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００８ Ｍａｒ ２７；８５（６）：９１１－５．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＴＰ．０ｂ０１３ｅ３１８１６６９１ｅｆ．）。更なる特性評価により、この毒性は全身サイトカインストーム及び肺内の致死レベルの炎症と同時に発生することが明らかになった。これらデータは、標的免疫療法のために天然ＮＫＧ２Ｄリガンドを使用する際には細心の注意を払わなければならないと警告し、強い活性化作用を有するＣＡＲのＴ細胞発現を強化することは、インビボでは有害である場合があることを示す（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。

【0036】

天然ＮＫＧ２Ｄリガンドには結合しない又はわずかにしか結合しない非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインで構成されたＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、及びマクロファージは、上記の形態の活性化を受けないため、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体をベースとするＣＡＲを発現する細胞ほど毒素原性が高くない。更に、細胞上の非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインは、可溶性フォーマットの天然ＮＫＧ２Ｄリガンドによる又は骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）におけるダウンレギュレーションを受けない（Ｄｅｎｇ Ｗ，Ｇｏｗｅｎ ＢＧ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｌａｕ Ｓ，Ｉａｎｎｅｌｌｏ Ａ，Ｘｕ Ｊ，Ｒｏｖｉｓ ＴＬ，Ｘｉｏｎｇ Ｎ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ，２０１５．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａ ｓｈｅｄ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５ Ａｐｒ ３；３４８（６２３０）：１３６－９．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８８６７．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｍａｒ ５）。しかし、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインを有するこのようなＣＡＲ細胞が、本発明の同種非天然α１－α２ドメイン及びその意図する標的を見つけ、結合しているその異種ターゲティングモチーフを有する二重特異性分子と会合すると、ＣＡＲが活性化し、ＣＡＲ細胞のエフェクター機能が発現する。ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、及びＣＡＲ－マクロファージ細胞のエフェクター機能は、標的となる細胞の生存率又は機能を低下させたり、損なわせたりすることができる。標的となる細胞としては、悪性細胞、腫瘍の免疫抑制細胞、自己免疫疾患の原因となる細胞、例えばＨＩＶ、肝炎ウイルス、ＨＴＬＶ－１、ＣＭＶ、ＥＢＶ、及び他のヘルペスウイルスであるがこれらに限定されないウイルスに感染した細胞を挙げることができる。

【0037】

非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインで構成されるＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞は、同種非天然α１－α２ドメインで構成される会合した二重特異性分子の存在下を除いて活性化されないので、投与される二重特異性分子によってその活性化を制御することができ、該分子は、バイオ医薬品として、当技術分野において周知である薬物動態及び薬力学を示す。有害事象が発生した場合、医師は、現在行われているように、注入したＣＡＲ細胞を破壊するための誘導性自殺機序を展開する必要はなく、投与する二重特異性分子の投与レジメンを単に変更するだけでよい（Ｍｏｎｉｃａ Ｃａｓｕｃｃｉ ａｎｄ Ａｔｔｉｌｉｏ Ｂｏｎｄａｎｚａ．Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１１；２：３７８－３８２）。更に、異なる特異的ターゲティングモチーフを有するこのような二重特異性分子を同時に又は逐次投与して、複数の異なる自己ＣＡＲ細胞を作製、増殖、及び注入する必要なく、標的抗原が失われた結果として腫瘍細胞又はウイルス感染細胞の抵抗性及び回避の発生に対処するのを支援することができる（Ｇｉｌｌ ＆ Ｊｕｎｅ，２０１５）。全てのＣＡＲの構築は、全てのＣＡＲ細胞に対して同一であってよく、ターゲティング特異性は、単に生成された本発明の二重特異性分子のターゲティングモチーフによって決定されるので、製造プロセスが簡略化され、より安価になる。

【0038】

多くのウイルスは、自然免疫監視システム、特にＮＫＧ２Ｄ依存性成分による宿主細胞の殺傷を回避するための機序を進化させてきた。例えば、アデノウイルス、巨細胞封入体ウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、及びパピローマウイルスは、いずれも１つ以上の機序を保有している。このようなウイルスは、感染した宿主細胞の表面上でウイルス抗原を発現させることができ、そのエピトープは、抗体、抗体の断片、又は他の分子ターゲティングモチーフが結合するためのウイルス特異的分子標的として機能し得る。これら細胞表面に露出している分子標的は、ウイルス感染の拡大を防いだり、ウイルス感染細胞を排除することによってウイルス感染を治療したりするための抗体又は養子細胞療法（ＡＣＴ）の標的として魅力的である。

【0039】

ＨＩＶ－１の潜伏感染は、急性感染の初期に確立され、主にメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞内でみられる。このリザーバは、ほとんど転写されていないが、抗原若しくはサイトカインの刺激によって宿主細胞が再活性化されたとき又は抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）が中断されたときに、感染性のウイルスを十分に生成することができる。潜伏感染ＨＩＶリザーバは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の９８％超が存在しているリンパ組織に主にみられる。ＡＲＴはウイルスの複製を抑制することができるが、潜伏感染リザーバを根絶することはできない（Ｒｕｅｌａｓ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ Ｗ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｌａｔｅｎｃｙ．Ｃｅｌｌ，２０１３．１５５（３）：ｐ．５１９－２９．）。潜伏ＨＩＶ－１を一掃するための試みは、当初、サイトカイン又はＴ細胞受容体活性化剤を用いて潜伏プロウイルスを再活性化することに重点的に取り組んでいた。しかし、これら戦略の結果、重度の副作用が生じ、有効性は低かった。その代わり、いわゆる「ショック・アンド・キル」戦略は、ＨＩＶ－１の転写を誘導することができる化合物である潜伏感染反転剤（ＬＲＡ）を投与することを通して、転写されていないプロウイルスを再活性化させることを含む（Ｃａｒｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｋ．Ｆｕｊｉｎａｇａ，ａｎｄ Ｂ．Ｍ．Ｐｅｔｅｒｌｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＨＩＶ ｌａｔｅｎｃｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１６．１２６（２）：ｐ．４４８－５４．）。潜伏ウイルスを再活性化すると、活性化した細胞の表面上でＨＩＶエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１６０が発現し、ｇｐ１２０及びｇｐ４１に加工される。ｇｐ１２０のドメインＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｃ１、Ｃ２、及びＮセグメントは、中和抗体、そして、本発明に記載の通りのＣＡＲ－Ｔ細胞でＨＩＶ感染細胞を攻撃するための魅力的な標的を与える。

【0040】

潜伏感染細胞を再活性化した後、これら細胞はウイルスを産生し（これはＡＲＴの投与により停止される）、そして、これら細胞はウイルスの細胞変性作用によるアポトーシスによって死滅し、それによって、潜伏リザーバのサイズが減少すると予測された。この仮説を検証すると、再活性化された細胞は死滅せず、潜伏リザーバのサイズも縮小しないことが示された（Ｓｈａｎ Ｌ，Ｄｅｎｇ Ｋ，Ｓｈｒｏｆｆ ＮＳ，Ｄｕｒａｎｄ ＣＭ，Ｒａｂｉ ＳＡ，Ｙａｎｇ ＨＣ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｍａｒｇｏｌｉｃｋ ＪＢ，Ｂｌａｎｋｓｏｎ ＪＮ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ ＲＦ，Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ａｆｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１２；３６（３）ｐ．４９１－５０１．）。リザーバの再活性後も２つの主な問題が存在する。第１は、ＣＴＬによる殺傷に対して抵抗性を有するウイルスの出現に関する（Ｄｅｎｇ Ｋ，Ｐｅｒｔｅａ Ｍ，Ｒｏｎｇｖａｕｘ Ａ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｄｕｒａｎｄ ＣＭ，Ｇｈｉａｕｒ Ｇ，Ｌａｉ Ｊ，ＭｃＨｕｇｈ ＨＬ，Ｈａｏ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，，ＪＢ，Ｇｕｒｅｒ Ｃ，Ｍｕｒｐｈｙ ＡＪ，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ＤＭ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ，Ｄｅｅｋｓ ＳＧ，Ｓｔｒｏｗｉｇ Ｔ，Ｋｕｍａｒ Ｐ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ ＪＤ， Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ，Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ，Ｓｈａｎ Ｌ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ ＲＦ Ｂｒｏａｄ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｃｌｅａｒ ｌａｔｅｎｔ ＨＩＶ－１ ｄｕｅ ｔｏ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊａｎ １５；５１７（７５３４）ｐ．３８１－５．）。これは、感染の最初の６カ月間にＡＲＴ治療を受けなかった慢性感染個体（慢性感染個体の大多数）に共通する問題である。第２の問題は、ＣＴＬがＨＩＶ関連の慢性炎症に曝露されて、ＣＴＬが疲弊することに起因する（Ｃｅｌｌａ Ｍ，Ｐｒｅｓｔｉ Ｒ，Ｖｅｒｍｉ Ｗ，Ｌａｖｅｎｄｅｒ Ｋ，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ Ｅ，Ｏｃｈｓｅｎｂａｕｅｒ－Ｊａｍｂｏｒ Ｃ，Ｋａｐｐｅｓ ＪＣ，Ｆｅｒｒａｒｉ Ｇ，Ｋｅｓｓｅｌｓ Ｌ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｉ；ＣＨＡＶＩ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｅ Ｂ，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＡＪ，Ｈａｙｎｅｓ ＢＦ，Ｂｏｒｒｏｗ Ｐ，Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ；ＮＩＡＩＤ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ＤＮＡＭ－１ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ａｐｒ；４０（４）：ｐ．９４９－５４．）。ウイルス抵抗性及び細胞疲弊の問題を回避する、再活性化したリザーバ細胞を死滅させるための新たなアプローチが必要であると考えられる。本発明者らは、再活性化したリザーバ細胞を殺傷するためにＣＴＬを標的とする広域中和ＨＩＶ抗体を利用する、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築を提案する。

【0041】

このように、本発明は、ＡＣＴのこれら現行の認識されている課題の多くを克服すると同時に、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、及び／又はマクロファージを用いて癌又はウイルス感染を管理する、この注目に値する非常に有望な免疫学的アプローチの多様性及び実用性を拡大する。

【0042】

本明細書で使用するとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は互換的に使用され；「異種分子」、「異種ペプチド」、「異種配列」、又は「異種原子」は、それぞれ、天然では又は通常は対象となる分子と物理的に結合した状態ではみられない分子、ペプチド、核酸若しくはアミノ酸の配列、又は原子である。本明細書で使用するとき、「非天然」及び「改変」は互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「天然」及び「ネイティブ」は互換的に使用され、「ＮＫＧ２Ｄ」及び「ＮＫＧ２Ｄ受容体」は互換的に使用される。用語「抗体」とは、本明細書では最も広い意味で用いられ、そして、具体的には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を網羅する。「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片（複数可）から形成される多特異性抗体が挙げられる。

【0043】

「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」、又は「特徴とする」と互換的に使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的又はオープンエンドな言語であり、そして、追加の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではない。語句「からなる」は、特許請求の範囲で指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。語句「から本質的になる」は、特許請求の範囲の範囲を、指定の材料又は工程、及び請求される発明の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を与えることのないものに限定する。本開示は、これら各語句の範囲に対応する本発明の組成物及び方法の実施形態を企図する。このように、列挙された要素又は工程を含む組成物又は方法は、該組成物又は方法がこれらの要素又は工程から本質的になる又はからなる特定の実施形態を企図する。

【0044】

本明細書に引用されている全ての参照文献は、既に明確に組み込まれていているかどうかにかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用するとき、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ａｎｙ」は、それぞれ単数形及び複数形の両方を含むことを意図する。

【0045】

ここまで本発明を十分に説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、また過度の実験を行うことなく、広範囲の等価なパラメータ、濃度、及び条件内でそれを実施できることが当業者には理解されるであろう。本発明をその具体的な実施形態に関連して説明してきたが、更なる変更が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般的には本発明の原理に従って本発明のあらゆる変形、使用、又は適応を網羅することを意図しており、本発明が属する技術分野における公知の又は慣習的な実施の範囲内であり、かつ本明細書に記載された本質的な特徴に適用することができる場合、本開示からの逸脱を含むものである。

【実施例】

【0046】

実施例１（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１－α２ドメイン。）これらは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体への結合親和性を著しく強化するように改変されたＮＫＧ２ＤＬにポリペプチドを結合させる実施例である。ＭＩＣタンパク質のα１－α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するＮＫＧ２ＤＬである。この親和性は、ＮＫ細胞を生理学的に活性化し、「標的細胞」の二次元原形質膜表面に不可逆的に繋留されたネイティブな完全長ＭＩＣタンパク質を発現している細胞の溶解を刺激するのに十分である（Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｇｒｏｈ Ｖ，Ｗｕ Ｊ，Ｓｔｅｉｎｌｅ Ａ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＪＨ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ，Ｓｐｉｅｓ Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９ Ｊｕｌ ３０；２８５（５４２８）：７２７－９．）。しかし、本発明の遺伝子操作された可溶性ＭＩＣタンパク質は、標的細胞の表面上の特異的標的抗原に可逆的に結合するので、遺伝子操作された可溶性ＭＩＣタンパク質のＮＫＧ２Ｄへの結合親和性は、ＮＫ細胞と標的抗原を発現している細胞との間に形成される可溶性ＭＩＣ依存性複合体の安定性に直接影響を与える。特に、ＮＫＧ２Ｄからの改変ｓＭＩＣＡの解離速度又はオフレートが実質的に遅くなることによってｓＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の親和性が増大する場合、標的細胞に結合している可溶性ＭＩＣ分子の密度が低いほど、ＮＫ細胞をベースとする殺傷効果がより大きくなると予測される。本発明以前には、可溶性ＭＩＣタンパク質の殺傷活性を変化させたり、結合オフレートを著しく低下させてＭＩＣタンパク質のＮＫＧ２Ｄへの親和性を強化したりするいかなるα１－α２変異も同定されていなかった。コンピュータによる設計の試みにより、野生型ＭＩＣＡのα１－α２ドメインにおける３つの変異：Ｎ６９Ｗ、Ｋ１５２Ｅ、及びＫ１５４Ｄ（ＷＥＤ－ＭＩＣＡ）を組み合わせると、結合していないＭＩＣＡの安定性に影響を与え、それによって、そのＮＫＧ２Ｄへの会合速度又は結合のオンレートに影響を与えることにより、ＮＫＧ２Ｄの結合親和性に中程度の影響を与え得ることが示された（Ｌｅｎｇｙｅｌ ＣＳ，Ｗｉｌｌｉｓ ＬＪ，Ｍａｎｎ Ｐ，Ｂａｋｅｒ Ｄ，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ Ｔ，Ｓｔｒｏｎｇ ＲＫ，ＭｃＦａｒｌａｎｄ ＢＪ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｏｃｔ １９；２８２（４２）：３０６５８－６６．Ｅｐｕｂ ２００７ Ａｕｇ ８）；その後、公開されている構造記述に従って、理論的にＮＫＧ２Ｄと接触するＭＩＣＡの２２個のアミノ酸位置を反復計算によって走査する、同じグループによる広範なコンピュータによる設計研究により（Ｌｉ Ｐ，Ｍｏｒｒｉｓ ＤＬ，Ｗｉｌｌｃｏｘ ＢＥ，Ｓｔｅｉｎｌｅ Ａ，Ｓｐｉｅｓ Ｔ，Ｓｔｒｏｎｇ ＲＫ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｍａｙ；２（５）：４４３－４５１）、先に設計された３つの変更と組み合わせたとき、ＭＩＣＡを更に合理的、反復的にコンピュータで設計すると、合計７つの複合変異によってＮＫＧ２Ｄに対する親和性が弱（Ｋｄ約２．５μＭ）から中程度に緊密（Ｋｄ＝５１ｎＭ）に定性的に変化することが実験的に示された（Ｈｅｎａｇｅｒ，Ｓａｍｕｅｌ Ｈ．，Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．Ｈａｌｅ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｊ．Ｍａｕｒｉｃｅ，Ｅｒｉｎ Ｃ．Ｄｕｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｒｔｅｒ Ｊ．Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｍｅｇａｎ Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｊ．Ｂａｎ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ，Ｌｕｋｅ Ｄ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｌｉｓａ Ｋ．Ｓａｎｄｅｒｓ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ，２１０２，Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｎａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＩＣＡ－ＮＫＧ２Ｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１：１３９６－１４０２）。対照的に、本発明に記載の実験的アプローチでは、Ｌｅｎｇｙｅｌら（Ｌｅｎｇｙｅｌ ＣＳ，Ｗｉｌｌｉｓ ＬＪ，Ｍａｎｎ Ｐ，Ｂａｋｅｒ Ｄ，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ Ｔ，Ｓｔｒｏｎｇ ＲＫ，ＭｃＦａｒｌａｎｄ ＢＪ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｏｃｔ １９；２８２（４２）：３０６５８－６６．Ｅｐｕｂ ２００７ Ａｕｇ ８）の３つのＷＥＤ変化によって安定化されたＭＩＣＡから開始して、ＭＩＣＡのα１－α２ドメインとＮＫＧ２Ｄとの間のオフレートを減速させるＭＩＣＡのアミノ酸改変を実験的に選択した。

【0047】

この実施例は、オフレート結合キネティクスに影響を与えるα１－α２ドメイン内の選択されたアミノ酸位置に特定の変異を導入することを通して可溶性ＭＩＣタンパク質のＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改変し、それにより、本発明の非天然の標的となるＭＩＣ分子のＮＫ細胞を介した殺傷活性を変化させることに関する。

【0048】

遺伝子操作してＮＫＧ２Ｄに対する親和性が変化した可溶性非天然α１－α２ドメインを作製するために、α１－α２ドメインにおける５７残基を広範な変異誘発のために選択した（図１２）。α１－α２ドメインをコードしており、５７個のアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ変異原性コドンを含有する合成ＤＮＡライブラリを合成し、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質への融合体として個別にクローニングし、変異誘発されたα１－α２バリアントをディスプレイしているファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で産生させた（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．（２０１１）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｌｉｇｈｔ－ ａｎｄ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１１）。α１－α２ファージライブラリを、標的抗原として組み換えビオチン化ＮＫＧ２Ｄを用いて結合親和性の増大について選別し、遅い解離速度又はオフレートについて濃縮された高親和性バリアントを選択するために、意図的に延長した結合、延長した洗浄、及びファージクローンの溶出の反復ラウンドを繰り返した。特定のアミノ酸変異のセットは、α１－α２の６つの位置において高頻度で発生しており、ＮＫＧ２Ｄの結合親和性の強化された好ましいアミノ酸置換として選択した（図３、表１）。

【0049】

【表1】

【0050】

特定の発見された変異の異なる組み合わせを含む４つの代表的なバリアント１５、１６、１７、１８のα１－α２ドメインをコードしているＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号２１～２４）を合成した（表２）。

【0051】

【表2】

【0052】

上記例のＮＫＧ２ＤＬに対して、リンカーペプチドを用いてこれら４つの改変α１－α２ ＮＫＧ２ＤＬのそれぞれにポリペプチド等の異種分子を直接結合させた。異種分子が結合している改変ＮＫＧ２ＤＬからなる４つのＨｉｓタグ付きタンパク質（配列番号２５～２８）を昆虫細胞で発現させ、精製して、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性及びキネティック結合パラメータを特性評価した。競合結合ＥＬＩＳＡを用いて、４つの改変α１－α２バリアントの相対的ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を求めた。ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに可溶性野生型（ＷＴ）ＮＫＧ２ＤＬ、ｓＭＩＣＡタンパク質をコーティングして、ヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ試薬の結合パートナーを提供した。ＥＬＩＳＡウェルに４つのα１－α２バリアント並びにＷＴ及びＷＥＤ－α１－α２ドメイン（配列番号２０）の溶液を滴定（ｔｉｔｒａｔｅ）し、プレートにコーティングされたＷＴ ｓＭＩＣＡに対する２ｎＭヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃの結合を競合的に阻害させた。プレート上のＷＴ ＮＫＧ２ＤＬに結合しているヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃの濃度を、抗Ｆｃ－ＨＲＰ抗体を用いて検出した。図１３、パネルＡは、バリアント１６、１７、及び１８が０．７、０．６、０．５ｎＭのＩＣ_５０値を呈するのに対し、バリアント１５は１．７ｎＭのＩＣ_５０値を呈し、いずれもＮＫＧ２Ｄに対する結合がＷＴ ＮＫＧ２ＤＬに比べてそれぞれ２７倍、３２倍、３８倍、及び１１倍と著しく優れており、更に、ＷＥＤ－ＭＩＣＡよりも実質的に優れていることを示す（表３）。

【0053】

【表3】

【0054】

重要なことに、相対的なＩＣ_５０の差は、マウスＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するより優れた結合にも変換され、前臨床薬物開発において重要な特性である、ヒト及び非ヒトのＮＫＧ２Ｄ受容体にまたがって可溶性改変α１－α２ドメインの結合を改善する能力を示した。

【0055】

親和性の変化についての動力学的基礎を理解するために、表面コーティングされたビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄに対するα１－α２バリアントＮＫＧ２ＤＬの結合についてのオンレート及びオフレートの両方を、各１００ｎＭの改変α１－α２タンパク質でバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）を用いて測定した。ＩＣ_５０ ＥＬＩＳＡの結果と一致して、バリアント１６、１７、及び１８はそれぞれオフレートの著しい低下（ＷＴに対して１８倍）を示し、これが親和性の増大（ＷＴ ａ１－ａ２に対して約３０倍；表３）の主な原因である。バリアント１５は、１６、１７、及び１８と同様に遅いオフレートを示したが、オンレートは低下し、その結果、ＷＴよりも強いが、バリアント１６、１７、及び１８よりも弱い親和性を示した。バリアント１５（配列番号２５）とバリアント１６（配列番号２６）との間の唯一の違いはＫ１２５Ｎ対Ｋ１２５Ｌであったので、１２５位における変異はオンレートを明らかに変化させたが、オフレートの低下はＨ１６１Ｒ変異に起因していた。したがって、オフレートの著しい低下を通してＮＫＧ２Ｄに対するα１－α２親和性を高めるために、選択されたＮＫＧ２ＤＬ変異のセット（表１）を使用したが、特定の置換はオンレートも変化させ、その結果、下記の通りのＮＫ細胞介在性殺傷アッセイにおいて差動的な活性を有することが本発明で示された様々な漸増的な親和性の増加が得られた。

【0056】

ＦＧＦＲ３を発現している標的細胞のＮＫ細胞介在性溶解をリダイレクトするα１－α２親和性バリアントの能力は、カルセイン放出アッセイにおいてインビトロで実証された。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、ＦＧＦＲ３を異所的に発現しているカルセイン負荷Ｐ８１５標的細胞と共培養し、可溶性改変ＭＩＣタンパク質を用いて滴定した。図１５の結果は、ＦＧＦＲ３特異的可溶性ＭＩＣバリアントの殺傷活性が、遺伝子操作されたα１－α２親和性と相関していることを示した。具体的には、バリアント１６、１７、及び１８は、０．７８ｎＭのＷＴに比べて約１５倍高い殺傷力を示した。ＷＥＤ－ＭＩＣＡ（配列番号２０）は、ＷＴよりもほんのわずかに優れていた。したがって、本発明では、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合している可溶性ＭＩＣタンパク質のオフレートを低下させることによってＮＫＧ２Ｄの結合親和性を増大させ、その結果、予測通り殺傷能が増大したα１－α２ドメイン内のアミノ酸置換について説明する。オフレートを低下させるのではなくオンレートを上昇させることによってＷＴ ＭＩＣＡよりも幾分高いＮＫＧ２Ｄに対する親和性を呈したＷＥＤ－ＭＩＣＡは、標的細胞の殺傷の大きな改善は示さなかった。更に、ＷＥＤ－ＭＩＣＡはＷＴ ＭＩＣＡよりも実質的に低いマウスＮＫＧ２Ｄに対する結合を示したが、１５、１６、１７、及び１８のバリアントはそれぞれ、ヒト及びマウスの両方のＮＫＧ２Ｄに対してより高い親和性を示した。

【0057】

これらα１－α２ ＮＫＧ２ＤＬ親和性バリアント１５、１６、１７、及び１８は、結合しているポリペプチドのＮＫＧ２Ｄ受容体に対する結合親和性を高め、それによって、ＮＫ細胞介在性の標的細胞の溶解を強化した。

【0058】

実施例２．（ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１－α２ドメイン及びそれが結合する同種非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体）
ＭＩＣＡ及び他のＮＫＧ２Ｄリガンドのα１－α２ドメインは、既知の特定の部位でＮＫＧ２Ｄ受容体に結合し（Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００１；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｔａｎｊａ Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｓｈｕｙｕａｒｎ Ｆ．Ｙｕ，Ｄａｖｉｄ Ｂａｋｅｒ，ａｎｄ Ｒｏｌａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ．Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｃ－Ｔｙｐｅ Ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ Ｌｉｇａｎｄｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１１，４１１－４２２，Ａｐｒｉｌ，２００３）、そして、ＮＫＧ２Ｄ受容体を有する免疫細胞の活性化を駆動し、その結果、ＭＩＣＡ又は他のリガンドをディスプレイしている標的細胞を殺傷する。ファージディスプレイを用いて、ＮＫＧ２Ｄとの結合に関与している可能性が高い５７個の特定の部位で広範な変異誘発を行うことによって、ＭＩＣＡの非天然α１－α２ドメインを遺伝子操作した（図１６）。α１－α２ドメインをコードしており、５７個のアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ変異原性コドンを含有する合成ＤＮＡライブラリを合成し、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質への融合体として個別にクローニングし、変異誘発されたα１－α２バリアントをディスプレイしているファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０大腸菌細胞で産生させた（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３^ｒｄ，２０１１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｌｉｇｈｔ－ ａｎｄ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１１）。α１－α２ファージライブラリを、標的抗原として組み換えビオチン化ＮＫＧ２Ｄを用いて結合親和性の増大について選別し、遅い解離速度又はオフレートについて濃縮された高親和性バリアントを選択するために、意図的に延長した結合、延長した洗浄、及びファージクローンの溶出の反復ラウンドを繰り返した。α１－α２ドメインの９つの位置における特定のアミノ酸変異のセットを、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性の強化されたアミノ酸置換の好ましい部位として選択した。本発明者らは、特定の変異の異なる組み合わせを含む８つの代表的なバリアント（配列番号２９～３６）のα１－α２ドメインをコードしているＤＮＡポリヌクレオチドを合成した（表４）。

【0059】

【表4】

【0060】

８つのバリアントのα１－α２ドメインをコードしているＤＮＡポリヌクレオチドを、ＰＣＲプライマー（配列番号３７～３８）を用いて増幅した。Ｂｌｐ１及びＳａｐ１制限酵素を用いて、それぞれをＨｉｓタグ付きα１－α２－α３－Ｆｖ融合発現コンストラクト（配列番号３９）にサブクローニングして、天然（ｗｔ）α１－α２配列をコードしている配列を変異型α１－α２配列に置き換えた。９つの融合タンパク質（配列番号４０～４８）を２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現系、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ）で発現させ、Ｎｉ－アフィニティクロマトグラフィ（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてアフィニティ精製した。

【0061】

ＮＫＧ２Ｄ受容体タンパク質を構築するために、野生型受容体の細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）をコードしているＤＮＡ（配列番号４９）を合成し、ＰＣＲプライマー（配列番号５０～５１）並びにＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ部位を用いて、合成ＤＮＡをＮ末端Ｈｉｓ－ａｖｉｔａｇ発現ベクター（配列番号７８）にクローニングした。Ｈｉｓ－ａｖｉｔａｇ－天然ＮＫＧ２Ｄ（配列番号５２）を２９３細胞で一過的に発現させ、Ｎｉ－アフィニティクロマトグラフィを用いて精製した。精製後、ＢｉｒＡを用いてＮＫＧ２Ｄタンパク質を部位特異的にビオチン化して、ａｖｉｔａｇ配列にビオチン基を結合させた（ＢｉｒＡ ｂｉｏｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ．）。

【0062】

天然ＮＫＧ２Ｄに対する天然及び８つのバリアントのα１－α２ドメインのキネティック結合パラメータを特性評価し、比較するために、各１００ｎＭのα１－α２－α３－Ｆｖ融合タンパク質で、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）を用いて、表面コーティングされたビオチン化天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインへの結合を測定した。結果を表５に提示する。

【0063】

【表5】

【0064】

表５に示すように、配列番号４２～４８の異種ポリペプチドα３－Ｆｖへの融合体としての選択されたα１－α２ドメイン変異は、オフレートを著しく低下させることを通して天然ＮＫＧ２Ｄに対するα１－α２ドメインの親和性を増大させた。オフレートは、ｗｔ（配列番号４０）及び既述のＭＩＣｗｅｄ α１－α２ドメインバリアント（配列番号４１）よりも２０倍から１００倍超遅くなった。

【0065】

本発明のこの実施例では、以下に記載する通り、α１－α２－α３－Ｆｖ融合体として天然ＮＫＧ２Ｄ（表２；配列番号４３）に対する親和性が高く、それからのオフレートが非常に遅い非天然α１－α２ドメイン（ＤＳＭ２５、配列番号３１、表４）が、天然ＮＫＧ２Ｄリガンドへの結合を消失させる特定の変異を含む非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して緊密な結合親和性を示すことを更に実証した。ＮＫＧ２Ｄの外部ドメイン（配列番号４９及び図４）の７３位及び１２０位と等価なヒトＮＫＧ２Ｄのチロシン１５２及びチロシン１９９における変異が、天然リガンドであるＭＩＣＡへの結合を消失させることは、他の研究者によって実証されている（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋ．Ｍａｄｄｏｘ１，Ａｎｄｒｅｗ Ｂ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐａｉｒｓ ｉｎ ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｊａｎｕａｒｙ；４８（４）：５１６－５２３）。

【0066】

非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体タンパク質を構築するために、ＰＣＲプライマー（配列番号５０～５１）を用いて、天然ＮＫＧ２Ｄの外部ドメインをコードしているＤＮＡ（配列番号４９）をクローニングし、それをＮ末端Ｈｉｓ－ａｖｉｔａｇ発現ベクター配列番号５２に挿入してＨｉｓ－ａｖｉｔａｇ－ＮＫＧ２Ｄ（配列番号５３）を作製した。天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインのＤＮＡコンストラクトに対して部位特異的変異誘発を実施して、Ｙ１５２Ａ、Ｙ１９９Ａ、又はＹ１５２Ａ＋Ｙ１９９Ａの変異を導入し、ヒトＮＫＧ２Ｄの３つの非天然バリアントを作製した（それぞれ配列番号５４～５６）。天然ＮＫＧ２Ｄ及びＨｉｓ－ａｖｉｔａｇを有する３つの非天然ＮＫＧ２Ｄ変異体を２９３細胞で一過的に発現させ、Ｎｉ－アフィニティクロマトグラフィを用いて精製した。精製後、ＢｉｒＡを用いてＮＫＧ２Ｄタンパク質を部位特異的にビオチン化して、ａｖｉｔａｇ配列にビオチン基を結合させた（ＢｉｒＡ ｂｉｏｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ．）。

【0067】

α３－Ｆｃ異種ポリペプチドとＭＩＣｗｅｄのα１－α２ドメイン（配列番号２９）及びＤＳＭ２５のα１－α２ドメイン（配列番号３１）との融合体を生成するために、α１－α２ドメインをコードしているＤＮＡポリヌクレオチドを、ＰＣＲプライマー（配列番号３７～３８）を用いて増幅した。ＸｂａＩ及びＮｃｏＩ制限酵素を用いて、それぞれをα１－α２－α３－Ｆｃ融合発現コンストラクト（配列番号５７）にサブクローニングして、天然（ｗｔ）α１－α２配列をコードしている配列を変異型α１－α２配列に置き換えた。ＭＩＣＡ－Ｆｃ（配列番号５８）、ＭＩＣｗｅｄ－Ｆｃ（配列番号５９）、及びＭＩＣｖ２５－Ｆｃ（配列番号６０）の３つの融合タンパク質を２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ）で発現させ、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（カタログ番号２０３３４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてアフィニティ精製した。

【0068】

上記３つのＦｃ融合タンパク質の精製に加えて、ＮＫＧ２Ｄリガンド－Ｆｃ融合タンパク質ＭＩＣＢ－Ｆｃ、ＵＬＢＰ１－Ｆｃ、ＵＬＢＰ２－Ｆｃ、ＵＬＢＰ３－Ｆｃ、及びＵＬＢＰ４－ＦｃをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。異なるα１－α２ドメイン－Ｆｃ融合体の天然及び非天然の両ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインタンパク質への結合を、プレートベースのＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。天然及び非天然のα１－α２ドメイン－Ｆｃ融合体の全てを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２μｇ／ｍＬのコーティング濃度を用いて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートの別々のウェルに４℃で一晩コーティングした。プレートを２０～２２℃においてＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミンで２時間ブロックした。ビオチン化された天然及び非天然のＮＫＧ２Ｄ受容体タンパク質を、プレートに結合しているＮＫＧ２Ｄリガンドに対して２０～２２℃で２時間滴定し、２０～２２℃においてＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、結合しているＮＫＧ２Ｄタンパク質をストレプトアビジン－ＨＲＰ二次検出工程を用いて検出し、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ Ｅｌｉｓａで発色させた。ＮＫＧ２Ｄの外部ドメインの天然形態（配列番号４９）は、試験した全てのα１－α２ドメイン－Ｆｃ融合体に結合することができた。非天然ＭＩＣ－ｖ２５α１－α２ドメインリガンドは、最も高い親和性（ＥＣ_５０＝１４ｎＭ）で結合し、これは、ＭＩＣｗｅｄよりも８倍、試験した全ての天然α１－α２ドメインリガンドよりも１００倍超高かった。天然及び非天然のα１－α２ドメインの両方を含む全てのリガンドは、Ｙ１９９Ａ（配列番号５５；図１８、パネルＢ）及びＹ１５２Ａ＋Ｙ１９９Ａ（配列番号５６）二重変異体ＮＫＧ２Ｄ受容体への結合を失った。しかし、試験した全ての天然及び非天然のα１－α２ドメインリガンドのうち、ＭＩＣｖ２５－Ｆｃ（配列番号６０）の非天然α１－α２ドメイン（配列番号３１）のみが、Ｙ１５２Ａ変異体ＮＫＧ２Ｄ外部ドメイン（配列番号５４）への結合を保持しており、ＥＣ５０は５０ｎＭであった。

【0069】

天然のＮＫＧ２Ｄの結合特異性は、高親和性の非天然リガンドに対する選好性を示すが、特定の健常組織及び多くのストレスを受けた組織に存在する天然ＮＫＧ２Ｄリガンドへの強力な結合は、現行のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲアプローチを使用した場合、極めて高い毒性のリスクを生じさせる（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。Ｙ１５２Ａ非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体は、オフレートが顕著に低下するように遺伝子操作された高親和性非天然α１－α２ドメインで構成されるタンパク質のみに特異的に結合した。この原型的な例は、非天然α１－α２ドメインの非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する能力を強調するものであり、したがって、ＮＫＧ２Ｄリガンドの本発明の非天然α１－α２ドメインを含む二重特異性タンパク質を用いた非天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの選択的制御を提供した。

【0070】

実施例３（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１－α２ドメイン）。
この実施形態は、ＵＬＢＰタンパク質のα１－α２ドメインを遺伝子操作することを通して得られる追加のα１－α２ＮＫＧ２ＤＬ親和性バリアントに関する。ＵＬＢＰタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することができるＮＫＧ２Ｄリガンドであるα１－α２ドメインを含有する（Ｃｅｒｗｅｎｋａ Ａ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ（２００４）．ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ：ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６１（５）：３３５－４３．ｄｏｉ：１０．１０３４／ｊ．１３９９－００３９．２００３．０００７０．ｘ．ＰＭＩＤ１２７５３６５２）。このＮＫＧ２Ｄ結合の親和性は、ＮＫ細胞を生理学的に活性化し、「標的細胞」の二次元原形質膜表面に天然にかつ不可逆的に繋留されたネイティブな完全長ＵＬＢＰタンパク質を発現している細胞の溶解を刺激するのに十分である（Ｃｅｒｗｅｎｋａ Ａ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ（２００４）．ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ：ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６１（５）：３３５－４３．ｄｏｉ：１０．１０３４／ｊ．１３９９－００３９．２００３．０００７０．ｘ．ＰＭＩＤ１２７５３６５２）。しかし、本発明の特定の実施形態における異種ポリペプチドに融合している遺伝子操作された可溶性α１－α２ドメインは、標的細胞の表面上の特異的標的抗原に可逆的に結合するので、遺伝子操作されたＵＬＢＰα１－α２ドメインのＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性は、遺伝子操作された可溶性ＭＩＣタンパク質によって既に示されている通り、ＮＫ細胞と標的抗原を発現している細胞との間に形成される人工シナプスの安定性に直接影響を与える（実施例２１－２）。ＮＫＧ２Ｄリガンドとしての遺伝子操作された非天然α１－α２ドメインのレパートリーを多様化するために、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性をファージディスプレイに基づいて遺伝子操作するための基質又は出発点としてＵＬＢＰタンパク質を用いた。ＵＬＢＰとＭＩＣＡとの間で構造的な相同性が観察されているにもかかわらず（Ｒａｄａｅｖ，Ｓ．，Ｒｏｓｔｒｏ，Ｂ．，Ｂｒｏｏｋｓ，ＡＧ．，Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．，Ｓｕｎ，ＰＤ．（２００１）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ－ｌｉｋｅ Ｌｉｇａｎｄ ＵＬＢＰ３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５，１０３９－４９．）、ＭＩＣＡに対するＵＬＢＰα１－α２ドメインの配列相同性は＜５０％であった。したがって、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改善するＵＬＢＰα１－α２ドメインにおけるコドン位置を同定しようとした。

【0071】

ＵＬＢＰタンパク質からの可溶性非天然α１－α２ドメインを遺伝子操作するために、ファージディスプレイ及び高親和性ＮＫＧ２Ｄ結合を有する変異体の選択のためにＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３を選択した。ＵＬＢＰ２のα１－α２ドメイン（配列番号６１）における６０個のアミノ酸位置及びＵＬＢＰ３のα１－α２ドメイン（配列番号６２）における３６個のアミノ酸位置を、広範な変異誘発のために選択した。更に、ポリペプチドが結合しているＮＫＧ２Ｄリガンドの安定性及び機能を増大させることに加えてファージパニングプロセスを改善するために、ＵＬＢＰ２（配列番号６１）におけるＣ８Ｓ及びＵＬＢＰ３（配列番号６２）におけるＣ１０３Ｓにおいてシステインからセリンへの保存的変異を行い、対になっていない遊離システイン排除した。これらシステインがセリンに改変されたα１－α２ドメインをコードしており、選択されたアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ変異原性コドンを含有する合成ＤＮＡライブラリを合成し、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質への融合体として個別にクローニングし、変異誘発されたα１－α２ＵＬＢＰ２又はＵＬＢＰ３バリアントをディスプレイしているファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０大腸菌細胞で産生させた（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｌｉｇｈｔ－ ａｎｄ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１１）。α１－α２ファージディスプレイライブラリを、標的タンパク質としてヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃを用いてＮＫＧ２Ｄへの結合親和性の増大について選別し、遅い解離速度又はオフレートについて濃縮された高親和性バリアントを選択するために、意図的に延長した結合、延長した洗浄、及びファージクローンの溶出の反復ラウンドを繰り返した。ＵＬＢＰ２では、α１－α２におけるＲ８０位、Ｖ１５１位、Ｖ１５２位、Ａ１５３位に特定のアミノ酸変異が高頻度でみられ、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性の強化された好ましいアミノ酸置換として同定された（図１９、パネルＡ；及び表６）。

【0072】

【表6】

【0073】

ＵＬＢＰ３では、ＵＬＢＰ２と比べて異なる箇所において高頻度で特定のアミノ酸変異がみられた。ＵＬＢＰ３のα１－α２ドメインにおけるＲ１６２位及びＫ１６５位は、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性が強化された好ましいアミノ酸置換として同定された特定の変異を含んでいた（表７）。ＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３に由来するこれら改変非天然α１－α２ドメインは、単一のタンパク質として又は異種のペプチド若しくはポリペプチドとの融合体として、複数の治療フォーマットでＮＫＧ２Ｄ結合を強化するために使用することができる。

【0074】

【表7】

【0075】

実施例４（抗体ペプチドに融合したＵＬＢＰの改変α１－α２ドメインによる結合及び細胞溶解）
以下の実施例は、ヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄ受容体への結合親和性を著しく強化するように改変されたＮＫＧ２ＤＬに対する抗体ポリペプチドの結合に関する。各ＵＬＢＰタンパク質のα１－α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体の天然のリガンド、すなわちＮＫＧ２ＤＬである。抗体は、２本の大きな重鎖及び２本の小さな軽鎖で構成された安定性の高い糖タンパク質である（図１）。当技術分野では、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対してネイティブなＵＬＢＰドメインよりも緊密に結合する非天然ＵＬＢＰα１－α２ドメインを用いて免疫細胞を直接活性化することができるＩｇＧ抗体のフォーマットは存在していなかった。更に、ＵＬＢＰα１－α２ドメインは、ＭＩＣＡα１－α２ドメインと比べて異なるインビボでの特性を有し得る抗体融合体を構築するための代替ＮＫＧ２ＤＬを提供する。例えば、抗体融合体内のＭＩＣＡα１－α２ドメインに対するインビボ抗薬物抗体応答は、ＵＬＢＰとＭＩＣＡα１－α２ドメインとの間の配列相同性が低いことから、改変ＵＬＢＰα１－α２ドメインとは反応せず、干渉もしない可能性が高い（図５）。この実施例は、遺伝子操作されたＵＬＢＰα１－α２ＮＫＧ２Ｄリガンド（表６及び７）とＩｇＧ分子の重鎖との融合体が、天然ＵＬＢＰα１－α２ＮＫＧ２Ｄリガンドと比べてＮＫＧ２Ｄの結合及び標的細胞の殺傷を強化することを示す。このことは、改変α１－α２ドメインを異種のタンパク質又はペプチドに融合させることの有用性を更に実証するものである。

【0076】

遺伝子操作されたα１－α２ドメインの抗体への融合体を生成するために、ＵＬＢＰ２のＣ８Ｓ改変α１－α２ドメイン（配列番号６１）のバリアントＲ８０Ｗ及びＶ１５１Ｄ（それぞれ配列番号６３及び６４）、並びにＵＬＢＰ３のＣ１０３Ｓ改変α１－α２ドメイン（配列番号６２）のバリアントＲ１６２Ｇ（配列番号６５）をコードしているＤＮＡ配列を合成し、Ｈｅｒ２特異的抗体からの重鎖配列へのＣ末端融合体としてクローニングした（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．，Ｇｏｒｍａｎ，ＣＭ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，ＪＢ．，Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．，Ｗｏｎｇ，ＷＬ．，Ｒｏｗｌａｎｄ，ＡＭ．，Ｋｏｔｔｓ，Ｃ．，Ｃａｒｖｅｒ，ＭＥ．，Ｓｈｅｐａｒｄ，ＨＭ．（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １５，４２８５－９．）。得られた融合体を哺乳類発現ベクターｐＤ２５０９にクローニングし、対合したフルＩｇＧ抗体として親抗体の軽鎖と共に発現させた。製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を用いてＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させ、標準的なプロテインＡアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した。ＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３のα１－α２抗体重鎖融合体に対して実施した結合ＥＬＩＳＡは、改変ＵＬＢＰ２融合体（ＨＣ＿Ｒ８０Ｗ及びＨＣ＿Ｖ１５１Ｄ）及びＵＢＬＰ３融合体（ＨＣ＿Ｒ１６２Ｇ）が、同じ重鎖に融合するそれぞれの天然α１－α２ドメインと比べてヒトＮＫＧ２Ｄに対してより高い親和性で結合することを示した。

【0077】

改変ＵＬＢＰ抗体融合体の標的細胞殺傷特性を特徴付けるために、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、Ｈｅｒ２を発現しているカルセイン負荷ＳＫＢＲ３標的細胞と共培養し、遺伝子操作された抗体融合タンパク質を用いて滴定した。結果は、Ｈｅｒ２特異的な非天然ＵＬＢＰ２及び非天然ＵＬＢＰ３のα１－α２抗体融合体の細胞溶解（殺傷）活性の強化は、その遺伝子操作されたα１－α２ドメインのＮＫＧ２Ｄに対する親和性の強化を反映していることを示した。具体的には、ＵＬＢＰ２バリアント融合体ＨＣ＿Ｒ８０Ｗ及びＨＣ＿Ｖ１５１Ｄ、並びにＵＬＢＰ３バリアント融合体ＨＣ＿Ｒ１６２Ｇは、ネイティブα１－α２ドメインのいずれかを含有する抗体融合体よりも有効にＳＫＢＲ３細胞を殺傷した。これらデータは、改変α１－α２バリアント－抗体融合体が、ＩｇＧ分子がＮＫＧ２Ｄに緊密に結合し、抗原特異的細胞溶解を指示することを可能にするための普遍的なプラットフォームであることを示した。

【0078】

実施例５（Ｙ１５２Ａ非天然ＮＫＧ２Ｄに選択的に結合する直交性非天然α１－α２ドメインの構築）
毒性を軽減し、腫瘍に対する有効性を改善するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を選択的に制御するための手段が強く求められている（Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，前喝）。以前、後に治療用モノクローナル抗体のＦｃドメインを通して会合することができるＣＤ１６の外部ドメインを用いてＣＡＲを開発する試みが行われ、これにより、ＣＡＲ－Ｔターゲティングを抗体ベースで制御することが可能になった（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，前喝．しかし、ＣＤ１６ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞は、血液及び組織中の全ての内因性抗体分子を認識することができ、これら細胞を制御するために使用される治療用抗体は、ＮＫ細胞上の内因性ＣＤ１６受容体の干渉を受けることになる。これら両特徴は、それぞれ腫瘍外毒性及び薬物動態の不良に関連する問題を引き起こす。

【0079】

これら問題に対処するために、本発明者らは、遺伝子操作を行って、実施例２で示した通り、全ての天然ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合せず、高親和性非天然α１－α２ドメインの結合を通して制御することができる非天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。非天然α１－α２ドメインが、非天然ＮＫＧ２Ｄに対して高い親和性を保持し、天然ＮＫＧ２Ｄドメインへの結合を回避することが更に必要である。したがって、天然ＮＫＧ２Ｄよりも非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して強い選択性を示す遺伝子操作されたα１－α２ドメインは、非天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ受容体、又は非天然α１－α２ドメインが選択的に会合することができる非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインに融合した任意の受容体若しくはタンパク質を選択的に制御するための理想的なシステムを表す。

【0080】

本発明者らは、ファージディスプレイを用いて、遺伝子操作によりＹ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ受容体に選択的に結合する直交性非天然α１－α２ドメインを得た。出発点として、天然ＮＫＧ２Ｄに対して高い親和性を有する３つの非天然α１－α２ドメインを、更なる変異誘発及びファージディスプレイによるスクリーニングのための親ドメインとして選択した。個々のα１－α２ドメインバリアントであるＤＳＭ２５、ＵＬＢＰ２ Ｒ８０Ｗ、及びＵＬＢＰ３ Ｒ１６２Ｇ（配列番号３１、６３、及び６５）について合成ＤＮＡライブラリを作製し、それによって、結合状態においてＮＫＧ２Ｄ受容体のＹ１５２位に近接近して位置するアミノ酸残基のコドンをＮＮＫコドンに置き換えた。ＤＳＭ２５ライブラリは、残基７１～７５及び１５５～１５９におけるＮＮＫ位置からなり、ＵＬＢＰ２ Ｒ８０Ｗライブラリは１５４～１５９位にＮＮＫコドンを有し、ＵＬＢＰ３ Ｒ１６２Ｇライブラリは１５５～１５９位にＮＮＫコドンを有していた。ライブラリを、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質への融合体としてクローニングし、変異誘発されたα１－α２ドメインバリアントをディスプレイしているファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０大腸菌細胞で産生させた（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｌｉｇｈｔ－ ａｎｄ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１１）。α１－α２ファージディスプレイライブラリを、ビオチン化されていない天然ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ競合タンパク質の存在下で、ビオチン化されたＹ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質に結合しているファージクローンを選択的に捕捉することにより、非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する高い結合親和性について選別した。ビオチン化されていない天然ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃの濃度を増大させながら複数ラウンドの競合選択を繰り返すことによって、選択的クローンを濃縮した。

【0081】

４ラウンドの選択後、ファージクローンの配列を決定して、ＮＮＫ変異原性領域内の特定の変異を同定した。表８、９、及び１０は、Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄの選択的スクリーニングから得られた各α１－α２ドメインについて優勢であることが判明した、選択されたアミノ酸残基を示す。

【0082】

【表8】

【0083】

【表9】

【0084】

【表10】

【0085】

ファージクローンが適切な選択的結合をディスプレイしたことを確認するために、個々のクローン：ＭＩＣＡ２５．１７、ＭＩＣＡ２５．１８、ＵＬＢＰ２．Ｓ１、ＵＬＢＰ２．Ｓ２、ＵＬＢＰ２．Ｓ３、ＵＬＢＰ３．Ｓ１、及びＵＬＢＰ３．Ｓ２（それぞれ、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、及び７２）についてファージを生成し、結合ＥＬＩＳＡにおいてＹ１５２Ａ又は天然ＮＫＧ２Ｄに対して滴定した。図２３、パネルＡ～Ｃは、７つのファージクローン全てが、天然又は野生型のＮＫＧ２Ｄに比べて非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対して１０倍を超える選択的結合を示すことを実証した。

【0086】

Ｙ１５２Ａ選択的なα１－α２ドメインバリアントが、抗体融合体の枠内で特異的結合特性を保持していることを確認するために、既に記載されているＦＧＦＲ３特異的抗体の重鎖へのＣ末端融合体としてＭＩＣＡ２５．１７及びＵＬＢＰ２．Ｓ３をクローニングした（Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９．前喝；それぞれ配列番号７３及び７４）。得られた融合体を哺乳類発現ベクターｐＤ２５０９にクローニングし、対合したフルＩｇＧ抗体として親抗体の軽鎖と共に発現させた（Ｒ３ ＨＣ２５．１７及びＲ３ ＨＣ．Ｕ２Ｓ３）。製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を用いてＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させ、標準的なプロテイン－Ａアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した。Ｒ３ ＨＣ２５．１７及びＲ３ ＨＣ．Ｕ２Ｓ３ α１－α２抗体重鎖融合体の非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ及び天然ＮＫＧ２Ｄへの結合を測定したＥＬＩＳＡでは、天然のＮＫＧ２Ｄと比べてＹ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性が著しく高いことが実証された（図６、パネルＢ及びＤ）。対照的に、ＤＳＭ２５及びＵＬＢＰ２ Ｒ８０Ｗに対する抗体融合体は、天然ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対する優先的な結合を示した（図６、パネルＡ及びＣ）。まとめると、これらデータは、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して高い親和性結合を保有し、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する結合親和性が著しく低下している非天然直交性α１－α２ドメインの発明を実証した。更に、直交性α１－α２ドメインの抗体ポリペプチドへの融合体は、その選択的結合特性を保持しており、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の枠内で非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を新しい抗原にリダイレクトするために使用することができる。

【0087】

実施例６（非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲティング及び殺傷活性は、ターゲティング抗体に融合した直交性α１－α２ドメインを用いて制御される）。
非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを配備するキメラ受容体を用いて構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞の選択的制御を実証するために、それぞれのＮＫＧ２Ｄ外部ドメインをＣＡＲのＣＤ８ヒンジ領域（図２）に融合させた４－１ＢＢ／ＣＤ３ｚｅｔａ ＣＡＲコンストラクト（Ｃａｍｐａｎａ特許第８，３９９，６４５号）を用いて、先行研究に基づいて天然ＮＫＧ２Ｄ又は非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインのいずれかを有するＣＡＲを構築した。これらコンストラクトをレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルス形質導入を用いて初代ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞で発現させた。得られた天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞で発現している天然ＭＩＣＡリガンドを認識することと一致して、インビトロで特異的な細胞殺傷活性を示した。具体的には、結果は、天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は天然ＭＩＣＡリガンドを発現しているＰ１細胞を殺傷したが、非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は能力が著しく失われ、ＭＩＣＡを発現しているＰ１細胞の殺傷が大きく減少したことを示した。更に、直交性α１－α２抗体重鎖融合体であるＲ３ ＨＣ２５．１７及びＲ３ ＨＣ．Ｕ２Ｓ３は、非天然Ｙ１５２Ａ ＣＡＲ－Ｔ細胞を選択的に活性化して、ＦＧＦＲ３を発現しているＰ１標的細胞を殺傷したが、天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性をリダイレクトすることはできなかった。これは、非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに対して選択的ではなく、天然及び非天然のＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化してＰ１標的細胞を殺傷したＲ３ ＨＣ２５及びＲ３ ＨＣ．Ｕ２Ｒ８０Ｗ α１－α２抗体重鎖融合体とは対照的であった。これらデータは、非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄに選択的に結合するように遺伝子操作された非天然直交性α１－α２ドメインが、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を回避しながら、非天然Ｙ１５２Ａ ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞を特異的に活性化することを示した。

【0088】

実施例７（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ非天然ＮＫＧ２Ｄに選択的に結合する直交性非天然α１－α２ドメインの構築）
ＮＫＧ２Ｄの外部ドメイン（配列番号４９）の７３位及び１２０位と等価なヒトＮＫＧ２Ｄのチロシン１５２又はチロシン１９９における変異が、天然リガンドであるＭＩＣＡへの結合を大きく減少させることができることは、他の研究者によって実証されている（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋ．Ｍａｄｄｏｘ，Ａｎｄｒｅｗ Ｂ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐａｉｒｓ ｉｎ ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｊａｎｕａｒｙ；４８（４）：５１６－５２３）。本発明者らは、いずれかのチロシン残基の変異はＮＫＧ２Ｄのその天然リガンドへの結合能力に大きな影響を与えたが、チロシン１５２（Ｙ１５２）及びチロシン１９９（Ｙ１９９）の両方が同時に変異すると、全てのネイティブリガンドと会合する受容体の能力が実質的になくなると考えた。したがって、本発明者らは、任意の天然のリガンドと会合することができない単一及び二重の変異体バリアントを両方同定する目的で、Ｙ１５２及びＹ１９９の個々の及び組み合わせの置換を探索し、その生化学的な挙動に関して特性評価した。うまく発現し、組み立てられたバリアントは、特に興味深いものであったが、それは、これらが、分析のためにより容易に生成することができた不活性リガンドであることを意味したためである。

【0089】

天然ＮＫＧ２Ｄ（野生型）の外部ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、配列番号４９）及び候補となる非天然ＮＫＧ２Ｄバリアントの外部ドメイン（配列番号７５～９２）（「遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄ」又は「ｅＮＫＧ２Ｄ」とも呼ばれる）を、短い第Ｘａ因子が認識可能なＩｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇリンカー（配列番号９３）を介して、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆａｂドメインを含まない）のＣ末端に融合体としてクローニングし、互換的にＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ又はＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ及びＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ又はｅＮＫＧ２Ｄ（配列番号９４～１１２）と称する。ＭＨＣＩシグナル配列（配列番号１１３及び１１４）、リンカー付きヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１１５）、及びＮＫＧ２Ｄ外部ドメインバリアント（配列番号１１６～１２４）に対応するｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）ＤＮＡ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を合成し、ｐＤ２６１０－Ｖ１２（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）に挿入した。Ｙ１５２、Ｙ１９９における置換、又はＹ１５２／Ｙ１９９変異の組み合わせ（表１）を探索するＤＮＡコンストラクトをＥｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で一過性に発現させ、分泌されたタンパク質をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（カタログ番号２０３３４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって精製した。溶出した物質を、Ａｋｔａ Ｐｕｒ Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムにおいてサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって特性評価し、そして、アッセイに含める前に、正しく組み立てられた、サイズが適切な物質を分画し、凝集体ピークから単離した。

【0090】

精製したＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１９９Ａ－Ｆｃ融合体をＳＥＣで特性評価したところ、主に凝集した物質の組成が明らかになった（図２）。これに比べて、天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ融合体及びＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ融合体の両物質は、より迅速に移動する凝集体と容易に見分けられる別個の非凝集ピークによって区別された。Ｙ１９９Ａ変異の凝集に対する影響は、Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ａの二重変異体Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ融合バリアントにおいても明らかであり、これは、それがタンパク質のミスフォールディングに対して最も重要な影響を有していたことを示す（図２）。したがって、ＮＫＧ２ＤバリアントにＹ１５２変異の任意の組み合わせと共にＹ１９９Ａを含めるこの態様は、その後の遺伝子操作の試みに必要な材料を生成する上での課題となり、また、組み立て及び細胞表面における提示についても懸念が生じた。その結果、組み合わせてよりロバストな分子を得ることができる、Ｙ１５２及びＹ１９９における他の置換を探索することを試みた。ｅＮＫＧ２Ｄ組み合わせＹ１５２及びＹ１９９変異体候補をＦｃ融合体として検討し、（表１）に詳細を示した。更に、精製し、発現させたＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ融合体候補を全てＳＥＣによってプロファイリングしたところ、それらのクロマトグラムから、様々なレベルの凝集体形成が明らかになった（図２及び３、表１）。残基１５２におけるアラニン、セリン、スレオニン、及びバリンで探索した単一アミノ酸置換のうちのいずれもＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ分子の組み立てに影響を与えなかったが、Ｙ１５２－ロイシン（Ｙ１５２Ｌ）からは高度に凝集した物質が生じた。アラニンと同様に、グルタミン酸もアスパラギン酸も１９９位において許容できなかったが、フェニルアラニンは、凝集体形成をほんのわずかに増加させた。探索した変異の組み合わせのうち、Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ、Ｙ１５２Ｓ／Ｙ１９９Ｆ、Ｙ１５２Ｔ／Ｙ１９９Ｆ、及びＹ１５２Ｆ／Ｙ１９９Ｆは、所望の二量体形成に悪影響を及ぼさなかったが、他の組み合わせでは凝集が増加した。

【0091】

実施例８：（非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドバリアントを有する抗体ベースの二重特異性分子「ＭｉｃＡｂｏｄｙ」の作製）。）
ヒトＩｇＧ１に融合した非天然ＭｉｃＡバリアントを作製するために、例えば、ＭＩＣｗｅｄ（配列番号７）及びＭＩＣ２５（配列番号３１）のα１－α２ドメインをコードしているＤＮＡポリヌクレオチドを、Ｃ末端カッパ軽鎖に融合させるためのＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１３５）又はヒトＩｇＧ１のＣ末端重鎖に融合させるためのＧＧＧＳリンカー（配列番号１３６）のいずれかをコードしているポリヌクレオチドも導入されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。更に、全てのＦｃγＲ受容体への結合を減少させる２つの変異Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（Ｋａｂａｔ付番）を重鎖のＣＨ２ドメインに導入して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を排除した（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ ＪＢＣ，２７６：６５９１－６６０４］。ＧＰＩ連結を有しない野生型ＵＬＢＰ２（ＵＬＢＰ２．ｗｔ）のα１－α２ドメイン（配列番号６１）をコードしているポリヌクレオチドも同様にクローニングし、リンカーをコードしているＤＮＡポリヌクレオチド及びＩｇＧ１の重鎖又は軽鎖に融合させた。これら二重特異性抗体は、単数形では「ＭｉｃＡｂｏｄｙ（商標）」、複数形では「ＭｉｃＡｂｏｄｉｅｓ」と呼ばれ、融合したα１－α２ドメインについて二価となる。ｅＮＫＧ２Ｄの遺伝子操作を探求する目的でＭｉｃＡｂｏｄｙを生成するために使用した抗体の例としては、限定されるものではないが、トラスツズマブ（配列番号１３７及び１３８）及びリツキシマブ（配列番号１３９及び１４０）が挙げられ、その後それぞれ「トラスツズマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙ」及び「リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙ」と命名された。融合コンストラクトを、Ｇｉｂｓｏｎクローニング（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を介してｐＤ２６１０－Ｖ１２（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）に個々に挿入した。特定の抗原を認識する所与の抗体については、重鎖をコードしているプラスミドと、天然又は非天然のＮＫＧ２Ｄリガンドに融合している軽鎖をコードしているプラスミドとを、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で一過性に発現させるためにコトランスフェクトした。あるいは、天然又は非天然のＮＫＧ２Ｄリガンドと融合した重鎖をコードしているプラスミドと、軽鎖のプラスミドとをコトランスフェクトした。分泌された二重特異性抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（カタログ番号２０３３４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって精製し、溶出した物質をＡｋｔａ Ｐｕｒ Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって特性評価し、必要に応じて分画を実施した。更に、精製したサンプルに対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行って、融合した重鎖及び融合した軽鎖の種の予測分子量を確認した。

【0092】

実施例９：（天然ＮＫＧ２Ｄ結合リガンドにも、野生型ＮＫＧ２Ｄへの結合が強化された非天然リガンドにも結合することができない改変ＮＫ２ＧＤバリアントの同定）
α１－α２バリアントの、天然（野生型）ＮＫＧ２Ｄ及び非天然ｅＮＫＧ２Ｄタンパク質の細胞外ドメインに対する結合親和性を、プレートベースのＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。ＳＥＣ分画された天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ及び非天然Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄの融合体をそれぞれ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬのコーティング濃度を用いて、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の別々のウェルに４℃で一晩コーティングした。プレートを２０～２２℃においてＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、２０～２２℃において２時間ＰＢＳ中０．５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ－Ｂ）でブロッキングした。ＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－ＢＴ）中で２０～２２℃において６０分間、プレートに結合している天然又は非天然のＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ融合体に対してＭｉｃＡｂｏｄｙを滴定し、２０～２２℃においてＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ－ＢＴ中のＨＲＰコンジュゲート抗ヒトカッパ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いて、結合した二重特異性タンパク質を検出し、１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で発色させた。ＵＬＢＰ２．ｗｔリツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙ（配列番号１３９及び１４１）の結合は、野生型ＮＫＧ２Ｄと後者への結合が減少したｅＮＫＧ２Ｄバリアントとを識別し、リガンドバリアントであるＭＩＣｗｅｄ（配列番号２０及び７８）及びＭＩＣ２５（配列番号１３８及び８０）は、リガンド結合が消失したｅＮＫＧ２Ｄバリアントの同定においてよりストリンジェントであった。３つの二重特異性リガンド全てに対する各ｅＮＫＧ２Ｄバリアントの結合挙動から、野生型及びバリアントのリガンドの結合を最も大きく減少させるＮＫＧ２Ｄ改変の組み合わせが明らかになり、リード不活性ＮＫＧ２Ｄバリアントの選択が可能となった。

【0093】

また、ＦｏｒｔeＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステム（全てＦｏｒｔeＢｉｏ ＬＬＣ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いたバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、ｅＮＫＧ２Ｄバリアントのリガンドへの結合に関する追加の生物物理学的分析を行った。これら実験のために、ヒトＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＩＣＡ－Ｆｃ、ＭＩＣＢ－Ｆｃ、ＵＬＢＰ１－Ｆｃ、ＵＬＢＰ２－Ｆｃ、ＵＬＢＰ３－Ｆｃ、及びＵＬＢＰ４－ＦｃをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットにおけるリガンドを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサチップに捕捉した。ベースラインが確立された後、チップを３００ｎＭ～０．４１ｎＭの範囲の滴定系列のＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質に曝露し、会合／解離のキネティクスをモニタリングした。全ての工程をＰＢＳ－ＢＴ中で実行した。続いて、Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質をＡＨＣチップに捕捉し、ＭｉｃＡｂｏｄｙを滴定して結合キネティクスを特性評価した。

【0094】

天然ＮＫＧ２ＤのＭＩＣｗｅｄ又はＭＩＣ２５のいずれかへの結合によって定義される最大応答を求めるために、天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ融合体をＡＨＣバイオセンサに捕捉し、２０ｎＭのトラスツズマブ－ＭＩＣｗｅｄ ＭｉｃＡｂｏｄｙ又は２０ｎＭのトラスツズマブ－ＭＩＣ２５ ＭｉｃＡｂｏｄｙを２分間インキュベートした後、３０秒間解離キネティクスを観察した。次いで、捕捉剤としてＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ融合受容体を用いて同じ条件下で結合分析を行い、Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔによって確立された最大結合応答の百分率として各ｅＮＫＧ２Ｄの結合レベルをランク付けした（表２）。ＭＩＣｗｅｄについては、Ｙ１９９Ｆを除く全ての単一変異体Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄバリアントの応答が５０％まで低下した。Ｙ１９９Ｆは、１００％の結合応答を維持していた。しかし、二重変異体Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄバリアントは全て、ＭＩＣｗｅｄへの結合が完全に消失した。ＭＩＣ２５については、全ての単一変異体Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄバリアント及びＹ１５２Ｖ／Ｙ１９９Ｆは、野生型Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄの結合に比べて１００％の結合応答を維持していた。しかし、Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ、Ｙ１５２Ｓ／Ｙ１９９Ｆ、及びＹ１５２Ｔ／Ｙ１９９Ｆを含む二重変異体Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄバリアントのうちの幾つかでは、結合が５０％まで低下した。

【0095】

捕捉剤としてＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ融合体を用いるＥＬＩＳＡアッセイを、ＵＬＢＰ２．ｗｔ、ＭＩＣｗｅｄ、ＭＩＣ２５ ＭｉｃＡｂｏｄｙで実施し、３００ｎＭから出発して滴定した。可能な場合、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ_５０値を算出した（表１１）。

【0096】

【表11】

【0097】

天然ＮＫＧ２Ｄは、それぞれＫｄｓ値が１．４、０．００７、及び０．００５ｎＭと算出された親和性でＵＬＢＰ２、ＭＩＣｗｅｄ、及びＭＩＣ２５ベースのＭｉｃＡｂｏｄｙに結合した。ＵＬＢＰ２及びＭＩＣｗｅｄ ＭｉｃＡｂｏｄｙの全ての単一変異体ｅＮＫＧ２Ｄ候補との親和性は低下したが、ＭＩＣ２５のｅＮＫＧ２Ｄ候補への結合は保持された。しかし、二重変異体ｅＮＫＧ２Ｄ候補は全て、Ｍｉｃａｂｏｄｙフォーマットにおいて、３つのリガンド－ＵＬＢＰ２、ＭＩＣｗｅｄ、ＭＩＣ２５の全てへの結合がなくなったか又は著しく減少した。

【0098】

ｅＮＫＧ２ＤバリアントであるｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ）、ｅＮＫＧ２Ｄ７（Ｙ１５２Ｓ／Ｙ１９９Ｆ）、ｅＮＫＧ２Ｄ８（Ｙ１５２Ｔ／Ｙ１９９Ｆ）、及びｅＮＫＧ２Ｄ９（Ｙ１５２Ｖ／Ｙ１９９Ｆ）は、Ｏｃｔｅｔ分析及びＥＬＩＳＡの両方によって、ＵＬＢＰ２、ＭＩＣｗｅｄ、及びＭＩＣ２５ベースのＭｉｃＡｂｏｄｙへの結合が減少又は消失していた（表２及び３）。更に、ｅＮＫＧ２Ｄ５、７、及び８は凝集の量が最も少なく、２９３Ｔ発現時のタンパク質の組み立てがよりロバストであることが示唆された（表１）。Ｏｃｔｅｔ ＡＨＣチップに捕捉されたＭｉｃＡｂｏｄｙとしての野生型リガンドへの結合について、ｅＮＫＧ２Ｄ５（配列番号１０２）をより詳細に検討した。単一変異体Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ（配列番号９５）は、天然（配列番号９４）ＮＫＧ２Ｄと比べて、全ての天然リガンドへの結合が減少していた（図５）。ｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ）の結合についての応答曲線は、Ｙ１５２ＡのｅＮＫＧ２Ｄと比べて更により低下した。ｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ、以下「ＡＦ」又は「ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ」と称する）を、同種選択的直交性非天然リガンドを遺伝子操作するためのリードＮＫＧ２Ｄバリアントとして選択した。

【0099】

実施例１０：（非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインに選択的に結合する直交性非天然α１－α２ドメインの構築）。
ファージディスプレイを用いて、遺伝子操作によりＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（配列番号１０２）受容体に選択的に結合する直交性非天然α１－α２ドメインを得た。出発点として、天然野生型ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ）外部ドメインに対して高い親和性を有する非天然ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗα１－α２ドメイン（図１Ｂ；配列番号１４２）を、更なる変異誘発及びファージディスプレイによるスクリーニングのための親ドメインとして選択した。ジスルフィド結合の可能性を排除するために更にＣ８Ｓ変異を有するＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（配列番号１０８）のα１－α２ドメインについて、合成ＤＮＡライブラリを作製した。結合状態において天然ＮＫＧ２Ｄ受容体のＹ１５２位及びＹ１９９位に近接近して位置するリガンドのアミノ酸残基のコドンをＮＮＫコドンに置き換えた；ライブラリは１５４～１５９位のＮＮＫコドンからなっていた。ライブラリを、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質への融合体としてクローニングし、変異誘発されたα１－α２ドメインバリアントをディスプレイしているファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０大腸菌細胞で産生させた（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．（２０１１）。これらα１－α２ファージディスプレイライブラリを、ビオチン化されていない天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ競合タンパク質の存在下で、ビオチン化されたＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦタンパク質に結合しているファージクローンを選択的に捕捉することにより、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体に対する高い結合親和性について選別した。ビオチン化されていない天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄの濃度を増大させながら複数ラウンドの競合選択を繰り返すことによって、選択的なクローンを濃縮した。

【0100】

４ラウンドの選択後、ファージクローンを９６ウェルフォーマットで個別に配列し、スポットＥＬＩＳＡを実施して、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに比べてプレートに結合している非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの優先的な異なる結合を確認した。結合しているファージを、ビオチン化したＭ１３ファージコートタンパク質モノクローナル抗体Ｅ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ストレプトアビジン－ＨＲＰ検出（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、及び１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて検出した。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに結合しているファージのＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに結合しているファージに対する比として、各クローンのスポットＥＬＩＳＡシグナルを表した。１４以上の比を有するファージの配列を決定して、ＮＮＫ変異誘発領域内の特定の変異を同定した。同じ配列を表す複数のクローンが同定された場合、ＥＬＩＳＡシグナルの比をプロットし、データポイントのクラスタリングによってファージクローンの一貫性を確認した（データは示さない）。

【0101】

ＥＬＩＳＡで同定されたバリアントのうちの３０個を個々の単培養で増殖させて、ファージの高力価マイクロバッチを作製した。精製されたファージ濃度をＯＤ_２６８＝０．５に対して正規化し、次いで、プレートに結合しているＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ又はＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対して１：３希釈系列に供し、ファージの検出及びＥＬＩＳＡの発色を上記の通り実施した。このようにアッセイした３０個のバリアントは全て、一貫してＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合を示し、アッセイしたファージの最高濃度でさえもＮＫＧ２Ｄ．ｗｔにはほとんど又は全く結合しなかった。また、選択されたファージは、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦとＮＫＧ２Ｄ．ｗｔとの間で最大半量結合を達成するために、ファージ濃度の２ｌｏｇ以上のシフトを示した。

【0102】

ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択的なα１－α２ドメイン変異体が、抗体融合の状況で特異的結合特性を保持していることを確認するために、２１個のバリアント（表５；例えば、配列番号１４３～１５０）を、リツキシマブ抗体の軽鎖へのＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳリンカーを用いたＣ末端融合体としてクローニングした。得られた融合体を、Ｇｉｂｓｏｎクローニング（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を介して哺乳類発現ベクターｐＤ２６１０－Ｖ１２（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）にクローニングし、対合したフルＩｇＧ抗体として親抗体の重鎖と共に共発現させた。製造業者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で一過的に発現させ、標準的なプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（カタログ番号２０３３４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて精製した。各バリアントＵＬＢＰ２ α１－α２抗体融合体の非天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ及び天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔへの結合を測定するＥＬＩＳＡによって、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔと比べてＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対する結合親和性が著しく高いことが実証された（表１２）。

【0103】

【表12】

【0104】

まとめると、これらデータは、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体に対して高い結合親和性を保有し、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する結合親和性が著しく低下している非天然直交性α１－α２ドメインの発明を実証した。更に、これら直交性α１－α２ドメインの抗体ポリペプチドへの融合体は、その選択的結合特性を保持しており、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の状況において非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体を特定の抗原に向けてリダイレクトするために使用した。

【0105】

実施例１１：（一方又は他方に選択的に結合することによって非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体バリアント間を識別することができる非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドの同定）
ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａに選択的に結合する直交性非天然α１－α２ドメイン（以降、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、受容体と称するを遺伝子操作するためのファージディスプレイを、上述の通り、出発点として非天然ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗα１－α２ドメイン（配列番号１４２）を用いて実施した。α１－α２ファージディスプレイライブラリを、ビオチン化されていない天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ（配列番号９４）競合タンパク質の存在下で、ビオチン化されたＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（配列番号９５）タンパク質に結合しているファージクローンを選択的に捕捉することにより、非天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ受容体に対する高い結合親和性についてパニングした。更なるファージクローンの検証研究の結果、Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに比べてＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに優先的に結合するバリアントが同定された（表１３）。

【0106】

【表13】

【0107】

例えば、ＵＬＢＰ２．Ｓ３（配列番号１５１）は、ＥＬＩＳＡ及びＯｃｔｅｔ分析（単量体Ｈｉｓタグ付き及び二重特異性抗体融合フォーマットの両方）により、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに比べて非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの選択的な結合を一貫して示した。これは、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して高親和性結合を有する非天然直交性α１－α２ドメインの本発明の異なる形態（この場合、実施例２のＮＫＧ２Ｄ．ＡＦとは対照的にＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ）を表していた。更に、直交性α１－α２ドメインの抗体ポリペプチドへの融合体は、その選択的結合特性を保持しており、抗体等の融合した異種ペプチドによって決定される特定の分子に向けて非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を選択的にリダイレクトするために使用した。

【0108】

ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに選択的に結合する非天然α１－α２ドメイン（ＵＬＢＰ２．Ｓ３、配列番号１５１）及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに選択的に結合する非天然α１－α２ドメインが、これらの２つの非天然受容体バリアントを識別できるかどうかを判定するために、滴定ＥＬＩＳＡを実施した。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに結合している選択されたα１－α２バリアントの２１個全てについて、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの結合をＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの結合に対して直接比較した。これらのうちの４つは、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに結合できない、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対して強い親和性がある、及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに比べてＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの結合が著しく少ない（１５～２０倍）又は結合しないという特性を示した。これら４つの非天然ＵＬＢＰ２α１－α２バリアントであるＵＬＢＰ２．Ｃ、ＵＬＢＰ２．Ｒ、ＵＬＢＰ２．ＡＡ、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１４３、１４５、１４７、及び１４９）を、ＮｅｔＭＨＣ４．０サーバー（９ｍｅｒペプチド分析を用いた全てのＨＬＡスーパータイプ代表に対するペプチド－ＭＨＣクラスＩの結合を検索するため；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）及びＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３サーバー（１５ｍｅｒペプチド分析を用いたＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰハプロタイプに対するペプチド－ＭＨＣクラスＩＩの結合を検索するため；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／）（これらはいずれもＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋによって開発されたアルゴリズムである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；Ａｎｄｒｅａｔｔａ Ｍ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｍ，Ｇａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｙｓｔｅｍ，２０１６ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３２：５１１，ＰＭＩＤ：２６５１５８１９；Ｊｅｎｓｅｎ ＫＫ，Ａｎｄｒｅａｔｔａ Ｍ，Ｍａｒｃａｔｉｌｉ Ｐ，Ｂｕｕｓ Ｓ，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ ＪＡ，Ｙａｎ Ｚ，Ｓｅｔｔｅ Ａ，Ｐｅｔｅｒｓ Ｂ，ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｍ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１８ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＰＭＩＤ：２９３１５５９８））を用いて、野生型ＵＬＢＰ２ペプチド配列（配列番号６１）と比べた予測免疫原性プロファイルの変化についても調べた。ＵＬＢＰ２．Ｃ、ＵＬＢＰ２．Ｒ、及びＵＬＢＰ２．ＡＢに組み込まれた変異は、予測免疫原性を増大させなかったが、ＵＬＰＢ２．ＡＡの免疫原性は、幾つかのハプロタイプでわずかに増大した（図８及び９）。ＵＬＢＰ２．ＲのＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対する特異性及びその予測可能な免疫原性の欠如の結果として、その結合挙動をＵＬＢＰ２．Ｓ３（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに選択される非天然直交性リガンド）、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（野生型ＮＫＧ２Ｄへの親和性が強化された非天然リガンド）、及び野生型ＵＬＢＰ２（ＵＬＢＰ２．ｗｔ）と直接比較するための更なるＥＬＩＳＡ分析のために、ＵＬＢＰ２．Ｒを選択した。４つのリツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙ試薬（それぞれＵＬＢＰ２．Ｒ、ＵＬＢＰ２．Ｓ３、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ、及びＵＬＢＰ２．ｗｔの重鎖及び軽鎖として配列番号１３９及び１５１、１３９及び１５２、１５３及び１４０、並びに１３９及び１４１）の結合を、野生型ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ）並びに２つの不活性非天然変異体ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対してアッセイした。データは、ＭｉｃＡｂｏｄｙとしてのＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに選択されるバリアントＵＬＢＰ２．Ｓ３は、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに高い親和性で結合するが、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦにも天然ＮＫＧ２Ｄにも会合しないことを示した。更に、ＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットのＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに選択されるバリアントＵＬＢＰ２．Ｒは、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに高い親和性で結合したが、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡにも天然ＮＫＧ２Ｄにも会合しなかった。これら結果は、ＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣリガンド軸の探索の、そして、新規選択性的非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体とそのそれぞれの同種非天然ＭＩＣリガンド結合パートナーとの固有の対の開発のための、途方もない可能性を示した。

【0109】

実施例１２：（非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインを発現しているＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲティング及び殺傷活性は、異種ターゲティングポリペプチドに融合した直交性α１－α２ドメインによって制御される）
毒性を軽減し、腫瘍に対する有効性を改善するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を選択的に制御するための手段が強く求められている（Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，前喝）。以前、後に治療用モノクローナル抗体のＦｃドメインを通して会合することができるＣＤ１６の外部ドメインを用いてＣＡＲを開発する試みが行われ、これにより、ＣＡＲ－Ｔターゲティングを抗体ベースで制御することが可能になった（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，前喝）。しかし、ＣＤ１６ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞は、血液及び組織中のほぼ全ての内因性抗体分子を認識することができ、これら細胞を制御するために使用される治療用抗体は、ＮＫ細胞、ＰＭＮ、単球、及びマクロファージ上の内因性ＣＤ１６受容体からの競合を受けることになる。これら両特徴は、それぞれ腫瘍外毒性及び薬物動態の不良の問題の原因となる。

【0110】

天然ＮＫＧ２Ｄリガンドは、特定の健常組織及び多くのストレスを受けた組織に存在するため、現行のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲアプローチを使用すると、極めて高い毒性のリスクが生じる（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。Ｙ１５２Ａ非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＮＫＧ２Ｄリガンドの本発明の非天然α１－α２ドメインで構成される二重特異性タンパク質を用いて非天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの活性を選択的に制御することができる手段の一例を構成している、ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１－α２ドメインに特異的に結合した。

【0111】

本発明者らは、全ての天然ＮＫＧ２Ｄリガンド又は既に記載されているＹ１５２Ａ改変ＮＫＧ２Ｄに対して直交性かつ同種の非天然α１－α２ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ）には結合しない、ＮＫＧ２Ｄの改変Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ（「ＡＦ」）外部ドメインで構成される受容体でＣＡＲ－Ｔ細胞を遺伝子操作した。本発明の同種非天然α１－α２ドメインは、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインに対して高い親和性で結合し、天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメイン及びＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ外部ドメインへの結合は回避した。したがって、天然ＮＫＧ２Ｄ及び非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡよりも非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインに対して強い選択性を示す遺伝子操作されたα１－α２ドメインは、非天然ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ受容体、又は本発明の非天然α１－α２ドメインが選択的に会合することができる非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインに融合した任意の受容体若しくはタンパク質を選択的に制御するための理想的なシステムを表す。本発明は、更に、それぞれが明確に異なる細胞内ドメインによりシグナル伝達を行う２つの特徴的なＣＡＲ（一方はＮＫＧ２Ｄ．ＹＡで構成され、他方はＮＫＧ２Ｄ．ＡＦで構成される）を単一細胞で発現させることができる。これら特徴的なＣＡＲは、それぞれの同種の直交性ＭｉｃＡｂｏｄｙ又は別の非抗体融合ポリペプチドへの細胞外曝露による、細胞の活性の独立した二重の制御を有する。

【0112】

非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインを配備するキメラ受容体を用いて構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞の選択的制御を実証するために、それぞれのＮＫＧ２Ｄ外部ドメインをＣＡＲのＣＤ８ヒンジ領域に融合させた４－１ＢＢ／ＣＤ３ｚｅｔａ ＣＡＲコンストラクト（Ｃａｍｐａｎａ特許第８，３９９，６４５号）を用いて、先行研究に基づいて天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ（配列番号４９）、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（配列番号５４）、又は非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（配列番号１５４）の外部ドメインのいずれかを有するＣＡＲ（配列番号１５５、１５７、１５９）を構築した。これらコンストラクト（配列番号１５６、１５８、１６０）をレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルス形質導入を用いて初代ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞で発現させた。ＨｅＬａ細胞は、その表面上において、構成的にアップレギュレートされている濃度のＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ３、及びＵＬＢＰ２／５／６を含むＭＩＣリガンドを有する（これを確認するために使用した抗体は、これら３つのＵＬＢＰを区別することができない；Ｈｕｍａｎ ＵＬＢＰ－２／５／６ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。また、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトして、天然ＵＬＢＰ１又はＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに選択されるバリアントＵＬＢＰ２．Ｒのいずれかを表面上で過剰発現させ、これら細胞をインビトロ殺傷アッセイの標的として使用した。ＨｅＬａ標的細胞にカルセインを予め負荷し、漸増するエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で５時間、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ－ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ、又はＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ ＣＤ８細胞に曝露した後、上清に放出されたカルセインの量を定量し、洗剤処理時に放出された全カルセインに対して正規化した。高レベルのＭＩＣリガンドがＨｅＬａ細胞の表面上で天然に発現することから、ＣＡＲとして天然ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ）を発現しているＣＤ８細胞は、この過剰発現した天然リガンドを介してＨｅＬａ細胞と会合し、細胞溶解作用を発揮した。しかし、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲの両方を形質導入したＣＤ８細胞は、Ｅ：Ｔ比が高くても天然ＨｅＬａ細胞をほとんど溶解しないことが実証され、形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞と同等の活性レベルを示した。ＵＬＢＰ１をＨｅＬａ細胞の表面で過剰発現させると、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ－ＣＡＲ ＣＤ８ Ｔ細胞だけがＨｅＬａ細胞を著しく溶解した。ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ細胞では、Ｅ：Ｔ比が高い場合にいくらかの追加の殺傷がみられたが、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞ではそれがみられないことから、二重変異Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆは単一のＹ１５２Ａ変異よりも更にＮＫＧ２Ｄを不活化することが示される。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択的な非天然ＵＬＢＰ２．Ｒを過剰発現しているＨｅＬａ細胞では、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ－ＣＡＲ細胞は、（内因性ＭＩＣリガンドの認識により）溶解を指示するが、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞は、受容体とその選択的リガンドとの会合と一致して著しいレベルの溶解を指示した。

【0113】

適切な同種のターゲティングＭｉｃＡｂｏｄｙにしかＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ細胞又はＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞の溶解を指示することができないことを実証するために、非天然ＵＬＢＰ２．Ｓ３又はＵＬＢＰ２．Ｒ直交性リガンドのいずれかに連結したリツキシマブベースのＭｉｃＡｂｏｄｙと組み合わせて、Ｒａｍｏｓ細胞を細胞溶解の標的として使用した。リツキシマブ－ＵＬＢＰ２．Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙは、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ ＣＤ８細胞の細胞殺傷活性を指示することはできたが、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞は指示できず、一方、リツキシマブ－ＵＬＢＰ２．Ｒ ＭｉｃＡｂｏｄｙは、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞の活性を指示することはできたが、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ細胞は指示できなかった。このことは、更に、好ましいパートナーとして遺伝子操作されたその同種の非天然ＮＫＧ２Ｄバリアントに対する２つの非天然ＵＬＢＰ２バリアントの選択性を実証する。ＭｉｃＡｂｏｄｙの抗体部分の特異性を実証するために、リツキシマブ－ＵＬＢＰ２．Ｒ、トラスツズマブ－ＵＬＰＢ２．Ｒ（配列番号９５及び１３３、それぞれ重鎖及び軽鎖）、又は等モルの２つの組み合わせのいずれかと共にＭｉｃＡｂｏｄｙの飽和総濃度でインキュベーションすることによって予め武装させたＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ ＣＤ８細胞を用いて、インビトロ殺傷アッセイを実施した。結合していないＭｉｃＡｂｏｄｙを洗浄によって除去した後、カルセインを予め負荷したＲａｍｏｓ細胞（ＣＤ２０を発現、リツキシマブの標的）又はＣＴ２６－Ｈｅｒ２（ヒトＨｅｒ２を発現するようにトランスフェクトされたマウス細胞株）にＣＤ８細胞を適用した。２つの異なるＥ：Ｔ比で２時間インキュベートした後、放出されたカルセインの量を定量した。リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙで細胞を予め武装させた場合、Ｒａｍｏｓ細胞のみが溶解したが、トラスツズマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙはＣＴ２６－Ｈｅｒ２細胞のみに対して細胞溶解活性を指示した。しかし、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ ＣＤ８細胞にリツキシマブ－及びトラスツズマブ－ＵＬＢＰ２．Ｒ ＭｉｃＡｂｏｄｙの両方を同時に予め武装させたところ、両標的細胞株が溶解したことから、これらＣＡＲ細胞は、受容体とリガンドとの間の遺伝子操作された選択的で特権的なパートナーにより、容易に多重化され、それによって、異なる腫瘍標的に同時に会合するように指示されることが実証された。

【0114】

実施例１３：（生産的にＨＩＶを感染させたヒト扁桃腺ＣＤ４ Ｔ細胞の殺傷）健常ドナーのＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって活性化し、不活性ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激性４－１ＢＢドメイン、及び

【0115】

【0116】

で構成されるＣＡＲを形質導入した。このＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ細胞と称される。これらＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲの不活性ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して同種である改変非天然リガンドと融合した広域中和ＨＩＶ抗体に間接的に結合することしかできなかった。ネガティブコントロールとして、同じドナーからの形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞も並行して調製した。３ＢＮＣ６０、３ＢＮＣ１１７、ＰＧＴ１２１、及び１０－１０７４の広域中和抗体の配列に基づいて、４つのＨＩＶ特異的なＭｉｃＡｂｏｄｙを作製した（配列番号の１６１及び１６２（３ＢＮＣ６０）、それぞれＭｉｃＡｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖；１６３及び１６４（３ＢＮＣ１１７）、それぞれＭｉｃＡｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖；１６５及び１６６（ＰＧＴ１２１）、それぞれＭｉｃＡｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖；１６７及び１６８（１０－１０７４）、それぞれＭｉｃＡｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖）。これらＭｉｃＡｂｏｄｙは、ＨＩＶ ｇｐ１６０エンベロープ分子の特定のエピトープに結合する。３ＢＮＣ６０及び３ＢＮＣ１１７によって結合される標的となるエピトープは、配列番号１６９であり、ＰＧＦ１２及び１０－１０７４によって結合される標的となるエピトープは、配列番号１７０である（Ｄｅｎｇ Ｋ，Ｐｅｒｔｅａ Ｍ，Ｒｏｎｇｖａｕｘ Ａ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｄｕｒａｎｄ ＣＭ，Ｇｈｉａｕｒ Ｇ，Ｌａｉ Ｊ，ＭｃＨｕｇｈ ＨＬ，Ｈａｏ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，，ＪＢ，Ｇｕｒｅｒ Ｃ，Ｍｕｒｐｈｙ ＡＪ，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ＤＭ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ，Ｄｅｅｋｓ ＳＧ，Ｓｔｒｏｗｉｇ Ｔ，Ｋｕｍａｒ Ｐ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ ＪＤ， Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ，Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ，Ｓｈａｎ Ｌ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ ＲＦ Ｂｒｏａｄ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｃｌｅａｒ ｌａｔｅｎｔ ＨＩＶ－１ ｄｕｅ ｔｏ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊａｎ １５；５１７（７５３４）ｐ．３８１－５．）。ネガティブコントロールとしてＣＤ２０又はＨＥＲ２を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙも開発した。

【0117】

４人の健常ドナー由来のヒト扁桃腺細胞を加工して、ヒトリンパ球凝集培養物（ＨＬＡＣ）を作製した。Ｒ５指向性ＨＩＶ－１及びＧＦＰレポーター遺伝子に対応するＤＮＡを事前にトランスフェクトしておいた２９３Ｔ細胞に、ＨＬＡＣ細胞を重ね合わせた。２４時間後、ＨＬＡＣ細胞を除去し、更に４日間ＨＩＶ感染を拡散させ続けた。次に、ＧＦＰ陽性感染ＨＬＡＣ細胞を、形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞又は指定のＭｉｃＡｂｏｄｙで武装させたＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞に曝露し、更なるウイルスの拡散を防ぐために５μＭサキナビルの存在下で４８時間培養した。次いで、遠心分離によって細胞を回収し、洗浄し、染色して、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて感染細胞及び非感染細胞における生存率を評価した。

【0118】

異なる濃度の特異的にＨＩＶを標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙを用いたＣＡＲ－Ｔ細胞による、ＨＩＶに感染した初代ＣＤ４ Ｔ細胞の殺傷についてのエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比の評価。上記の通り、Ｂａｌ－ＧＦＰ Ｒ５ウイルスに感染した初代扁桃腺由来細胞１００万個（約１０％感染、１×１０^４個の感染細胞）を、異なる濃度の４つの異なる広域中和ＨＩＶ ＭｉｃＡｂｏｄｙの存在下で、１×１０^５個の形質導入されていないＣＤ８（０：１）、又は１×１０^４個（１：１）若しくは２×１０^５個（２０：１）のＣＡＲ－Ｔ細胞と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を染色し、フローサイトメトリーによって評価した。細胞を、ＧＦＰを発現しているか又は発現していない単一細胞／生／ＣＤ３＋／ＣＤ８－細胞でゲーティングした。３回の試験を平均した結果を図７に示す。これら研究では、ＨＩＶ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙ及びＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を組み合わせることで、Ｒ５ ＨＩＶウイルスに感染した扁桃腺細胞が特異的に殺傷された。殺傷に最適なエフェクター：標的比は１：１～１０：１の範囲であり、非感染細胞の生存率は低下しなかった。殺傷は、感染細胞、すなわち、ＧＦＰを発現している細胞に高度に限定されていた。同じ培養物中に存在するＧＦＰ－細胞は、細胞数がほとんど又は全く減少しなかった（図Ｂ及びＣ；ＧＦＰ＋対ＧＦＰ－）。更に、同じドナーの形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞又はＨＩＶを標的としないＭｉｃＡｂｏｄｙ（例えば、ＣＤ２０を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ又はＨｅｒ２を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ）を使用した場合、非感染細胞の殺傷は生じず、感染細胞の殺傷も生じなかった。

【0119】

特異的ＨＩＶ ＭｉｃＡｂｏｄｙと組み合わせたＣＡＲ－Ｔによる、Ｒ５ウイルスに感染した初代ＣＤ４細胞の特異的殺傷。Ｂａｌ－ＧＦＰ Ｒ５ウイルスに感染した初代扁桃腺由来細胞１００万個（約１×１０^４個の感染細胞）を、異なる濃度のＨＩＶ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙ又はＢ細胞特異的なＣＤ２０を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ又はＨＥＲ２を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｈｅｒ２）の存在下で１×１０^５個のＣＡＲ－Ｔ細胞と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を単一細胞／生／ＣＤ３＋／ＣＤ８－及びＧＦＰ＋又はＧＦＰ－のいずれかでゲーティングした。４回の試験を平均した結果を図８に示す。

【0120】

特異的ＨＩＶ ＭｉｃＡｂｏｄｙと組み合わせたＣＡＲ－Ｔによる、Ｆ４ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ／ｆｏｕｎｄｅｒウイルスに感染した初代ＣＤ４細胞の特異的殺傷。Ｆ４－ＧＦＰ（Ｔ／Ｆ）ウイルスに感染した初代扁桃腺由来細胞１００万個（約１×１０^４個の感染細胞）を、異なる濃度の４つの別個のＨＩＶ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙ、ＣＤ２０を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｒｉｔｕｘ）、又はＨＥＲ２を標的とするＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｈｅｒ２）の存在下で、１×１０^５個のｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞と共にインキュベートした。２４時間後に細胞を染色し、続いて、フローサイトメトリーを行った。細胞を単一細胞／生／ＣＤ３＋／ＣＤ８－及びＧＦＰ＋又はＧＦＰ－のいずれかでゲーティングした。結果を図９に示す。Ｒ５ウイルスに感染した細胞又はヒトからヒトへの水平感染に成功したウイルス株であるＦ４ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ／ｆｏｕｎｄｅｒＨＩＶウイルスに感染した細胞では、有効な殺傷が確認された。

【0121】

実施例１４（慢性的にＨＩＶに感染し、ＡＲＴを受けている非ウイルス血症患者からの再活性化した潜伏感染リザーバ細胞のＣＡＲ－Ｔ及びＭｉｃＡｂｏｄｙによる殺傷）
連続フロー遠心分離白血球除去に続いて、フィコール－ハイパック勾配における細胞の密度遠心法によって、ＡＲＴを受けている６名の非ウイルス血症ＨＩＶ陽性個体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。その後、休止ＣＤ４＋Ｔリンパ球を「ノータッチ」陰性抗体枯渇によって単離した。細胞を、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で培養した。１，０００万個の休止ＣＤ４＋リンパ球を、８０ｎＭ ＰＭＡ＋１ｕＭイオノマイシンで７２時間刺激した。再活性化後、５μＭサキナビルの存在下で、ＣＡＲ－Ｔ又は異なるＭｉｃＡｂｏｄｙを有する同じドナーの形質導入されていないＣＤ８細胞と共に細胞を４８時間インキュベートした。３００ｇで１０分間遠心分離を行うことによって、細胞を回収した。次いで、細胞ペレットを溶解させ、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲシステムを用いてｃＤＮＡを作製し、同時にウイルスのｍＲＮＡを前もって増幅させた（すなわち、１０サイクルの予増幅）後、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析及び定量を行った。ＡＲＴを受けている既知のＨＩＶ感染患者から回収したＰＢＭＣからノータッチネガティブセレクションによってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、１００ｎＭ酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）＋１ｕＭイオノマイシンで７２時間再活性化した。次いで、細胞を２回洗浄し、図中ＭＩＸと表記されている等濃度のＨＩＶ ｂＮＡｂベースのＭｉｃＡｂｏｄｙ（３ＢＮＣ６０、３ＢＮＣ１１７、ＰＧＴ１２１、及び１０－１０７４）の混合物０．１ｎＭ又は１ｎＭの存在下で、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞又は形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞と共に４８時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、細胞ペレットからＲＮＡを抽出した。細胞に会合しているＨＩＶ ＲＮＡをｄｄＰＣＲによって測定した。結果を図１０に示す。ＡＲＴを受けている非ウイルス血症感染個体（ｎ＝６）からの再活性化された潜伏リザーバ細胞（ＰＭＡ＋イオノマイシンで３日間）のこの実施例の研究では、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、同じドナーの形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞＋ＭｉｃＡｂｏｄｙの混合物と比較して、これら再活性化されたリザーバ細胞の数を約５０％有効に減少させることができることが観察された。誘導因子及びエフェクター細胞の存在下及び非存在下で、細胞に会合しているＨＩＶ ＲＮＡをｄｄＰＣＲで定量することにより、誘導性リザーバサイズを評価した。実施例１３及び１４のこれら知見は、まとめると、広域中和ヒトＩｇＧ１抗体で構築された同種ＭｉｃＡｂｏｄｙを加えたＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞が、潜伏ＨＩＶ－１リザーバ内の再活性化に成功したＨＩＶ感染細胞を排除するための新規の効率的で高度に選択的な殺傷戦略として使用できることのエクスビボにおける概念実証を提供する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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