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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-26
(45)【発行日】2025-03-06
(54)【発明の名称】試料の分析方法、分析装置およびコンピュータプログラム
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20250227BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20250227BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20250227BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 F
C12M1/34 F
C12M1/42
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021545706
(86)(22)【出願日】2020-01-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-25
(86)【国際出願番号】 FI2020050056
(87)【国際公開番号】W WO2020161384
(87)【国際公開日】2020-08-13
【審査請求日】2022-12-16
(31)【優先権主張番号】20195074
(32)【優先日】2019-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(73)【特許権者】
【識別番号】519459399
【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ ホールディングス プライベート リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【氏名又は名称】倉澤 伊知郎
(74)【代理人】
【識別番号】100130937
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100144451
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 博子
(74)【代理人】
【識別番号】100123630
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 誠
(72)【発明者】
【氏名】ファラレロ アドヤリー
(72)【発明者】
【氏名】トイヴァネン パシ
【審査官】田中 洋介
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５１８５５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００８／０１９１１４９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１０－２５６０７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－２８６５６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】欧州特許出願公開第０１８０４０５１（ＥＰ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／９５８
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ｇ０１Ｎ １５／００－１５／１４９２
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロプレート（１）のウェル（２）内に配置された１つ以上の試料（３）を分析する方法であって、各ウェル（２）の中には１つの試料（３）が配置されており、
－第１の所定の波長または波長範囲を有する電磁放射を生成するステップ（１０１）と、
－前記ウェル（２）の直径の最大６０パーセントの直径を有する光ビームを使用して、前記電磁放射を、前記マイクロプレート（１）の上から前記ウェル（２）の上端を介して前記試料（３）に透過させることによって、前記電磁放射により前記試料（３）に照射するステップ（１０２）と、
－前記試料（３）から放出され、かつ第２の所定の波長または波長範囲を有する光を、前記ウェル（２）の前記上端を介して検出器（１３）に送信するステップ（１０３）と、
－前記試料（３）の複数の所定の測定領域（２３）から放出された光の強度を決定するステップ（１０４）と、を含み、前記試料（３）の前記複数の所定の測定領域（２３）から放出された光の前記強度を決定するために、一度に１つの測定領域（２３）が照射され、さらに、
－前記少なくとも２つの測定領域（２３）から放出された光の前記決定された強度に基づき、前記試料（３）から放出され、かつ前記第２の所定の波長または波長範囲を有する光の総光量を表す結果値を決定するステップ（１０５）と、
－前記試料（３）の前記第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするステップ（１０６）と、を含む方法。
【請求項2】
前記複数の測定領域（２３）が前記ウェル（２）の底部全体を覆う、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記試料（３）の前記少なくとも２つの所定の測定領域（２３）から放出された光の前記強度を決定するために、前記検出器（１３）として光電子増倍管が使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記スポットをカウントするために、前記ウェル（２）の前記底部全体を照射し、カメラセンサ（１３ａ）を使用して前記試料（３）の画像を形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
複数のウェル（２）を含むマイクロプレート（１）を受容するように構成されている分析装置（１０）であって、前記ウェル（２）の各々が試料（３）を受容するように構成されており、前記分析装置（１０）が、－前記ウェル（２）の直径の最大６０パーセントの直径を有する光ビームを使用すると共に、第１の所定の波長または波長範囲を有する電磁放射を使用して、前記マイクロプレート（１）の上から、前記マイクロプレート（１）のウェル（２）の上端を介して試料（３）を照射する照射手段（１１）と、
－前記試料（３）の複数の測定領域（２３）から前記ウェル（２）の前記上端を介して放出され、かつ第２の所定の波長または波長範囲を有する光の強度を決定する検出手段（１３）と、
－前記試料（３）の前記第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするように構成されている、手段（１５、２１）と、
－前記複数の測定領域（２３）から放出された光の前記決定された強度に基づき、前記試料（３）から放出され、かつ前記第２の所定の波長または波長範囲を有する光の総光量を表す結果値を決定するように構成されている、手段（１５、２１）と、を含み、
前記試料（３）の前記複数の所定の測定領域（２３）から放出された光の前記強度を決定するために、前記装置（１０）は、前記測定領域（２３）を、一度に１つの測定領域（２３）ずつ連続して照射するように構成されている分析装置（１０）。
【請求項6】
前記照射手段（１１）が、電球、ＬＥＤまたはレーザーを含む、請求項５に記載の分析装置（１０）。
【請求項7】
前記装置（１０）が、前記試料（３）を照射するための波長を選択する手段（１７）を含む、請求項５または６に記載の分析装置（１０）。
【請求項8】
前記試料（３）を照射するための波長を選択する前記手段（１７）が、フィルタまたはモノクロメータを含む、請求項７に記載の分析装置（１０）。
【請求項9】
前記検出手段（１３）が光電子増倍管またはシリコンフォトダイオードを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の分析装置（１０）。
【請求項10】
前記検出手段（１３）がカメラセンサ（１３ａ）を含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の分析装置（１０）。
【請求項11】
前記装置（１０）が、前記第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするために、前記試料（３）の画像を形成するように構成されている、請求項５～１０のいずれか一項に記載の分析装置（１０）。
【請求項12】
前記第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするための前記試料（３）の画像を形成するため、前記装置（１０）が、前記ウェル（２）の底部全体を照射するように構成されている、請求項１１に記載の分析装置（１０）。
【請求項13】
分析装置（１０）を動作させるためのコンピュータプログラムであって、前記プログラムがコンピュータによって実行されると、分析装置（１０）に請求項１～５のいずれか一項に記載の方法を実行させる命令を含む、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、請求項１に定義されるように、マイクロプレートのウェルに配置された１つ以上の試料を分析する方法に関する。本発明はまた、分析装置、および他の独立請求項による分析装置を動作させるためのコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
蛍光に基づくアッセイは、一般的にライフサイエンスで使用されている。蛍光は発光の一形態である。蛍光は、光または他の電磁放射を吸収した物質による光（光子）の放出を意味する。エネルギーの吸収は、分子の軌道電子をより高い電子状態に励起し、基底状態への緩和により光子が放出される。
【0003】
蛍光アッセイは、蛍光色素分子の特性を利用する。蛍光色素分子は、ある波長の光エネルギーを吸収し、それに応じて、別のより長い波長の光エネルギーを再放出する。各蛍光色素分子は、光を吸収する波長の明確な範囲、および光を放出する波長の別の明確な範囲を有する。この特性は、それらを分析機器および分析技術による生物学的産物の特定の検出に使用できるようにする。
【0004】
蛍光アッセイでは、試料は、典型的にマイクロプレートのウェル内に配置される。マイクロプレートは、複数のウェル、すなわち行と列とに配置された穴、を含む平坦なプレートである。ウェルは、試料を受容し、小さな試験管として機能するように構成されている。典型的なマイクロプレートは、６個、２４個、９６個、３８４個、または１５３６個のウェルを含むが、より大きなマイクロプレートも存在する。
【0005】
特定のタイプの蛍光アッセイでは、蛍光スポットが形成され、試料の分析は、蛍光スポットの数のカウントに大きく基づいている。スポットのカウントに関連する問題は、カウントプロセスが、分析装置の助けを借りて人間の使用者がスポットを検査することに強く依存していることである。これにより、分析に時間がかかり、非常に主観的になる。さらなる問題は、試料内の蛍光スポットの数が多い場合、カウントの信頼性がなくなることである。たとえば、９６ウェルのマイクロプレート内のウェルの直径は約６ｍｍである。１つのウェル内のスポットの数が、例えば５００個以上の場合、スポットが互いに非常に接近しているため、信頼性の高いスポットカウントは困難になる。
【発明の概要】
【0006】
本発明の目的は、マイクロプレートのウェル内に配置された１つ以上の試料を分析するための改善された方法を提供することである。本発明による方法を特徴付ける特徴は、請求項１に示されている。本発明の別の目的は、改善された分析装置を提供することである。本発明のさらに別の目的は、分析装置を動作させるための改善されたコンピュータプログラムを提供することである。分析装置およびコンピュータプログラムを特徴付ける特徴は、他の独立請求項に記載されている。
【0007】
本発明による方法は、第１の所定の波長または波長範囲を有する電磁放射を生成するステップと、上記電磁放射を、マイクロプレートの上からウェルの上端を介して試料に透過させることによって、電磁放射により試料に照射するステップと、試料から放出され、第２の所定の波長または波長範囲を有する光を、マイクロプレートの上からウェルの上端を介して検出器に送信するステップと、試料の１つ以上の所定の測定領域から放出された光の強度を決定するステップと、上記１つ以上の所定の測定領域から放出された光の決定された強度に基づき、試料から放出されかつ第２の所定の波長または波長範囲を有する光の総光量を表す結果値を決定するステップと、を含む。
【0008】
本発明による分析装置は、第１の所定の波長または波長範囲を有する電磁放射を使用して、マイクロプレートの上からマイクロプレートのウェルの上端を介して試料を照射する照射手段と、試料の１つ以上の所定の測定領域からウェルの上端を介して放出され第２の所定の波長または波長範囲を有する光、の強度を決定する検出手段と、上記１つ以上の所定の測定領域から放出された光の決定された強度に基づき、試料から放出され第２の所定の波長または波長範囲を有する光の総光量を表す結果値を決定するように構成された手段と、を含む。
【0009】
本発明によるコンピュータプログラムは、このプログラムがコンピュータによって実行されると、上記で定義された方法ステップを分析装置に実行させる命令を含む。
【0010】
本発明による方法、装置およびコンピュータプログラムを用いれば、試料分析の、使用者による判断への依存度はより低くなるであろう。結果値は、試料が放出した光の総光量の積分または推定値を表す。
【0011】
本発明の一実施形態によれば、試料は複数の所定の測定領域を含み、結果値は、上記複数の測定領域から放出される光の強度に基づいて計算される。
【0012】
本発明の一実施形態によれば、測定領域は、ウェルの底部全体を覆う。
【0013】
本発明の一実施形態によれば、試料の上記１つ以上の所定の測定領域から放出された光の強度を決定するために、試料は、ウェルの直径の最大６０パーセントである直径を有する光ビームを使用して照射される。
【0014】
本発明の一実施形態によれば、試料の上記１つ以上の所定の測定領域から放出された光の強度を決定するために、一度に１つの測定領域が照射される。
【0015】
本発明の一実施形態によれば、試料の上記１つ以上の所定の測定領域から放出された光の強度を決定するために、検出器として光電子増倍管が使用される。
【0016】
本発明の一実施形態によれば、方法は、第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするステップを含む。この方法は、高感度を提供することにより、試料の迅速なスクリーニングを可能にする。さらに、この方法は、蛍光スポットを単にカウントする場合に比べ、存在する蛍光スポットの数が多すぎてスポットのカウントの信頼性が低下するような場合であっても測定を可能にするため、より広域な動的信号範囲を提供する。
【0017】
本発明の一実施形態によれば、スポットをカウントするために、ウェルの底部全体が照射され、カメラセンサを使用して試料の画像を形成する。
【0018】
本発明の一実施形態によれば、照射手段は、電球、ＬＥＤまたはレーザーを含む。
【0019】
本発明の一実施形態によれば、分析装置は、試料を照射するための波長を選択する手段を含む。
【0020】
本発明の一実施形態によれば、試料を照射するための波長を選択する手段は、フィルタまたはモノクロメータを含む。
【0021】
本発明の一実施形態によれば、検出手段は、光電子増倍管またはシリコンフォトダイオードを含む。
【0022】
本発明の一実施形態によれば、検出手段は、カメラセンサを含む。
【0023】
本発明の一実施形態によれば、試料の複数の測定領域から放出された光の強度を決定するために、装置は、上記複数の測定領域を、一度に１つの測定領域ずつ連続して照射するように構成されている。
【0024】
本発明の一実施形態によれば、装置は、第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするため、試料の画像を形成するように構成されている。
【0025】
本発明の一実施形態によれば、第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするために試料の画像を形成するため、装置は、ウェルの底部全体を照射するように構成されている。
【0026】
本発明の一実施形態によれば、装置は、第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数をカウントするように構成された手段を含む。
【0027】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して以下により詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】本発明の一実施形態による方法のステップをフローチャートとして示す。
【図2】本発明による方法を実行するのに適した分析装置の主な要素を示す。
【図3】分析装置の制御システムの例を示す。
【図4】分析装置での使用に適したマイクロプレートの例を示す。
【図5】マイクロプレートのウェル内の測定点の例を示す。
【図6】分析装置の蛍光測定システムの例を概略図として示す。
【図7】分析装置の画像化システムの例を概略図として示す。
【図8】本発明による方法によって得られた蛍光アッセイの測定結果の一例を示す。
【図10】ＥＬＩＳｐｏｔ／ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイのワークフローを概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、マイクロプレートのウェル内に配置された１つ以上の試料を分析する方法、分析装置、および分析装置を動作させるためのコンピュータプログラムに関する。
【0030】
本発明による方法では、試料から放出される光の強度が測定される。したがって、この方法は、ライフサイエンスで一般的に使用されている蛍光ベースのアッセイで使用できる。
【0031】
蛍光は発光の一形態である。蛍光手段は、光または他の電磁放射を吸収した物質による光（光子）の放出に基づいている。エネルギーの吸収は、分子の軌道電子をより高い電子状態に励起し、基底状態への緩和が光子を放出する。
【0032】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔなどの蛍光アッセイは、蛍光色素分子の特性を利用する。蛍光色素分子は、ある波長の光エネルギーを吸収し、それに応じて、別の、典型的にはより長い波長の光エネルギーを再放出する。各蛍光色素分子は、光を吸収する波長の明確な範囲、および光を放出する波長の別の明確な範囲を有する。この特性は、それらを分析機器および分析技術による生物学的産物の特定の検出に使用できるようにする。
【0033】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイは、一般的に使用されるＥＬＩＳｐｏｔアッセイの変形である。図１０に、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ／ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの概略図を示す。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイは、免疫応答の研究に使用できる。マイクロプレートのウェル２の底部は、膜を備えており、適切な抗体３０（捕捉抗体）でコーティングされている。細胞３１は、ウェル２内で培養および刺激されて、例えばサイトカイン、ケモカイン、または免疫グロブリンであり得る分析物３２を生成する。細胞３１によって分泌されたそのような分析物３２は、プレートに結合された抗体３０によって捕捉される。次に、細胞３１がウェル２から取り出される。分泌された分析物３２を検出するために、蛍光標識された検出蛍光色素分子抗体がウェル２に添加される。例えば、ビオチン化検出抗体３３およびストレプトアビジン－酵素複合体３４を使用することができる。このようにして、ウェルの底部の膜に固定された蛍光スポットが形成され、これらのスポットは分析装置を使用して検出することができる。右側のウェルはＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを示し、左側のウェルはＥＬＩＳｐｏｔアッセイを示している。１つのスポットは、分析物を分泌した１つのセルに対応すると想定される。蛍光スポットの数を数えることにより、抗原特異的Ｔ細胞の周波数を決定することが可能である。これは免疫学的アプリケーションで非常に関連性のあるパラメータである。
【0034】
蛍光アッセイでは、試料は、典型的にマイクロプレートのウェル内に配置される。図４は、マイクロプレート１の例を示す。マイクロプレート１（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロウェルプレート、マルチウェルプレート、またはマルチウェルとも呼ばれる）は、複数のウェル２、すなわち行と列とに配置された穴、を含む平坦なプレートである。マイクロプレート１のウェル２は、試料を受容し、小さな試験管として機能するように構成されている。典型的なマイクロプレートは、６個、２４個、９６個、３８４個、または１５３６個のウェルを含むが、より大きなマイクロプレートも存在する。ウェル２は、辺の比率が典型的には２：３である矩形行列に配置される。図４は、９６個のウェル２を持つマイクロプレート１を示している。しかしながら、他のマイクロプレートサイズも、本発明による方法および装置で使用され得る。
【0035】
図１は、本発明の実施形態による方法のステップを示している。この方法の第１のステップ１０１において、第１の所定の波長または波長範囲を有する電磁放射が生成される。この方法の第２のステップ１０２において、マイクロプレート１の上から試料３に電磁放射を透過させることによって、試料３に電磁放射が照射される。この方法の第３のステップ１０３において、試料３から放出され、第２の所定の波長または波長範囲を有する光は、ウェル２の上端を介して検出器または検出手段に送信される。第２の波長または波長範囲は、第１の所定の波長または波長範囲とは異なる。この方法の第４のステップ１０４において、試料３の１つ以上の所定の測定領域２３から放出された光の強度が決定される。測定領域２３の例を図５に示す。図５の例では、ウェル２内に複数の測定領域２３が存在する。しかしながら、複数の測定領域２３の代わりに、単一の測定領域が存在する可能性がある。単一の測定領域は、ウェル２の底部全体を覆うことができる。この方法の第５のステップ１０５において、試料３から放出され、第２の所定の波長または波長範囲を有する光の総光量を表す結果値が、測定領域２３から放出された光の決定された強度に基づいて決定される。したがって、分析された試料に対して単一の結果値が決定される。この値は、試料に存在する蛍光スポットの数と相関している。第５のステップ１０５は、コンピュータに実装される。本発明による方法は、分析装置によって実施することができる。
【0036】
この方法は、第６のステップ１０６をさらに含むことができる。この方法の第６のステップ１０６において、第２の所定の波長または波長範囲を有する光を放出するスポットの数がカウントされる。第６のステップ１０６は、コンピュータに実装される。結果値の決定およびスポットのカウントは、上記の順序で行う必要はないが、例えば、結果値が決定される前に、または方法の第５のステップ１０５と同時にスポットをカウントすることもできる。同一の検出手段または異なる検出手段のいずれかを、スポットカウントおよび放出された光の強度を決定するために使用することができる。試料は、スポットカウントと放出された光の強度を決定するために別々に照射されることができる。例えば、スポットカウントのためには、ウェルの底部全体を一度に照射することが可能であるのに対し、放出された光の強度を決定するためには、試料を複数の測定領域に分割し、一度に１つの測定領域を照射することが可能である。
【0037】
本発明による方法の利点は、分析が使用者の判断にあまり依存しないことである。さらに、蛍光スポットを単にカウントする場合に比べ、この方法は、蛍光スポットの数が多すぎてカウントの信頼性が低下するような場合であっても測定を可能にするため、より広域な動的信号範囲を提供する。
【0038】
本発明による方法は、分析装置１０によって実施することができる。マイクロプレート１は、典型的には試料を保持するために使用されるため、そのような分析装置を、本明細書ではマイクロプレートリーダーと呼ぶ。
【0039】
本発明による方法を実施するのに適したマイクロプレートリーダー１０の主要部分を、図２に概略的に示す。マイクロプレートリーダー１０は、マイクロプレート１（図２には示されていない）内の試料３の生物学的、化学的、または物理的事象を検出し得る。マイクロプレートリーダーの動作は、吸光度または発光などの異なる現象に基づき得る。本発明による方法は、蛍光ベースのアッセイに使用できるため、この方法を実施するために使用されるマイクロプレートリーダー１０は、少なくとも蛍光を測定するように構成されている。しかしながら、マイクロプレートリーダー１０は、異なるアッセイに使用可能なマルチモードリーダーであってもよい。
【0040】
マイクロプレートリーダー１０は、マイクロプレート１のウェル２内に配置された試料３から放出された電磁放射を測定するように構成されている。マイクロプレートリーダー１０は、特定の波長または波長範囲を有する電磁放射を生成することができる照射装置または照射手段１１を含む。波長は、好ましくは、マイクロプレートリーダー１０の使用者によって選択され得る。電磁放射は、可視光（波長範囲約３８０～７５０ｎｍ）、紫外光（１０～３８０ｎｍ）、または赤外光（７５０ｎｍ～１ｍｍ）であり得る。照射手段１１は、マイクロプレート１のウェル２内に配置された試料３を照射するように構成されている。１つの試料３または試料の一部は一度に照射されることができ、またはマイクロプレートリーダー１０は、一度に複数の試料を照射するように構成することができる。
【0041】
照射手段１１は、キセノンフラッシュランプまたはハロゲンランプなどの電球であり得る、光源１６を含む。代わりに、光源１６は、ＬＥＤまたはレーザーであってもよい。照射手段１１は、併用可能ないくつかの光源を含んでもよく、または異なる測定目的のために異なる光源が使用されてもよい。照射手段１１がレーザーを含む場合、特定の波長を有する光を直接生成することができる。光源１６がより広いスペクトルを有する光を生成する場合、マイクロプレートリーダー１０は、試料３を照射するために使用される光の波長、すなわち励起波長を選択するための手段１７を含むことができる。励起波長を選択するための手段１７（励起波長セレクタ）は、１つ以上のフィルタおよび／またはモノクロメータを含むことができる。
【0042】
マイクロプレートリーダー１０は、検出手段１３をさらに含む。検出手段１３は、試料３から放出された電磁放射を測定するように構成されている。検出手段１３は、例えば、光電子増倍管、カメラセンサ、またはシリコンフォトダイオードを含むことができる。マイクロプレートリーダー１０は、異なる測定のための２つ以上の異なる検出手段１３を含むことができる。検出手段１３は、図５の例に示されるような、試料の１つ以上の測定領域２３から放出される光の強度を測定するように構成されている。検出手段１３はまた、蛍光スポットのカウントを可能にするための試料の画像を形成するために使用され得る。
【0043】
マイクロプレートリーダー１０は、照明光学系および測定光学系１８をさらに含む。照明光学系は、光源１６からの電磁放射を試料３に集束させるように構成される。測定光学系は、試料３によって放出された光を検出手段１３に集束させるように構成される。照明光学系と測定光学系は、少なくとも部分的に同じであり得る。
【0044】
マイクロプレートリーダー１０は、測定される放射波長を選択するための手段１９をさらに含むことができる。手段１９（測定波長セレクタ）は、例えば、検出手段１３の前に配置されるフィルタであり得る。波長選択手段１９は、測定対象となる波長のみを通過させるために使用される。したがって、励起光は、検出手段１３から遮断することができる。
【0045】
マイクロプレートリーダー１０は、試料３を測定位置に移動させるための位置決めシステムまたは位置決め手段２９をさらに含んでもよい。位置決め手段２９は、マイクロプレートを動かすように構成されることができる。代わりに、位置決め手段２９は、検出手段１３を移動させるように構成されてもよく、かつ／または選択された試料の蛍光を測定するために、照明光学系および測定光学系を制御するように構成されてもよい。
【0046】
図３は、マイクロプレートリーダー１０の制御システムの例を示している。マイクロプレートリーダー１０は、入力手段１４を介して制御される。入力手段１４は、例えば、操作ボタン、キーボード、および／またはタッチディスプレイを含み得る。入力手段１４を介して、マイクロプレートリーダー１０の使用者は、マイクロプレートリーダー１０の動作を制御し、パラメータを調整し、かつ／またはマイクロプレートリーダー１０の設定を変更することができる。分析の結果は、ディスプレイ１２に表示することができる。ディスプレイ１２は、マイクロプレートリーダー１０の一体部分であっても、マイクロプレートリーダー１０に接続された外部ディスプレイであってもよい。入力手段１４、照射手段１１、検出手段１３、およびディスプレイ１２は、中央処理ユニット（ＣＰＵ）１５と通信する。また、位置決め手段２９は、ＣＰＵ１５によって制御される。入力手段１４およびディスプレイ１２は、ＣＰＵ１５に直接接続される必要はない。マイクロプレートリーダー１０は、ＰＣなどの外部汎用コンピュータ２１にインストールされたソフトウェアを介して制御されることもできる。したがって、入力手段１４は、例えば、外部コンピュータ２１に接続されたキーボードを含み得る。ディスプレイ１２を外部コンピュータ２１に接続することもできる。すべての接続を有線または任意の無線手段によって実装することができ、外部コンピュータ２１は、リモートサーバまたはクラウドサーバであってもよい。
【0047】
マイクロプレートリーダー１０が蛍光アッセイに使用される場合、使用者は最初に、試料を照射するための所望の波長を設定する。使用者は、入力手段１４を介して所望の励起波長を選択することができる。マイクロプレートリーダー１０はまた、特定の励起バンド幅の選択を可能にし得、その場合、使用者は、試料を照射するための特定の波長範囲を選択することができる。実際には、特定の励起波長が選択された場合でも、マイクロプレートリーダー１０は、特定のバンド幅で電磁放射を生成することができる。通常、狭いバンド幅が好ましい。許容可能なバンド幅は、用途に依存する。場合によっては、２０ｎｍのバンド幅で十分である。一部の用途では、バンド幅は、最大１０ｎｍであるべきである。一部の用途では、バンド幅は、２．５ｎｍを超えるべきではない。
【0048】
検出手段１３からの測定データは、ＣＰＵ１５によって収集される。このデータは、光の総光量を表す結果値を計算するため、または特定の波長で試料３から放出される光の総光量の推定値を計算するために使用される。結果値を計算するために、ＣＰＵ１５または外部コンピュータ２１のいずれかを使用することができる。ＣＰＵ１５または外部コンピュータ２１は、蛍光スポットの数をカウントするようにさらに構成されることができる。
【0049】
本発明によるマイクロプレートリーダー１０は、試料から放出された電磁放射を測定することと、試料の画像を形成することと、の両方のために構成されることができる。したがって、マイクロプレートリーダー１０は、蛍光測定手段および画像化手段の両方を含むことができる。蛍光の測定と試料の画像化に使用される手段は、少なくとも部分的に同じであってもよいが、以下では、図６および図７を参照して手段を個別に説明する。
【0050】
図６は、マイクロプレートリーダー１０の蛍光測定システムの例を簡略図として示しており、これは、照射手段１１によって励起されたときに試料３から放出された電磁放射を測定するように構成される。図６の例では、照射手段１１は、光源１６を含む。光源１６は、キセノンフラッシュランプなどの広バンド幅ランプであり得る。光源１６はまた、例えば、石英ハロゲンランプであり得る。光源１６は、広いスペクトルを有する、可視光（波長範囲約３８０～７５０ｎｍ）、紫外光（１０～３８０ｎｍ）、または赤外光（７５０ｎｍ～１ｍｍ）などの電磁放射を生成する。特定の波長を選択するために、照射手段１１は、モノクロメータ１７をさらに含む。モノクロメータ１７は、狭いバンド幅の光ビームを生成する。一例によれば、モノクロメータ１７の後の光のバンド幅は、２．５ｎｍ未満である。ただし、一部の用途では、より広いバンド幅でも十分である。モノクロメータの代わりに、干渉フィルタを、波長選択のための手段として使用することもできる。光源はまた、ＬＥＤまたはレーザーなどの狭いバンドの光源であってもよい。その場合、モノクロメータ、干渉フィルタ、または波長選択のための他の外部手段は必要ない場合がある。
【0051】
光源１６からの光ビームは、マイクロプレートリーダー１０の光学系を介してモノクロメータ１７を透過する。図６の例では、光源１６とモノクロメータ１７との間の光学系は、ミラー２３と入射スリット２４を含む。しかしながら、マイクロプレートリーダー１０の光学系は、多くの異なる方法で構築され得る。
【0052】
図６の例では、光は、モノクロメータ１７から、出口スリット２５および光ファイバ２２を介してマイクロプレートに透過される。光は、照明光学系１８によって、マイクロプレートのウェル２内に配置された試料に集束される。試料は上から照射される。試料から放出された光の強度は、シリコンフォトダイオードまたは光電子増倍管などの検出器１３によって測定される。図６のマイクロプレートリーダー１０は、上部読み取り用に構成されている。
【0053】
マイクロプレート１と検出器１３との間に波長フィルタを配置して、放出された光子を励起光子から分離することができる。マイクロプレートリーダー１０は、背景蛍光を除去するため、または１つの試料内の複数の蛍光色素分子に由来する蛍光シグナルを分離するために、検出器１３の前に、ローパス放出フィルタまたはバンドパス放出フィルタなどの放出フィルタをさらに含むことができる。
【0054】
蛍光測定システムは、好ましくは、試料の複数の測定領域２３から放出された光の強度を測定するように構成される。ただし、単一の測定領域が使用されてもよい。測定領域２３または単一の測定領域は、好ましくは、マイクロプレート１のウェル２の底部全体を覆う。マイクロプレートリーダー１０は、試料３の１つの測定領域２３を一度に照射するように構成することができる。測定領域２３が照射され、領域２３から放出された光の強度が、検出手段１３によって測定される。試料を照射するために使用される光ビームの直径はまた、例えば、ウェルの直径の２０～６０パーセントであり得る。細いビームを使用することにより、照射強度を高め、測定の感度を上げることが可能となる。測定された強度に基づいて、試料の結果値が計算される。単一の測定領域の場合、結果値は単一の測定領域の測定強度に基づく。
【0055】
図５の実施形態では、２つの隣接する測定領域２３の中心点間の距離は、照射ビームの半径に相当するように構成されている。例えば、ビームの直径が３ｍｍである場合、このビームは、２つの隣接する測定領域２３の間で１．５ｍｍ移動される。
【0056】
マイクロプレートリーダー１０は、蛍光スポットの数をカウントするための画像化システムをさらに含む。図７は、マイクロプレートリーダー１０の画像化システムの例を示している。図７の画像化システムは、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔおよびＥＬＩＳｐｏｔアッセイに適しているが、他のアッセイにも使用可能である。マイクロプレートリーダー１０は、照射手段１１を含む。照射手段１１の機能は、マイクロプレート１のウェル２内の試料を照射するために使用される光を生成することである。図７のマイクロプレートリーダーでは、マイクロプレート１の１つのウェル２と１つの試料が一度に照射される。照射手段１１は、光源１６を含む。照射手段１１から、光はビームスプリッタ７に向けられる。ビームスプリッタ７は、光の一部を反射し、残りの光を透過させるように構成された光学装置である。実際には、ビームスプリッタ７によって受け取られた光の一部が吸収される。ビームスプリッタ７は、反射光をマイクロプレートリーダー１０の読み取り面２６に向けるように構成されている。ビームスプリッタ７は、例えば、互いに接着された２つの三角形のガラスプリズムで作ることができる。代わりに、ビームスプリッタ７は、コーティングされたガラス板であってもよい。ビームスプリッタ７はさまざまな特性を有することができる。光学式リーダーの最適なビーム分割率は５０～５０％である。すなわち、ビームスプリッタ７によって反射される光の量は、ビームスプリッタ７によって透過される光の量に等しい。したがって、光の半分がビームスプリッタ７によって吸収されずに反射され、光の半分が透過される。しかしながら、反射された光の部分は、例えば、４０～６０パーセントの範囲にあり得る。
【0057】
ビームスプリッタ７と読み取り面２６との間に、少なくとも１つのレンズ８ａを含むレンズシステム８が配置されている。図１には、単一のレンズ８ａのみが示されているが、実際には、レンズシステム８は、複数のレンズを含むことができる。レンズシステム８は、照射装置１１およびビームスプリッタ７から受け取った光を、マイクロプレート１のウェル２の底部に配置された試料に集束させるように配置されている。レンズシステム８は、レンズ８ａと読み取り面２６との間に配置された開口部８ｂをさらに含む。
【0058】
マイクロプレート１のウェル２の底部およびウェル２内の試料は、光の一部をレンズシステム８に向けて反射して戻す。蛍光測定では、試料は、マイクロプレート１からレンズシステム８に向かって光を放出する。レンズシステム８は、試料の画像を、検出手段として機能する画像化装置１３に焦点を合わせるように構成されている。したがって、同じレンズシステム８が、試料を照射するために使用される光を集束させるため、およびマイクロプレート１から受け取った光を集束させるために使用される。したがって、同じ構成要素が照明光学系と測定光学系の両方を形成する。レンズシステム８から、光はビームスプリッタ７に向けられる。光の一部は、ビームスプリッタ７から照射装置１１に向かって反射されるが、光の一部は、ビームスプリッタ７を通過して、画像化装置１３に到達することができる。ビームスプリッタ７のビーム分割率が５０～５０％であり、かつビームスプリッタ７による吸収が省略された場合、光の半分が反射され、光の半分がビームスプリッタ７を透過する。画像化装置１３は、デジタルカメラセンサ１３ａを含むことができる。画像化装置１３は、各試料の１つ以上の画像を撮影するように構成されている。
【0059】
レンズシステム８のレンズ８ａと読み取り面２６との間の開口８ｂは、マイクロプレート３のウェル２の直径の最大でも同じ直径を有するような寸法にされる。これにより、試料と画像化装置１３の両方でビネットが除去される。開口部８ｂは、マイクロプレートリーダーが異なるマイクロプレート１内の試料を分析するために使用されることを可能にするように調整可能であり得る。開口部を用いることにより、ウェル２の底部にある照射領域のサイズを調整できる。例えば、典型的な９６ウェルプレートでは、照射領域の直径は約６．６ｍｍであり得、３８４ウェルプレートでは２．５ｍｍであり得る。
【0060】
光源１６は、例えば、ＬＥＤまたはＬＥＤのグループであり得る。マイクロプレート１のウェル２の底部にある照射領域は、底部全体を覆う必要がある。典型的なＬＥＤチップの直径は、マイクロプレート１のウェル２の直径よりもはるかに小さい。照射領域のサイズは、レンズシステム８の影響を受ける可能性がある。ただし、ＬＥＤまたは他の光源の周囲に、ウルブリヒト球とも呼ばれる積分球を配置することにより、照射領域のサイズを大きくすることが有益な場合がある。
【0061】
マイクロプレートリーダーは、マイクロプレート１を動かすように構成された、位置決め手段（図７には示されていない）をさらに含む。マイクロプレート１が読み取り面２６内で動かされることにより、一度に１つのウェル２がレンズシステム８の下にくるようにする。試料のさまざまな画像が撮影され、次にマイクロプレート１が動かされることにより、次のウェル２がレンズシステム８の下にくる。
【0062】
図７のマイクロプレートリーダーは、照射手段１１によって生成され、ビームスプリッタ７を透過する光の強度を測定するように配置された、参照検出器２８をさらに含む。ＬＥＤが光源１６として使用される場合、このＬＥＤの強度は、加熱によって変化する可能性があり、これは画像化装置１３によって撮影された画像に影響を与える。光の強度を測定することにより、マイクロプレートリーダーの測定結果を解釈する際にこの影響を考慮に入れることができる。
【0063】
マイクロプレートリーダーはさらに、照射手段１１とビームスプリッタ７との間に配置された第１のフィルタ１７を備えている。第１のフィルタ１７は、蛍光アッセイで使用される。第１のフィルタ１７は、試料を励起するために必要とされる光源１６のスペクトルのその部分のみを通過させるように構成されている。したがって、第１のフィルタ１７は、励起波長を選択するための手段として使用される。第２のフィルタ１９は、ビームスプリッタ７と画像化装置１３との間に配置されている。第１のフィルタ１２と同様に、第２のフィルタ１９も蛍光アッセイで使用される。第２のフィルタ１９は、試料から放出された波長からなる光を通過させるように構成されている。
【0064】
図７の実施形態では、画像化装置１３は、レンズシステム８の真上に配置されている。照射手段１１は、ビームスプリッタ７と同じ水平面に配置されている。したがって、照射手段からの光はマイクロプレート１に反射され、マイクロプレート１からの光はビームスプリッタ７を透過する。この配置は、試料の照射を乱すことなく、参照検出器２８の使用を可能にする。しかしながら、画像化装置１３と照射手段１１の場所を切り替えることも可能であろう。したがって、試料を照射するために使用される光は、ビームスプリッタ７を通過することができ、試料の画像は、ビームスプリッタ７によって画像化装置１３に反射されることができる。
【0065】
この画像化システムによって形成された画像は、試料の蛍光スポットをカウントするために使用することができる。したがって、マイクロプレートリーダー１０または外部コンピュータ２１の中央処理装置１５は、試料内の蛍光スポットの数を決定するように構成することができる。
【0066】
したがって、本発明によるマイクロプレートリーダー１０は、図６のシステムなどの蛍光測定システムと、図７のシステムなどの画像化システムの、両方を含むことができる。したがって、マイクロプレートリーダー１０は、試料から放出される光の強度を測定し、試料の画像を形成するように構成することができる。これにより、試料のより包括的な分析が可能となる。蛍光測定システムと画像化システムの構成要素の一部は同じにすることができる。例えば、同じ光源１６を両方のシステムで使用することができる。また、測定光学系および照明光学系は、放出された光の強度を測定することおよび試料を画像化することの両方のため、少なくとも部分的に同じであり得る。画像化システムは、蛍光を測定するためにも使用できる。放出された光の強度は、カメラセンサ１３ａによって決定することができ、したがって、放出された光の強度を測定するための別個のシステムは必要とされないであろう。
【0067】
図８および図９は、本発明の実施形態による方法によって得られた結果の例を示している。この方法を、９６ウェルマイクロプレートのウェルに配置された試料に適用し、ウェル底部の直径は６ｍｍであった。試料を照射するために使用された光ビームの直径は３ｍｍであった。測定領域は、図５に示すように配置された。したがって、この測定領域は、５行５列からなるマトリックスを形成している。光ビームは、一度に１．５ｍｍ移動した。図８は、放出された光の強度を決定するステップの結果を示し、図９は、スポットカウントステップによって得られた結果を示している。両方の図のＸ軸には、抗原提示細胞、この場合はヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の量（ＰＢＭＣの量／ウェル）が示されている。図８は、Ｙ軸に、複数の測定点で５２０ｎｍの波長で放出された光の測定された強度に基づいて計算された蛍光結果値を示している。励起光の波長は４８０ｎｍである。図９は、Ｙ軸に、試料からカウントされたスポットの数を示している。どちらの場合も、ＩＦＮ－γ産生細胞の数が測定される。図８および図９の上側のドットは刺激された試料を表し、下側のドットはブランク（刺激されていない試料）を表す。
【0068】
多点蛍光測定の読み出し値は、細胞濃度の全範囲（サイトカイン産生の低レベルおよび非常に高レベル）で直線的に増加する一方、スポット数はプラトーまでほぼ直線的に増加し、これは、ウェルあたりの検出可能なスポットの最大数と一致する。これは、スポットがウェル上で混雑しすぎた場合に、背景からスポットを分割するための画像ベースの方法の本質的な制限に起因するものである。一方、スポットカウント方法の検出の制限は、蛍光強度測定に基づくものよりも優れている。したがって、両方の読み出しを組み合わせることにより、アッセイの動的範囲を拡大しながら、スポットカウント方法の検出制限を低く維持することが可能となる。例えば、スポットカウントの代わりに、測定された蛍光信号を使用して、高周波数値での抗原陽性細胞の周波数の予測を行うことが可能であるが、これは上記のような場合には信頼性が低くなる。
【0069】
本発明による方法は、例えば、マイクロプレートの迅速なスクリーニングに使用することができる。この方法により、さらなる分析のために採取すべき試料を特定できる。この方法は、蛍光スポットの数が多すぎて単一スポットを数えられない場合に特に有益である。スポットカウントと蛍光信号の計算の組み合わせは、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔデータ分析の包括的な解決法を提供し、スポットのカウントが失敗した場合のトラブルシューティングを可能にする。
【0070】
本発明は上に記載される実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲内で変化し得ることを当業者は理解するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】