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特許7641512ＴＬＲ７アゴニストにカップリングする新規コロナウイルスポリペプチドワクチンおよびその適用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-27
(45)【発行日】2025-03-07
(54)【発明の名称】ＴＬＲ７アゴニストにカップリングする新規コロナウイルスポリペプチドワクチンおよびその適用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/165 20060101AFI20250228BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250228BHJP
C07K 7/04 20060101ALI20250228BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20250228BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20250228BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20250228BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20250228BHJP
C12N 5/0787 20100101ALI20250228BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20250228BHJP
A61K 35/15 20250101ALI20250228BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250228BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250228BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20250228BHJP
【ＦＩ】
C07K14/165
C07K19/00 ZNA
C07K7/04
C12N5/0784
C12N5/0783
C12N5/078
C12N5/0786
C12N5/0787
A61K39/215
A61K35/15
A61K35/17
A61P31/14
C12N15/50
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2022575358
(86)(22)【出願日】2020-12-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-10
(86)【国際出願番号】 CN2020133168
(87)【国際公開番号】W WO2021248853
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2023-01-20
(31)【優先権主張番号】202010514683.8
(32)【優先日】2020-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】512148861
【氏名又は名称】シャンハイ インスティチュート オブ マテリア メディカ，チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】コン，リークン
(72)【発明者】
【氏名】レン，ジン
(72)【発明者】
【氏名】ジン，グァンイー
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】チン，ジョーピン
(72)【発明者】
【氏名】ロン，イールー
(72)【発明者】
【氏名】ソン，チェンホア
(72)【発明者】
【氏名】リュウ，ティンティン
(72)【発明者】
【氏名】タン，フェン
(72)【発明者】
【氏名】チュー，ペン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１１２１７９１７（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１９２４５４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５１６０４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２８４４４５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】bioRxiv，2020年04月16日，https://doi.org/10.1101/2020.04.15.040618
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチンポリペプチドであって、前記ワクチンポリペプチドは、式Ｉの構造または式Ｉの構造を含むオリゴマーを有し、
式（Ｉ）：Ｚ－（Ｊ－Ｕ）ｎ
前記式において、
Ｚは、抗原ポリペプチドであり、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有し、また、前記抗原ポリペプチドは、前記Ｓタンパク質のＲＢＭ（受容体結合モチーフ）領域に由来するアミノ酸配列を有し、前記抗原ポリペプチドの長さは、８～１００個のアミノ酸であり、前記抗原ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、６、７、または１２で示されるものであり、
Ｕは、それぞれ独立して、ＴＬＲ７アゴニストであり、前記ＴＬＲ７アゴニストは、小分子アゴニストであり、
ｎは、１、２、３，４，５、又は６である正の整数であり、
Ｊは、化学結合またはリンカーであり、
前記ワクチンポリペプチドは、霊長類動物および齧歯類動物を刺激して、新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＲＢＤ（受容体結合ドメイン）領域のＡＣＥ２への結合を遮断する中和抗体を発生させることができること
を特徴とする、前記新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチンポリペプチド。
【請求項2】
前記ワクチンポリペプチドは、霊長類動物を刺激して、新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるＲＢＤ領域のＡＣＥ２への結合を遮断する中和抗体を発生させることができることを特徴とする、請求項１に記載のワクチンポリペプチド。
【請求項3】
前記ＴＬＲ７アゴニストは、ＳＺＵ－１０１【化1】
【請求項4】
前記ＳＺＵ－１０１は、抗原ポリペプチドのアミノ基に結合し、Ｓ１に示される構造【化2】
を形成し、または
前記ＳＺＵ－１０１は、抗原ポリペプチドのスルフヒドリル基に結合し、Ｓ２に示される構造
【化3】
を形成することを特徴とする、請求項３に記載のワクチンポリペプチド。
【請求項5】
前記Ｕは、固定点でＺに結合し、前記ワクチンポリペプチドは、以下の群のカップリングペプチドから選択され、
（Ｓ１）－ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ－（Ｓ１）（配列番号１４）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＧのＮ末端アミノ基とＫの側鎖アミノ基とに結合し、
（Ｓ１）２－ＫＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲ（配列番号１５）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＫのＮ末端と側鎖アミノ基とに結合し、
（Ｓ１）－ＬＦＲＫ（－Ｓ１）ＳＮＬＫ（－Ｓ１）ＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（配列番号１２）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＬのＮ末端アミノ基とＫの側鎖アミノ基とに結合し、
ＧＶＥＧＦＮＣ（－Ｓ２）ＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ（配列番号１４）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してアミノ酸配列におけるＣ上のスルフヒドリルに結合し、
（Ｓ２）－ＣＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ（配列番号１６）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
（Ｓ２）－ＣＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮ（配列番号５）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
（Ｓ２）－ＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ（配列番号６）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合することを特徴とする、請求項４に記載のワクチンポリペプチド。
【請求項6】
少なくとも二つの種の請求項１に記載の新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチンポリペプチドを含むことを特徴とする、単離されたペプチド集合。
【請求項7】
請求項１に記載の新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチンポリペプチドまたは請求項６に記載のペプチド集合、および薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項8】
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはその関連疾患を予防するための薬物の調製に使用されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチンポリペプチドまたは請求項６に記載のペプチド集合または請求項７に記載の医薬組成物の使用方法。
【請求項9】
（ａ）請求項１に記載のワクチンポリペプチドまたは請求項６に記載のペプチド集合による免疫により活性化された免疫細胞、および（ｂ）薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、細胞製剤。
【請求項10】
前記免疫細胞は、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞ＮＫ、リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、またはその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の細胞製剤。
【請求項11】
融合タンパク質であって、キャリアタンパク質および前記融合タンパク質に融合する請求項１に記載のワクチンポリペプチドを含むことを特徴とする、前記融合タンパク質。
【請求項12】
（ａ）請求項１１に記載の融合タンパク質またはその免疫により活性化された免疫細胞、および（ｂ）薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリペプチド薬およびポリペプチドワクチンの分野に関し、具体的には、ＴＬＲ７小分子アゴニストにカップリングする新規コロナウイルスポリペプチドワクチンおよびその適用に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる新規コロナウイルス肺炎（Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）は、伝染性が高く、世界中で深刻な流行を引き起こし、何百万の人々の命を危険にさらしている。しかしながら、現在ＣＯＶＩＤ－１９に対する明確で有効な予防、治療薬および対策はまだなく、臨床的にはサポーティブプレイ・チョーセラピーおよび対症療法が中心である。
【0003】
ワクチンを通じてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する集団免疫を構築することは、ＣＯＶＩＤ－１９の流行を制御および遮断するための最終的な方法である。現在、弱毒性ワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、組換えタンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチンおよびポリペプチドワクチン等の様々な種類のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが前臨床および臨床試験の段階にある。
【0004】
しかしながら、現在開発されているワクチンによる免疫保護作用は、限界があり、例えば、免疫原性が低く、ウイルス免疫逃避等の問題が存在する。
【0005】
従って、当技術分野では、人体を効率的に刺激してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を生成し、ワクチン接種を受けた人に遮断性抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を生成することにより、強力な免疫保護作用を提供する、新しいワクチンを開発する緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、人体を効率的に刺激してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を生成し、ワクチン接種を受けた人に遮断性抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を生成することにより、強力な免疫保護作用を提供する、新しいワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の態様は、新規コロナウイルスのワクチンポリペプチドを提供し、前記ワクチンポリペプチドは、抗原ポリペプチドおよび任意選択で前記抗原ポリペプチドにカップリングするＴＬＲ７アゴニストを含む。
【0008】
別の好ましい例において、前記ワクチンポリペプチドは、式Ｖの構造または式Ｖの構造を含むオリゴマーを有し、
式（Ｖ）：Ｚ－（Ｕ）ｎ
式において、
Ｚは、抗原ポリペプチドであり、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有し、また、前記抗原ポリペプチドは、Ｓタンパク質のＲＢＭ領域に由来するアミノ酸配列を有し、
Ｕは、それぞれ独立して、ＴＬＲ７アゴニストであり、
ｎは、０または正の整数であり、
「－」は、化学結合またはリンカーまたはコネクタである。
式（Ｖ）：Ｚ－（Ｕ）ｎ
式において、
Ｚは、抗原ポリペプチドであり、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有し、また、前記抗原ポリペプチドは、Ｓタンパク質のＲＢＭ領域に由来するアミノ酸配列を有し、
Ｕは、それぞれ独立して、ＴＬＲ７アゴニストであり、
ｎは、０または正の整数であり、
「－」は、化学結合またはリンカーまたはコネクタである。
【0009】
別の好ましい例において、前記ワクチンポリペプチドは、式Ｉの構造または式Ｉの構造を含むオリゴマーを有し、
式（Ｉ）：Ｚ－（Ｊ－Ｕ）ｎ
式において、
Ｚは、抗原ポリペプチドであり、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有し、また、前記抗原ポリペプチドは、Ｓタンパク質のＲＢＭ領域に由来するアミノ酸配列を有し、
Ｕは、それぞれ独立して、ＴＬＲ７アゴニストであり、
ｎは、０または正の整数であり、
Ｊは、化学結合またはコネクタである。
式（Ｉ）：Ｚ－（Ｊ－Ｕ）ｎ
式において、
Ｚは、抗原ポリペプチドであり、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有し、また、前記抗原ポリペプチドは、Ｓタンパク質のＲＢＭ領域に由来するアミノ酸配列を有し、
Ｕは、それぞれ独立して、ＴＬＲ７アゴニストであり、
ｎは、０または正の整数であり、
Ｊは、化学結合またはコネクタである。
【0010】
別の好ましい例において、前記ワクチンポリペプチドは、霊長類動物および齧歯類動物を刺激してＲＢＤのＡＣＥ２への結合を遮断する中和抗体を発生させることができる。
【0011】
別の好ましい例において、前記ワクチンポリペプチドは、霊長類動物を刺激して細胞性免疫および体液性免疫を発生させることができる。
【0012】
別の好ましい例において、前記霊長類動物は、ヒトおよび非ヒト霊長類動物を含む。
【0013】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドの長さは、８～１００個のアミノ酸、好ましくは１０～８０個のアミノ酸である。
【0014】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤ領域に由来するアミノ酸配列を有する。
【0015】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、ＲＢＤ領域のＲＢＭ領域に由来するアミノ酸配列を有する。
【0016】
別の好ましい例において、前記ＲＢＭ領域とは、新規コロナウイルスのＲＢＤタンパク質の４３８～５０６位のアミノ酸を指す。
【0017】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドの「ＲＢＤタンパク質のＲＢＭ領域に由来するアミノ酸配列」とは、前記抗原ポリペプチドのアミノ酸配列がＲＢＭ領域と相同性（または同一性）を有することを指し、前記相同性は、≧８０％、好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。
【0018】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスのＳタンパク質にヒトＡＣＥ２タンパク質と競合的結合する。
【0019】
別の好ましい例において、前記「競合的結合」とは、前記抗原ポリペプチドが、新規コロナウイルスのＳタンパク質と同じまたは実質的に同じヒトＡＣＥ２タンパク質の結合ドメイン（またはアミノ酸セグメント）に結合することを指す。
【0020】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスのＳタンパク質とヒトＡＣＥ２タンパク質の同じ結合セグメントに結合する。
【0021】
別の好ましい例において、前記競合的結合は、遮断性または非遮断性競合的結合を含む。
【0022】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、人工的合成または組換え抗原ポリペプチドである。
【0023】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１～１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）におけるポリペプチドのアミノ酸配列に一つもしくは複数のアミノ酸を付加するか、一つもしくは複数のアミノ酸を置換するか、または１～３個のアミノ酸を欠失することにより形成される誘導ポリペプチドからなる群から選択され、前記誘導ポリペプチドは、誘導前の元のポリペプチドと実質的に同じ機能を有する。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１～１２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）におけるポリペプチドのアミノ酸配列に一つもしくは複数のアミノ酸を付加するか、一つもしくは複数のアミノ酸を置換するか、または１～３個のアミノ酸を欠失することにより形成される誘導ポリペプチドからなる群から選択され、前記誘導ポリペプチドは、誘導前の元のポリペプチドと実質的に同じ機能を有する。
【0024】
別の好ましい例において、前記「実質的に同じ機能」とは、前記誘導ポリペプチドが誘発免疫応答と実質的に同じ免疫原性、新規コロナウイルスのＳタンパク質とヒトＡＣＥ２タンパク質に競合的結合する活性を有し、および／または少なくとも一つのＴ細胞エピトープを有し、および／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有する。
【0025】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドの構造は、式ＩＩに示されたとおりであり、
式（II）：Ｘ１－Ｘ－Ｘ２
式において、
（ａ）Ｘは、コアフラグメントであり、ここで、前記コアフラグメントの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２（表Ａを参照）の一つまたは複数から選択され、
（ｂ）Ｘ１、Ｘ２は、それぞれ独立して、なし、１、２または３個のアミノ酸であり、Ｘ１およびＸ２のアミノ酸数の合計は、≦４、好ましくは、３、２、１、より好ましくは０または１であり、
（ｃ）「－」とは、ペプチド結合、ペプチドリンカー、または他のコネクタを示す（即ち、Ｘ１とＸとの間および／またはＸとＸ２との間は、ペプチド結合、ペプチドリンカー（例えば、１～１５個のアミノ酸で構成される柔軟性リンカー）または他のコネクタによって結合される）。
式（II）：Ｘ１－Ｘ－Ｘ２
式において、
（ａ）Ｘは、コアフラグメントであり、ここで、前記コアフラグメントの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２（表Ａを参照）の一つまたは複数から選択され、
（ｂ）Ｘ１、Ｘ２は、それぞれ独立して、なし、１、２または３個のアミノ酸であり、Ｘ１およびＸ２のアミノ酸数の合計は、≦４、好ましくは、３、２、１、より好ましくは０または１であり、
（ｃ）「－」とは、ペプチド結合、ペプチドリンカー、または他のコネクタを示す（即ち、Ｘ１とＸとの間および／またはＸとＸ２との間は、ペプチド結合、ペプチドリンカー（例えば、１～１５個のアミノ酸で構成される柔軟性リンカー）または他のコネクタによって結合される）。
【0026】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、表Ａから選択される。
【0027】
【表1】
【0028】
別の好ましい例において、Ｘ１は、なし、Ｋ、またはＣである。
【0029】
別の好ましい例において、Ｘ２は、なし、Ｋ、またはＣである。
【0030】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤ領域の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有する。
【0031】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、新規コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＭ領域の少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有する。
【0032】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、少なくとも一つのＴ細胞エピトープ、好ましくは１、２、３または４個のＴ細胞エピトープ、より好ましくは１または２個のＴ細胞エピトープを有する。
【0033】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、少なくとも一つのＢ細胞エピトープ、好ましくは１、２、３または４個のＢ細胞エピトープ、より好ましくは１または２個のＢ細胞エピトープを有する。
【0034】
別の好ましい例において、前記抗原ポリペプチドは、１～２個のＴ細胞エピトープおよび０～２個のＢ細胞エピトープ、好ましくは１～２個のＴ細胞エピトープおよび０～１個のＢ細胞エピトープを有する。
【0035】
別の好ましい例において、ＴＬＲアゴニストの分子数ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは１、２、３または４である。
【0036】
別の好ましい例において、前記ＴＬＲ７アゴニストは、小分子アゴニストである。
【0037】
別の好ましい例において、前記ＴＬＲ７アゴニストは、ＳＺＵ－１０１を含む。
【0038】
【化1】
【0039】
別の好ましい例において、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＳＺＵ－１０１）は、抗原ポリペプチドのスルフヒドリル基に結合する。
【0040】
別の好ましい例において、前記ＳＺＵ－１０１は、抗原ポリペプチドのアミノ基に結合し、Ｓ１に示される構造を形成し、
式（Ｓ１）：
または
前記ＳＺＵ－１０１は、抗原ポリペプチドのスルフヒドリル基に結合し、Ｓ２に示される構造を形成する。
【化2】
または
前記ＳＺＵ－１０１は、抗原ポリペプチドのスルフヒドリル基に結合し、Ｓ２に示される構造を形成する。
【0041】
【化3】
別の好ましい例において、前記ＴＬＲ７アゴニストは、固定点でおよび／またはランダムに前記抗原ポリペプチドに結合する（即ち、式Ｉにおいて、前記Ｕは、固定点でおよび／またはランダムにＺに結合する）。
【0042】
別の好ましい例において、前記Ｕは、固定点でＺに結合する。
【0043】
別の好ましい例において、前記Ｕは、固定点で抗原ポリペプチドＺのＧ、Ｋ、Ｌ、Ａ、Ｃまたはその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸部位に結合する：。
【0044】
別の好ましい例において、前記ワクチンポリペプチドは、以下の群のカップリングペプチドから選択され、
前記ワクチンポリペプチドは、以下の群のカップリングペプチドから選択され、
（Ｓ１）－ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ－（Ｓ１）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＧのＮ末端アミノ基とＫの側鎖アミノ基とに結合し、
（Ｓ１）２－ＫＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１５）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＫのＮ末端と側鎖アミノ基とに結合し、
（Ｓ１）－ＬＦＲＫ（－Ｓ１）ＳＮＬＫ（－Ｓ１）ＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＬのＮ末端アミノ基とＫの側鎖アミノ基とに結合し、
ＧＶＥＧＦＮＣ（－Ｓ２）ＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してアミノ酸配列におけるＣ上のスルフヒドリルに結合し、
（Ｓ２）－ＣＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
（Ｓ２）－ＣＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
（Ｓ２）－ＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
またＳ１およびＳ２の構造は、上記で定義されたとおりである。
前記ワクチンポリペプチドは、以下の群のカップリングペプチドから選択され、
（Ｓ１）－ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ－（Ｓ１）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＧのＮ末端アミノ基とＫの側鎖アミノ基とに結合し、
（Ｓ１）２－ＫＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１５）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＫのＮ末端と側鎖アミノ基とに結合し、
（Ｓ１）－ＬＦＲＫ（－Ｓ１）ＳＮＬＫ（－Ｓ１）ＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ１構造を介してアミノ酸配列におけるＬのＮ末端アミノ基とＫの側鎖アミノ基とに結合し、
ＧＶＥＧＦＮＣ（－Ｓ２）ＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してアミノ酸配列におけるＣ上のスルフヒドリルに結合し、
（Ｓ２）－ＣＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
（Ｓ２）－ＣＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
（Ｓ２）－ＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）
ここで、ＳＺＵ－１０１は、Ｓ２構造を介してポリペプチドのＣ上のスルフヒドリル基に結合し、
またＳ１およびＳ２の構造は、上記で定義されたとおりである。
【0045】
別の好ましい例において、前記カップリングペプチドは、表Ｂから選択される。
【0046】
【表2】
【0047】
別の好ましい例において、前記ＴＬＲ７アゴニストは、ＳＵＺ－１０１である。
【0048】
本発明の第２の態様は、単離されたペプチド集合を提供し、前記ペプチド集合は、少なくとも二つの種の本発明の第１の態様に記載の新規コロナウイルスのワクチンポリペプチドを含む。
【0049】
別の好ましい例において、前記ペプチド集合は、少なくとも２～２０種、好ましくは２～１２種（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２種）の前記ワクチンポリペプチドを含む。
【0050】
本発明の第３の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明の第１の態様に記載の新規コロナウイルスのワクチンポリペプチドまたは本発明の第２の態様に記載のペプチド集合および薬学的に許容されるベクターを含む。
【0051】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ワクチン組成物である。
【0052】
別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、一価または多価である。
【0053】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、アジュバント、好ましくは様々なアルミニウムアジュバントをさらに含む。組成物中の活性ペプチドおよびアジュバント（例えば、アルミニウム）のモル比または重量比は、１：１００の間、好ましくは１：４０～１：６０の間である。
【0054】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、単一の薬物、複合薬物、または相乗的薬物を含む。
【0055】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、液体、固体またはゲル状態である。
【0056】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、マイクロニードル注射、経口投与、または口鼻スプレーおよび噴霧吸入からなる群から選択される投与方法で投与される。
【0057】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に記載の新規コロナウイルスのワクチンポリペプチドまたは第２の態様に記載のペプチド集合または第３の態様に記載の医薬組成物の用途を提供し、それらは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはその関連疾患を予防するための薬物の調製に使用される。
【0058】
別の好ましい例において、前記コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連疾患は、気道感染症、肺炎およびその合併症、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0059】
別の好ましい例において、前記コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連疾患は、新規コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）である。
【0060】
本発明の第５の態様は、細胞製剤を提供し、前記細胞製剤は、（ａ）本発明の第１の態様に記載の新規コロナウイルスのワクチンポリペプチドまたは本発明の第２の態様に記載のペプチド集合による免疫により活性化された免疫細胞、および（ｂ）薬学的に許容されるベクターを含む。
【0061】
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞ＮＫ、リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0062】
別の好ましい例において、前記活性化は、インビトロ活性化である。
【0063】
別の好ましい例において、前記インビトロ活性化は、前記ワクチンポリペプチドの存在下で、前記免疫細胞を一定期間（例えば、６～４８時間）培養することにより、免疫活性化免疫細胞を得ることを含む。
【0064】
別の好ましい例において、前記細胞製剤は、生細胞を含む液体製剤である。
【0065】
別の好ましい例において、前記細胞製剤は、静脈内投与によって再注入される。
【0066】
本発明の第６の態様は、必要とする対象に本発明の第１の態様に記載の新規コロナウイルスのワクチンポリペプチド、第２の態様に記載のペプチド集合または第３の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を生成する方法を提供する。
【0067】
別の好ましい例において、前記対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。
【0068】
別の好ましい例において、前記非ヒト哺乳動物は、非ヒト霊長類動物（例えば、サル）を含む。
【0069】
別の好ましい例において、前記方法は、前記対象においてコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の生成を誘導する。
【0070】
別の好ましい例において、前記中和抗体は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とヒトＡＣＥ２タンパク質との結合を遮断する。
【0071】
本発明の第７の態様は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、キャリアタンパク質および前記融合タンパク質に融合する本発明の第１の態様に記載のワクチンポリペプチドを含む。
【0072】
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、非天然タンパク質である。
【0073】
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、式IIIａまたはIIIｂの構造を有し、
式（IIIａ）：Ｐ１－Ｐ２
式（IIIｂ）：Ｐ２－Ｐ１
式において、Ｐ１は、本発明の第１の態様に記載のワクチンポリペプチドであり、Ｐ２は、キャリアタンパク質である。
式（IIIａ）：Ｐ１－Ｐ２
式（IIIｂ）：Ｐ２－Ｐ１
式において、Ｐ１は、本発明の第１の態様に記載のワクチンポリペプチドであり、Ｐ２は、キャリアタンパク質である。
【0074】
別の好ましい例において、前記Ｐ１は、単一のワクチンポリペプチド、または直列に接続された複数の同じまたは異なるワクチンポリペプチド（または抗原ポリペプチド）であり得る。
【0075】
別の好ましい例において、前記Ｐ１は、一つまたは複数のＴＬＲ７アゴニストにカップリングする。
【0076】
本発明の第８の態様は、医薬組成物を提供し、それは、（ａ）本発明の第７の態様に記載の融合タンパク質またはその免疫により活性化された免疫細胞、および（ｂ）薬学的に許容されるベクターを含む。
【0077】
本発明の第９の態様は、本発明の第７の態様に記載の融合タンパク質または第８の態様に記載の医薬組成物の用途を提供し、それらは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはその関連疾患を予防するための薬物の調製に使用される。
【発明の効果】
【0078】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のアミノ酸配列分析およびＡＣＥ２と相互作用するＲＢＤの重要な部位を示す。
【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤ領域とヒトＡＣＥ２との間の相互作用構造および重要な作用部位のグラフを示す。
【図3】ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１が、２４種の主要集団ＨＬＡグラスII分子対立遺伝子タイプの分子への結合の可能性の包括的な分析グラフを示す。
【図4】ＢｅｐｉＰｒｅｄソフトウェアによって予測されたＳタンパク質ＲＢＤに含まれる線形Ｂ細胞エピトープ、ならびにポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１との相対位置関係グラフを示す。
【図5】Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅソフトウェアによって予測されたＳタンパク質ＲＢＤに含まれるコンフォーメーションＢ細胞エピトープの構造図を示す。
【図6】Ｓタンパク質ＲＢＤ構造上のポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１およびＬＹ５４の位置図を示す。
【図7】ＴＬＲ７小分子アゴニストＳＺＵ－１０１の化学構造を示す。
【図8】ポリペプチドＰ－７１およびＳＺＵ－１０１に結合したそのカップリングペプチドによって誘導されたインビトロでのマウス脾臓リンパ球からのサイトカイン放出の結果を示す。
【図9】ポリペプチドＰ－７１およびＳＺＵ－１０１に結合したそのカップリングペプチドによって誘導されたインビトロでのマウス脾臓リンパ球の増殖結果を示す。
【図10】ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１およびＰ－６７－Ｆ２ならびにそれぞれＳＺＵ－１０１に結合したそのカップリングペプチド（表Ｂを参照）を、単独でまたは混合してＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した後の抗ＲＢＤ抗体の生成状況を示す。
【図11】蟹食猿にＬＹ５４、ＬＹ５４－Ｓ１を免疫した後の抗ＲＢＤ抗体の生成状況、ならびにポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１およびＰ－６７－Ｆ２がそれぞれＳＺＵ－１０１にカップリングした後の混合したカップリングペプチド（表Ｂを参照）で蟹食猿を免疫した後の抗ＲＢＤ抗体の生成結果を示す。
【図12】ＬＹ５４、ＬＹ５４－Ｓ１および混合カップリングペプチド（表Ｂを参照）で蟹食猿を免疫することによって生成された抗ＲＢＤ抗体がＲＢＤのＡＣＥ２への結合を遮断する中和活性を有することを示す。
【図13】ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１およびＬＹ５４がヒトＡＣＥ２に対してより良好な結合効果を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0080】
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究を通じて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤに対する配列および構造解析の研究に基づいて、Ｓタンパク質のＣＤ４＋Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、線形／コンフォーメーションＢ細胞エピトープ、相互作用の重要な部位、表面の特徴、グリコシル化修飾部位およびポリペプチド物理化学的特性等の特徴を分析して、初めて哺乳類動物の体にコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を効果的に誘導できるワクチンポリペプチドをスクリーニングして決定した。実験によると、本発明のワクチンポリペプチドは、げっ歯類動物（例えば、マウス）および霊長類動物（例えば、蟹食猿）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性免疫および体液性免疫を効果的に誘導することができることを示し、それによってＲＢＤとＡＣＥ２との結合を遮断するより高い力価の中和抗体が生成されることにより、本発明は、新規コロナウイルス肺炎の予防または治療において潜在的な適用の見通しを有する。これに基づいて、本発明を完成させた。
【0081】
具体的には、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に対するＲＢＤ配列および構造情報の解析に基づいて、Ｓタンパク質のＴ／Ｂ細胞エピトープを決定し、Ｓタンパク質の構造表面特徴、ＡＣＥ２との相互作用の重要な部位およびポリペプチドの物理化学的特性等を総合的に考慮することにより、表Ａに示される１２の抗原ポリペプチドをスクリーニングして決定し、抗原ポリペプチド（Ｐ－３７、Ｐ－６７（Ｐ－６７－Ｆ１およびＰ－６７－Ｆ２を含む）、Ｐ－７１およびＬＹ５４を含む）をそれぞれＴＬＲ７小分子アゴニストに結合して、表Ｂに示されるカップリングペプチドを形成する。実験によると、カップリングしたポリペプチドワクチンは、マウスおよび蟹食猿においてより強力な細胞性免疫および体液性免疫の効果を起動し、ＲＢＤとＡＣＥ２との結合を遮断するより高い力価の中和抗体が生成されることを示す。
【0082】
用語
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＣｏＶ）は、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属し、エンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのサブファミリーは、α、β、δおよびγの四つの属を含む。
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＣｏＶ）は、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属し、エンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのサブファミリーは、α、β、δおよびγの四つの属を含む。
【0083】
現在ヒトに感染することが知られているコロナウイルスにおいて、ＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３は、α属コロナウイルスに属し、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、すべてβ属コロナウイルスである。
【0084】
２０１９年末に発生した新規コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと約８０％の類似性、ＭＥＲＳ－ＣｏＶと４０％の類似性を有し、β属コロナウイルスにも属する。
【0085】
当該タイプのウイルスのゲノムは、レプリカ―ぜ、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、エンベロープタンパク質およびヌクレオキャプシドタンパク質等をコードする、ゲノムの最大のＲＮＡウイルスの一つである、一本鎖プラス鎖ＲＮＡである。ウイルス複製の初期段階において、ゲノムは、数千のアミノ酸からなる２本のペプチド鎖、即ち前駆体ポリタンパク質（Ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）に翻訳し、次に前駆体タンパク質は、プロテアーゼによって切断されて、非構造タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよびヘリカーゼ）および構造タンパク質（例えば、スパイクタンパク質）ならびに補助タンパク質を生成する。
【0086】
Ｓタンパク質は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主要な構造タンパク質であり、その構造の模式図は、図１に示されたとおりであり、ここで、ＲＢＤは、ヒトＡＣＥ２受容体の構造を担うが、ＲＢＭ領域は、ヒトＡＣＥ２に結合するモチーフ（ｍｏｔｉｆ）を含む。典型的なＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３に示されたとおりである。
【0087】
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧ
ＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ領域は、Ｓタンパク質の３３３～５２７位に位置し、代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の３３３～５２７位に示されたとおりであるか、または図４に示されたとおりである。
ＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ領域は、Ｓタンパク質の３３３～５２７位に位置し、代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の３３３～５２７位に示されたとおりであるか、または図４に示されたとおりである。
【0088】
＞ＲＢＤ（３３３－５２７）
ＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の３３３～５２７位）
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭ領域は、Ｓタンパク質の４３８～５０６位に位置し、代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の４３８～５０６位または図１に示されたとおりである。
ＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の３３３～５２７位）
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭ領域は、Ｓタンパク質の４３８～５０６位に位置し、代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の４３８～５０６位または図１に示されたとおりである。
【0089】
＞ＲＢＭ（４３８－５０６）
ＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の４３８～５０６位）
本発明において、Ｓタンパク質、ＲＢＤ領域およびＲＢＭ領域は、すべて野生型および突然変異型を含むことを理解すべきである。
ＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３の４３８～５０６位）
本発明において、Ｓタンパク質、ＲＢＤ領域およびＲＢＭ領域は、すべて野生型および突然変異型を含むことを理解すべきである。
【0090】
ワクチンポリペプチド
本発明において、「本発明のエピトープペプチド」、「本発明のワクチンポリペプチド」、「本発明のポリペプチド」は、交換可能に使用され、本発明の第１の態様に記載のワクチンポリペプチド、特に式Ｉの構造を有するポリペプチドを指す。前記用語は、本発明の一つの種のワクチンポリペプチドだけでなく、本発明の複数の種のワクチンポリペプチドによって形成されるペプチド集合（またはペプチドの組み合わせ）も含むことを理解されたい。
本発明において、「本発明のエピトープペプチド」、「本発明のワクチンポリペプチド」、「本発明のポリペプチド」は、交換可能に使用され、本発明の第１の態様に記載のワクチンポリペプチド、特に式Ｉの構造を有するポリペプチドを指す。前記用語は、本発明の一つの種のワクチンポリペプチドだけでなく、本発明の複数の種のワクチンポリペプチドによって形成されるペプチド集合（またはペプチドの組み合わせ）も含むことを理解されたい。
【0091】
本発明において、ワクチンポリペプチドは、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または融合タンパク質等の他の形式をさらに含む。好ましくは、本発明のワクチンポリペプチドは、ＴＬＲ７アゴニストに結合して形成されるコンジュゲート（カップリングペプチド）、特に一つまたは複数のＴＬＲ７アゴニストがカップリングされたカップリングペプチド、例えば、表中に示されるコンジュゲートである。
【0092】
さらに、本発明において、好ましいワクチンポリペプチドは、式IIに示される構造を有し、
式（II）：Ｘ１－Ｘ－Ｘ２
（ａ）Ｘは、コアフラグメントであり、ここで、前記コアフラグメントの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２（表Ａを参照）の一つまたは複数から選択され、
（ｂ）Ｘ１、Ｘ２は、それぞれ独立して、なし、１、２または３個のアミノ酸であり、Ｘ１およびＸ２のアミノ酸数の合計は、≦４、好ましくは、３、２、１、より好ましくは０または１であり、
ここで、Ｘ１とＸとの間、ＸとＸ２との間以ペプチド結合は、ペプチドリンカー（例えば、１～１５個のアミノ酸で構成される柔軟性リンカー）または他のコネクタによって結合される。
式（II）：Ｘ１－Ｘ－Ｘ２
（ａ）Ｘは、コアフラグメントであり、ここで、前記コアフラグメントの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２（表Ａを参照）の一つまたは複数から選択され、
（ｂ）Ｘ１、Ｘ２は、それぞれ独立して、なし、１、２または３個のアミノ酸であり、Ｘ１およびＸ２のアミノ酸数の合計は、≦４、好ましくは、３、２、１、より好ましくは０または１であり、
ここで、Ｘ１とＸとの間、ＸとＸ２との間以ペプチド結合は、ペプチドリンカー（例えば、１～１５個のアミノ酸で構成される柔軟性リンカー）または他のコネクタによって結合される。
【0093】
本発明において、コアフラグメントまたはワクチンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１～１２のいずれか一つの配列への一つまたは複数の（例えば、１～５個、好ましくは１～３個）アミノ酸付加、一つまたは複数の（例えば、１～５個、好ましくは１～３個の）アミノ酸置換および／または１～３個のアミノ酸欠失によって形成される誘導ポリペプチドを含み、前記誘導ポリペプチドは、誘導前の元のポリペプチドと実質的に同じ機能を有する。
【0094】
好ましくは、コアフラグメントまたはワクチンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１～１２のいずれか一つの配列への１～３個のアミノ酸付加（好ましくはＮ末端またはＣ末端に付加される）、および／または１～２個のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を含み、且つ依然として誘導前の元のポリペプチドと実質的に同じ機能を有する。
【0095】
好ましくは、前記保存的アミノ酸置換は、表Ｃに従ってアミノ酸置換を実施する。
【0096】
【表3】
【0097】
好ましくは、本発明に記載のペプチド集合は、本発明の第１の態様から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種のワクチンポリペプチドまたはその誘導ポリペプチド（カップリングペプチドを含む）を含み、より好ましくは、前記ペプチド集合は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１２から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種のワクチンポリペプチドまたはその誘導ポリペプチドを含む。さらに、前記ペプチド集合は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１２以外の他のコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原ペプチドまたはタンパク質をさらに含む。
【0098】
本明細書で使用されるように、「単離された」とは、物質がもの環境から分離されることを指す（天然物質の場合、元の環境は、自然環境である）。生きた細胞内の自然状態下でのポリペプチドは、分離および精製されず、同じポリペプチドは、自然な状態で一緒に存在する他の物質から分離されば、分離および精製される。
【0099】
本明細書で使用されるように、「単離されたペプチド」とは、本発明のポリペプチドが自然、および関連する他のタンパク質、脂質、糖類または他の物質を実質的に含まないことを指す。当業者は、標準的なタンパク質精製技術を本発明のポリペプチドを精製することができる。実質的に生成されたポリペプチド（融合タンパク質）は、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要なバンドを生成する。
【0100】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、または合成ポリペプチド、好ましくは、合成ポリペプチドであり得る。
【0101】
本発明において、ワクチンポリペプチドの配列が比較的短い場合（例えば、≦７０ａａ、より好ましくは≦６０ａａの場合）、化学的方法によって直接合成することができる。
【0102】
ワクチンポリペプチドの配列が比較的に長い場合または融合タンパク質の形態でワクチンポリペプチドが提供される場合、組換え法を使用して関連するペプチド配列を大量に取得することもできる。これは、通常、前記抗原ポリペプチドまたはその融合タンパク質をコードするコード配列をベクターにクローニングし、細胞に細胞に形質転換し、次いで従来方法によって、増殖した宿主細胞から関連する抗原ポリペプチドまたは融合タンパク質を分離する。
【0103】
医薬組成物および投与方法
本発明は、医薬組成物をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、治療用または予防用であり得る（例えば、ワクチン）。本発明の医薬組成物は、有効量の本発明のワクチンポリペプチドまたはペプチド集合、またはワクチンポリペプチドが活性化された免疫細胞（例えば、本発明のワクチンポリペプチドで感作された樹状細胞または樹状細胞で誘導されたＴ細胞）、ならびに少なくとも一つの種の薬学的に許容されるベクター、希釈剤または賦形剤を含む。
本発明は、医薬組成物をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、治療用または予防用であり得る（例えば、ワクチン）。本発明の医薬組成物は、有効量の本発明のワクチンポリペプチドまたはペプチド集合、またはワクチンポリペプチドが活性化された免疫細胞（例えば、本発明のワクチンポリペプチドで感作された樹状細胞または樹状細胞で誘導されたＴ細胞）、ならびに少なくとも一つの種の薬学的に許容されるベクター、希釈剤または賦形剤を含む。
【0104】
別の好ましい例において、前記新規コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患は、気道感染症、肺炎およびその合併症、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0105】
本発明において、これらの（ワクチン）組成物は、免疫性抗原（本発明のワクチンポリペプチド、ペプチド集合またはその誘導体を含む）を含み、また通常「薬学的に許容されるベクター」と組み合わせ、これらのベクターは、それ自体で、当該組成物を受ける個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意のベクターを含む。適切なベクターの例としては、タンパク質、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）等を含むが、これらに限定さ入れない。さらに、これらのベクターは、免疫刺激剤（「アジュバント」）として作用することができる。
【0106】
さらに、本発明の（ワクチン）組成物は、追加のアジュバントをさらに含むことができる。代表的なワクチンアジュバントは、水酸化アルミニウム、ミョウバン等の無機アジュバント、人工合成二本鎖ポリヌクレオチド（二本鎖ポリアデニル酸、ウリジン酸）、レバミゾール、イソプリノシン等の合成アジュバント、フロイントアジュバント、落花生油乳化アジュバント、鉱物油、植物油等の油剤等のカテゴリを含む（これらに限定されない）。
【0107】
通常、ワクチン組成物または免疫原性組成物を注射剤、例えば、液体溶液または懸濁液として調製することができ、注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体形態を調製することができる。当該製剤は、リポソームに乳化またはカプセル化して、アジュバント効果を増強することができる。
【0108】
組成物は、単位剤形または複数回剤形で調製されることができる。各剤形は、所望の治療効果を生成するために計算された所定量の活性物質、ならびに適切な医薬品賦形剤をを含む。
【0109】
調製された医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、経口投与、または局所投与を含む（これらに限定されない）、従来の経路によって投与されることができる。
【0110】
（ワクチン）組成物を使用する場合、安全かつ有効量の本発明のワクチンポリペプチドまたはペプチド集合をヒトに投与し、ここで、当該安全かつ有効量は、通常、少なくとも約１μｇペプチド／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約８ｍｇペプチド／ｋｇ体重以下であり、好ましくは当該用量は、約１μｇ～１ｍｇペプチド／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な用量については、投与経路、患者の健康状態等の要因も、考慮されるべできであり、これらは、すべて熟練した医師の技術の範囲内にある。
【0111】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
【0112】
（ａ）本発明で使用されるワクチンポリペプチド（結合ポリペプチドを含む）は、霊長類動物等の哺乳動物の体でＳタンパク質ＲＢＤ（受容体結合領域）に対する中和抗体を生成することができ、前記中和抗体は、ＲＢＤとＡＣＥ２との結合を遮断することができる。
【0113】
（ｂ）最適化されないポリペプチドと比較して、本発明の最適化されたポリペプチド配列をＴＬＲ７小分子アゴニストに結合して形成されるカップリングペプチドは、最適化された構造を有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する細胞性免疫および体液性免疫を効率的に生成することができる。
【0114】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。
【0115】
実施例１．Ｓタンパク質ＲＢＤの配列および構造解析に基づく抗原ポリペプチドのスクリーニング
本実施例において、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるヒトＡＣＥ２と相互作用するＲＢＤ領域を分析対象とし、ＲＢＤにおける相互作用の重要な部位を決定し、図１および図２に示されたとおりである。
本実施例において、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質におけるヒトＡＣＥ２と相互作用するＲＢＤ領域を分析対象とし、ＲＢＤにおける相互作用の重要な部位を決定し、図１および図２に示されたとおりである。
【0116】
本発明者らは、ソフトウェアを使用して、ＲＢＤ配列中のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを予測および分析し、Ａｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｎｅｔ Ｄａｔａｂａｓｅデータベースの統計分析を使用して、世界人口の主なＨＬＡクラスII分子対立遺伝子タイプを得、ＲＢＤ配列中のＨＬＡクラスII分子の結合ペプチドをさらに分析および予測し、これを予測ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして使用し、ＢｅｐｉＰｒｅｄおよびＤｉｓｃｏｔｏｐｅソフトウェアを使用して、ＲＢＤ配列中の線形およびコンフォーメーションＢ細胞エピトープを予測し、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースを使用して、ＲＢＤ領域のグリコシル化修飾部位を取得し、ＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウェアを使用して、候補ポリペプチドの物理化学的特性を予測する。
【0117】
上記の分析結果および情報を総合して、本発明者らは、最終的に１２のポリペプチドをスクリーニングし、アミノ酸配列は、次のとおりである。
【0118】
【表4】
【0119】
ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１に含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対応するＨＬＡクラスＩ分子対立遺伝子タイプは、表１に示されたとおりであり、三つのポリペプチドが、キラーＴ細胞の抗ウイルス応答をよりよく誘発する可能性を有することを示唆する。
【0120】
表１．一部のポリペプチドに含まれるＣＴＬエピトープに対応するＨＬＡクラスI分子対立遺伝子タイプ
集団中の２４種の主なＨＬＡクラスII分子に対する三つのポリペプチド（Ｐ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１）の結合親和性は、表２および図３に示されたとおりである。これは、三つのポリペプチドが集団内の主なＨＬＡII分子によって提示されることにより、広範囲のＣＤ４＋Ｔ細胞効果を誘発し、Ｂ細胞が抗ウイルス抗体を生成する可能性を促進することができる。
【表5】
【0121】
表２．２４種の主な集団ＨＬＡクラスI分子対立遺伝子タイプ分子に対するポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１の結合親和性の予測および分析
さらなる分析により、三つのポリペプチド（Ｐ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１）は、ＲＢＤの線形およびコンフォーメーションＢ細胞エピトープと良好なクロスオーバーラップ（図４および図５）を有し、これは、Ｂ細胞性免疫応答を効果的に活性化できることを示唆する。
【表6】
【0122】
さらに、三つのポリペプチド（Ｐ－３７、Ｐ－６７およびＰ－７１）は、グリコシル化修飾部位を含まず、適切な物理化学的特性を有する。
【0123】
ＬＹ５４は、Ｐ－３７およびＰ－７１の両方のエピトープを含む長いペプチドであり、ＲＢＤとＡＣＥ２との間の相互作用海面に跨り、図６に示されたとおりである。
【0124】
実施例２．ポリペプチドの調製
本実施例において、ポリペプチド合成機を使用して、ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１およびＬＹ５４を調製する。
本実施例において、ポリペプチド合成機を使用して、ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１およびＬＹ５４を調製する。
【0125】
【表7】
【0126】
実施例３．カップリングペプチドの調製
人工的に合成されたポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７（Ｐ－６７－Ｆ１およびＰ－６７－Ｆ２）、Ｐ－７１およびＬＹ５４等は、それぞれＴＬＲ７小分子アゴニストに結合して、対応するカップリングペプチドを形成する。
人工的に合成されたポリペプチドＰ－３７、Ｐ－６７（Ｐ－６７－Ｆ１およびＰ－６７－Ｆ２）、Ｐ－７１およびＬＹ５４等は、それぞれＴＬＲ７小分子アゴニストに結合して、対応するカップリングペプチドを形成する。
【0127】
結合ポリペプチドに使用されるＴＬＲ７小分子アゴニストの分子構造は、次のとおりである。
【0128】
【化4】
【化5】
【0129】
３．１．カップリングペプチドＰ－３７－Ｓ２の調製
Ｐ－３７ペプチド（ＣＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。１８ｍｇのＰ－３７ペプチドを秤量し、２７０μＬのＨ２Ｏおよび１８０μＬのＤＭＦの混合溶液に溶解し、４．８８ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え、同時に最終濃度３０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合成１５．５ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－３７ペプチドとのカップリング生成物Ｐ－３７－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ７４０．９９７６。
Ｐ－３７ペプチド（ＣＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。１８ｍｇのＰ－３７ペプチドを秤量し、２７０μＬのＨ２Ｏおよび１８０μＬのＤＭＦの混合溶液に溶解し、４．８８ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え、同時に最終濃度３０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合成１５．５ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－３７ペプチドとのカップリング生成物Ｐ－３７－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ７４０．９９７６。
【0130】
３．２．カップリングペプチドＰ－６７－Ｆ１－Ｓ２の調製
Ｐ－６７－Ｆ１ペプチド（ＣＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。１６．５ｍｇのＰ－６７－Ｆ１ペプチドを秤量し、３３０μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した９８４μＬのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え（２０ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを秤量し、２ｍＬのＤＭＦに事前に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度３０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合成９．３ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－６７－Ｆ１ペプチドとのカップリング生成物Ｐ－６７－Ｆ１－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ４９４．２４５６。
Ｐ－６７－Ｆ１ペプチド（ＣＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。１６．５ｍｇのＰ－６７－Ｆ１ペプチドを秤量し、３３０μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した９８４μＬのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え（２０ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを秤量し、２ｍＬのＤＭＦに事前に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度３０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合成９．３ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－６７－Ｆ１ペプチドとのカップリング生成物Ｐ－６７－Ｆ１－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ４９４．２４５６。
【0131】
３．３．カップリングペプチドＰ－６７－Ｆ２－Ｓ２的調製
Ｐ－６７－Ｆ２ペプチド（ＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。２０ｍｇのＰ－６７－Ｆ２ペプチドを秤量し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２ｍＬの５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、ＤＭＦに溶解した６７５μＬのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え（２０ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを秤量し、２ｍＬのＤＭＦに事前に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度１００ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計１３．５ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－６７－Ｆ２－Ｓ２ペプチドとのカップリング生成物Ｐ－６７－Ｆ２－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ８６１．４０７７。
Ｐ－６７－Ｆ２ペプチド（ＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。２０ｍｇのＰ－６７－Ｆ２ペプチドを秤量し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２ｍＬの５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、ＤＭＦに溶解した６７５μＬのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え（２０ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを秤量し、２ｍＬのＤＭＦに事前に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度１００ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計１３．５ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－６７－Ｆ２－Ｓ２ペプチドとのカップリング生成物Ｐ－６７－Ｆ２－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ８６１．４０７７。
【0132】
３．４．カップリングペプチドＰ－７１－Ｓ２の調製
Ｐ－７１－Ｃペプチド（ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。２０ｍｇのＰ－７１－Ｃペプチドを秤量し、４００μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した４６１μＬのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え（２０ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを秤量し、２ｍＬのＤＭＦに事前に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度３０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計２０ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－７１－Ｃペプチドとのカップリング生成物Ｐ－７１－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ９７１．４５５４。
Ｐ－７１－Ｃペプチド（ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。２０ｍｇのＰ－７１－Ｃペプチドを秤量し、４００μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した４６１μＬのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを加え（２０ｍｇのＳＺＵ－１０１－Ｍａｌを秤量し、２ｍＬのＤＭＦに事前に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度３０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計２０ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－７１－Ｃペプチドとのカップリング生成物Ｐ－７１－Ｓ２を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ９７１．４５５４。
【0133】
３．４．カップリングペプチドＰ－７１－Ｃ－Ｓ１の調製
Ｐ－７１－Ｃペプチド（ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ）与ＴＬＲ７小分子アゴニストコンジュゲート的調製（２）。１８ｍｇのＰ－７１－Ｃペプチドを秤量し、３６０μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した８５０μＬのＳＺＵ－１０１－ＮＨＳを加え（ＤＭＦに事前に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、三つのＳＺＵ－１０１小分子に結合する生成物を形成し、最終濃度５ｍＭのＤＴＴを加えた後に３７℃下で１時間反応させ続け、二つのＳＺＵ－１０１に結合する生成物を形成し、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計１２ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－７１－Ｃペプチドとのカップリング生成物Ｐ－７１－Ｃ－Ｓ１を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０４２．９７８９。
Ｐ－７１－Ｃペプチド（ＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＫ）与ＴＬＲ７小分子アゴニストコンジュゲート的調製（２）。１８ｍｇのＰ－７１－Ｃペプチドを秤量し、３６０μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した８５０μＬのＳＺＵ－１０１－ＮＨＳを加え（ＤＭＦに事前に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、三つのＳＺＵ－１０１小分子に結合する生成物を形成し、最終濃度５ｍＭのＤＴＴを加えた後に３７℃下で１時間反応させ続け、二つのＳＺＵ－１０１に結合する生成物を形成し、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計１２ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－７１－Ｃペプチドとのカップリング生成物Ｐ－７１－Ｃ－Ｓ１を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０４２．９７８９。
【0134】
３．５．カップリングペプチドＰ－７１－Ｎ－Ｓ１の調製
Ｐ－７１－Ｎペプチド（ＫＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。２２ｍｇのＰ－７１－Ｎペプチドを秤量し、４４０μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した１０００μＬのＳＺＵ－１０１－ＮＨＳを加え（ＤＭＦに事前に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、三つのＳＺＵ－１０１小分子に結合する生成物を形成し、最終濃度５ｍＭのＤＴＴを加えた後に３７℃下で１時間反応させ続け、二つのＳＺＵ－１０１に結合する生成物を形成し、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計１９ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－７１－Ｎペプチドとのカップリング生成物Ｐ－７１－Ｎ－Ｓ１を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０４２．９７８９。
Ｐ－７１－Ｎペプチド（ＫＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。２２ｍｇのＰ－７１－Ｎペプチドを秤量し、４４０μＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した１０００μＬのＳＺＵ－１０１－ＮＨＳを加え（ＤＭＦに事前に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、室温下で１時間反応させた後、三つのＳＺＵ－１０１小分子に結合する生成物を形成し、最終濃度５ｍＭのＤＴＴを加えた後に３７℃下で１時間反応させ続け、二つのＳＺＵ－１０１に結合する生成物を形成し、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計１９ｍｇのＳＺＵ－１０１とＰ－７１－Ｎペプチドとのカップリング生成物Ｐ－７１－Ｎ－Ｓ１を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０４２．９７８９。
【0135】
３．６．カップリングペプチドＬＹ５４－Ｓ１の調製
ＬＹ５４ペプチド（ＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。１０ｍｇのＬＹ５４ペプチドを秤量し、２００ＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した４４２μＬのＳＺＵ－１０１－ＮＨＳを加え（ＤＭＦに事前に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、温下で１時間反応させた後、五つのＳＺＵ－１０１小分子に結合する生成物を形成し、最終濃度５ｍＭのＤＴＴを加えた後に３７℃下で１時間反応させ続け、三つのＳＺＵ－１０１に結合する生成物を形成し、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計７．２ｍｇのＳＺＵ－１０１とＬＹ５４ペプチドとのカップリング生成物ＬＹ５４－Ｓ１を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋６Ｈ］６＋ １０３５．０７７１。
ＬＹ５４ペプチド（ＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ）とＴＬＲ７小分子アゴニストとのコンジュゲートの調製。１０ｍｇのＬＹ５４ペプチドを秤量し、２００ＬのＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＦに溶解した４４２μＬのＳＺＵ－１０１－ＮＨＳを加え（ＤＭＦに事前に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬの原液を形成する）、同時に最終濃度２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を加え、温下で１時間反応させた後、五つのＳＺＵ－１０１小分子に結合する生成物を形成し、最終濃度５ｍＭのＤＴＴを加えた後に３７℃下で１時間反応させ続け、三つのＳＺＵ－１０１に結合する生成物を形成し、Ｃ１８分取カラムによって生成物を分離して、合計７．２ｍｇのＳＺＵ－１０１とＬＹ５４ペプチドとのカップリング生成物ＬＹ５４－Ｓ１を得、ＨＲＭＳ ［Ｍ＋６Ｈ］６＋ １０３５．０７７１。
【0136】
実施例４．インビトロマウス脾臓リンパ球増殖およびサイトカイン放出実験
実施例３で調製したＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１等のポリペプチド、およびＴＬＲ７アゴニストＳＺＵ－１０１に結合した後に形成されたカップリングペプチドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から分離および調製された初代脾臓リンパ球培養液に加え、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、６０μＭの四つの用量群を含み、サイトカインＩＬ－６、ＩＬ～１２、ＩＦＮ－γを２４時間刺激後に検出し、細胞増殖を７２時間刺激後に検出する。
実施例３で調製したＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１等のポリペプチド、およびＴＬＲ７アゴニストＳＺＵ－１０１に結合した後に形成されたカップリングペプチドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から分離および調製された初代脾臓リンパ球培養液に加え、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、６０μＭの四つの用量群を含み、サイトカインＩＬ－６、ＩＬ～１２、ＩＦＮ－γを２４時間刺激後に検出し、細胞増殖を７２時間刺激後に検出する。
【0137】
【0138】
（１）単独のポリペプチドは、脾臓リンパ球のサイトカインの放出の増加を誘導しないか、または弱く誘導でき、ＳＺＵ－１０１に結合した後のカップリングペプチドは、脾臓リンパ球のサイトカインの放出の増加を効果的に誘導でき、これは、ＴＬＲ７アゴニストに結合した後、ワクチンポリペプチドによって誘導される免疫応答を顕著に向上できることを示唆する。
【0139】
（２）檀独のポリペプチドは、脾臓リンパ球の増殖を誘導できないか、または弱く誘導でき、ＳＺＵ－１０１に結合した後のカップリングペプチドは、脾臓リンパ球のサイトカイン増殖を効果的に誘導でき、これは、ＴＬＲ７アゴニストにカップリングした後、ワクチンポリペプチドによって誘導される免疫応答を顕著に向上できることを示唆する。
【0140】
実施例５．結合ポリペプチドワクチンのマウス免疫実験
実施例３で調製したＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１等のポリペプチド、およびＴＬＲ７アゴニストＳＺＵ－１０１に結合して後に形成されたカップリングペプチドを、単独でまたは合併して使用し、合併する場合、混合比は、１：１：１（質量比）であり、水酸化アルミニウムをアジュバントとして調製した後、腹腔内注射してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫する。
実施例３で調製したＰ－３７、Ｐ－６７、Ｐ－７１等のポリペプチド、およびＴＬＲ７アゴニストＳＺＵ－１０１に結合して後に形成されたカップリングペプチドを、単独でまたは合併して使用し、合併する場合、混合比は、１：１：１（質量比）であり、水酸化アルミニウムをアジュバントとして調製した後、腹腔内注射してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫する。
【0141】
初回免疫から２９日後および５７日後に血清を採取し、ブリッジング－ＥＬＩＳＡ法（Ｂｒｉｄｇｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ）を使用して血清中（１：１００倍希釈）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤに対する抗体を検出する。
【0142】
図１０に示されるように、結果は、次のとおりである。
【0143】
（１）Ｐ－７１－Ｃ－Ｓ１またはＰ－７１－Ｓ２を含む混合ペプチド＋アジュバント群では、ＲＢＤに対する抗体を有意に生成することができる。
【0144】
（２）単独のコンジュゲートＰ－３７－Ｓ２＋アジュバント群は、ＲＢＤに対する抗体を有意に生成することができる。
【0145】
（３）ＳＺＵ－１０１にカップリングしない混合ペプチドは、ＲＢＤに対する抗体を誘導できるが、生成された抗体の数は、カップリングペプチドを含む混合ペプチド群よりも少なく、これは、ＴＬＲ７アゴニストに結合した後、ワクチンポリペプチドによって誘導される免疫応答を顕著に向上できることを示唆する。
【0146】
実施例６．カップリングポリペプチドワクチンの蟹食猿免疫実験
本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するカップリングポリペプチドワクチンの免疫効果を蟹食猿でさらに検証する。
本実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するカップリングポリペプチドワクチンの免疫効果を蟹食猿でさらに検証する。
【0147】
（ａ）Ｐ－３７、Ｐ－６７－Ｆ２、Ｐ－７１がＳＺＵ－１０１に結合した混合カップリングペプチド（Ｐ－７１－Ｃ－Ｓ１／Ｐ－７１－Ｎ－Ｓ１／Ｐ－７１－Ｓ２／Ｐ－３７－Ｓ２／Ｐ－６７－Ｆ２－Ｓ２）、（ｂ）ＬＹ５４、（ｃ）ＬＹ５４－Ｓ１を使用し、それぞれＴｉｔｅｒＭａｘアジュバントで免疫製剤を調製し、蟹食猿を皮下多点注射により免疫し、２回目の免疫から１４日後、Ｂｒｉｄｇｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ法を使用して抗体力価を測定し、抗血清がＲＢＤとＡＣＥ２との結合を遮断する能力を測定する。
【0148】
中和抗体は、競合ＥＬＩＳＡ法によって検出され、具体的な測定方法は、次のとおりである。１０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２を使用してマイクロタイタープレートを一晩コーティングし、ブロッキング後に使用する。サンプル希釈緩衝液で抗ペプチド血清を様々な程度に希釈し（１：１２８、１：６４、１：３２、１：１６、１：８および１：４）、その後、異なる程度に希釈した抗血清を１２μｇ／ｍＬのＢｉｏ－ＲＢＤとともに３７℃で１時間インキュベートし、次に１００μＬの反応混合液を上記のブロッキングしたＡＣＥ２コーティングマイクロタイタープレート上のウェルに加え、３７℃下で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１：１００００希釈したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａを加え、３７℃下で１時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ＴＭＢを加えて発色させ、終結後に４５０ｎｍの波長下でプレートを読み取る。
【0149】
結果によると、すべての動物がＲＢＤに対する抗体を生成し、抗体の力価がすべて比較的に高いことを示す（図１１）。
【0150】
さらに、混合カップリングペプチド、ＬＹ５４、ＬＹ５４－Ｓ１を使用して生成した抗血清は、すべてＲＢＤとＡＣＥ２との結合を遮断する能力（図１２）を有し、つまり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染を遮断する効果を有する。
【0151】
実施例７．ポリペプチドとＡＣＥ２とのインビトロ結合実験
本実施例において、空間構造がＲＢＤとＡＣＥ２との相互作用海面に位置するポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１、ＬＹ５４をビオチン標識し、ＥＬＩＳＡ法によって上記のポリペプチドとＡＣＥ２との結合能力を検出する。
本実施例において、空間構造がＲＢＤとＡＣＥ２との相互作用海面に位置するポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１、ＬＹ５４をビオチン標識し、ＥＬＩＳＡ法によって上記のポリペプチドとＡＣＥ２との結合能力を検出する。
【0152】
具体的な測定方法は、次のとおりである。１０ｕｇ／ｍＬのＡＣＥ２を使用してマイクロタイタープレートを一晩コーティングし、ブロッキング後に異なる濃度（１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬ）のビオチン標識ポリペプチドを加え、３７℃下で１．５時間インキュベートした後、１：５０００希釈したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａを加え、３７℃下で１時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ＴＭＢを加えて発色させ、終結後に４５０ｎｍの波長でプレートを読み取る。
【0153】
結果によると、ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１、ＬＹ５４は、ＡＣＥ２に対して強い結合能力をゆすることを示し（図１３）、これは、ポリペプチドＰ－３７、Ｐ－７１およびＬＹ５４自体が潜在的な遮断効果を有することを示唆する。
【0154】
議論
ポリペプチドワクチンは、免疫化のために免疫原性の高いタンパク質から一つまたは複数の抗原エピトープフラグメントを選択する。ポリペプチドワクチンのアミノ酸鎖が短いため、ポリペプチド合成技術の成熟により、迅速かつ大量のインビトロ合成および精製に便利であり、製品の各バッチの純度および再現性を容易に確保することができる。
ポリペプチドワクチンは、免疫化のために免疫原性の高いタンパク質から一つまたは複数の抗原エピトープフラグメントを選択する。ポリペプチドワクチンのアミノ酸鎖が短いため、ポリペプチド合成技術の成熟により、迅速かつ大量のインビトロ合成および精製に便利であり、製品の各バッチの純度および再現性を容易に確保することができる。
【0155】
同時に、コンピューター補助のワクチン設計により、新規ウイルス等によって引き起こされる突然の公衆衛生上の問題に迅速にかつ対応し、ワクチン開発に適合した候補ペプチドセグメントを予測およびスクリーニングすることができる
さらに、他の種類のワクチンと比較して、ポリペプチドワクチンは、明確なエピトープ、優れた安定性、高い純度、およびより優れた安全性を有する。しかしながら、ポリペプチドワクチンのアミノ酸鎖の長さは、比較的に短く、通常約１０～３０アミノ酸であるため、免疫原性が低いという問題にも直面しており、通常より良い免疫応答を生み出すために修飾またはアジュバントの追加が必要になる。
さらに、他の種類のワクチンと比較して、ポリペプチドワクチンは、明確なエピトープ、優れた安定性、高い純度、およびより優れた安全性を有する。しかしながら、ポリペプチドワクチンのアミノ酸鎖の長さは、比較的に短く、通常約１０～３０アミノ酸であるため、免疫原性が低いという問題にも直面しており、通常より良い免疫応答を生み出すために修飾またはアジュバントの追加が必要になる。
【0156】
ポリペプチドワクチンの設計には、コンピューターを利用したワクチン設計技術の補助が必要であり、通常、標的タンパク質のＴ／Ｂ細胞エピトープならびに構造および修飾情報を包括的に分析する必要がある。ここで、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、キラーＴ細胞を活性化して抗ウイルス効果を発揮し、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、主にヘルパーＴ細胞を活性化してＢ細胞を非活性化して、抗ウイルス抗体を生成する。線形およびコンフォーメーションＢ細胞エピトープは、Ｂ細胞を直接活性化して抗体を生成することができる。
【0157】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、表面のＳｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓタンパク質）がアンジオテンシン変換酵素２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ２、ＡＣＥ２）タンパク質に結合することにより、宿主細胞に侵入する。従って、Ｓタンパク質は、ウイルスの侵入を遮断できる中和抗体の生成を誘導することを期待する、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン設計の好ましい標的タンパク質である。しかしながら、現在知られているワクチンは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を体に効果的に引き起こすことは困難である。
【0158】
従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高効率の抗原提示細胞を活性化することは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを開発するための鍵となる。
【0159】
本発明者らは、研究を通じて、スクリーニングおよび配列最適化後のコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の抗原ポリペプチド、およびＴＬＲ７小分子アゴニストに結合することによって形成されたワクチンポリペプチドに基づいて、霊長類動物を含む体でＳタンパク質のＲＢＤ領域に対して遮断効果を有する抗ウイルス抗体を効果的に誘導および生成することができることを予想外に発見した。さらに、結合したＴＬＲ７小分子アゴニストＳＺＵ－１０１のワクチンポリペプチドは、抗原提示細胞を効率的に活性化し、ポリペプチドの免疫原性が低く、ウイルスの免疫逃避の発生などの問題を克服することができる。
【0160】
従って、本発明のカップリングペプチドは、新規コロナウイルスポリペプチドワクチンを開発するために使用されることができる。人体で細胞性免疫および体液性免疫を引き起こすことにより、新規コロナウイルス肺炎（Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）を含むコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および関連疾患を予防および治療する。
【0161】
さらに、本発明者らは、ＴＬＲ７アゴニストと特異的抗原ポリペプチドとを結合することによって形成されるカップリングポリペプチド（特にＳ１および／またはＳ２構造等のＴＬＲ７小分子アゴニストＳＺＵ－１０１にカップリングすることによって形成される結合ポリペプチド）の策略を、他の一本鎖ＲＮＡウイルス（ｓｓＲＮＡウイルス）感染症またはその関連疾患を予防および治療するための薬物またはワクチンの開発、特にＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ等の既知のコロナウイルスおよび未知のコロナウイルスを含む様々な異なるコロナウイルスに対するワクチンの開発にも適用することができる。
【0162】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】