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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-27
(45)【発行日】2025-03-07
(54)【発明の名称】前立腺がんの検査方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20250228BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20250228BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
C12Q1/6886 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020144086
(22)【出願日】2020-08-28
(65)【公開番号】P2022039186
(43)【公開日】2022-03-10
【審査請求日】2023-08-28
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ １０，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ４４２２（２０１９） 発行日 令和１年９月２７日 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１９年総会講演要旨集 発行日 令和１年９月１０日 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１９年総会 開催日 令和１年１０月１５～１９日 理化学研究所プレスリリース掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／２０１９／２０１９０９２７＿１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ウェブサイトの掲載日 令和１年９月２７日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、次世代がん医療創生研究事業（オーダーメイド医療の実現プログラム事業）「ゲノム網羅的解析情報を基盤とするオーダーメイドがん医療実現のための開発研究」委託研究開発、産業技術強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】507148456
【氏名又は名称】学校法人 岩手医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中川 英刀
(72)【発明者】
【氏名】藤田 征志
(72)【発明者】
【氏名】赤松 秀輔
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼田 亮
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／２３７２０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－１５７２８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０３３０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nature，vol.538, no.7624，2016年，p.248-252
【文献】Lung Cancer，vol.147，2020年07月12日，p.106-114
【文献】泌尿器外科，vol.33, no.8，2020年08月15日，p.1037-1038
【文献】日本臨床，vol.74, no.1，2016年，p.34-39
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
前立腺がんの検査方法であって、rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594（なお、ｒｓ番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベースの登録番号を示す。
）から選択される1以上の一塩基多型を解析する工程を含む、方法。
【請求項2】
さらに、以下の表１に記載のいずれか1以上の一塩基多型を解析する、請求項１に記載の
方法。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【請求項3】
合計１０種類以上の一塩基多型を解析する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
複数の一塩基多型の解析結果からリスクスコアを算出し、当該リスクスコアに基づいて、前立腺がんを検査する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前立腺がんが若年性前立腺がんである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
配列番号１～１２から選ばれる塩基配列において、塩基番号２６番目の塩基を含む１５塩基以上の配列の相補配列を有する前立腺がん検査用プローブであって、
配列番号１の２６番目の塩基に相当する塩基がＴ（リスクアレル）；
配列番号２の２６番目の塩基に相当する塩基がＧ（リスクアレル）；
配列番号３の２６番目の塩基に相当する塩基がＧ（リスクアレル）；
配列番号４の２６番目の塩基に相当する塩基がＣ（リスクアレル）；
配列番号５の２６番目の塩基に相当する塩基がＧ（リスクアレル）；
配列番号６の２６番目の塩基に相当する塩基がＣ（リスクアレル）；
配列番号７の２６番目の塩基に相当する塩基がＧ（リスクアレル）；
配列番号８の２６番目の塩基に相当する塩基がＣ（リスクアレル）；
配列番号９の２６番目の塩基に相当する塩基がＡ（リスクアレル）；
配列番号１０の２６番目の塩基に相当する塩基がＡ（リスクアレル）；
配列番号１１の２６番目の塩基に相当する塩基がＧ（リスクアレル）；または
配列番号１２の２６番目の塩基に相当する塩基がＡ（リスクアレル）；
である、プローブ。
【請求項7】
rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174 、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594から選択される１以上の一塩基多型を解析するための前立腺がん検査用試薬であって、配列番号１～１２から選ばれる塩基配列において、塩基番号２６番目の塩基を含む領域を増幅することのできる１５塩基以上の塩基配列を有するプライマーのセットを含む、前立腺がん検査用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は遺伝子配列解析を利用した前立腺がんの検査方法に関する。
【背景技術】
【0002】
前立腺がんは、世界的に発症頻度の高いがんの一つであり、これまで欧米人に多くアジア人には少ないと考えられてきた。しかし、日本でも、食生活などの生活習慣の欧米化や人口の超高齢化に伴い、その罹患者数は急激に増えてきており、2018年の罹患者は約78,000人以上に上っている。また、前立腺がんは典型的な高齢者のがんであり、罹患者の約43％は75歳以上の後期高齢者である。前立腺がんは、他のがんに比べて治癒の可能性が高いがんとして知られているが、高齢者については、発症後の生存期間や治療の副作用を考慮して、積極的な治療をしない場合が増えてきている。
【0003】
一方で、非高齢者の前立腺がん患者の治療については、手術支援ロボットを使った手術療法、男性ホルモンを抑制するホルモン療法、放射線療法などさまざまな治療法がある。また、若年者（60歳未満）では積極的に早期診断をして根治治療を行うことが重要で、早期発見のためのスクリーニングとして、PSA健診が利用されている。
【0004】
前立腺がん発症の一般的な危険因子としては、人種、欧米型の食生活、体内のホルモン環境、加齢などが挙げられるが、特定の危険因子は分かっていなかったが、遺伝性前立腺がんの存在や、前立腺がんの発症に関連する多数の遺伝子や一塩基多型（SNP）が発見され
たことから、発症には遺伝的要因が深く関わっていることが明らかになってきている。
たことから、発症には遺伝的要因が深く関わっていることが明らかになってきている。
【0005】
2010年と2012年に理化学研究所の研究チームは、オーダーメイド医療実現化プロジェクト/バイオバンクジャパン（BBJ）で収集した約5,000人の日本人サンプルを対象にゲノムワ
イドSNP関連解析（GWAS）を実施し、9個のSNPが日本人における前立腺がん発症と強い関
連があることを発見した（非特許文献１、２）。また、特許文献１では前立腺がんと関連するSNPが報告されている。
イドSNP関連解析（GWAS）を実施し、9個のSNPが日本人における前立腺がん発症と強い関
連があることを発見した（非特許文献１、２）。また、特許文献１では前立腺がんと関連するSNPが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開2012-157283
【非特許文献】
【0007】
【文献】Nat Genet. 2010 Sep;42(9):751-4
【文献】Nat Genet. 2012 Feb 26;44(4):426-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、前立腺がんの発症リスクを高精度で検査することのできる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。具体的には、約9,900人の日
本人前立腺がん罹患者と約84,000人の男性対照群に対して、ゲノム全体にある50万個以上のSNPの頻度情報をもとにゲノムワイド関連解析を行った。その結果、前立腺がんに関連
する新規の12個のSNPを見出し、これらが存在すると前立腺がん発症リスクがSNP1個につ
き1.12～1.31倍高まることを見出した。また、これら新規SNPと、これまでに日本人の前
立腺がん発症と関連が証明されているSNPを含む合計82個のSNP情報を組み合わせて、前立腺がん発症リスクを予測するゲノムリスクスコア（PRS）を算出し、前立腺がんとの関連
解析を行ったところ、PRSの値が若年発症（60歳未満）および前立腺がん家族歴と有意に
相関することを見出した。このような知見に基づき、本発明を完成させた。
本人前立腺がん罹患者と約84,000人の男性対照群に対して、ゲノム全体にある50万個以上のSNPの頻度情報をもとにゲノムワイド関連解析を行った。その結果、前立腺がんに関連
する新規の12個のSNPを見出し、これらが存在すると前立腺がん発症リスクがSNP1個につ
き1.12～1.31倍高まることを見出した。また、これら新規SNPと、これまでに日本人の前
立腺がん発症と関連が証明されているSNPを含む合計82個のSNP情報を組み合わせて、前立腺がん発症リスクを予測するゲノムリスクスコア（PRS）を算出し、前立腺がんとの関連
解析を行ったところ、PRSの値が若年発症（60歳未満）および前立腺がん家族歴と有意に
相関することを見出した。このような知見に基づき、本発明を完成させた。
【0010】
本発明の要旨は以下の通りである。
［１］前立腺がんの検査方法であって、
下記から選択される1以上の一塩基多型を解析する工程を含む、方法。
rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594
（なお、ｒｓ番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベースの登録番号を示す。）
［２］さらに、表１に記載のいずれか１以上の一塩基多型を解析する、［１］に記載の方法。
［３］合計１０種類以上の一塩基多型を解析する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］複数の一塩基多型の解析結果からリスクスコアを算出し、当該リスクスコアに基づいて、前立腺がんを検査する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前立腺がんが若年性前立腺がんである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。［６］下記から選択される１以上の一塩基多型を解析するための試薬を含む、前立腺がんの検査用試薬。
rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594
［１］前立腺がんの検査方法であって、
下記から選択される1以上の一塩基多型を解析する工程を含む、方法。
rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594
（なお、ｒｓ番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベースの登録番号を示す。）
［２］さらに、表１に記載のいずれか１以上の一塩基多型を解析する、［１］に記載の方法。
［３］合計１０種類以上の一塩基多型を解析する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］複数の一塩基多型の解析結果からリスクスコアを算出し、当該リスクスコアに基づいて、前立腺がんを検査する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前立腺がんが若年性前立腺がんである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。［６］下記から選択される１以上の一塩基多型を解析するための試薬を含む、前立腺がんの検査用試薬。
rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594
【発明の効果】
【0011】
本発明において新規に同定された前立腺がん関連ＳＮＰの１つ以上を解析することにより、前立腺がんの発症リスクを効率よく検査することができる。また、これら前立腺がん関連ＳＮＰの複数、またはそれらと公知の前立腺がん関連ＳＮＰを組み合わせてリスクスコアを算出し、得られたリスクスコアを指標とすることで、より精度の良い前立腺がんの検査が可能となり、若年発症の前立腺がんの高精度の予測も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】日本人集団における前立腺がんのゲノムリスクスコア（ＰＲＳ）分布。（ａ）前立腺がん症例（ｎ＝４８９３）および男性対照（ｎ＝１０，６８２）のＰＲＳ分布。ガウス核を使用して密度を推定した。５％以上および５％以下のパーセンタイルを点線で示す。（ｂ）前立腺がん症例（ｎ＝４７６２）における前立腺がん診断時の年齢によるＰＲＳ分布。ガウス核を使用して密度を推定した。６０歳より若い（ｎ＝１２９）；６５歳より若い（ｎ＝７８１）；６５歳以上（ｎ＝３８５２）の３群に分けて解析した。（ｃ）前立腺がん症例（ｎ＝４８９３）における前立腺がん家族歴の有無によるＰＲＳ分布。ガウス核を使用して密度を推定した。家族歴あり（Yes）（ｎ＝２７２）；家族歴なし（No）（ｎ＝４６２１）の２群に分けて解析した。（ｄ）慈恵医大検証コホート（ｎ＝２２１８）における前立腺がん診断時の年齢によるＰＲＳ分布。ガウス核を使用して密度を推定した。５５歳より若い（ｎ＝９４）；６０歳より若い（ｎ＝３１０）；６５歳≧（ｎ＝８０２）；６５歳以上（ｎ＝８０２）の４群に分けて解析した。
【図2】バイオバンクジャパン（BBJ）または慈恵医大検証コホートにおける、ＰＲＳ上位5％群の年齢別割合を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の前立腺がん検査方法は、下記から選択される1以上のSNPを解析する工程を含む。rs7542260、rs11125927、rs73862213、rs75777376、rs16901814、rs4554825、rs77911174、rs11055034、rs8023793、rs6117562、rs138708及びrs4826594
これらのSNPのうち、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上解析することが好ましい。
これらのSNPのうち、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上解析することが好ましい。
【0014】
なお、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）の登録番号を示す。
【0015】
前立腺がんは前立腺に発生する悪性腫瘍であれば特に制限されないが、５９歳以下の対象者に発生する若年性前立腺がんであってもよい。
【0016】
rs7542260は第１染色体上のMIR4417遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession
No. NC_000001.10の5743196番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＴである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＴである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
No. NC_000001.10の5743196番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＴである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＴである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0017】
なお、rs7542260について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１に示した。配列番号１における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＴ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
GCAGTGACGCTTCTGGTCTTAAGCC(C/T)GCCCTTCTTGCCCCTTCCTCCCCTT（配列番号１）
GCAGTGACGCTTCTGGTCTTAAGCC(C/T)GCCCTTCTTGCCCCTTCCTCCCCTT（配列番号１）
【0018】
rs11125927は第２染色体上のRPL21P37遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000002.11の62752975番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／アデニン（Ａ）の
ＳＮＰを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
ＳＮＰを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0019】
なお、rs11125927について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの
長さの配列を、配列番号２に示した。配列番号２における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
TATTTTATTGGTTAATATTTGAACA(A/G)TTGTTGGGCAGAGAGTCTGTGTAAT（配列番号２）
長さの配列を、配列番号２に示した。配列番号２における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
TATTTTATTGGTTAATATTTGAACA(A/G)TTGTTGGGCAGAGAGTCTGTGTAAT（配列番号２）
【0020】
rs73862213は第３染色体上のLOC100506995遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000003.11の128217499番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／アデニン（Ａ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0021】
なお、rs73862213について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの
長さの配列を、配列番号３に示した。配列番号３における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
ATACCAGGATCCTTGGAGGTGAGGG(A/G)GTTCCTGTTTTGCTTGTGGCTACAG（配列番号３）
長さの配列を、配列番号３に示した。配列番号３における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
ATACCAGGATCCTTGGAGGTGAGGG(A/G)GTTCCTGTTTTGCTTGTGGCTACAG（配列番号３）
【0022】
rs75777376は第８染色体上のFAM84B遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession
No. NC_000008.10の127796183番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＣである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。ま
た、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＴＣ＞ＴＴの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＣである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
No. NC_000008.10の127796183番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＣである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。ま
た、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＴＣ＞ＴＴの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＣである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0023】
なお、rs75777376について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの
長さの配列を、配列番号４に示した。配列番号４における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
AAAATTCATATCACAAGTAAAATTA(T/C)TAAGTAATGTAGCATCATTCAGCTA（配列番号４）
長さの配列を、配列番号４に示した。配列番号４における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
AAAATTCATATCACAAGTAAAATTA(T/C)TAAGTAATGTAGCATCATTCAGCTA（配列番号４）
【0024】
rs16901814は第８染色体上のSRRM1P1遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000008.10の127881952番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／アデニン（Ａ）の
ＳＮＰを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
ＳＮＰを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0025】
なお、rs16901814について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの
長さの配列を、配列番号５に示した。配列番号５における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
TCCCATTAGAGACTCTGCAGATCAC(G/A)CAAGTCATTCATTCCTTATTAATCA（配列番号５）
長さの配列を、配列番号５に示した。配列番号５における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
TCCCATTAGAGACTCTGCAGATCAC(G/A)CAAGTCATTCATTCCTTATTAATCA（配列番号５）
【0026】
rs4554825は第１０染色体上のLOC100130698遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000010.10の80244623番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＣである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＣである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0027】
なお、rs4554825について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号６に示した。配列番号６における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
GCATTATTAAGTGTAGCTGTTGAGG(C/T)GTTTTCCATCATGGGGGAAACATGC（配列番号６）
GCATTATTAAGTGTAGCTGTTGAGG(C/T)GTTTTCCATCATGGGGGAAACATGC（配列番号６）
【0028】
rs77911174は第１０染色体上のLOC283050遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000010.10の80826833番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／アデニン（Ａ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0029】
なお、rs77911174について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの
長さの配列を、配列番号７に示した。配列番号７における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
CCCAAGAGGCCCAGGAGACCCGCAA(A/G)TCTGTGCTGCACGTCCGCACTCCCA（配列番号７）
長さの配列を、配列番号７に示した。配列番号７における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
CCCAAGAGGCCCAGGAGACCCGCAA(A/G)TCTGTGCTGCACGTCCGCACTCCCA（配列番号７）
【0030】
rs11055034は第１２染色体上のAPOLD1遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accessi
on No. NC_000012.11の12890626番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／アデニン（Ａ）の
ＳＮＰを意味し、この塩基がＣである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＡ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＣである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
on No. NC_000012.11の12890626番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／アデニン（Ａ）の
ＳＮＰを意味し、この塩基がＣである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＡ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＣである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0031】
なお、rs11055034について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの
長さの配列を、配列番号８に示した。配列番号８における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
AGAAAGTGAGAAGGAGGGAGCTGGG(C/A)GCTTATCTTTGGCATATCCTCAGCT（配列番号８）
長さの配列を、配列番号８に示した。配列番号８における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
AGAAAGTGAGAAGGAGGGAGCTGGG(C/A)GCTTATCTTTGGCATATCCTCAGCT（配列番号８）
【0032】
rs8023793は第１５染色体上のSMAD6遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession
No. NC_000015.9の66942093番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＡである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＣ＞ＣＣの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＡである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
No. NC_000015.9の66942093番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＡである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＣ＞ＣＣの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＡである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0033】
なお、rs8023793について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号９に示した。配列番号９における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＡ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
CATGTTTATTAGATAACTAACCAAT(A/C)AAATAAAACAAACACACCAACAATT（配列番号９）
CATGTTTATTAGATAACTAACCAAT(A/C)AAATAAAACAAACACACCAACAATT（配列番号９）
【0034】
rs6117562は第２０染色体上のC20orf54遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000020.10の753310番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＡである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＧ＞ＧＧの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＡである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0035】
なお、rs6117562について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１０に示した。配列番号１０における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＡ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
AGTTCTTATTTATTCATTTTAACCA(A/G)TATTTCTTGGGCACCAACTGTGTGC（配列番号１０）
AGTTCTTATTTATTCATTTTAACCA(A/G)TATTTCTTGGGCACCAACTGTGTGC（配列番号１０）
【0036】
rs138708は第２２染色体上のSUN2遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000022.10の39138332番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）／アデニン（Ａ）のＳＮ
Ｐを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
Ｐを意味し、この塩基がＧである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＡＧ＞ＡＡの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0037】
なお、rs138708について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長
さの配列を、配列番号１１に示した。配列番号１１における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
TGGATGCGAGCAGCAGTTTCCCTGC(G/A)GAAATCCTCCTTCAGGGCAGCTTCA（配列番号１１）
さの配列を、配列番号１１に示した。配列番号１１における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＧ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
TGGATGCGAGCAGCAGTTTCCCTGC(G/A)GAAATCCTCCTTCAGGGCAGCTTCA（配列番号１１）
【0038】
rs4826594は第Ｘ染色体上のTSR2遺伝子近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000023.10の54454406番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）のＳＮＰを意味し、この塩基がＡである場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＡである被験者には、前立腺がんの予防または治療のための処置を行うことが考えられる。
【0039】
なお、rs4826594について、SNP塩基及びその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１２に示した。配列番号１２における２６番目の塩基がＳＮＰを有し、この塩基がＡ（リスクアレル）である場合は前立腺がんの可能性または発症リスクが高いと判定される。
ACATCCTTACTATTCTAGCCCTTGT(A/G)GCCAACAGATGCTAAAGTGACCTCC（配列番号１２）
ACATCCTTACTATTCTAGCCCTTGT(A/G)GCCAACAGATGCTAAAGTGACCTCC（配列番号１２）
【0040】
なお、上記では解析対象のＳＮＰの位置について説明したが、本発明の方法においては、これらＳＮＰ塩基に相当する塩基を解析すればよい。ここで、上記ＳＮＰ塩基に相当する塩基とは、ヒト染色体上の上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がSNP以外
の位置で若干変化したとしても、上記ＳＮＰを含む領域における該当塩基を解析することが含まれる。
の位置で若干変化したとしても、上記ＳＮＰを含む領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【0041】
また、本発明において解析するＳＮＰは上記のものに限定されず、上記のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを分析してもよい。ここで「上記のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰ」とは、上記のＳＮＰと好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たすＳＮＰをいう。ｒ2は連鎖不平衡係数である。連鎖不平衡にあるＳＮＰは、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。
【0042】
上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰをまとめて解析してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記１２個のＳＮＰの少なくとも１つと、前立腺がんと関連する既知のＳＮＰや当該既知のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰとを組み合わせて解析してもよい。以下の表１に、上記１２個のＳＮＰ以外で、今回、ＧＷＡＳおよびＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙに
使用された前立腺がんと関連する既知のＳＮＰを記載した。表１において、ＯＲ（オッズ比）とＤＯＳＥ（Ｄｏｓａｇｅ）は非リスクアレルを対照とした。
使用された前立腺がんと関連する既知のＳＮＰを記載した。表１において、ＯＲ（オッズ比）とＤＯＳＥ（Ｄｏｓａｇｅ）は非リスクアレルを対照とした。
【0043】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0044】
前立腺がんと関連する複数のＳＮＰ、例えば、合計１０以上のＳＮＰ、好ましくは合計２０以上のＳＮＰ、より好ましくは合計３０以上のＳＮＰ、さらに好ましくは合計４０以上のＳＮＰをまとめて解析することにより、前立腺がんの検査の精度をより向上させることができる。複数のＳＮＰを解析し、それぞれがリスクアレルであるかを確認し、リスクアレルの総数により、前立腺がんリスクの指標（例えば、リスクアレルを１個以上、２個以上、または３個以上有する場合に前立腺がんリスクが高いと判定する）としてもよいが、複数のＳＮＰの解析結果からリスクスコアを算出し、得られたリスクスコアを前立腺がんリスクの指標とすることがより好ましい。例えば、リスクスコアが一定の基準値を超えた場合に、前立腺がんリスクが高いと判定することができる。
【0045】
リスクスコア（ＰＲＳ）としては、例えば、以下の式が例示される。
ＰＲＳ＝β１ｘ１＋β２ｘ２＋．．．βｋｘｋ＋βｎｘｎ
ここで、βｋは、ＳＮＰｋについてのリスクアレルの前立腺がんに対するｌｏｇオッズ比（ＯＲ）であり、ｘｋはＳＮＰｋについてのリスクアレルの保持数（０、１または２）であり、ｎは解析ＳＮＰの総数である。
ＰＲＳ＝β１ｘ１＋β２ｘ２＋．．．βｋｘｋ＋βｎｘｎ
ここで、βｋは、ＳＮＰｋについてのリスクアレルの前立腺がんに対するｌｏｇオッズ比（ＯＲ）であり、ｘｋはＳＮＰｋについてのリスクアレルの保持数（０、１または２）であり、ｎは解析ＳＮＰの総数である。
【0046】
上記のようにして１または複数のSNPの塩基の種類を調べ、得られた結果またはそれに基
づくリスクスコアなどの指標をもちいて前立腺がんとの関連付けを行うことにより、前立腺がんを検査することができる。すなわち、本発明の方法は、前立腺がん診断のためのデータを提供することができる。
づくリスクスコアなどの指標をもちいて前立腺がんとの関連付けを行うことにより、前立腺がんを検査することができる。すなわち、本発明の方法は、前立腺がん診断のためのデータを提供することができる。
【0047】
本発明の方法により判定された結果は、必要に応じて医師等に提供される。結果を提供された医師等は、血液検査、X線検査、CT検査等の必要な検査を行った上で、発症リスクや
進行リスクを診断することができる。医師等が前立腺がんの発症リスクや進行リスクが高いと診断した場合には、手術や抗がん剤治療等の治療を施すことができる。また、リスクが低いと診断した場合には、患者に取って負担が大きいこれらの治療を回避することができる。
進行リスクを診断することができる。医師等が前立腺がんの発症リスクや進行リスクが高いと診断した場合には、手術や抗がん剤治療等の治療を施すことができる。また、リスクが低いと診断した場合には、患者に取って負担が大きいこれらの治療を回避することができる。
【0048】
本発明において、解析の対象はヒトであり、例えば、前立腺がんのリスクが疑われるヒトである。人種は特に制限されないが、例えば、日本人を含むアジア人である。
SNPの解析に用いる試料は、対象由来の染色体DNAを含む試料であれば特に制限されない。SNPの解析に用いる試料としては、例えば、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘
膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用
することもできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解
析することが好ましい。
SNPの解析に用いる試料は、対象由来の染色体DNAを含む試料であれば特に制限されない。SNPの解析に用いる試料としては、例えば、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘
膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用
することもできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解
析することが好ましい。
【0049】
なお、SNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シ
ークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、
これらに限定されない。なお、いずれのSNPも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、各配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
ークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、
これらに限定されない。なお、いずれのSNPも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、各配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【0050】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その
解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめSNP部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめSNP部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
【0051】
また、SNPの解析は、PCRによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産
物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書）、ICAN法（特開2002-233379号公報）、SmartAmp法（特許第3897805号明細書）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書）、ICAN法（特開2002-233379号公報）、SmartAmp法（特許第3897805号明細書）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【0052】
また、SNP部位を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1;12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むDNAを増幅し、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分
離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるか
を決定することができる。
離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるか
を決定することができる。
【0053】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（RFLP法）。この場合、まず、DNA試料を制限酵素によ
り切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
り切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【0054】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる
。
。
【0055】
＜２＞本発明の前立腺がん検査用試薬
本発明はまた、前立腺がんを検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によっ
てSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１～
１２のいずれかに示す塩基配列の２６番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５～３５塩基であり、より好ましくは２０～３５塩基である。
本発明はまた、前立腺がんを検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によっ
てSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１～
１２のいずれかに示す塩基配列の２６番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５～３５塩基であり、より好ましくは２０～３５塩基である。
【0056】
また、プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのでき
るプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１～１２のいずれかに示す塩基配列の２６番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５～５０塩基が好ましく、１５～３５塩基がより好ましく、２０～３５塩基がさらに好まし
い。
るプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１～１２のいずれかに示す塩基配列の２６番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５～５０塩基が好ましく、１５～３５塩基がより好ましく、２０～３５塩基がさらに好まし
い。
【0057】
上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域
、好ましくは３０～１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０～１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
、好ましくは３０～１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０～１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【0058】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラ
ーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
ーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【0059】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の態様には限定されない。
【0060】
＜方法＞
研究サンプル
ＧＷＡＳサンプルは、東京大学医科学研究所において設立されたバイオバンク・ジャパン（ＢＢＪ）からの５０８８症例サンプルを用いた。５０８８症例の中で、２７２（５．３％）の対象は、前立腺がんの家族歴を有し、１２１９（２３．９％）の対象はＰＳＡ≧１０を示し、１９８９（３９．１％）の対象は７以上のグリーソンスコアを有するがんであると診断された。ＢＢＪから、病理学的に証明された前立腺がん症例を選択した。非がん対照は、前立腺がんと診断されたことがない４つの大規模コホート研究（日本多施設共同コホート（Ｊ－ＭＩＣＣ）研究、多目的コホート（ＪＰＨＣ）研究、いわて東北メディカル・メガバンク機構（ＩＭＭ）、および東北メディカル・メガバンク機構（ＴｏＭＭｏ））から１０，６８２名の日本人男性のサンプルを使用した。
ゲノムＤＮＡサンプルを、標準的方法を使用して末梢血白血球および正常組織から抽出した。
全ての研究は、登録前にその機関の倫理委員会により承認された次のプロトコールにより全参加者からインフォームドコンセントを得た。
研究サンプル
ＧＷＡＳサンプルは、東京大学医科学研究所において設立されたバイオバンク・ジャパン（ＢＢＪ）からの５０８８症例サンプルを用いた。５０８８症例の中で、２７２（５．３％）の対象は、前立腺がんの家族歴を有し、１２１９（２３．９％）の対象はＰＳＡ≧１０を示し、１９８９（３９．１％）の対象は７以上のグリーソンスコアを有するがんであると診断された。ＢＢＪから、病理学的に証明された前立腺がん症例を選択した。非がん対照は、前立腺がんと診断されたことがない４つの大規模コホート研究（日本多施設共同コホート（Ｊ－ＭＩＣＣ）研究、多目的コホート（ＪＰＨＣ）研究、いわて東北メディカル・メガバンク機構（ＩＭＭ）、および東北メディカル・メガバンク機構（ＴｏＭＭｏ））から１０，６８２名の日本人男性のサンプルを使用した。
ゲノムＤＮＡサンプルを、標準的方法を使用して末梢血白血球および正常組織から抽出した。
全ての研究は、登録前にその機関の倫理委員会により承認された次のプロトコールにより全参加者からインフォームドコンセントを得た。
【0061】
遺伝子型同定および品質管理
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＯｍｎｉＥｘｐｒｅｓｓ ＥｘｏｍｅまたはＯｍｎｉＥｘｐｒｅｓｓ＋ ＨｕｍａｎＥｘｏｍｅ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してＧＷＡＳを行った。遺伝子型同定された９４７，８３０のＳＮＰのうち、１９５，５８８は単一アレルであり、さらなる分析から除外した。最小Ｐ値を示す上位１００のＳＮＰのクラスタープロットを目視によりチェックし、６０４，９９２のＳＮＰは症例および対照サンプルの両方においてコール率（call rate）
≧０．９９の判断基準を満足した。最終的に、ハーディー・ワインベルク平衡検定においてＰ≧１．００×１０－６のＳＮＰを選択した。合計５２３，０５１のＳＮＰについて相関解析を行った。
遺伝子型同定されていないＳＮＰのインピュテーションを、ＭａＣＨ（Science 316, 1341-1345 (2007)）ならびにｍｉｎｉｍａｃ（Nat. Genet. 44, 955-959(2012)）によって行った。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＯｍｎｉＥｘｐｒｅｓｓ ＥｘｏｍｅまたはＯｍｎｉＥｘｐｒｅｓｓ＋ ＨｕｍａｎＥｘｏｍｅ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してＧＷＡＳを行った。遺伝子型同定された９４７，８３０のＳＮＰのうち、１９５，５８８は単一アレルであり、さらなる分析から除外した。最小Ｐ値を示す上位１００のＳＮＰのクラスタープロットを目視によりチェックし、６０４，９９２のＳＮＰは症例および対照サンプルの両方においてコール率（call rate）
≧０．９９の判断基準を満足した。最終的に、ハーディー・ワインベルク平衡検定においてＰ≧１．００×１０－６のＳＮＰを選択した。合計５２３，０５１のＳＮＰについて相関解析を行った。
遺伝子型同定されていないＳＮＰのインピュテーションを、ＭａＣＨ（Science 316, 1341-1345 (2007)）ならびにｍｉｎｉｍａｃ（Nat. Genet. 44, 955-959(2012)）によって行った。
【0062】
追試のためのサンプルおよび遺伝子型同定
独立した４８１８の前立腺がん症例サンプルおよび７３，２６１の対照サンプルを使用して追試を行った。バイオバンク・ジャパン（２２３６症例）から症例サンプルを得て、慈恵会医科大学からＪＩＫＥＩサンプル（２５８２サンプル）を得た。全症例は地域の病理
学者によって組織学的に診断され、臨床データは地域の泌尿器科医によって収集された。追試における対照サンプルは、前立腺がん以外の疾病についてＧＷＡＳに付されたＢＢＪからの７３，２６１の男性サンプルであった。
独立した４８１８の前立腺がん症例サンプルおよび７３，２６１の対照サンプルを使用して追試を行った。バイオバンク・ジャパン（２２３６症例）から症例サンプルを得て、慈恵会医科大学からＪＩＫＥＩサンプル（２５８２サンプル）を得た。全症例は地域の病理
学者によって組織学的に診断され、臨床データは地域の泌尿器科医によって収集された。追試における対照サンプルは、前立腺がん以外の疾病についてＧＷＡＳに付されたＢＢＪからの７３，２６１の男性サンプルであった。
【0063】
マルチインデックスＰＣＲベース標的シーケンシング法を使用して症例サンプルの標的領域を配列決定した（Hum. Mol. Genet. 25, 5027-5034 (2016)）。二段階ＰＣＲ法を使用
してＤＮＡライブラリーを構築した。２０２プライマー対および２Ｘ ＰｌａｔｉｎｕｍマスタープレックスＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して第一ＰＣＲ（２５サイクル）を行い、標的領域を増幅した後、第二ＰＣＲ（４サイクル）を行って、第一ＰＣＲおよびＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＡＰＡ）中に導入された共有５’オーバーハングを標的とするプライマーを使用して、８－ｂｐバーコードおよびアダプター配列を付加した。プールされたライブラリーの精製および定量後、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）装置で２１５０ｂｐのペアエンドリードによってこれらを配列決定した。各個体に割り当てられた配列リードを、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（バージョン０．７．１２）を使用してヒト参照配列（ｈｇ１９）にアライメントし、Ｇｅｎｏｍｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ、バージョン３．４－４６）を使用して処理した。品質管理のため、標的領域の９８％超が２０以上の配列リードでカバーされる個体を選択した。ＧＡＴＫのＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒおよびＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ、ならびにＶＣＭＭ（バージョン１．０．２）を別々に使用して各個体のバリアントを調査した。全個体の遺伝子型を、参照および代替アレルの配列リード比に基づいて各バリアントについて一緒に決定した。代替アレル頻度が０～０．１５、０．２５～０．７５、および０．８５～１である場合、それぞれ、参照アレルのホモ接合体、ヘテロ接合体、および代替アレルのホモ接合体とした。マルチインデックスシーケンシングによって解析することができないＳＮＰを、マルチプレックスＰＣＲベースインベーダーアッセイ（J. Hum. Genet. 46, 471-7 (2001)）によって遺伝子型同定した。
してＤＮＡライブラリーを構築した。２０２プライマー対および２Ｘ ＰｌａｔｉｎｕｍマスタープレックスＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して第一ＰＣＲ（２５サイクル）を行い、標的領域を増幅した後、第二ＰＣＲ（４サイクル）を行って、第一ＰＣＲおよびＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＡＰＡ）中に導入された共有５’オーバーハングを標的とするプライマーを使用して、８－ｂｐバーコードおよびアダプター配列を付加した。プールされたライブラリーの精製および定量後、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）装置で２１５０ｂｐのペアエンドリードによってこれらを配列決定した。各個体に割り当てられた配列リードを、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（バージョン０．７．１２）を使用してヒト参照配列（ｈｇ１９）にアライメントし、Ｇｅｎｏｍｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ、バージョン３．４－４６）を使用して処理した。品質管理のため、標的領域の９８％超が２０以上の配列リードでカバーされる個体を選択した。ＧＡＴＫのＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒおよびＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ、ならびにＶＣＭＭ（バージョン１．０．２）を別々に使用して各個体のバリアントを調査した。全個体の遺伝子型を、参照および代替アレルの配列リード比に基づいて各バリアントについて一緒に決定した。代替アレル頻度が０～０．１５、０．２５～０．７５、および０．８５～１である場合、それぞれ、参照アレルのホモ接合体、ヘテロ接合体、および代替アレルのホモ接合体とした。マルチインデックスシーケンシングによって解析することができないＳＮＰを、マルチプレックスＰＣＲベースインベーダーアッセイ（J. Hum. Genet. 46, 471-7 (2001)）によって遺伝子型同定した。
【0064】
統計解析
全ステージにおいて、各ＳＮＰの相関性を加法モデル下で評価した。ＧＷＡＳでは、遺伝子インフレ因子（genetic inflation factor）λＧＣを全被験ＳＮＰに関するコクラン・アーミテージ傾向検定によって得られたＰ値から誘導された。分位数－分位数プロットを、Ｒプログラムを使用して描いた。λＧＣ １０００を、次式５４を使用して算出した：
λＧＣ １０００＝１＋（１－λＧＣ ｏｂｓ）×（１／ｎｃａｓｅｓ＋１／ｎｃｏｎｔｒｏｌｓ）／（１／１０００ｃａｃｅｓ＋１／１０００ｃｏｎｔｒｏｌｓ）
ＧＷＡＳおよび追試を合わせた分析結果を、マンテル・ヘンツェル法によって検証した。２つのステージにわたる不均一性を、Ｐリンク（IARC Sci. Publ. 82, 1-406 (1987)）を使用して検査した。マルチプレックス検定に対するボンフェローニ補正後、有意性閾値をＰ＝５×１０－８（ＧＷＡＳおよびメタ分析）とした。
全ステージにおいて、各ＳＮＰの相関性を加法モデル下で評価した。ＧＷＡＳでは、遺伝子インフレ因子（genetic inflation factor）λＧＣを全被験ＳＮＰに関するコクラン・アーミテージ傾向検定によって得られたＰ値から誘導された。分位数－分位数プロットを、Ｒプログラムを使用して描いた。λＧＣ １０００を、次式５４を使用して算出した：
λＧＣ １０００＝１＋（１－λＧＣ ｏｂｓ）×（１／ｎｃａｓｅｓ＋１／ｎｃｏｎｔｒｏｌｓ）／（１／１０００ｃａｃｅｓ＋１／１０００ｃｏｎｔｒｏｌｓ）
ＧＷＡＳおよび追試を合わせた分析結果を、マンテル・ヘンツェル法によって検証した。２つのステージにわたる不均一性を、Ｐリンク（IARC Sci. Publ. 82, 1-406 (1987)）を使用して検査した。マルチプレックス検定に対するボンフェローニ補正後、有意性閾値をＰ＝５×１０－８（ＧＷＡＳおよびメタ分析）とした。
【0065】
多遺伝子性リスクスコア
リスクアレル数の加重和として多遺伝子性スコアをコンピュータ計算した。本研究のＧＷＡＳ部分においてコンピュータ計算したオッズ比の対数を加重として使用した。組み込まれたＳＮＰ数は、ＧＷＡＳおよび検証コホートにおいて、それぞれ、８２および６３であった。ＧＷＡＳにおいて帰属されたアレルについて、リスクアレル数として遺伝子量を使用した。多遺伝子性スコアおよび臨床情報間の統計的関連性を、統計ソフトウェアＲ（A language and environment for statistical computing. R
Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. https://www.R-project.org/.）を使用して解析した。
リスクアレル数の加重和として多遺伝子性スコアをコンピュータ計算した。本研究のＧＷＡＳ部分においてコンピュータ計算したオッズ比の対数を加重として使用した。組み込まれたＳＮＰ数は、ＧＷＡＳおよび検証コホートにおいて、それぞれ、８２および６３であった。ＧＷＡＳにおいて帰属されたアレルについて、リスクアレル数として遺伝子量を使用した。多遺伝子性スコアおよび臨床情報間の統計的関連性を、統計ソフトウェアＲ（A language and environment for statistical computing. R
Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. https://www.R-project.org/.）を使用して解析した。
【0066】
＜結果＞
前立腺がん感受性ＳＮＰｓの同定
まず、上記の５０８８症例および１０６８２対照のサンプルを使用してＧＷＡＳを行い、P＜1×１０－５で前立腺がんと相関する２９９７ＳＮＰを同定した。次に、ＢＢＪおよびＪＩＫＥＩコホートから４８１８症例、ならびにＢＢＪコホートから７３，２６１対照を使用して独立した追試を行った。前記２９９７ＳＮＰのうち、低インピュテーション品
質（Ｒ２乗値＜０．３）を示したＳＮＰおよび前立腺がんと関連していると以前に報告されたＳＮＰｓを除いた。
同じ連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックにおいて、前立腺がんと最も強い相関性を示した各遺伝子領域に対する代表的ＳＮＰを選択した。また、同ＬＤブロックの他のＳＮＰと比較して、前立腺がんに対して特別顕著な相関性を示した２０ＳＮＰを選択した。そして、合計で１０１の追試用ＳＮＰを選択した。追試では、マルチインデックスシーケンシングおよびマルチプレックスインベーダー法を使用して、遺伝子型同定を行った。候補ＳＮＰの中で、５ＳＮＰはいずれの方法によっても遺伝子型を同定することができず、除外した。
１回目と追試のＧＷＡＳの結果、Ｐ＜５×１０－８で前立腺がんと有意に相関する新規の１２ＳＮＰを同定した（表２）。なお、表２において、ＲＳＱＲはＧＷＡＳにおけるimputation accuracyを示し、ＯＲはアレル２を対照としたオッズ比である。
前立腺がん感受性ＳＮＰｓの同定
まず、上記の５０８８症例および１０６８２対照のサンプルを使用してＧＷＡＳを行い、P＜1×１０－５で前立腺がんと相関する２９９７ＳＮＰを同定した。次に、ＢＢＪおよびＪＩＫＥＩコホートから４８１８症例、ならびにＢＢＪコホートから７３，２６１対照を使用して独立した追試を行った。前記２９９７ＳＮＰのうち、低インピュテーション品
質（Ｒ２乗値＜０．３）を示したＳＮＰおよび前立腺がんと関連していると以前に報告されたＳＮＰｓを除いた。
同じ連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックにおいて、前立腺がんと最も強い相関性を示した各遺伝子領域に対する代表的ＳＮＰを選択した。また、同ＬＤブロックの他のＳＮＰと比較して、前立腺がんに対して特別顕著な相関性を示した２０ＳＮＰを選択した。そして、合計で１０１の追試用ＳＮＰを選択した。追試では、マルチインデックスシーケンシングおよびマルチプレックスインベーダー法を使用して、遺伝子型同定を行った。候補ＳＮＰの中で、５ＳＮＰはいずれの方法によっても遺伝子型を同定することができず、除外した。
１回目と追試のＧＷＡＳの結果、Ｐ＜５×１０－８で前立腺がんと有意に相関する新規の１２ＳＮＰを同定した（表２）。なお、表２において、ＲＳＱＲはＧＷＡＳにおけるimputation accuracyを示し、ＯＲはアレル２を対照としたオッズ比である。
【0067】
ｒｓ１３８７０８を除くこの研究で同定された全新規ＳＮＰは、非エキソン領域に存在した。１２の新規座位のうち、５座位（ｃｈｒ．１においてｒｓ７５４２２６０、ｃｈｒ．８においてｒｓ７５７７７３７６、ｃｈｒ．８においてｒｓ１６９０１８１４、ｃｈｒ．１０においてｒｓ４５５４８２５、およびｃｈｒ．１５においてｒｓ８０２３７９３）は、そのＬＤブロックまたはその近傍（１００ｋｂ以内）にタンパク質コード遺伝子を含んでいなかった。一方、ｃｈｒ．２におけるｒｓ１１１２５９２７は、ＴＭＥＭ１７遺伝子のイントロンにあった。ｃｈｒ．３におけるｒｓ７３８６２２１３は、ＧＡＴＡ２の近くにあった。ｃｈｒ．１０におけるｒｓ７７９１１１７４領域は、ＺＭＩＺ１遺伝子を含んでいた。ｃｈｒ．１２におけるｒｓ１１０５５０３４は、ＡＰＯＬＤ１のイントロンにあり、この領域はＣＤＫＮ１Ｂの３’末端を含んでいた。ｃｈｒ．２０におけるｒｓ６１１７５６２は、ＳＬＣ５２Ａ３を含む領域にあった。ｃｈｒ．２２におけるｒｓ１３８７０８は多くの遺伝子を含む非常に大きなＬＤブロックを形成していたが、ｒｓ１３８７０８はＳＵＮ２遺伝子のエキソン中の非同義ＳＮＰである。ｃｈｒ．Ｘにおけるｒｓ４８２６５９４をスパンする領域は、３つの遺伝子、ＦＧＤ１、ＧＮＬ３Ｌ、およびＴＳＲ２を含んでいた。
【0068】
【表2】
【0069】
日本人集団における多遺伝子性リスクスコア。
今回の研究で新たに発見された１２個のＳＮＰおよび以前に報告されたＳＮＰから日本人の前立腺がんリスクと相関性を示す６８個のＳＮＰを選択し、さらに、以前報告された２つの座位（ｒｓ５８２３５２６７およびｒｓ５７９９９２１）を代表するｒｓ１１４７８０２３６およびｒｓ４８４２６８７も含めた。
６８個のＳＮＰとｒｓ１１４７８０２３６およびｒｓ４８４２６８７を上記表１に示した。
今回の研究で新たに発見された１２個のＳＮＰおよび以前に報告されたＳＮＰから日本人の前立腺がんリスクと相関性を示す６８個のＳＮＰを選択し、さらに、以前報告された２つの座位（ｒｓ５８２３５２６７およびｒｓ５７９９９２１）を代表するｒｓ１１４７８０２３６およびｒｓ４８４２６８７も含めた。
６８個のＳＮＰとｒｓ１１４７８０２３６およびｒｓ４８４２６８７を上記表１に示した。
【0070】
ＧＷＡＳサンプルの各個体におけるリスクアレル数およびその影響を集計することにより多遺伝子性リスクスコア（ＰＲＳ）を算出した。前立腺がん症例（ｎ＝４８９３）および男性対照（ｎ＝１０，６８２）におけるＰＲＳ分布を図１ａに示す。遺伝子性高リスク群として上位５％の症例（ｎ＝２４５）および低リスク群として下位５％（ｎ＝２４５）を画定し、これらの遺伝子的リスク層別化群の臨床的特徴を検査した。特に、高リスク群の平均診断年齢は非高リスク群より２．７歳若い（ｔ検定により平均年齢６８．７歳 対 ７１．４歳、Ｐ＝６．５４×１０－８）ことを見出し、一方、低リスク群と非低リスク群との間の平均診断年齢にほとんど差がない（７２．３ 対 ７１．１、Ｐ＝０．０２０）ことを見出した。また、早期発症前立腺がん症例において高ＰＲＳが多い（ｔ検定により年齢＜６０歳の症例についてはＰ＝０．００２２１、および年齢＜６５歳の症例についてはＰ＝４．３０×１０－９、図１ｂ）ことを見出した。この傾向は慈恵医大検証コホートでも同様であった（図１ｄ）。また、高リスク群は、前立腺がんの陽性家族歴を有する患者が多かった（フィッシャー検定によりＰ＝０．００３３９、図１ｃ）。
【0071】
このように、前立腺がん症例群のPRS上位5％群（発症リスク2.5倍以上）を前立腺がんの
発症高リスク群とすると、若年発症者や前立腺がんの家族歴のある症例が有意に多かった。
発症高リスク群とすると、若年発症者や前立腺がんの家族歴のある症例が有意に多かった。
【0072】
また、ＢＢＪの前立腺がん症例（左、ｎ＝４６３３)、慈恵医大の前立腺がん症例（右、
ｎ＝２２１８）において、ＰＲＳの高リスク群（上位５％）に分類された割合は、６０歳未満でそれぞれ１２％、８％であった。このように、発症年齢が若い群ほど、ＰＲＳでの高リスク群の割合が高くなった（図２）。
ｎ＝２２１８）において、ＰＲＳの高リスク群（上位５％）に分類された割合は、６０歳未満でそれぞれ１２％、８％であった。このように、発症年齢が若い群ほど、ＰＲＳでの高リスク群の割合が高くなった（図２）。
【図1】
【図2】
【配列表】