特許 7641612 表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-27

(45)【発行日】2025-03-07

(54)【発明の名称】表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20250228BHJP

   A23L 33/00 20160101ALI20250228BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALI20250228BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250228BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20250228BHJP

   A61K 8/00 20060101ALI20250228BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20250228BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68 ZNA

A23L33/00

C12Q1/6883 Z

C12N15/09 Z

A61Q19/08

A61K8/00

C12N15/11 Z

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020157055

(22)【出願日】2020-09-18

(65)【公開番号】P2022050883

(43)【公開日】2022-03-31

【審査請求日】2023-07-28

(73)【特許権者】

【識別番号】592262543

【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】井上 悠

(72)【発明者】

【氏名】五十嵐 敏夫

(72)【発明者】

【氏名】奥野 凌輔

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 靖司

【審査官】藤井 美穂

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１０１４４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００７－３３０１４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－０８３２０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２１－０９３９３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Exp. Dermatol.，2022年，Vol.31，p.1944-1948

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００

Ａ２３Ｌ ５／４０ － ５／４９

Ａ２３Ｌ ３１／００ － ３３／２９

Ａ６１Ｋ ８／００ － ８／９９

Ａ６１Ｑ １／００ － ９０／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者から採取したＤＮＡ含有試料に含まれるミトコンドリアＤＮＡについて、以下の（１）～（９）の１種又は２種以上のヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列上の一塩基多型（ＳＮＰ）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルがリスクアレルである場合に、該被験者が表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を判定する方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列の１４６番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１４６、リスクアレルはＴ）
（２）配列番号１に示される塩基配列の５１４７番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ５１４７、リスクアレルはＡ）
（３）配列番号１に示される塩基配列の６９６２番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ６９６２、リスクアレルはＡ）
（４）配列番号１に示される塩基配列の１０６０９番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１０６０９、リスクアレルはＣ）
（５）配列番号１に示される塩基配列の１２４０６番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ１２４０６、リスクアレルはＡ）
（６）配列番号１に示される塩基配列の１２８８２番目の塩基におけるＣ又はＴのＳＮＰ（ｍｔ１２８８２、リスクアレルはＴ）
（７）配列番号１に示される塩基配列の１３９２８番目の塩基におけるＧ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１３９２８、リスクアレルはＣ）
（８）配列番号１に示される塩基配列の１６２４９番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１６２４９、リスクアレルはＣ）
（９）配列番号１に示される塩基配列の１６３０４番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１６３０４、リスクアレルはＣ）

【請求項2】

請求項１に記載の方法により判定された結果に基づいて、被験者の表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の程度に応じた表皮ターンオーバー遅延の予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法。

【請求項3】

配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列において、１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基を含む連続する１５～４０塩基の配列、又はその相補配列を有するプローブ、及び／又は、
配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列において、１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を判定するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定方法に関する。より詳しくは、表皮ターンオーバー遅延に関連するミトコンドリアＳＮＰ（ｍｔＳＮＰ）を検出することによる、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定方法、及び該方法に用いるキットに関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、大きく分けて表皮・真皮・皮下組織の３層構造から成り立っている。皮膚のうち、最外層に存在する表皮組織は、水分の保持や外界からの刺激や異物の侵入防止等のバリア機能を有し、生体にとって極めて重要な役割を担っている。表皮組織は分化段階の異なる表皮細胞からなる複数の層により構成される（基底層、有棘層、顆粒層、角質層）（非特許文献１）。表皮細胞の幹細胞（表皮幹細胞）は、このうち最も下層に位置する基底層に存在し、必要に応じて増殖と分化を繰り返し、組織に新しい細胞を常に供給していると考えられている（非特許文献２）。表皮細胞は、分化に伴って組織を下から上に移動する間に扁平になり、面積もそれに伴って大きくなる。基底層で表皮細胞が生まれてから最外層で垢となって剥がれ落ちるまでの過程を表皮のターンオーバーという。この表皮ターンオーバーが遅延すると、表皮の菲薄化、角質肥厚、バリア機能の低下等の原因となると考えられる。これまでの研究により、表皮のターンオーバー時間は、角質層の最外層に存在する細胞の面積（角層細胞面積）に相関することが分かっている（非特許文献３）。すなわち、ターンオーバー速度が遅くなるほど表皮最外層に存在する角質細胞の面積は大きくなると考えられている。そのため、角質細胞の面積は個人のターンオーバーの遅延の程度を測る指標になると考えられる。ヒトにおいては、加齢によりターンオーバーが遅延する傾向があり、角質細胞の面積の増大がみられることが明らかになっている（非特許文献４）。一般的に、表皮ターンオーバー遅延の現れ易さ（遺伝的素因）には個人差があることが知られているが、この遺伝的素因を正確かつ簡便に判定する技術の確立は十分ではなかった。

【0003】

ミトコンドリアは、細胞内に存在する細胞小器官の一つであり、核とは異なる独自のＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ； ｍｔＤＮＡ）を有している。ｍｔＤＮＡは、全長が１６，５６９塩基対で、環状二重鎖構造をとり、エネルギー産生に関わる１３種類の酸化的リン酸化酵素、２２種類のｔＲＮＡ、２種類のｒＲＮＡをコードしている。ｍｔＤＮＡは、核ゲノムと異なり、２０００コピー程度存在するので、酸化等の傷害を受けやすく、また修復活性が弱いこと等から変異しやすく、そのため多型性が高い。これまでｍｔＤＮＡの多型とアルツハイマー病、糖尿病、心臓病等の罹患リスクや老化現象との関係が研究されており、例えば、メタボリック症候群等に関連することが報告されている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特許第５３６０８５３号公報

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｓｉｍｐｓｏｎ ＣＬ， Ｐａｔｅｌ ＤＭ， Ｇｒｅｅｎ ＫＪ． Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｋｉｎ：ｃｙｔｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１１；１２：５６５－８０．

【文献】Ａｋａｍａｔｓｕ Ｈ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｓ， Ｙａｍａｄａ Ｔ， Ｍｉｚｕｔａｎｉ Ｈ， Ｎａｋａｔａ Ｓ， Ｙａｇａｍｉ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＣＤ２７１（＋） ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２０１６；４３：３１１－３．

【文献】Ｇ． Ｌ， Ｇｒｏｖｅ， Ａ． Ｍ． Ｋｌｉｇｍａｎ． Ｃｏｒｎｅｏｃｙｔｅｓ Ｓｉｚｅ ａｓ Ａｎ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｓｔｒａｔｕｍ Ｃｏｒｎｅｕｍ １９８３；１９１－１９５．

【文献】河合通雄， 芋川玄爾， 溝口昌子． 角質細胞診断法と角層ターンオーバー測定法による顔面皮膚性状解析． 日皮会誌 １９８９；９９：９９９－１００６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、個人の表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を正確かつ簡便に判定する手段を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因（表皮ターンオーバー遅延の発生し易さ）と関連するミトコンドリアＤＮＡ上の特定の一塩基多型（ｍｔＳＮＰ）を見出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］被験者から採取したＤＮＡ含有試料に含まれるミトコンドリアＤＮＡについて、以下の（１）～（９）の１種又は２種以上のヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列上の一塩基多型（ＳＮＰ）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルがリスクアレルである場合に、該被験者が表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を判定する方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列の１４６番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１４６）
（２）配列番号１に示される塩基配列の５１４７番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ５１４７）
（３）配列番号１に示される塩基配列の６９６２番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ６９６２）
（４）配列番号１に示される塩基配列の１０６０９番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１０６０９）
（５）配列番号１に示される塩基配列の１２４０６番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ１２４０６）
（６）配列番号１に示される塩基配列の１２８８２番目の塩基におけるＣ又はＴのＳＮＰ（ｍｔ１２８８２）
（７）配列番号１に示される塩基配列の１３９２８番目の塩基におけるＧ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１３９２８）
（８）配列番号１に示される塩基配列の１６２４９番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１６２４９）
（９）配列番号１に示される塩基配列の１６３０４番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１６３０４）
［２］［１］に記載の方法により判定された結果に基づいて、被験者の表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の程度に応じた表皮ターンオーバー遅延の予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法。
［３］配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列において、１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、及び／又は、
配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列において、１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を判定するためのキット。

【発明の効果】

【0009】

本発明の方法によれば、被験者の生体試料に存在するミトコンドリアＤＮＡ上の一塩基多型（ｍｔＳＮＰ）のアレルを検出することにより、該被験者が、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有するか（表皮ターンオーバーの遅延が生じ易いか）を正確かつ簡便に判定することができる。よって、この判定結果に基づき、表皮ターンオーバー遅延の予防や改善のための対策を早期に講じることができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

１．表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定方法
本発明の表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定方法は、被験者から採取したＤＮＡ含有試料に含まれるミトコンドリアＤＮＡについて、以下の（１）～（９）の１種又は２種以上のヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列上の一塩基多型（ＳＮＰ）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルがリスクアレルである場合に、該被験者が表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有すると判定する工程を含む。
（１）配列番号１に示される塩基配列の１４６番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１４６）
（２）配列番号１に示される塩基配列の５１４７番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ５１４７）
（３）配列番号１に示される塩基配列の６９６２番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ６９６２）
（４）配列番号１に示される塩基配列の１０６０９番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１０６０９）
（５）配列番号１に示される塩基配列の１２４０６番目の塩基におけるＧ又はＡのＳＮＰ（ｍｔ１２４０６）
（６）配列番号１に示される塩基配列の１２８８２番目の塩基におけるＣ又はＴのＳＮＰ（ｍｔ１２８８２）
（７）配列番号１に示される塩基配列の１３９２８番目の塩基におけるＧ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１３９２８）
（８）配列番号１に示される塩基配列の１６２４９番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１６２４９）
（９）配列番号１に示される塩基配列の１６３０４番目の塩基におけるＴ又はＣのＳＮＰ（ｍｔ１６３０４）

【0011】

上記（１）～（９）のＳＮＰは、本明細書において、それぞれｍｔ１４６、ｍｔ５１４７、ｍｔ６９６２、ｍｔ１０６０９、ｍｔ１２４０６、ｍｔ１２８８２、ｍｔ１３９２８、ｍｔ１６２４９、ｍｔ１６３０４と表記する場合がある。

【0012】

本発明で用いるヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｈｍｔＤＮＡ）の塩基の番号は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ＩＤ：ＮＣ＿０１２９２０．１）（配列番号１）の塩基配列の５’末端の塩基を１番目とした場合の番号をいう。

【0013】

後述の実施例の関連解析結果に示すように、ヒトミトコンドリアＤＮＡ上の上記９箇所のＳＮＰ（ｍｔＳＮＰ）は、ｐ値が０．０５未満となるものであり、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因と統計学的に関連が示唆されたものである。上記のＳＮＰは１種でも表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定が可能であるが、２種以上を組み合わせることにより判定精度をより高めることができる。例えば、２種の組み合わせでは、ｍｔ１０６０９とｍｔ１４６の組み合わせが好ましい。

【0014】

一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ、以下、「ＳＮＰ」と記載する場合がある）とは、一般的には、遺伝子の塩基配列が１箇所だけ異なる状態及びその部位をいう。また、多型とは、一般的には、母集団中１％以上の頻度で存在する２以上の対立遺伝子をいう。

【0015】

本明細書において「アレル」とは、あるｍｔＳＮＰ部位において取りうる、互いに異なる塩基をいい、「リスクアレル」とは、あるｍｔＳＮＰの各アレルのうち、表皮ターンオーバー遅延が生じ易い被験者群において生じにくい被験者群よりも頻度が高いアレルをいう。また、本明細書において「遺伝型」とは、あるｍｔＳＮＰ部位におけるアレルの型をいう。例えば、ｍｔ１４６における遺伝型には、Ｃ型及びＴ型が存在する。

【0016】

本発明の判定方法において、「一塩基多型（ＳＮＰ）のアレルを検出する」とは、そのＳＮＰのアレルの塩基の種類を同定することを意味し、「一塩基多型（ＳＮＰ）のアレルを検出する」の態様には、当該ＳＮＰのアレルを検出すること、当該ＳＮＰの遺伝型を同定することを含むものとする。

【0017】

本発明の判定方法においては、検出されるアレルがリスクアレルである場合に、該被験者が表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有する（表皮ターンオーバー遅延が生じ易い）と判定する。具体的には、配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基におけるＳＮＰについて、下記表１に示すリスクアレルが検出されれば、該リスクアレルが検出されない場合と比較して、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有する（表皮ターンオーバー遅延が生じ易い）。例えば、年齢に相応しない表皮ターンオーバー遅延が発生する可能性が高く、将来表皮ターンオーバー遅延を起こす可能性が相対的に高いと判定でき、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有する（表皮ターンオーバー遅延が生じ易い）程度が高いと判定できる。

【0018】

例えば、ｍｔ１４６の場合は、その遺伝型がＴ型であることが、Ｃ型である場合よりも表皮ターンオーバー遅延が生じ易いことを示す。

【0019】

【表1】

【0020】

本発明の判定方法において、被験者の人種は、特に限定はされないが、好ましくは東アジア人、より好ましくは日本人である。ここで、東アジア人とは、日本、朝鮮、中国、台湾及びモンゴルの人々のいずれかを起源に持つ人をいう。

【0021】

本発明の判定方法において用いるＤＮＡ含有試料としては、被験者より採取されたＤＮＡを含有する生体試料であれば、特に限定されない。ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡを含んでいればよい。ＤＮＡ含有試料としては、例えば、ミトコンドリアＤＮＡを採取可能な任意の体液、分泌液、組織、細胞、組織や細胞の培養物等を使用することができ、具体的には、被験者の唾液、血液、尿、喀痰、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、口腔（内頬）粘膜ぬぐい液、涙腺分泌液、汗、毛髪、爪、皮膚、粘膜、皮膚付着後に剥がしたテープストリップ等が挙げられるが、容易性及び低侵襲性の点から、唾液が好ましい。当該試料は、一般的な臨床検査で行われている方法に従って採取し、公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。その際、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを使用することができる。

【0022】

ＳＮＰの検出及びＳＮＰ（アレル）の型の判定（ＳＮＰタイピング）の方法は、特に制限されず、例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、ＰＣＲ法等により増幅し、増幅産物の多型を蛍光又は発光によって検出する方法等、公知の方法により行うことできる。例えば、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ（ＲＥＳＴＲＩＣＴＩＯＮ ＦＲＡＧＭＥＮＴ ＬＥＮＧＴＨ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭ）法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ＳＩＮＧＬＥ－ＳＴＲＡＮＤ ＣＯＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭ）法、ＰＣＲ－ＳＳＯ （ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ）法、ダイレクトシークエンス（ＤＩＲＥＣＴ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）法、ＡＳＯ（ＡＬＬＥＬＥ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ）ハイブリダイゼーション法、ＡＳＰ－ＰＣＲ（ＡＬＬＥＬＥ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＰＲＩＭＥＲ－ＰＣＲ）法、ＳＮＡＰＳＨＯＴ法、ＡＲＭＳ（ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＲＥＦＲＡＣＴＩＮＧ ＭＵＴＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ）法、ＴＡＱＭＡＮ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＲＮＡＳＥ Ａ切断法、ＤＯＬ（ＤＹＥ－ＬＡＢＥＬＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＬＩＧＡＴＩＯＮ）法、ＴＤＩ（ＴＥＭＰＬＡＴＥ－ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＤＹＥ－ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）等が挙げられる。上記方法はいずれも当業者に周知の方法であり、また、ＳＮＰの型の判定のための試薬やキットも市販されており、例えば、ＴＡＱＭＡＮ ＳＮＰ ＧＥＮＯＴＹＰＩＮＧ ＡＳＳＡＹＳ （ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等を用いることができる。

【0023】

上記の判定方法により得られた結果は、被験者が表皮ターンオーバー遅延の予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を選択する上で有用な指標となり、例えば、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有する（表皮ターンオーバー遅延が生じ易い）と判定された被験者は、年齢に関係なく、表皮ターンオーバー遅延を予防する対策を推奨できる。よって、本発明の別の側面によれば、上記の判定方法により得られた結果に基づいて、被験者の表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因（表皮ターンオーバー遅延の生じ易さ）の程度に応じた表皮ターンオーバー遅延の予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法もまた提供される。

【0024】

２．表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定用キット
上記のＳＮＰの検出及びタイピング方法では、各方法に応じたプローブやプライマーが使用される。このようなプローブやプライマーもまた本発明の範囲に包含され、キットとして提供できる。

【0025】

プローブとしては、上記のｍｔＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってｍｔＳＮＰ部位の塩基の種類を判別できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上の配列又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは１５～４０塩基、より好ましくは２０～３５塩基である。また、プローブは、適当な標識物質で標識されていてもよく、標識物質としては、例えば、酵素（ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、発光物質（ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、放射性同位元素（^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ等）、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド等が挙げられる。あるいは、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。

【0026】

また、プローブは固相に固定されていてもよい（ＤＮＡアレイ）。ＤＮＡアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズを同時に検出することが可能である。よって、多数のｍｔＳＮＰ部位を同時に解析するには、ＤＮＡアレイは有用である。アレイに搭載するプローブとなるオリゴヌクレオチドは、通常ｉｎ ｓｉｔｕで合成される。例えば、リソグラフィー方式（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、インクジェット方式（Ａｇｉｌｅｎｔ社）、ビーズアレイ方式（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）等によるオリゴヌクレオチドのｉｎ ｓｉｔｕ合成法が知られている。

【0027】

また、プライマーとしては、上記ｍｔＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ｍｔＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１に示すヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の１４６番目、５１４７番目、６９６２番目、１０６０９番目、１２４０６番目、１２８８２番目、１３９２８番目、１６２４９番目、及び１６３０４番目の塩基を含む領域を増幅したり、シークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。上記ｍｔＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマーは、該ｍｔＳＮＰ部位を含む領域のＤＮＡを鋳型として、当該ｍｔＳＮＰ部位に向かって相補鎖合成を開示することができるオリゴヌクレオチドであればよく、このようなプライマーの長さは１０～３０塩基が好ましく、１５～２５塩基がより好ましい。プライマーは、配列番号１に示される塩基配列において、当該ｍｔＳＮＰ部位の上流または下流の位置に設定することができる。

【0028】

当業者であれば、ｍｔＳＮＰ部位を含む周辺ＤＮＡ領域の塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプローブ及びプライマーを設計することができる。また、プローブ及びプライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することが可能である。

【0029】

本発明のキットには、上記のプローブ及びプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを少なくとも含んでいればよい。また、当該キットには、必要に応じて、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。なお、キット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。

【実施例】

【0030】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0031】

（実施例１）表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因（表皮ターンオーバー遅延の生じ易さ）に関連するｍｔＳＮＰの同定
本試験を実施するにあたり、同意書、遺伝型判定等について、自社における倫理審査委員会によって承認を受けた。同意書のサインにて同意を受けた被験者よりサンプル採取を行い、遺伝型判定及び表現型との関連解析を行った。

【0032】

（１）ＤＮＡサンプル
自社女性社員をＤＮＡサンプル提供の対象者とした。このうち募集に応じた女性３６３人の唾液を採取した。採取した唾液からＭａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｓａｌｉｖａ ＤＮＡ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を使用してＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡが含まれる）を抽出し、ＤＮＡサンプルを得た。

【0033】

（２）ヒトミトコンドリアＤＮＡの増幅
得られたＤＮＡサンプルについて、ヒトミトコンドリアＤＮＡの全長（１６，５６９ 塩基対）をＬｏｎｇ Ｒａｎｇｅ ＰＣＲにて増幅した。具体的には、下記のプライマーセット１、２を用いて、オーバーラップを含めて２つの断片として増幅した。ＰＣＲは、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて行った。条件は、９４℃ １分間の後、９４℃ ３０秒間→５４℃ １５秒間→６８℃ １１分間を３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させた。

【0034】

［プライマーセット１］増幅産物９０６４塩基対
フォワードプライマー：５’－ＡＡＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣ－３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’－ＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡＧＴＴ－３’（配列番号３）

【0035】

［プライマーセット２]増幅産物１１１７０塩基対
フォワードプライマー：５’－ＴＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＡＴＡＣＡＴＴ－３’（配列番号４）
リバースプライマー：５’－ＡＡＴＧＴＴＧＡＧＣＣＧＴＡＧＡＴＧＣＣ－３’（配列番号５）

【0036】

（３）ライブラリの作製
次に、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ （イルミナ社製）及びＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２ Ｓｅｔ Ａ （イルミナ社製）を用いて、（２）で調製したＰＣＲ産物からライブラリを作製した。実験手法については、各キットのプロトコルに従った。

【0037】

（４）シークエンス
（３）で作製したライブラリを用いて、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）により被験者３６３人の全ミトコンドリア配列を解析した。なお、シーケンスには、ＭｉＳｅｑ Ｒｅｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２ （３００ ｃｙｃｌｅ， イルミナ社製）を用いた。

【0038】

（５）ｍｔＳＮＰの同定
各被験者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を参照配列（ＮＣ＿０１２９２０．１；配列番号１）と比較することによりｍｔＳＮＰを同定した。なお、解析には、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ社製）を用いた。

【0039】

（６）表現型データ（角質細胞面積）
表皮ターンオーバー遅延の指標として被験者の角質細胞面積を測定した。具体的には、前記３６３人の被験者の上腕内側部からテープストリッピングにより角質細胞を採取し、グリメリウス染色により染色した後、細胞面積を測定した。グリメリウス染色は、角質細胞が付着したテープを０．０３％硝酸銀液（３７℃ ３時間）、還元液（３７℃ ３時間）、２％チオ硫酸ナトリウム水溶液（室温 ３分）で染色した後、流水で５分間洗浄し、乾燥することにより行った。なお、上記各試薬は武藤化学株式会社製のものを用いた。次に、顕微鏡（ＤＭＩ ６０００Ｂ ライカ社製）を用いて、被験者一人あたり２０個の角質細胞を撮影し、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪにより個々の細胞面積を測定した。そして、各被験者における角質細胞面積の平均値をその被験者の代表値として算出した。

【0040】

（７）関連解析
遺伝型データと角質細胞面積データとの関連性について、Ｒ ３．６．３（ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を利用して評価した。表現型データと年齢との関連性を除去するため、表現型データを目的変数、年齢を説明変数とした回帰分析を行い、残差を算出した。そして、ｍｔＳＮＰ毎に、変異の有無により分けた２群間の残差の平均値の差についてウェルチのｔ検定を行い、算出されたｐ値が０．０５未満となるｍｔＳＮＰを表現型との関連性があるものとして抽出した。

【0041】

（８）結果
以上の解析から、表皮ターンオーバー遅延（角質細胞面積の増加）の遺伝的素因と関連性があり、個人の表皮ターンオーバーの遅延の生じ易さを判定できるｍｔＳＮＰとして９個のｍｔＳＮＰを特定した（表２）。特定したｍｔＳＮＰ、ヒトミトコンドリアＤＮＡ上の位置、アレル及びリスクアレルの塩基、遺伝型のｐ値を示す。

【0042】

【表2】

【0043】

（実施例２）表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因に関連するｍｔＳＮＰによる多変量解析
実施例１で同定されたｍｔＳＮＰについて、表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因の判定精度を高めることができるｍｔＳＮＰの組み合わせについて検討を行った。具体的には、表現型データと年齢との関連性を除去するため、表現型データを目的変数、年齢を説明変数とした回帰分析を行い、残差を算出した。次に、ｍｔＳＮＰの選択順について、この残差を目的変数、当該ＳＮＰの遺伝型データに変異が有る場合を１、無い場合を０とした変数を説明変数とした重回帰分析において、ステップワイズ法による変数選択を行った場合（表３－１）と、前記ウェルチのｔ検定のｐ値の小さい順に単純に変数選択した場合（表３－２）とで、判定精度の比較を行った。

【0044】

【表3-1】

【0045】

【表3-2】

【0046】

表３－１、表３－２に示されるように、ステップワイズ法によって最適な変数として選択したｍｔ１０６０９とｍｔ１４６の組み合わせのほうが、ウェルチのｔ検定のｐ値の小さい順に選択したｍｔ１０６０９とｍｔ６９６２の組み合わせより、重回帰式の精度を示す指標である決定係数Ｒ２（及び自由度調整済み決定係数：補正Ｒ２）が高かった。また、赤池の情報量基準（ＡＩＣ）は、ｍｔ１０６０９とｍｔ１４６の組み合わせのほうが、ｍｔ１０６０９とｍｔ６９６２の組み合わせより値が小さくなり、重回帰モデルのあてはまり度が高いことがわかった。よって、ｍｔ１０６０９に他のｍｔＳＮＰを加えて判定を行う場合、ｍｔ１４６と組み合わせることより、判定精度をより向上させることが可能である。

【産業上の利用可能性】

【0047】

本発明の方法により、サンプル提供者が表皮ターンオーバー遅延の遺伝的素因を有するかどうか、将来表皮ターンオーバー遅延が発生する可能性の有無や程度を、正確かつ簡便に判定することができる。よって、その判定結果に基づき、サンプル提供者にカスタマイズした表皮ターンオーバー遅延予防や改善のための化粧品やサプリメントを提供すること、また表皮ターンオーバー遅延予防や改善のためのケア方法に関するカウンセリングやアドバイスを行うことが可能となる。

【配列表】

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