特許 7641666 フィブリン分解酵素プラスミンの改善された高度に強力な特異的ヒトＫｕｎｉｔｚインヒビター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-02-27

(45)【発行日】2025-03-07

(54)【発明の名称】フィブリン分解酵素プラスミンの改善された高度に強力な特異的ヒトＫｕｎｉｔｚインヒビター

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20250228BHJP

   C12N 15/15 20060101ALI20250228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250228BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250228BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250228BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250228BHJP

   C07K 14/81 20060101ALI20250228BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20250228BHJP

   A61L 15/32 20060101ALI20250228BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20250228BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

C12N15/15 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/21

C12N1/19

C12N5/10

C07K14/81

A61P7/04

A61L15/32 100

A61K9/70

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2023515756

(86)(22)【出願日】2021-09-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-29

(86)【国際出願番号】 US2021049284

(87)【国際公開番号】W WO2022055882

(87)【国際公開日】2022-03-17

【審査請求日】2023-05-08

(31)【優先権主張番号】63/076,516

(32)【優先日】2020-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/112,840

(32)【優先日】2020-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バジャジ， エス． ポール

【審査官】長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１４４５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５２１９３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】J Pharmacol Exp Ther.，2009年，Vol.331, No.3，pp.940-945，10.1124/jpet.109.161034

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｐ ７／００－ ７／１２

Ｃ０７Ｋ １４／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）からなるポリペプチド；および薬学的に受容可能な賦形剤、
を含む医薬組成物。

【請求項2】

前記薬学的に受容可能な賦形剤は、保存剤、張度調整剤、洗浄剤、ヒドロゲル、粘度調整剤、またはｐＨ調整剤のうちの少なくとも１種から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物は、静脈内注射または注入における使用のために選択された薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ポリペプチドのプラスミン阻害定数（Ｋｉ）は、３７℃において、少なくとも２日間、４日間または１週間、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ カルシウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中での前記組成物のインキュベーション後に、１０％未満変化する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

ポリペプチド配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。

【請求項6】

前記ポリヌクレオチドは、配列：ＡＡＣＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＡＧＧＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号２）
を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記ポリヌクレオチドは、細胞において前記ポリペプチドを発現させるための１またはこれより多くの調節配列を含むベクターの中に配置される、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

請求項７に記載のベクターを含む細胞。

【請求項9】

前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項７に記載の細胞。

【請求項10】

プラスミンの少なくとも１種の活性を阻害する方法における使用のための請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記方法は、プラスミンと、プラスミンの少なくとも１種の活性を阻害するために十分な量の前記組成物を接触させることを包含する組成物。

【請求項11】

前記方法は、線維素溶解が阻害されるように、線維素溶解を阻害するために十分な量の前記組成物を患者に投与することによって、前記患者における線維素溶解を阻害することを包含する、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

被験体において出血を阻害するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

前記出血は、外傷性傷害から生じる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記外傷性傷害は、外傷性脳傷害である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記出血は、手術から生じる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項16】

前記出血は、心臓手術を受けておりかつ血液喪失の低減の必要性のある患者におけるものであり、前記組成物は、前記手術の前、最中、または後に投与されるものであることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記心臓手術は、心肺バイパス手術である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記出血は、外傷性出血性ショックのための処置を受けている患者におけるものである、請求項１２に記載の組成物。

【請求項19】

前記組成物は、マトリクス中に配置される、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

前記マトリクスは、パッチまたは圧迫包帯である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

配列ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）からなる、天然に存在しない単離されたポリペプチド。

【請求項22】

前記ポリペプチドは、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫＤ１の二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有する６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合、プラスミンを阻害するにあたって少なくとも３倍大きい効力を有する、請求項２１に記載の天然に存在しない単離されたポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年９月１０日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６３／０７６，５１６号および２０２０年１１月１２日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６３／１１２，８４０号（これらの出願は、それらの全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。

【0002】

政府支援の研究および開発の下でなされた発明の権利に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＨＬ１４１８５０の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

技術分野
本発明の分野は、プラスミンの作用を阻害し得るポリペプチド剤に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
線維素溶解は、正常な生理学的状況下でクロット形成およびその過剰な成長の程度を調節する生理学的プロセスである。しかし、外傷または手術、虚血および再灌流の後には、血液は、大きな非内皮表面（例えば、過剰な線維素溶解を生じる心肺バイパス（ＣＰＢ）回路）と接触する。この過剰な線維素溶解は、凝固障害、出血、および炎症応答に寄与する。これらの環境下では、このプロセスの重要なメディエーターであるプラスミンを阻害する抗線維素溶解剤は、出血、同種異系血液投与、および有害な臨床転帰を低減するために、医療従事者によって使用される。

【0005】

使用されている抗線維素溶解剤は、アプロチニン、トラネキサム酸（ＴＸＡ）およびε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）である。アプロチニンは、２００８年に、主に腎機能障害およびアナフィラキシーが原因で患者におけるその有害作用に起因して、市場から取り除かれた（１）。意義深いことには、アプロチニンは、そのリスク－ベネフィットプロフィールの理由から、欧州およびカナダにおいて使用制限付きで再導入されている（２）。しかし、アプロチニンの禁止は、米国では解かれていない。現在使用されるリジンアナログであるＴＸＡおよびＥＡＣＡは、アプロチニンほど有効ではなく、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）および腎機能障害をも引き起こす（３，４）。Ｍｏｎｔｒｅａｌの心臓手術グループの近年の論文（５）は、４ユニットより多くの赤血球の輸血が、ＴＸＡをほぼ１００％使用しているにもかかわらず、２０１２年～２０１５年の間に彼らの施設において心臓手術をした患者の全体のほぼ１／４において発生したことを示した。このことから、著者らは、効率的な血液節約剤（blood-sparing agent）の必要性がなおあると結論づけた。所望の生成物は、リスクに対するベネフィットの最良のバランスを有する、線維素溶解および炎症に関するプロテアーゼ阻害プロフィールを明確に示さなければならない（６）。

【0006】

近年、プラスミンを阻害する２つの生成物、すなわち、エカランチド（Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ）およびＭＤＣＯ－２０１０が、フェーズＩＩ臨床試験までの心臓バイパス手術の試験を完了した。しかし、各生成物は、フェーズＩＩＩ心臓バイパス手術治験において満足のいく有効性および安全性プロフィールを提供できず、両方の治験は、早々に終了した（７，８）。これは、エカランチドおよびＭＤＣＯ－２０１０がカリクレインの強力なインヒビターであることに関連し得る。さらに、ＭＤＣＯ－２０１０はまた、凝固性プロテアーゼである第Ｘａ因子を阻害する。別の生成物、Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎ－１（ヘビ毒由来のＫｕｎｉｔｚタイプセリンプロテアーゼインヒビター）は、早期開発段階にある（９）。この場合に、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、アプロチニンＫｕｎｉｔｚドメイン（これは、ウシ肺に由来する）と比較した場合、ヘビ毒に由来する。従って、アプロチニンに類似して、ヘビ毒Ｋｕｎｉｔｚドメインは、ヒトにおいてアナフィラキシー応答を生じると予測される。アプロチニンに伴う問題およびこの技術分野において当業者がインビボでの使用のためにより適した抗線維素溶解剤を同定しようとする進行中の努力は、この認識される問題が解決することなく長期間当該分野に存在し、このニーズが、当業者によって認識された根強いものであることを示す。

【0007】

抗線維素溶解剤としての使用が探索されている作用物質の一群としては、ヒトＫｕｎｉｔｚタイプインヒビターポリペプチドのバリアントが挙げられる（例えば、米国特許第８，９９３，７１９号および米国特許公開２００８００２６９９８を参照のこと）。しかし、これらのヒトＫｕｎｉｔｚタイプインヒビターポリペプチドは、種々のポリペプチドとインビボで相互作用し得る（プラスミンおよびセリンプロテアーゼ（例えば、カリクレイン）を含む）ことから、このようなポリペプチドの複雑な薬物動態は、このようなバリアントポリペプチドにインビボでの治療剤としての使用のために最適化された機能的特性を提供するアミノ酸残基の一団（constellation）を有するヒトＫｕｎｉｔｚタイプインヒビターバリアントポリペプチドを見出すにあたって困難を引き起こす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】米国特許第８，９９３，７１９号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００８／００２６９９８号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の要旨
本明細書で開示されるように、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）の新たな天然に存在しないポリペプチドバリアントが作製され、非常に望ましい薬物動態プロフィールを有することが発見された。例えば、本開示のポリペプチドは、従来利用されていたが問題のある抗線維素溶解剤であるアプロチニンより良好な、プラスミンの活性を阻害する能力を含む薬物動態プロフィールを有する。さらに、アプロチニンで観察されるプラスミン阻害活性より優れたこの新たなポリペプチドバリアントのプラスミン阻害活性に加えて、本明細書で開示されるポリペプチドバリアントは、アプロチニンおよび関連分子で観察されるある特定の有害副作用をさらに回避する。このことの１つの例証において、本明細書で開示されるポリペプチドバリアントは、他の凝固セリンプロテアーゼ（例えば、カリクレイン）に対して最小の阻害活性を示すことが観察される。

【0010】

本明細書で開示される６０残基のポリペプチドバリアントは、リジン残基を含むＣ末端構造を含むアミノ酸残基の特有の一団を含む。特定の理論によっても作用機序によっても拘束されないが、このＣ末端構造は、フィブリンクロットへのプラスミノゲン結合を阻害する様式において、そのクリングルドメインを介して、プラスミンまたはプラスミノゲンへの上記６０残基のポリペプチドバリアントの結合を促進するようである。本明細書で開示されるポリペプチドバリアントはまた、１５位におけるリジンアミノ酸置換を含む３つのアミノ酸変異（「ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ」）の群を含む。驚くべきことに、このＹ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異体は、二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有する６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合に、プラスミンを阻害するにあたって、４～５倍さらに強力であることが観察される。特定の理論によっても作用機序によっても拘束されないが、１５位におけるリジンアミノ酸置換を有するこの三重変異体は、このバリアントポリペプチドの、プラスミンにおける残基Ａｓｐ１８９およびＳｅｒ１９０との相互作用を促進することによって機能するようである。予測外なことには、この６０残基のＹ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異ポリペプチドは、二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有する相当の６０残基のポリペプチドバリアントと比較する場合、カリクレイン、第ＸＩａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子の少なくとも１０倍弱い阻害をさらに示す。従って、本明細書で開示される６０残基のバリアントポリペプチドは、例えば、この技術において類似の阻害性分子と関連するある特定の副作用を同時に回避しながら、プラスミンを強く阻害する能力を含む、非常に望ましい薬物動態／材料プロフィールを示す。

【0011】

本明細書で開示される発明は、多くの実施形態を有する。本発明の実施形態は、例えば、配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥ ＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）を含むポリペプチドおよび／または単離された天然に存在しないポリペプチド（配列番号１）を含む組成物を含む。代表的には、このような組成物はまた、さらなる剤、例えば、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、保存剤、張度調整剤、洗浄剤、ヒドロゲル、粘度調整剤、ｐＨ調整剤など）を含む。このような実施形態は、例えば、静脈内注射または注入における使用のために選択された薬学的に受容可能な賦形剤を含む医薬組成物を含む。

【0012】

本発明の別の実施形態は、ポリペプチド配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲ ＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ(配列番号1)をコードするポリヌクレオチドを含む組成物である。本明細書で開示される発明の作業実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列：ＡＡＣＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＡＧＧＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号２）を含む。この技術における当業者は、この具体的配列が、ヒトにおいて本明細書で開示されるＫｕｎｉｔｚドメイン１インヒビターポリペプチドを生成するために使用されるコドンを含むが、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、上記ポリペプチドを発現するために使用されるシステムに応じて変動し得る（すなわち、細菌、酵母および昆虫細胞では異なるコドンが使用され得る）ことを理解する。代表的には、このようなポリヌクレオチドは、細胞において上記ポリペプチドを発現するために、１またはこれより多くの調節配列を含むベクター中に配置される。本発明の実施形態はまた、このようなベクターを含む細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞）を含む。

【0013】

以下で考察されるように、本発明の実施形態はまた、本明細書で開示されるポリペプチドを使用する方法を含む。本発明のこのような実施形態は、例えば、プラスミンの少なくとも１種の活性を阻害する方法であって、上記方法は、プラスミンと、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドとを接触させることを包含する方法を含む。本発明の関連する実施形態は、患者における線維素溶解を阻害する方法であって、上記方法は、線維素溶解が阻害されるように、線維素溶解を阻害するために十分な量の本明細書で開示されるポリペプチドを、上記患者に投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、プラスミン活性の阻害の必要性のある被験体を処置するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、手術の必要性のある被験体を処置するための方法であって、上記方法は、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを、手術の前、最中、および／または後に、上記被験体に投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、がんまたは前がん状態に罹患した被験体を処置するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、アプロチニンによって処置可能な状態に関して、被験体を処置する方法であって、上記方法は、上記被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。

【0014】

本発明の１つの例証的な実施形態は、被験体において出血を阻害するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法である。本発明のある特定の実施形態において、上記出血は、手術（例えば、心臓手術、または肝移植のような臓器移植手術）または外傷性傷害（例えば、外傷性脳傷害、銃創、事故など）から生じる。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１に示されるポリペプチドが中に配置されているパッチまたは包帯などを含む。この文脈において、本発明の別の実施形態は、被験体においてプラスミンの少なくとも１種の活性を阻害する方法であって、上記被験体における出血している組織と、配列番号１に示されるポリペプチドが中に配置されているこのようなパッチなどとを、これらのポリペプチドが上記被験体においてプラスミンの少なくとも１種の活性を阻害し得るように接触させることによる方法である。

【0015】

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになる。しかし、詳細な説明および具体例が、本発明のいくつかの実施形態を示すと同時に、限定ではなく例証するために与えられていることは、理解されるべきである。本発明の範囲内の多くの変更および改変は、その趣旨から逸脱することなく行われ得、本発明は、全てのこのような改変を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１。精製ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_ＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動からのデータ。レーン１、タンパク質マーカー；レーン２、還元ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；レーン３、非還元ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ。

【0017】

【図2】図２。プラスミン、ＦＸＩａ、カリクレイン（ＫＬＫ）、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦおよびＦＸａでのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５ＫＬ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの平衡阻害定数（Ｋｉ）からのデータ。

【化1】

略語：Ｐｍ、プラスミン；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（アプロチニン、トラジロール）；ＫＤ１ＴＭ、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５ＫＬ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＫＬＫ、カリクレイン；ＦＸＩａ、第ＸＩａ因子、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ、第ＶＩＩａ因子／可溶性組織因子；ＦＸａ、第Ｘａ因子。

【0018】

【図3】図３Ａおよび３Ｂ。ヒト血漿中の線維素溶解に対するＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１ ５ＫＬ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ（Ａ）またはＢＰＴＩ（Ｂ）の効果を試験するデータ。トロンビン（ＩＩａ）をヒト血漿に添加して、クロット形成（これは、ＯＤ４０５における増加と関連付けられる）を開始した（黒；白抜きの丸；ＩＩａ、ゼロｔＰＡ）。３μＭ ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５ＫＬ１７Ｒ}－Ｋ_ＴまたはＢＰＴＩの添加は、クロット形成に影響を及ぼさない（褐色の曲線；ＩＩａ、３μＭ ＫＤ１ＴＭ（パネルＡ）またはＢＰＴＩ（パネルＢ））。ｔＰＡの添加は、プラスミノゲンをプラスミンへと変換し、このことは、約１２分以内にフィブリンクロットを完全に溶解し、ＯＤ４０５における最初の増加、続いて、減少によって示される（黒；塗りつぶしの丸；ＩＩａ、ｔＰＡ）。ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_ＴまたはＢＰＴＩの添加は、用量依存性様式において線維素溶解を阻害する－ ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ（Ａ）またはＢＰＴＩ（Ｂ）は以下のとおり：０．５μＭ（青）、１μＭ（赤）、２μＭ（緑）、３μＭ（マゼンタ）。略語：ｔＰＡ、組織プラスミノゲンアクチベーター；ＫＤ１ＴＭ、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（アプロチニン／トラジロール）。

【0019】

【図4】図４。ＨＵＶＥＣ生存率の試験からのデータ。ＨＵＶＥＣを、処理しなかったか、または示された濃度における抗線維素溶解薬：ＫＤ１ＴＭ、ＢＰＴＩ、ＥＡＣＡ、もしくはＴＸＡで２４時間にわたって処理した。細胞を、細胞透過性の非毒性かつ弱い蛍光青色指示染料であるレサズリンとともにインキュベートした（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ生存率アッセイ）。蛍光強度は、相対的細胞数に比例する。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。各抗線維素溶解剤で処理した細胞の生存率は、処理しなかった細胞とは有意差がないことが見出された（ｐ＞０．０５）。略語： ＫＤ１ＴＭ， ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ＥＡＣＡ、εアミノカプロン酸、ＴＸＡ、トラネキサム酸。

【0020】

【図5】図５。線維芽細胞生存率の試験からのデータ。線維芽細胞を、処理しなかったか、または示された濃度における以下の抗線維素溶解薬：ＫＤ１ＴＭ、ＢＰＴＩ、ＥＡＣＡ、もしくはＴＸＡで２４時間にわたって処理した。細胞を、細胞透過性の非毒性かつ弱い蛍光青色指示染料であるレサズリンとともにインキュベートした（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ生存率アッセイ）。蛍光強度は、相対的細胞数に比例する。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。各抗線維素溶解剤で処理した細胞の生存率は、処理しなかった細胞とは有意差がないことが見出された（ｐ＞０．０５）。略語：上記の図４と同じ。

【0021】

【図6A】図６Ａおよび６Ｂ。ＨＵＶＥＣ（Ａ）およびヒト線維芽細胞（Ｂ）のアポトーシスの試験からのデータ。ＨＵＶＥＣまたは線維芽細胞を、処理しなかったか、または以下の抗線維素溶解剤：３０μＭ ＫＤ１ＴＭ、３０μＭ ＢＰＴＩ、６０ｍＭ ＥＡＣＡ、３０ｍＭ ＴＸＡもしくは０．０５μＭ タキソール（陽性コントロール）で２４時間にわたって処理した。発光（相対的光単位（ＲＬＵ）として示される）は、カスパーゼ－３／７活性に比例する。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。略語：ＫＤ１ＴＭ， ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ＥＡＣＡ、εアミノカプロン酸、ＴＸＡ、トラネキサム酸；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞。

【図6B】図６Ａおよび６Ｂ。ＨＵＶＥＣ（Ａ）およびヒト線維芽細胞（Ｂ）のアポトーシスの試験からのデータ。ＨＵＶＥＣまたは線維芽細胞を、処理しなかったか、または以下の抗線維素溶解剤：３０μＭ ＫＤ１ＴＭ、３０μＭ ＢＰＴＩ、６０ｍＭ ＥＡＣＡ、３０ｍＭ ＴＸＡもしくは０．０５μＭ タキソール（陽性コントロール）で２４時間にわたって処理した。発光（相対的光単位（ＲＬＵ）として示される）は、カスパーゼ－３／７活性に比例する。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。略語：ＫＤ１ＴＭ， ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ＥＡＣＡ、εアミノカプロン酸、ＴＸＡ、トラネキサム酸；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞。

【0022】

【図7】図７。ＨＵＶＥＣ細胞傷害の試験からのデータ。ＨＵＶＥＣを、処理しなかったか、または以下の抗線維素溶解剤：３０μＭ ＫＤ１ＴＭ、３０μＭ ＢＰＴＩ、６０ｍＭ ＥＡＣＡ、３０ｍＭ ＴＸＡもしくは陽性コントロールとしての０．０５μＭ タキソールで２４時間にわたって処理した（上のパネル）。ＦＩＴＣ：ＣｅｌｌＴｏｘ ｇｒｅｅｎ色素は、膜の完全性が障害された場合に、ＤＮＡに結合する。蛍光シグナル（棒グラフにおいて定量、下のパネル）は、細胞傷害に比例する。ＤＡＰＩ：核染色は、全ての核に結合する。略語：ＦＩＴＣ， フルオレセインイソチオシアネート；ＤＡＰＩ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞；ＫＤ１ＴＭ、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ＥＡＣＡ、εアミノカプロン酸、ＴＸＡ、トラネキサム酸。

【0023】

【図8】図８。線維芽細胞の細胞傷害の試験からのデータ。線維芽細胞を、処理しなかったか、または以下の抗線維素溶解剤：３０μＭ ＫＤ１ＴＭ、３０μＭ ＢＰＴＩ、６０ｍＭ ＥＡＣＡ、３０ｍＭ ＴＸＡもしくは陽性コントロールとしての０．０５μＭ タキソールおよび溶解緩衝液で２４時間にわたって処理した（上のパネル）。ＦＩＴＣ：ＣｅｌｌＴｏｘ ｇｒｅｅｎ色素は、膜の完全性が障害された場合に、ＤＮＡに結合する。蛍光シグナル（棒グラフにおいて定量、下のパネル）は、細胞傷害に比例する。ＤＡＰＩ：核染色、は、全ての核に結合する。略語：ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート；ＤＡＰＩ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＫＤ１ＴＭ、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ；ＢＰＴＩ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ＥＡＣＡ、εアミノカプロン酸、ＴＸＡ、トラネキサム酸。

【0024】

【図9A】図９Ａ～９Ｂ。ヒト組織因子経路インヒビターのＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のモデル化された複合体。図９Ａは、プラスミンとのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ相互作用のモデル化された複合体を示す。（Ａ）ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとプラスミンプロテアーゼドメインとのモデル化された相互作用。プラスミンプロテアーゼドメインの静電的表面およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの漫画表示（淡緑色）が示される。プラスミンとのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ相互作用のＰ１（Ｌｙｓ１５）、Ｐ５（Ｔｈｒ１１）およびＰ２’（Ａｒｇ１７）残基は、棒の表示で示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。（Ｂ）ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとプラスミンクリングルドメインとのモデル化された相互作用。プラスミノゲンクリングルドメイン１の静電的表面およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの漫画表示（淡緑色）が示される。水素結合およびクリングルドメインとＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとの間の塩橋（破線として示される）を形成する残基は、棒の表示で示される。炭素原子は、クリングルドメインに関しては緑で、およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔに関しては淡緑色で示される。（Ａ）にあるように、酸素原子は赤で示され、窒素原子は青で示される。ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ残基は、接尾辞Ｉ（suffix I）で表示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。図９Ｂは、プラスミンとのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ相互作用のモデル化された複合体を示す。（Ａ）ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとプラスミンプロテアーゼドメインとのモデル化された相互作用。プラスミンプロテアーゼドメインの静電的表面およびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの漫画表示（黄色）を示す。プラスミンとのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ相互作用のＰ１（Ａｒｇ１５）、Ｐ５（Ｔｈｒ１１）およびＰ２’（Ａｒｇ１７）残基は、棒の表示で示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。（Ｂ）ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとプラスミンクリングルドメインとのモデル化された相互作用。プラスミノゲンクリングルドメイン１の静電的表面およびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの漫画表示（黄色）を示す。水素結合およびクリングルドメインとＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとの間の塩橋（破線で示される）を形成する残基は、棒の表示で示される。炭素原子は、クリングルドメインに関しては緑で、およびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔに関しては黄色で示される。（Ａ）にあるように、酸素原子は赤で示され、窒素原子は青で示される。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ残基は、接尾辞Ｉで表示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。

【図9B】図９Ａ～９Ｂ。ヒト組織因子経路インヒビターのＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のモデル化された複合体。図９Ａは、プラスミンとのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ相互作用のモデル化された複合体を示す。（Ａ）ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとプラスミンプロテアーゼドメインとのモデル化された相互作用。プラスミンプロテアーゼドメインの静電的表面およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの漫画表示（淡緑色）が示される。プラスミンとのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ相互作用のＰ１（Ｌｙｓ１５）、Ｐ５（Ｔｈｒ１１）およびＰ２’（Ａｒｇ１７）残基は、棒の表示で示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。（Ｂ）ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとプラスミンクリングルドメインとのモデル化された相互作用。プラスミノゲンクリングルドメイン１の静電的表面およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの漫画表示（淡緑色）が示される。水素結合およびクリングルドメインとＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとの間の塩橋（破線として示される）を形成する残基は、棒の表示で示される。炭素原子は、クリングルドメインに関しては緑で、およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔに関しては淡緑色で示される。（Ａ）にあるように、酸素原子は赤で示され、窒素原子は青で示される。ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ残基は、接尾辞Ｉ（suffix I）で表示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。図９Ｂは、プラスミンとのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ相互作用のモデル化された複合体を示す。（Ａ）ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとプラスミンプロテアーゼドメインとのモデル化された相互作用。プラスミンプロテアーゼドメインの静電的表面およびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの漫画表示（黄色）を示す。プラスミンとのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ相互作用のＰ１（Ａｒｇ１５）、Ｐ５（Ｔｈｒ１１）およびＰ２’（Ａｒｇ１７）残基は、棒の表示で示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。（Ｂ）ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとプラスミンクリングルドメインとのモデル化された相互作用。プラスミノゲンクリングルドメイン１の静電的表面およびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの漫画表示（黄色）を示す。水素結合およびクリングルドメインとＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとの間の塩橋（破線で示される）を形成する残基は、棒の表示で示される。炭素原子は、クリングルドメインに関しては緑で、およびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔに関しては黄色で示される。（Ａ）にあるように、酸素原子は赤で示され、窒素原子は青で示される。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ残基は、接尾辞Ｉで表示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。

【0025】

【図10】図１０。ＫＤ１ポリペプチドの配列。ヒトＴＦＰＩ－２ ＫＤ１単一変異体（ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ）のＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された配列（配列番号４）、ならびに二重変異体（ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ）のＥ．ｃｏｌｉ（配列番号５）およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（配列番号６）において発現された配列。下向きの矢印は、Ｈｉｓタグを除去するために導入されたエンテロキナーゼ切断部位を示す。変異した残基、Ｔｙｒ１１ＴｈｒおよびＬｅｕ１７Ａｒｇはまた、印が付けられている。残基１は、ＢＰＴＩ－Ｋｕｎｉｔｚドメイン番号付けに従って番号付けされており、ＴＦＰＩ－２ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１配列においてアミノ酸１０に相当する。

【0026】

【図11】図１１。ＴＦＰＩ－２ ＫＤ１単一変異体および二重変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の試験からのデータ。レーン１、分子量（ＭＷ）マーカー；レーン２、還元Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ；レーン３、還元Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ；レーン４、還元Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ；レーン５、非還元Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ；レーン６、非還元Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ；レーン７、非還元Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ。５μｇのタンパク質を、各レーンに載せた。ＫＤ１ＳＭ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ；およびＫＤ１ＤＭ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ。

【0027】

【図12】図１２Ａおよび１２Ｂ。１２（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＫＤ１－ＷＴ（ＩＩａ切断部位、３２）、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、エンテロキナーゼ切断部位を有するＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンと、プラスミンとの平衡解離定数（Ｋ_ｉ）の決定の試験からのデータ。酵素活性を、漸増インヒビター濃度でのパーセント分別活性（阻害された率／阻害されなかった率）として表す。阻害定数（Ｋ_ｉ）を、実験の節において概説されるとおりの式１および２を使用して決定した。データは、３回の実験の平均を表す。使用したプラスミンの濃度は、３ｎＭであった。１２（Ｂ）ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ、ｐＫＬＫおよびＦＸＩａでのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの阻害プロフィール。ＦＶＩＩａ／ｓＴＦの濃度は、２０ｎＭであったのに対して、ｐＫＬＫおよびＦＸＩａは、各々１ｎＭであった。行った三連の実験において、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの３μＭ濃度までは、阻害は観察されなかった。

【0028】

【図13】図１３Ａおよび１３Ｂ。ＳＰＲによって測定される場合の、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴとＤＩＰ－δプラスミンおよびｔＰＡとの相互作用の試験からのデータ。（Ａ）ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴへのＤＩＰ－δプラスミン結合。ＤＩＰ－δプラスミンを、アミンカップリング法によってＣＭ５チップに連結し、結合したタンパク質に関して７３４応答単位（ＲＵ）の固定レベルを達成した。５種の濃度（０．１μＭ、０．３μＭ、０．５μＭ、０．７５μＭおよび１μＭ）のＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを使用し、６分間の会合時間および１０分間の解離時間（流速１０μＬ／分）を使用した。詳細を、実験の節に提供する。（Ｂ）ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴへのｔＰＡ結合。ｔＰＡをＣＭ５チップに連結し、結合したタンパク質に関して１１８２ ＲＵの固定レベルを達成した。５種の濃度のＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ（０．１μＭ、０．３μＭ、０．７５μＭ、１μＭおよび２μＭ）を使用した。分析物の会合および解離プロトコールは、パネル（Ａ）におけるものと同じであった。パネルＡおよびパネルＢにおける実験を二連で行った。次いで、各データセットを使用して、ｋｏｎ値、ｋｏｆｆ値およびＫ_ｄ値を計算し、本文中に提供される平均±ＳＤ値を得た。

【0029】

【図14】図１４Ａ～１４Ｃ。ヒトＮＰＰにおける線維素溶解に対するＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンの効果の試験からのデータ。

【化2】

【0030】

【図15】図１５Ａ～１５Ｄ。血漿クロット溶解アッセイにおいて使用される種々の濃度でのＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンに関する線維素溶解中点の比較の試験からのデータ。棒グラフが表され、示された濃度のＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンでの線維素溶解中点に達するまでの時間（分）を示す。使用される各インヒビターの濃度は、各パネルに関して示される。全ての実験を、三連で行い、平均±ＳＤ値を示す。注：バーのない^＊は、列挙される全ての他の作用物質からの有意差を表す。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。

【0031】

【図16】図１６Ａ～１６Ｇ。ＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンおよびＥＡＣＡの用量応答分析を図示するトロンボエラストグラムからのデータ。全ての実験は、クエン酸加全血（３００μｌ）、１．５μＭ プラスミンおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含んだ。抗線維素溶解剤を、上記血液に最初に添加し、次いで、これに、１．５μＭ プラスミンおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加した。クロット形成および溶解を、１８０分間モニターした。コントロール実験を、いかなる抗線維素溶解剤もなしに、プラスミンの存在下または非存在下で行った。（Ａ）クロット形成および線維素溶解のプラスミン効果。クエン酸加全血（３００μｌ）に、種々の濃度のプラスミン（０～３μＭ）および１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加した。クロット形成および溶解を、１８０分間モニターした。１．５μＭ プラスミンを使用するクロット形成および線維素溶解に対するＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンの１μＭ（Ｂ）、２μＭ（Ｃ）、３μＭ（Ｄ）、４μＭ（Ｅ）、５μＭ（Ｆ）および７．５μＭ（Ｇ）の効果。（Ｇ）１．５μＭ プラスミンを使用するクロット形成および線維素溶解に対する２００μＭ～３０００μＭ ＥＡＣＡの効果。Ｐｍ、プラスミン；ＮＨＢ、正常ヒト血液。

【0032】

【図17】図１７Ａ～１７Ｆ。種々の濃度のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンおよびＥＡＣＡについてのＴＥＧ実験からの最大振幅（ＭＡ）の比較の試験からのデータ。棒グラフは、種々の濃度のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンおよびＥＡＣＡ－Ａ、１μＭ；Ｂ、２μＭ， Ｃ、３μＭ；Ｄ、５μＭ Ｄ、Ｅ、７．５μＭおよびＦ、ＥＡＣＡで達成されたＭＡを表す。全ての実験を、二連で行い、平均±ＳＤ値を表す。注：バーのない^＊は、列挙される全ての他の作用物質からの有意差を表す。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。

【0033】

【図18】図１８Ａ～１８Ｆ。種々の濃度のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンおよびＥＡＣＡについての剪断弾性率強度（Ｇ、ＴＥＧ実験）の比較の試験からのデータ。棒グラフは、種々の濃度のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンおよびＥＡＣＡ－Ａ、１μＭ；Ｂ、２μＭ， Ｃ、３μＭ；Ｄ、５μＭ Ｄ、Ｅ、７．５μＭおよびＦ、ＥＡＣＡで達成された「Ｇ」を表す。全ての実験を、二連で行い、平均±ＳＤ値を表す。注：バーのない^＊は、列挙される全ての他の作用物質からの有意差を表す。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。

【0034】

【図19】図１９Ａ～１９Ｄ。種々の濃度のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびアプロチニンについてのＬＹ６０％（ＴＥＧ実験）の比較の試験からのデータ。６０分間でのパーセント溶解を示す棒グラフを示す。全ての実験を、二連で行い、平均±ＳＤ値を表す。注：バーのない^＊は、列挙される全ての他の作用物質からの有意差を表す。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。

【0035】

【図20】図２０。ＫＤ１ＴＭの用量応答分析を図示するトロンボエラストグラム。全ての実験は、クエン酸加全血（３００μＬ）、０．１５μＭ トロンビンおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含んだ。ＫＤ１ＴＭを上記血液に先ず添加し、次いで、これに０．１５μＭ トロンビン、２ｎＭ ｔＰＡおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２を添加した。クロット形成および溶解を、１８０分間モニターした。コントロール実験を、ＫＤ１ＴＭなしに、２ｎＭ ｔＰＡの存在下または非存在下で行った（曲線１および曲線２）。０．１５μＭ α－トロンビンおよび２ｎＭ ｔＰＡでのクロット形成および線維素溶解に対するＫＤ１ＴＭ効果（曲線３、２μＭおよび曲線４、４μＭ）。

【発明を実施するための形態】

【0036】

発明の詳細な説明
実施形態の説明において、その一部を形成しかつ本発明が実施され得る具体的実施形態の例証によって示される添付の図面に対して言及がなされ得る。他の実施形態が利用され得、構造的変更が本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは、理解されるべきである。別段定義されなければ、本明細書で使用される技術、表記法および他の化学的用語または用語法の全ての用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明瞭性のためにおよび／または容易な参照のために本明細書で定義され、本明細書中でのこのような定義の包含は、必ずしも、当該分野で一般に理解されるものを超える実質的違いを表すと解釈されるべきではない。本明細書で記載または言及される技術および手順の局面のうちの多くは、当業者によって十分に理解され、かつ一般に使用される。以下の本文は、本発明の種々の実施形態を考察する。

【0037】

本開示のポリペプチドのような抗線維素溶解剤は、大きな手術手順および外傷（例えば、心臓手術、整形外科手術、肝臓手術、神経外科手術および産科）の間の出血および輸血を低減するにあたって有用である。本明細書で開示されるように、以下の配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）を有するヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）の新たなポリペプチドバリアントが作製され、インビボでの使用のために非常に望ましい薬物動態プロフィールを有することが発見された。本明細書で開示されるこの６０残基のポリペプチドバリアントは、リジン残基を含むＣ末端構造を含むアミノ酸残基の特有の一団を含む。本明細書で開示されるポリペプチドバリアントは、１５位におけるリジンアミノ酸置換を含む３つのアミノ酸変異の群をさらに含む（「ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}」）。驚くべきことに、このＹ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異体は、二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有する６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合に、プラスミンを阻害するにあたって４～５倍さらに強力であることが観察される。驚くべきことに、この６０残基のＹ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異ポリペプチドは、二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有する相当の６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合に、カリクレイン、第ＸＩａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子に対して少なくとも１０倍弱い阻害をさらに示す。従って、本明細書で開示される６０残基のバリアントポリペプチドは、例えば、この技術において類似の阻害性分子（例えば、アプロチニン）と関連するある特定の副作用を同時に回避しながら、プラスミンを強く阻害する能力を含む、非常に所望の薬物動態／材料プロフィールを示す。よって、本明細書で開示される６０残基のバリアントポリペプチドは、認識され、根強く残っておりかつ他者によって解決されていない長年にわたるニーズを満たす。

【0038】

本明細書で開示される発明は、多くの実施形態を有する。本発明の実施形態は、例えば、以下の配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）を含む（またはそれから本質的になる）ポリペプチドを含む組成物を含む。代表的には、このような組成物はまた、さらなる剤、例えば、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、保存剤、張度調整剤、洗浄剤、ヒドロゲル、粘度調整剤、ｐＨ調整剤など）を含む。本発明のこのような実施形態は、例えば：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）によって表される６０アミノ酸のタンパク質配列；および静脈内注射または注入に適した薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物を含む。このような薬学的に受容可能な賦形剤は、その分野で周知であり、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、および他の賦形剤の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． 最新版）に示される。

【0039】

さらに、本明細書で開示されるヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のポリペプチドバリアントは、望ましいかつ予測外の安定性プロフィールをさらに示す。例えば、本発明のある特定の実施形態において、本明細書で開示される６０残基のポリペプチドバリアントは、組成物の中に配置され、ここで上記ポリペプチドのプラスミン阻害定数（Ｋｉ）は、このポリペプチド組成物が、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ カルシウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で少なくとも２日間、４日間または１週間にわたって３７℃においてインキュベートされる場合に、１０％未満（または５％未満）変化する。例えば、以下の実施例２の表７を参照のこと。

【0040】

本発明の実施形態は、パッチまたは圧迫包帯材料などの基材内にさらに配置される本明細書で開示されるポリペプチド組成物を含む。当該分野で公知であるように、このようなパッチまたは圧迫包帯材料は、出血している創傷の止血をもたらすために使用され得る。上記基材は、本発明の文脈において、創傷処置に関して医療分野において従来から使用されるように、医療用圧迫包帯、パッチ、スポンジ、パッド、スワブ、包帯などの任意のタイプを含むことが理解される。上記基材は、例えば、吸収性の織布または不織布のテキスタイル製品の形態にあるように、綿および／またはセルロースベースの材料（ビスコースまたはレーヨン）から作製され得る。この文脈において、本発明の１つのこのような実施形態は、本明細書で開示される６０アミノ酸のポリペプチド（配列番号１に示されるとおり）がパッチ、スポンジ、パッド、スワブ、包帯などのマトリクス内に配置されているパッチ、スポンジ、パッド、スワブ、包帯などである。代表的な実施形態において、上記パッチなどは、インビボでの位置（例えば、傷害部位）に配置されるように設計され、上記６０アミノ酸のポリペプチドは、このポリペプチドがパッチなどのマトリクスから離れて、上記パッチが配置されている部位の周辺組織へと拡散し得るように、上記パッチ内に配置される。例証的なパッチおよび同様の材料および本発明のこのような実施形態とともに使用するために適合され得る方法は、例えば、米国特許公開番号２００２００４９４７１、同第２０１１００７１４９８および同第２０２１００３８７５８（これらの内容は、参考として援用される）に開示される。

【0041】

本発明の別の実施形態は、上記ポリペプチド配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲ ＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを含む組成物である。本明細書で開示される発明の作業実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列：ＡＡＣＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＡＧＧＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号２）を含む。この技術の当業者は、この具体的配列が、ヒトにおいて本明細書で開示されるＫｕｎｉｔｚドメイン１インヒビターポリペプチドを生成するために使用されるコドンを含む一方で、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、上記ポリペプチドを発現するために使用されるシステムに応じて変動し得る（すなわち、細菌、酵母および昆虫細胞では、異なるコドンが使用され得る）ことを理解する。代表的には、このようなポリヌクレオチドは、細胞において上記ポリペプチドを発現するために、１またはこれより多くの調節配列を含むベクターの中に配置される。本発明の実施形態はまた、このようなベクターを含む細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞）を含む。

【0042】

本発明の実施形態はまた、本明細書で開示されるポリペプチドを使用する方法を含む。本発明のこのような実施形態は、例えば、患者における線維素溶解を阻害する方法であって、上記方法は、上記患者に、線維素溶解が阻害されるように、線維素溶解を阻害するために十分な量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明の関連する実施形態は、プラスミンの少なくとも１種の活性を阻害する方法であって、上記方法は、プラスミンと有効量の本明細書で開示されるポリペプチドとを接触させることを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、アプロチニンによって処置可能な状態に関して被験体を処置する方法であって、上記方法は、上記被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、プラスミン活性の阻害の必要性のある被験体を処置するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、手術の必要性のある被験体を処置するための方法であって、上記方法は、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを、手術の前、最中、および／または後に、上記被験体に投与することを包含する方法を含む。本発明の他の例証的な実施形態は、がんまたは前がん状態に罹患した被験体を処置するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明の１つのこのような例証的な実施形態は、がん転移に苦しむ被験体を処置するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。

【0043】

本発明の関連する実施形態は、被験体において出血を阻害するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の本明細書で開示されるポリペプチドを投与することを包含する方法を含む。本発明のある特定の実施形態において、上記出血は、裂傷（例えば、肝臓裂傷）から、手術（例えば、肝移植のような臓器）または外傷外傷性傷害（例えば、外傷性脳傷害、銃創、事故など）から生じる。本発明のこれらの方法の特定のものにおいて、上記ポリペプチドは、６０アミノ酸のポリペプチドが中に配置されたパッチにおいて、インビボでの位置に送達される。この文脈において、本発明の別の実施形態は、被験体において出血を阻害するための方法であって、この方法は、上記６０アミノ酸のポリペプチドが上記パッチマトリクスから離れてかつインビボ環境（例えば、出血している組織）へと拡散し得るように、上記パッチと出血している組織とを接触させることを包含する方法である。例えば、例えば、過剰な出血に苦しんでいる患者を処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の本開示のポリペプチドを、上記患者に投与することを包含する方法が、本明細書で提供される。他の実施形態において、例えば、脳卒中（例えば、急性脳卒中）、脳卒中によって引き起こされる脳虚血、血腫、浮腫、低酸素／無酸素脳傷害または外傷性脳傷害に苦しんでいる患者を処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の本開示のポリペプチドを上記患者に投与することを包含する方法が、本明細書で提供される。

【0044】

本発明の１つの例証的な実施形態は、心臓手術を受けておりかつ血液喪失の低減の必要性のある患者を処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の、以下：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ 配列番号１）によって表される６０アミノ酸のタンパク質配列；および静脈内注射または注入に適した薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物を、手術の前、最中、および／または後に、投与することを包含する方法である。本発明のある特定の実施形態において、上記心臓手術は、心肺バイパス手術である。本発明の別の実施形態は、外傷性出血性ショックにある患者を処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の、（配列番号１）によって表される６０アミノ酸のタンパク質配列；および静脈内注射または注入に適した薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物を、手術の前、最中、および／または後に、投与することを包含する方法である。さらに、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭの強力なプラスミン阻害特性（および抗凝固特性がない）が原因で、上記組成物は、この状態を処置するために過去にどのようにアプロチニンを使用したかに類似する様式で、血友病を予防的に処置するために使用され得る。さらに、本明細書で開示されるポリペプチドは、アプロチニンを超える利点をさらに有する。この中の１つの例では、アプロチニン（これは、ウシ由来である）の使用で起こることが観察されたアナフィラキシー応答が原因で、アプロチニンは、このような治療レジメンにおいて長期間使用され得ない。

【0045】

本発明の実施形態は、本明細書で開示されるヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）の６０アミノ酸のポリペプチドバリアントを投与するための方法を含む。例えば、本発明の実施形態は、治療方法において（例えば、患者においてプラスミンの少なくとも１種の活性を阻害する方法において）、患者体重１ｇに対して約１μｇの上記ポリペプチドバリアントから、患者体重の各グラムに対して上記ポリペプチドバリアントの各グラムに対して約１０μｇの上記ポリペプチドバリアント（例えば、患者体重の各グラムに対して上記ポリペプチドバリアントの各グラムに対して約２～約８μｇの上記ポリペプチドバリアント、患者体重の各グラムに対して上記ポリペプチドバリアントの各グラムに対して約４μｇの上記ポリペプチドバリアントなど）である、この６０アミノ酸のポリペプチドバリアントの用量を投与することを包含する。さらに、本発明の実施形態は、急性および／または慢性の医学的状態を処置するために具体的に設計された投与（ｄｏｓｉｎｇ）／投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）方法を含む。例えば、本発明のある特定の実施形態において、６０アミノ酸のポリペプチドバリアントは、手術／傷害の直後に（例えば、手術／傷害後４８時間未満、２４時間未満、１２時間未満または４時間未満で）上記ポリペプチドバリアントを投与するように選択された方法において使用される。本発明のいくつかの実施形態において、上記６０アミノ酸のポリペプチドバリアントは、手術／傷害後の長期間後に（例えば、手術／傷害後少なくとも２日間、４日間、７日間、１４日間または２１日間）、このポリペプチドバリアントを投与するように選択された方法において使用される。

【0046】

上記ポリペプチドおよび関連する方法の詳細な局面および実施形態は、以下の例において開示される。本発明のさらなる局面および実施形態は、以下の節において考察される。

【0047】

本発明の局面および実施形態
本明細書で開示される発明の文脈において、用語「ポリペプチド」、タンパク質」および「ペプチド」ならびに「糖タンパク質」とは、交換可能に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、ホルミル化、およびシグナル配列の付加または欠失のような改変を排除しない。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１またはこれより多くの鎖であって、ここで各鎖が、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸を含み、上記ポリペプチドまたはタンパク質が、ペプチド結合によって非共有結合的におよび／または共有結合的に一緒に連結された複数の鎖を含み得、天然のタンパク質、すなわち、天然に存在するおよび具体的には非組換え細胞、または遺伝的に操作されたかもしくは組換え細胞によって生成されるタンパク質の配列を有し、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列の１もしくはこれより多くのアミノ酸の欠失、付加および／もしくは置換を有する分子を含み得るものを意味する。従って、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１つの（「モノマー」といわれる）または複数の（「マルチマー」といわれる）アミノ酸鎖を含み得る。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本開示の免疫調節ポリペプチド、または免疫調節ポリペプチドの１もしくはこれより多くのアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する配列を具体的に包含する。

【0048】

用語「単離された」とは、物質がその本来の環境（例えば、その物質が天然に存在している場合にその天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリペプチドまたは核酸は、単離されていないが、その同じポリペプチドまたは核酸は、その天然のシステムにおいて同時に存在する物質のうちのいくつかまたは全てから分離されていれば、単離されている。このような核酸は、ベクターの一部であり得る、および／またはこのような核酸もしくはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であり得、このようなベクターまたは組成物がその核酸またはポリペプチドにとっての天然の環境の一部ではないという点において、なお単離されている。用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する；それは、コード領域の前および後ろにある領域「リーダーおよびトレーラー」、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間に介在配列（イントロン）を含む。

【0049】

本明細書で言及される用語「単離されたタンパク質」および「単離されたポリペプチド」とは、主題のタンパク質またはポリペプチドが、（１）これが代表的には天然において一緒に見出されるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質またはポリペプチドを含まないこと、（２）同じ供給源に由来する、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質またはポリペプチドを本質的に含まないこと、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されること、（４）上記「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」が天然において関連付けられているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されていること、（５）上記「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」が天然において関連付けられ得るタンパク質またはポリペプチドの一部と（共有結合的または非共有結合的な相互作用によって）関連付けられていないこと、（６）上記「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」が天然において関連付けられていないポリペプチドと（共有結合的または非共有結合的な相互作用によって）作動可能に関連付けられること、あるいは（７）天然に存在しないことを意味する。このような単離されたタンパク質またはポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡによってコードされ得るか、または人工的なペプチドおよびタンパク質合成に関して多くの周知の化学反応のうちのいずれかによる合成起源のものであり得るか、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。ある特定の実施形態において、上記単離されたタンパク質またはポリペプチドは、その使用（治療、診断、予防、研究または他のもの）に干渉するであろう天然の環境において見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。

【0050】

ある特定の実施形態は、本明細書で記載されるプラスミン阻害ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。所望の核酸および／またはポリペプチドの生成のための方法は、当該分野で周知である。例えば、核酸および／またはポリペプチドは、細胞から単離されてもよいし、化学合成によって新規に合成されてもよい。このような核酸またはポリペプチドは、ベクターに導入され得、宿主細胞へと形質転換され得る。宿主細胞は、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または適切な配列を増幅するための必要な補充物または添加物を加えた標準的な栄養培地中で培養され得る。

【0051】

さらに、プラスミン阻害ポリペプチドのコードポリヌクレオチドまたはポリペプチドバリアントは、それぞれ、天然のもの（例えば、野生型、または優勢なもしくは天然に存在するアレル形態）に対して、１もしくはこれより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、バリアントは、Ｎ末端のＬ－アミノ酸がＤ－アミノ酸で置き換えられている分子を含み、ある特定の他の実施形態では、１またはこれより多くの他のアミノ酸（例えば、Ｎ末端に位置していない）が、さらにまたは代わりに、Ｄ－アミノ酸で置き換えられ得る。ある特定の実施形態において、バリアントは、Ｎ末端αアミノ酸がβアミノ酸またはγアミノ酸で置き換えられる分子を含む。バリアントは、好ましくは、プラスミン阻害ポリペプチド配列のまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一部と、少なくとも約７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％または８９％同一性、および好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を示す。パーセント同一性は、上記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドバリアントの配列と、全長のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相当する部分とを比較することによって、容易に決定され得る。配列比較のためのいくつかの技術は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズム（例えば、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５－５６５， １９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９， １９９２））を使用することを含む。デフォルトパラメーターが使用され得る。

【0052】

さらに、本明細書で開示されるプラスミン阻害ポリペプチドバリアントは、さらなる分子または作用物質（例えば、画像化剤、粒子、ポリマー、またはある特定のインビボでの位置へのポリペプチド送達を容易にするものを含む他の作用物質（例えば、抗体、ペプチドなど）に連結され得る。本発明のこのような実施形態は、さらなる分子または作用物質に連結される配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）を含む（またはそれから本質的になる）ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のポリペプチドバリアントを含む。この中の１つの例において、本発明の実施形態は、ＣＮＳへのポリペプチド送達を容易にするために、この様式で改変され得る（例えば、Ｂｅｈｚａｄら， （２０１９）， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， １６：６， ５８３－６０５；Ｓａｌａｍｅｈら， Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１４；７１：２７７－９９；および米国特許公開番号２０２００２３０２１８、同第２００６０１８９５１５、同第２０１５０１７４２６７および同第２０１６０２１３７６０（これらの内容は、参考として援用される）を参照のこと）。

【0053】

用語「作動可能に連結される」とは、この用語が適用される構成成分が、これら構成成分が適切な条件下でそれらの本質的な機能を行うことを可能にする関係性にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、そのタンパク質コード配列の発現が、上記制御配列の転写活性と適合する条件下で達成されるように、そのタンパク質コード配列にライゲーションされる。

【0054】

用語「制御配列」とは、本明細書で使用される場合、これらがライゲーションされるかまたは作動可能に連結されるコード配列の発現、プロセシングまたは細胞内局在化に影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物のための転写制御配列としては、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられ得る。他の特定の実施形態において、真核生物のための転写制御配列としては、転写因子のための１または複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列およびポリアデニル化配列が挙げられ得る。ある特定の実施形態において、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列が挙げられ得る。

【0055】

用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で言及される場合、１本鎖または２本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかのタイプの改変された形態であり得る。このような改変としては、塩基改変（例えば、ブロモウリジン）、リボース改変（例えば、アラビノシドおよび２’，３’－ジデオキシリボース）およびヌクレオチド間結合改変（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデート）が挙げられ得る。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的には、ＤＮＡの１本鎖形態および２本鎖形態を含む。

【0056】

用語「天然に存在するヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「改変されたヌクレオチド」とは、改変または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチド連結（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、オリゴヌクレオチド連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラダート、ホスホロアミデートなど）を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら， １９８６， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：９０８１；Ｓｔｅｃら， １９８４， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら， １９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６：３２０９；Ｚｏｎら， １９９１， Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ６：５３９；Ｚｏｎら， １９９１， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ． ８７－１０８ （Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，編）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら， 米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ， １９９０， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０：５４３（これらの開示は、任意の目的のために本明細書によって参考として援用される）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの検出またはそのハイブリダイゼーションを可能にするために、検出可能な標識を含み得る。

【0057】

用語「ベクター」とは、宿主細胞にコード情報を移入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）に言及するために使用される。用語「発現ベクター」とは、宿主細胞の形質転換に適し、挿入された異種核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現は、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在すれば）のようなプロセスを含むが、これらに限定されない。

【0058】

当業者によって理解されるように、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外のプラスミドにコードされた配列およびより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。これらは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するかまたは発現するように適合させることができる。このようなセグメントは、当然のことながら単離されてもよいし、当業者によって合成して改変されていてもよい。

【0059】

同様に当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または２本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これは、イントロンを含み、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する）およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、本開示に従うポリヌクレオチド内に存在し得るが、必要ではなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材に連結され得るが、必要ではない。ポリヌクレオチドは、天然の配列を含んでいてもよいし、このような配列のバリアントまたは誘導体をコードする配列を含んでいてもよい。

【0060】

従って、これらおよび関連の実施形態によれば、本開示はまた、本明細書で記載されるプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態において、本明細書で記載されるとおりのプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のうちのいくらかまたは全てを含むポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドの相補体が提供される。

【0061】

他の関連する実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書で記載されるプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と実質的な同一性を有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される方法（例えば、以下で記載されるように、標準的パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、参照ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書で開示されるアミノ酸配列を有するプラスミン阻害ポリペプチドをコードする配列）と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％もしくはこれより高い配列同一性を含むポリヌクレオチドであり得る。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置を考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の相当する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認識する。

【0062】

代表的には、ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは上記バリアントポリヌクレオチドによってコードされるプラスミン阻害ポリペプチドのプラスミンに対する結合親和性が、本明細書で具体的に示されるアミノ酸配列を有するプラスミン阻害ポリペプチドの該結合親和性に対して実質的に減少しないように、１またはこれより多くの置換、付加、欠失および／または挿入を含む。

【0063】

ある特定の関連する実施形態によれば、本明細書で記載されるとおりの１またはこれより多くの構築物を含む組換え宿主細胞；プラスミン阻害ポリペプチドまたはそのバリアントをコードする核酸；およびそのコードされた生成物を生成する方法であって、上記方法は、その生成物のためのコード核酸からの発現を含む方法が、提供される。発現は、便利なことには、適切な条件下で、上記核酸を含む組換え宿主細胞を培養することによって達成され得る。発現による生成後に、プラスミン阻害ポリペプチドが任意の適切な技術を使用して単離および／または精製され得、次いで、所望されるとおりに使用され得る。

【0064】

クローニングおよび種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドの発現のためのシステムは、周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞および多くの他のものが挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

【0065】

Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞でのペプチドの発現は、当該分野で十分に確立されている。総説に関しては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５－５５１ （１９９１）を参照のこと。培養での真核生物における発現はまた、組換えポリペプチドの生成のための選択肢として当業者に利用可能である。近年の総説、例えば、参考文献 （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ４：５７３－５７６；Ｔｒｉｌｌら （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３－５６０を参照のこと。酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるペプチドの発現はまた、当該分野で周知である（例えば、米国特許公開番号２０１８０１４２０３８、同第２０１９０２４１６４５および同第２０１９０１１９６９２を参照のこと）。

【0066】

適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な場合には他の配列を含む）を含む適切なベクターが、選択または構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、または適切な場合にはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第２版， Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作のための多くの公知の技術およびプロトコール、ならびにタンパク質の分析は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２、またはその後の最新版に詳細に記載される。

【0067】

用語「宿主細胞」は、本明細書で記載される免疫調節ポリペプチドのうちの１またはこれより多くのものをコードする核酸配列が導入されたか、または導入することが可能な、かつ目的の選択された遺伝子（例えば、任意の本明細書で記載されるプラスミン阻害ポリペプチドをコードする遺伝子）をさらに発現するかまたは発現することが可能な細胞に言及するために使用される。上記用語は、親細胞の子孫であって、その子孫が、その元の親と形態または遺伝的構成において同一であろうとなかろうと、その選択された遺伝子が存在している限りにおいて、その親細胞の子孫を含む。よって、このような核酸を宿主細胞に導入することを包含する方法がまた、企図される。導入は、任意の利用可能な技術を使用し得る。真核生物細胞に関しては、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス（例えば、ワクシニア）を使用する形質導入、または昆虫細胞に関しては、バキュロウイルスが挙げられ得る。細菌細胞に関しては、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられ得る。上記導入は、上記核酸からの発現を引き起こすかもしくは可能にすることによって、例えば、宿主細胞を、上記遺伝子の発現のための条件下で培養することによって、追跡され得る。１つの実施形態において、上記核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）へと組み込まれる。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることによって促進され得る。

【0068】

本発明はまた、ある特定の実施形態において、特定のポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるとおりのプラスミン阻害ポリペプチド）を発現するために、発現システムにおいて上述のとおりの構築物を使用することを包含する方法を提供する。用語「形質導入」は、一方の細菌からもう一方の細菌への、通常は、ファージによる遺伝子の移入に言及するために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の達成および移入に言及する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来のまたは外因性のＤＮＡの取り込みに言及するために使用され、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞膜の中に導入されている場合に「トランスフェクトされ」ている。多くのトランスフェクション技術が当該分野で周知であり、本明細書で開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら， １９８６， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；ａｎｄ Ｃｈｕら， １９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術は、１またはこれより多くの外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞へと導入するために使用され得る。

【0069】

用語「形質転換」とは、本明細書で使用される場合、細胞の遺伝的特性の変化に言及し、細胞は、新たなＤＮＡを含むように改変されている場合に形質転換されている。例えば、細胞は、その天然の状態から遺伝的に改変されている場合に形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入後に、その形質転換するＤＮＡは、細胞の染色体へと物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組換わっていてもよいし、複製されることなくエピソームエレメントとして一過性に維持されてもよいし、プラスミドとして独立して複製してもよい。細胞は、上記ＤＮＡが細胞の分裂に伴って複製される場合に安定して形質転換されているとみなされる。用語「天然に存在する」または「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」とは、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料に関連して使用される場合、天然に見出されかつヒトによって操作されていない材料に言及する。同様に、「天然に存在しない」または「非天然の（ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ）」とは、本明細書で使用される場合、天然において見出されないか、またはヒトによって構造的に改変されているかもしくは合成されている材料に言及する。

【0070】

本発明はまた、ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるプラスミン阻害ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。１つの実施形態において、上記医薬組成物は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与される場合、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤中に、およびプラスミンの少なくとも１種の活性を阻害するために有効な量でプラスミン阻害ポリペプチドを含む。他の実施形態において、上記医薬組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤中に、およびプラスミン活性の阻害の必要性のある被験体を処置するために有効な量で、例えば、上記被験体に、有効量の本明細書で開示されるプラスミン阻害ポリペプチドを投与することを包含する方法において、プラスミン阻害ポリペプチドを含む。

【0071】

プラスミンの阻害の必要性に関する疾患、障害、および処置の例としては、手術、外傷性傷害（例えば、外傷性脳傷害）、ならびに他の状態および状況（例えば、腫瘍形成、血管新生、骨のリモデリング、血友病、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。他の文脈において出血を制御するための、例えば、抗線維素溶解組成物としておよびプラスミン過量、あるいはｔＰＡ、またはプラスミンもしくは他の関連プロテアーゼの活性を直接的にもしくは間接的に促進し得る他の血液学的に活性な物質の過量に対する解毒薬として、本明細書で記載されるプラスミン阻害ポリペプチドを含む医薬組成物の使用がまた、企図される。

【0072】

純粋形態または適切な医薬組成物でのプラスミン阻害ポリペプチドの投与は、類似の有用性に役立つための薬剤の許容された投与様式のうちのいずれかを介して行われ得る。上記医薬組成物は、プラスミン阻害ポリペプチドと、適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを組み合わせることによって調製され得、固体、半固体、液体もしくは気体形態（例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤・散剤（powder）、粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア剤、およびエアロゾル剤）にある調製物へと製剤化され得る。このような医薬組成物を投与する代表的な経路としては、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、直腸、膣、鼻内、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、舌下、皮下、筋肉内、直腸、経頬、鼻内、リポソーム、吸入を介して、眼内、カテーテルを介して（例えば、血管形成術におけるように）、局所送達を介して、皮下、脂肪内、関節内または髄腔内が挙げられるが、これらに限定されない。用語、非経口とは、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射または注入技術を含む。医薬組成物は、その中に含まれる有効成分が患者への上記組成物の投与の際に生体利用可能であることを可能にするように製剤化される。被験体または患者に投与される組成物は、１またはこれより多くの投与単位の形態をとり、ここで例えば、錠剤は、単一投与単位であり得、エアロゾルの形態にある本発明の化合物の容器は、複数の投与単位を保持し得る。このような剤形の実際の調製方法は、当業者に公知であり、または明らかである；例えば、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， 第２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００）を参照のこと。投与されるべき組成物は、いずれにしても、本教示に従って目的の疾患または状態の処置のための治療上有効な量のプラスミン阻害ポリペプチドを含む。

【0073】

本明細書で有用な医薬組成物はまた、それ自体が上記組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品を含む薬学的に受容可能なキャリア（任意の適切な希釈剤または賦形剤を含む）を含む。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどのような液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、および他の賦形剤の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． 最新版）に示される。

【0074】

上記医薬組成物は、液体、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁剤の形態にあり得る。上記液体は、２つの例としては、経口投与のためのまたは注射による送達のためのものであり得る。経口投与に関して意図される場合、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味剤、保存剤、色素／着色料および香味増強剤のうちの１またはこれより多くのものを含む。注射によって投与されることが意図される組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、バッファー、安定化剤および等張剤のうちの１またはこれより多くのものが、含まれ得る。

【0075】

上記液体の医薬組成物は、それらが液剤、懸濁剤または他の同様の形態であろうが、以下の補助剤のうちの１またはこれより多くのものを含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、塩類溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油（例えば、溶媒または懸濁媒体として働き得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリド）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒）；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；バッファー（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）および等張性の調整のための剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入され得る。生理食塩水は、好ましい補助剤である。注射用の医薬組成物は、好ましくは無菌である。

【0076】

非経口または他の投与のいずれかのために意図された液体の医薬組成物は、適切な投与量が得られるように、プラスミン阻害ポリペプチドのある量を含むべきである。代表的には、この量は、上記組成物中のプラスミン阻害ポリペプチドのうちの少なくとも０．０１％である。この量は、上記組成物の重量の０．１～約７０％の間であるように変動され得る。本発明に従うある特定の例証的な医薬組成物および調製物は、非経口投与単位が０．０１～１０重量％の間のプラスミン阻害ポリペプチドを含むように調製される。

【0077】

上記プラスミン阻害ポリペプチドは、治療上有効な量で投与され、その量は、特異的ポリペプチドの活性；プラスミン阻害ポリペプチドの代謝安定性および作用の長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事；投与の様式および時間；排泄速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または状態の重篤度；ならびに治療を受けている被験体を含む種々の要因に応じて変動する。一般に、治療上有効な日用量は、（７０Ｋｇの哺乳動物につき）約１ｍｇ／Ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）～約１０ｍｇ／Ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）である；好ましくは、治療上有効な用量は、（７０Ｋｇの哺乳動物につき）約２ｍｇ／Ｋｇ～約８ｍｇ／Ｋｇである；より好ましくは、治療上有効な用量は、約４ｍｇ／Ｋｇである。

【0078】

本明細書で提供される有効な用量の範囲は、限定であることを意図されるのではなく、好ましい用量範囲を表す。しかし、最も好ましい投与量は、関連分野の当業者によって理解および決定可能であるように、個々の被験体に合わせて調整される（例えば、Ｂｅｒｋｏｗｅｔら，編， Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ， 第１６版， Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， １９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら，編， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第１０版， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｌｍｓｆｏｒｄ， Ｎ．Ｙ．， （２００１）；Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第３版， ＡＤＩＳ Ｐｒｅｓｓ， ＬＴＤ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ． （１９８７）， Ｅｂａｄｉ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｌｉｔｔｌｅ， Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｂｏｓｔｏｎ， （１９８５）；Ｏｓｏｌｃｉら，編， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （１９９０）；Ｋａｔｚｕｎｇ， Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎ． （１９９２））を参照のこと。

【0079】

各処置のために必要とされる合計用量は、所望であれば、１日、または１週間もしくは１ヶ月の過程にわたって複数用量によってまたは単一用量で投与され得る。概して、処置は、プラスミン阻害ポリペプチドの最適用量未満である、より小さな投与量で開始される。その後、上記投与量を、その環境下での最適な効果に達するまで少しずつ増加させる。上記プラスミン阻害ポリペプチドは、単独で、あるいは他の診断剤および／または病態に対する、もしくはその病態の他の症状に対する他の医薬と併せて投与され得る。上記プラスミン阻害ポリペプチドの投与のレシピエントは、任意の脊椎動物（例えば、哺乳動物）であり得る。哺乳動物の中で、好ましいレシピエントは、以下の目の哺乳動物である：霊長目（ヒト、類人猿およびサルを含む）、偶蹄目（ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む）、齧歯目（マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む）、および食肉目（ネコ、およびイヌを含む）。鳥類の中では、好ましいレシピエントは、シチメンチョウ、ニワトリおよび同じ目のうちの他のメンバーである。最も好ましいレシピエントは、ヒトである。

【0080】

上記医薬組成物は、パッチのようなマトリクス中に配置されるように製剤化され得る。これは、上記プラスミン阻害ポリペプチドが、その後上記マトリクス／パッチから、およびインビボ環境へと放出されるように、インビボで配置され得る。このような組成物は、例えば、裏材、活性化合物レザバ、制御膜、ライナーおよび接触型接着剤を含み得る。経皮パッチは、所望されるとおりの本発明のプラスミン阻害ポリペプチドの連続的な拍動性のまたは要求に応じた送達を提供するために使用され得る。例証的なパッチ材料および本発明のこのような実施形態とともに使用するために適合させることができる方法は、例えば、米国特許公開番号２００２００４９４７１、同第２０１１００７１４９８および同第２０２１００３８７５８において開示される。

【0081】

上記プラスミン阻害ポリペプチドは、当該分野で公知の手順を使用することによって、患者への投与後に有効成分の迅速な放出、徐放または遅延された放出を提供するように製剤化され得る。放出制御薬物送達システムは、ポリマーコーティングされたレザバまたは薬物－ポリマーマトリクス製剤を含む浸透圧ポンプシステムおよび溶解システム（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ）を含む。放出制御システムの例は、米国特許第３，８４５，７７０号および同第４，３２６，５２５号、ならびにＰ． Ｊ． Ｋｕｚｍａら， Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ２２ （６）：５４３－５５１（１９９７）（これらは全て、本明細書に参考として援用される）に示される。

【0082】

最も適した経路は、処置されている状態の性質および重篤度に依存する。当業者はまた、投与方法（例えば、経口、静脈内、吸入、皮下、直腸など）、剤形、適切な薬学的賦形剤およびプラスミン活性の阻害の必要性のある被験体への上記プラスミン阻害ポリペプチドの送達に関連する他の事項の決定に精通している。

【0083】

種々の企図される実施形態によれば、プラスミン活性の阻害の必要性のある被験体は、がん（例えば、肺、乳房、前立腺もしくは結腸がん、または別のがんのような固形腫瘍）、血友病、関節リウマチもしくは全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を有していても、有するリスクにあると疑われてもよいし、あるいは上記被験体は、血管新生、骨のリモデリングまたは冠状動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）を受ける必要性があってもよいし、受けたことがあってもよい。上記被験体は、手術を受けている最中であってもよいし、最近（例えば、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間もしくは２４時間以内に、または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日もしくは１０日以内に）手術（例えば、心臓血管手術、腫瘍手術、泌尿生殖器手術、形成外科手術、胸部手術、形成外科手術、外傷手術、腹部手術、移植手術、神経手術または耳鼻咽喉手術）を受けたことがあってもよい。

【0084】

関連分野の当業者は、本明細書で記載される医薬組成物の投与を適合させ得る任意の数の診断上の、外科上のおよび他の臨床上の基準に精通している。例えば、Ｈｕｍａｒら， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００６， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｋｕｏら， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００４ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｇｒｕｅｓｓｎｅｒら， Ｌｉｖｉｎｇ Ｄｏｎｏｒ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００７ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；Ａｎｔｉｎら， Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００９ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｗｉｎｇａｒｄら （Ｅｄ．）， Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ， ２００９ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ；Ｓａｂｉｓｔｏｎ， Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ， ２０１２ Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＆ Ｃｏ．；Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ， Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ’ｓ Ｓｕｒｇｅｒｙ， ２０１０ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ， ２００９ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ；Ｌａｗｒｅｎｃｅ， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２０１２ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと。

【0085】

上記本文の参考文献
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【実施例】

【0086】

実施例１：ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２ドメイン１のプラスミン特異的Ｋｕｎｉｔｚ－インヒビター（Ｃ末端のＩＥＫを有する６０残基のＹ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ二重変異体）の増強された抗線維素溶解有効性
現在の抗線維素溶解剤は、プラスミン活性部位を阻害することによって（例えば、アプロチニン）またはプラスミノゲン／組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）がフィブリンクロットに結合することを防止することによって（例えば、ε－アミノカプロン酸およびトラネキサム酸）、血液喪失を低減する；しかし、それらは、有害な副作用を有する。ここで、本発明者らは、プラスミンおよびプラスミノゲン活性化を阻害し得るヒト組織因子経路インヒビタータイプ２の６０残基のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）変異体を発現させた。単一（ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ）および二重変異体（ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいてＨｉｓタグ化構築物（各々、エンテロキナーゼ切断部位を有する）として発現させた。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいても発現させた。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、アプロチニンに匹敵してプラスミンを阻害し、プラスミノゲン／プラスミンおよびｔＰＡのクリングルドメインに、それぞれ、約５０ｎＭおよび約３５ｎＭのＫ_ｄで結合する。重要なことには、アプロチニンと比較して、上記ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、カリクレインを阻害しない。さらに、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの抗線維素溶解潜在能は、血漿クロット溶解アッセイにおいてＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔより良好であり、アプロチニンに類似である。トロンボエラストグラフィー実験において、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、用量依存性様式において線維素溶解を阻害し、より高濃度においてアプロチニンに匹敵する。さらに、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、初代ヒト内皮細胞または線維芽細胞において細胞傷害を誘導しない。本発明者らは、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔが、プラスミンの最も強力な公知のインヒビターであるアプロチニンに匹敵し、Ｐｉｃｈｉａを使用して大量に生成され得ることを結論づける。

【0087】

１．緒言
重度の外傷においておよび大手術（例えば、心臓手術）の手順の間に、線維素溶解系は、過剰に活性化され、大量出血を生じる（１～３）。過剰な出血は、戦場、事故および病院の状況において重大な死亡リスクおよびコストをもたらす。制御されない出血は、外傷において防止可能な死亡の原因第１位であり、しばしば、手術中に大量輸血の必要性を引き起こす（４，５）。線維素溶解薬は、線維素溶解を阻害することによって、およびそれによってフィブリン分解生成物を阻害することによって、輸血の必要条件を低減する（６，７）。アプロチニン（ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ＢＰＴＩ）は、プラスミン活性部位の強力なインヒビターであり、心臓手術および四肢外傷の間の血液喪失を低減するための有力な抗線維素溶解剤であった（８）。しかし、その使用は、重篤な副作用（例えば、腎臓損傷、心筋梗塞、および脳卒中）に関連付けられた（９～１０）。さらに、アプロチニンは、ウシ由来のものであるので、そのアナフィラキシーの可能性が大きな懸念事項である（１１）。これらの理由から、アプロチニンは、２００８年に臨床市場から一時的に除去された（１２）。現在承認されている治療剤であるトラネキサム酸（ＴＸＡ）およびε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は、リジンアナログであり、これらは、フィブリンクロットへのプラスミノゲンおよび組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の結合を防止する（１３，１４）。結果として、プラスミノゲンからプラスミンへの局所的な活性化が妨げられ、線維素溶解が防止される。しかし、ＥＡＣＡおよびＴＸＡは、血液喪失を低減するにあたってアプロチニンほど有効ではない（１５）。さらに、アプロチニンのように、それらはまた、腎不全を引き起こし（１６）、近年の証拠から、ＴＸＡが、およびより低い程度にはＥＡＣＡが、発作の重大な発生率と関連することが示される（１６，１７）。従って、アプロチニンおよびリジンアナログの有害作用を欠いている改善された抗線維素溶解剤が、必要とされる。

【0088】

いくつかの活性部位プラスミンインヒビターが文献において報告されている（１８～２５）が、それらの大部分の開発段階は、未知である。Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎ－１（Ｑ８００８）、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓに由来するＫｕｎｉｔｚドメインプラスミン活性部位インヒビター（１９，２６）は、前臨床開発段階にある。Ｑ８００８は、アプロチニンより１０～１５倍弱い親和性でプラスミンを阻害するが、それは、カリクレインもわずかに阻害する（１９，２６）。マウス尾部出血モデルでは、Ｑ８００８は、血液喪失を低減するにあたってアプロチニンと同程度有効であることが報告された（２６）。しかし、Ｑ８００８は、ヘビ毒に由来することから、アプロチニンに関して観察されるものと同様に、ヒトにおいてアナフィラキシー応答を引き起こし得る。さらに、ヒマワリトリプシンインヒビター－１の足場を使用して、０．０５ｎＭ Ｋｉを有するプラスミンの非常に強力な環状ペプチド活性部位インヒビターが設計され、薬物開発の候補であることが提唱されている（２５）。さらに、周術期出血を低減することが提唱されたアロステリック合成線維素溶解インヒビターが存在するが、それらは、非常に早期の開発段階にある（２７，２８）。さらに、非常に強力なプラスミンインヒビター（ＤＸ－１０００）は、抗線維素溶解剤としての代わりに、行腫瘍剤として開発されている（２９）。

【0089】

顕著なことには、アプロチニンが２００８年に禁止されたとき、薬理学的薬剤、エカランチド（ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ）（ＤＸ－８８）（これは、カリクレインおよびプラスミンの両方を阻害する）を、臨床評価した（３０）。この試験は、エカランチドアームにおいて観察された死亡率の増加に起因して早々に終了した。別の薬剤、ＭＤＣＯ２０１０（これは、プラスミン、第Ｘａ因子（Ｆ）、ＦＸＩａおよび活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を阻害する）をまた、臨床評価した（３１）。この試験は、処置群において重篤な有害事象の数の増加に起因して、同様に早々に終了した。安全性の問題の原因およびその薬物使用に対する潜在的な関連は、さらに調査中である。

【0090】

本実施例では、本発明者らは、抗線維素溶解剤（これは、アプロチニンに匹敵する効力でプラスミンを阻害するが、カリクレインの非常に弱いインヒビターである）を記載する。上記薬剤を、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２（ＴＦＰＩ－２）のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）を足場として使用して設計した。新たな６０残基のプラスミンインヒビター、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、Ｃ末端ＩＥＫＶＰＫを有する先の異種単一変異体ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ（ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨと称される）と比較して、異なるＣ末端リジンで１個のさらなる変異（ＩＥＫ_Ｔ）を有する（３２）。上記ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、現在の単一変異体ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔより良好にプラスミンを阻害し、プラスミンに加えて、それはまた、プラスミノゲンおよびｔＰＡのクリングルドメインに、３５～５０ｎＭの解離定数で結合する。アプロチニン（３３）の最低のＨａｍｍｅｒｓｍｉｔｈレジメンである血漿中２μＭの治療用量において、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、従って、プラスミン活性部位を阻害することによって、ならびにフィブリンクロットへのプラスミノゲンおよびｔＰＡの結合を遮断することによって線維素溶解を効果的に阻害することが予測される。従って、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、臨床状況においてアプロチニンに置き換わる有望な候補であるようである。アプロチニンとＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔとを比較する実験の詳細は、本明細書で示される。さらに、モデル化を使用して、Ｔｙｒ１１からＴｈｒの変異およびＴＦＰＩ－２ ＫＤ１インヒビター足場におけるＣ末端のＩＥＫの効果を評価した。上記変異体の増強された抗線維素溶解活性を詳述するためにこのようなモデル化から獲得した構造的情報が、考察される。

【0091】

２． 実験の節
２．１． 材料
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＬｙｓＳおよびｐＥＴ２８ａ発現ベクターを、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から得た。Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターデバイス（３０００ Ｍｒカットオフ）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）から購入した。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、およびＨｉｓ－Ｔｒａｐ ＨＰカラムを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から得た。ＴＸＡ、ＥＡＣＡ、カナマイシンおよびイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から得た。Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ ＡｓｓａｙキットおよびＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキットを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から得た。精製ヒトＦＸＩａ、トロンビン（ＩＩａ）およびプラスミンを、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ， ＶＴ）から購入した。血漿カリクレイン（ｐＫＬＫ）を、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ， ＩＮ）から得た。アルテプラーゼ（ｔＰＡ）を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）から購入した。組換えエンテロキナーゼを、Ｎｏｖｏｇｅｎ， ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）から得た。プールされた正常血漿（ＮＰＰ）を、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．（Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ， Ｋａｎｓａｓ）から購入した。δプラスミン（プロテアーゼドメインおよび第１のクリングルドメインを含む組換えプラスミン）を、Ｖｉｃｔｏｒ Ｍａｒｄｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）から得た。タキソールは、Ｚｈｅｎｆｅｎｇ Ｄｕａｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）から快く提供された。アプロチニン（ＢＰＴＩ）は、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）から受容し、ヒト第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）を、以前に記載されるように調製した（３４）。可溶性組織因子（ｓＴＦ、残基１～２１９）を、Ｔｏｍ Ｇｉｒａｒｄ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から得た。プラスミン基質Ｓ－２２５１（Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ｐ－ニトロアニリド）、ｐＫＬＫ、およびＦＸＩａ基質Ｓ－２３６６（ピロＧｌｕ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリド）、およびＦＶＩＩａ基質Ｓ－２２８８（Ｈ－ＤＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリド）を、Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＯＨ）から得た。新鮮な正常ヒトクエン酸加血液を、Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｍａｈａ）から購入した。部分トロンボプラスチン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、各血液ドナーについて正常であった。

【0092】

２．２． Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの発現および精製
ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＣ末端ＩＥＫを有するＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴのｃＤＮＡ配列をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳにおいてＴ７プロモーターシステムを使用して、アミノ末端Ｈｉｓ６タグ化融合タンパク質として過剰発現させた。ｐＥＴ２８ａに由来し、Ｈｉｓ６リーダー配列、続いて、エンテロキナーゼ切断部位、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴまたはＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴをコードするｃＤＮＡを含む組換えプラスミドは、標準的手順に従って調製した（３５）。発現される構築物の配列を、図１０に示す。上記Ｈｉｓ６タグ化ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、１５ｍｇ／リットルのカナマイシンを含むＬｕｒｉａブロス中で成長させ、対数増殖期中期（Ａ６００ 約０．９）に１ｍＭ ＩＰＴＧで３７℃で５～６時間誘導したＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。上記Ｈｉｓ６タグ化ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、ニッケル負荷（ｎｉｃｋｅｌ－ｃｈａｒｇｅｄ）Ｈｉｓ－Ｔｒａｐカラムを使用して封入体から精製した。上記Ｈｉｓ－Ｔｒａｐ精製タンパク質を、還元型および酸化型グルタチオン系を使用して再折りたたみし、以前に記載されたようにＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムを使用してさらに精製した（３２，３６）。

【0093】

２．３． ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔクローン構築およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３および分泌発現ベクターｐＰＩＣＺαＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。アミノ酸配列（図１０）に対応するＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ ｃＤＮＡを、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）が合成した。上記ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、その生成物を線状化して、ｐＰＩＣＺαＡのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位へとサブクローニングした。さらなるベクター増幅を、ＤＨ５αコンピテント細胞において行った。抽出したｃＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーターを用いたエレクトロポレーションを介してＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ－３３へと導入した。形質転換体を、５００μｇ ゼオシン／ｍＬを補充したＹＰＤプレート上にプレーティングした。コロニーを、ＢＭＭ培地中でのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ発現に関してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。発酵接種用振盪フラスコを、緩衝化最小グリセロール培地（ＢＭＧＹ） ｐＨ ６．０を使用して調製した。第１に、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを発現する単一のコロニーを、５０ｍＬへと１２時間にわたって接種し、得られた培養物のうちの０．５ｍＬを、３００ｍＬ ＢＭＧＹ ｐＨ ６．０へと２０時間にわたって移した。次いで、後者を、３Ｌ Ｂａｓａｌ Ｓａｌｔｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＳＭ） ｐＨ ５．０を含む１５Ｌ ＮＬＦ ＢｉｏＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｗａｌｄ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へと接種した。タンパク質発現をメタノールで誘導し、４８時間、３０℃、ｐＨ ５．０および４０％ 溶存酸素において行った。発酵ブロスを、７２００ｒｐｍ、４℃において遠心分離した。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを含む上清を集め、さらに処理するまで－３０℃で貯蔵した。

【0094】

２．４． Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ精製
発酵上清のうちの１００ｍＬを、ｐＨ ８．５へと調整し、室温において１５００ ＲＦＣで５分間遠心分離した。次いで、その上清を集め、ｐＨ ３．０に調整し、０．５ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００と３０分間混合した。尿素を４Ｍの最終濃度まで添加し、２．５時間、室温においてインキュベートした。インキュベーション後、上記溶液を、１２ｍＳの最終導電率へと希釈した。１２０ｃｍ／時間の一定の流速でＢｉｏｃａｄ Ｖｉｓｉｏｎワークステーションを使用して精製を行った。サンプルを、５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ ２．８（洗浄緩衝液）で予め平衡化したＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）カラムに載せた。次いで、そのカラムを、２カラム容積の洗浄緩衝液で洗浄し、タンパク質を、１．０Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ ２．８で溶離した。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを含む画分をプールし、Ｌ－アルギニンを０．５Ｍに、およびマンニトールを７％になるように補充した。室温で１時間インキュベートした後、それを、３．５ｋＤａ ＭＷカットオフ膜透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ． ＮＪ）を使用して、１０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ ８．０に対して透析した。

【0095】

２．５． ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｅ緩衝液システムを使用して行った（３７）。使用したアクリルアミド濃度は１５％であり、ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ色素で染色した。

【0096】

２．６． プロテアーゼ阻害アッセイ
全ての反応を、０．１ｍｇ ウシ血清アルブミン／ｍｌ（ＴＢＳ／ＢＳＡ）および２ｍＭ Ｃａ２＋（ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｃａ２＋， ｐＨ ７．５）を含むＴＢＳ， ｐＨ ７．５（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．５）中で行った。各酵素（プラスミン、ｐＫＬＫ、ＦＸＩａまたはＦＶＩＩａ／ｓＴＦ）を、種々の濃度（１０－１～２×１０３ｎＭ）のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔまたはアプロチニン（ＢＰＴＩ）とともに１時間、室温において９６ウェルマイクロタイタープレート（総容積１００μｌ／ウェル）の中でインキュベートした。次いで、各酵素に適した合成基質（５μｌ）を、最終濃度 １Ｋ_Ｍになるまで添加し、残存アミド分解活性を、Ｖｍａｘキネティックマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。阻害定数Ｋ_ｉ ^＊を、非線形回帰データ分析プログラムＧｒａｆｉｔを使用して決定した。アプロチニン、ＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔのデータを、強結合インヒビターに関する式（式１）で分析した（ここでｖｉおよびｖ０は、それぞれ、阻害率および非阻害率であり、（Ｉ）_０および（Ｅ）_０は、それぞれ、インヒビターおよび酵素の全濃度である（３８，３９））。

【数1】

Ｋ_ｉ値は、式２を使用して、Ｂｅｉｔｈ（３８）に従う基質の効果に関して補正することによって得た（ここで（Ｓ）は、基質濃度であり、Ｋ_Ｍは、各酵素に対して特異的である）。

【数2】

【0097】

２．７． ＤＩＰ－δプラスミンの調製
活性部位を遮断したδプラスミンを、δプラスミンを室温において２０分間、等容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ８．０および１Ｍ ＤＦＰ（最終濃度は１ｍＭ ＤＦＰ）で処理し、続いて、氷上で数時間インキュベートすることによって生成した。さらに等容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ８．０および１Ｍ ＤＦＰ（最終濃度は２ｍＭ）を添加し、その反応物を、室温において２０分間、次いで、一晩４℃においてインキュベートした。ＤＦＰで阻害したδプラスミン（ＤＩＰ－δプラスミン）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５に対して透析し、Ｓ－２２５１合成基質加水分解を使用して残存活性に関してアッセイした。その残存活性に基づくと、δプラスミンのうちの＞９９％が不活化された。ＤＩＰ－δプラスミンは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した場合、タンパク質分解がないことを明らかにした。

【0098】

２．８． 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するｔＰＡおよびＤＩＰ－δプラスミンへのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ結合
結合試験を、２５℃においてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００フローバイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。ＤＩＰ－δプラスミン（ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して約９８％ 純度）またはｔＰＡ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して＞９８％ 純度）を、アミンカップリング化学反応を使用して、カルボキシメチル－デキストランフローセル（ＣＭ５センサーチップ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定した。フローセル表面を、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドの混合物で５分間（流速１０μｌ／分）活性化し、その後、タンパク質（１０ｍＭ 酢酸ナトリウム， ｐＨ ５．５中２０μｇ／ｍｌ）を、表面上に注入した。反応しなかった部位を、１Ｍ エタノールアミンで５分間ブロッキングした。分析物、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ（１００～２０００ｎＭ）を、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ） Ｐ２０）中、１０μｌ／分で６分間、フローセルを通して灌流した。タンパク質なしのＨＢＳ－Ｐ緩衝液に交換した後、分析物解離を、１０分間モニターした。フローセルを、２０ｍＭ ＥＡＣＡを含むＨＢＳ－Ｐで再生した。データを、カップリングしたタンパク質なしのフローセルを通して注入した分析物で得られたシグナルを差し引くことによって、非特異的結合に関して補正した。結合を、１：１結合モデルを使用してＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）で分析した。Ｋ_ｄ値を、導出された解離（ｋ_ｄ）および会合（ｋ_ａ）速度定数の商から計算した。

【0099】

２．９． 線維素溶解（クロット溶解）アッセイ
ＳｐｅｒｚｅｌおよびＨｕｅｔｔｅｒの方法（４０）に、先に概説したとおりの軽微な改変（３２，４１）を加えてそれに従った。簡潔には、ＩＩａを使用して、ＮＰＰにおけるフィブリン形成を開始し、形成されたクロットの溶解（線維素溶解）を、ｔＰＡの同時の添加によって誘導した。クロット形成および溶解を、４０５ｎｍでの光学密度を測定するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０）でモニターした。簡潔には、１０μＬの各試験化合物（ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニン）または食塩水コントロールを、２４０μＬのＮＰＰに添加した。次いで、この混合物のうちの２２５μＬを、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ／ＢＳＡ中の２５μＬ ＩＩａおよびｔＰＡに添加した。２５０μＬ 最終容積中では、ＩＩａの濃度は０．１５μｇ／ｍｌであり、ｔＰＡの濃度は１μｇ／ｍｌであった。対照条件（ゼロｔＰＡおよびゼロ試験化合物）下では、ＯＤ４０５は直ぐに増加した。これは、凝固に続いて、極めて遅い減少が、線維素溶解を表すことを示す。凝固は５分後にほぼ完了したことから、ｔＰＡによって誘導される線維素溶解は、６０分間までＯＤ４０５の相対的減少として評価された。ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、０．５μＭから５μＭまでの最終濃度で試験した一方で、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンを、０．５μＭから３μＭまでの最終濃度で試験した。

【0100】

２．１０． トロンボエラストグラフィー
線維素溶解に対する異なる濃度のＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンまたはＥＡＣＡの効果を、ＴＥＧ ５０００ Ｔｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ， Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ， ＭＡ）を使用して、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）で評価した。各クロット形成／溶解アッセイは、最終容積を３６０μＬにするために、３００μｌのクエン酸加全血；プラスミン（１．５μＭ 最終濃度）、ＣａＣｌ_２（１０ｍＭ 最終濃度）およびリンゲル溶液中の種々の濃度の各抗線維素溶解剤を含んだ。プラスミンおよびＣａＣｌ_２を最後に添加して、同時の凝固および線維素溶解を開始した。１．５μＭ プラスミン濃度を、クロット強度および溶解に対するプラスミン効果に基づいて選択した。各実験を、１８０分間行って、ＬＹ６０値を確立した。トロンボエラストグラフを各日で較正し、各インヒビター濃度を二連で試験した。ＴＥＧ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン４．２．２； Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ， ＭＡ）を使用して、凝固開始までの時間（Ｒ）、最大クロット強度（最大振幅（ＭＡ）（これは、剪断弾性率強度、Ｇに直接関連した））、およびＭＡの６０分間後のパーセント溶解（ＬＹ６０）（４２）を計算した。

【0101】

２．１１． 細胞傷害性アッセイ
２．１１．１． 細胞および培養条件
初代ヒトプール臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＡＴＣＣから得た。その細胞を、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ－ＢＢＥ（ＡＴＣＣ）およびペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ（ＡＴＣＣ）を補充したＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）中で維持した。初代ヒト真皮線維芽細胞を、ＬＯＮＺＡから得、成長因子カクテル、ウシ胎仔血清および抗生物質（ＦＧＭＴＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓＴＭ， ＬＯＮＺＡ）を補充したＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＢＭＴＭ， ＬＯＮＺＡ）中で維持した。全ての細胞を、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃において維持し、それらがいったん８０％コンフルエンスに達した後に継代した。全ての実験を、対数成長期にある細胞で行った。

【0102】

２．１１．２． 抗線維素溶解剤（ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニン、ＥＡＣＡおよびＴＸＡ）
抗線維素溶解剤のストック溶液を、リン酸緩衝液中で調製した。毒性試験のために、細胞を、３，５００ 細胞／ｃｍ２において９６ウェルまたは２４ウェルの細胞培養プレートへと播種し、細胞が８０％コンフルエンスにいったん達してから実験に使用した。細胞を、抗線維素溶解剤で２４時間、以下の濃度－アプロチニンおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは０．１μＭ、１μＭ、１０μＭおよび３０μＭにおいて；ＥＡＣＡは１ｍＭ、５ｍＭ、２０ｍＭ、および６０ｍＭにおいて、ならびにＴＸＡは０．２ｍＭ、２ｍＭ、１０ｍＭおよび３０ｍＭにおいて処理した。

【0103】

２．１１．３． レサズリン還元アッセイ
レサズリン還元アッセイ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、初代ヒト内皮細胞および皮膚線維芽細胞に対する抗線維素溶解剤の潜在的細胞傷害を評価した。サンプルを溶解するために使用したリン酸緩衝液は、陰性コントロールとして含めた。上記アッセイは、生細胞によって高度に蛍光性のレゾルフィンへの非蛍光色素レサズリンの還元に基づく。蛍光シグナルは、非生細胞が上記色素を還元できず、蛍光シグナルを生じないことから、生細胞の数に比例する。簡潔には、９６ウェル細胞培養プレート中の細胞を、異なる濃度の抗線維素溶解化合物で処理した（上で記載されるとおり）。２４時間後に、レサズリン試薬を各ウェルに添加し、プレートを３７℃において４時間インキュベートした。蛍光を、励起波長５４４ｎｍおよび発光波長５９０ｎｍを使用して、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）によって測定した。各アッセイを、各々３個の反復物について二連で行った。生存率を、非処理細胞との比較に基づいて評価した。

【0104】

２．１１．４． カスパーゼ３／７アッセイ
細胞のアポトーシスに対する抗線維素溶解剤の影響を、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して検出した。カスパーゼ３および７を、アポトーシスを受けている細胞において活性化する。上記アッセイは、カスパーゼ３および７のための発光基質を提供する。酵素活性は発光をもたらし、発光は、存在するカスパーゼ活性の量に比例する。細胞を、９６ウェルプレートに播種し、抗線維素溶解剤またはリン酸緩衝液（溶媒コントロール）で処理した。タキソールを陽性コントロールとして含めた。処理の２４時間後に、カスパーゼ試薬を各ウェルに添加し、混合し、１時間、室温においてインキュベートした。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して発光を測定した。

【0105】

２．１１．５． 細胞毒性アッセイ
細胞毒性および細胞死を、ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。このアッセイは、細胞死の結果として起こる膜完全性の変化を測定する。このシステムにおいて使用した色素は、生細胞からは排除されるが、障害された細胞中のＤＮＡに結合し、蛍光シグナルを生じる。本発明者らは、４種の濃度（上で記載されるとおり）において濃度１種につき三連で、２４ウェルプレートにおいて２４時間の曝露後に抗線維素溶解剤で処理したＨＵＶＥＣおよび初代線維芽細胞において細胞死を測定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ての核を染色した。細胞の画像を、倒立顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ； Ｅｄｉｐｓｅ Ｔ２０００ ＴＥ）を使用して捕捉した。緑色蛍光細胞（ＦＩＴＣフィルター）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色細胞（ＤＡＰＩフィルター）を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して計数した。蛍光細胞を、全細胞のパーセンテージとして示した。

【0106】

２．１２． 統計法
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、血漿クロット溶解アッセイにおいて、線維素溶解を阻害するにあたって抗線維素溶解剤（ＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニン）の効果を比較した。任意の２つの手段を比較するためのｐ値を、事後検定を使用して計算し、Ｔｕｋｅｙの調整を使用して多重比較のために調整した。ＴＥＧデータに関しては、ＬｅｖｅｎｅのＦ検定から、等分散性が満たされないことが明らかにされた。よって、ＷｅｌｃｈのＦ検定を使用し、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ事後手順を行って、平均ＭＡおよび平均ＬＹ６０％レベルのどの対が有意に異なるかを決定した。細胞毒性アッセイに関しては、集めたデータセットを、ＡＮＯＶＡによって分析し、個々の群を、スチューデントのｔ検定を使用して比較した。全ての実験を２または３回反復したところ、類似の結果を得た。定量値を、図の凡例に示されるように、平均±標準偏差（ＳＤ）または平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ｐ値が０．０５以下で統計的に有意であるとみなした。全ての統計分析を、ＳＰＳＳ Ｖ２７（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．， Ａｒｍｏｎｋ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して行った。

【0107】

２．１３． 分子モデリング
δ－プラスミン（４３）、プラスミノゲンクリングルドメイン１（１４）および野生型ＫＤ１（３６）の結晶構造をテンプレートとして使用して、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔと、δ－プラスミンとのおよびプラスミンクリングルドメイン１との複合体をモデル化した。これらの複合体をモデル化するためのプロトコールは、以前に記載されている（４１，４４）。Ｃ末端残基は野生型ＫＤ１結晶構造では無秩序であることから、本発明者らは、ＭＯＤＥＬＬＥＲプログラム（４５）を使用して、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ分子のこの部分を構築した。この構築モデルを、ＡＭＢＥＲプログラム（４６）を使用して、１０ ｋｃａｌ．ｍｏｌ^－１．Å^－２のハーモニックな拘束で１０００ステップの最小化に供することによってさらに精密にした。

【0108】

３． 結果
３．１． Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの発現および精製
６０残基のＨｉｓ６タグ化ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、エンテロキナーゼ切断部位とともにＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳにおいて発現させた（図１０）。これらの構築物は、以前に発現されたＣ末端においてＩＥＫＶＰＫを有するＫＤ１－Ｌ１７Ｒ（ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨと称される）と比較した場合、Ｎ末端において９残基短くかつＩＥＫ_Ｔで終わるＣ末端において３残基短い（図１０）（４１）。上記融合タンパク質を再折りたたみし、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムを使用して精製した。その精製ＫＤ１変異体タンパク質を、エンテロキナーゼとともにインキュベートして、Ｈｉｓ６タグを除去した；しかし、切断は、酵素：基質が１：５０比では不成功であった。不成功のＨｉｓ６タグ除去の理由は、アプロチニンによるエンテロキナーゼの阻害に関して記載されるものに類似するＫＤ１変異体によるエンテロキナーゼの阻害に起因し得る（４７）。精製ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ（各々、エンテロキナーゼ切断部位およびＮＨ２末端においてＨｉｓ６タグを含む）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、図１０に示す。

【0109】

３．２． Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの発現および精製
Ｈｉｓ６タグは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現変異体においてエンテロキナーゼによって除去できなかったことから、本発明者らは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して６０残基の二重変異体ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを発現させ、実験の節に記載されるように均一になるまで精製した。およそ５０ｍｇのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、１００ｍｌの培養培地から精製した。精製したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、図１１に示す。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔが、Ｈｉｓ６タグおよびエンテロキナーゼ切断配列を含む対応するＥ．ｃｏｌｉ発現ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔと比較した場合に、わずかにＭＷが低いことに注意すること（図１１）。

【0110】

３．３． ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの阻害プロフィール
ＩＩａ切断部位を含む野生型ＫＤ１（ＫＤ１－ＷＴ）は、プラスミンをＫ_ｉ ６．０±０．５ｎＭで阻害した（３２， 図１２Ａ）。エンテロキナーゼ切断部位を含むＩＥＫ Ｃ末端を有するＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、切断部位を含むＶＰＫ Ｃ末端を有する以前に記載されたＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨに類似して、プラスミンをＫ_ｉ ０．９±０．１ｎＭで阻害した（４１）。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの両方発現ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、アプロチニン（Ｋ_ｉ ０．４９±０．１）と同様の親和性でプラスミンを阻害した（Ｋ_ｉ ０．５９±０．１）（図１２Ａ）。各インヒビターによるプラスミン阻害についてのＫ_ｉ値を、表１に提供する。従って、エンテロキナーゼ切断配列およびＨｉｓ６タグは、阻害活性に影響を及ぼさない。さらに、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨ（３２，４１）に類似して、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ（本実施例）は、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ、ＦＸＩａおよびｐＫＬＫを、Ｋｉ＞３μＭで弱く阻害した（図１２Ｂ）。

【表1】

【0111】

３．４． ＤＩＰ－δプラスミンおよびｔＰＡへのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ結合
本発明者らは、ＳＰＲを使用して、固定したＤＩＰ－δプラスミン（図１３Ａ）およびｔＰＡ（図１３Ｂ）へのＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの結合を試験した。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴへのＤＩＰ－δプラスミンの結合に関するｋ_ｏｎは、１．４９±０．３×１０^３ Ｍ^－１ｓ^－１であった；ｋ_ｏｆｆは、７．１３±０．９×１０^－５ ｓ^－１であり、Ｋ_ｄは、４７．６±７ｎＭであった。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴへのｔＰＡの結合に関するｋ_ｏｎは、２．９１±０．４×１０^３ Ｍ^－１ｓ^－１であった；ｋ_ｏｆｆは、１．０５±０．７×１０^－４ ｓ^－１であり、Ｋ_ｄは、３５．４±５ｎＭであった。

【0112】

３．５． 線維素溶解（クロット溶解）アッセイ
これらの実験を行って、ｔＰＡ誘導性血漿クロット線維素溶解を阻害することにおけるＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、およびアプロチニンの有効性を比較した。ＮＰＰへのＩＩａの添加は、フィブリン形成を引き起こし、これは、ＯＤ４０５の増加によって反映される（曲線ＩＩａ、ゼロｔＰＡ、図１４Ａ～Ｃ）。ｔＰＡを同時に添加すると、最初のクロット形成、続いて、プラスミノゲンからプラスミンへのｔＰＡ媒介性の変換によって誘導されるフィブリンの溶解が引き起こされる（曲線ＩＩａ、ｔＰＡ； 図１４Ａ～Ｃ）；線維素溶解の中点は、線維素溶解インヒビターの非存在下では、各場合において６～７分間の間であった。全３種の薬剤は、線維素溶解を用量依存性様式で阻害した。使用したインヒビターの各濃度での最大ＯＤ４０５、６０分でのＯＤ４０５および線維素溶解中点に達するまでの時間を、表２に提供する。最大ＯＤ４０５は、上記インヒビター間で、および使用したインヒビターの濃度間で異ならなかった。最大ＯＤ４０５は、形成したフィブリンクロットのＩＩａ誘導性強度を反映する、そのフィブリンクロット形成は、その後の溶解がクロット部位においてｔＰＡで生成されたプラスミンによって始まる前に、迅速に達成された。従って、使用した各インヒビターの異なる濃度での最大ＯＤ４０５が類似であることは、予期される。さらに、線維素溶解の程度を示す６０分でのＯＤ４０５は、各インヒビターに関して低濃度において比較的類似であった；しかし、それは、より高濃度においてアプロチニンと比較した場合、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔに関してはより低減され、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔに関しては中程度に低減された（図１４， 表２）。

【0113】

重要なことには、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、線維素溶解中点を、０．５μＭでは約７分から約１０分へ、１μＭでは約１３分へ、１．５μＭでは約１７分へ、３μＭでは約３１分へ、４μＭでは約４３分へ、および５μＭでは約５５分へとそれぞれ増加させた（図１４Ａ， 表２）。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、線維素溶解中点を、０．５μＭでは約７分から約１２分へ、１μＭでは約２８分へ、１．５μＭでは約４３分へ、および２μＭと３μＭでは＞６０分へと、それぞれ増加させた（図１４Ｂ， 表２）。アプロチニンは、線維素溶解の中点を、０．５μＭでは約７分から約１３分へと、１μＭでは約４０分へと、および１．５μＭと＞１．５μＭ濃度では＞６０分へと、それぞれ増加させた（図１４Ｃ， 表２）。累積的に、図１５において表される統計分析は、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔが、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔと比較した場合に、線維素溶解中点を増加させるにあたってより有効であり、アプロチニンは、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔよりわずかに有効であったことを明らかにする。

【0114】

３．６． トロンボエラストグラフィー
トロンボエラストグラフィー実験を行って、ＣａＣｌ_２の添加によって全血で形成されるクロットのプラスミン誘導性溶解に対するＫＤ１－ＷＴ（３１）、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、アプロチニンおよびＥＡＣＡの効果を評価した。これらのデータを、図１６に示し、表３にまとめる。図１６Ａは、ＣａＣｌ_２で開始されたクロット形成に対するプラスミンの種々の濃度でのＴＥＧトレースを示す。プラスミンの非存在下では、達成された平均最大振幅（ＭＡ）は、約４６２０ ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断弾性率強度Ｇで約４７ｍｍであり、６０分間でクロット溶解は検出されなかった（ＬＹ６０＜０．１％）。１．５μＭ プラスミンでは、到達したＭＡは、約４０１ｄｙｎ／ｃｍ２のＧ値で約７ｍｍであり、１００％ クロット溶解が３０分分以内に起こった（表３）。＞１．５μＭ プラスミンでは、クロット形成は観察されなかった。図１６Ｂ～Ｆは、１．５μＭ プラスミンの存在下でのクロット形成および溶解に対するＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンの種々の濃度（１μＭ～７．５μＭ）での平均ＴＥＧのトレースを図示する。そのデータは、試験した全ての抗線維素溶解薬が、クロットの硬さ（ＭＡ）、剪断強度（Ｇ）を改善し、濃度依存性様式で線維素溶解を阻害したことを示す（表３）。顕著なことには、５μＭ（Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈレジメンの高用量に対応し、アプロチニンに関して確立された臨床投与レジメンである）（３３）のインヒビター濃度では、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、クロット強度ＭＡを、約８０％（３７．５ｍｍ）へと、およびＧを約６５％（約３００４ ｄｙｎ／ｃｍ２）へと改善したのに対して、アプロチニンは、ＭＡを約６９％（３２．９ｍｍ）へと、およびＧを約５３％（約２４５３ ｄｙｎ／ｃｍ２）へと改善した。しかし、約１２％のＬＹ６０は、アプロチニンでの０．２％と比較して、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔで観察された。７．５μＭ濃度では、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンの両方が、類似のＭＡ（約８３％および約８０％）およびＧ（約７０％および約６５％）、ならびにＬＹ６０（各々０．２％）を有した。ＥＡＣＡはまた、ＭＡ、ＧおよびＬＹ６０を用量依存性様式で改善した（図１６Ｇ）。しかし、ＥＡＣＡの３ｍＭ濃度（臨床状況において使用した用量）では、それは、ＭＡおよびＧをそれぞれ、約６７％および約５０％まで改善したに過ぎなかった。累積的に、ＴＥＧデータは、ＥＡＣＡが、ＭＡおよびＧを回復させるにあたって、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔまたはアプロチニンほど有効ではないことを示す。さらに、ＫＤ１－ＷＴおよびＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔはまた、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔまたはアプロチニンほど有効ではなかった。重要なことには、より高濃度（≧７．５μＭ）では、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、ＭＡおよびＧを回復させ、ならびにアプロチニンと同様に線維素溶解を阻害した。

【0115】

ＴＥＧ実験においてＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンによる最大振幅（ＭＡ）、剪断弾性率強度（Ｇ）およびＬＹ６０の濃度依存性増強に対して行った多重比較分析を、図１７～１９に示す。１μＭ インヒビター濃度では、ＭＡは、ＫＤ１－ＷＴを除いてコントロールと各Ｋｕｎｉｔｚインヒビター間で有意に異ならなかった（図１７Ａ）。２μＭまたは３μＭのインヒビター濃度では、アプロチニンによるＭＡ増強は、ＫＤ１－ＷＴ、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔと比較した場合に、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図１７Ｂ～Ｃ）。３μＭを上回ると、ＭＡの増強は、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンに関して統計的に異ならなかった；しかし、それはＫＤ１－ＷＴに対しては有意に低かった（図１７Ｄ～Ｅ）。ＥＡＣＡに関しては、スチューデントのｔ検定を行って、コントロールと試験した各ＥＡＣＡ濃度との間でＭＡを比較した（図１７Ｆ）。５００μＭ、１０００μＭまたは３０００μＭ ＥＡＣＡ濃度では、ＭＡ増強は、コントロールと比較した場合に、統計的に有意であった。

【0116】

顕著なことには、３μＭまで、アプロチニンは、ＫＤ１に基づくインヒビターと比較して、Ｇを有意に増強した（図１８Ａ～Ｃ）。驚くべきことに、５μＭおよび７．５μＭのインヒビター濃度では、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴによるＧの増強は、他のインヒビターと比較した場合に、有意により高かった（図１８Ｄ～Ｅ）。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ 対 アプロチニンに関してクロット剪断強度Ｇにおいてこの観察された改善はおそらく、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔによる阻害が本質的にないことに対して、アプロチニンによるＦＸＩａおよびカリクレイン阻害に起因し得る。さらに、選択された濃度での各インヒビターに関するＬＹ６０の多重比較分析を、図１９に示す。１μＭまたは５μＭでは、アプロチニンは、各ＫＤ１インヒビターと比較した場合に、線維素溶解を防止するにあたって有意により良好であったのに対して、ＫＤ１－ＷＴは、試験した全ての濃度において各インヒビターより劣っていた。２μＭまたは３μＭでは、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンは、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔより優れ、７．５μＭ濃度では、いかなるインヒビターでもＬＹ６０は観察されなかった。全体的に、アプロチニンおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、ＴＥＧ実験において線維素溶解を阻害するにあたって、他のインヒビターより優れているようである。

【0117】

３．７． 細胞毒性試験
ここで、本発明者らは、アプロチニンならびに現在使用される抗線維素溶解剤であるＥＡＣＡおよびＴＸＡと比較したＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの潜在的毒性に関する洞察を獲得したかった。患者を、大手術を受けている間に代表的には静脈内注射を介して、または外傷の状況においては外用を介して、抗線維素溶解剤で処置する。本発明者らはそのようにして、内皮細胞および皮膚線維芽細胞における細胞傷害を試験した；上記細胞は、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの治療用量に曝される可能性が最も高い。ヒト、ラットおよびイヌにおけるＴＸＡの血漿半減期は、約１２０分である（４８）。その２種のＫＤ１バリアントホモログ（アプロチニンおよびエカランチド）の半減期各々はまた、ヒトにおいて約１２０分である（４９，５０）のに対して、マウス、ラットまたはイヌにおけるアプロチニンの半減期は、約７０分である（５１）。各ＫＤ１バリアントの半減期は公知でないが、短いと思われるので、計画して決定する。抗線維素溶解剤の各々のインビボでの半減期は短いことから、注入は通常、手術の継続時間全体にわたって連続的である。従って、処置継続時間を２４時間に設定し、選択した用量範囲は、試験した試薬の各々について臨床用量の約３倍と同等のものを含む。

【0118】

ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔまたはアプロチニンで２４時間処理したＨＵＶＥＣのレサズリンアッセイは、０．１μＭ～３０μＭの全用量範囲にわたって、リン酸緩衝液コントロールで処理した細胞と比較して、細胞生存率において有意な変化を何ら生じなかった（Ｖａｄｉｖｅｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｎｏｖ １７；９（１１）：３６８４． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９１１３６８４における図１１Ａ）。同じ結果が、ＥＡＣＡ（用量範囲は１～６０ｍＭ）およびＴＸＡ（用量範囲は０．２～３０ｍＭ）での処理後に得られた。細胞生存率は、初代ヒト皮膚線維芽細胞において等しく変化しなかった（Ｖａｄｉｖｅｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｎｏｖ １７；９（１１）：３６８４． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９１１３６８４における図１１Ｂ）。これは、試験した抗線維素溶解剤のいずれも、処理の２４時間の継続時間内に測定可能な細胞傷害を引き起こさなかったことを示す。

【0119】

生存率は、細胞傷害のエンドポイントである。従って、本発明者らは、カスパーゼ活性化から生じるアポトーシスの誘導を試験した。カスパーゼ３／７アッセイを、抗線維素溶解剤での処理後にＨＵＶＥＣ細胞において行った（Ｖａｄｉｖｅｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｎｏｖ １７；９（１１）：３６８４． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９１１３６８４における図１１Ｃ）。カスパーゼ３／７活性は、上記細胞をＴＸＡの２種の高い方の濃度（１０ｍＭおよび３０ｍＭ）で処理した場合に有意に増加し、ＥＡＣＡ（２０ｍＭおよび６０ｍＭ）での曝露後により低い程度に増加した。ＴＸＡおよびＥＡＣＡとは対照的に、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンは、全ての濃度でベースラインを上回るカスパーゼ活性を誘導しなかった。タキソールを、陽性コントロールとして含めた。抗線維素溶解薬のいずれも、全ての用量にわたって、初代線維芽細胞においてベースラインを上回ってカスパーゼ活性を増加させなかった。

【0120】

異なるアッセイを使用して上記の結果を確認するために、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ細胞および初代線維芽細胞においてＣｅｌｌＴｏｘ ｇｒｅｅｎ細胞傷害性アッセイを行った。Ｔｈｅ ＣｅｌｌＴｏｘ ｇｒｅｅｎ色素はＤＮＡに結合し、膜完全性が障害されている場合にのみ蛍光染色を生じる。内皮細胞（Ｖａｄｉｖｅｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｎｏｖ １７；９（１１）：３６８４． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９１１３６８４における図１１Ｄ）においても線維芽細胞（Ｖａｄｉｖｅｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｎｏｖ １７；９（１１）：３６８４． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９１１３６８４における図１１Ｅ）においても、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの最高用量（３０μＭ）で処理した２４時間後に、蛍光細胞のパーセンテージの有意な増加は検出されなかった。細胞の細胞傷害はまた、細胞（ＨＵＶＥＣまたは線維芽細胞）を試験した他の抗線維素溶解剤で処理した場合に、ベースラインを有意に上回って増加しなかった。簡潔にするために、アプロチニン、ＴＸＡおよびＥＡＣＡについてのデータは示していない。

【0121】

まとめると、０．１～３０μＭ ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴまたはアプロチニンでのＨＵＶＥＣ細胞および初代ヒト線維芽細胞の２４時間の処理は、生存率を減少させず、アポトーシスを誘導せず、細胞傷害のいかなる徴候をも示さなかった。しかし、ＴＸＡおよびＥＡＣＡは、カスパーゼ３／７活性における増加から推定されるように、ＨＵＶＥＣ細胞においてより高濃度でアポトーシス（細胞死）を誘導した。

【0122】

４． 考察
以前に、構造情報およびＳ２’－サブサイト特異性に基づいて、本発明者らは、ＴＦＰＩ－２ ＫＤ１から７３残基のＫｕｎｉｔｚドメインプラスミンインヒビターを設計した（３２）。ＫＤ１－ＷＴは、匹敵する親和性でプラスミン、ならびにｐＫＬＫ、ＦＸＩａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦを阻害するのに対して、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒは、プラスミンのみを阻害する。残基１７（ＢＰＴＩ番号付け）におけるＬｅｕからＡｒｇへの変化は、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒをプラスミンに対して特異的にし、ｐＫＬＫおよびＦＸＩａ阻害を劇的に低減した。現在の６０残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔと比較した場合、以前に発現させたＫＤ１－Ｌ１７Ｒは、Ｎ末端において１３個のさらなる残基（ＴＦＰＩ－２配列から９個およびＩＩａ切断部位から４個）、およびコアＫｕｎｉｔｚドメインから離れたＣ末端において４個の残基（ＶＰＫＶ）を有した。これらのさらなる残基は、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ機能に干渉しないが、それらは可撓性でありかつＫＤ１－ＷＴの結晶構造から推測されるように無秩序であり得る（３６）。従って、新たな６０残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ変異体を発現させ、その阻害プロフィールを特徴づけた。６０残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの活性部位阻害プロフィールのいずれも、以前に発現させた７３残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒから変化しないことから、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、血液喪失の低減において非常に有効であり、試験した２種のマウス出血モデル（肝臓裂傷および尾部切断）においてアプロチニンに匹敵し得ることが推測される（３２，４１，５２）。

【0123】

７３残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒは、Ｃ末端においてＩＥＫＶＰＫＶを有し、バリンは、ＩＩａとの長時間のインキュベーションによって除去され得る（４１）。Ｃ末端におけるＶａｌ残基の除去による、Ｃ末端リジンが生じ、これは、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒを、プラスミン活性部位およびプラスミノゲン活性化を阻害することによって、線維素溶解の二重反応性インヒビターにする（４１）。さらに、ＩＩａとの長時間インキュベーションは、異なるＮ末端残基を有するＫＤ１－Ｌ１７Ｒの不均一な集団を生じた（４１）。プラスミンおよびＫＤ１－Ｌ１７Ｒのモデル化された複合体の構造分析から、残基Ｔｙｒ１１からＴｈｒへの変化が、プラスミン阻害にとって有益であることが示された。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔにおけるスレオニンは、プラスミンの残基Ｑ１９２とさらなる水素結合を作る（図９Ａ）。興味深いことには、７３残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒは、Ｃ末端セグメント（ＩＥＫＶＰＫＶ）において２個のリジン残基を含み、それらのうちのいずれかは、Ｃ末端残基として働き得る。さらに、Ｃ末端ＩＥＫ配列を有する６０残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔのモデル化は、それがプラスミノゲンおよびｔＰＡのクリングルドメインとの相互作用を増強することを示す（図９ＡおよびＢ）。特定の理論によっても作用機序によっても拘束されないが、ＶＰＫ配列と比較した場合、ＩＥＫ配列は、ＫｕｎｉｔｚドメインのＡｒｇ５７およびＧｌｕ５９と、プラスミンクリングル残基Ｇｌｕ１５１およびＡｒｇ１５３とからそれぞれ生じる２個のさらなる相互作用を有すると考えられる（図９Ｂ）。同様の相互作用は、ｔＰＡのクリングルドメインでも同様に起こると推定される。

【0124】

新たにＥ．ｃｏｌｉ発現ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＣ末端ＩＥＫ配列を有するＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔはともに、Ｈｉｓ６タグおよびエンテロキナーゼ切断配列を含む；しかし、これらのさらなる残基は、エンテロキナーゼによって除去できなかった。７３残基のＫＤ１－Ｌ１７Ｒ構築物と同様に、さらなる残基の存在は、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＴおよびＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ変異体の阻害特性に影響を及ぼさなかった。従って、６０残基のＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現させた。推測されるように、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔと比較して、増加した親和性（０．５９ｎＭ 対 ０．９ｎＭ）でプラスミンを阻害した。さらに、ＩＥＫ Ｃ末端を有する６０残基のＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、Ｃ末端ＶＰＫを有するＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨ（２５０ｎＭ～３００ｎＭ）と比較した場合、増加した親和性（３５ｎＭ～５０ｎＭ）でｔＰＡおよびプラスミンのクリングルドメインに結合する（図１３）（４１）。プラスミン活性部位阻害における中程度の増加ならびにプラスミノゲンおよびｔＰＡのクリングルドメインに対する有意に改善された親和性は、血漿クロット溶解アッセイにおけるＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔによる線維素溶解の強い阻害（図１４Ｂ）およびＴＥＧ実験におけるＭＡ、ＧおよびＬＹ６０の回復（図１６Ｂ～Ｆ）において反映された。

【0125】

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて作製したＫＤ１二重変異体（ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔ）は、ヒト起源の小型で、均一な、および効果的な特異的プラスミンインヒビターである。ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔの特性は、プラスミン阻害アッセイ、血漿クロット溶解アッセイおよびＴＥＧ実験においてアプロチニンに匹敵する。さらに、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、ｐＫＬＫ、ＦＸＩａおよびＦＶＩＩａ／ｓＴＦを阻害しない。さらに、ＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔは、初代内皮細胞または皮膚線維芽細胞においていかなる測定可能な細胞傷害をも誘導しなかった。しかし、ＴＸＡおよびＥＡＣＡは、より高濃度ではこれらの細胞においてアポトーシスを引き起こし、これらの抗線維素溶解薬の腎クリアランスの間に達成される可能性があった。これらの結果は、サル腎臓において腎毒性も発作もいかなる検出可能な組織病理的変化をも誘導しなかったＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨ（Ｃ末端ＶＰＫ）単一変異体と一致する（３２）。アプロチニンの場合には、その酸性の性質およびｐＫＬＫ阻害によって、腎臓活動の変化が生じ、これは、腎損傷をもたらす（３２， ５３）。現在の抗線維素溶解薬、ＥＡＣＡおよびＴＸＡは、グリシンレセプターを阻害することによって、発作を引き起こす（５４）。リジンアナログは、アプロチニンほど有効ではないことから、より高用量のＥＡＣＡおよびＴＸＡは、これらの薬剤が糸球体濾過によるクリアランスの間に非常に高濃度に達するので、腎不全のリスクを増加させる（５５，５６）。本開示において見出されるＫＤ１Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_Ｔデータは、励みになる；しかし、それは、臨床試験について考慮され得る前に、適切な動物出血モデルにおいて評価される必要がある。

【表2】

【表3】

【0126】

実施例１参考文献
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【0127】

実施例２：予測されない機能的プロフィールを有する６０残基のＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異体（ｒＨＵＫＤ１－ＴＭ）を含む新たなプラスミン特異的Ｋｕｎｉｔｚインヒビターポリペプチド
先に試験した抗線維素溶解ポリペプチドバリアントは、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）の単一変異体および二重変異体（ＫＤ１_Ｌ１７Ｒ、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ}）を含む（例えば、米国特許第７，５８５，８４２号ならびに米国特許公開番号２００８００２６９９８および同第２０１４０２８８を参照のこと）。これらは、２種のマウス傷害モデル（肝臓裂傷および尾部切断モデル）において血液喪失を防止するにあたって成功した。しかし、これらのポリペプチドバリアントの効力は、例えば、それらが、組織プラスミノゲンアクチベーターとの長期間のインキュベーションにわたる血漿クロット溶解アッセイにおいて、アプロチニンでの類似の試験と比較した場合に幾分低減した活性を示すという点において、制限を有する。

【0128】

血漿クロット溶解アッセイにおいてこのようなバリアントの効力を増加させようとする試みにおいて、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２バリアントのさらなるＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）を作製し、試験した。これらの試験の一部として、アミノ酸変異の特有の一団を有する短縮型三重変異体（ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}）を開発した。このバリアントは、以下を含む：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）。
以下は、単一、二重および三重ＫＤ１変異体の配列比較およびそれらの特性を提供する。

【化3】

【0129】

本明細書で開示されるＫＤ１三重変異体（配列ＮＨ_２－１ＮＡＥＩ^…ＩＥＫ６０－ＣＯＯＨを有する６０残基（ＢＰＴＩ番号付け））を、Ｐｉｃｈｉａにおいて発現させ、精製したところ、分子量が７．１ＫＤａであることが明らかにされた（図１）。上で注記されるように、このバリアントは、カリクレインを含む他の凝固セリンプロテアーゼを阻害するという有害作用なしに、アプロチニンに類似するプラスミンの強力なインヒビター（図２）であることが見出された（図２）。従って、広い特異性のプロテアーゼインヒビターであるアプロチニンと比較して、本明細書で開示されるＫＤ１三重変異体は、ヒト起源のものであり、プラスミンを阻害することについて非常に特異的である。

【0130】

以下の表４～６で示されるデータは、ある特定の予測外の薬物動態特性および本明細書で開示されるヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）の６０残基の三重変異体ポリペプチドバリアントの予測外の特性の組み合わせを例証する。

【表4】

各インヒビターに関するＫ_ｉ値を、強結合式を使用して計算した。ＫＤ１ＴＭによるカリクレイン阻害は、１８ｎＭのＫ_ｉを有するアプロチニンと比較して、２５μＭまで観察されない。アプロチニンによるカリクレイン阻害は、腎損傷に関連付けられる。リジンアナログであるトラネキサム酸（ＴＸＡ）およびε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は、異なる機序を通じて機能し、プラスミン活性部位または他のプロテアーゼを阻害しない。

【0131】

表５および表６： ｔＰＡおよびプラスミノゲンのクリングルドメインへのヒトＴＦＰＩ－２ ＫＤ１変異体結合
表面プラズモン共鳴実験から得られる結合定数。

【表5】

【表6】

【0132】

例えば、表４～６に提供されるデータおよび図９の模式図において示されるように、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のこの６０残基の三重変異体ポリペプチドバリアントは、非常に望ましい薬物動態プロフィールを有することが発見された。このプロフィールは、アプロチニン（従来利用されたが、問題のある抗線維素溶解剤）と比較した場合に、プラスミンの活性を阻害するより大きな能力を含む。さらに、この新たなポリペプチドバリアントのプラスミン阻害活性は、アプロチニンのプラスミン阻害活性と比較してより有利である一方で、本明細書で開示されるポリペプチドバリアントは、アプロチニンおよび関連分子で観察されるある特定の有害な副作用をさらに回避する。この中の１つの例証では、本明細書で開示されるポリペプチドバリアントは、他の凝固セリンプロテアーゼ（例えば、カリクレイン、第ＸＩａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子）に対して最小限の阻害活性を示すことが観察される。

【0133】

上で注記されるように、本明細書で開示される６０残基のポリペプチドバリアントは、Ｃ末端リジン構造／部分を含むアミノ酸残基の特有の一団を含む。特定の理論によっても作用機序によっても拘束されないが、このＣ末端構造は、フィブリンクロットへのプラスミノゲン結合を阻害する様式で、そのクリングルドメインを介して、プラスミンまたはプラスミノゲンへの６０残基のポリペプチドバリアントの結合を促進することによって機能するようである。本明細書で開示されるポリペプチドバリアントは、１５位におけるリジンアミノ酸置換を含む３個のアミノ酸変異の群（「ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}」）をさらに含む。驚くべきことに、Ｃ末端リジンを含むこのＹ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異体は、二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有するコントロールの６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合に、プラスミンを阻害するにあたって４～５倍さらに強力であることが観察される（例えば、図２および表４～６に示されるデータを参照のこと）。特定の理論によっても作用機序によっても拘束されないが、１５位におけるリジンアミノ酸置換を有するこの三重変異体は、このバリアントポリペプチドの、プラスミンにおける残基Ａｓｐ１８９およびＳｅｒ１９０との相互作用を促進することによって機能するようである。

【0134】

予測外なことには、この６０残基のＹ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ三重変異体ポリペプチドは、二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有するコントロールの６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合、カリクレイン、第ＸＩａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子の少なくとも１０倍弱い阻害をさらに示し、その機能的プロフィールは、望ましくない副作用（例えば、アプロチニンで観察されるもの）を制限する。野生型ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２分子の１５位（ＢＰＴＩ番号付け）におけるＡｒｇ残基は、第ＸＩａ因子およびカリクレインを阻害することにとって重要である。しかし、第ＸＩａ因子およびカリクレインは、１９０位においてアラニン残基を有することから、本明細書で開示されるＫｕｎｉｔｚドメイン１ポリペプチドインヒビターの１５位におけるリジンは、明らかに、第ＸＩａ因子およびカリクレインにおけるＡｌａ１９０と相互作用できない。結論として、この位置においてリジンを有するこれら６０残基のポリペプチドは、第ＸＩａ因子およびカリクレイン活性の極めて弱いインヒビターである。

【0135】

上で注記した理由から、本明細書で開示される６０残基のバリアントポリペプチドは、例えば、この技術において類似の阻害性分子と関連するある特定の副作用を同時に回避しながら、プラスミンに強く結合する能力を含む、驚くべきかつ非常に望ましい薬物動態／材料プロフィールを示す。このような機能的特性は、これらのポリペプチドをインビボでの治療剤としての使用に最適化されたものにする。本明細書で開示されるポリペプチドはさらに、いくつかの他の所望の特性を有する。例えば、６０残基のバリアントポリペプチドは、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）に結合し、フィブリンクロットへのその結合を阻害し、それによって、凝固の部位におけるプラスミノゲン活性化を弱めることが示される。

【0136】

６０残基のバリアントポリペプチドのさらなる局面は、以下の説で考察される。

【0137】

ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとの相互作用のモデル化
図９Ａにおいて、プラスミンとのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ相互作用のモデル化された複合体が示される。サブパート（Ａ）は、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとプラスミンプロテアーゼドメインとのモデル化された相互作用を示す。プラスミンプロテアーゼドメインの静電的表面およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの漫画表示（淡緑色）が記載される。プラスミンとのＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ相互作用のＰ１（Ｌｙｓ１５）、Ｐ５（Ｔｈｒ１１）およびＰ２’（Ａｒｇ１７）残基は、棒の表示で示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。サブパート（Ｂ）は、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとプラスミンクリングルドメインとのモデル化された相互作用を示す。プラスミノゲンクリングルドメイン１の静電的表面およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔの漫画表示（淡緑色）が記載される。クリングルドメインとＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔとの間の水素結合および塩橋（破線として示される）を形成する残基は、棒の表示で示される。炭素原子は、クリングルドメインに関しては緑で、およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔに関しては黄色で示される。サブパート（Ａ）にあるように、酸素原子は赤で示され、窒素原子は青で示される。ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ残基は、接尾辞Ｉで表示される。静電的表面では、青は正電荷を表し、赤は負電荷を表し、白は中性の電荷を表す。

【0138】

プラスミンにおける残基１９０ Ｓｅｒは、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ（ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ）におけるリジン１５と相互作用し、これはカリクレインまたは第ＸＩａ因子におけるＡｌａ １９０には可能でないことに注意すること。従って、プラスミン活性部位親和性は、プラスミンに関しては増加し、カリクレインおよび第ＸＩａ因子に関しては減少する。さらに、特定の理論によっても作用機序によっても拘束されないが、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_ＴポリペプチドバリアントにおけるＩＥＫ Ｃ末端は、プラスミンと、ＶＰＫ Ｃ末端配列を有するポリペプチドより大きな相互作用を有するので、プラスミンクリングルドメインに対してより高い親和性を有するようである。さらに、類似のＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔポリペプチドバリアント相互作用は、組織プラスミノゲンアクチベーターのクリングルドメインで起こる。

【0139】

図９Ａは、ＩＥＫ Ｃ末端モチーフが、ＶＰＫ Ｃ末端モチーフを有するポリペプチドと比較した場合に、プラスミンクリングルドメインにより良好に結合する理由を含め、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔポリペプチドバリアントで観察されるプラスミン阻害のレベルに関する情報を提供する。この発見は、１５位において（２４位と同じ）ＡｒｇからＬｙｓ、および米国特許公開２００８００２６９９８に開示されるＶＰＫＶ末端配列を有する７３残基の長さ（トロンビン切断からプラス４－残基）のｋｕｎｉｚドメイン先行技術構築物に対する試験によって裏付けられる。この先行技術構築物は、上記ポリペプチドのＣ末端においてＬｙｓアミノ酸を有さず、プラスミンクリングルドメインに結合しない。さらに、この特異的な７３残基の先行技術分子のＮ末端における９個の残基およびＣ末端における４個の残基は、溶媒露出しており、非常に無秩序であり、このことは、この先行技術変異体の結合能力の局面を損ない得る。対照的に、本発明の三重変異体構築物は、Ｃ末端 ＩＥＫを有する６０残基の長さ（（ＫＤ１_{Ｙ１１ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ）であり、クリングルドメインに非常に高い親和性（約４０ｎＭ）で結合することが観察される。さらに、以下の節で考察されるように、本明細書で開示されるヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のポリペプチドバリアント（配列番号１）は、非常に望ましい安定性プロフィールを示す。

【0140】

安定性試験
本明細書で開示されるヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）のポリペプチドバリアントは、予測外のかつ望ましい安定性プロフィールを示す。例えば、本発明のある特定の実施形態において、本明細書で開示される６０残基のポリペプチドバリアントは、組成物の中に配置され、ここでこのポリペプチド組成物が、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ カルシウムを含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で、３７℃において少なくとも１週間インキュベートされる場合に、上記ポリペプチドのプラスミン阻害定数（Ｋｉ）は、１０％未満（または５％未満）変化する。

【0141】

安定性試験において、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔサンプル（０．５９ｍｇ／ｍｌ）を、４℃、室温、および３７℃において１週間維持し、そのプラスミン阻害を、各日に試験した。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭは安定であり、そのプラスミン阻害特性は変化しないようである。アプロチニンに類似するｒＨｕＫＤ１－ＴＭ変異体は、緩慢強結合プラスミンインヒビターである。反応を、ＴＢＳ／ＢＳＡおよび２ｍＭ カルシウム中で行った。ヒトプラスミンを、種々の濃度のｒＨｕＫＤ１－ＴＭとともに１時間、室温において９６ウェルマイクロタイタープレートの中でインキュベートした。次いで、プラスミンのための合成基質を、最終濃度 １Ｋ_Ｍへと添加し、残存アミド分解活性を、キネティックマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において測定した。以下の表７において、見かけ上の阻害定数、Ｋ_ｉ ^＊を、非線形回帰データ分析プログラムを使用して決定した。データを、強結合インヒビターに関する式を使用して分析し、Ｋ_ｉ値を、基質濃度の効果に関して補正することによって得る。

【表7】

【0142】

ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５ＫＬ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ（ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ）およびアプロチニンによるプラスミンの阻害についての平衡解離定数（Ｋ_ｉ）
ｒＨｕＫＤ１－ＴＭおよびアプロチニンによるプラスミンの阻害についての平衡解離定数（Ｋ_ｉ）を、緩慢強結合阻害式（１０，１１）を使用して計算した。プラスミンへのｒＨｕＫＤ１－ＴＭの結合のＫ_ｉ値は、アプロチニンに関する４００～５００ピコモル濃度と比較して、異なる実験において５０～１５０ピコモル濃度の範囲に及んだ（図２）。さらに、Ｃ末端の６０－リジンは、プラスミノゲン／プラスミンおよび組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のクリングルドメインへのｒＨｕＫＤ１－ＴＭの結合を可能にし、それらがフィブリンクロットへ結合することを阻害するはずである。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭのこの特性は、プラスミンによる線維素溶解をさらに阻害する。従って、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ（ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ）は、線維素溶解を阻害することに関して非常に強力かつ特有の作用物質である。

【0143】

ＫＤ１二重変異体（Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ）におけるＡｒｇ１５からＬｙｓへの変化は、プラスミンのＳ１部位Ａｓｐ１８９と効果的に相互作用し、これは、トリプシンとアプロチニンとの構造において定義されるように、プラスミンのＳｅｒ１９０とｒＨｕＫＤ１－ＴＭのＬｙｓ１５との相互作用を含む（１２）。Ｌｙｓ１５のこのような相互作用は、カリクレインまたは第ＸＩａ因子および第Ｘａ因子（これは、Ｓｅｒの代わりにＡｌａ１９０を有する（１３，１４））とでは可能でない。結果として、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔは、これら３種の酵素を極めてわずかに阻害し（図２）、これは患者における使用にとって望ましい結果である。しかし、第ＶＩＩａ因子はＳｅｒ１９０を有し、単一変異体または二重変異体に類似して、三重変異体によってわずかに阻害される（図２）。

【0144】

ヒト正常プール血漿における線維素溶解に対するｒＨｕＫＤ１－ＴＭおよびアプロチニンの効果
実験を行って、ｔＰＡ誘導性血漿クロット線維素溶解を阻害する三重変異体 ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンの有効性を比較した。これらのデータを、三重変異体に関しては図３Ａに、アプロチニンに関しては図３Ｂに示す。ヒト正常プール血漿（ＮＰＰ）へのトロンビン（ＩＩａ）の添加は、フィブリン形成を引き起こしたが、これは、ＯＤ４０５の増加によって反映される（黒の曲線、図３Ａおよび３Ｂ）。ｔＰＡを同時に添加すると、最初にクロット形成が、続いて、プラスミノゲンからプラスミンへのｔＰＡ媒介性変換によって誘導されるフィブリンの溶解が引き起こされる（黒丸を伴う黒の曲線、図３Ａおよび３Ｂ）； 線維素溶解の中点は、各場合において約８分であった。両方の抗線維素溶解剤が、用量依存性様式において線維素溶解を阻害した。ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ（三重変異体）およびアプロチニンの両方が、０．５μＭにおいて線維素溶解中点を約１５分へと増加させ、３μＭでは、両方のインヒビターが、ｔＰＡ誘導性線維素溶解を完全に防止した（図３Ａおよび３Ｂにおけるマゼンタの曲線）。重要なことには、ｔＰＡの非存在下での３μＭの各インヒビターの添加は、クロット形成に対しても線維素溶解に対しても効果を有しなかった（褐色の曲線、図３Ａおよび３Ｂ）。従って、ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔおよびアプロチニンの両方が、長期間にわたってｔＰＡ誘導性血漿クロット溶解を防止するにあたって本質的に等しい。

【0145】

抗線維素溶解剤による初代細胞生存率に対する効果
各抗線維素溶解剤、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ、アプロチニン、ＥＡＣＡおよびＴＸＡの効果を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および皮膚線維芽細胞の生存率に対して試験した。そのデータを、ＨＵＶＥＣに関しては図４に、皮膚線維芽細胞に関しては図５に示す。試験した抗線維素溶解剤はいずれも、試験した２種の細胞タイプに関して２４時間以内に生存率に対して検出可能な効果を有しなかった。生細胞は、サイトゾル内に還元環境を維持することに注意のこと。生細胞は、基質レサズリンを蛍光性のレソフリン（resofurin）へと還元し、蛍光は、細胞数に正比例する。基質レサズリンは、細胞状態にかかわらず細胞透過性である（細胞に入る）。従って、このアッセイは、いかなる細胞アポトーシスも壊死も検出しない。

【0146】

抗線維素溶解剤による細胞アポトーシスに対する効果
アポトーシスは、ときおり「細胞自殺」と称され、細胞の自己破壊の正常なプログラムされたプロセスである。アポトーシスの間に、細胞は縮小し、その隣り合うものから引き離される。カスパーゼ３および７は、細胞がアポトーシスを受けているときにのみ活性化されるプロテアーゼである。ここで使用されるアッセイでは、特定の基質が、カスパーゼ３およびカスパーゼ７によって、ルシフェラーゼの基質へと変換される。次いで、ルシフェラーゼは、発光シグナルを生じる。発光は、カスパーゼ活性に正比例する。アポトーシスの間に、細胞の膜完全性は、無傷のまま維持される。使用されるこのアッセイにおいて、ＥＡＣＡおよびＴＸＡは、ＨＵＶＥＣにおいてはカスパーゼ活性の有意な増加を誘導するが、線維芽細胞では誘導しない（図６）。従って、ＥＡＣＡおよびＴＸＡは、インビボで血管を内張りする内皮細胞においてプログラム細胞死を誘導できた。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭおよびアプロチニン（ＢＰＴＩ）は、いずれの細胞、ＨＵＶＥＣまたは皮膚線維芽細胞においても、使用した条件下ではアポトーシスを誘導しなかった（図６）。

【0147】

抗線維素溶解剤による細胞毒性に対する効果
ここで使用した細胞毒性グリーンアッセイ（ｃｅｌｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｇｒｅｅｎ ａｓｓａｙ）は、細胞傷害の結果として起こる膜完全性における変化を測定する。シアニン色素は、無傷な膜を通して細胞に入ることはできない。膜完全性が障害される場合、その色素は細胞に入り、ＤＮＡを染色し、蛍光シグナルをもたらす。従って、観察される蛍光は、細胞傷害に比例する。使用されるアッセイにおいて、ＴＸＡは、ＨＵＶＥＣおよび皮膚線維芽細胞の両方において毒性を誘導した（図７および８）のに対して、ＥＡＣＡによっては、皮膚線維芽細胞においてのみ有意な毒性が観察された。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭおよびアプロチニン（トラジロール、ＢＰＴＩ）は、試験した条件下でこれらの細胞において毒性を誘導しなかった。

【0148】

トロンボエラストグラフィー実験
線維素溶解に対するＫＤ１－Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨ（ＫＤ１ＴＭ）の異なる濃度の効果を、ＴＥＧ ５０００ Ｔｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ， Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用して、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）で評価した。各クロット形成／溶解アッセイは、最終容積を３６０μＬにするために、ＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍｇ ウシ血清アルブミン／ｍＬを含む）中に３００μＬのクエン酸加全血、トロンビン（０．１５μＭ， 最終濃度）、ｔＰＡ（２ｎＭ， 最終濃度）、ＣａＣｌ_２（１０ｍＭ， 最終濃度）および種々の濃度のＫＤ１ＴＭを含んだ。トロンビン、ｔＰＡおよびＣａＣｌ_２を最後に添加して、同時のクロット形成および線維素溶解を開始した。ｔＰＡの濃度を、プラスミンの生成からほぼ完全なクロット溶解が９０分にわたって生じるように選択し、プラスミンインヒビターの効果がモニターされることを可能にした。各実験を、最大振幅がＬＹ６０値を確立するように達した後に、少なくとも６０分間行った。ＴＥＧ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン４．２．３； Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用して、凝固開始までの時間（Ｒ）、最大クロット強度（最大振幅（ＭＡ）（これは剪断弾性率強度、Ｇに正比例した）、およびＭＡ６０分後のパーセント溶解（ＬＹ６０）を計算した。トロンボエラストグラフィー実験を行って、トロンビンおよびＣａＣｌ_２の添加によって全血中で形成されるクロットのｔＰＡ誘導性溶解に対するＫＤ１ＴＭの効果を評価した。これらのデータを図２０に示し、表８にまとめる。図２０は、ｔＰＡで開始されるクロット溶解に対する異なる濃度のＫＤ１ＴＭにおけるＴＥＧトレースを示す。ｔＰＡの非存在下では、達成された最大振幅（ＭＡ）は、４１７４ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断弾性率強度Ｇで４５．５分であり、１８０分ではクロット溶解は検出できなかった（ＬＹ６０＜０．１％）（曲線１）。曲線２は、２ｎＭ ｔＰＡの存在下でインヒビターなしのクロット形成および溶解に対するＴＥＧトレースを図示する。曲線３および４は、２ｎＭ ｔＰＡの存在下でのクロット形成および溶解に対するＫＤ１ＴＭの異なる濃度（２μＭおよび４μＭ）でのＴＥＧトレースを図示する。データは、ＫＤ１ＴＭが、クロットの硬さ（ＭＡ）および剪断強度（Ｇ）を改善し、濃度依存性様式で線維素溶解を阻害したことを示す（表８）。顕著なことには、４μＭでは、ＫＤ１ＴＭは、クロット強度ＭＡを９８％（４４．２ｍｍ）へと、Ｇを９６％（４０１１ ｄｙｎ／ｃｍ^２）へと改善した（曲線４）。さらに、コントロール（ＬＹ３０、３４．６％、曲線２）と比較した場合、ＬＹ３０は観察されなかった。同様に、コントロール（ＬＹ６０ ６５％）と比較した場合に、ＬＹ６０のわずか３．７％または１．７％が、ＫＤ１ＴＭの２μＭおよび４μＭ濃度で観察された。重要なことには、ＴＥＧデータは、ＫＤ１ＴＭが、ｔＰＡで誘導される線維素溶解において、ＭＡおよびＧを効果的に回復させることを示す。

【表8】

【0149】

本明細書で提供される開示は、以下を含む多くの結論をもたらす：
ＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ（ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ）は、ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨ（ＫＤ１ＳＭ）およびＫＤ１_{Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒ}－Ｋ_Ｔ（ＫＤ１ＤＭ）より優れ、プラスミンの活性部位を阻害するにあたってアプロチニン（トラジロール）に等価である。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭは、ＮＡＥＩＣで始まり、Ｃ末端ＩＥＫを有する６０残基のＫｕｎｉｔｚドメインである（ＢＰＴＩ番号付け）。さらに、それは、以前の単一変異体（ＫＤ１－Ｌ１７Ｒ－Ｋ_ＣＯＯＨ）のようにＮ末端においてさらなる９残基を有さない。上記単一変異体はまた、ＩＥＫＶＰＫで終了するＣ末端において３個のさらなる残基を有する。上記単一変異体の欠点は、２個の疎水性残基、ＶａｌおよびＰｒｏがその可溶性を低減させることである。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭは、高度に可溶性である。ｒＨｕＫＤ１－ＴＭはまた、プラスミンを阻害することおよび血漿クロット溶解アッセイにおいて、ＫＤ１ＳＭおよびＫＤ１ＤＭより優れ、長期インキュベーション期間にわたってアプロチニンに匹敵する。さらに、単一変異体（ＫＤ１ＳＭ）および二重変異体（ＫＤ１ＤＭ）と比較して、三重変異体（ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ）は、カリクレイン、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子の非常に弱いインヒビターである。

【0150】

集中的な試験（例えば、図４～８）は、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭが、ＨＵＶＥＣまたは線維芽細胞およびおそらく他の細胞に対しても損傷を引き起こさないことを示す。ＥＡＣＡおよびＴＸＡ（これらは、腎臓を介して除去される）はおそらく、腎臓において高濃度に存在し得、細胞損傷を引き起こし得る。これは、ＴＸＡおよびＥＡＣＡの観察される副作用としての腎不全についての理由であり得る。

【0151】

上に開示されるように、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭ（配列番号１）は、プラスミンの優れたインヒビターであると同時に、カリクレインおよび第ＸＩａ因子の極めて弱いインヒビターである（そして抗凝固活性を有しない）ことが発見された。これは、ウシ起源でありかつカリクレインの阻害が原因で腎損傷を引き起こすアプロチニンとは対照的である。さらに、２種のインヒビターは、カリクレイン（７，８）を非常に強く阻害し、フェーズＩＩＩの心臓バイパス手術治験に失敗した。従って、ｒＨｕＫＤ１－ＴＭによるカリクレインおよび第ＸＩａ因子の極めて弱い阻害は、本開示のポリペプチドの非常に都合の良い特性である。よって、本明細書で開示される６０残基のバリアントポリペプチドは、認識され、根強く残っておりかつ他者によって解決されていない長年にわたるニーズを満たす驚くべき材料特性の一団を有することが発見された。

【0152】

本明細書で言及される全ての刊行物（例えば、上記に数字で列挙されているもの、米国特許第８，９９３，７１９号、米国特許公開番号２００４０１２６８５６、同第２００４０１１０６８８、同第２００８００２６９９８、同第２００９００１８０６９および同第２０１４０２８８０００、ならびにＶａｄｉｖｅｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｎｏｖ １７；９（１１）：３６８４． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｊｃｍ９１１３６８４）は、引用された刊行物に関連して局面、方法および／または材料を開示および記載するために本明細書に参考として援用される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）を有するポリペプチド；および薬学的に受容可能な賦形剤、
を含む医薬組成物。
（項目２）
前記薬学的に受容可能な賦形剤は、保存剤、張度調整剤、洗浄剤、ヒドロゲル、粘度調整剤、またはｐＨ調整剤のうちの少なくとも１種から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物は、静脈内注射または注入における使用のために選択された薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物を含む、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記ポリペプチドのプラスミン阻害定数（Ｋｉ）は、３７℃において、少なくとも２日間、４日間または１週間、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ カルシウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中での前記組成物のインキュベーション後に、１０％未満変化する、項目１～３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５）
ポリペプチド配列：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
（項目６）
前記ポリヌクレオチドは、配列：ＡＡＣＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＡＧＧＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号２）
を含む、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記ポリヌクレオチドは、細胞において前記ポリペプチドを発現させるための１またはこれより多くの調節配列を含むベクターの中に配置される、項目６に記載の組成物。
（項目８）
項目７に記載のベクターを含む細胞。
（項目９）
前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、項目７に記載の細胞。
（項目１０）
プラスミンの少なくとも１種の活性を阻害するための方法であって、前記方法は、プラスミンと、プラスミンの少なくとも１種の活性を阻害するために十分な量の項目１～４のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを包含する方法。
（項目１１）
前記方法は、線維素溶解が阻害されるように、線維素溶解を阻害するために十分な量の前記組成物を患者に投与することによって、前記患者における線維素溶解を阻害することを包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
被験体において出血を阻害するための方法であって、前記方法は、出血が阻害されるように、項目１～４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を被験体に投与することを包含する方法。
（項目１３）
前記出血は、外傷性傷害から生じる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記外傷性傷害は、外傷性脳傷害である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記出血は、手術から生じる、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記出血は、心臓手術を受けておりかつ血液喪失の低減の必要性のある患者におけるものであり、前記方法は、治療上有効な量の前記組成物を、前記手術の前、最中、または後に投与することを包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記心臓手術は、心肺バイパス手術である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記出血は、外傷性出血性ショックのための処置を受けている患者におけるものである、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物は、マトリクス中に配置される、項目１０～１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記マトリクスは、パッチまたは圧迫包帯である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
配列ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＴＧＰＣＫＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫ（配列番号１）を有する、天然に存在しない単離されたポリペプチド。
（項目２２）
前記ポリペプチドは、ヒト組織因子経路インヒビタータイプ２のＫＤ１の二重変異Ｙ１１Ｔ／Ｌ１７Ｒのみを有する６０残基のポリペプチドバリアントと比較した場合、プラスミンを阻害するにあたって少なくとも３倍大きい効力を有する、項目２１に記載の天然に存在しない単離されたポリペプチド。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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