知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧 ▶ メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチの特許一覧 ▶ ボストン サイエンティフィック サイムド，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-02-28
(45)【発行日】2025-03-10
(54)【発明の名称】塞栓形成のための組成物
(51)【国際特許分類】
A61L 31/12 20060101AFI20250303BHJP
A61L 31/02 20060101ALI20250303BHJP
A61K 33/00 20060101ALI20250303BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20250303BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250303BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20250303BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250303BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20250303BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20250303BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20250303BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20250303BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20250303BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250303BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20250303BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20250303BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20250303BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20250303BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20250303BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20250303BHJP
A61L 31/16 20060101ALI20250303BHJP
A61L 31/18 20060101ALI20250303BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20250303BHJP
A61K 35/02 20150101ALI20250303BHJP
【ＦＩ】
A61L31/12
A61L31/02
A61K33/00
A61K38/39
A61P9/00
A61P7/04
A61P43/00 105
A61P43/00 107
A61P17/02
A61P17/14
A61P13/02
A61P1/04
A61P9/14
A61P35/00
A61P1/16
A61P15/00
A61P13/08
A61P13/12
A61P17/00
A61P1/18
A61L31/16
A61L31/18
A61K49/00
A61K35/02
【請求項の数】
37
(21)【出願番号】P 2023515184
(86)(22)【出願日】2021-09-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-27
(86)【国際出願番号】 US2021048821
(87)【国際公開番号】W WO2022055785
(87)【国際公開日】2022-03-17
【審査請求日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】63/075,598
(32)【優先日】2020-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(73)【特許権者】
【識別番号】501083115
【氏名又は名称】メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ
(73)【特許権者】
【識別番号】506192652
【氏名又は名称】ボストン サイエンティフィック サイムド，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＳＴＯＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＳＣＩＭＥＤ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(72)【発明者】
【氏名】オクル、ラフミ
(72)【発明者】
【氏名】カデムホッセイニ、アリレザ
(72)【発明者】
【氏名】ジャバルザデ、エフサン
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】再公表特許第９８／００３２０３（ＪＰ，Ａ１）
【文献】米国特許第５６１４２０４（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１４４０６８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Journal of Biomaterials Applications，2019年，Vol.33, No.10，pp.1427-1433
【文献】International Society on Thrombosis and Haemostasis，2015年，Vol.13 (Suppl.2)，p.625 PO323-TUE
【文献】Adv. Funct. Mater.，2018年，Vol.28, 1704452，pp.1-9
【文献】Journal of Conservative Dentistry，2013年，Vol.16, No.4，pp.284-293
【文献】Oral Maxillofac Surg，2019年，Vol.23，pp.381-386
【文献】Journal of Oral Implantology，2011年，Vol.37, No.6，pp.681-690
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ １５／００－３３／１８
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）０．１重量％～１０重量％の多血小板フィブリン（ＰＲＦ）又は白血球－ＰＲＦ、及び（ｂ）４重量％～２０重量％の１つ以上のナノクレイ材料を含み、シアシニング組成物である、組成物。
【請求項2】
前記ＰＲＦ及び前記白血球－ＰＲＦを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
０．１重量％～１０重量％の前記ＰＲＦを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
０．１重量％～１０重量％の前記白血球－ＰＲＦを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項5】
０．４～０．８重量％の前記ＰＲＦを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項6】
１．２～１．６重量％の前記ＰＲＦを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項7】
２．２～２．６重量％の前記ＰＲＦを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項8】
５重量％～１５重量％の前記ナノクレイ材料を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
６．４～６．８重量％の前記ナノクレイ材料を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ナノクレイ材料はフィロケイ酸塩ナノクレイである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
放射線不透過性造影剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
０．１重量％～９０重量％の前記放射線不透過性造影剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
１０～４０重量％の前記放射線不透過性造影剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記放射線不透過性造影剤は、エチオ化油、イオヘキソール、ガドブトロール、酸化鉄ナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、酸化マグネシウム粒子、及びタンタル粒子からなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記組成物の粘度は、１０－２１／秒のせん断速度下で低下する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物は、８５ｋＰａ～２００ｋＰａの置換圧を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
哺乳動物内の血管の塞栓形成のための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は前記組成物を前記血管に送達することを含む、組成物。
【請求項18】
哺乳動物内の血管内の血流を減少させる方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は前記組成物を前記血管に送達することを含む、組成物。
【請求項19】
前記血管内の前記血流が１ｍＬ／秒未満に減少する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
哺乳動物内で血液凝固を誘導するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は、前記組成物を前記哺乳動物に送達することにより、送達部位で凝固を誘導することを含む、組成物。
【請求項21】
前記凝固が前記送達後１０分未満で誘発される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記哺乳動物は、抗凝固哺乳動物又は凝固障害哺乳動物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
哺乳動物内でコラーゲン沈着を誘導するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は、前記組成物を前記哺乳動物に送達することにより、送達部位でコラーゲン沈着を誘導することを含む、組成物。
【請求項24】
哺乳動物内で血管新生を誘導するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は、前記組成物を前記哺乳動物に送達することにより、送達部位で血管新生を誘導することを含む、組成物。
【請求項25】
哺乳動物内で細胞増殖を誘導するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は、前記組成物を前記哺乳動物に送達することにより、送達部位で細胞増殖を誘導することを含む、組成物。
【請求項26】
哺乳動物内の創傷を治療するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は前記組成物を前記創傷に送達することを含む、組成物。
【請求項27】
前記創傷は皮膚創傷である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記創傷は、潰瘍、褥瘡、外科的皮膚創傷、火傷、及び脱毛症からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項29】
出血性疾患を有する哺乳動物を治療するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は前記組成物を前記哺乳動物に送達することを含む、組成物。
【請求項30】
前記出血性疾患は、非外傷性出血、外傷性出血、破裂した動脈瘤、嚢状動脈瘤、尿道皮膚瘻、動静脈瘻、腸皮膚瘻、及び腸管瘻からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
腫瘍を有する哺乳動物を治療するための方法に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は、前記腫瘍に栄養を与えている前記哺乳動物内の血管に前記組成物を送達することを含む、組成物。
【請求項32】
前記腫瘍は良性腫瘍である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記腫瘍は悪性腫瘍である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項34】
前記腫瘍は、肝腫瘍、子宮筋腫、良性前立腺肥大症、前立腺腫瘍、腎腫瘍、乳がん腫瘍、黒色腫、胃がん腫瘍、及び膵臓がん腫瘍からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項35】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１７～３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
前記送達はカテーテル誘導送達を含む、請求項１７～３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項37】
前記送達は、１ｃｃ～１０ｃｃの前記組成物を含む、請求項１７～３６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦資金に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＨＬ１４０９５１及びＨＬ１３７１９３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＨＬ１４０９５１及びＨＬ１３７１９３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【0002】
技術分野
本開示は、１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成のための方法及び材料に関する。例えば、本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成のためのバイオマテリアル組成物（例えば、血液由来塞栓物質（ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｍｂｏｌｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ：ＢＥＭ）組成物）を提供する。
本開示は、１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成のための方法及び材料に関する。例えば、本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成のためのバイオマテリアル組成物（例えば、血液由来塞栓物質（ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｍｂｏｌｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ：ＢＥＭ）組成物）を提供する。
【背景技術】
【0003】
背景情報
１９７０年代初頭、インターベンショナルラジオロジストであるＣｈａｒｌｅｓ Ｄｏｔｔｅｒは、患者自身の血液に由来する血塊を使用して、急性に出血している胃の動脈を治療するためのカテーテル誘導塞栓術を初めて実施した（非特許文献１；非特許文献２；及び非特許文献３）。しかし、自然血栓溶解により数時間から数日以内に再疎通が起こり、再出血が生じるため、塞栓用の自己血塊はすぐに断念された。現在は、出血している動脈を塞栓するために、カテーテルを通して金属製のコイルを、動脈内のコイルの塊が流血を遅らせ、凝固させるまで繰り返し押し込んでいる。しかし、これらのコイルには多くの欠点がある。例えば、抗凝固患者又は凝固障害のある患者では効果が限られていること、隣接する軟部組織の評価を制限する重大な画像アーチファクトが生成されること、配置されると、それらは回収できるように設計されておらず、費用対効果が高くないことである（非特許文献４；非特許文献５；及び非特許文献６）。例えば、動脈瘤を塞栓するために、多くのコイルが使用されることがよくある。実際、ある研究では、動脈瘤の塞栓術の費用が１５万ドルを超える可能性があり、医療に大きな費用負担を課していることが示された（非特許文献７）。
１９７０年代初頭、インターベンショナルラジオロジストであるＣｈａｒｌｅｓ Ｄｏｔｔｅｒは、患者自身の血液に由来する血塊を使用して、急性に出血している胃の動脈を治療するためのカテーテル誘導塞栓術を初めて実施した（非特許文献１；非特許文献２；及び非特許文献３）。しかし、自然血栓溶解により数時間から数日以内に再疎通が起こり、再出血が生じるため、塞栓用の自己血塊はすぐに断念された。現在は、出血している動脈を塞栓するために、カテーテルを通して金属製のコイルを、動脈内のコイルの塊が流血を遅らせ、凝固させるまで繰り返し押し込んでいる。しかし、これらのコイルには多くの欠点がある。例えば、抗凝固患者又は凝固障害のある患者では効果が限られていること、隣接する軟部組織の評価を制限する重大な画像アーチファクトが生成されること、配置されると、それらは回収できるように設計されておらず、費用対効果が高くないことである（非特許文献４；非特許文献５；及び非特許文献６）。例えば、動脈瘤を塞栓するために、多くのコイルが使用されることがよくある。実際、ある研究では、動脈瘤の塞栓術の費用が１５万ドルを超える可能性があり、医療に大きな費用負担を課していることが示された（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｌｕｂａｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．Ｒａｄｉｏｌ．，２６：３５２（２００９）
【文献】Ｐｏｕｒｓａｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２４０：４１４（２０１６）
【文献】Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，３１：ｅｌ９０１０７１（２０１９）
【文献】Ｂｕｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｕｒａｌ Ｐｒａｃｔ．，５：１０９（２０１４）
【文献】Ｓｏｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｕｒａｌ Ｐｒａｃｔ．，５：１１８（２０１４）
【文献】Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，３１：ｅｌ８０５４５２（２０１９）
【文献】Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｔｅｒｖ．Ｓｕｒｇ．，２：１６３（２０１０）
【発明の概要】
【0005】
本開示は、１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成のための方法及び材料を提供する。例えば、本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成（例えば、可逆的塞栓形成）のための組成物（例えば、ＢＥＭ組成物などのバイオマテリアル組成物）を提供する。
【0006】
本明細書で実証されるように、バイオマテリアル組成物（例えば、多血小板フィブリン（ＰＲＦ）（及び／又は多白血球及び多血小板フィブリン（白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物））は、腎動脈や腸骨動脈などの一次動脈の塞栓術を達成するために、臨床カテーテルを使用して迅速に調製及び送達され得る。また、本明細書で実証されるように、放射線不透過性ＢＥＭ組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）、１つ以上のナノクレイ材料、及びエチオ化油などの１つ以上の放射線不透過性薬剤を含むＢＥＭ組成物）を使用する塞栓術を哺乳動物（例えば、ヒト）患者に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで可視化することができる。
【0007】
ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物を送達することにより、哺乳動物（例えば、ヒト）の血管内で塞栓形成を行う性能を有することは、哺乳動物内の１つ以上の血管の止血を安全かつ迅速に達成するための特有かつまだ実現されていない機会を提供する。例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物は、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）及び／又は創傷などの出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）を治療するために使用することができる。例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含む、塞栓形成のために本明細書で提供されるＢＥＭ組成物を送達するために臨床カテーテルを使用することは、ポイントオブケアで（例えば、患者自身の血液を使用して）調製することができ、かつ効率的、効果的、安全、及び／又は費用対効果が高い。
【0008】
さらに、哺乳動物（例えば、ヒト）に送達された、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）、１つ以上のナノクレイ材料、及び１つ以上の造影剤（例えば、放射線不透過性造影剤）を含むＢＥＭ組成物を視覚化する性能を有することは、哺乳動物内のＢＥＭ組成物の位置及び有効性をモニタリングするための特有かつまだ実現されていない機会を提供する。
【0009】
総じて、本開示の一態様は、（ａ）多血小板フィブリン（ＰＲＦ）又は白血球－ＰＲＦ、及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を特徴とする。組成物は、ＰＲＦ及び白血球－ＰＲＦを含み得る。組成物は、約０．１重量％～約９０重量％のＰＲＦを含み得る。組成物は、約０．１重量％～約９０重量％の白血球－ＰＲＦを含み得る。組成物は、約０．４～約０．８重量％のＰＲＦを含み得る。組成物は、約１．２～約１．６重量％のＰＲＦを含み得る。組成物は、約２．２～約２．６重量％のＰＲＦを含み得る。組成物は、約０．５重量％～約９０重量％のナノクレイ材料を含み得る。約６．４～約６．８重量％のナノクレイ材料を含み得る。ナノクレイ材料はケイ酸塩ナノクレイであり得る。組成物は、放射線不透過性造影剤も含み得る。組成物は、約０．１重量％～約９０重量％の放射線不透過性造影剤を含み得る。組成物は、約１０～約４０重量％の放射線不透過性造影剤を含み得る。放射線不透過性造影剤は、エチオ化油、イオヘキソール、ガドブトロール、酸化鉄ナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、酸化マグネシウム粒子、又はタンタル粒子であり得る。組成物の粘度は、約１０－２１／秒のせん断速度下で低下し得る。組成物は、約８５ｋＰａ～約２００ｋＰａの置換圧を有し得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0010】
別の態様において、本開示は、哺乳動物内の血管の塞栓形成のための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物内の血管に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0011】
別の態様では、本開示は、哺乳動物内の血管内の血流を減少させる方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物内の血管に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得る。血管内の血流は、約１ｍＬ／秒未満に減少させることができる。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0012】
別の態様において、本開示は、哺乳動物内で血液凝固を誘導するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得、組成物は送達部位で凝固を誘導するのに有効であり得る。凝固は、送達後約１０分未満で誘発され得る。哺乳動物は、抗凝固哺乳動物又は凝固障害哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0013】
別の態様において、本開示は、哺乳動物内でコラーゲン沈着を誘導するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得、組成物は送達部位でコラーゲン沈着を誘導するのに有効であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0014】
別の態様において、本開示は、哺乳動物内で血管新生を誘導するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得、組成物は送達部位で血管新生を誘導するのに有効であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0015】
別の態様において、本開示は、哺乳動物内で細胞増殖を誘導するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得、組成物は送達部位で細胞増殖を誘導するのに有効であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0016】
別の態様において、本開示は、哺乳動物内の創傷を治療するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物内の創傷に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得る。創傷は皮膚創傷であり得る。創傷は、潰瘍、褥瘡、外科的皮膚創傷、火傷、又は脱毛症であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0017】
別の態様において、本開示は、出血性疾患を有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物に送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得る。出血性疾患は、非外傷性出血、外傷性出血、破裂した動脈瘤、嚢状動脈瘤、尿道皮膚瘻、動静脈瘻、腸皮膚瘻、又は腸管瘻であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0018】
別の態様において、本開示は、腫瘍を有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物内の腫瘍に栄養を与えている哺乳動物内の血管に、（ａ）ＰＲＦ又は白血球－ＰＲＦ及び（ｂ）１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を送達することを含むか、又は本質的にそれからなるものであり得る。腫瘍は良性腫瘍であり得る。腫瘍は悪性腫瘍であり得る。腫瘍は、肝腫瘍、子宮筋腫、良性前立腺肥大症、前立腺腫瘍、腎腫瘍、乳がん腫瘍、黒色腫、胃がん腫瘍、又は膵臓がん腫瘍であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。送達は、カテーテル誘導送達であり得る。送達は、約１ｃｃ～約１０ｃｃの組成物を含み得る。
【0019】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を使用して本発明を実施することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示のみを目的とし、限定を意図するものではない。
【0020】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】経動脈塞栓術のための例示的な血液由来塞栓物質（ＢＥＭ）の製造。模式図は、２種類のＢＥＭのコンポーネントを示す。選択的処置の場合、ＰＲＦは、４℃で長期保存するために凍結乾燥された血液から得ることができる。血管内処置が必要な場合、ＰＲＦをナノクレイと混合してＢＥＭを作成できる。応急処置又は救急処置では、精製ＰＲＦをナノクレイと混合することで、ポイントオブケアＢＥＭを作成できる。この形態では、迅速に調製してすぐに使用することができる（例えば、腎動脈又は腸骨動脈を塞栓するために）。
【図2】図２Ａ～２Ｌは、ＢＥＭの特性評価。（図２Ａ）凍結乾燥ＰＲＦ（Ｌ－ＰＲＦ）、ＮＣ、及びＢＥＭの代表的なＳＥＭ画像と、それぞれの全体的な外観。（図２Ｂ）シアシニング特性を明らかにするＮＣ及びＢＥＭの流動曲線。（図２Ｃ）低ひずみと高ひずみの振動下でのゲルの回復性を示すチキソトロピー試験。（図２Ｄ）振幅スイープから得られたゲルの貯蔵弾性率Ｇ’の概要（ｎ＝３）。（図２Ｅ）５Ｆカテーテルを介してＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯによって生成された注入力の概要（ｎ＝３）。（図２Ｆ）血管閉塞モデル（ｎ＝３）でＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯを変位させるために必要な平均圧力のグラフによる概要。黒い点線は生理的圧力（１２０ｍｍＨｇ）を示す。挿入図は、代表的な変位圧力曲線を示す。（図２Ｇ）ＰＲＦ、Ｌ－ＰＲＦ、ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯ抽出物と２４時間インキュベーションした後のＬ－９２９細胞の相対生存率を示すグラフ（ｎ＝１２）。（図２Ｈ）接種後２４時間でも１週間でもＢＥＭ－ＥＯに細菌の増殖がないことを示す、６００ｎｍでの光学密度に基づく無菌試験の概要。ＬＢブロス単独及び大腸菌を接種したＬＢブロスを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。（図２Ｉ）血液単独と比較して、血液と接触したＢＥＭ－ＥＯのΔＧ’の増強を示すレオロジー研究。（図２Ｊ）血液がＢＥＭ－ＥＯ及び臨床的に使用されるコイル繊維と接触した場合に凝固が促進されることを示す血液凝固研究の画像。（図２Ｋ）様々な濃度のエチオ化油を含有するＢＥＭ－ＥＯ装填シリンジの蛍光透視画像。（図２Ｌ）Ｐｅｎｕｍｂｒａシステムを使用した、ＢＥＭ－ＥＯの完全な除去を示す、３Ｄプリントされた動脈モデルにおけるＢＥＭ－ＥＯ回復試験の画像。ｐ値はテューキーの多重比較を使用した二元配置分散分析によって決定した。ｎｓ、有意差なし、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。データは平均±ＳＥＭとして表されている。
【図3】図３Ａ～３Ｇは、ラットの背部へのＮＣ又はＢＥＭ－ＥＯの皮下移植後の組織学的反応の評価。（図３Ａ）移植後３、１４、又は２８日のＮＣ又はＢＥＭ－ＥＯ注射部位のＨ＆Ｅ染色皮膚組織切片の顕微鏡写真（矢じり印は注射されたバイオマテリアルを指し、矢印は浸潤細胞を示す）。（図３Ｂ）注射後１４日目にＮＣと比べてＢＥＭ－ＥＯ処理部位で著しく高い細胞浸潤を示す、組織切片のバイオマテリアル領域内の平均細胞数の概要。（図３Ｃ）移植後３、１４、又は２８日のＮＣ又はＢＥＭ－ＥＯ注射部位のマッソントリクローム染色皮膚組織切片の組織像（点線は線維性被膜の厚さを示し、黒線は細胞浸潤の領域を示す）。（図３Ｄ）注射後Ｄ１４でのＮＣと比較して、ＢＥＭ－ＥＯ処理部位の細胞浸潤層が厚いことを示すグラフ。（図３Ｅ）（図３Ｃ）において点線でマークされたように、注射後Ｄ２８でのＢＥＭ－ＥＯにおける注射されたバイオマテリアルの周りの線維性被膜層を示す形態計測分析。（図３Ｆ及び図３Ｇ）Ｄ３でＮＣと比較してＢＥＭ－ＥＯにおいて体積が大きく、Ｄ３のＢＥＭ－ＥＯと比較して２８日までにＢＥＭ－ＥＯ体積が減少したことを示す、再構成されたマイクロＣＴ画像と注射されたバイオマテリアルの量のボリューム分析。スケールバーはマイクロＣＴ画像では２ｍｍ、組織像では１５０μｍ。ｐ値はテューキーの多重比較を使用した分散分析によって決定した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表される。
【図4】図４Ａ～４Ｐは、ブタにおけるＢＥＭ－ＥＯを使用した腸骨動脈及び腎動脈のカテーテル誘導塞栓術。（図４Ａ）内腸骨動脈（ＩＩＡ）の開存性を示す塞栓術前の血管造影（白い矢印）。（図４Ｂ）塞栓術後のＩＩＡ（白い矢印）におけるＢＥＭ－ＥＯのシングルショットＸ線透視画像。（図４Ｃ）ＩＩＡの閉塞（白い矢印）を確認する塞栓術後のＤＳＡ。（図４Ｄ）塞栓されたＩＩＡの体軸方向コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像。白い矢印はＢＥＭ－ＥＯを示す。（図４Ｅ）遠位大動脈及び腸骨動脈の３Ｄ再構成ＣＴＡ画像。ＩＩＡ（白い矢印）をキャストした明るいＢＥＭ－ＥＯと塞栓された腸骨動脈。（図４Ｆ）塞栓術後１時間及び２週間の、ＢＥＭ－ＥＯで閉塞されたＩＩＡの染色された組織学的断面の顕微鏡写真。２週間の生存群、動脈壁内に破壊されたエラスチンを伴う広範な同心円状の線維炎症反応（黒い矢印）。（図４Ｇ）エラスチン染色された組織切片で評価された動脈壁の中膜の厚さの形態計測分析。（図４Ｈ）ＰＣＮＡ陽性細胞数の概要は、塞栓術の２週間後に有意な増加を示している。（図４Ｉ）開存性腎動脈分節枝（矢印）を示す塞栓術前の血管造影。（図４Ｊ）塞栓術後の腎動脈におけるＢＥＭ－ＥＯを示す蛍光透視画像（矢印）。（図４Ｋ）ＢＥＭ－ＥＯによる腎動脈の完全閉塞（矢印間）を示す塞栓術後のデジタルサブトラクション血管造影。（図４Ｌ及び図４Ｍ）動脈内における画像アーチファクトのない可視ＢＥＭ－ＥＯ（白い矢印）を示す、塞栓された腎臓の体軸方向ＣＴ画像及び３ＤレンダリングＣＴ画像。（４Ｎ及び図４Ｏ）塞栓術後１時間及び２週間のブタ腎臓のマイクロＣＴ、全体図、及び組織像であり、マイクロＣＴには腎動脈におけるＢＥＭ－ＥＯが示されている（白い矢印）。染色された組織学的画像は、塞栓術後１時間及び２週間にＢＥＭ－ＥＯで満たされた動脈枝（黒い輪郭の領域）を示し、壊死した尿細管細胞が塞栓術後２週間で観察される（黒い矢印）。（図４Ｐ）対照腎臓と比較した、腎動脈塞栓術後２週間のブタ腎臓の３ＤレンダリングＣＴスキャンの体積分析。スケールバーは、組織像では１５０μｍ、全体図画像では１ｃｍ。対応のないｔ検定によって決定されたｐ値、＊ｐ≦０．０５、ｎｓ、有意差なし。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表されている。
【図5】図５Ａ～５Ｅは、マイクロＣＴを用いたＢＥＭ－ＥＯの経時的な構造変化の評価。（図５Ａ）ＢＥＭ－ＥＯによる塞栓術後１時間及び２週間の腸骨動脈のマイクロＣＴスキャン及び対応する組織学的画像の３Ｄレンダリング。これらの画像は、経時的な形態学的変化を示している。非生存１時間群は均一に閉塞した動脈を示し、２週間群ではこれが進行して断片化し、介入する非増強領域は線維性組織に置き換えられた。標本Ｐ４とＰ８の点線は、体軸方向マイクロＣＴ画像及び対応するＨ＆Ｅ画像が取得された位置を表す。スケールバーは２．５ｍｍ。（図５Ｂ）ＢＥＭ－ＥＯの３Ｄ総体積は、セグメンテーションソフトウェアを使用して、塞栓された腸骨動脈のマイクロＣＴスキャンから計算された。これらのデータは、バイオマテリアルの体積が２週間で６３％減少したことを示している。（図５Ｃ）３７℃で０、３、７、１４、及び７０日間保存されたチューブ内のＢＥＭ－ＥＯの一連のスキャンは、経時的に低密度病巣の一貫した分散を示す（矢印は時間の経過とともに同様の領域を示す）。スケールバーは２．５ｍｍ。（図５Ｄ及び図５Ｅ）模式図に見られるように、各チューブの５つの階層から得られたチューブに装填されたＢＥＭ－ＥＯの低密度病巣及び放射線密度の経時的測定。各チューブを５つの区分に分け、各区分に対して測定を行い、経時的な有意差は示されなかった。これは、ＢＥＭ－ＥＯが安定しており、時間の経過とともに成分への相分離が発生しないことを示唆している。スチューデントのｔ検定を使用してＢＥＭ－ＥＯ体積の差を計算し、テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマイクロＣＴの経時的変化を評価した。＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓ、有意差なし。データは平均±ＳＥＭとして表されている。
【図6】図６Ａ～６Ｈは、ポイントオブケア血液由来塞栓物質（ｐｏｃＢＥＭ）の製造及び特徴解析。（図６Ａ）３匹の異なるブタから得られた、新たに調製されたＰＲＦで測定されたＰＤＧＦ－Ｂレベルを示すグラフ。（図６Ｂ）類似の粘度プロファイルを示す５匹の異なるブタからのｐｏｃＢＥＭのせん断速度スイープ。（図６Ｃ）１０ｒａｄｓ－１で実行された振幅スイープに対して決定された異なるｐｏｃＢＥＭのＧ’を示すグラフ（破線は、すべてのｐｏｃＢＥＭにおける１５６８５Ｐａの平均Ｇ’を示す）。（図６Ｄ）すべてのｐｏｃＢＥＭ製剤の優れた回復性を示すチキソトロピー試験。（図６Ｅ）平均力３０Ｎ（破線）でのｐｏｃＢＥＭの注入性を示す圧縮試験。（図６Ｆ）無菌条件下で調製したｐｏｃＢＥＭを接種してから１日後及び１週間後に得られたＯＤ６００測定値は、細菌の増殖を示さない。（図６Ｇ）血液単独と比較して、血液がｐｏｃＢＥＭと接触している場合のΔＧ’の急速な増加を示すレオロジー研究。（図６Ｈ）血液単独と比較して加速された凝固時間を示すｐｏｃＢＥＭの血栓形成能の代表的な試験。ｐ値はテューキーの多重比較を使用した二元配置分散分析によって決定した。ｎｓ、有意差なし、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。データは平均±ＳＥＭとして表されている。
【図7】図７Ａ～７Ｌは、ブタでのｐｏｃＢＥＭを使用した、経カテーテル動脈塞栓術、回収、及び失敗した塞栓のコイルによるレスキュー。（図７Ａ）開存性内腸骨動脈（ＩＩＡ）を示すブタの腸骨動脈の血管造影図。（図７Ｂ）完全な閉塞を示す、ｐｏｃＢＥＭを使用した右ＩＩＡ（ＲＩＩＡ）の塞栓術後のデジタルサブトラクション血管造影（ＤＳＡ）。（図７Ｃ）両方のＩＩＡへの血流の中断を示す、ｐｏｃＢＥＭを使用した両方のＩＩＡの塞栓術後のＤＳＡ。（図７Ｄ）冠状面及び横断面の塞栓されたＩＩＡのマイクロＣＴ画像（破線は横断面の位置を示す）。ｐｏｃＢＥＭは、ＲＩＩＡ及びＬＩＩＡを画像アーチファクトなく完全に充填する。（図７Ｅ）腸骨動脈への正常な血流を示す血管造影画像。（図７Ｆ）ＬＩＩＡのコイル塞栓術後の血管造影画像は、抗凝固処置を施したブタの血流を停止できなかったことを示す。（図７Ｇ）血管造影画像は、Ｆでの失敗したコイル塞栓のレスキューの後に完全な閉塞をもたらしたカテーテルを介したｐｏｃＢＥＭ注入を示す。（図７Ｈ）Ｐｅｎｕｍｂｒａ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎシステムを使用したｐｏｃＢＥＭ回収後のＩＩＡ内のコイルを通る正常な血流を示すＬＩＩＡの血管造影画像。（図７Ｉ）コイル塞栓術及びｐｏｃＢＥＭの回収が行われたＬＩＩＡの冠状及び体軸方向のマイクロＣＴ画像（破線は、下の対応する体軸方向断面を示している）は、コイルに起因する広範なストリークアーチファクトを示す。ＬＩＩＡは不透明化を示さず、ｐｏｃＢＥＭの吸引の成功を示唆する。（図７Ｊ）右の模式図に示すように、抗凝固処理されたブタでのコイルによる腎動脈塞栓術の失敗を示す血管造影画像。（図７Ｋ）Ｊの失敗したコイル塞栓術は、ｐｏｃＢＥＭで正常に塞栓され、ここでは腎臓への血流がない。（図７Ｌ）ｐｏｃＢＥＭが、重大なストリークアーチファクトをもたらすコイル塊の近位の腎動脈を満たしていることを示す、塞栓された腎臓のマイクロＣＴ画像。
【図8】図８Ａ～８Ｃは、ＰＲＦの調製。（図８Ａ）ガラス管での遠心分離後の上相のＰＲＦを示すブタ血液アリコートの画像。（図８Ｂ及び図８Ｃ）全血からの４３±５．３重量％のＰＲＦの重量収率、及びＰＲＦ調製物からの７．３±０．８４重量％のＬ－ＰＲＦの重量収率を示すプロット。
【図9】図９Ａ～９Ｇは、ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析。（図９Ａ）３匹の異なるブタからのＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像、及び同様のタンパク質画分を示すプールされたＬ－ＰＲＦサンプル。（図９Ｂ）ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦにおけるＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ－Ｂ、及びＴＧＦ－βタンパク質のウエスタンブロット検出。（図９Ｃ及び図９Ｄ）３つのＬ－ＰＲＦ調製物におけるＰＤＧＦ－Ｂ及びＶＥＧＦ－Ａタンパク質レベルの定量分析。（図９Ｅ）対照と比較して、ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦ処理細胞における細胞増殖の増強を示す、１日目及び３日目のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ－９２９細胞増殖に対するＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦの効果（ｎ＝８）。（図９Ｆ）Ｌ９２９細胞を無血清培地（対照）、ＰＲＦ、及びＬ－ＰＲＦと共にインキュベートして１日後に得られたｉｎ ｖｉｔｒｏスクラッチアッセイの代表的な画像。（図９Ｇ）陰性対照と比較して、ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦ処理細胞における細胞遊走の増強を示す、Ｌ－９２９遊走に対するＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦの効果（ｎ＝６）。ｐ値はテューキーの多重比較を使用した一元配置分散分析によって決定した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。データは平均±ＳＥＭとして表されている。
【図10】ＮＣ、Ｌ－ＰＲＦ、及びＢＥＭのＳＥＭ画像。ＮＣの層状構造、Ｌ－ＰＲＦのハニカム状構造、及びＢＥＭの多孔質構造を示す異なる倍率のＳＥＭ画像。
【図11】図１１Ａ～１１Ｅは、ＢＥＭ－ＥＯ特性評価。（図１１Ａ）ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯアリコートの全体的な外観。ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの蛍光透視画像は、ＢＥＭ－ＥＯシリンジでの顕著なＸ線増強を示す。（図１１Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用するＢＥＭ又はＢＥＭ－ＥＯを装填したシリンジ。（図１１Ｃ）シアシニング特性を明らかにするＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの流動曲線。（図１１Ｄ）振幅スイープから得られたバイオマテリアルの貯蔵弾性率Ｇ’の概要（ｎ＝３）。（図１１Ｅ）変位圧力測定システムの模式図。データは平均±ＳＥＭとして表されている。
【図12】ＢＥＭ－ＥＯ無菌アッセイのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。ミューラーヒントン寒天プレートの全体図画像は、ＬＢブロスに可溶化したＢＥＭ－ＥＯの接種７日後に、大腸菌陽性対照と比較して細菌の増殖がないことを示している。
【図13】ラットの背部への生理食塩水、ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの皮下注射。各ラットは、生理食塩水、ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯのそれぞれの２００μＬの皮下注射を４回受けた（ｎ＝４、各群）。
【図14-1】図１４Ａ～１４Ｅは、ラット背部に皮下注射されたＢＥＭの形態計測分析。（図１４Ａ）代表的なＨ＆Ｅ、又はマッソントリクローム染色された組織切片、及びＢＥＭの注射後３、１４、又は２８日で外植された皮膚組織から得られたマイクロＣＴ画像（矢じり印及び破線の領域は、注入されたバイオマテリアルを示す。矢印は、組織切片における浸潤細胞を示す）。（図１４Ｂ）ＮＣと比較して、ＢＥＭ及びＢＥＭ－ＥＯにおいてＤ１４でピークに達する浸潤細胞数の増加を示す、組織切片におけるＢＥＭゾーン内の平均細胞数の概要。（図１４Ｃ）マッソントリクローム染色切片で測定された細胞浸潤層の厚さ（線維芽細胞が豊富なゾーン）を示すグラフ。（図１４Ｄ）バイオマテリアル及び周囲の組織を取り囲む線維性被膜の厚さの概要。（図１４Ｅ）Ｄ２８でのＢＥＭ及びＢＥＭ－ＥＯ体積の減少を示す、注入されたバイオマテリアルのマイクロＣＴ体積分析を示すグラフ。スケールバーは、マイクロＣＴ画像では２ｍｍ、組織像では１５０μｍ。ｐ値はテューキーの多重比較を使用した分散分析によって決定した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表される。
【図14-2】同上。
【図15-1】図１５Ａ～１５Ｄは、バイオマテリアル移植後のラット皮下組織における細胞増殖及び血管新生の評価。（図１５Ａ）ＮＣ、ＢＥＭ、ＢＥＭ－ＥＯの皮下注射後３、１４、及び２８日目に得られたＰＣＮＡ免疫染色ラット皮膚切片の代表的な画像。増殖中の細胞を茶色に可視化している（黒い矢印）。（図１５Ｂ）１４日目及び２８日目に、ＮＣと比較してＢＥＭで増殖中の細胞数が多いことを示すＰＣＮＡ陽性細胞数の概要。（図１５Ｃ）ＮＣ、ＢＥＭ、又はＢＥＭ－ＥＯの皮下注射後３、１４、及び２８日目に得られたＣＤ３１免疫染色ラット皮膚切片の代表的な画像。血管を可視化している（黒い矢印）。（図１５Ｄ）ＮＣと比較してＢＥＭ及びＢＥＭ－ＥＯでの血管新生の増強を示す、Ｄ２８でのＣＤ３１陽性血管数の概要。スケールバーは１５０μｍ。統計分析は、テューキーの多重比較を使用した二元配置分散分析によって計算した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【図15-2】同上。
【図16】ＢＥＭ－ＥＯによるブタ内腸骨動脈塞栓術。４匹のブタのベースライン時と、ＢＥＭ－ＥＯによる塞栓術後の内腸骨動脈を示す蛍光透視画像。塞栓術の前に、腸骨動脈（白い矢印）の開存性がＤＳＡによって示される。塞栓後、ＤＳＡは塞栓された腸骨動脈（２つの矢印の間）に血流がないことを示す。ＢＥＭ－ＥＯは、シングルショット蛍光透視画像の塞栓後に容易に検出できる（白い矢印）。ＢＥＭ－ＥＯが塞栓術の２週間後にＩＩＡをキャストしていることを示す（白い矢印）コンピュータ断層撮影血管造影画像のパネル。
【図17】ブタの塞栓術から２週間後の全身ＣＴ画像。４匹のブタの脳、肝臓、脾臓、後肢、及び肺のＣＴスキャンのパネルが示されている（破線）。すべての組織において異常は見られなかった。白い矢印は、両方の後肢の動脈の正常な流出を示す。
【図18】図１８Ａ～１８Ｄは、ＢＥＭ－ＥＯによる塞栓術の２週間後の内腸骨動脈（ＩＩＡ）の組織学的評価。（図１８Ａ及び図１８Ｂ）Ｈ＆Ｅ染色ＩＩＡ断面は、管腔領域（ブラケット）の約４０％を占める同心円状の炎症反応ゾーンと共に、ＢＥＭ－ＥＯによる動脈管腔の完全なキャスティングを示している。（図１８Ｃ）非常に豊富なマクロファージの存在下で出現する脂肪滴（黒い矢印）を示す、同心円ゾーンから得られた高倍率の組織切片。（図１８Ｄ）散在する多核巨細胞（黒い矢印）を示す、同心円ゾーンから得られた高倍率の組織像。スケールバーは１００μｍ。
【図19】ＢＥＭ－ＥＯによるブタ腎動脈塞栓術。４匹のブタのベースライン（塞栓術前）時と、ＢＥＭ－ＥＯによる塞栓後の完全な閉塞時の腎動脈を示す蛍光透視画像のパネル。４匹のブタにおいて持続する閉塞（白い矢印）を示す、ＢＥＭ－ＥＯによる腎動脈塞栓術の２週間後に得られたコンピュータ断層撮影血管造影画像。塞栓後、ＤＳＡは塞栓された腎動脈と腎臓において血流がないことを示す。シングルショット蛍光透視画像及び体軸方向ＣＴＡでは、ＢＥＭ－ＥＯは容易に検出できる（白い矢印）。
【図20】図２０Ａ～２０Ｈは、ＢＥＭ－ＥＯで塞栓された腎実質の組織像。（図２０Ａ）塞栓術の１時間後に得られた腎実質のＨ＆Ｅ染色組織切片（挿入図は、高倍率画像が撮影された場所を示す）。（図２０Ｂ）正常な腎実質を示す組織像。（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）トリクローム染色切片の塞栓された分節動脈（黒い矢印）を示す高倍率組織像。（図２０Ｅ）腎動脈塞栓術の２週間後に得られた腎実質のＨ＆Ｅ組織像。（図２０Ｆ、図２０Ｇ、図２０Ｈ）黒い四角で囲まれた領域の高倍率組織像は、閉塞した腎実質のびまん性壊死と、トリクローム染色画像の線維性分節腎動脈を示す（矢印）。Ａ及びＥにおけるスケールバーは１ｍｍである。
【図21】図２１Ａ～２１Ｃは、ｐｏｃＢＥＭの微細構造。（図２１Ａ）ｐｏｃＢＥＭ構造の模式図。（図２１Ｂ）ｐｏｃＢＥＭのＨ＆Ｅ画像は、白血球（白い矢印）及び血小板（黒い矢印）の存在を示す。（図２１Ｃ）ｐｏｃＢＥＭのＳＥＭ画像は、多孔質構造のフィブリン（白い矢印）を示す。
【図22】図２２Ａ～２２Ｉは、ｐｏｃＢＥＭで塞栓された腸骨動脈及び腎動脈の塞栓術後１時間のマイクロＣＴ及び組織像。（図２２Ａ）蛍光透視下の腸骨動脈におけるｐｏｃＢＥＭの可視性。（図２２Ｂ、図２２Ｃ）ｐｏｃＢＥＭで塞栓された腸骨動脈の体軸方向及び冠状方向のマイクロＣＴ画像。（図２２Ｄ、図２２Ｅ）無定形のｐｏｃＢＥＭが動脈管腔を均一に閉塞していることを示す、塞栓された腸骨動脈のＨ＆Ｅ画像。（図２２Ｆ）腎動脈の開存性を示す塞栓術前のＤＳＡ画像。（図２２Ｇ）ｐｏｃＢＥＭを使用した腎動脈塞栓術後、ＤＳＡ画像は、閉塞された腎動脈（白い矢印）、及び腎臓への血流の欠如（白い点線）を示す。（図２２Ｈ）腎動脈及びその分節枝を画像アーチファクトなく充填する高密度ｐｏｃＢＥＭを示す、塞栓された腎臓のマイクロＣＴ画像。（図２２Ｉ）塞栓された腎臓のＨ＆Ｅ画像。高倍率画像は、腎実質の塞栓された動脈を示す。
【図23】図２３Ａ～２３Ｌは、ブタモデルにおける損傷動脈のカテーテル誘導塞栓術による急性出血制御。（図２３Ａ）腎動脈分枝の開存性を示す塞栓術前の血管造影。（図２３Ｂ）２０ｃｍ及び１８Ｇ針を使用した腎損傷後のデジタルサブトラクション血管造影（ＤＳＡ）（黒い矢印）。造影剤の血管外遊出及び仮性動脈瘤（白い矢印）が示されている。（図２３Ｃ）ｐｏｃＢＥＭを使用した腎動脈塞栓後のＤＳＡ（黒い矢印）は、損傷領域（破線領域）に出血がないことを示している。（図２３Ｄ）腎動脈の開存性を示す腎損傷前のＤＳＡ画像。（図２３Ｅ）腎損傷後、ＤＳＡ画像は、造影剤の血管外遊出及び仮性動脈瘤（矢印）を示す。（図２３Ｆ）損傷した腎動脈の塞栓術後の、出血を示さないＤＳＡ（破線領域）。（図２３Ｇ及び図２３Ｈ）損傷後の出血性動脈仮性動脈瘤（矢印）を示す血管造影画像。（図２３Ｉ）ｐｏｃＢＥＭでの塞栓後に出血がないことを示すＤＳＡ画像（矢印）。（図２３Ｊ及び図２３Ｋ）外腸骨動脈枝に針で形成された損傷後の出血性仮性動脈瘤（黒い矢印）を示すＤＳＡ画像。（図２３Ｌ）ｐｏｃＢＥＭによる塞栓後の出血制御を示すＤＳＡ画像（黒い矢印）。
【発明を実施するための形態】
【0022】
詳細な説明
実施形態の説明では、本説明の一部を形成し、本発明の実施となり得る特定の実施形態を例として示す添付の図面を参照することがある。他の実施形態を利用することができ、本発明の範囲から逸脱することなく構造上の変更を行うことができることを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、及びその他の科学用語又は専門用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、明確にするため、及び／又はすぐに参照できるように、一般的に理解されている意味を持つ用語が本明細書で定義されている。本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般的に理解されている定義との実質的な違いを表すものとして必ずしも解釈されるべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び手順の態様の多くは、当業者によって十分に理解され、一般的に使用される。以下の文章は、本発明の様々な実施形態を述べている。
実施形態の説明では、本説明の一部を形成し、本発明の実施となり得る特定の実施形態を例として示す添付の図面を参照することがある。他の実施形態を利用することができ、本発明の範囲から逸脱することなく構造上の変更を行うことができることを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、及びその他の科学用語又は専門用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、明確にするため、及び／又はすぐに参照できるように、一般的に理解されている意味を持つ用語が本明細書で定義されている。本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般的に理解されている定義との実質的な違いを表すものとして必ずしも解釈されるべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び手順の態様の多くは、当業者によって十分に理解され、一般的に使用される。以下の文章は、本発明の様々な実施形態を述べている。
【0023】
本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）の塞栓形成のための方法及び材料を提供する。例えば、本開示は、血管の塞栓形成のために哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管（例えば、１つ以上の動脈）に送達することができる組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料）を含むＢＥＭ組成物などのバイオマテリアル組成物）を提供する。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、バイオマテリアル組成物）は、血管内で血栓（例えば、人工塞栓）の形成を誘導するために哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達されることができる。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、バイオマテリアル組成物）は、血管内に塞栓（例えば、人工塞栓）を形成するために哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達されることができる。別の態様では、本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の１つ以上の創傷（例えば、皮膚の創傷、粘膜の創傷及び／又は胃腸創傷）に、その創傷を治療するため（例えば、創傷治癒を促進するため）に送達することができる組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物などのバイオマテリアル組成物）を提供する。
【0024】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＢＥＭ組成物）は、ＰＲＦ及び１つ以上のナノクレイ材料を含み得る。当技術分野で知られているように、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ナノクレイなどのナノクレイ材料は、ナノ細孔を有するナノサイズのケイ酸塩粒子である。これらの粘土は、以下の４つの主要なグループ：カオリナイトグループ（ゼオライト又はハロイサイト）、モンモリロナイト／スメクタイトグループ、イライトグループ、及びクロライトグループに分類できる（例えば、Ｇａｈａｒｗａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１９年６月；３１（２３）：ｅ１９００３３２；Ｅｒｅｚｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ．２０２１年８月；１０（１６）：ｅ２１００２１７；Ｖｉｌｌａｌｂａ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｌｓ．２０２１年５月１４日；７（２）：５９．ｄｏｉ：１０．３３９；及び米国特許出願公開第２０１８００７１４４６号及び第２０２００３９０８０４号を参照。これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。場合によっては、本明細書で提供される組成物は無菌であり得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は抗菌活性を有することができる。場合によっては、本明細書で提供される組成物は生物活性であり得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、１つ以上の治療薬を含むように設計することができる。
【0025】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＢＥＭ組成物）は、任意の適切な量のバイオマテリアル（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料）を含むように設計することができる。例えば、本明細書で提供される組成物は、約０．１％（重量％）～約９０％（重量％）のバイオマテリアル（例えば、約０．１重量％～約８０重量％、約０．１重量％～約７０重量％、約０．１重量％～約６０重量％、約０．１重量％～約５０重量％、約０．１重量％～約４０重量％、約０．１重量％～約３０重量％、約０．１重量％～約２０重量％、約０．１重量％～約１０重量％、約１重量％～約９０重量％、約５重量％～約９０重量％、約１０重量％～約９０重量％、約２０重量％～約９０重量％、約３０重量％～約９０重量％、約４０重量％～約９０重量％、約５０重量％～約９０重量％、約６０重量％～約９０重量％、約７０重量％～約９０重量％、約８０重量％～約９０重量％、約０．５重量％～約８０重量％、約１重量％～約７０重量％、約２重量％～約６０重量％、約３重量％～約５０重量％、約４重量％～約４０重量％、約５重量％～約３０重量％、約６重量％～約２０重量％、約７重量％～約１０重量％、約０．５重量％～約５重量％、約１重量％～約１０重量％、約２重量％～約１２重量％、約３重量％～約１５重量％、約４重量％～約２０重量％、又は約５重量％～約２５重量％のバイオマテリアル）を含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約７．２重量％のバイオマテリアルを含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約８重量％のバイオマテリアルを含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約９重量％のバイオマテリアルを含み得る。
【0026】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＢＥＭ組成物）は、任意のタイプのＰＲＦ及び／又は白血球－ＰＲＦを含むように設計することができる。例えば、ＰＲＦ（又は白血球－ＰＲＦ）は、本明細書に記載のように治療される哺乳動物の血液に由来するものであり得る。ＰＲＦ及び／又は白血球－ＰＲＦは、任意の適切な方法を使用して得ることができる。ＰＲＦを得る方法は、例えば、実施例１に記載されているように行うことができる。場合によっては、ＰＲＦを得る方法は、他の場所で説明されているようにすることができる（例えば、Ｄｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．，１０１（３）：ｅ３７－ｅ４４（２００６），Ｇｈａｎａａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．，４０（６）：６７９－６８９（２０１４）；及びＶａｒｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，２３（３）：１３０９－１３１８（２０１９）を参照）。場合によっては、ＰＲＦ（又は白血球－ＰＲＦ）は凍結乾燥させることができる。ＰＲＦ（又は白血球－ＰＲＦ）は、任意の量の血小板を含み得る。例えば、ＰＲＦ（又は白血球－ＰＲＦ）は、ＰＲＦ１立方ミリメートル当たり約１０個の血小板（血小板／ｍｍ３）～約１０６血小板／ｍｍ３（例えば、約１０血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約１０５血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約１０４血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約１０３血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約７５０血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約５００血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約２５０血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約２００血小板／ｍｍ３、約１０血小板／ｍｍ３～約１００血小板／ｍｍ３、約５０血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約１００血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約２５０血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約５００血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約７５０血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約１０３血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、約１０４血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３、又は約１０５血小板／ｍｍ３～約１０６血小板／ｍｍ３）を含み得る。場合によっては、ＰＲＦ（又は白血球－ＰＲＦ）は、１つ以上の追加の成分を含み得る（例えば、血小板及びフィブリンに加えて）。ＰＲＦ（又は白血球－ＰＲＦ）に存在し得る成分の例には、限定するものではないが、血小板、フィブリン、増殖因子（例えば、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ））、サイトカイン（例えば、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－１０）、接着分子、凝固因子、細胞（例えば、白血球、線維芽細胞、好中球、マクロファージ、及び間葉系幹細胞）、ＴＧＦ－β、及びオステオカルシンが含まれる。
【0027】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、任意の量のＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約０．１％（重量％）～約９０％（重量％）のＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）（例えば、約０．１重量％～約７５重量％、約０．１重量％～約５０重量％、約０．１重量％～約４０重量％、約０．１重量％～約３０重量％、約０．１重量％～約２０重量％、約０．１重量％～約１０重量％、約０．１重量％～約８重量％、約０．１重量％～約５重量％、約０．１重量％～約４重量％、約０．１重量％～約３重量％、約０．１重量％～約２重量％、約０．１重量％～約１重量％、約０．２重量％～約９０重量％、約０．３重量％～約９０重量％、約０．４重量％～約９０重量％、約０．５重量％～約９０重量％、約０．６重量％～約９０重量％、約０．７重量％～約９０重量％、約０．８重量％～約９０重量％、約０．９重量％～％～約９０重量％、約１重量％～約９０重量％、約２重量％～約９０重量％、約０．２重量％～約５０重量％、約０．３重量％～約３０重量％、約０．４重量％～約１５重量％、約０．５重量％～約１０重量％、約０．６重量％～約８重量％、約０．７重量％～約５重量％、約０．８重量％～約３重量％、約０．２重量％～約０．６重量％、約０．４重量％～約０．８重量％、約０．６重量％～約１重量％、約０．７重量％～約１．１重量％、約０．８重量％～約１．２重量％、約１重量％～約１．４重量％、約１．２重量％～約１．６重量％、約１．４重量％～約１．８重量％、約１．６重量％～約２重量％、約１．８重量％～約２．２重量％、約２重量％～約２．４重量％、約２．２重量％～約２．６重量％、約２．６重量％～約３重量％、約２．８重量％～約３．２重量％、約３重量％～約３．６重量％、又は約３．４重量％～約４重量％、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ））を含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約０．４重量％～約０．８重量％（例えば、約０．６重量％）のＰＲＦを含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約１．２重量％～約１．６重量％（例えば、約１．４重量％）のＰＲＦを含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約２．２重量％～約２．６重量％（例えば、約２．４重量％）のＰＲＦを含み得る。
【0028】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、任意のタイプのナノクレイ材料を含み得る。場合によっては、組成物は単一種のナノクレイ材料を含み得る。場合によっては、組成物は、２種以上（例えば、２種、３種、４種、又はそれ以上）のナノクレイ材料を含むことができるとともに、任意の形態であることができる。例えば、ナノクレイ材料は粉末であり得る。場合によっては、ナノクレイ材料は膨潤性であり得る（例えば、水などの液体に分散したときに膨張することでヒドロゲルなどのゲルを生成するナノクレイ材料）。場合によっては、ナノクレイ材料は、１つ以上のナノ粒子を含み得る。本明細書で提供されるナノクレイ材料に含めることができるナノ粒子の例には、限定するものではないが、ポリ（ｄ，ｌ乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ｄ，ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド－ｃｏ－アクリル酸）、ポリ［アクリル酸－ｃｏ－ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリラート］（ＰＡＡ－ｃｏ－ＰＥＧＭＥＡ）、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡｍ）－ヘクトライド（ｈｅｃｔｏｒｉｄｅ）が含まれる。本明細書で提供される組成物に含めることができるナノクレイ材料の例には、限定するものではないが、ケイ酸塩ナノクレイ（例えば、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）などのフィロケイ酸塩ナノクレイ）が含まれる。
【0029】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、任意の量のナノクレイ材料を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約０．５％（重量％）～約９０％（重量％）のナノクレイ材料（例えば、約０．５重量％～約７０重量％、約０．５重量％～約５０重量％、約０．５重量％～約３０重量％、約０．５重量％～約１５重量％、約０．５重量％～約１２重量％、約０．５重量％～約１０重量％、約０．５重量％～約９重量％、約０．５重量％～約８重量％、約０．５重量％～約７重量％、約０．５重量％～約６重量％、約０．５重量％～約５重量％、約１重量％～約９０重量％、約２重量％～約９０重量％、約３重量％～約９０重量％、約４重量％～約９０重量％、約５重量％～約９０重量％、約６重量％～約９０重量％、約７重量％～約９０重量％、約８重量％～約９０重量％、約９重量％～約９０重量％、約１０重量％～約９０重量％、約１５重量％～約９０重量％、約２０重量％～約９０重量％、約５０重量％～約９０重量％、約７５重量％～約９０重量％、約１重量％～約７５重量％、約２重量％～約５０重量％、約３重量％～約３０重量％、約４重量％～約２０重量％、約５重量％～約１５重量％、約６重量％～約１０重量％、約６．４重量％～約６．８重量％、約１重量％～約５重量％、約２重量％～約６重量％、約３重量％～約７重量％、約４重量％～約８重量％、約５重量％～約９重量％、約６重量％～約１０重量％、約７重量％～約１１重量％、又は約８重量％～約１２重量％のナノクレイ材料）を含み得る。場合によっては、本明細書で提供されるバイオマテリアル組成物は、約６．４重量％～約６．８重量％（例えば、約６．６重量％）のナノクレイ材料を含み得る。
【0030】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、１つ以上の造影剤を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、１つ以上の放射線不透過性造影剤を含むように設計することができる。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、単一種の放射線不透過性造影剤を含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、２種以上（例えば、２種、３種、４種、又はそれ以上）の放射線不透過性造影剤を含み得る。本明細書で提供される組成物に含めることができる放射線不透過性造影剤の例には、限定するものではないが、エチオ化油、イオヘキソール、ヨウ素、磁気共鳴造影剤（例えば、ガドビストなどのガドブトロール）、及び、酸化鉄ナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、酸化マグネシウム粒子、タンタル粒子などの金属粒子（例えば、金属ナノ粒子を含むポリマーナノ粒子）が含まれる。
【0031】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、任意の量の造影剤（例えば、放射線不透過性造影剤）を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約０％（重量％）～約９０％（重量％）の放射線不透過性造影剤（例えば、約０．１重量％～約８０重量％、約０．１重量％～約７０重量％）、約０．１重量％～約６０重量％、約０．１重量％～約５０重量％、約０．１重量％～約４０重量％、約０．１重量％～約３０重量％、約３重量％～約９０重量％、約５重量％～約９０重量％、約８重量％～約９０重量％、約１０重量％～約９０重量％、約２０重量％～約９０重量％、約３０重量％～約９０重量％、約４０重量％～約９０重量％、約５０重量％～約９０重量％、約６０重量％～約９０重量％、約５重量％～約７５重量％、約８重量％～約５０重量％、約１０重量％～約４０重量％、約１２重量％～約３０重量％、約１５重量％～約２５重量％、約１８重量％～約２２重量％、約５重量％～約１５重量％、約１０重量％～約２０重量％、約１５重量％～約２５重量％、約２０重量％～約３０重量％、約２５重量％～約３５重量％、約３０重量％～約４０重量％、又は約３５重量％～約４５重量％の放射線不透過性造影剤）を含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約１８～約２２重量％の放射線不透過性造影剤（例えば、約２０重量％のエチオ化油）を含み得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約１０～約４０重量％の放射線不透過性造影剤（例えば、約２５重量％のエチオ化油）を含み得る。
【0032】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）が造影剤を含む場合、組成物は、任意の適切な方法を使用して（例えば、哺乳動物内で）可視化することができる。例えば、超音波、コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像法、及び／又は蛍光透視法などの画像化技術を使用して、１つ以上の造影剤を含む本明細書で提供される組成物を可視化することができる。
【0033】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、約０．６重量％のＰＲＦ及び約６．６重量％のナノクレイ材料を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約０．６重量％のＰＲＦ、約６．６重量％のナノクレイ材料、及び約２０重量％のエチオ化油を含み得る。
【0034】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、約１．４重量％のＰＲＦ及び約６．６重量％のナノクレイ材料を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約１．４重量％のＰＲＦ、約６．６重量％のナノクレイ材料、及び約２５重量％のエチオ化油を含み得る。
【0035】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、約２．４重量％のＰＲＦ及び約６．６重量％のナノクレイ材料を含み得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約２．４重量％のＰＲＦ、約６．６重量％のナノクレイ材料、及び約２５重量％のエチオ化油を含み得る。
【0036】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は生分解性であり得る（例えば、哺乳動物内で生分解し得る）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された組成物の体積は、経時的に減少し得る。場合によっては、哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された組成物の体積は、経時的に少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％）減少し得る。場合によっては、哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された組成物の体積は、送達後約１４日間減少し得る。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された組成物の体積は、送達後約１４日間で少なくとも約６０％減少し得る。場合によっては、哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された組成物の体積は、送達後約２８日間減少し得る。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された組成物の体積は、送達後約２８日間で少なくとも約７５％減少し得る。
【0037】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）が哺乳動物（例えば、ヒト）内の血管に送達された後に生分解する場合、生分解された組成物は、線維性組織（例えば、永久線維性組織）に置き換えられ得る。
【0038】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、シアシニング組成物であり得る。例えば、本明細書で提供される組成物の粘度は、約０．０００１ １／秒～約１００ １／秒（例えば、約０．０００１ １／秒～約８０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約６０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約５０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約４０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約３０ １／秒、約０．０００１～約２０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約１０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約１ １／秒、約０．００１ １／秒～約１００ １／秒、約０．０１ １／秒～約１００ １／秒、約０．１ １／秒～約１００ １／秒、約１ １／秒～約１００ １／秒、約１０ １／秒～約１００ １／秒、約２０ １／秒～約１００ １／秒、約３０ １／秒～約１００ １／秒、約５０ １／秒～約１００ １／秒、約７０ １／秒～約１００ １／秒、約０．００１ １／秒～約９０ １／秒、約０．０１ １／秒～約８０ １／秒、約０．１ １／秒～約７０ １／秒、約１ １／秒～約６０ １／秒、約１０ １／秒～約５０ １／秒、約２０ １／秒～約４０ １／秒、約０．０００１ １／秒～約１ １／秒、約０．００１ １／秒～約１０ １／秒、約０．０１ １／秒～約２０ １／秒、約０．１ １／秒～約３０ １／秒、約１ １／秒～約４０ １／秒、約１０ １／秒～約５０ １／秒、約２０ １／秒～約６０ １／秒、約３０ １／秒～約７０ １／秒、約４０ １／秒～約８０ １／秒、又は約５０ １／秒～約９０ １／秒）のせん断速度の下で減少し得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物の粘度は、約０．０１（１０－２）１／秒のせん断速度の下で低下し得る。
【0039】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、血管（例えば、健康な血管）の平均圧力よりも高い置換圧を有する。例えば、本明細書で提供される組成物は、約８５ｋＰａ～約２００ｋＰａ（例えば、約８５ｋＰａ～約１７５ｋＰａ、約８５ｋＰａ～約１５０ｋＰａ、約８５ｋＰａ～約１２５ｋＰａ、約８５ｋＰａ～約１００ｋＰａ、約１００ｋＰａ～約２００ｋＰａ、約１２５ｋＰａ～約２００ｋＰａ、約１５０ｋＰａ～約２００ｋＰａ、約１７５ｋＰａ～約２００ｋＰａ、約１００ｋＰａ～約１７５ｋＰａ、約１２５ｋＰａ～約１５０ｋＰａ、約８５ｋＰａ～約１２５ｋＰａ、約１００ｋＰａ～約１５０ｋＰａ、又は約１２５ｋＰａ～約１７５ｋＰａ）の置換圧を有することができる。
【0040】
場合によっては、本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、貯蔵安定性がある（例えば、保存中に分離しない）ものであり得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、任意の温度（例えば、約－２０℃、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）で安定であり得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約０．１時間～約１２ヶ月間（例えば、約０．１時間～約１１ヶ月間、約０．１時間～約１０ヶ月間、約０．１時間～約９ヶ月間、約０．１時間～約８ヶ月間、約０．１時間～約７ヶ月間、約０．１時間～約６ヶ月間、約０．１時間～約５ヶ月間、約０．１時間～約４ヶ月間、約０．１時間～約３ヶ月間、約０．１時間～約２ヶ月間、約０．１時間～約１ヶ月間、約０．１時間～約３週間、約０．１時間～約２週間、約０．１時間～約７日間、約０．１時間～約４日間、約０．１時間～約２日間、約０．１時間～約２４時間、約０．１時間～約１２時間、約０．１時間～約３時間、約２時間～約１２ヶ月間、約１２時間～約１２ヶ月間、約２４時間～約１２ヶ月間、約５日～約１２ヶ月間、約２週間～約１２ヶ月間、約３週間～約１２ヶ月間、約１ヶ月間～約１２ヶ月間、約２ヶ月間～約１２ヶ月間、約３ヶ月間～約１２ヶ月間、約４ヶ月間～約１２ヶ月間、約５ヶ月間～約１２ヶ月間、約６ヶ月間～約１２ヶ月間、約７ヶ月間～約１２ヶ月間、約８ヶ月間～約１２ヶ月間、約９ヶ月間～約１２ヶ月間、約１０ヶ月間～約１２ヶ月間、約１時間～約８ヶ月間、約１２時間～約６ヶ月間、約２４時間～約４ヶ月間、約１週間～約３ヶ月間、約２週間～約２ヶ月間、約１時間～約１週間、約１週間～約１ヶ月間、約２週間～約２ヶ月間、約３週間～約３ヶ月間、約４週間～約４ヶ月間、約５週間～約５ヶ月間、約６週間～約６ヶ月間、約７週間～約７ヶ月間、約８週間～約８ヶ月間、約９週間～約９ヶ月間、又は約１０週間～約１０ヶ月間）安定であり得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、試験管内で約６ヶ月間（例えば、相分離なく）安定であり得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、（例えば、３７℃で）約７０日間安定であり得る。
【0041】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、任意の適切な方法を使用して作製することができる。場合によっては、ＰＲＦと１つ以上のナノクレイ材料を最初に混合し、次に１つ以上の放射線不透過性造影剤を加えることができる。本明細書で提供される組成物を作成するための、ＰＲＦ、１つ以上のナノクレイ材料、及び任意選択で１つ以上の放射線不透過性造影剤の混合（例えば、均一混合）には、例えば、遠心混合、ボルテックス混合、スピードミキサー混合、及び／又は手動混合を使用することができる。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、実施例１に記載のように作製することができる。
【0042】
本明細書で提供される組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、迅速に作製することができる。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約６０分未満（例えば、約５５分未満、約５０分未満、約４５分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、又は約２０分未満）のうちに調製され得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、約２５分未満のうちに調製され得る。場合によっては、本明細書で提供される組成物は、約１０分～約２４時間（例えば、約１０分～約１２時間、約１０分～約１０時間、約１０分～約８時間、１０分～約１時間、約１０分～約４５分、約１０分～約３５分、約１０分～約３０分、約１０分～約２５分、約２０分～約２４時間、約３０分～約２４時間、約６０分～約２４時間、約１５分～約１２時間、約２０分～約８時間、約２５分～約４時間、約１０分～約２５分、約１５分～約３０分、又は約２０分～約３５分）のうちに調製され得る。
【0043】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を使用する方法も本明細書で提供される。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管の塞栓形成のために使用することができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物内の１つ以上の血管の塞栓形成のためにその血管に送達することができる。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、送達された組成物の断片化を伴わずに塞栓形成に使用することができる。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、その組成物の移動を伴わずに塞栓形成に使用することができる。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、再疎通率が約３５％未満（例えば、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、又は約１０％未満）の塞栓形成に使用することができる。
【0044】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達することで、その血管内の血流を減少させ又は排除することができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達することで、その血管内の血流を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又はそれ以上のパーセンテージで減少させることができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達することで、その血管内の血流を約１ｍＬ／秒未満まで減少させることができる。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物を哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達することで、その血管内の血流を止めることができる。
【0045】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位で凝固を誘導することができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、約１０分未満（例えば、約９分未満、約８分未満、約７分未満、約６分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、又は約２分未満）のうちに送達部位で凝固を誘導することができる。
【0046】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位でのコラーゲン沈着を増加させることができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位でのコラーゲン沈着を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又はそれ以上のパーセンテージで増加させることができる。
【0047】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位での血管形成を増強することができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位での血管形成を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又はそれ以上のパーセンテージで増強することができる。
【0048】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位での細胞増殖を増強することができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することで、送達部位での細胞増殖を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又はそれ以上のパーセンテージで増強することができる。
【0049】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、出血性疾患（例えば、凝固障害）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達することで、その哺乳動物を治療することができる。例えば、本明細書で提供される組成物を、哺乳動物内の１つ以上の腫瘍に栄養を与えている１つ以上の血管に送達することで、出血性疾患に関連する血流を減少させ又は排除することができる。本明細書に記載のように（例えば、ＰＲＦ及び１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物内の１つ以上の血管に送達することによって）治療できる出血性疾患の例には、限定するものではないが、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）（例えば、非外傷性出血及び外傷性出血）、動脈瘤（例えば、破裂動脈瘤、及び嚢状動脈瘤）、血管奇形（例えば、尿道皮膚瘻、動静脈瘻、腸皮膚瘻、及び腸管瘻などの瘻孔）が含まれる。
【0050】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を、１つ以上の腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）の１つ以上の血管に送達することで、その哺乳動物を治療することができる。例えば、本明細書で提供される組成物を、哺乳動物内の１つ以上の腫瘍に栄養を与えている１つ以上の血管に送達することで、腫瘍への血流を減少させ又は排除することができる。場合によっては、腫瘍は悪性腫瘍であり得る。場合によっては、腫瘍は良性腫瘍であり得る。本明細書に記載のように（例えば、ＰＲＦ及び１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物内の１つ以上の血管に送達することによって）治療することができる腫瘍の例には、限定するものではないが、肝腫瘍、子宮筋腫、良性前立腺肥大症、前立腺腫瘍、腎腫瘍、乳がん腫瘍、黒色腫、胃がん腫瘍、及び膵臓がん腫瘍が含まれる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の腫瘍に栄養を与えている１つ以上の血管に送達することで、その腫瘍のサイズ（例えば、体積）を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又はそれ以上のパーセンテージで減少させることができる。
【0051】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達した時も、哺乳動物が経験する塞栓形成に関連する合併症を最小限に抑えるか、又はまったくなくすことができる。塞栓形成に関連する合併症の例には、限定するものではないが、血管痙攣、血栓症、解離、及び破裂が含まれる。
【0052】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を哺乳動物（例えば、ヒト）の創傷（例えば皮膚創傷）に投与することで、その哺乳動物内の創傷治癒を加速することができる。例えば、本明細書で提供される組成物を、哺乳動物内の創傷に送達することで、創傷からの血流を減少させ又は排除すること（例えば、創傷部に血塊を形成させること）ができる。創傷は、哺乳動物のあらゆる部分（例えば、哺乳動物の体のあらゆる部分）に影響を与える可能性がある。場合によっては、創傷は皮膚の（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ又はｓｋｉｎ）創傷であり得る。本明細書に記載のように（例えば、ＰＲＦ及び１つ以上のナノクレイ材料を含む組成物を哺乳動物内の１つ以上の血管に送達することによって）治療することができる創傷の例には、限定するものではないが、擦過傷、潰瘍（例えば、慢性下肢潰瘍、糖尿病性足潰瘍、及び静脈性下肢潰瘍）、褥瘡、外科的皮膚創傷、やけど、及び脱毛症が含まれる。例えば、本明細書に記載の組成物を、創傷を有する哺乳動物に投与することで、哺乳動物内の創傷治癒を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又はそれ以上のパーセンテージで加速することができる。
【0053】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、任意のタイプの哺乳動物内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することができる。場合によっては、哺乳動物（例えば、ヒト）は抗凝固処理され得る（例えば、１つ以上の抗凝固剤を服用することができる）。場合によっては、哺乳動物（例えば、ヒト）は凝固障害のあるものであり得る（例えば、哺乳動物の血液凝固能力が損なわれている出血性疾患を有するものであり得る）。本明細書で提供される１つ以上の組成物を哺乳動物内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達することができる哺乳動物の例には、限定するものではないが、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、及びウサギが含まれる。
【0054】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達する場合、その組成物は哺乳動物内の任意のタイプの血管に送達することができる。場合によっては、血管は病気の血管であり得る。場合によっては、血管は損傷した血管であり得る。本明細書で提供される組成物を送達することができる血管のタイプの例には、限定するものではないが、動脈、静脈、及び毛細血管が含まれる。本明細書で提供される１つ以上の組成物を動脈に送達する場合、動脈は、腎動脈、肝動脈、脾動脈、大腿動脈、上腕動脈、腸骨動脈、頸動脈、又は脳動脈などの哺乳動物（例えば、ヒト）内の任意の動脈であり得る。
【0055】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達する場合、任意の適切な送達方法を使用できる。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、血管（例えば、塞栓術を必要とする血管）への直接注入によって、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達され得る。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、創傷に直接注入することによって、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の創傷に送達され得る。場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、カテーテル誘導送達によって（例えば、塞栓術が必要な血管内に挿入されたカテーテルを介して）、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達され得る。本明細書で提供される１つ以上の組成物を、カテーテル誘導送達によって哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達する場合、任意のタイプのカテーテルを使用することができる（例えば、バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）カテーテル、マイクロカテーテル、コブラ（Ｃｏｂｒａ）カテーテル、フォガティー（Ｆｏｇａｒｔｙ）バルーン、及びプログレート（ＰｒｏＧｒｅａｔ）カテーテル）。本明細書で提供される１つ以上の組成物を、カテーテル誘導送達によって哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達する場合、任意のサイズのカテーテルを使用することができる。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、約１．７フレンチ～約６フレンチ（例えば、約１．７フレンチ～約５フレンチ、約１．７フレンチ～約４フレンチ、約１．７フレンチ～約３フレンチ、約１．７フレンチ～約２フレンチ、約２フレンチ～約６フレンチ、約３フレンチ～約６フレンチ、約４フレンチ～約６フレンチ、約５フレンチ～約６フレンチ、約２フレンチ～約５フレンチ、約３フレンチ～約４フレンチ、約２フレンチ～約４フレンチ、又は約３フレンチ～約５フレンチ）（１フレンチ＝１／３ｍｍ）のサイズを有するカテーテルを使用して、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、約５フレンチ（約１．６６７ｍｍ）のサイズを有するカテーテルを使用して哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達され得る。
【0056】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に任意の送達速度で送達され得る（例えば、任意の流量で送達され得る）。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に約５０μＬ／分～約５０００μＬ／分（例えば、約５０μＬ／分～約４０００μＬ／分、約５０μＬ／分～約３０００μＬ／分、約５０μＬ／分～約２０００μＬ／分、約５０μＬ／分～約１０００μＬ／分、約５０μＬ／分～約５００μＬ／分、約５０μＬ／分～約４００μＬ／分、約５０μＬ／分～約３００μＬ／分、約５０μＬ／分～～約２００μＬ／分、約５０μＬ／分～約１００μＬ／分、約１００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約２００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約３００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約４００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約５００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約６００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約７００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約８００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約９００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約１０００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約２０００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約３０００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約４０００μＬ／分～約５０００μＬ／分、約１００μＬ／分～約４０００μＬ／分、約２００μＬ／分～約３０００μＬ／分、約３００μＬ／分～約２０００μＬ／分、約４００μＬ／分～約１０００μＬ／分、約５００μＬ／分～約７５０μＬ／分、約５０μＬ／分～約５００μＬ／分、約１００μＬ／分～約６００μＬ／分、約２００μＬ／分～約７００μＬ／分、約３００μＬ／分～約８００μＬ／分、約４００μＬ／分～約９００μＬ／分、約５００μＬ／分～約１０００μＬ／分、約６００μＬ／分～約２０００μＬ／分、約７００μＬ／分～約３０００μＬ／分、又は約８００μＬ／分～約４０００μＬ／分）の量で送達され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に約３００μＬ／分の量で送達され得る。
【0057】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）の任意の量が、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達され得る。例えば、約１ｃｃ～約１０ｃｃ（例えば、約１ｃｃ～約９ｃｃ、約１ｃｃ～約８ｃｃ、約１ｃｃ～約７ｃｃ、約１ｃｃ～約６ｃｃ、約１ｃｃ～約５ｃｃ、約１ｃｃ～約４ｃｃ、約１ｃｃ～約３ｃｃ、約１ｃｃ～約２ｃｃ、約２ｃｃ～約１０ｃｃ、約３ｃｃ～約１０ｃｃ、約４ｃｃ～約１０ｃｃ、約５ｃｃ～約１０ｃｃ、約６ｃｃ～約１０ｃｃ、約７ｃｃ～約１０ｃｃ、約８ｃｃ～約１０ｃｃ、約９ｃｃ～約１０ｃｃ、約２ｃｃ～約９ｃｃ、約３ｃｃ～約８ｃｃ、約４ｃｃ～約７ｃｃ、約５ｃｃ～約６ｃｃ、約１ｃｃ～約３ｃｃ、約２ｃｃ～約４ｃｃ、約３ｃｃ～約５ｃｃ、約４ｃｃ～約６ｃｃ、約５ｃｃ～約７ｃｃ、約６ｃｃ～約８ｃｃ、又は約７ｃｃ～約９ｃｃ）の本明細書で提供される１つ以上の組成物が、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管及び／又は１つ以上の創傷に送達され得る。
【0058】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）を哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管の塞栓形成に使用した後、その組成物はその血管から回収され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を、血管の塞栓形成のために哺乳動物内の１つ以上の血管に送達した後、その血管を通る血流を増加（例えば、回復）させるためにその組成物は回収され得る。任意の適切な方法を使用して、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管から本明細書で提供される１つ以上の組成物を回収することができる。哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管から本明細書で提供される１つ以上の組成物を回収するために、例えば、吸引カテーテル及び外科的除去を使用することができる。
【0059】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、塞栓術に使用される唯一の活性剤として、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達され得る。
【0060】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）は、塞栓術に使用される１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、固体塞栓物質（例えば、コイル、粒子、フォーム、プラグ、ミクロスフェア、及び／又はビーズ）及び／又は液体塞栓材料（例えば、シアノアクリル酸ブチル（ｎ－ＢＣＡ）、及びＯｎｙｘ（登録商標））と組み合わせて、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の血管に送達され得る。
【0061】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含むＢＥＭ組成物）が、塞栓術に使用される追加の薬剤と組み合わせて使用される場合、その塞栓術に使用される１つ以上の追加の薬剤は、同時に（例えば、同じ組成物で、又は別々の組成物で）又は独立して投与され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を最初に投与し、塞栓術に使用される１つ以上の追加の薬剤を２番目に投与することができ、又はその逆も可能である。
【0062】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の創傷に、創傷治癒に使用される唯一の活性剤として送達され得る。
【0063】
場合によっては、本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の創傷に、創傷治癒に使用される１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて送達され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物は、抗菌剤（例えば、抗生物質、抗真菌剤、及び防腐剤）、組換え増殖因子、免疫療法、化学療法、及び／又はナノ粒子療法と組み合わせて、哺乳動物（例えば、ヒト）内の１つ以上の創傷に送達され得る。
【0064】
本明細書で提供される１つ以上の組成物（例えば、ＰＲＦ（及び／又は白血球－ＰＲＦ）及び１つ以上のナノクレイ材料を含有するＢＥＭ組成物）が、創傷治癒に使用される追加の薬剤と組み合わせて使用される場合、その創傷治癒に使用される１つ以上の追加の薬剤は、同時に（例えば、同じ組成物で、又は別々の組成物で）又は独立して投与され得る。例えば、本明細書で提供される１つ以上の組成物を最初に投与し、創傷治癒に使用される１つ以上の追加の薬剤を２番目に投与することができ、又はその逆も可能である。
【0065】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１：カテーテル誘導動脈塞栓術のための血液由来バイオマテリアル
この実施例は、凝固障害に関係なく即時かつ持続的な止血を達成するために迅速な調製及び臨床カテーテルを使用した送達が可能な、再生特性を有する血液由来塞栓物質（ＢＥＭ）の開発について説明する（図１）。ＢＥＭは、現在使用されている塞栓材料に比べて大きな利点があり、塞栓術のための有望な新しいツールとなっている。
実施例
実施例１：カテーテル誘導動脈塞栓術のための血液由来バイオマテリアル
この実施例は、凝固障害に関係なく即時かつ持続的な止血を達成するために迅速な調製及び臨床カテーテルを使用した送達が可能な、再生特性を有する血液由来塞栓物質（ＢＥＭ）の開発について説明する（図１）。ＢＥＭは、現在使用されている塞栓材料に比べて大きな利点があり、塞栓術のための有望な新しいツールとなっている。
【0066】
ＢＥＭを作成するために、ブタ全血の新たに採取したアリコートから多血小板フィブリン（ＰＲＦ）画分を単離した。この淡黄色のゲル状の物質には、重合したフィブリンメッシュ、成長因子、及び血小板が含まれており、抗菌性や再生特性など、塞栓剤に適したいくつかの特徴がある（Ｄｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．１０１：ｅ３７（２００６））。ＰＲＦをさらに処理して、凍結乾燥ＰＲＦ（Ｌ－ＰＲＦ）を調製した（図１及び図８）。このバージョンでは、後でＢＥＭを作成するためにＬ－ＰＲＦを４℃で保存できる。Ｌ－ＰＲＦとＰＲＦのＳＤＳ－ＰＡＧＥは類似しており、凍結乾燥プロセス中の分解の有意な証拠はなかった（図９Ａ）。さらに、Ｌ－ＰＲＦ及び新たに調製されたＰＲＦにおいて、選択された成長因子の完全性が維持されていることが、イムノブロッティング及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）実験によって実証された（図９Ｂ～９Ｄ）。ＶＥＧＦ－Ａの検出レベルには多少のばらつきが見られた。これは、各ブタのＰＲＦ組成の通常のばらつきを表している可能性がある（図９Ｄ）。ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦにおけるこれらの成長因子の生物学的活性を実証するために、Ｌ－９２９マウス線維芽細胞を使用して細胞遊走及び増殖アッセイを実施した。ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦの両方が、有意に増強された細胞増殖（ｐ＜０．０００１）及び遊走（ＰＲＦ；ｐ＜０．０５、Ｌ－ＰＲＦ；ｐ＜０．０１）を示した（図９Ｅ～９Ｇ）。これは、Ｌ－ＰＲＦ及びＰＲＦベースのＢＥＭが適切な生物活性を提供することで、動脈塞栓術後の線維炎症反応を促進し、再疎通を回避する耐久性のある閉塞を作成できることを示唆している。
【0067】
次に、Ｌ－ＰＲＦを臨床用カテーテルから注入できるようにするために、Ｌ－ＰＲＦをＬａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ナノクレイ（ＮＣ）と組み合わせてシアシニングＢＥＭを開発した。ＮＣは、注入性に有利な抗菌特性及びシアシニング特性を有することができる（Ｒａｗａｔ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７４：９３６（２０１４）；Ｇａｈａｒｗａｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．，８：９８３３（２０１４）；及びＡｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，８：３６５ｒａｌ５６（２０１６））。ＮＣは、表面に負電荷、縁に沿って正電荷を持つナノサイズのケイ酸塩ディスクを含むことができ、これはＰＲＦタンパク質（すなわち、フィブリン）とのイオン相互作用を形成するのに役立つ。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）では、ＢＥＭは多孔質の微細構造を示した（図２Ａ及び図１０）。
【0068】
Ｌ－ＰＲＦとＮＣとの間の相互作用を調査するために、ＮＣ含有量を６．６重量％で一定に保ちながら、様々な量のＬ－ＰＲＦ（７．２重量％、８重量％、及び９重量％の全固形分）を使用して３種類のＢＥＭ製剤を製造した（表１）。せん断速度の増加に伴う粘度の低下は、ＮＣ及びＢＥＭのシアシニング性能が、３つの製剤すべてで経カテーテル注入性に有利であることを示唆した（図２Ｂ）。さらに、３種類のＢＥＭは、低ひずみ及び高ひずみを交互に繰り返すサイクルにおいて優れた回復性を示し、これは振動の履歴によらない迅速なネットワークの崩壊と再構成の性能を示している（図２Ｃ）。Ｌ－ＰＲＦをＮＣに追加すると、ＢＥＭの安定性の指標である貯蔵弾性率Ｇ’が有意に向上した。さらに、弾性率がＮＣゲル単独（４０９７±１１８Ｐａ）と比較して、９重量％ＢＥＭで３倍（１２５６２±４７５Ｐａ）に増加したことが観察された（図２Ｄ）。カテーテル送達のための優れた機械的特性及び安定性を備える高Ｌ－ＰＲＦ含有量のＢＥＭ（９重量％）を、さらなる研究のために選択した。
【0069】
【表1】
【0070】
処置中の非標的塞栓形成を避けるために、ＢＥＭが動脈内のカテーテルの先端を出るときにリアルタイムでＢＥＭを観察することができる。可視化を可能にするために、Ｘ線ベースのイメージングモダリティ、すなわちコンピュータ断層撮影（ＣＴ）及び蛍光透視法において臨床で使用される一般的な造影剤であるエチオ化油をＢＥＭと混合した。市販のエチオ化油をＮＣ及びＬ－ＰＲＦと混合して、エチオ化油を含むＢＥＭ（ＢＥＭ－ＥＯ）を生成した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＢＥＭ－ＥＯのその後のレオロジー試験では、優れたＧ’（３９０６８±５７５Ｐａ）を有する持続的なシアシニング特性が実証され、これはＢＥＭ単独と比較して３倍高かった（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【0071】
次に、医師の体験（例えば、手での注入性能は、使いやすさ、処置時間の短縮、及び処置コストの削減のために重要である）を評価した。圧縮試験では、ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの最大注入力は、それぞれ２３±０．３Ｎ、３２±０．６Ｎ、及び７１±０．４Ｎであると測定され、臨床カテーテルを介した用手注入の実現可能性を示している（図２Ｅ）。ＢＥＭ－ＥＯの強化された弾性率は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血管閉塞モデルでＮＣ、ＢＥＭ、又はＢＥＭ－ＥＯを置換するのに必要な最大圧力（それぞれ７１±７ｋＰａ、９３±８ｋＰａ、及び１９２±７ｋＰａ）を測定することによってさらに確認された。ＢＥＭ－ＥＯは、通常の収縮期圧よりも約１２倍高い置換圧を示し、これは、動脈に注入すると、移動や断片化することなく定位置に留まることを示唆している（図２Ｆ及び図１１Ｅ）。
【0072】
次に、新鮮なＰＲＦ、Ｌ－ＰＲＦ、ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの細胞毒性を、Ｌ－９２９細胞を使用してＩＳＯ１０９９３－５ガイドラインに従って評価した。試験したＰＲＦ含有材料のいずれでも細胞毒性は観察されず、生体適合性が明らかになった（図２Ｇ）。放射線不透過性ＢＥＭ－ＥＯをブタの実験で使用するために選択したため、ＢＥＭ－ＥＯの無菌性及び止血性能を調査した。動物実験の前に、ＢＥＭ－ＥＯの調製物をＬＢブロスと混合し、３７℃でインキュベートした。これらは、１日目と７日目に無菌であることを示した（図２Ｈ及び図１２）。ＢＥＭ－ＥＯが血液と接触したときの時間依存的弾性率変化を観察するレオメトリーを使用して止血活性を試験した。血液がＢＥＭ－ＥＯと接触したとき、血液単独と比較して弾性率の急速な上昇が示された（図２Ｉ）。さらに、９６ウェルプレートにロードされた血液アリコートは５分で凝固することが示されたが、ＢＥＭ－ＥＯを含む血液は３分で凝固し始めた。これは、臨床で使用されるコイルと同様である（図２Ｊ）。ＢＥＭ中のエチオ化油の濃度は、Ｘ線透視下で最適化された。ＢＥＭと混合された２５重量％のエチオ化油は、Ｘ線ベースのイメージングモダリティの下で追跡を可能にするのに十分な放射線不透過性を生成した（図２Ｋ）。塞栓剤の別の望ましい特性は、塞栓剤を回収する性能である。これにより、偶発的な送達に起因する非標的塞栓のレスキューが可能になる。脳卒中の原因となる血栓を除去するためのＦＤＡ承認デバイスであるＰｅｎｕｍｂｒａアスピレーションカテーテルシステム（Ｐｅｎｕｍｂｒａ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ）を使用して、ＢＥＭ－ＥＯを回収できるかどうかを調査した（図２Ｌ）。ＢＥＭ－ＥＯは、送達後に回収可能であることが示された。これは、現在ＦＤＡに承認されている塞栓剤では不可能な独自の特性である。
【0073】
ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの生体適合性及び生分解性プロファイルをさらに評価するために、ラット皮下注射モデルを使用した（図１３）。注射後３、１４、及び２８日目に注入物及び周囲の組織を外植した。組織学的検査により、注射部位に無定形の好酸性と思われるＢＥＭ及びＢＥＭ－ＥＯが明らかになった（図３、図１４）。総細胞数の計測のためにＨ＆Ｅ染色を使用し、トリクローム染色を使用してコラーゲン沈着を示した。ＢＥＭ－ＥＯ群では、３日目と比較して有意に多い細胞数が１４日目（ｐ＜０．０１）及び２８日目（ｐ＜０．０５）に観察された（図３Ａ及び３Ｂ、矢印）。１４日目のＮＣと比較して、ＢＥＭ－ＥＯにはより多くの細胞も存在した（図３Ａ及び３Ｂ、矢印）。さらに、注入物は、細胞浸潤の層（図３Ｃ、黒い線）及びコラーゲンの豊富な線維性被膜（図３Ｃ、点線）に囲まれていた。１４日目の群では、ＢＥＭ（ｐ＜０．０５）及びＢＥＭ－ＥＯ（ｐ＜０．００１）の両方が、ＮＣ群と比較して有意に厚い細胞浸潤の層を有し、これは、Ｌ－ＰＲＦが増殖効果を有する可能性が高いことを示唆している（図３Ｃ及び３Ｄ、図１４Ａ及び１４Ｃ、黒い線）。２８日目のＢＥＭ－ＥＯサンプルは、ＮＣと比較してバイオマテリアル周辺のコラーゲン沈着の増加を表す、より厚いコラーゲンの豊富な線維性被膜も示した（図３Ｃ及び３Ｅ、点線）。この強化された線維化は、血管内の注入された材料を安定させることで、耐久性のある塞栓形成を達成するとともに長期的に再疎通を防ぐのに有益である。図３Ｆ及び３Ｇに示すように、注入された材料体積の変化を、外植組織の再構成されたマイクロＣＴ画像から測定した。マイクロＣＴ画像で、３日目から２８日目までの間に有意な体積減少がＢＥＭ（ｐ＜０．０５）及びＢＥＭ－ＥＯ（ｐ＜０．０１）で観察され（図３Ｆ及び３Ｇ、図１４Ｅ）、生分解性が明らかになった。すべてのラットからの血液サンプルの分析は、ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯの生体適合性をさらに裏付けた。全血球計算（ＣＢＣ）調査では、白血球、赤血球、及び血小板の正常なレベルが示された（表２）。
【0074】
【表2】
【0075】
血管新生及び細胞増殖は、軟部組織の治癒に不可欠である。ラット皮下注射モデルにおける増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）免疫染色は、１４日目（ｐ＜０．００１）及び２８日目（ｐ＜０．０５）で、ＮＣと比較してＢＥＭ群で有意に多い数の増殖細胞を示した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。組織－注入物界面での血管新生もＣＤ３１免疫染色を使用して評価し、ＮＣと比較して２８日目にＢＥＭ及びＢＥＭ－ＥＯサンプルで形成された血管の数が有意に多いことを示した（ｐ＜０．０１）（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。これらの発見は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖及び遊走アッセイとも一致しており、これは、ＢＥＭ－ＥＯが生分解及び線維化を促進する再生反応を誘発できることを示唆している。これらは、動脈内腔の持続的な閉塞の達成に関与する特性である。
【0076】
次に、ブタの動脈塞栓形成の前臨床モデルを使用して、ＢＥＭ－ＥＯが抗凝固状態（すなわち、活性化凝固時間（ＡＣＴ）＞３００秒）で再疎通することなく塞栓形成を達成する性能を試験した。頸動脈への動脈内アクセスに続いて、臨床カテーテルを遠位大動脈に進め、デジタル減算血管造影（ＤＳＡ）を実施して、ブタ腸骨動脈の正常な動脈解剖学を明らかにした（図４Ａ）。リアルタイム蛍光透視下で、カテーテルの先端を腸骨動脈の中央部に持ってきて、ＢＥＭ－ＥＯを含む注射器をルアーロックを介してカテーテルに接続し、内腸骨動脈（ＩＩＡ）に１５～２０秒間注入した。ＢＥＭ－ＥＯは、注入中に優れた可視性を示した（図４Ｂ）。塞栓術の直後に、遠位大動脈からのＤＳＡを再び実施したところ、腸骨動脈の即時閉塞が示された。断片化、遠位移動、又は非標的塞栓形成の証拠は観察されなかった（図４Ｃ）。金属コイルとは対照的に、これらの抗凝固処理されたブタは、ＢＥＭ－ＥＯが閉塞を達成するのに血栓形成を必要としないことを示した。塞栓術の後、１時間後に４匹のブタを屠殺し、別の４匹のブタを２週間生存させ、全身ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）イメージング後に屠殺した。塞栓術の１４日後、ＣＴＡは、ＢＥＭ－ＥＯがアーチファクト、断片化、変位又は移動、又はＢＥＭ－ＥＯ再疎通を伴うことなくＩＩＡにまだ見られることを示した（図４Ｄ及び４Ｅ）。すべての動物の蛍光透視画像と１４日目のブタのＣＴＡ調査は、一貫して塞栓術の成功を示した（図１６）。
【0077】
さらに、委員会認定の放射線科医によるＣＴスキャンの所見では、すべての調査で、非標的塞栓形成の証拠がなく、遠位後肢への正常な流れが示された。さらに、脳、肺、肝臓、及び脾臓にリンパ節腫脹や異常所見の証拠はなかった（図１７）。屠殺の直前に血液サンプルを採取し、剖検中に塞栓された動脈を採取し、高解像度マイクロＣＴイメージング及び組織学に供した。採取されたＩＩＡの組織学的評価は、認定された病理学者によって行われた。１時間の非生存群では、綿状の無定形の材料が、最小限の組織反応で動脈管腔をキャスティングするのが見られた（図４Ｆ）。２週間の生存群では、動脈管腔はＢＥＭ－ＥＯによって完全に閉塞され、これはマクロファージ、筋線維芽細胞、及びフィブリンの豊富な広範な同心性線維炎症反応を伴い、肉芽組織に似ている（図４Ｆ）。散在する多核巨細胞、及びマクロファージも脂肪滴と共に観察された（図１８）。２つの群間の中膜層の厚さは類似していたが（ｐ＞０．０５）、２週間の生存群は、内膜・中膜層の弾性繊維の線維化及び崩壊を示した（図４Ｆ（黒い矢印）及び４Ｇ）。しかし、ＰＣＮＡの免疫染色は、２週間で非生存群と比較して塞栓されたＩＩＡの細胞増殖の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示した（図４Ｆ及び４Ｈ）。
【0078】
骨盤内では、血管の流れに、閉塞を回避するのに役立つ広範な冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することがよくある。２週間生存群のＩＶ造影ＣＴＡ画像は、ＢＥＭ－ＥＯの遠位に造影剤の混濁を示した。これはほぼ確実に側副血流を表しているが、再疎通を完全に排除することはできなかった。再疎通を評価するために、動脈の冗長性のない終末器官の動脈を塞栓した。この場合、腎臓の主腎動脈をＢＥＭ－ＥＯ塞栓術のために選択した。合計８匹のブタで、処置中に抗凝固状態にして蛍光透視下で主腎動脈を塞栓した。４匹を１時間で屠殺し、別の４匹を塞栓術の２週間後に屠殺した。図４Ｉは正常な腎血管造影を示す。続いて、ＢＥＭ－ＥＯをリアルタイム蛍光透視中に５Ｆ臨床カテーテルを介して腎動脈に注入した（図４Ｊ）。塞栓術の後、ＤＳＡ画像は、塞栓された腎動脈を通る流れがないことを示した（図４Ｋ）。生存群を屠殺にする直前にＣＴＡを再度実施し、再疎通やイメージングアーチファクトのない腎動脈の完全な閉塞が示された（図４Ｌ及び４Ｍ）。ＢＥＭ－ＥＯによる腎動脈塞栓術は、すべての動物で問題なく達成された（図１９）。これと一致して、ＣＴＡ調査は、２週間で塞栓された腎臓の造影増強の証拠がないことを示し、これは再疎通が観察されなかったことを明確に示している（図１９）。塞栓された腎臓及び反対側の正常な腎臓の両方を採取し、高解像度のマイクロＣＴイメージング及び組織学によって評価した。マイクロＣＴ画像は、ＢＥＭ－ＥＯによる腎動脈の完全な充填を示した（図４Ｎ及び４Ｏ）。組織学的には、非生存群の腎実質は依然として生存していた。ＢＥＭ－ＥＯは、腎門動脈及び分節動脈に見られた（図２０Ａ～２０Ｄ）。２週間の生存群では、閉塞した腎門及び分節動脈における線維炎症反応を伴う腎実質における均一な虚血が再び認められた（図２０Ｅ～２０Ｈ）。これらの変化は、未処理の腎臓と比較して塞栓された腎臓の体積の２週間での有意な損失（ｐ＜０．０５）と一致し、腎動脈の塞栓術が成功したことを示している（図４Ｐ）。
【0079】
ＢＥＭ－ＥＯ塞栓術の全身性副作用を評価するために、各ブタの塞栓術の前後に血液サンプルを採取した。全血球計算（ＣＢＣ）、基礎代謝パネル（ＢＭＰ）、肝機能検査（ＬＦＴ）、及びタンパク質アレイを使用したサイトカインレベルは、目立たない正常範囲内の値を示した（表３）。２週間で、腎動脈塞栓術を受けたコホートでクレアチニンレベルの増加が観察されたことで、ＢＥＭ－ＥＯによる塞栓術が成功したときに期待される機能的結果が示された。
【0080】
【表3】
【0081】
塞栓された腸骨動脈セグメントのさらなるマイクロＣＴ分析では、１時間の非生存群は、冠状及び体軸方向の両方の画像でＢＥＭ－ＥＯによる動脈管腔の完全な充填を示した。対応するＨ＆Ｅ画像は、動脈管腔の均一な充填を示した（図５Ａ）。しかし、２週間の生存群は、冠状画像でより不均一な外観を示した。これは、時間の経過とともに劣化したＢＥＭ－ＥＯが線維組織に置き換えられたことを示唆している。体軸方向ＣＴ画像及び対応するＨ＆Ｅ画像は、ＢＥＭ－ＥＯに対する特徴的な同心円状の線維炎症反応を示している（図５Ａ）。生存群における２週間にわたるＢＥＭ－ＥＯの分解プロファイルを決定するために、広範な画像解析を実施することで、周囲の結合組織から動脈内のＢＥＭ－ＥＯをセグメント化した。これらのデータは、ＢＥＭ－ＥＯの６３％以上が２週間で生分解されたことを明らかにした（図５Ｂ）。ＢＥＭ－ＥＯ組成の安定性を評価するために、サンプルをチューブに入れて３７℃で保存し、０、３、７、１４、及び７０日目にマイクロＣＴを使用して高解像度で連続的に画像化した（図５Ｃ）。マイクロＣＴ画像内の低密度病巣の計数及びチューブ全体のハンスフィールド単位測定を含む、これらのチューブの広範な画像分析を実施した。これらのデータは、経時的にチューブ間に有意差がないことを示した。これは、ＢＥＭ－ＥＯが安定しており、成分の相分離が起こらなかったことを示唆している（図５Ｄ及び５Ｅ）。
【0082】
次に、応急又は緊急の塞栓処置のためにポイントオブケアで調製できるバージョンのＢＥＭ－ＥＯを導入した。同じブタの全血を７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、増殖因子、細胞、及びタンパク質にも富んだ液体形態のＰＲＦを生成した（図６Ａ）。この液体バージョンのＰＲＦを、直ちにＮＣ及びエチオ化油と混合し、ポイントオブケアバージョンのＢＥＭすなわちｐｏｃＢＥＭを生成した。採血からローディングまでの使用準備済みｐｏｃＢＥＭシリンジを調製するプロセスには、２６±０．７分かかった（ｎ＝５）。異なるブタ（ｎ＝５）から調製されたｐｏｃＢＥＭは、粘度プロファイルが類似しており、これは一貫したシアシニング特性を示している（図６Ｂ）。ｐｏｃＢＥＭにはまた、優れた弾性率（１５６８５±４３４Ｐａ）及び回復性があることが明らかになった。これらは、塞栓物質の動脈内での移動又は断片化を抑制する安定性に関与する（図６Ｃ及び６Ｄ）。５フレンチ（１．６６７ｍｍ）臨床カテーテルを介してｐｏｃＢＥＭを注入するために必要な最大注入力は、３０±１．５Ｎ（ｎ＝５）であると測定され、これは用手注入の実現可能性を示している（図６Ｅ）。さらに、ｐｏｃＢＥＭｓの調製プロセスは、１週間細菌の増殖がなく無菌であることが示された（図６Ｆ）。さらに、ｐｏｃＢＥＭの止血性能を試験した。血液単独と比較して、ｐｏｃＢＥＭと接触した血液はより速く凝固した。これはレオロジー研究でも裏付けられた（図６Ｇ及び６Ｈ）。最後に、ｐｏｃＢＥＭのＳＥＭ画像及びＨ＆Ｅ染色は、ｐｏｃＢＥＭにおけるフィブリンの束及び血小板の存在を明らかにした（図２１）。
【0083】
調製後、ｐｏｃＢＥＭを注射器に詰め、同じブタに注射した。８匹のブタの腸骨動脈と４匹のブタの腎動脈が、ｐｏｃＢＥＭを使用して正常に塞栓された。塞栓術中、ｐｏｃＢＥＭは蛍光透視下でリアルタイムに視認でき（図２２Ａ）、即時の止血を達成し、その後のＤＳＡは塞栓された動脈に流れがないことを示した（図７Ａ～７Ｃ）。ブタは、塞栓術後１時間で安楽死させた。すべての塞栓動脈を、マイクロＣＴ及び組織学的評価のために採取した。マイクロＣＴでは、ｐｏｃＢＥＭは腸骨動脈の管腔を完全に閉塞した（図７Ｄ及び図２２Ｂ及び２２Ｃ）。組織学画像では、ｐｏｃＢＥＭは無定形の血管内物質として現れた（図２２Ｄ及び２２Ｅ）。さらに、ｐｏｃＢＥＭを臨床的に使用される塞栓剤と比較するために、ＩＩＡのコイル塞栓術を実施した（図７Ｅ及び７Ｆ）。抗凝固状態の血管内コイルによる塞栓術の失敗の後、コイル塊に１～２ｃｃのｐｏｃＢＥＭを送達すると、失敗したコイルを助ける即時止血を達成することができた（図７Ｇ）。さらに、図７Ｈは、偶発的なｐｏｃＢＥＭの非標的送達の場合、Ｐｅｎｕｍｂｒａ吸引カテーテルシステムを使用してｐｏｃＢＥＭを回収することで血流を回復できることを示している。高解像度マイクロＣＴでは、図７Ｈから採取された腸骨動脈は、コイルによって引き起こされた広範なストリークアーチファクトを示し、残留ｐｏｃＢＥＭの証拠はないため、ｐｏｃＢＥＭがＬＩＩＡから正常に吸引されたことを示唆している（図７Ｉ）。
【0084】
次に、ｐｏｃＢＥＭを使用して腎動脈塞栓術を実施し、その後のＤＳＡ画像は腎臓への血流の完全な停止を示した（図２２Ｆ及び２２Ｇ）。しかし、腎動脈のコイル塞栓術は止血に失敗した。一方、腎動脈のコイル塊への１～２ｃｃのｐｏｃＢＥＭ送達により、即時止血を達成することができた（図７Ｊ及び７Ｋ）。塞栓された腎臓の採取に続いて、高解像度マイクロＣＴイメージングを行った。ｐｏｃＢＥＭ単独で塞栓された腎臓は、イメージングアーチファクトを引き起こすことなく、主腎動脈及び分節枝の均一な充填を示した（図２２Ｈ）。組織学では、ｐｏｃＢＥＭは、塞栓された腎臓の腎門動脈枝及び分節動脈枝に存在していた（図２２Ｉ）。コイルとｐｏｃＢＥＭの両方を受けた腎動脈のマイクロＣＴイメージングでは、コイルからの有意なストリークアーチファクトと、腎動脈のｐｏｃＢＥＭで塞栓されたセグメントの均一なキャスティングが再び示された（図７Ｌ）。
【0085】
まとめると、これらの結果は、ＢＥＭが強化された局所細胞増殖を誘発し、血管分布を促進し、生分解を促進できることを示している。これらの結果は、線維炎症反応が長期の閉塞を維持し、再疎通及び断片化を抑制できることも示している。
【0086】
実験の部
多血小板フィブリン（ＰＲＦ）及び凍結乾燥ＰＲＦ（Ｌ－ＰＲＦ）の調製：
ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦを生成するために、健康な成体のヨークシャー種のブタから血液サンプルを採取した。典型的な調製では、１０ｍＬの全血を無添加のガラス製血液チューブ（ＢＤバキュテイナ（登録商標）、ＢＤ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）に採取した後、直ちに室温で２７００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。遠心分離後、血液は、淡黄色の上層のＰＲＦと、チューブの底にある赤色の血液が豊富な塊とを含む２つの異なる相に分離した。上層のＰＲＦ層を注意深く収集し、－８０℃で凍結し、２４時間凍結乾燥して（Ｌａｂｃｏｎｃｏ ＦｒｅｅＺｏｎｅ、米国カンザスシティ）、Ｌ－ＰＲＦを得た。
多血小板フィブリン（ＰＲＦ）及び凍結乾燥ＰＲＦ（Ｌ－ＰＲＦ）の調製：
ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦを生成するために、健康な成体のヨークシャー種のブタから血液サンプルを採取した。典型的な調製では、１０ｍＬの全血を無添加のガラス製血液チューブ（ＢＤバキュテイナ（登録商標）、ＢＤ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）に採取した後、直ちに室温で２７００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。遠心分離後、血液は、淡黄色の上層のＰＲＦと、チューブの底にある赤色の血液が豊富な塊とを含む２つの異なる相に分離した。上層のＰＲＦ層を注意深く収集し、－８０℃で凍結し、２４時間凍結乾燥して（Ｌａｂｃｏｎｃｏ ＦｒｅｅＺｏｎｅ、米国カンザスシティ）、Ｌ－ＰＲＦを得た。
【0087】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）：
ゲル電気泳動を行うことで、タンパク質抽出バッファーに可溶化されたＬ－ＰＲＦを、還元条件下で８～１６％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して分画した。各サンプルの総タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して測定し、２０μｇの総タンパク質を各ウェルにロードした。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、タンパク質画分の分子量を特定した。ゲルを１００ボルトで１時間分離した後、クーマシーブルーＲ－２５０染色（Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）タンパク質染色、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を行った。ゲルとタンパク質を、１００Ｖで１時間の電気泳動によって分離した。ゲルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６８０（Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ、米国マサチューセッツ州）を使用して画像化した。サンプルはトリプリケートで試験した。
ゲル電気泳動を行うことで、タンパク質抽出バッファーに可溶化されたＬ－ＰＲＦを、還元条件下で８～１６％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して分画した。各サンプルの総タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して測定し、２０μｇの総タンパク質を各ウェルにロードした。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、タンパク質画分の分子量を特定した。ゲルを１００ボルトで１時間分離した後、クーマシーブルーＲ－２５０染色（Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）タンパク質染色、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を行った。ゲルとタンパク質を、１００Ｖで１時間の電気泳動によって分離した。ゲルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６８０（Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ、米国マサチューセッツ州）を使用して画像化した。サンプルはトリプリケートで試験した。
【0088】
ウェスタンブロッティング：
ＶＥＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、及びＴＧＦ－βタンパク質を、ウェスタンブロッティングを使用して検出した。ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦサンプルを、Ｔｒｉｓ－グリシン－ＳＤＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中の８～１６％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）にロードし、還元条件下で１００Ｖで１時間泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）に転写した後、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ溶液で４℃で一晩ブロッキングした。次いで膜をＶＥＧＦ特異的抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ５３４６５；１：１０００）、ＰＤＧＦ特異的抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ３４０４；１：１０００）又はＴＧＦ－β特異的抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ９２４８６；１：１０００）と共に室温で１時間インキュベートした後、それぞれのＨＲＰ結合二次抗体（ＰＤＧＦにはａｂ９７１１０、ＴＧＦ－β及びＶＥＧＦにはａｂ９７０５１）と共に室温で１時間インキュベートした。各インキュベーション期間の後、１％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＰＢＳで膜を１０分間、３回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔｆｅｍｔｏ最大感度試薬基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州）のアリコートと共に膜をインキュベートすることにより、特定のタンパク質バンドを可視化した。各成長因子について、３回の独立したウェスタンブロッティング実験を実施した。
ＶＥＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、及びＴＧＦ－βタンパク質を、ウェスタンブロッティングを使用して検出した。ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦサンプルを、Ｔｒｉｓ－グリシン－ＳＤＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中の８～１６％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）にロードし、還元条件下で１００Ｖで１時間泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）に転写した後、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ溶液で４℃で一晩ブロッキングした。次いで膜をＶＥＧＦ特異的抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ５３４６５；１：１０００）、ＰＤＧＦ特異的抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ３４０４；１：１０００）又はＴＧＦ－β特異的抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ９２４８６；１：１０００）と共に室温で１時間インキュベートした後、それぞれのＨＲＰ結合二次抗体（ＰＤＧＦにはａｂ９７１１０、ＴＧＦ－β及びＶＥＧＦにはａｂ９７０５１）と共に室温で１時間インキュベートした。各インキュベーション期間の後、１％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＰＢＳで膜を１０分間、３回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔｆｅｍｔｏ最大感度試薬基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州）のアリコートと共に膜をインキュベートすることにより、特定のタンパク質バンドを可視化した。各成長因子について、３回の独立したウェスタンブロッティング実験を実施した。
【0089】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
Ｌ－ＰＲＦ調製物を無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬあたり６ｍｇで３７℃で１時間可溶化し、次いで５００×ｇで１分間遠心分離した後、分析まで－８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡキットを製造元の指示に従い使用して、Ｌ－ＰＲＦ抽出物を、ＶＥＧＦ－Ａ（ＲＡＢ１１３５－１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）及びＰＤＧＦ－Ｂ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ＰＤＧＦ－ＢＢ ＥＬＩＳＡ、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、米国ジョージア州）のタンパク質レベルについて分析した。
Ｌ－ＰＲＦ調製物を無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬあたり６ｍｇで３７℃で１時間可溶化し、次いで５００×ｇで１分間遠心分離した後、分析まで－８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡキットを製造元の指示に従い使用して、Ｌ－ＰＲＦ抽出物を、ＶＥＧＦ－Ａ（ＲＡＢ１１３５－１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）及びＰＤＧＦ－Ｂ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ＰＤＧＦ－ＢＢ ＥＬＩＳＡ、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、米国ジョージア州）のタンパク質レベルについて分析した。
【0090】
細胞培養：
Ｌ９２９細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス）から入手し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。加湿した５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。
Ｌ９２９細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス）から入手し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。加湿した５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。
【0091】
抽出物調製：
ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦを、抗生物質を添加した無血清ＭＥＭ中、３７℃のウォーターバス内で７２時間インキュベートした。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより、細胞及びデブリのない抽出物を回収した。
ＰＲＦ及びＬ－ＰＲＦを、抗生物質を添加した無血清ＭＥＭ中、３７℃のウォーターバス内で７２時間インキュベートした。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより、細胞及びデブリのない抽出物を回収した。
【0092】
細胞増殖：
Ｌ９２９細胞の増殖を、ＷＳＴ－１アッセイ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミシガン州アナーバー）で評価した。細胞を９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間インキュベートした。細胞培地を低血清（０．５％ＦＢＳ）ＭＥＭに２４時間交換して、増殖停止を誘導した。次に、細胞をＰＲＦ抽出物とともに最大３日間インキュベートした。細胞生存率を、処理後１日目と３日目に評価した。実験は６レプリケートで行い、独立して３回繰り返した。
Ｌ９２９細胞の増殖を、ＷＳＴ－１アッセイ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミシガン州アナーバー）で評価した。細胞を９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間インキュベートした。細胞培地を低血清（０．５％ＦＢＳ）ＭＥＭに２４時間交換して、増殖停止を誘導した。次に、細胞をＰＲＦ抽出物とともに最大３日間インキュベートした。細胞生存率を、処理後１日目と３日目に評価した。実験は６レプリケートで行い、独立して３回繰り返した。
【0093】
細胞遊走：
細胞をセルトラッカーグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）で蛍光標識し、１チャンバーあたり２０，０００個の細胞密度でプレーティングし（Ｉｂｉｄｉ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、米国ウィスコンシン州フィッツバーグ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で、加湿した５％ＣＯ２の３７℃のチャンバーで２４時間インキュベートした。次いで、インサートを取り出して蛍光標識細胞の単層を作成し、無細胞創傷領域を露出させた。次いで、細胞を温ＰＢＳで洗浄し、ＰＲＦ又はＬ－ＰＲＦ抽出物又は無血清培地（陰性対照）、又は完全増殖培地（陽性対照）で処理した。細胞遊走を、２４時間のインキュベーション後に評価した。蛍光画像を、処理後０時間及び２４時間で撮影した。創傷領域内の遊走細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセスダ）を使用して計数した。データは、陰性対照に対する細胞遊走の倍数変化として計算された。３回の独立した遊走実験を行った。
細胞をセルトラッカーグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）で蛍光標識し、１チャンバーあたり２０，０００個の細胞密度でプレーティングし（Ｉｂｉｄｉ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、米国ウィスコンシン州フィッツバーグ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で、加湿した５％ＣＯ２の３７℃のチャンバーで２４時間インキュベートした。次いで、インサートを取り出して蛍光標識細胞の単層を作成し、無細胞創傷領域を露出させた。次いで、細胞を温ＰＢＳで洗浄し、ＰＲＦ又はＬ－ＰＲＦ抽出物又は無血清培地（陰性対照）、又は完全増殖培地（陽性対照）で処理した。細胞遊走を、２４時間のインキュベーション後に評価した。蛍光画像を、処理後０時間及び２４時間で撮影した。創傷領域内の遊走細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセスダ）を使用して計数した。データは、陰性対照に対する細胞遊走の倍数変化として計算された。３回の独立した遊走実験を行った。
【0094】
血液由来塞栓物質（ＢＥＭ）の調製：
ＢＥＭを、ナノクレイとＬ－ＰＲＦを所定の比率で混合することによって調製した（表１）。スピードミキサー（ＦｌａｃｋＴｅｋ，Ｉｎｃ．、米国サウスカロライナ州ランドラム）を使用して、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）粉末（ＢＹＫ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ Ｌｔｄ．）を氷冷超純水中で混合することにより、ナノクレイ（ＮＣ）（９％ｗ／ｖ）を最初に調製した。次に、Ｌ－ＰＲＦをＮＣに追加することで、様々なＢＥＭ製剤を生成した（表１）。例えば、９重量％ＢＥＭを、２５０ｍｇの凍結乾燥ＰＲＦと２．５ｇの水を７．５ｇの９％（ｗ／ｖ）ＮＣに加え、続いてスピードミキサーで混合して均質化することによって調製した。最終的な９重量％のＢＥＭには、６．６重量％のＮＣ及び２．４重量％のＬ－ＰＲＦが含まれていた。他のＢＥＭを、同様のプロトコルを使用して調製した。ゲルを放射線不透過性にするために、エチオ化油造影剤（Ｌｉｐｉｏｄｏｌ（登録商標）Ｕｌｔｒａｆｌｕｉｄｅ、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｇｕｅｒｂｅｔ、仏国オーネー＝スー＝ボア）をＢＥＭと混合し、すべての固体成分の重量を一定に保ち、２５重量％の最終濃度のエチオ化油を含むＢＥＭ－エチオ化油（ＢＥＭ－ＥＯ）製剤を作成した。
ＢＥＭを、ナノクレイとＬ－ＰＲＦを所定の比率で混合することによって調製した（表１）。スピードミキサー（ＦｌａｃｋＴｅｋ，Ｉｎｃ．、米国サウスカロライナ州ランドラム）を使用して、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）粉末（ＢＹＫ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ Ｌｔｄ．）を氷冷超純水中で混合することにより、ナノクレイ（ＮＣ）（９％ｗ／ｖ）を最初に調製した。次に、Ｌ－ＰＲＦをＮＣに追加することで、様々なＢＥＭ製剤を生成した（表１）。例えば、９重量％ＢＥＭを、２５０ｍｇの凍結乾燥ＰＲＦと２．５ｇの水を７．５ｇの９％（ｗ／ｖ）ＮＣに加え、続いてスピードミキサーで混合して均質化することによって調製した。最終的な９重量％のＢＥＭには、６．６重量％のＮＣ及び２．４重量％のＬ－ＰＲＦが含まれていた。他のＢＥＭを、同様のプロトコルを使用して調製した。ゲルを放射線不透過性にするために、エチオ化油造影剤（Ｌｉｐｉｏｄｏｌ（登録商標）Ｕｌｔｒａｆｌｕｉｄｅ、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｇｕｅｒｂｅｔ、仏国オーネー＝スー＝ボア）をＢＥＭと混合し、すべての固体成分の重量を一定に保ち、２５重量％の最終濃度のエチオ化油を含むＢＥＭ－エチオ化油（ＢＥＭ－ＥＯ）製剤を作成した。
【0095】
ポイントオブケアＢＥＭ（ｐｏｃＢＥＭ）の調製：
ポイントオブケア用のｐｏｃＢＥＭを作成するために、迅速な調製プロトコルを開発した。このプロセスでは、１０ｍＬの全血をガラス管に採取し、直ちに室温で７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、注射用多血小板フィブリン（Ｉ－ＰＲＦ）の上相を生成した。上相（Ｉ－ＰＲＦ）を注射器に吸引し、重量を量った。５グラムの注射用ＰＲＦを、スピードミキサーを使用して９％（ｗ／ｖ）ＮＣ（１５ｇ）及びエチオ化油（２０重量％）と直ちに混合し、ｐｏｃＢＥＭ組成物を生成した。このプロセスは、ブタからｐｏｃＢＥＭを生成し、その後、同じ動物から得られた血液アリコートに由来する塞栓剤を使用して腸骨動脈又は腎動脈の血管内塞栓術をタイムリーに行うことの実現可能性及び適用性を調査するために（ｎ＝５）時間調整された。
ポイントオブケア用のｐｏｃＢＥＭを作成するために、迅速な調製プロトコルを開発した。このプロセスでは、１０ｍＬの全血をガラス管に採取し、直ちに室温で７００ｒｐｍで３分間遠心分離して、注射用多血小板フィブリン（Ｉ－ＰＲＦ）の上相を生成した。上相（Ｉ－ＰＲＦ）を注射器に吸引し、重量を量った。５グラムの注射用ＰＲＦを、スピードミキサーを使用して９％（ｗ／ｖ）ＮＣ（１５ｇ）及びエチオ化油（２０重量％）と直ちに混合し、ｐｏｃＢＥＭ組成物を生成した。このプロセスは、ブタからｐｏｃＢＥＭを生成し、その後、同じ動物から得られた血液アリコートに由来する塞栓剤を使用して腸骨動脈又は腎動脈の血管内塞栓術をタイムリーに行うことの実現可能性及び適用性を調査するために（ｎ＝５）時間調整された。
【0096】
ＮＣ、ＢＥＭ、及びｐｏｃＢＥＭのレオロジー評価：
ＮＣ、ＢＥＭ、及びｐｏｃＢＥＭのレオロジー試験を、回転レオメータ（ＭＣＲ３０２、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オーストリア）を使用して実施した。すべてのレオロジー測定は、２５ｍｍのサンドブラスト処理した上部プレートを用いて行った。上部プレートと底部プレート（これもサンドブラスト処理した）との間の隙間は０．８ｍｍに維持した。各試験では、温度を３７℃で５分間平衡化してから測定を行った。試験中、溶媒トラップを使用し、溶媒トラップの端を水で満たすことで、材料の乾燥を防ぐための加湿環境を提供した。流動曲線は、１０－３／ｓ及び１００／ｓのせん断速度範囲を使用して実行された。大振幅振動掃引（Ｌａｒｇｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｓｗｅｅｐｓ：ＬＡＯＳ）を、すべての材料に対して１０ｒａｄ／ｓの固定角周波数で行った。構造分解中の材料の回復性及び時間の関数としての回復を調査するために、チキソトロピー試験を行った。ひずみは、１０ｒａｄ／ｓで、２．５分間０．１％の低振幅と１分間の１００％の高振幅の間で振動させた。各タイプの試験はトリプリケートで行った。
ＮＣ、ＢＥＭ、及びｐｏｃＢＥＭのレオロジー試験を、回転レオメータ（ＭＣＲ３０２、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オーストリア）を使用して実施した。すべてのレオロジー測定は、２５ｍｍのサンドブラスト処理した上部プレートを用いて行った。上部プレートと底部プレート（これもサンドブラスト処理した）との間の隙間は０．８ｍｍに維持した。各試験では、温度を３７℃で５分間平衡化してから測定を行った。試験中、溶媒トラップを使用し、溶媒トラップの端を水で満たすことで、材料の乾燥を防ぐための加湿環境を提供した。流動曲線は、１０－３／ｓ及び１００／ｓのせん断速度範囲を使用して実行された。大振幅振動掃引（Ｌａｒｇｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｓｗｅｅｐｓ：ＬＡＯＳ）を、すべての材料に対して１０ｒａｄ／ｓの固定角周波数で行った。構造分解中の材料の回復性及び時間の関数としての回復を調査するために、チキソトロピー試験を行った。ひずみは、１０ｒａｄ／ｓで、２．５分間０．１％の低振幅と１分間の１００％の高振幅の間で振動させた。各タイプの試験はトリプリケートで行った。
【0097】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）：
ＳＥＭを実施して、凍結乾燥後のＮＣ、ＢＥＭ、及びｐｏｃＢＥＭの微細構造を調査した。凍結乾燥した標本を、スパッタコーター（ＬＥＩＣＡ ＥＭ ＡＣＥ２００、独国ヴェッツラー）を使用して６ｎｍの金／パラジウム層でコーティングした後、ＳＥＭイメージング（ＪＣＭ－６０００ＰＬＵＳ、ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．、米国マサチューセッツ州ピーボディ）を行った。
ＳＥＭを実施して、凍結乾燥後のＮＣ、ＢＥＭ、及びｐｏｃＢＥＭの微細構造を調査した。凍結乾燥した標本を、スパッタコーター（ＬＥＩＣＡ ＥＭ ＡＣＥ２００、独国ヴェッツラー）を使用して６ｎｍの金／パラジウム層でコーティングした後、ＳＥＭイメージング（ＪＣＭ－６０００ＰＬＵＳ、ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．、米国マサチューセッツ州ピーボディ）を行った。
【0098】
注入力：
材料のカテーテル注入性を、圧縮試験（Ｉｎｓｔｒｏｎ５９４２、Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ノーウッド）を使用して注入力を測定することにより評価した。材料を１ｍＬ Ｍｅｄａｌｌｉｏｎ（登録商標）シリンジ（Ｍｅｒｉｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、米国ユタ州サウスジョーダン）に装填し、材料を、１００ｃｍの５Ｆ（１．６６７ｍｍ）カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国インディアナ州ブルーミントン）に３００μＬ／分の流量で押し込むのに必要な力を、システムソフトウェア（Ｂｌｕｅｈｉｌｌ３、Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ノーウッド）を使用して記録した。各サンプルを３回試験した。注入プロセス中の最大の力を分析し、まとめた。
材料のカテーテル注入性を、圧縮試験（Ｉｎｓｔｒｏｎ５９４２、Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ノーウッド）を使用して注入力を測定することにより評価した。材料を１ｍＬ Ｍｅｄａｌｌｉｏｎ（登録商標）シリンジ（Ｍｅｒｉｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、米国ユタ州サウスジョーダン）に装填し、材料を、１００ｃｍの５Ｆ（１．６６７ｍｍ）カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国インディアナ州ブルーミントン）に３００μＬ／分の流量で押し込むのに必要な力を、システムソフトウェア（Ｂｌｕｅｈｉｌｌ３、Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ノーウッド）を使用して記録した。各サンプルを３回試験した。注入プロセス中の最大の力を分析し、まとめた。
【0099】
ｅｘ ｖｉｖｏ閉塞変位試験：
ＮＣ、ＢＥＭ、ＢＥＭ－ＥＯ組成物が静水圧に耐える性能を、閉塞－変位試験を使用して評価した。簡潔に述べると、血管の塞栓形成を模倣するために、１ｍＬの材料をチューブに入れた。ＰＢＳを７０ｍＬ／分の一定流量で注入し（ＧｅｎｉｅＴｏｕｃｈ（商標）シリンジポンプシステム、Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒｔａｉｏｎ、米国コネチカット州）、材料を変位させた。材料の変位中の圧力を、材料の上流と下流に接続された圧力センサ（Ｏｍｅｇａ、ＰＸ４０９、米国コネチカット州）を使用して記録した。各材料に対して３回の試験を行い、記録された最大圧力をまとめた。
ＮＣ、ＢＥＭ、ＢＥＭ－ＥＯ組成物が静水圧に耐える性能を、閉塞－変位試験を使用して評価した。簡潔に述べると、血管の塞栓形成を模倣するために、１ｍＬの材料をチューブに入れた。ＰＢＳを７０ｍＬ／分の一定流量で注入し（ＧｅｎｉｅＴｏｕｃｈ（商標）シリンジポンプシステム、Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒｔａｉｏｎ、米国コネチカット州）、材料を変位させた。材料の変位中の圧力を、材料の上流と下流に接続された圧力センサ（Ｏｍｅｇａ、ＰＸ４０９、米国コネチカット州）を使用して記録した。各材料に対して３回の試験を行い、記録された最大圧力をまとめた。
【0100】
無菌試験：
ゲルの無菌性を評価するために、ＢＥＭ－ＥＯ及びｐｏｃＢＥＭ抽出物のアリコートを、オービタルシェーカーを使用して３７℃、１８０ＲＰＭで２４時間又は１週間、ＬＢブロスに可溶化した。陽性対照として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とのＬＢブロスの接種を使用した。各ＬＢ溶液の２００μＬアリコートの光学密度を、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ．、米国カリフォルニア州）を使用して６００ｎｍで測定した。さらに、ミューラーヒントン寒天プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｍｅｌ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ａｇａｒ、Ｒ４５４０８２、米国マサチューセッツ州）を使用して、１週間のインキュベーション後の各アリコートの細菌増殖の評価をさらに除外した。接種後、寒天プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。
ゲルの無菌性を評価するために、ＢＥＭ－ＥＯ及びｐｏｃＢＥＭ抽出物のアリコートを、オービタルシェーカーを使用して３７℃、１８０ＲＰＭで２４時間又は１週間、ＬＢブロスに可溶化した。陽性対照として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とのＬＢブロスの接種を使用した。各ＬＢ溶液の２００μＬアリコートの光学密度を、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ．、米国カリフォルニア州）を使用して６００ｎｍで測定した。さらに、ミューラーヒントン寒天プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｍｅｌ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ａｇａｒ、Ｒ４５４０８２、米国マサチューセッツ州）を使用して、１週間のインキュベーション後の各アリコートの細菌増殖の評価をさらに除外した。接種後、寒天プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。
【0101】
細胞毒性：
すべてのバイオマテリアルの細胞毒性を、国際標準（ＩＳＯ１０９９３）プロトコルに従い、ＷＳＴ－１アッセイ（Ｃａｙｍｅｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミシガン州アナーバー）を使用してＬ９２９細胞で評価した。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０００細胞の密度で播種し、２４時間インキュベートした。次に、細胞を、ＭＥＭ増殖培地で様々な濃度（１００％、５０％、２５％、１２．５％（ｖ／ｖ））に希釈した後のＰＲＦ、Ｌ－ＰＲＦ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯ抽出物で処理した。２４時間後、細胞生存率を、ＷＳＴ－１アッセイ（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミシガン州アナーバー）を製造元の指示に従って使用して評価した。３回の独立した実験を、各実験につき４レプリケートで行った。
すべてのバイオマテリアルの細胞毒性を、国際標準（ＩＳＯ１０９９３）プロトコルに従い、ＷＳＴ－１アッセイ（Ｃａｙｍｅｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミシガン州アナーバー）を使用してＬ９２９細胞で評価した。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０００細胞の密度で播種し、２４時間インキュベートした。次に、細胞を、ＭＥＭ増殖培地で様々な濃度（１００％、５０％、２５％、１２．５％（ｖ／ｖ））に希釈した後のＰＲＦ、Ｌ－ＰＲＦ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯ抽出物で処理した。２４時間後、細胞生存率を、ＷＳＴ－１アッセイ（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミシガン州アナーバー）を製造元の指示に従って使用して評価した。３回の独立した実験を、各実験につき４レプリケートで行った。
【0102】
凝固試験：
９６ウェルプレートにおけるＢＥＭ－ＥＯ組成物の止血性能及びレオロジー止血試験を、別の場所に記載されているように行った（Ｇａｈａｒｗａｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．，８：９８３３（２０１４））。血液の時間依存係数変化は、血液アリコートのみを使用するか、ｐｏｃＢＥＭ、又はＢＥＭ－ＥＯと接触させて、回転レオメータ（ＭＣＲ３０２、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オーストリア）を使用して行われた。
９６ウェルプレートにおけるＢＥＭ－ＥＯ組成物の止血性能及びレオロジー止血試験を、別の場所に記載されているように行った（Ｇａｈａｒｗａｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．，８：９８３３（２０１４））。血液の時間依存係数変化は、血液アリコートのみを使用するか、ｐｏｃＢＥＭ、又はＢＥＭ－ＥＯと接触させて、回転レオメータ（ＭＣＲ３０２、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オーストリア）を使用して行われた。
【0103】
ｉｎ ｖｉｖｏラットモデル：
ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯ組成物の４回の皮下注射を、４～５週齢のオスのスプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の背部にイソフルラン麻酔下で行った（図１３）。各注射部位は、０．２ｍＬの各バイオマテリアルを受けた。ラットのサブグループを、注射後３、１４、又は２８日で安楽死させた（１群あたりｎ＝４）。
ＮＣ、ＢＥＭ、及びＢＥＭ－ＥＯ組成物の４回の皮下注射を、４～５週齢のオスのスプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の背部にイソフルラン麻酔下で行った（図１３）。各注射部位は、０．２ｍＬの各バイオマテリアルを受けた。ラットのサブグループを、注射後３、１４、又は２８日で安楽死させた（１群あたりｎ＝４）。
【0104】
ｉｎ ｖｉｖｏブタモデル：
実験の前に、ヨークシャー種のブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍｓ、カリフォルニア州ブレントウード）を順応させるために４日間飼育した。５ｍｇ／ｋｇのチレタミン・ゾラゼパム（Ｔｅｌａｚｏｌ、Ｚｏｅｔｉｓ、米国ニューハンプシャー州）、２ｍｇ／ｍＬのキシラジン、及び０．０２ｍｇ／ｋｇのグリコピロレートの筋肉内注射を行うことで麻酔を導入した。手術の前に、血管造影台（Ｐａｎｎｏｍｅｄ Ａｅｒｏｎ、ＤＲＥ、ＫＹ）の上でブタを仰向けにして挿管した。処置中、麻酔は１．５～３％イソフルランの吸入で維持され、心電図、経皮オキシヘモグロビン飽和度（ＳｐＯ２）、呼気終末ＣＯ２濃度、吸気酸素分率、深部体温も監視した。超音波（ＡＣＵＳＯＮ Ｓ２０００、Ｓｉｅｍｅｎｓ、独国）及び蛍光透視（ＯＥＣ９８００ ｐｌｕｓ Ｃ－Ａｒｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国イリノイ州シカゴ）ガイダンスを使用して、頸動脈への経皮的アクセスを、標準の２１Ｇアクセス針と０．０１８インチ（０．４５７ｍｍ）の硬いガイドワイヤを使用して達成した。このワイヤを０．０３５Ｂｅｎｔｓｏｎワイヤに交換し、５フレンチ（１．６６７ｍｍ）の血管シースを留置した。５バーンスタインカテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国インディアナ州ブルーミントン）と０．０３５ガイドワイヤ（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国インディアナ州ブルーミントン）の組み合わせを使用して、カテーテルの先端を標的動脈に配置した。ＤＳＡ（３５０ｍｇＩ／ｍＬ Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、マサチューセッツ州）を用いて位置を確認した。ＢＥＭ－ＥＯ又はｐｏｃＢＥＭ組成物を含む１ｍＬのＭｅｄａｌｌｉｏｎ（登録商標）シリンジを、ルアーロックを介してカテーテルに接続し、リアルタイム蛍光透視ガイダンス中に腸骨動脈又は腎動脈に１５～２０秒かけて注入した。ＢＥＭ－ＥＯ又はｐｏｃＢＥＭ組成物による塞栓形成後、塞栓動脈への血流を評価するために、複数回の用手注入ＤＳＡを実施した。塞栓術後、ブタを塞栓後１時間（非生存群）又は２週間（生存群）のいずれかで安楽死させた。手術の前後に分析のために血液サンプルを採取した。ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）スキャンを、生存群の塞栓術の２週間後に行った。ＢＥＭ－ＥＯ又はｐｏｃＢＥＭで塞栓された動脈及び腎臓をマイクロＣＴイメージング及び組織病理学分析のために採取した。
実験の前に、ヨークシャー種のブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍｓ、カリフォルニア州ブレントウード）を順応させるために４日間飼育した。５ｍｇ／ｋｇのチレタミン・ゾラゼパム（Ｔｅｌａｚｏｌ、Ｚｏｅｔｉｓ、米国ニューハンプシャー州）、２ｍｇ／ｍＬのキシラジン、及び０．０２ｍｇ／ｋｇのグリコピロレートの筋肉内注射を行うことで麻酔を導入した。手術の前に、血管造影台（Ｐａｎｎｏｍｅｄ Ａｅｒｏｎ、ＤＲＥ、ＫＹ）の上でブタを仰向けにして挿管した。処置中、麻酔は１．５～３％イソフルランの吸入で維持され、心電図、経皮オキシヘモグロビン飽和度（ＳｐＯ２）、呼気終末ＣＯ２濃度、吸気酸素分率、深部体温も監視した。超音波（ＡＣＵＳＯＮ Ｓ２０００、Ｓｉｅｍｅｎｓ、独国）及び蛍光透視（ＯＥＣ９８００ ｐｌｕｓ Ｃ－Ａｒｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国イリノイ州シカゴ）ガイダンスを使用して、頸動脈への経皮的アクセスを、標準の２１Ｇアクセス針と０．０１８インチ（０．４５７ｍｍ）の硬いガイドワイヤを使用して達成した。このワイヤを０．０３５Ｂｅｎｔｓｏｎワイヤに交換し、５フレンチ（１．６６７ｍｍ）の血管シースを留置した。５バーンスタインカテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国インディアナ州ブルーミントン）と０．０３５ガイドワイヤ（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国インディアナ州ブルーミントン）の組み合わせを使用して、カテーテルの先端を標的動脈に配置した。ＤＳＡ（３５０ｍｇＩ／ｍＬ Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、マサチューセッツ州）を用いて位置を確認した。ＢＥＭ－ＥＯ又はｐｏｃＢＥＭ組成物を含む１ｍＬのＭｅｄａｌｌｉｏｎ（登録商標）シリンジを、ルアーロックを介してカテーテルに接続し、リアルタイム蛍光透視ガイダンス中に腸骨動脈又は腎動脈に１５～２０秒かけて注入した。ＢＥＭ－ＥＯ又はｐｏｃＢＥＭ組成物による塞栓形成後、塞栓動脈への血流を評価するために、複数回の用手注入ＤＳＡを実施した。塞栓術後、ブタを塞栓後１時間（非生存群）又は２週間（生存群）のいずれかで安楽死させた。手術の前後に分析のために血液サンプルを採取した。ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）スキャンを、生存群の塞栓術の２週間後に行った。ＢＥＭ－ＥＯ又はｐｏｃＢＥＭで塞栓された動脈及び腎臓をマイクロＣＴイメージング及び組織病理学分析のために採取した。
【0105】
全血球計算（ＣＢＣ）及び血液生化学：
獣医用血液分析装置（ＨｅｍａＴｒｕｅ、Ｈｅｓｋａ、米国コロラド州ラブランド）を使用してＣＢＣを分析した。生化学は、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＲＩ－ＣＨＥＭ ４０００、Ｈｅｓｋａ、米国コロラド州ラブランド）によって行った。測定されたＣＢＣ及び生化学値を、ブタの全体的な健康状態を評価するために使用した。また、記載されているように、ラットに対してＣＢＣを実施した。ブタの血清サンプルを、ブタのサイトカインアレイ１３－ｐｌｅｘ（Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カルガリー）を使用して分析した。
獣医用血液分析装置（ＨｅｍａＴｒｕｅ、Ｈｅｓｋａ、米国コロラド州ラブランド）を使用してＣＢＣを分析した。生化学は、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＲＩ－ＣＨＥＭ ４０００、Ｈｅｓｋａ、米国コロラド州ラブランド）によって行った。測定されたＣＢＣ及び生化学値を、ブタの全体的な健康状態を評価するために使用した。また、記載されているように、ラットに対してＣＢＣを実施した。ブタの血清サンプルを、ブタのサイトカインアレイ１３－ｐｌｅｘ（Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カルガリー）を使用して分析した。
【0106】
コンピューター断層撮影血管造影（ＣＴＡ）：
デュアルエナジーＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｆｏｒｃｅ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、独国エルランゲン）を使用して、ブタの全身イメージングを行った。ＣＴスキャン中、１２０ｍＬのＩＶ造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ ３５０ｍｇＩ／ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国マサチューセッツ州）の注入の前後に、標準的なシンカットＣＴ血管造影を行った。ＣＴスキャンは、０．６ｍｍの検出器サイズ構成で８０ｋＶｐ～１５０ｋＶｐのエネルギーレベルで行った。ＣＴスキャンに続いて、３Ｄ再構成、ボリュメトリック研究、及び画像解釈、ならびに、画像判読を、Ｖｉｓａｇｅ７．１１ＰＡＣＳシステム（Ｖｉｓａｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。
デュアルエナジーＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｆｏｒｃｅ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、独国エルランゲン）を使用して、ブタの全身イメージングを行った。ＣＴスキャン中、１２０ｍＬのＩＶ造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ ３５０ｍｇＩ／ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国マサチューセッツ州）の注入の前後に、標準的なシンカットＣＴ血管造影を行った。ＣＴスキャンは、０．６ｍｍの検出器サイズ構成で８０ｋＶｐ～１５０ｋＶｐのエネルギーレベルで行った。ＣＴスキャンに続いて、３Ｄ再構成、ボリュメトリック研究、及び画像解釈、ならびに、画像判読を、Ｖｉｓａｇｅ７．１１ＰＡＣＳシステム（Ｖｉｓａｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。
【0107】
組織学調査：
組織サンプルをパラフィンブロックに埋め込んだ。４μｍの切片をＨ＆Ｅ、マッソントリクローム、及びＥＶＧ弾性染色で染色し、ＰＣＮＡ（ａｂ９２５５２、Ａｂｃａｍ、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）及びＣＤ３１（ａｂ１８２９８１）の免疫染色を行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所）を使用して、皮下注射された皮膚組織の総細胞数を含む、組織学スライドの形態計測分析を実施し、各組織切片でランダムに選択された測定面積０．１ｍｍ２の８つの視野で、ＰＣＮＡ陽性細胞の数をカウントした。線維性被膜の厚さと細胞浸潤の厚さを、マッソントリクローム染色切片で測定した。各注入部位の表皮側で、サンプルごとに１２カ所のランダムな位置を選択して、線バイオマテリアル注入後に形成された維性被膜の厚さと細胞浸潤層の厚さを測定した。皮下注射領域の周囲の血管の数を、サンプルごとにランダムに選択された８つの高倍率視野（倍率４００倍）で手動でカウントした。
組織サンプルをパラフィンブロックに埋め込んだ。４μｍの切片をＨ＆Ｅ、マッソントリクローム、及びＥＶＧ弾性染色で染色し、ＰＣＮＡ（ａｂ９２５５２、Ａｂｃａｍ、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）及びＣＤ３１（ａｂ１８２９８１）の免疫染色を行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所）を使用して、皮下注射された皮膚組織の総細胞数を含む、組織学スライドの形態計測分析を実施し、各組織切片でランダムに選択された測定面積０．１ｍｍ２の８つの視野で、ＰＣＮＡ陽性細胞の数をカウントした。線維性被膜の厚さと細胞浸潤の厚さを、マッソントリクローム染色切片で測定した。各注入部位の表皮側で、サンプルごとに１２カ所のランダムな位置を選択して、線バイオマテリアル注入後に形成された維性被膜の厚さと細胞浸潤層の厚さを測定した。皮下注射領域の周囲の血管の数を、サンプルごとにランダムに選択された８つの高倍率視野（倍率４００倍）で手動でカウントした。
【0108】
マイクロＣＴイメージング：
Ｓｋｙｓｃａｎ１２７６（Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー、コンティフ）を使用して、マイクロＣＴイメージングを実施した。スキャンパラメータは、腎臓サンプルでは５５ｋＶ、２００μＡ、０．５ｍｍアルミニウム（Ａｌ）フィルターを使用した８０μｍの解像度、及び０．８°の回転ステップであった。腸骨動脈サンプルには、４５ｋＶ、２００μＡエネルギーレベル、０．２５Ａｌフィルターを使用した２０μｍの解像度、及び０．４°回転ステップのスキャンパラメータを使用した。ＢＥＭ－ＥＯ充填気密チューブは、５０ｋＶ、２００μＡエネルギーレベル、Ａｌ０．２５ｍｍフィルターでの２０μｍの解像度、及び０．６°回転ステップでスキャンした。各スキャンのマイクロＣＴ再構成を、ＮＲｅｃｏｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー、コンティフ）を使用して行った。塞栓された腸骨動脈のＢＥＭ－ＥＯ体積を、Ｍｉｍｉｃｓセグメンテーションソフトウェア（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ、ベルギー、ルーヴェン）を使用して、再構成されたマイクロＣＴ画像を閾値処理することによって計算した。スキャンされたＢＥＭ－ＥＯ充填エアロックチューブサンプルを、ＣＴａｎソフトウェア（ＣＴＡｎａｌｙｚｅｒ、Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー、コンティフ）を使用して分析した。
Ｓｋｙｓｃａｎ１２７６（Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー、コンティフ）を使用して、マイクロＣＴイメージングを実施した。スキャンパラメータは、腎臓サンプルでは５５ｋＶ、２００μＡ、０．５ｍｍアルミニウム（Ａｌ）フィルターを使用した８０μｍの解像度、及び０．８°の回転ステップであった。腸骨動脈サンプルには、４５ｋＶ、２００μＡエネルギーレベル、０．２５Ａｌフィルターを使用した２０μｍの解像度、及び０．４°回転ステップのスキャンパラメータを使用した。ＢＥＭ－ＥＯ充填気密チューブは、５０ｋＶ、２００μＡエネルギーレベル、Ａｌ０．２５ｍｍフィルターでの２０μｍの解像度、及び０．６°回転ステップでスキャンした。各スキャンのマイクロＣＴ再構成を、ＮＲｅｃｏｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー、コンティフ）を使用して行った。塞栓された腸骨動脈のＢＥＭ－ＥＯ体積を、Ｍｉｍｉｃｓセグメンテーションソフトウェア（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ、ベルギー、ルーヴェン）を使用して、再構成されたマイクロＣＴ画像を閾値処理することによって計算した。スキャンされたＢＥＭ－ＥＯ充填エアロックチューブサンプルを、ＣＴａｎソフトウェア（ＣＴＡｎａｌｙｚｅｒ、Ｂｒｕｋｅｒ、ベルギー、コンティフ）を使用して分析した。
【0109】
統計分析：
特に明記しない限り、すべてのデータは平均±ＳＥＭとして報告されている。複数の群間の統計的有意差は、テューキーの事後検定又はダネットの多重比較検定による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して計算された。スチューデントのｔ検定を使用して、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ８（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国カリフォルニア州）を使用して２つの群間の統計的有意差を計算した。ｐ＜０．０５は有意であると見なされた。
特に明記しない限り、すべてのデータは平均±ＳＥＭとして報告されている。複数の群間の統計的有意差は、テューキーの事後検定又はダネットの多重比較検定による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して計算された。スチューデントのｔ検定を使用して、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ８（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国カリフォルニア州）を使用して２つの群間の統計的有意差を計算した。ｐ＜０．０５は有意であると見なされた。
【0110】
実施例２：ＢＥＭによる血行動態の不安定性の治療
急性出血におけるｐｏｃＢＥＭの値を試験するために、２０ｃｍの１８Ｇ針を使用して、腎臓及び骨盤血管又はブタへの直接損傷を誘発した（図２３）。２つの腎臓では、超音波及び蛍光透視ガイダンス下で針を使用して、仮性動脈瘤及び活発な血管外漏出（図２３Ａ～２３Ｆ）を含むかなりの損傷が生じた。その後、動物は血行動態が不安定になり、頻脈及び低血圧になった。これらの動物に直ちにｐｏｃＢＥＭが与えられ、止血を達成し、血行動態の安定性を回復させた（図２３Ｃ及び２３Ｆ）。別の２匹の動物では、外腸骨動脈の分枝などの骨盤血管に出血性動脈仮性動脈瘤が作成された（図２３Ｇ～２３Ｌ）。これらの分枝を、続いて血行動態の安定性を回復するために塞栓した（図２３Ｉ及び２３Ｌ）。
急性出血におけるｐｏｃＢＥＭの値を試験するために、２０ｃｍの１８Ｇ針を使用して、腎臓及び骨盤血管又はブタへの直接損傷を誘発した（図２３）。２つの腎臓では、超音波及び蛍光透視ガイダンス下で針を使用して、仮性動脈瘤及び活発な血管外漏出（図２３Ａ～２３Ｆ）を含むかなりの損傷が生じた。その後、動物は血行動態が不安定になり、頻脈及び低血圧になった。これらの動物に直ちにｐｏｃＢＥＭが与えられ、止血を達成し、血行動態の安定性を回復させた（図２３Ｃ及び２３Ｆ）。別の２匹の動物では、外腸骨動脈の分枝などの骨盤血管に出血性動脈仮性動脈瘤が作成された（図２３Ｇ～２３Ｌ）。これらの分枝を、続いて血行動態の安定性を回復するために塞栓した（図２３Ｉ及び２３Ｌ）。
【0111】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
