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特許7642949増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-03
(45)【発行日】2025-03-11
(54)【発明の名称】増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20250304BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20250304BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20250304BHJP
C12N 5/02 20060101ALN20250304BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12Q1/02
A61L27/38 100
C12N5/02
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2021565592
(86)(22)【出願日】2020-12-15
(86)【国際出願番号】 JP2020046781
(87)【国際公開番号】W WO2021125176
(87)【国際公開日】2021-06-24
【審査請求日】2023-06-23
(31)【優先権主張番号】P 2019226717
(32)【優先日】2019-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004178
【氏名又は名称】ＪＳＲ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】598121341
【氏名又は名称】慶應義塾
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】増田 範生
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 俊朗
(72)【発明者】
【氏名】五十嵐 亮
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０４８１９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５１６５６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０００２６０２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／２２２８５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０１６１７３４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Gene Expression，2003年，vol.11，p.55-75
【文献】Cell，2018年，vol.175, no.6，p.1591
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
代謝活性化肝オルガノイドの製造方法であって、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ること、及び、
前記増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ること、を含み、
前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカイン、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、形質転換増殖因子－β阻害剤、骨形成タンパク質阻害剤、及びフォルスコリンを含み、
前記分化用培地は、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、形質転換増殖因子－β阻害剤、骨形成タンパク質阻害剤、及びフォルスコリンを含み、前記分化用培地中に含まれるインターロイキン－６ファミリーサイトカインの濃度は０ｎｇ／ｍＬであるか又は１０ｎｇ／ｍＬ未満であり、
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、製造方法。
【請求項2】
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記増殖用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度は０ｍＭであるか又は９ｍＭ以下である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項5】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項6】
前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項7】
前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項8】
前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項9】
前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項10】
前記増殖用培地中での培養において、前記肝幹細胞又は前記肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項11】
前記増殖用培地中での培養において、前記細胞外マトリックスがコラーゲン及びマトリゲルの混合物である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項12】
前記増殖用培地中での培養において、少なくとも２週間培養を行う、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項13】
前記分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度は０ｍＭであるか又は９ｍＭ以下である、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項14】
前記分化用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項15】
前記分化用培地が、ビタミンＤを更に含む、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項16】
前記分化用培地が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を更に含む、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項17】
代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法であって、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地中で培養し、前記代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導することを含み、
前記誘導用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカイン、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、形質転換増殖因子－β阻害剤、骨形成タンパク質阻害剤、及びフォルスコリンを含み、
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、誘導方法。
【請求項18】
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１７に記載の誘導方法。
【請求項19】
請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、代謝活性化肝オルガノイド。
【請求項20】
インターロイキン－６ファミリーサイトカイン、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、形質転換増殖因子－β阻害剤、骨形成タンパク質阻害剤、及びフォルスコリンを含み、
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、増殖性肝オルガノイドを培養するための増殖用培地。
【請求項21】
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２０に記載の増殖用培地。
【請求項22】
請求項１９に記載の代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させることと、前記代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することと、
を含む、被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用に関する。
本願は、２０１９年１２月１６日に、日本に出願された特願２０１９－２２６７１７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年１２月１６日に、日本に出願された特願２０１９－２２６７１７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
医薬品開発の薬物動態試験において、げっ歯類を用いたインビボ試験や、げっ歯類由来の初代（凍結）肝細胞（肝実質細胞）を用いたインビトロ試験が行われている。しかしながら、種差があるためヒト特異的に発生する毒性を予測することが困難である。一方、ヒト初代（凍結）肝細胞では、数に限りがあることから、良質の肝細胞を安定して入手することが難しい。
【0003】
薬物動態試験においては、特に肝細胞に多く存在するシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）に着目し、薬物の研究開発が進められている。ＣＹＰは、人体に存在する生体異物を代謝する主要な酵素の１つである。ＣＹＰによる薬物の代謝を解析する際に、ＨｅｐａＲＧ（登録商標、以降、「登録商標」との記載を省略する）というフランス国立衛生医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）で開発されたヒト肝腫瘍由来細胞株が用いられる。ＨｅｐａＲＧ細胞は、ＣＹＰについてヒト肝細胞の平均的な活性を有すると考えられている。しかしながら、ＨｅｐａＲＧ細胞はＣＹＰの活性を回復させるために、培養時間を要し、さらに、購入するためにコストがかかる。また、ＨｅｐＧ２細胞等のヒト由来の肝癌細胞株はＣＹＰの活性が低く、ＣＹＰによる代謝に関連した毒性を評価できない。また、安定した細胞数を確保する観点からヒトｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の多能性幹細胞由来の肝細胞を用いることも検討されている。しかしながら、ヒトｉＰＳ細胞由来の肝細胞では、ヒト由来の肝癌細胞株と同様に、ＣＹＰの活性が低く、さらに、細胞の成熟度についても初代（凍結）肝細胞よりも劣る。これらのことから、より安定に使用できるインビトロにより製造されたヒト由来の肝細胞（肝オルガノイド）が必要とされている。
【0004】
２０１３年にＨａｎｓ Ｃｌｅｖｅｒｓらによってマウス由来の肝細胞から肝オルガノイドを培養する方法が確立され、その後、２０１５年に同グループによってヒト由来の肝幹細胞から肝オルガノイドが確立されている。さらに、２０１８年には同グループによって前出の肝オルガノイドとは異なる細胞起源の肝幹細胞から肝オルガノイドが確立されており、肝細胞の新たな供給源として期待されている（特許文献１及び非特許文献１～非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】日本国特表２０１３－５３５２０１号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Huch M et al., “Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.”, Cell, Vol. 160, Issue 1, p299-312, 2015.
【文献】Hu H et al, “Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.”, Cell, Vol. 175, Issue 6, p1591-1606, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイド及びその製造方法、並びに、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイド及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
すなわち、本発明は、以下の実施態様を含む。
（１） 増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、
肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、
前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、製造方法。
（２） 前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインが、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）に記載の製造方法。
（３） 前記増殖用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１）又は前記（２）に記載の製造方法。
（４） 前記増殖用培地が成長因子を更に含む、前記（１）～前記（３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（５） 前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（４）に記載の製造方法。
（６） 前記増殖用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１）～前記（５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（６） 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（６）に記載の製造方法。
（８） 前記増殖用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（９） 前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（８）に記載の製造方法。
（１０） 前記増殖用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（９）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１１） 前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１０）に記載の製造方法。
（１２） 前記増殖用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（１１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１３） 前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１２）に記載の製造方法。
（１４） 前記増殖用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１）～前記（１３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１５） 前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１）～前記（１４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１６） 前記増殖用培地中での培養において、前記肝幹細胞又は前記肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、前記（１）～前記（１５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１７） 前記増殖用培地中での培養において、前記細胞外マトリックスがコラーゲン及びマトリゲルの混合物である、前記（１６）に記載の製造方法。
（１８） 前記増殖用培地中での培養において、少なくとも２週間培養を行う、前記（１）～前記（１７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１９） 代謝活性化肝オルガノイドの製造方法であって、
前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、
前記分化用培地が、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法。
（２０） 前記分化用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１９）に記載の製造方法。
（２１） 前記分化用培地が成長因子を更に含む、前記（１９）又は前記（２０）に記載の製造方法。
（２２） 前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２１）に記載の製造方法。
（２３） 前記分化用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１９）～前記（２２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２４） 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２３）に記載の製造方法。
（２５） 前記分化用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２６） 前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２５）に記載の製造方法。
（２７） 前記分化用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２６）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２８） 前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２７）に記載の製造方法。
（２９） 前記分化用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２８）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３０） 前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２９）に記載の製造方法。
（３１） 前記分化用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１９）～前記（３０）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３２） 前記分化用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１９）～前記（３１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３３） 前記分化用培地が、ビタミンＤを更に含む、前記（１９）～前記（３２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３４） 前記分化用培地が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（３３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３５） 代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法であって、
前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地中で培養し、前記代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導することを含み、
前記誘導用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法。
（３６） 前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、増殖性肝オルガノイド。
（３７） 前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、代謝活性化肝オルガノイド。
（３８） インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、増殖性肝オルガノイドを培養するための増殖用培地。
（３９） 前記（３７）に記載の代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させることと、
前記代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することと、
を含む、被験物質の評価方法。
（１） 増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、
肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、
前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、製造方法。
（２） 前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインが、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）に記載の製造方法。
（３） 前記増殖用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１）又は前記（２）に記載の製造方法。
（４） 前記増殖用培地が成長因子を更に含む、前記（１）～前記（３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（５） 前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（４）に記載の製造方法。
（６） 前記増殖用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１）～前記（５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（６） 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（６）に記載の製造方法。
（８） 前記増殖用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（９） 前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（８）に記載の製造方法。
（１０） 前記増殖用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（９）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１１） 前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１０）に記載の製造方法。
（１２） 前記増殖用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（１１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１３） 前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１２）に記載の製造方法。
（１４） 前記増殖用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１）～前記（１３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１５） 前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１）～前記（１４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１６） 前記増殖用培地中での培養において、前記肝幹細胞又は前記肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、前記（１）～前記（１５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１７） 前記増殖用培地中での培養において、前記細胞外マトリックスがコラーゲン及びマトリゲルの混合物である、前記（１６）に記載の製造方法。
（１８） 前記増殖用培地中での培養において、少なくとも２週間培養を行う、前記（１）～前記（１７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１９） 代謝活性化肝オルガノイドの製造方法であって、
前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、
前記分化用培地が、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法。
（２０） 前記分化用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１９）に記載の製造方法。
（２１） 前記分化用培地が成長因子を更に含む、前記（１９）又は前記（２０）に記載の製造方法。
（２２） 前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２１）に記載の製造方法。
（２３） 前記分化用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１９）～前記（２２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２４） 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２３）に記載の製造方法。
（２５） 前記分化用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２６） 前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２５）に記載の製造方法。
（２７） 前記分化用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２６）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２８） 前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２７）に記載の製造方法。
（２９） 前記分化用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２８）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３０） 前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２９）に記載の製造方法。
（３１） 前記分化用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１９）～前記（３０）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３２） 前記分化用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１９）～前記（３１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３３） 前記分化用培地が、ビタミンＤを更に含む、前記（１９）～前記（３２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３４） 前記分化用培地が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（３３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３５） 代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法であって、
前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地中で培養し、前記代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導することを含み、
前記誘導用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法。
（３６） 前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、増殖性肝オルガノイド。
（３７） 前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、代謝活性化肝オルガノイド。
（３８） インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、増殖性肝オルガノイドを培養するための増殖用培地。
（３９） 前記（３７）に記載の代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させることと、
前記代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することと、
を含む、被験物質の評価方法。
【発明の効果】
【0009】
上記態様の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドを提供することができる。上記態様の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
【0012】
本明細書中で例示する各成分、例えば増殖用培地中や分化用培地中の各成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種単独で含有することもでき、或いは、２種以上組み合わせて含有することもできる。
【0013】
本明細書で、「Ａ～Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢをその数値範囲に含むものとする。
【0014】
＜増殖性肝オルガノイドの製造方法＞
一実施形態において、本発明は、増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ること（以下、「工程Ａ」ともいう）を含み、前記増殖用培地は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）ファミリーサイトカインを含む、製造方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ること（以下、「工程Ａ」ともいう）を含み、前記増殖用培地は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）ファミリーサイトカインを含む、製造方法を提供する。
【0015】
本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドが得られる。
【0016】
従来のヒト初代（凍結）肝細胞では、数に限りがあることから、良質の肝細胞を安定して入手することが難しかった。
【0017】
これに対して、本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法では、ヒト初代（凍結）肝細胞等の肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片から、増殖能を有する増殖性肝オルガノイドを得ることができる。そのため、薬物動態試験に必要な良質の肝細胞を安定して供給することができる。
【0018】
また、本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化させることで、代謝活性に優れた、代謝活性化肝オルガノイドが得られる。
本明細書における「代謝活性化肝オルガノイド」とは、生体の肝臓組織を構成する肝細胞と類似の特性を有する細胞集団であることを意味する。代謝活性化肝オルガノイドとしては、例えば、ヒト初代凍結浮遊肝細胞での発現量に対してアルブミンの発現量が５０％以上、ＣＹＰ２Ｅ１の発現量が３００％以上、ＵＧＴ１Ａ１の発現量が３００％以上、ＮＲＰ２の発現量が５００％以上である肝オルガノイドが挙げられる。
また、本明細書において、「分化させる」、「分化誘導する」とは、少なくとも、複雑化及び異性化のいずれかが起こるように働きかけることをいう。後述する本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法では、増殖性肝オルガノイドを代謝活性化肝オルガノイドへと分化誘導する。
本明細書における「代謝活性化肝オルガノイド」とは、生体の肝臓組織を構成する肝細胞と類似の特性を有する細胞集団であることを意味する。代謝活性化肝オルガノイドとしては、例えば、ヒト初代凍結浮遊肝細胞での発現量に対してアルブミンの発現量が５０％以上、ＣＹＰ２Ｅ１の発現量が３００％以上、ＵＧＴ１Ａ１の発現量が３００％以上、ＮＲＰ２の発現量が５００％以上である肝オルガノイドが挙げられる。
また、本明細書において、「分化させる」、「分化誘導する」とは、少なくとも、複雑化及び異性化のいずれかが起こるように働きかけることをいう。後述する本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法では、増殖性肝オルガノイドを代謝活性化肝オルガノイドへと分化誘導する。
【0019】
なお、本実施形態の製造方法により製造された「増殖性肝オルガノイド」と、後述する本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により前記増殖性肝オルガノイドから分化して製造された「代謝活性化肝オルガノイド」と、を総じて「肝細胞塊」と称する場合がある。
【0020】
［工程Ａ］
工程Ａでは、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得る。
工程Ａでは、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得る。
【0021】
肝臓は、肝機能の本質を担う肝実質細胞とこの肝実質細胞の増殖や生存を支える肝非実質細胞群により構成されている。肝実質細胞は、肝細胞とも呼ばれる。肝非実質細胞群は、肝星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、胆管上皮細胞等から構成されている。
【0022】
肝幹細胞は肝細胞と胆管上皮細胞へ分化する両能性を保持する細胞であり、肝臓内の肝細胞にも肝非実質細胞にも存在し、組織損傷時に肝臓再生を担う幹細胞集団である。肝幹細胞を含む組織片は、肝細胞の組織片である。
【0023】
工程Ａでは、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを接触させて培養することが好ましい。
【0024】
ＥＣＭと肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片とを接触させて培養する方法としては、例えば、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックス前駆体とを混合し、細胞外マトリックス前駆体をゲル化させてＥＣＭを形成し、次いで、ＥＣＭを増殖用培地に浸漬して培養することができる。
【0025】
工程Ａにおいて使用するＥＣＭとしては、少なくとも２種類の特異な糖タンパク質を含むＥＣＭが好ましい。例えば、２つの異なるタイプのコラーゲンを含むＥＣＭであってもよく、例えば、コラーゲン及びラミニンを含むＥＣＭであってもよい。ＥＣＭは、合成ヒドロゲル細胞外マトリックスであってもよく、天然ＥＣＭであってもよい。ＥＣＭとして、ラミニン、エンタクチン及びコラーゲンＩＶを含む、マトリゲル（登録商標）（ＢＤバイオサイエンス社）を用いることが好ましい。また、コラーゲンＩ及びマトリゲルの混合物を用いてもよく、このとき、混合比は体積比で１：１であることが好ましい。細胞外マトリックスは、細胞培養容器の上にコーティングされた状態のものであってもよく、溶解状態のものであってもよい。
【0026】
工程Ａにおける培養条件としては、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすることができる。例えば、３０℃以上４０℃以下程度（好ましくは、３７℃程度）の温度、５％体積分率（１気圧）程度のＣＯ２濃度環境下で行なうことができる。
【0027】
培養時間は細胞数や細胞の状態等に応じて、適宜調整することができる。培養開始から１週間以上２週間以下程度の期間後、増殖性肝オルガノイドを形成させることができる。中でも、増殖性肝オルガノイドの増殖及びオルガノイドの形成の観点から、少なくとも２週間培養を行なうことが好ましい。
【0028】
［増殖用培地］
増殖用培地は、増殖性肝オルガノイドを培養するための培地であり、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む。
増殖用培地としては、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。また、ＩＬ－６ファミリーサイトカインに加えて、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＴＧＦ－β阻害剤を更に含むことが好ましく、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びフォルスコリンを更に含むことがより好ましい。
増殖用培地は、増殖性肝オルガノイドを培養するための培地であり、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む。
増殖用培地としては、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。また、ＩＬ－６ファミリーサイトカインに加えて、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＴＧＦ－β阻害剤を更に含むことが好ましく、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びフォルスコリンを更に含むことがより好ましい。
【0029】
増殖用培地は、通常、基本培地に各成分を添加して調製することができる。基本培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地（ＭＥＭ）、ノックアウト－ＤＭＥＭ（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、グラスゴー基本培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／ハムＦ１２（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムＦ－１０、ハムＦ－１２、１９９培地、ＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。
【0030】
これらの中でもＨＥＰＥＳ、グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンが添加された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、及びＲＰＭＩ１６４０が好ましい。また、無血清培養に最適化され、グルタミンの代わりに、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ社製、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩが好ましい。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ培地には、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加することが好ましい。
【0031】
発明者らは、細胞周期におけるＧ０期からＧ１期への移行に関与しているサイトカインや成長因子等の各種因子のうち、炎症性サイトカインであるＩＬ－６ファミリーサイトカインに着目し、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む増殖用培地を用いることで高い増殖能を維持しながら長期間培養できる増殖性肝オルガノイドを得ることができることを見出した。
【0032】
（１）ＩＬ－６ファミリーサイトカイン
ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、例えば、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロピン－１（ＣＴ－１)、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられ、中でも、ＩＬ－６が好ましい。
ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、例えば、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロピン－１（ＣＴ－１)、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられ、中でも、ＩＬ－６が好ましい。
【0033】
ＩＬ－６ファミリーサイトカインの由来は特に限定されず、各種生物由来のものを用いることができる。中でも、哺乳動物由来のものであることが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。
【0034】
主な哺乳動物のＩＬ－６ファミリーサイトカインを始めとする増殖用培地に含まれる各種成分のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトＩＬ－６のアミノ酸配列はアクセッション番号ＸＰ＿０１１５１３６９２、ＸＰ＿００５２４９８０２で登録されている。
【0035】
増殖用培地に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１．０μｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
【0036】
（２）ニコチンアミド
増殖用培地は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の観点から、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。ここでいう「ニコチンアミドを実質的に含まない」とは、増殖用培地がニコチンアミドを全く含まない（増殖用培地の総容量に対して０ｍＭ）、又は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の妨げにならない程度の極微量、例えば、９ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下の濃度しか含まないことを意味する。
増殖用培地は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の観点から、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。ここでいう「ニコチンアミドを実質的に含まない」とは、増殖用培地がニコチンアミドを全く含まない（増殖用培地の総容量に対して０ｍＭ）、又は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の妨げにならない程度の極微量、例えば、９ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下の濃度しか含まないことを意味する。
【0037】
（３）成長因子
増殖用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、成長因子を更に含むことが好ましい。成長因子は、細胞の成長、分化、生存、炎症、および組織修復を刺激する拡散性シグナル伝達タンパク質を指す。
増殖用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、成長因子を更に含むことが好ましい。成長因子は、細胞の成長、分化、生存、炎症、および組織修復を刺激する拡散性シグナル伝達タンパク質を指す。
【0038】
成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、アンフィレグリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）等が挙げられる。
【0039】
ＥＧＦはＥＧＦファミリーの一つであり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）を活性化させる成長因子である。活性化したＥＧＦＲは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を主に活性化させ、また、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路やＪａｋ／ｓｔａｔシグナル伝達経路を活性化させる。
【0040】
増殖用培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
【0041】
ＨＧＦは、Ｍｅｔ受容体を活性化させる成長因子であり、活性化したＭｅｔ受容体は、ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達経路を活性化させる。ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達経路の活性化は、βカテニン経路の活性化を促し、血管新生やメタロプロテアーゼ産生を促す。
【0042】
増殖用培地中に含まれるＨＧＦの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
【0043】
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ２）又はＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）に結合することができるものが好ましく、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０であることが好ましく、ＦＧＦ１０であることが特に好ましい。
【0044】
増殖用培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、通常、２０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【0045】
Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ及びＨＢ－ＥＧＦはＥＧＦファミリーの一つであり、ＥＧＦと同じくＥＧＦＲを活性化させて、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、又はＪａｋ／ｓｔａｔシグナル伝達経路を活性化させる。
【0046】
増殖用培地中に含まれるＡｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
【0047】
増殖用培地中に含まれるＨＢ－ＥＧＦの終濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
【0048】
（４）Ｗｎｔアゴニスト
増殖用培地は、肝幹細胞の維持及び細胞増殖性の向上の観点から、Ｗｎｔアゴニストを更に含むことが好ましい。ＷｎｔアゴニストとはＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する作動薬である。
Ｗｎｔアゴニストとしては、例えば、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジンファミリー、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、及びグリコーゲン合成酵素（ＧＳＫ）阻害剤が挙げられる。
増殖用培地は、肝幹細胞の維持及び細胞増殖性の向上の観点から、Ｗｎｔアゴニストを更に含むことが好ましい。ＷｎｔアゴニストとはＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する作動薬である。
Ｗｎｔアゴニストとしては、例えば、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジンファミリー、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、及びグリコーゲン合成酵素（ＧＳＫ）阻害剤が挙げられる。
【0049】
Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６が挙げられ、中でも、Ｗｎｔ３ａが好ましい。
【0050】
Ｗｎｔファミリーメンバーの安定化及び可溶化には、アファミン（Ａｆａｍｉｎ）が寄与していることが知られていることから、Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリーメンバーとアファミンとの複合体を用いることがより好ましい。Ｗｎｔファミリーメンバーとアファミンとの複合体は、Ｗｎｔファミリーメンバーの濃度が１８ｎｇ／ｍＬ～９００ｎｇ／ｍＬの該複合体を含む熟成培養液（コンディションメディウム）として用いることができる。
【0051】
アファミンとは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質を意味する。
ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９で登録されている。
ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９で登録されている。
【0052】
Ｗｎｔファミリーメンバーとして、Ｗｎｔファミリーメンバーの濃度が上記範囲であるコンディションメディウムを用いる場合に、増殖用培地中に含まれるコンディションメディウムの含有量は、増殖用培地の総容量に対して、通常、１容量（ｖ／ｖ）％～５０容量（ｖ／ｖ）％、好ましくは１０容量（ｖ／ｖ）％～３０容量（ｖ／ｖ）％、１５容量（ｖ／ｖ）％～２５容量（ｖ／ｖ）％である。
【0053】
Ｒ－スポンジンファミリーとしては、例えば、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４が挙げられ、中でも、Ｒ－スポンジン１が好ましい。Ｒ－スポンジンファミリーは、細胞膜においてＬｇｒ５と結合すると，自己ユビキチン化により細胞膜から除去され，その結果，Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するＦｒｅｚｚｌｅｄが細胞膜において安定化やβカテニン経路を活性化する。Ｒ－スポンジンファミリーメンバーは、濃度が０．１３μｇ／ｍＬ～６．５μｇ／ｍＬの該複合体を含む熟成培養液として用いることができる。
【0054】
Ｒ－スポンジンファミリーメンバーとして、Ｒ－スポンジンファミリーメンバーの濃度が上記範囲であるコンディションメディウムを用いる場合に、増殖用培地中に含まれるコンディションメディウムの含有量は、増殖用培地の総容量に対して、通常、１容量（ｖ／ｖ）％～５０容量（ｖ／ｖ）％、好ましくは５容量（ｖ／ｖ）％～２５容量（ｖ／ｖ）％、８容量（ｖ／ｖ）％～２０容量（ｖ／ｖ）％である。
【0055】
ＧＳＫ阻害剤は、グリコーゲン合成酵素３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤を示す。ＧＳＫ３βは、β－カテニンをリン酸化しその分解反応を促進することから、ＧＳＫ阻害剤はＷｎｔアゴニストとして作動する。
【0056】
ＧＳＫ阻害剤として、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ番号：２８０７４４－０９－４）、ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ番号：２６４２１８－２３－７）、ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ番号：２５２９３５－９４－７）、ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ番号：６１２４８７－７２－６）、ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ番号：６０３２８８－２２－８）が挙げられ、中でも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
【0057】
Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリーメンバー及びＲ－スポンジンファミリーを組み合わせて用いることが好ましく、Ｗｎｔ３ａ及びＲ－スポンジン１を組み合わせて用いることがより好ましく、Ｗｎｔ３ａとアファミンとの複合体及びＲ－スポンジン１を組み合わせて用いることがさらに好ましい。
【0058】
（５）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
増殖用培地は、アポトーシス抑制の観点から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＩＧＦ－１シグナル伝達のアンタゴニストとして作動するものである。
増殖用培地は、アポトーシス抑制の観点から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＩＧＦ－１シグナル伝達のアンタゴニストとして作動するものである。
【0059】
ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６－５０－７）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１－２６－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、ＳＬｘ－２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７－８７－３）、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン（Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ）（ＣＡＳ番号：８５０６６４－２１－０）、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ（ＣＡＳ番号：８７２５４３－０７－６）、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤（ＲＯＫα ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンーカルボキシアミド（４－（１－ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ）、Ｒｈｏスタチン（Ｒｈｏｓｔａｉｎ）、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２が挙げられる。これらの中でも、Ｙ－２７６３２が好ましい。
【0060】
増殖用培地中に含まれる、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、通常、１μＭ～２０μＭ、好ましくは５μＭ～１５μＭ、より好ましくは８μＭ～１２μＭである。なお、単位「μＭ」は増殖用培地１リットル中の分子量（ｍｏｌ／Ｌ）の１／１００００００である濃度を示し、以降も同様の濃度を表す。
【0061】
（６）形質転換増殖因子－β阻害剤
増殖用培地は、肝幹細胞の維持の観点から、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）－β阻害剤を含むことが好ましい。
増殖用培地は、肝幹細胞の維持の観点から、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）－β阻害剤を含むことが好ましい。
【0062】
ＴＧＦ－β阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＴＧＦ－β活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＴＧＦ－β阻害活性は、当業者にとって公知の方法で評価することができる。係る評価系としては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を動かすヒトＰＡＩ－１プロモーター又はＳｍａｄ２／３結合部位を含むレポーター構築物を用いて細胞が安定にトランスフェクトされている細胞アッセイが挙げられる。
【0063】
ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＤ－２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）が挙げられ、中でも、Ａ８３－０１が好ましい。
【0064】
増殖用培地中に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、通常、０．０５μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、より好ましくは１μＭ～１５μＭ以下である。
【0065】
（７）骨形成タンパク質阻害剤
増殖用培地は、オルガノイド内に含まれる肝幹細胞の量を調節する観点から、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤を更に含むことが好ましい。
増殖用培地は、オルガノイド内に含まれる肝幹細胞の量を調節する観点から、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤を更に含むことが好ましい。
【0066】
ＢＭＰは、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（Ｓｍａｄ１／５／９）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。
【0067】
ＢＭＰ阻害剤としては、例えば、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ（ＤＡＮ）、及びＤＡＮ様タンパク質が挙げられる。ＤＡＮ様タンパク質としては、例えば、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンが挙げられる。中でも、ノギンが好ましい。
【0068】
増殖用培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬである。
【0069】
（８）フォルスコリン
増殖用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を更に含むことが好ましい。
増殖用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を更に含むことが好ましい。
【0070】
増殖用培地中に含まれるフォルスコリンの濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～１５μＭである。
【0071】
（９）その他の成分
増殖用培地は、上記成分に加えて、ガストリン、神経生物系サプリメント、及び、Ｎ－アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことができる。神経生物系サプリメントとしては、例えば、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、並びにＮ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等のインシュリンを含むサプリメントが挙げられる。
増殖用培地は、上記成分に加えて、ガストリン、神経生物系サプリメント、及び、Ｎ－アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことができる。神経生物系サプリメントとしては、例えば、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、並びにＮ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等のインシュリンを含むサプリメントが挙げられる。
【0072】
増殖用培地中に含まれるガストリンの含有量は、通常、５ｎＭ～１５ｎＭ以下である。なお、単位「ｎＭ」は増殖用培地１リットル中の分子量（ｍｏｌ／Ｌ）の１／１０００００００００である濃度を示し、以降も同様の濃度を表す。
【0073】
Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリン等を含む組成物であり、５０倍液体濃縮液として市販されている。
【0074】
Ｎ２サプリメントは、５００μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、５００μｇ／ｍＬのウシインシュリン、０．６３μｇ／ｍＬのプロゲステロン、１６１μｇ／ｍＬのプトレシン及び０．５２μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム等を含む組成物であり、１００倍液体濃縮液として市販されている。
【0075】
増殖用培地中に含まれるＮ－アセチルシステインの濃度は、通常、１５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。
【0076】
＜代謝活性化肝オルガノイドの製造方法＞
一実施形態において、本発明は、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ること（以下、「工程Ｂ」ともいう）を含み、前記分化用培地が、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ること（以下、「工程Ｂ」ともいう）を含み、前記分化用培地が、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法を提供する。
【0077】
本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた、代謝活性化肝オルガノイドが得られる。この代謝活性化肝オルガノイドは、後述する実施例に示すように、薬物動態試験に使用できる程度まで各種代謝酵素の発現が向上している。
【0078】
［工程Ｂ］
工程Ｂでは、上記製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で代謝活性化肝オルガノイドへ分化させる。
工程Ｂでは、上記製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で代謝活性化肝オルガノイドへ分化させる。
【0079】
工程Ｂで使用される増殖性肝オルガノイドとしては、増殖性肝オルガノイドの増殖及びオルガノイドの形成の観点から、工程Ａにおいて２週間以上培養を行なったものが好ましい。
【0080】
工程Ｂにおける培養期間は、通常、５日間～１５日間、好ましくは７日間～１２日間である。
【0081】
工程Ｂでは、増殖性肝オルガノイドと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを接触させて培養することが好ましい。例えば、後述する実施例に示すように、重合したＥＣＭに増殖用培地を重層して培養した増殖性肝オルガノイドにおいて、必要に応じて、適度な個数の増殖性肝オルガノイドを含むように物理的に解離した後、増殖用培地の代わりに分化用培地を重層して培養してもよい。
【0082】
工程Ｂにおいて使用するＥＣＭとしては、上述した、工程Ａで使用するＥＣＭと同様のものが挙げられる。
【0083】
工程Ｂにおける培養条件としては、工程Ａにおける培養条件と同様の条件が挙げられる。
【0084】
本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法において、増殖性肝オルガノイドが代謝活性化肝オルガノイドに分化したことは、肝細胞マーカーの発現や薬物代謝活性等を指標にして判定又は評価することができる。肝細胞マーカーとしては、例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、チロシン－アミノ基転移酵素（ＴＡＴ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）等が挙げられる。肝細胞マーカーの発現量の測定は、遺伝子レベルで行ってもよく、タンパク質レベルで行ってもよい。
【0085】
代謝活性化肝オルガノイドを含む細胞集団から、代謝活性化肝オルガノイドのみからなる細胞を得る方法としては、例えば、前記肝細胞マーカーの存在を指標にして、代謝活性化肝オルガノイドを選別及び分取する方法が挙げられる。
【0086】
薬物代謝活性は、薬物代謝酵素の発現の検出又は薬物代謝アッセイによって評価することができる。薬物代謝酵素としては、例えば、シトクロムＰ４５０ １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ（ＣＹＰ２Ｂ）、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）、シトクロムＰ４５０ ２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）、シトクロムＰ４５０ ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）、ウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）、及び硫酸転移酵素（ＳＵＬＴ）が挙げられる。
【0087】
［分化用培地］
分化用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。これにより、増殖性肝オルガノイドから肝細胞への分化することができる。
分化用培地としては、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましく、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＴＧＦ－β阻害剤を含むことが好ましく、これらに加えて、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びフォルスコリンを含むことが好ましい。
分化用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。これにより、増殖性肝オルガノイドから肝細胞への分化することができる。
分化用培地としては、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましく、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＴＧＦ－β阻害剤を含むことが好ましく、これらに加えて、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びフォルスコリンを含むことが好ましい。
【0088】
分化用培地は、通常、基本培地に各成分を添加して調製することができる。基本培地としては、増殖用培地と同様の基礎培地が挙げられる。
【0089】
（１）ＩＬ－６ファミリーサイトカイン
分化用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。「ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない」とは、分化用培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度が、０ｎｇ／ｍＬ、又は極微量、具体的には、分化用培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは、１ｎｇ／ｍＬ以下であることを意味する。ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、上述した増殖用培地で例示されたものと同様のものが挙げられる。
分化用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。「ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない」とは、分化用培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度が、０ｎｇ／ｍＬ、又は極微量、具体的には、分化用培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは、１ｎｇ／ｍＬ以下であることを意味する。ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、上述した増殖用培地で例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0090】
（２）ニコチンアミド
分化用培地は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の観点から、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。「ニコチンアミドを実質的に含まない」とは、分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度が０ｍＭ、又は極微量、具体的には、分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度が、９ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下であることを意味する。
分化用培地は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の観点から、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。「ニコチンアミドを実質的に含まない」とは、分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度が０ｍＭ、又は極微量、具体的には、分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度が、９ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下であることを意味する。
【0091】
（３）成長因子
分化用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、成長因子を更に含むことが好ましい。成長因子の種類及び分化用培地中に含まれる成長因子の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
分化用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、成長因子を更に含むことが好ましい。成長因子の種類及び分化用培地中に含まれる成長因子の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
【0092】
（４）Ｗｎｔアゴニスト
分化用培地は、肝幹細胞の維持及び細胞増殖性の向上の観点から、Ｗｎｔアゴニストを更に含むことが好ましい。Ｗｎｔアゴニストの種類及び分化用培地中に含まれるＷｎｔアゴニストの濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
分化用培地は、肝幹細胞の維持及び細胞増殖性の向上の観点から、Ｗｎｔアゴニストを更に含むことが好ましい。Ｗｎｔアゴニストの種類及び分化用培地中に含まれるＷｎｔアゴニストの濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
【0093】
（５）ＲＯＣＫ阻害剤
分化用培地は、細胞のアポトーシス抑制の観点から、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
分化用培地は、細胞のアポトーシス抑制の観点から、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
【0094】
（６）ＴＧＦ－β阻害剤
分化用培地は、肝幹細胞の維持の観点から、ＴＧＦ－β阻害剤を更に含むことが好ましい。ＴＧＦ－β阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
分化用培地は、肝幹細胞の維持の観点から、ＴＧＦ－β阻害剤を更に含むことが好ましい。ＴＧＦ－β阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
【0095】
（７）ＢＭＰ阻害剤
分化用培地は、オルガノイドに含まれる肝幹細胞量の調節の観点から、ＢＭＰ阻害剤を更に含むことが好ましい。ＢＭＰ阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
分化用培地は、オルガノイドに含まれる肝幹細胞量の調節の観点から、ＢＭＰ阻害剤を更に含むことが好ましい。ＢＭＰ阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
【0096】
（８）フォルスコリン
分化用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、フォルスコリンを更に含むことが好ましい。分化用培地中に含まれるフォルスコリンの濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
分化用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、フォルスコリンを更に含むことが好ましい。分化用培地中に含まれるフォルスコリンの濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
【0097】
（９）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
分化用培地は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤を更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４の発現量を増大させることができる。Ｎｏｔｃｈシグナルは細胞間の情報伝達を担っており、細胞の分化を制御するシグナルである。
分化用培地は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤を更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４の発現量を増大させることができる。Ｎｏｔｃｈシグナルは細胞間の情報伝達を担っており、細胞の分化を制御するシグナルである。
【0098】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤としては、例えば、Ｌ－６８５４５８（ＣＡＳ番号：２９２６３２－９８－５）、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）、ＤＢＺ（ＣＡＳ番号：２０９９８４－５６－５）、ＭＲＫ５６０（ＣＡＳ番号：６７７７７２－８４－８）、３，５－ビス（４－ニトロフェノキシ）安息香酸、ＭＲＫ００３（ＣＡＳ番号：６２３１６５－９３－５）、ＭＫ０７５２（ＣＡＳ番号：４７１９０５－４１－６）、フルルビプロフェン、及びＪＬＫ６（ＣＡＳ番号：６２２５２－２６－０）等のγ-セクレターゼ阻害剤が挙られる。
【0099】
分化用培地中に含まれるＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤の濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬである。
【0100】
（１０）ビタミンＤ
分化用培地は、ビタミンＤを更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのアルブミンの産生量を増大させることができる。ビタミンＤ受容体の活性化は、Ｐ２１とＰ２７タンパク質の発現を誘導し細胞周期におけるＧ０／Ｇ１期を停止する。
分化用培地は、ビタミンＤを更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのアルブミンの産生量を増大させることができる。ビタミンＤ受容体の活性化は、Ｐ２１とＰ２７タンパク質の発現を誘導し細胞周期におけるＧ０／Ｇ１期を停止する。
【0101】
ビタミンＤは、生体内で合成や代謝する。よって、ビタミンＤとしては、ビタミンＤ前駆体、ビタミンＤ代謝産物およびビタミンＤ類洞体が含まれる。
ビタミンＤとしては、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、７－デヒドロコレステロール等のビタミンＤ前駆体、カルシフェジオール、及びカルシトリオール等のビタミンＤ代謝産物、並びにカルシポトリオール、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、ＺＫ１９１７８４、及びＺＫ２０３２７８8等のビタミンＤ類洞体が挙げられる。
ビタミンＤとしては、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、７－デヒドロコレステロール等のビタミンＤ前駆体、カルシフェジオール、及びカルシトリオール等のビタミンＤ代謝産物、並びにカルシポトリオール、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、ＺＫ１９１７８４、及びＺＫ２０３２７８8等のビタミンＤ類洞体が挙げられる。
【0102】
分化用培地中に含まれるビタミンＤの濃度は、通常、１０ｎＭ～１，０００ｎＭ、好ましくは５０ｎＭ～８００ｎＭ、より好ましくは１００ｎＭ～５００ｎＭである。
【0103】
（１１）ＤＮＡ脱メチル化剤
分化用培地は、ＤＮＡ脱メチル化剤を更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４の発現量を増大させることができる。
分化用培地は、ＤＮＡ脱メチル化剤を更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４の発現量を増大させることができる。
【0104】
ＤＮＡ脱メチル化剤としては、５－アザ－２－デオキシシチジン、５－アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５－フルオロ－２－デオキシシチジン、５，６－ジヒドロ－５－アザシチジン、２’－デオキシ－５，６－ジヒドロ－５－アザシチジン、６－アザシチジン、２’，２’－ジフルオロ－デオキシシチジン、及びシトシン－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシド等のシチジン類似体が挙げられる。
【0105】
分化用培地中に含まれるＤＮＡ脱メチル化剤の濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～１５μＭである。
【0106】
（１２）その他の添加剤
分化用培地は、上記成分に加えて、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、又はＮ－アセチルシステインを含有することができる。分化用培地において、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及びＮ－アセチルシステインとしては、上述した増殖用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。
分化用培地は、上記成分に加えて、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、又はＮ－アセチルシステインを含有することができる。分化用培地において、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及びＮ－アセチルシステインとしては、上述した増殖用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。
【0107】
＜代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法＞
一実施形態において、本発明は、上記代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導すること（以下、「工程Ｃ」ともいう）を含み、前記誘導用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、上記代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導すること（以下、「工程Ｃ」ともいう）を含み、前記誘導用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法を提供する。
【0108】
本実施形態の誘導方法によれば、代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに戻すことができ、細胞の増殖能を回復させることができる。
【0109】
工程Ｃにおける培養条件は、上述した増殖性肝オルガノイドの製造方法における工程Ａにおける培養条件と同様の条件である。また、使用する誘導用培地は、上述した増殖性肝オルガノイドの製造方法に記載の増殖用培地と同様の組成である。
【0110】
＜被験物質の評価方法＞
一実施形態において、本発明は、代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させること、及び代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することを含む、前記被験物質の評価方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させること、及び代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することを含む、前記被験物質の評価方法を提供する。
【0111】
本実施形態の評価方法により、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、トランスポーター活性等をインビトロで評価し、インビボにおける評価に近い結果を得ることができる。
【0112】
被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、及び代謝物ライブラリが挙げられる。被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）等が挙げられる。
【0113】
医薬や栄養食品等の既存成分又は候補成分も被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、及び培養上清等を被験物質として用いることができる。また、２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用等を調べることもできる。
【0114】
被験物質と代謝活性化肝オルガノイドとを接触させる期間は、通常、１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。被験物質と代謝活性化肝オルガノイドとの接触を複数回に分けて行うことができる。
【0115】
代謝活性化肝オルガノイドの応答の評価は、例えば、産生される代謝産物に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、又は免疫学的手法により行うことができる。免疫学的手法としては、例えば、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）が挙げられる。
【0116】
代謝活性化肝オルガノイドにおける薬物代謝酵素（例えば、シトクロム、ＵＧＴ等）の発現を指標として被験物質の代謝を測定することもできる。薬物代謝酵素の発現は、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルが挙げられる。
【0117】
本実施形態の評価方法は、被験物質の毒性を試験することもできる。例えば、被験物質を接触させた後の代謝活性化肝オルガノイドの状態を調べ、被験物質の毒性を評価する。代謝活性化肝オルガノイドの状態としては、生存率、細胞形態、及び培養液中の肝障害マーカー（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）の存在量等が挙げられる。
【0118】
＜その他実施形態＞
一実施形態において、本発明は、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイド及び代謝活性肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを提供する。本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドは、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、及びトランスポーター活性等のインビトロ評価に好適に用いることができる。
一実施形態において、本発明は、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイド及び代謝活性肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを提供する。本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドは、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、及びトランスポーター活性等のインビトロ評価に好適に用いることができる。
【0119】
増殖性肝オルガノイド及び代謝活性化肝オルガノイドと、例えば生体内に天然に存在する肝細胞とは、遺伝子発現パターン等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違が存在するか否かは定かではなく、また、そのような相違を特定して、遺伝子発現パターン等により本実施形態の細胞を特定するためには、著しく多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実質的に不可能である。したがって、本実施形態の細胞は、上述した製造方法により製造されたことにより特定することが実際的であるといえる。
【0120】
一実施形態において、本発明は、増殖用培地及び分化用培地を提供する。増殖用培地及び分化用培地は、それぞれ、増殖性肝オルガノイドの製造方法に記載の増殖用培地、及び代謝活性肝オルガノイドの製造方法に記載の分化用培地に記載したとおりである。
【実施例】
【0121】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。また、全ての実験は慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画に基づいて行った。
【0122】
［実験例１］ヒト増殖性肝オルガノイドの製造
ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。なお、無血清培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた培地である。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から４０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５分間以上１０分間以下程度インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、表１に示す増殖用培地を重層して１２週間培養し、実験例１の増殖性肝オルガノイドを製造した。
ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。なお、無血清培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた培地である。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から４０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５分間以上１０分間以下程度インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、表１に示す増殖用培地を重層して１２週間培養し、実験例１の増殖性肝オルガノイドを製造した。
【0123】
なお、Ｒ－スポンジン１は、Ｒ－スポンジン１を含むコンディションメディウムの形態で用いており、コンディションメディウムの総容量に対するＲ－スポンジン１の濃度は１．３μｇ／ｍＬである。
Ｗｎｔ３ａについてもＲ－スポンジン１と同様に、Ｗｎｔ３ａとアファミンとの複合体を含むコンディションメディウムの形態で用いており、コンディションメディウムの総容量に対するＷｎｔ３ａの濃度は３６０ｎｇ／ｍＬである。
Ｗｎｔ３ａについてもＲ－スポンジン１と同様に、Ｗｎｔ３ａとアファミンとの複合体を含むコンディションメディウムの形態で用いており、コンディションメディウムの総容量に対するＷｎｔ３ａの濃度は３６０ｎｇ／ｍＬである。
【0124】
初代凍結浮遊肝細胞からの増殖性肝オルガノイド（培養開始から２週間後）の増殖率を目視にて判定した。結果を表１に示す。判定基準は、増殖率が高いものから順に（＋＋＋、＋＋、＋、－）とした。
【0125】
培養開始から２週間後の増殖性肝オルガノイドの形態を蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、装置名「ＢＺ－Ｘ７１０」）で観察し、形態を観察した。オルガノイドの内部が空洞であるものを「中空」と判定し、内部まで細胞がつまっているものを「中実」と判定した。結果を表１に示す。また、顕微鏡像を図１に示す。
【0126】
増殖性肝オルガノイドの維持継代培養の可否を判定した。判定は継代した後に細胞の増殖性を顕微鏡像から判断した。結果を表１に示す。
【0127】
培養開始から２週間後の増殖性肝オルガノイドについて、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡ Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン、代謝酵素及びトランスポーター遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。結果を表３に示す。なお、表３において、数値は、ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）での発現量を１００とした時の相対値で表されている。
【0128】
［実験例２～実験例４］肝オルガノイドの製造
表１に示す各組成である増殖用培地を用いた以外は、実験例１と同様の方法を用いて、肝オルガノイドを製造した。増殖率、細胞の形態、維持拡大培養、並びに遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定についても実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表１及び表３に示す。また、実験例２の肝オルガノイドの顕微鏡像を図２に示す。
表１に示す各組成である増殖用培地を用いた以外は、実験例１と同様の方法を用いて、肝オルガノイドを製造した。増殖率、細胞の形態、維持拡大培養、並びに遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定についても実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表１及び表３に示す。また、実験例２の肝オルガノイドの顕微鏡像を図２に示す。
【0129】
［実験例５］代謝活性化肝オルガノイドの製造
実験例１の方法を用いて、増殖用培地中で２週間培養したヒト増殖性肝オルガノイドを機械的解離によって希釈し、継代した。その際、培地を増殖用培地から分化用培地に交換して、１週間培養することで、代謝活性化肝オルガノイドを製造した。分化用培地としては、表２に示す組成であるＩＬ－６を含まない無血清培地を用いた。細胞の形態、維持拡大培養、並びに遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定について実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表２及び３に示す。また、得られた肝オルガノイドの顕微鏡像を図３に示す。
実験例１の方法を用いて、増殖用培地中で２週間培養したヒト増殖性肝オルガノイドを機械的解離によって希釈し、継代した。その際、培地を増殖用培地から分化用培地に交換して、１週間培養することで、代謝活性化肝オルガノイドを製造した。分化用培地としては、表２に示す組成であるＩＬ－６を含まない無血清培地を用いた。細胞の形態、維持拡大培養、並びに遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定について実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表２及び３に示す。また、得られた肝オルガノイドの顕微鏡像を図３に示す。
【0130】
［参考例１］ヒト肝オルガノイドの製造
非特許文献２に記載の方法を用いて、ヒト肝オルガノイドを製造した。遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定について実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表３に示す。
非特許文献２に記載の方法を用いて、ヒト肝オルガノイドを製造した。遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定について実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表３に示す。
【0131】
【表1】
【0132】
【表2】
【0133】
【表3】
【0134】
表１から、ＩＬ－６を含む増殖用培地を用いて得られた増殖性肝オルガノイド（実験例１）は、細胞の形態が中空であり、増殖率が高く、維持拡大培養が可能なものであった。また、図１の顕微鏡像から、オルガノイド内部に赤色の成分が含まれることが観察された。
【0135】
これに対して、ＩＬ－６を含まない増殖用培地を用いて得られた肝オルガノイド（実験例２）は、細胞の形態が中実であり、増殖率は高いが、維持拡大培養をすることができなかった。また、ＩＬ－６を含まず、ニコチンアミドを含む増殖用培地を用いて得られた肝オルガノイド（実験例３及び実験例４）は、細胞の形態が中実であり、増殖率が低く、維持拡大培養をすることができなかった。
【0136】
表２及び表３から、ＩＬ－６を含まない分化用培地を用いて実験例１の増殖性肝オルガノイドから分化された実験例５の代謝活性化肝オルガノイドは、細胞の形態が中空であり、維持拡大培養はできないものの、遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量が万遍なく向上しており、薬物動態試験に使用できる程度のものであった。また、図３の顕微鏡像から、オルガノイド内部にビリルビンと推定される黄色の成分が含まれることが観察された。
【0137】
［実験例６～実験例７］増殖性肝オルガノイドの製造
表４に示す増殖用培地を用いた以外は、実験例１と同様の方法を用いて、増殖性肝オルガノイドを製造した。増殖率、及び維持拡大培養の測定についても実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表４に示す。
表４に示す増殖用培地を用いた以外は、実験例１と同様の方法を用いて、増殖性肝オルガノイドを製造した。増殖率、及び維持拡大培養の測定についても実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表４に示す。
【0138】
【表4】
【0139】
［実験例８～実験例１２］代謝活性肝オルガノイドの製造
表４に示す分化用培地を用いた以外は、実験例５と同様の方法を用いて、代謝活性肝オルガノイドを製造した。アルブミン発現量及びＣＹＰ３Ａ４発現量の測定についても実験例５と同様の方法を用いて行なった。結果を表５に示す。
表４に示す分化用培地を用いた以外は、実験例５と同様の方法を用いて、代謝活性肝オルガノイドを製造した。アルブミン発現量及びＣＹＰ３Ａ４発現量の測定についても実験例５と同様の方法を用いて行なった。結果を表５に示す。
【0140】
【表5】
【0141】
［実験例１３］コラーゲン－マトリゲル上でのヒト増殖性肝オルガノイドの製造
ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。なお、無血清培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた培地である。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から５０，０００個の肝細胞を１２．５μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）及び１２．５μＬのコラーゲンＩ（新田ゼラチン株式会社）と混合し、４８ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲル及びコラーゲンＩが完全に重合するまで３７℃で５分間以上１０分間以下程度インキュベートした。対照として、マトリゲルのみ又はコラーゲンのみを用いたものも準備した。続いて、マトリゲル及びコラーゲンＩが重合した後に、上記表１に示す増殖用培地を重層して培養し、実験例１３の増殖性肝オルガノイドを製造した。
ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。なお、無血清培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた培地である。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から５０，０００個の肝細胞を１２．５μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）及び１２．５μＬのコラーゲンＩ（新田ゼラチン株式会社）と混合し、４８ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲル及びコラーゲンＩが完全に重合するまで３７℃で５分間以上１０分間以下程度インキュベートした。対照として、マトリゲルのみ又はコラーゲンのみを用いたものも準備した。続いて、マトリゲル及びコラーゲンＩが重合した後に、上記表１に示す増殖用培地を重層して培養し、実験例１３の増殖性肝オルガノイドを製造した。
【0142】
【産業上の利用可能性】
【0143】
本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドが得られる。本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた、代謝活性化肝オルガノイドが得られる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】