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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-03
(45)【発行日】2025-03-11
(54)【発明の名称】嗅覚受容体発現促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/198 20060101AFI20250304BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20250304BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250304BHJP
【ＦＩ】
A61K31/198 ZNA
A61K31/197
A61P43/00 105
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2021016350
(22)【出願日】2021-02-04
(65)【公開番号】P2022119320
(43)【公開日】2022-08-17
【審査請求日】2023-10-10
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】禹 幸玉
(72)【発明者】
【氏名】石渡 潮路
(72)【発明者】
【氏名】桜井 哲人
【審査官】金子 亜希
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５２８７３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－１２３２５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－１６３３２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－１３４７９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－１４４５６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－２４６３７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－２１９３８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－１０７９３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１８３２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５１９５０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５１５４０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／０７７３４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第０２／０５６８４９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／１９８
Ａ６１Ｋ ３１／１９７
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインから選択される１以上のアミノ酸を有効成分とする嗅覚受容体であるＯＲ２ＡＴ４及び／又はＯＲ５１Ｂ５の発現促進用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、嗅覚受容体発現促進用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
嗅覚受容体（きゅうかくじゅようたい、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は、嗅細胞（嗅覚受容神経）にあるＧタンパク質結合受容体として見出された。脊椎動物ではこのタンパク質は嗅上皮に、昆虫では触角に位置し、嗅覚を感知する重要な受容体として知られている。
近年この嗅覚受容体が、皮膚、精子などの様々な組織細胞にも存在することが確認された。現在では、嗅覚受容体が身体全体に存在し、異なる多様な細胞型受容体（ＯＲファミリー）として発現されており、嗅覚以外の生体の生理学的細胞機能を調節すると考えられている。しかしその全体像は、いまだ解明されていない。
嗅覚受容体・ＯＲファミリーに属する受容体の一つであるＯＲ２ＡＴ４は、皮膚におけるケラチノサイトの増殖を刺激することがすでに知られている。なかでも、ヒト毛包の上皮、特に外根鞘がＯＲ２ＡＴ４を発現し、特異的ＯＲ２ＡＴ４アンタゴニストＰｈｅｎｉｒａｔ（登録商標）とＯＲ２ＡＴ４の共投与が、毛髪成長を阻害することが明らかにされている（非特許文献１）。
近年この嗅覚受容体が、皮膚、精子などの様々な組織細胞にも存在することが確認された。現在では、嗅覚受容体が身体全体に存在し、異なる多様な細胞型受容体（ＯＲファミリー）として発現されており、嗅覚以外の生体の生理学的細胞機能を調節すると考えられている。しかしその全体像は、いまだ解明されていない。
嗅覚受容体・ＯＲファミリーに属する受容体の一つであるＯＲ２ＡＴ４は、皮膚におけるケラチノサイトの増殖を刺激することがすでに知られている。なかでも、ヒト毛包の上皮、特に外根鞘がＯＲ２ＡＴ４を発現し、特異的ＯＲ２ＡＴ４アンタゴニストＰｈｅｎｉｒａｔ（登録商標）とＯＲ２ＡＴ４の共投与が、毛髪成長を阻害することが明らかにされている（非特許文献１）。
【0003】
また、全身に存在する嗅覚受容体は、免疫の活性化にも関与している。特許文献１には、公知化合物である合成物質のサンダロール（登録商標）及びブラマノール（登録商標）が、ＯＲ２ＡＴ４受容体の活性化を介して、インターロイキンＩＬ－１αの発現及び分泌を促すことにより創傷治癒を促進することが記載されている。
特許文献２には、嗅覚受容体ファミリー１、２または５１などの複数の嗅覚受容体と選択的に結合するか、または発現を選択的に変化させる化合物を癌、自己免疫疾患、感染症及び移植片対宿主病などの治療剤とする発明が開示されている。この特許文献２に開示された発明の化合物は、嗅覚受容体に結合し、あるいは嗅覚受容体の発現を制御することで、病的な細胞性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を調節し、免疫を活性化し又は正常に制御する。
特許文献２には、嗅覚受容体ファミリー１、２または５１などの複数の嗅覚受容体と選択的に結合するか、または発現を選択的に変化させる化合物を癌、自己免疫疾患、感染症及び移植片対宿主病などの治療剤とする発明が開示されている。この特許文献２に開示された発明の化合物は、嗅覚受容体に結合し、あるいは嗅覚受容体の発現を制御することで、病的な細胞性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を調節し、免疫を活性化し又は正常に制御する。
【0004】
特許文献３には、香料を有効成分とする皮膚免疫機能調節剤が記載されている。この皮膚免疫機能調節剤において、含有されている香料が、皮膚嗅覚受容体を刺激する作用を有していることが示されている。このように嗅覚受容体の発現促進剤は、癌、自己免疫疾患、感染症、臓器移植などの治療や改善剤として使用することができると考えられている。
一方、アミノ酸はタンパク質を構成する最小単位として知られており、さまざまな生理活性が知られている。しかしアミノ酸が嗅覚受容体の発現を促進することは知られていない。
一方、アミノ酸はタンパク質を構成する最小単位として知られており、さまざまな生理活性が知られている。しかしアミノ酸が嗅覚受容体の発現を促進することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１７－５１８３２４号公報
【文献】特表２０１６－５３５０６０号公報
【文献】特開２００３－２０６２３７号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ （２０１８）９：３６２４ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０５９７３－０ ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びシステインから選択される１以上のアミノ酸を有効成分とする、嗅覚受容体の発現促進用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下の構成である。
（１）ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインから選択される１以上のアミノ酸を有効成分とする嗅覚受容体発現促進用組成物。
（２）嗅覚受容体がＯＲ２ＡＴ４及び／又は ＯＲ５１Ｂ５である（１）に記載の嗅覚受容体発現促進用組成物。
（１）ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインから選択される１以上のアミノ酸を有効成分とする嗅覚受容体発現促進用組成物。
（２）嗅覚受容体がＯＲ２ＡＴ４及び／又は ＯＲ５１Ｂ５である（１）に記載の嗅覚受容体発現促進用組成物。
【発明の効果】
【0009】
本発明によりガンマアミノ酪酸（以下「ＧＡＢＡ」）、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインから選択される１以上のアミノ酸を有効成分とする嗅覚受容体発現促進用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】試験例２においてＧＡＢＡによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図2】試験例２においてＬ－シトルリンによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図3】試験例２においてＬ－（－）フェニルアラニンによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図4】試験例２においてＬ－アルギニンによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図5】試験例２においてＬ－アラニンによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図6】試験例２においてＬ－アスパラギンによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図7】試験例２においてＬ－アスパラギン酸による嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図8】試験例２においてＬ－システインによる嗅覚受容体発現促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明でいう組成物とは、ＧＡＢＡ、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインから選択される１以上のアミノ酸を含むものをいう。本発明の組成物は、さらに任意成分を含有するものも含まれる。
【0012】
上記の各アミノ酸は、それらの塩であってもよい。塩としては薬学上許容される塩であればよい。例えば、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、バリウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、トリシクロヘキシルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロピルアルコールアミン塩、ジイソプロピルアルコールアミン塩、トリイソプロピルアルコールアミン塩等のアルカノールアミン塩が挙げられる。
【0013】
アミノ酸の製法は特に限定されない。例えば、合成法、抽出法、酵素法、発酵法が挙げられる。また、Ｄ，Ｌ－アミノ酸のラセミ混合物を光学分割する方法も挙げられる。光学分割法としては特に限定されない。
【0014】
本発明の組成物は、上記アミノ酸の少なくとも１つ以上を含むものをいう。ＧＡＢＡ、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインから選択される１以上のアミノ酸を、合計量で換算した場合の好適な含有量の下限は、通常、０．００１質量％以上であり、好ましくは０．０１質量％以上である。その上限は、通常、３０質量％以下であり、好ましくは１０質量％以下である。
【実施例】
【0015】
以下に試験例を示して本発明を具体的に説明する。
＜＜試験例１＞＞
＜嗅覚受容体遺伝子発現促進作用を有するアミノ酸の一次スクリーニング＞
ＯＲ２ＡＴ４及び／又はＯＲ５１Ｂ５の発現促進作用を有するアミノ酸のスクリーニングを行った。
１．試験方法
（１）試験用の細胞及び培養方法
正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｅｏ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＮＨＥＫ）をＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ６０μＭ Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ）溶液にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２増殖添加剤（クラボウ）を添加し培養した。
８０－９０％程コンフルエントになったら、０．０１７％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．００７％ＥＤＴＡ（０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳで３倍希釈）で細胞を剥がし、再混濁した後細胞数を計測した。
１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように再播種し、３７℃、５％ＣＯ２ インキュベーターで一晩培養し、翌日試験サンプル（アミノ酸）を添加した。
＜＜試験例１＞＞
＜嗅覚受容体遺伝子発現促進作用を有するアミノ酸の一次スクリーニング＞
ＯＲ２ＡＴ４及び／又はＯＲ５１Ｂ５の発現促進作用を有するアミノ酸のスクリーニングを行った。
１．試験方法
（１）試験用の細胞及び培養方法
正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｅｏ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＮＨＥＫ）をＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ６０μＭ Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ）溶液にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２増殖添加剤（クラボウ）を添加し培養した。
８０－９０％程コンフルエントになったら、０．０１７％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．００７％ＥＤＴＡ（０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳで３倍希釈）で細胞を剥がし、再混濁した後細胞数を計測した。
１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように再播種し、３７℃、５％ＣＯ２ インキュベーターで一晩培養し、翌日試験サンプル（アミノ酸）を添加した。
【0016】
（２）ＲＮＡ抽出方法及びＲＴ－ＰＣＲ法
各濃度のアミノ酸を添加した細胞（２４時間経過後）の上清を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。３００μｌ／ｗｅｌｌずつＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ）を添加し、十分ピペッティングしながら細胞を破砕した。この細胞ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容量のＴｕｂｅに回収した。６０μｌのクロロホルムを加え、よく振り混ぜてから室温で５分間静置した。
次いで１２，０００×ｇで１５分間、４℃の温度条件で遠心し、分離した水層の上層（ＲＮＡ部分）を新しい試験管に移した。
さらに３００μｌのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で１０分間静置した。
次いで、１２，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心しＲＮＡを沈殿させた。上清を捨て、７５％ 冷エタノール３００μｌを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、７，５００×ｇで５分間、４℃の温度条件で遠心した。
上清を捨て、室温で数分間乾燥させた後、１５μｌのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶解し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用し、ＲＮＡを定量してから濃度を合わせ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコールに従い逆転写を行い、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い調整した後ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いリアルタイムＰＣＲを行った。各遺伝子のＣｐ値はＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｐ値に対する相対値で比較した。
各濃度のアミノ酸を添加した細胞（２４時間経過後）の上清を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。３００μｌ／ｗｅｌｌずつＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ）を添加し、十分ピペッティングしながら細胞を破砕した。この細胞ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容量のＴｕｂｅに回収した。６０μｌのクロロホルムを加え、よく振り混ぜてから室温で５分間静置した。
次いで１２，０００×ｇで１５分間、４℃の温度条件で遠心し、分離した水層の上層（ＲＮＡ部分）を新しい試験管に移した。
さらに３００μｌのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で１０分間静置した。
次いで、１２，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心しＲＮＡを沈殿させた。上清を捨て、７５％ 冷エタノール３００μｌを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、７，５００×ｇで５分間、４℃の温度条件で遠心した。
上清を捨て、室温で数分間乾燥させた後、１５μｌのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶解し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用し、ＲＮＡを定量してから濃度を合わせ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコールに従い逆転写を行い、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い調整した後ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いリアルタイムＰＣＲを行った。各遺伝子のＣｐ値はＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｐ値に対する相対値で比較した。
【0017】
Ｈｓ＿ＯＲ２ＡＴ４＿ｍＲＮＡのｐｒｉｍｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）には
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号１）、
Ｆｏｒｗａｒｄ： ＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＡ（配列番号２）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号１）、
Ｆｏｒｗａｒｄ： ＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＡ（配列番号２）、
【0018】
Ｈｓ＿ＯＲ５１Ｂ５＿ｍＲＮＡのＰｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）には
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＴＴＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＣＴＡＡ（配列番号３）、
Ｆｏｒｗａｒｄ： ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣ（配列番号４）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＴＴＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＣＴＡＡ（配列番号３）、
Ｆｏｒｗａｒｄ： ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣ（配列番号４）、
【0019】
Ｈｓ＿ＧＡＰＤＨ＿ｍＲＮＡのＰｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）には
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ（配列番号５）、
Ｆｏｒｗａｒｄ： ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ（配列番号６）
をそれぞれ用いた。
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ（配列番号５）、
Ｆｏｒｗａｒｄ： ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ（配列番号６）
をそれぞれ用いた。
【0020】
（３）試験対象アミノ酸
次の表１のアミノ酸について実施した。
次の表１のアミノ酸について実施した。
【0021】
【表1】
【0022】
上記表１に記載の２２種類のアミノ酸の嗅覚受容体に対する作用を次の条件で評価し、一次スクリーニングを行った。
各アミノ酸は、細胞培養培地で０．０１％、０．１％になるように溶解して試験溶液を調整し、１ｍｌ／ｗｅｌｌになるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで、２４時間培養した後、嗅覚受容体（ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５）のｍＲＮＡの発現変動を測定することで嗅覚受容体遺伝子の発現促進効果を評価した。
各アミノ酸は、細胞培養培地で０．０１％、０．１％になるように溶解して試験溶液を調整し、１ｍｌ／ｗｅｌｌになるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで、２４時間培養した後、嗅覚受容体（ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５）のｍＲＮＡの発現変動を測定することで嗅覚受容体遺伝子の発現促進効果を評価した。
【0023】
２．試験結果
アミノ酸濃度を０．０１％、０．１％としたとき、それぞれｍＲＮＡの変動が検出された。
下記表２にアミノ酸濃度０．０１％時のｍＲＮＡ測定結果を発現の高い順位に配列し、表３にアミノ酸濃度０．１％時のｍＲＮＡ測定結果を発現の高い順に配列して示した。
また無添加の場合の測定値（相対値）に対する各測定値が２以上を示すアミノ酸には＊を付した。
アミノ酸濃度を０．０１％、０．１％としたとき、それぞれｍＲＮＡの変動が検出された。
下記表２にアミノ酸濃度０．０１％時のｍＲＮＡ測定結果を発現の高い順位に配列し、表３にアミノ酸濃度０．１％時のｍＲＮＡ測定結果を発現の高い順に配列して示した。
また無添加の場合の測定値（相対値）に対する各測定値が２以上を示すアミノ酸には＊を付した。
【0024】
【表2】
【0025】
【表3】
【0026】
０．０１％の濃度で嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５の値がアミノ酸無添加の場合の値に対し２以上を示したアミノ酸に注目した。このようなアミノ酸は、ＧＡＢＡ、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システインの８アミノ酸であった。
【0027】
＜＜試験例２＞＞
＜アミノ酸の有効濃度＞
試験例１の結果から、嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現の増加作用が高い、ＧＡＢＡ、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニンの８アミノ酸について、さらに詳細に試験を行いｍＲＮＡ及び、嗅覚受容体タンパク質量の産生増加を指標として、各アミノ酸の有効濃度を確認した。
各アミノ酸の試験濃度は、０．００１％、０．０１％、０．１％の３段階とした。またＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ及びＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のタンパク質を測定した。
＜アミノ酸の有効濃度＞
試験例１の結果から、嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現の増加作用が高い、ＧＡＢＡ、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニンの８アミノ酸について、さらに詳細に試験を行いｍＲＮＡ及び、嗅覚受容体タンパク質量の産生増加を指標として、各アミノ酸の有効濃度を確認した。
各アミノ酸の試験濃度は、０．００１％、０．０１％、０．１％の３段階とした。またＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ及びＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のタンパク質を測定した。
【0028】
１．試験方法
（１）ｍＲＮＡ測定
試験例１と同様の条件でアミノ酸添加後に２４時間培養し、嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡを測定した。各濃度３ｗｅｌｌずつの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データはアミノ酸無添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
（１）ｍＲＮＡ測定
試験例１と同様の条件でアミノ酸添加後に２４時間培養し、嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡを測定した。各濃度３ｗｅｌｌずつの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データはアミノ酸無添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0029】
（２）発現したタンパク質量測定
また、発現した嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５タンパク質量はウエスタンブロット法によった。なおウエスタンブロット法による操作手順は、次の通りとした。
また、発現した嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４またはＯＲ５１Ｂ５タンパク質量はウエスタンブロット法によった。なおウエスタンブロット法による操作手順は、次の通りとした。
【0030】
１）上記各濃度のアミノ酸を添加して４８時間培養経過後の細胞を回収し、ＰＢＳ（－）で洗浄し、Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒによりタンパク質を抽出した。
２）抽出タンパク質濃度に合わせ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、抽出溶液中のＳＤＳ濃度が全量当たり２％になるように調整した。
３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５－２０％ ｇｅｌ）（ＤＲＣ）でタンパク質バンドを分離し、０．２μｍＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋに転写した。
４）ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温条件で、２０分間、ブロッキング操作を行った。
５）次いでブロッキング溶液を除去した後、１０００倍希釈した１次抗体に交換し、４℃で振動させながら一晩反応させた。なお一次抗体にはＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ－Ｈｕｍａｎ ＯＲ２ＡＴ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＯＲ５１Ｂ５ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ β－ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を使用した。
６）抗体反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ－ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＨＲＰ－Ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１：１００００に希釈し、室温で１時間反応させた。
７）ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分間反応させた後、ルミノ・イメージアナライザー ＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、β－ａｃｔｉｎに対する相対値を求めた。
８）各濃度３ｗｅｌｌずつの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データはアミノ酸無添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
２）抽出タンパク質濃度に合わせ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、抽出溶液中のＳＤＳ濃度が全量当たり２％になるように調整した。
３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５－２０％ ｇｅｌ）（ＤＲＣ）でタンパク質バンドを分離し、０．２μｍＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋに転写した。
４）ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温条件で、２０分間、ブロッキング操作を行った。
５）次いでブロッキング溶液を除去した後、１０００倍希釈した１次抗体に交換し、４℃で振動させながら一晩反応させた。なお一次抗体にはＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ－Ｈｕｍａｎ ＯＲ２ＡＴ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＯＲ５１Ｂ５ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ β－ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を使用した。
６）抗体反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ－ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＨＲＰ－Ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１：１００００に希釈し、室温で１時間反応させた。
７）ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分間反応させた後、ルミノ・イメージアナライザー ＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、β－ａｃｔｉｎに対する相対値を求めた。
８）各濃度３ｗｅｌｌずつの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データはアミノ酸無添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0031】
２．試験結果
試験結果を添加アミノ酸ごとに次に説明する。
（１）ＧＡＢＡ
図１上段にＧＡＢＡ添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
ＧＡＢＡの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＧＡＢＡは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
試験結果を添加アミノ酸ごとに次に説明する。
（１）ＧＡＢＡ
図１上段にＧＡＢＡ添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
ＧＡＢＡの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＧＡＢＡは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
【0032】
（２）Ｌ－シトルリン
図２上段にＬ－シトルリン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－シトルリンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－シトルリンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
図２上段にＬ－シトルリン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－シトルリンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－シトルリンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
【0033】
（３）Ｌ－（－）－フェニルアラニン
図３上段にＬ－（－）－フェニルアラニン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－（－）－フェニルアラニンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－（－）－フェニルアラニンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
図３上段にＬ－（－）－フェニルアラニン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－（－）－フェニルアラニンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－（－）－フェニルアラニンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
【0034】
（４）Ｌ－アルギニン
図４上段にＬ－アルギニン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アルギニンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－アルギニンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
図４上段にＬ－アルギニン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アルギニンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－アルギニンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
【0035】
（５）Ｌ－アラニン
図５上段にＬ－アラニン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アラニンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－アラニンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
図５上段にＬ－アラニン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アラニンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちＬ－アラニンは濃度依存性で、嗅覚受容体の遺伝子発現及びタンパク質発現を促進した。
【0036】
（６）Ｌ－アスパラギン
図６上段にＬ－アスパラギン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アスパラギンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加したが、０．０１％の添加が最適であった。すなわちＬ－アスパラギンは、ｍＲＮＡの発現には至適範囲があることが考えられた。しかし嗅覚受容体タンパク質発現は、ｍＲＮＡとは異なり濃度依存性で促進した。
図６上段にＬ－アスパラギン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アスパラギンの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加したが、０．０１％の添加が最適であった。すなわちＬ－アスパラギンは、ｍＲＮＡの発現には至適範囲があることが考えられた。しかし嗅覚受容体タンパク質発現は、ｍＲＮＡとは異なり濃度依存性で促進した。
【0037】
（７）Ｌ－アスパラギン酸
図７上段にＬ－アスパラギン酸添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アスパラギン酸の添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加したが、０．０１％添加が最適であった。すなわちＬ－アスパラギン酸の嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現には至適範囲があると考えられた。しかし嗅覚受容体のタンパク質発現は、ｍＲＮＡとは異なり濃度依存性で促進した。
図７上段にＬ－アスパラギン酸添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－アスパラギン酸の添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加したが、０．０１％添加が最適であった。すなわちＬ－アスパラギン酸の嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現には至適範囲があると考えられた。しかし嗅覚受容体のタンパク質発現は、ｍＲＮＡとは異なり濃度依存性で促進した。
【0038】
（８）Ｌ－システイン
図８上段にＬ－システイン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質比（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－システインの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちｍＲＮＡの発現においては濃度依存的に促進作用があると考えられた。一方、Ｌ－システインはＯＲ２ＡＴ４のタンパク質発現を促進したが、ＯＲ５１Ｂ５のタンパク質には統計的有意な効果は見られなかった。
図８上段にＬ－システイン添加によるＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ量（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ量（右グラフ）の測定結果を示す。また下段には同じくＯＲ２ＡＴ４のタンパク質（左グラフ）及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質比（右グラフ）の測定結果を示す。
Ｌ－システインの添加によって嗅覚受容体は、遺伝子の発現が促進され、各受容体の発現量が統計的有意に増加した。すなわちｍＲＮＡの発現においては濃度依存的に促進作用があると考えられた。一方、Ｌ－システインはＯＲ２ＡＴ４のタンパク質発現を促進したが、ＯＲ５１Ｂ５のタンパク質には統計的有意な効果は見られなかった。
【0039】
以上の試験結果から、ＧＡＢＡ、Ｌ－シトルリン、Ｌ（－）－フェニルアラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システインの８アミノ酸は、０．００１％以上の濃度において、濃度依存性で嗅覚受容体の遺伝子発現を促進して嗅覚受容体タンパク質の発現を促進することが明らかとなった。また最適濃度は０．０１％以上が好ましいことが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】