特許 7644111 がんを治療するための腫瘍内及び／または静脈内投与用組み換えＭＶＡウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-03-03

(45)【発行日】2025-03-11

(54)【発明の名称】がんを治療するための腫瘍内及び／または静脈内投与用組み換えＭＶＡウイルス

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20250304BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250304BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250304BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 15/48 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20250304BHJP

   C07K 14/15 20060101ALN20250304BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20250304BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20250304BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20250304BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61K39/21 ZNA

A61K39/00 H

A61K38/17

A61K39/395 T

A61K48/00

A61P35/00

A61P43/00 121

C12N15/12

C12N15/48

C12N15/62 Z

C12N7/01

C07K14/15

C07K14/47

C07K14/705

C07K19/00

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2022528248

(86)(22)【出願日】2020-11-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-01

(86)【国際出願番号】 EP2020082926

(87)【国際公開番号】W WO2021099586

(87)【国際公開日】2021-05-27

【審査請求日】2023-10-26

(31)【優先権主張番号】19210369.5

(32)【優先日】2019-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20193706.7

(32)【優先日】2020-08-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【微生物の受託番号】ECACC  00083008

(73)【特許権者】

【識別番号】509296443

【氏名又は名称】バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100221981

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 大成

(72)【発明者】

【氏名】ラウターバッハ・ヘニング

(72)【発明者】

【氏名】ヒンターベルガー・マリア

(72)【発明者】

【氏名】メディナ・エチェベルス・ホセ

(72)【発明者】

【氏名】ハビャン・マティアス

(72)【発明者】

【氏名】ハウスマン・ユルゲン

(72)【発明者】

【氏名】カッラ・マルクス

【審査官】宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０３８３８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０２２－５０７７４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Alexandra J. SPENCER et al.，“4-1BBL Enhances CD8+ T Cell Responses Induced by Vectored Vaccines in Mice but Fails to Improve Immunogenicity in Rhesus Macaques”，PLoS ONE，2014年08月20日，Vol. 9, No. 8，p.e105520，DOI: 10.1371/JOURNAL.PONE.0105520

【文献】Benjamin KRAUS et al.，“Vaccination Directed against the Human Endogenous Retrovirus-K Envelope Protein Inhibits Tumor Growth in a Murine Model System”，PLoS ONE，2013年08月30日，Vol. 8, No. 8，p.e72756，DOI: 10.1371/journal.pone.0072756

【文献】BENJAMIN KRAUS; ET AL，“Vaccination directed against the human endogenous retrovirus-K (HERV-K) gag protein slows HERV-K gag expressing cell growth in a murine model system”，VIROLOGY JOURNAL，2014年03月26日，VOL:11, NO:1，PAGE(S):58(1-7)，DOI: 10.1186/1743-422X-11-58

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００ー３５／７６８

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ ７／０１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする核酸と、
（ｉｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇをコードする核酸と、
（ｉｉｉ）ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードする核酸と、
（ｉｖ）４－１ＢＢＬをコードする核酸と、
を含む、組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。

【請求項2】

前記のＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードする核酸が、融合タンパク質として発現される、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。

【請求項3】

（ｖ）ＣＤ４０Ｌをコードする核酸をさらに含む、請求項１または２に記載の組み換えＭＶＡ。

【請求項4】

前記組み換えＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にＶ０００８３００８という番号で寄託されたものと同じＭＶＡ－ＢＮに由来する、請求項１～３のいずれかに記載の組み換えＭＶＡ。

【請求項5】

請求項４に記載の組み換えＭＶＡを含む、医薬調製物または医薬組成物。

【請求項6】

腫瘍内及び／または静脈内の投与に適応している、請求項５に記載の医薬調製物または医薬組成物。

【請求項7】

請求項１～３のいずれかに記載の組み換えＭＶＡを含む、医薬品またはワクチン。

【請求項8】

がんの治療のための、請求項５または６に記載の医薬調製物または医薬組成物、あるいは請求項７に記載の医薬品またはワクチン。

【請求項9】

がん性腫瘍での炎症応答の増強、がん性腫瘍のサイズの縮小、がん性腫瘍の増殖の遅延もしくは停止、及び／または対象の全生存率の上昇のための、請求項５または６に記載の医薬調製物または医薬組成物、あるいは請求項７に記載の医薬品またはワクチン。

【請求項10】

腫瘍内及び／または静脈内に投与される、請求項７に記載の医薬品またはワクチン。

【請求項11】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的抗体と組み合わせて用いられる、請求項７に記載の医薬品またはワクチン。

【請求項12】

免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストのいずれかと組み合わせて用いられる、請求項７に記載の医薬品またはワクチン。

【請求項13】

前記のＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする核酸が、配列番号１２に記載される配列を有するか、または配列番号１１に記載されるタンパク質配列をコードする、請求項１～４のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ。

【請求項14】

前記核酸が、ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥを、配列番号９に記載される配列を有する融合タンパク質としてコードする、請求項１～３または１３のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ。

【請求項15】

請求項１４に記載の組み換えＭＶＡを含む、医薬調製物または医薬組成物。

【請求項16】

腫瘍内及び／または静脈内の投与に適応している、請求項１５に記載の医薬調製物または医薬組成物。

【請求項17】

請求項１３または１４に記載の組み換えＭＶＡを含む、医薬品またはワクチン。

【請求項18】

がん性腫瘍での炎症応答の増強、がん性腫瘍のサイズの縮小、がん性腫瘍の増殖の遅延もしくは停止、及び／または対象の全生存率の上昇のための、請求項１５または１６に記載の医薬調製物または医薬組成物、あるいは請求項１７に記載の医薬品またはワクチン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんを治療するための治療法に関し、その治療は、静脈内または腫瘍内に投与される、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）をコードする核酸を含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを含む。組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス（組み換えＭＶＡ」または「ｒＭＶＡ」ともいう）は、本明細書で使用する場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＭＶＡを指す。より具体的な態様では、本発明は、静脈内または腫瘍内に投与される、ＴＡＡをコードする核酸と、４－１ＢＢＬをコードする核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。追加の態様では、本発明は、静脈内または腫瘍内に投与される、ＴＡＡをコードする核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。追加の態様では、本発明は、静脈内及び／または腫瘍内に投与される、ＴＡＡ、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、及びＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡを含む。

【背景技術】

【0002】

組み換えポックスウイルスは、感染性生物に対する免疫療法ワクチンとして、さらに最近では、腫瘍に対する免疫療法ワクチンとして使用されてきた（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８）：１０３１－１０３４）。

【0003】

感染症及びがんに対する免疫療法ワクチンとして有用であることが証明されているポックスウイルス株の１つは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス（単に「ＭＶＡ」と称する場合もある）である。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を５１６代連続継代することによって作製された（概説については、Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３：６－１４を参照のこと）。これらの長期継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、その約３１キロベースのゲノム配列が欠失しており、そのため、トリ細胞での複製に関して、宿主細胞が非常に限られているものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１－１０３８）。この得られたＭＶＡが大いに非病原性であることが様々な動物モデルにおいて示された（Ｍａｙｒ ＆ Ｄａｎｎｅｒ（１９７８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５－３４）。より安全な製品（ワクチンまたは医薬等）の開発用に、安全性プロファイルが向上されたＭＶＡ株が報告されてきている（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２０４２４８０号を参照のこと。また、例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照のこと。なお、これらのいずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような変異株は、非ヒト細胞及び非ヒト細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）では増殖的複製能があるが、ヒト細胞株（特にＨｅＬａ細胞株、ＨａＣａｔ細胞株及び１４３Ｂ細胞株を含む）では複製能がない。そのような株はまた、インビボにおいて、例えば、重度の免疫不全にあり、複製型ウイルスに対する感受性が高いトランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９等の特定のマウス株においても、増殖的複製能がない（米国特許第６，７６１，８９３号を参照のこと）。組み換え体を含め、そのようなＭＶＡ変異株及びその誘導体（「ＭＶＡ－ＢＮ」と称される）が報告されている（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２／０４２４８０号を参照のこと。また、例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照のこと）。

【0004】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードするポックスウイルスベクターの使用では、がん患者の腫瘍サイズが首尾よく縮小され、全生存率が向上することが示されている（例えば、ＷＯ２０１４／０６２７７８を参照のこと）。がん患者に、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＭＵＣ１及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙ等のＴＡＡをコードするポックスウイルスベクターを投与すると、がんと闘うために強い特異的なＴ細胞応答が患者で生じることが示されている（上記文献を参照のこと。また、Ｇｕａｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（２４），ｄｏｉ １０．１１５８／０００８－５４７２．ＳＡＢＣＳ－０９－５０８９）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．１：１０８７－９５も参照のこと）。

【0005】

多くのがん細胞及び腫瘍細胞に発現することが見出されたＴＡＡの一種は、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である。ＥＲＶは、以前は外来性であったレトロウイルスの残骸であって、宿主の生殖系列に侵入して、それ以降、遺伝的集団にわたり垂直伝播されてきたものである（Ｂａｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ａｒｔｉｃｌｅ １７８を参照のこと）。ＥＲＶに誘導されるゲノムの組み換えイベント及び正常細胞遺伝子の調節異常には、腫瘍の形成に寄与する作用があることが立証されている（上記文献を参照のこと）。さらに、特定のＥＲＶタンパク質に発がん特性があるという証拠がある（上記文献を参照のこと）。ＥＲＶは、例えば乳癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌及びリンパ腫を含む多種多様ながんで発現することが分かっている。（例えば、Ｂａｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：１７８、Ｃｅｇｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：４、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：１５２８－３５、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２０：８１－９０、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５８６９－７７、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８（１３ Ｓｕｐｐｌ．），ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｐｒｉｌ ２０１８，Ａｂｓｔｒａｃｔ １２５７、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ－Ｇａｌｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：９３２９－３６、Ｓｃｈｉａｖｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５５１０－１６、Ｍａｌｉｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７６２８１、Ｆａｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３１：３４－４５、Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：８７３５－４１、Ｂｕｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：４１７２－８０、Ｓｅｒａｆｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｔ’ｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１５：８４９－６２、Ｉｒａｍａｎｅｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２１：５１－７、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９７：１１３９－４６、Ｇｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３２：１４８４－９２、Ａｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．９：１８０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１９：４－２３を参照のこと）。

【0006】

ＭＶＡ等のポックスウイルスは、ＴＡＡを用いた場合のそれらの有効性に加えて、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）等のＣＤ４０アゴニスト（ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照のこと）、または４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）等の４－１ＢＢアゴニスト（Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１０５５２０）と組み合わせた場合に有効性が増強されることが示されている。

【0007】

ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌは、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子（「ＴＮＦＲ／ＴＮＦ」）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０が、Ｂ細胞、マクロファージ及びＤＣ等の多くの細胞種で構成的に発現するのに対して、そのリガンドであるＣＤ４０Ｌは、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（１１）：５７０７－５７１７、Ｍａ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ（２００９）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（５）：２６５－２７２）。感染または免疫後早期のＤＣとＣＤ４＋ Ｔ細胞との同族相互作用により、ＤＣは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を刺激するための「ライセンスを付与」される（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４－４７８）。ＤＣへのライセンシングにより、共刺激分子のアップレギュレーション、ＤＣの生存率上昇及びより良好な交差提示能がもたらされる。この過程は主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によって媒介されるが（Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７８－４８０、Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４８０－４８３）、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ非依存的な機序も存在する（ＣＤ７０、ＬＴ．ベータ．Ｒ）。興味深いことに、ＤＣに発現したＣＤ４０Ｌと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に発現したＣＤ４０との直接的相互作用も示唆されており、ヘルパー非依存的なＣＴＬ応答の発生について考えられ得る説明が提示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０：２１８－２２７）。

【0008】

４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬは、ＴＮＦＲ／ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。４－１ＢＢＬは、活性化Ｂ細胞、単球及びＤＣで発現する共刺激リガンドである。４－１ＢＢは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＤＣ、単球及び好中球を含むいくつかの自然免疫細胞集団によって構成的に発現される。興味深いことに、４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞に発現するが、休止Ｔ細胞には発現しない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２９：１９２－２１５）。４－１ＢＢの結合により、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）の増殖及び産生が誘導され、また、Ｂｃｌ－ｘＬ等の抗アポトーシス分子のアップレギュレーションを介してＴ細胞の生存が増強される（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４４：１９７－２１７）。重要なことには、４－１ＢＢの刺激により、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を介した、ＮＫ細胞増殖、ＩＦＮ－γ産生及び細胞溶解活性が増強される（Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：２４２３－３２）。

【0009】

４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬの免疫軸は現在、様々な免疫療法策によって探求されている。例として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の自家移植では、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において臨床効果が見られ、２０１７年にＦＤＡにより認可されている。腫瘍特異的抗体に由来する細胞外ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζ、及び４－１ＢＢの共刺激モチーフを組み合わせたＣＡＲを患者の自家Ｔ細胞に導入する。４－１ＢＢの付加は、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ持続性及び抗腫瘍傷害性に不可欠である（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：４６１７ｅ２７）。４－１ＢＢを標的とする抗体が現在研究されている。

【0010】

いくつかの研究で、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ経路を標的とするアゴニスト抗体は、単剤療法として使用した場合に抗腫瘍活性を示すことが示されている（Ｐａｌａｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２：６０８－２３）。４－１ＢＢを標的とするアゴニスト抗体（ＢＭＳのウレルマブ、Ｐｆｉｚｅｒのウトミルマブ）は現在、臨床開発段階にある。近年、４－１ＢＢＬを他の療法と組み合わせた研究では様々な成果が示されている。例えば、ＭＣ３８（マウス腺癌）腫瘍を以前から有するが、Ｂ１６メラノーマ腫瘍を有しないマウスに、ＣＴＬＡ－４に対する抗体及び抗４－１ＢＢを投与した場合、ＣＤ８＋ Ｔ細胞依存性の顕著な腫瘍退縮が観察され、これらの腫瘍に対する免疫が長期に持続した。別の例では、抗４－１ＢＢ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）－４６９４９２）による処置では、Ｍ１０９腫瘍のわずかな退縮しかもたらされなかったが、ＥＭＴ６腫瘍の増殖を大幅に遅延させた。

【0011】

腫瘍微小環境は、浸潤免疫細胞から、がん細胞、細胞外マトリックス、内皮細胞、及び腫瘍の進行に影響を及ぼす他の関与細胞まで、様々な種類の細胞で構成されている。この複雑に絡み合った平衡状態は、患者ごとに変化するのみならず、同じ対象の病変内でも変化する（Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ １７０（５）：９２７－９３８）。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現に基づく腫瘍の層別化は、がんに対する客観的奏効を得るための炎症環境の重要性を強調している（Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７５（１１）：２１３９－４５）。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の遺伝子発現プロファイルの汎がん解析により、腫瘍炎症シグネチャーが、免疫療法に対する客観的奏効と相関することが裏付けられている（Ｄａｎａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ６（１）：６３）。

【0012】

近年、がん療法でのワクチン投与経路を改善する試みは、皮下注射から静脈内投与経路まで拡大されてきている。例えば、異種抗原をコードするＭＶＡワクチンの静脈内投与が、その抗原に対する強力な特異的免疫応答を誘導できたことが示された（ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照のこと）。さらに、ＭＶＡワクチンにＣＤ４０Ｌを含めた場合、免疫応答増強が生じた。

【0013】

腫瘍病変への細菌由来物質（コーリートキシン）の接種が治癒応答をもたらすことが長きにわたり報告されており、抗腫瘍応答を促す際の局所感染の役割を強調している（Ｃｏｌｅｙ（１９０６）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．３（Ｓｕｒｇ Ｓｅｃｔ）：１－４８）。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、細菌産物及びウイルスの腫瘍病変への局所投与により、ｉ）Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）等の炎症誘発性サイトカインの分泌、ｉｉ）アラーミン及び熱ショックタンパク質等の危険シグナル、ならびにｉｉｉ）腫瘍抗原放出を含む、投与後の一連のイベントを起こす抗微生物プログラムが誘導される（Ａｚｎａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：３１－３９）。腫瘍内への免疫療法剤の局所投与は全身性免疫応答を誘導し、退縮は未処置の腫瘍病変で評価されてきた（（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ８（６）：６７）。

【0014】

ここ数年、ＭＶＡワクチンの腫瘍内投与が報告されている。ＧＭ－ＣＳＦを発現するＭＶＡの腫瘍内注射、及びＤＮＡワクチンによる免疫が、ＨＰＶ１６ Ｅ７腫瘍担持マウスの生存期間を延長することが見出された（Ｎｅｍｅｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ５４：４）。ＭＶＡの腫瘍内注射に関する他の研究では、膵臓腫瘍の増殖阻害を示すことはできなかった（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３（２）：ｅ０１９３１３１）。熱非働化ＭＶＡの腫瘍内注射では、危険シグナル、Ｉ型インターフェロン、樹状細胞による抗原交差提示の生成において依存的な抗腫瘍免疫応答が誘導された（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（１１）：ｅａａｌ１７１３）。

【0015】

多くのがんワクチンの活性には、腫瘍に対する適応免疫応答の誘導が伴う。腫瘍特異的Ｔ細胞の効果的な活性化には以下を含む。第１に、寛容誘導を最小限に抑え、コンピテントなＴ細胞レパートリーを促進するため、健全な組織ではなく腫瘍内での排他的かつ高い抗原発現。第２に、細胞内部での効果的な腫瘍抗原プロセシング及びＨＬＡ分子への結合。最後に、細胞表面での免疫原性ＨＬＡ／ペプチド複合体の提示及び腫瘍特異的Ｔ細胞によるそれらの認識である。

【0016】

能動免疫療法及びがんワクチンを含め、さらなるがん治療に対する実質的に満たされていない医療ニーズが明らかに存在する。加えて、患者の免疫応答の複数の領域で免疫応答増強を誘導することができる療法に対するニーズが存在する。多くの態様では、本開示の実施形態は、現在利用可能ながん治療を増加及び改善させる、ワクチン、療法及び併用療法を提供することによって、これらのニーズに対応する。

【発明の概要】

【0017】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と４－１ＢＢリガンド（本明細書では、４１ＢＢＬ、４－１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌともいう）とをコードする組み換えＭＶＡは、腫瘍内または静脈内に投与した場合に、がん患者の治療の効果を高めること、及び／またはその治療を増強することが本発明の様々な実施形態において確認された。より具体的には、本開示の様々な実施形態により、組み換えＭＶＡ単独での投与と比較して、腫瘍での炎症増大、腫瘍における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＴ細胞の疲弊の減少、腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖及びＮＫ細胞活性化、腫瘍体積縮小の増大、及び／またはがんである対象の生存率上昇がもたらされることが確認された。

【0018】

本発明の様々な実施形態では、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とをコードする組み換えＭＶＡは、腫瘍内または静脈内に投与した場合に、がん患者の治療を増強することが確認された。より具体的には、本開示の様々な実施形態により、組み換えＭＶＡ単独での投与と比較して、腫瘍での炎症増大、腫瘍における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＴ細胞の疲弊の減少、腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖及びＮＫ細胞活性化、腫瘍体積縮小の増大、及び／またはがんである対象の生存率上昇がもたらされることが確認された。

【0019】

追加の実施形態では、本発明は、静脈内及び／または腫瘍内に投与した場合にがん患者の治療を増強する、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）をコードする核酸とＣＤ４０Ｌをコードする核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを含む。

【0020】

したがって、一実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法を含み、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する。

【0021】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法を含み、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する。

【0022】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法を含み、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）をコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内及び／または静脈内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの投与により、ＴＡＡ、ＣＤ４０Ｌ抗原及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの、異なる注射経路による注射（すなわち、非腫瘍内または非静脈内の注射）と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する。

【0023】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法を含み、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し静脈内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの静脈内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内注射と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される。

【0024】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法を含み、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し静脈内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの静脈内投与により、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内注射と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される。

【0025】

追加の実施形態では、本発明は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法を含み、その方法が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し静脈内投与及び／または腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの静脈内及び／または腫瘍内投与により、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内または非腫瘍内の注射と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される。

【0026】

さらに別の実施形態では、本発明は、対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法を含み、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、異種の腫瘍関連抗原及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比較して、腫瘍での炎症応答増強を生じさせる。

【0027】

さらに別の実施形態では、本発明は、対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法を含み、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、異種の腫瘍関連抗原及びＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比較して、腫瘍での炎症応答増強を生じさせる。

【0028】

さらに別の実施形態では、本発明は、対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法を含み、その方法が、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内及び／または静脈内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与及び／または静脈内投与により、異種の腫瘍関連抗原をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第２の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内または非静脈内の注射によって生じる炎症応答と比較して、腫瘍での炎症応答増強を生じさせる。

【0029】

様々な追加の実施形態では、本発明は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを提供する。

【0030】

様々な追加の実施形態では、本発明は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0031】

様々な追加の実施形態では、本発明は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸と、ｃ）４－１ＢＢＬをコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0032】

さらに別の実施形態では、４－１ＢＢＬ抗原をコードする組み換えＭＶＡは、チェックポイント阻害剤アンタゴニストの投与と組み合わせて患者に腫瘍内投与された場合、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはがん患者の生存率を上昇させる。

【0033】

さらに別の実施形態では、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする組み換えＭＶＡは、チェックポイント阻害剤アンタゴニストの投与と組み合わせて患者に腫瘍内投与された場合、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはがん患者の生存率を上昇させる。

【0034】

さらに別の実施形態では、ＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする組み換えＭＶＡは、チェックポイント阻害剤アンタゴニストの投与と組み合わせて患者に腫瘍内及び／または静脈内投与された場合、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはがん患者の生存率を上昇させる。

【0035】

別の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体の投与と同時または抗体の投与の後に投与される。より好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、抗体の後に投与される。

【0036】

別の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、同じ投与経路（複数可）によって、抗体の投与と同時または抗体の投与の後に投与される。別の実施形態では、組み換えＭＶＡは、１つもしくは複数の異なる投与経路によって、または抗体の投与の後に投与される。

【0037】

さらに別の実施形態では、本発明は、がん患者における抗体療法を増強させるための方法を含み、その方法が、本発明の医薬組み合わせをがん患者に投与することを含み、その医薬組み合わせを投与することにより、抗体療法を単独で行う場合と比較して、抗体療法によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強される。

【0038】

好ましい実施形態では、第１の核酸は、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質であるＴＡＡをコードする。より好ましい実施形態では、ＥＲＶタンパク質は、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する。より好ましい実施形態では、ＥＲＶタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択される。

【0039】

好ましい実施形態では、第１の核酸は、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）ペプチドであるＴＡＡをコードする。より好ましい実施形態では、ＥＲＶペプチドは、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する。より好ましい実施形態では、ＥＲＶペプチドは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ）の偽遺伝子から選択される。

【0040】

他の好ましい実施形態では、第１の核酸は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＴＡＡをコードする。

【0041】

１つ以上の好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体である。

【0042】

様々な追加の実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストのいずれかと組み合わせて、がんである対象に投与が行われる。さらなる実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、がんである対象を治療するため、ＴＡＡに特異的な抗体と組み合わせて、がんである対象に投与が行われる。より好ましい実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、及びＩＣＯＳから選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせて投与が行われる。最も好ましい実施形態では、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、抗体を含む。最も好ましい実施形態では、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストは、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0043】

本発明のさらなる目的及び利点は、一部が下記の説明に示されており、一部は、その説明から明らかとなるか、または本発明を実施することにより認識され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘されている要素及び組み合わせによって認識及び実現されることになる。

【0044】

添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成すが、本発明の１つ以上の実施形態を例示すると共に、その記載と併せて、本発明の原理を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞によって、ＣＤ８ Ｔ細胞を４－１ＢＢＬの媒介により共刺激すると、ＤＣを必要とすることなく、サイトカインの産生に影響が及ぶことを示している。これに対して、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌでは、ＤＣの存在下でのみ、サイトカインの産生が増強される。実施例２に記載されているように、樹状細胞（ＤＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後に生成された。Ｂ１６．Ｆ１０細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを感染させ、感染した腫瘍細胞を採取し、指示されている場合には、ＤＣの存在下で共培養した。ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、上記の共培養物に加えた。細胞を培養し、その上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘによるサイトカイン濃度分析用に採取した。ＩＬ－６（Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（Ｂ）、ＩＬ－２（Ｃ）及びＩＦＮ－γ（Ｄ）の上清濃度が示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図2】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞は直接、すなわち、ＤＣを必要とすることなく、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化エフェクターＴ細胞への分化を促すが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染した腫瘍細胞のＣＤ４０Ｌ媒介による共刺激は、ＤＣの存在に依存することを示している。実施例３に記載されているように、樹状細胞（ＤＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後に生成された。Ｂ１６．Ｆ１０（メラノーマモデル）細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを感染させた。その翌日、感染した腫瘍細胞を採取し、（指示されている場合に）ＤＣの存在下で共培養した。ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、１：５の比率で共培養物に加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。その後、細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。Ａは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図では「ＣＤ８＋」として示されている）上のＴ－ｂｅｔのＧＭＦＩを示しており、Ｂは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４＋ グランザイムＢ＋ ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋のパーセンテージを示している。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図3】ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかをコードするＭＶＡに感染させると、腫瘍細胞株及びマクロファージにおける腫瘍細胞死が誘導されることを示している。実施例４に記載されているように、腫瘍細胞株Ｂ１６．ＯＶＡ（Ａ及びＢ）、ＭＣ３８（Ｃ）ならびにＢ１６．Ｆ１０（Ｄ）にベクターを、示されているＭＯＩで２０時間感染させた。細胞を、その生存率についてフローサイトメトリーにより解析した。Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥは、死細胞のパーセンテージ（「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ＋」）を示している。Ｂ：Ａの上清中のＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡによって定量した。Ｅ：骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、示されているＭＯＩで２０時間感染させた。細胞を、その生存率についてフローサイトメトリーにより解析した。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図4】ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬがインビボで、ＮＫ細胞の活性化を誘導することを示している。実施例５に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）もしくは２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせた５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡのいずれかにより静脈内免疫した。２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓をフローサイトメトリー解析用に処理した。ＣＤ６９（Ａ）及びＣＤ７０（Ｂ）の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）が示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図5】ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬによる静脈内免疫によって、インビボにおいて、血清ＩＦＮ－γの分泌が促進されることを示している。実施例６に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）、もしくは２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせた５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡのいずれかにより静脈内免疫した。Ａ：６時間後、マウスから採血し、全血から血清を分離して、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。Ｂ：３時間後、２１時間後及び４５時間後に、マウスに、ブレフェルジンＡを静脈内注射して、タンパク質の分泌を停止した。免疫から６時間後、２４時間後、及び４８時間後にマウスを屠殺し、脾細胞をフローサイトメトリーによって解析した。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図6】Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスにおいて、「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）で静脈内免疫すると、血清ＩＦＮ－γの分泌が促進されることを示している。実施例７に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡ（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）もしくはｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。６時間後、マウスから採血し、全血から血清を分離して、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図7】「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）で静脈内プライム免疫及び静脈内ブースト免疫を行った後、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びベクター特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が増加することを示している。実施例８に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４匹／群）に、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくは２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせた５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡのいずれかにより静脈内プライム免疫を０日目に行い、ブースト免疫を４１日目に行った。プライム免疫から６日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６４日目に、マウスから採血し、末梢血のフローサイトメトリー解析を行った。Ａは、末梢血白血球（ＰＢＬ）のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示しており、Ｂは、ＰＢＬのうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。プライム免疫後、７０日目に、マウスを屠殺した。脾臓を採取し、フローサイトメトリー解析を行った。Ｃは、生細胞のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示しており、Ｄは、生細胞のうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図8】４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスを静脈内注射すると、４－１ＢＢＬを含まない組み換えＭＶＡと比較して、抗腫瘍効果が増大することを示している。実施例９に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）を静脈内投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。

【図9】４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射の抗腫瘍効果増強を示している。実施例１０に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、１２日目及び１５日目（灰色の破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」として示されている）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」として示されている）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」として示されている）を腫瘍内投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。

【図10】確立された大腸癌に対して、ＣＤ４０Ｌを用いてコードさせたＭＶＡウイルスを腫瘍内注射することによる抗腫瘍効果を示している。実施例１１に記載されているように、ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から１４日目（黒い点線）、１９日目及び２２日目（黒い破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＴＡＡ（図では「ｒＭＶＡ」として示されている）もしくはＭＶＡ－ＴＡＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」として示されている）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。これらの実験では、組み換えＭＶＡによってコードされるＴＡＡは、抗原ＡＨ１Ａ５、ｐ１５Ｅ及びＴＲＰ２を含んだ。

【図11】チェックポイント阻害と腫瘍標的化抗体とが、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ（本明細書では「ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ」ともいう）の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与と相乗作用することを示している。実施例１２に記載されているように、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、指示されている場合（チェック印）には、２００μｇのＩｇＧ２ａ、抗ＴＲＰ－１または抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与した。腫瘍の接種から１３日目（黒い点線）、１８日目及び２１日目（灰色の破線）に、マウスをＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した。腫瘍増殖を定期的に測定した。

【図12】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射が、抗ＣＤ１３７抗体治療と比較して、より優れた抗腫瘍効果をもたらすことを示している。実施例１３に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞をｓ．ｃ．（皮下）投与した。７日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬまたは１０μｇの抗４－１ＢＢ（３Ｈ３）抗体のいずれかを腫瘍内注射した。腫瘍増殖を定期的に測定した。Ａには、腫瘍平均体積が示されている。Ｂ：プライミングから１２日目に、末梢血リンパ球をＯＶＡデキストラマーで染色し、ＦＡＣＳによって解析した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちのＯＶＡデキストラマー＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図13】内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍効果を示している。実施例１４に記載されているように、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ｗｔ細胞をｓ．ｃ．（皮下）投与した。腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、ＣＴ２６．ｗｔ腫瘍担持マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から１２日目に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ｒＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはｒＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。示されているのは、腫瘍平均径（Ａ）及び腫瘍平均体積（Ｂ）である。Ｃ：免疫から７日後に、血液細胞を再刺激したものであり、刺激後の血液中のＣＤ８＋ ＣＤ４４＋ ＩＦＮ－γ＋ 細胞のパーセンテージが示されている。

【図14】内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０及びＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍効果を示している。実施例１５に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞をｓ．ｃ．（皮下）投与した。７日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ｒＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはｒＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。示されているのは、腫瘍平均体積（Ａ）と、免疫から７日後に、ｐ１５ｅペプチドで刺激した後の血液中のＣＤ８＋ ＣＤ４４＋ ＩＦＮ－γ＋ 細胞のパーセンテージである（Ｂ）。

【図15】ＩＴ免疫に対するサイトカイン／ケモカインＭＶＡ－ＢＮ骨格応答は、４－１ＢＢＬのアジュバント作用によって増大し得る。本明細書では、「アジュバント作用」とは、組み換えＭＶＡの特定のコードされたタンパク質または成分によって、その組み換えＭＶＡの他のコードされているタンパク質（複数可）または成分（複数可）により生じる免疫応答が増大することが意図されている。この図においては、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した（実施例２３を参照のこと）。１０日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝６匹のマウス／群）。６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。サイトカイン／ケモカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘによって解析した。図１５には、免疫マウスにおいて、サイトカイン／ケモカインがアップレギュレートされたことが示されている。

【図16】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫に対するサイトカイン／ケモカインの炎症誘発性応答が増大する。５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した（実施例２３及び２４を参照のこと）。１０日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝６匹のマウス／群）。６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。サイトカイン／ケモカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘによって解析した。図１６は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫したマウスにおいて、ＭＶＡ－ＢＮの場合と比べてアップレギュレートするサイトカイン／ケモカインを示している。

【図17】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）のＴ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９～１３日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内注射した（実施例２５を参照のこと）。免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを屠殺し、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）をコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＣＤ４５＋ 細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が示されている。

【図18】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後のＴＭＥ及び流入領域ＬＮのＴ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９～１３日後、腫瘍の測定値が５．５×５．５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内注射した（実施例２６を参照のこと）。免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを屠殺し、腫瘍及びＴｄＬＮ（腫瘍流入領域リンパ節）をコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。Ａ：腫瘍（左パネル）及びＴｄＬＮ（右パネル）におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちのＫｉ６７＋ 細胞のパーセンテージが示されている。Ｂ：ｉ．ｔ．免疫から７日後の腫瘍におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のうちのＰＤ１のＧＭＦＩが示されている。Ｃ：ｉ．ｔ．免疫から７日後の腫瘍におけるＯＶＡ特異的Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇの比率が示されている。

【図19】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した後のＴＭＥ及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）のＮＫ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９～１３日後、腫瘍の測定値が５．５×５．５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内注射した（実施例２７を参照のこと）。免疫から１日後、３日後及び７日後に、マウスを屠殺し、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）をコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＮＫ細胞数、ならびに腫瘍及びＴｄＬＮ内のＮＫ細胞のＣＤ６９、グランザイムＢ及びＫｉ６７表面マーカーのＧＭＦＩが示されている。

【図20】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに媒介される抗腫瘍効果のＣＤ８ Ｔ細胞依存性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳまたは２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例２８を参照のこと）。この１回目の注射から５日目及び８日目に、これらの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射を繰り返した（縦の破線）。加えて、初回免疫の１日前、１日後、４日後、７日後、１１日後に、コントロール抗体であるＩｇＧ２ｂアイソタイプ（左及び中央のパネル）、または抗ＣＤ８抗体（２．４３、右パネル）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（１００μｇ／マウス）。腫瘍増殖を定期的に測定したものであり、腫瘍平均径が示されている。

【図21A】ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの媒介による抗腫瘍効果のＢａｔｆ３＋ ＤＣ依存性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｔｆ３－／－マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後（縦の破線）、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例２９を参照のこと）。１回目の腫瘍内注射から５日目及び８日目に、このｉ．ｔ．注射を繰り返した（縦の破線）。腫瘍増殖を定期的に測定した。腫瘍平均径が示されている。

【図21B】ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの媒介による抗腫瘍効果のＢａｔｆ３＋ ＤＣ依存性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｔｆ３－／－マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後（縦の破線）、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例２９を参照のこと）。１回目の腫瘍内注射から５日目及び８日目に、このｉ．ｔ．注射を繰り返した（縦の破線）。腫瘍増殖を定期的に測定した。初回免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞（すなわちＯＶＡ_{２５７－２６４}特異的Ｔ細胞）の存在について解析した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図22A】Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ担持マウスにおける、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与におけるＮＫ細胞の役割である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＩＬ１５Ｒα－／－マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例３０を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。腫瘍平均径が示されている。

【図22B】Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ担持マウスにおける、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与におけるＮＫ細胞の役割である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＩＬ１５Ｒα－／－マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例３０を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。生存率（％）が示されている。

【図22C】Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ担持マウスにおける、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与におけるＮＫ細胞の役割である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＩＬ１５Ｒα－／－マウスに、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内注射した（実施例３０を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。初回免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＶＡ_{２５７－２６４}デキストラマー＋（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図23】ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによるＩＴ免疫に応答した、ＮＫ細胞依存性サイトカイン／ケモカインプロファイルを示している。５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス及びＩＬ１５Ｒα－／－マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した（実施例３１を参照のこと）。７日目に、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝２～３匹のマウス／群）。６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。サイトカイン／ケモカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘによって解析した。図２３には、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した後、ＩＬ１５Ｒαの非存在下で減少するサイトカイン／ケモカインが示されている。

【図24A】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおいて、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果をＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの場合と比較したものを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３２を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。腫瘍平均径を示している。

【図24B】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおいて、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果をＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの場合と比較したものを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３２を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで処置したマウスの白斑の外観を示している。

【図24C】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおいて、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果をＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの場合と比較したものを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬもしくはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３２を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。初回免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について解析した。ｐ１５Ｅで再刺激後のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図25A】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおけるＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの腫瘍内投与の抗腫瘍効果である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３３を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。腫瘍平均径が示されている。

【図25B】Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ担持マウスにおけるＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの腫瘍内投与の抗腫瘍効果である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。７日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３３を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。初回免疫から１１日後、血液を採取し、ｐ１５ｅペプチドで再刺激した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図26A】ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣｔ２６ｗｔ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１３日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３４を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。腫瘍平均径を示している。

【図26B】ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣｔ２６ｗｔ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１３日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３４を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。生存率（％）を示している。

【図26C】ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣｔ２６ｗｔ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１３日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを腫瘍内注射した（実施例３４を参照のこと）。１回目の注射から５日目及び８日目に、処置を繰り返した。腫瘍増殖を定期的に測定した。初回免疫から１１日後、血液を採取し、ＡＨ１ペプチドで再刺激したものである。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮγ＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。

【図27】４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌをさらに含むＭＶＡ－ｇｐ７０を腫瘍内注射した後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）のＴ細胞の定量解析及び定性解析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。９日後、腫瘍の測定値が５×５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを腫瘍内注射した（実施例３５を参照のこと）。免疫から３日後、マウスを屠殺し、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）を採取し、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、フローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＣＤ８^＋Ｔ細胞、ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＫｉ６７^＋ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を示している。データは、平均±ＳＥＭを表す。

【図28】４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌをさらに発現するＭＶＡ－ｇｐ７０を腫瘍内注射した後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）のＴ細胞の定量解析及び定性解析を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した（実施例３６を参照のこと）。９日後、腫瘍の測定値が５．５×５．５ｍｍを上回ったら、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを腫瘍内内注射した。免疫から３日後、マウスを屠殺し、腫瘍及びＴｄＬＮを採取し、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化し、得られた個々の細胞をフローサイトメトリーによって解析した。腫瘍１ｍｇ当たり及びＴｄＬＮ当たりのＮＫ細胞、Ｋｉ６７^＋ＮＫ細胞及びグランザイムＢ^＋ＮＫ細胞の数が示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【図29A】ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の静脈内投与の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ＷＴ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１２日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを静脈内注射した（実施例３７を参照のこと）。腫瘍平均径を示している。

【図29B】ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の静脈内投与の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ＷＴ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１２日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを静脈内注射した（実施例３７を参照のこと）。生存率（％）を示している。初回免疫から７日後、血液を採取し、ＡＨ１ペプチドで再刺激した。

【図29C】ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、４－１ＢＢＬ及び／またはＣＤ４０Ｌでアジュバント添加を行ったＭＶＡ－ｇｐ７０の静脈内投与の抗腫瘍効果である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５×１０^５個のＣＴ２６．ＷＴ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。１２日後、マウスを群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを静脈内注射した（実施例３７を参照のこと）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞のパーセンテージを平均±ＳＥＭとして示している。

【図30A】ＭＶＡ系ベクターＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ（「ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４」または「ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ」）を示す。詳細については、実施例３８及び３９を参照のこと。

【図30B】感染細胞のＨＬＡ内にＴＡＡを取り込ませベクターの能力を示す。詳細については、実施例３８及び３９を参照のこと。

【図30C】ｈ４－１－ＢＢＬを機能的形態、すなわち、ｈ４－１－ＢＢ受容体結合性形態で発現させるベクターの能力を示す。詳細については、実施例３８及び３９を参照のこと。

【図31】ＭＶＡに基づくベクター「ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２」を示し（Ｃ）、さらに、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ（Ａ；ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４で使用する場合）及びＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３（Ｂ；ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２で使用する場合）の概略マップを示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

上記の概要及び下記の詳細な説明のいずれも、例示及び説明のためのものに過ぎず、特許請求されているような本発明を制限するものではないことを理解されたい。

【0047】

本願で説明及び例示されているように、本発明の組み換えＭＶＡ及び方法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。様々な態様では、本発明により、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と４－１ＢＢＬ抗原とを含む組み換えＭＶＡを、がんである対象に腫瘍内または静脈内に投与した場合に、対象において抗腫瘍効果が増大することが示されている。本明細書でさらに詳細に説明されているように、この抗腫瘍効果の増大には、腫瘍体積の縮小の増大、全生存率の上昇、ＴＡＡに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の増強、及び炎症応答の増強（ＮＫ細胞活性の増大、サイトカインの産生の増加等）が含まれる。

【0048】

本願で説明及び例示されているように、本発明の組み換えＭＶＡ及び方法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。様々な態様では、本発明により、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＣＤ４０Ｌ抗原とを含む組み換えＭＶＡを、がんである対象に腫瘍内または静脈内に投与した場合に、対象において抗腫瘍効果が増大することが示されている。本明細書でさらに詳細に説明されているように、この抗腫瘍効果の増大には、腫瘍体積の縮小の増大、全生存率の上昇、ＴＡＡに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の増強、及び炎症応答の増強（ＮＫ細胞活性の増大、サイトカインの産生の増加等）が含まれる。

【0049】

追加の態様では、本発明の様々な実施形態によって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と４－１ＢＢＬ抗原とを含む組み換えＭＶＡを、少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニスト／アゴニストと組み合わせて腫瘍内に投与すると、がんである対象において、腫瘍縮小が増大し、全生存率が上昇することが示されている。

【0050】

さらなる態様では、本発明の様々な実施形態によって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と４－１ＢＢＬ抗原とを含む組み換えＭＶＡを、腫瘍特異的抗体と組み合わせて腫瘍内に投与すると、がんである対象において、腫瘍縮小が増大し、全生存率が上昇することが示されている。

【0051】

これまで、組み換えＭＶＡウイルスにより４－１ＢＢＬ抗原がコードされているが、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡの免疫原性の有益性は不明であった（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（８）：ｅ１０５５２０を参照のこと）。Ｓｐｅｎｃｅｒの文献では、ＭＶＡベクターまたはアデノウイルスベクターのいずれかで、４－１ＢＢＬとトランスジェニック抗原を共発現させることにより、マウスでのＣＤ８ Ｔ細胞応答の増大がもたらされたが、４－１ＢＢＬをコードするアデノウイルスベクターの筋肉内投与の後には、非ヒト霊長類でのＩＦＮ－γ応答の増大はまったく見られなかった（上記文献、２ページ、６ページ）。さらに、がんを治療すること、ならびに腫瘍及び／または腫瘍細胞を破壊することの一環として、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡを用いる免疫原性の有益性は不明であった。

【0052】

本開示の様々な実施形態により、４－１ＢＢＬとＴＡＡをコードするＭＶＡ（本明細書では、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬという）は、ヒト等の対象のがんを治療するのに有効であり得ることが示されている。本明細書に示され、説明されているように、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを投与すると、がんである対象の免疫応答の複数局面を増強でき、腫瘍細胞を効果的に低減及び殺傷することができる。本開示の様々な実施形態の抗腫瘍効果の増強のうちの１つ以上が、以下で概説されている。

【0053】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの静脈内投与により、抗腫瘍効果の増強が生じる。少なくとも１つの態様では、本発明は、静脈内に投与される、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする組み換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ）を含み、静脈内投与により、４－１ＢＢＬを含まない組み換えＭＶＡの静脈内投与と比較して、または４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの非静脈内投与（例えば、４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの皮下投与等）と比較して、抗腫瘍効果が増強される。これらの抗腫瘍効果の増強には、ＮＫ細胞応答の増強（図４に示されている）、ＩＦＮ－γの分泌増加によって示される炎症応答の増強（図５及び図６に示されている）、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞増殖の増大（図７に示されている）、ならびに腫瘍縮小の増大（図８に示されている）が含まれる。

【0054】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、腫瘍での炎症が増強される。本発明の別の態様では、腫瘍細胞をＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬには感染させるが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌには感染させない場合、抗原を交差提示するＤＣの非存在下で、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が活性化されて、Ｔ細胞由来のサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ等）が産生されることが確認された（図１Ａ～１Ｄ）。活性化時にナイーブＴ細胞によって産生され、樹状細胞及び骨髄系細胞サブセットの成熟を誘導する成長因子であるＧＭ－ＣＳＦのケースでは、これは予想外であった（Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４６２５－４６２９）。抗原を交差提示するＤＣの存在下では、ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染させた腫瘍細胞によって刺激された抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γを産生したが、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬのようにＩＬ－２またはＧＭ－ＣＳＦを産生することはなかった（図１Ａ～１Ｄ）。興味深いことに、ＤＣによって産生される重要なサイトカインであるＩＬ－６が大量に検出された（図１Ａ）。

【0055】

有益な一態様では、腫瘍での炎症増強は、腫瘍部位で腫瘍細胞を殺傷するＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を多数生じさせることができる（例えば、Ｌａｎｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ．２８（ｓｕｐｐｌ １２）：ｘｉｉ１８－ｘｉｉ３２を参照のこと）。「ホット」腫瘍としても知られるこれらの炎症腫瘍により、ＴＩＬ、サイトカイン、及び他の炎症分子の数の増加を考えると、腫瘍細胞破壊の増強が可能になる。

【0056】

４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、腫瘍体積が縮小し、全生存率が上昇する。一態様では、本発明は、腫瘍内に投与される、４－１ＢＢＬ抗原をコードする組み換えＭＶＡ（ＭＶＡ－４－１ＢＢＬ）を含み、腫瘍内投与により、４－１ＢＢＬを含まない組み換えＭＶＡの腫瘍内投与と比較して、がんである対象における抗腫瘍効果が増強される。

【0057】

これまで、組み換えＭＶＡウイルスが腫瘍内に投与されたことはあるが（例えば、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３：ｅ０１９３１３１及びＮｅｍｅｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ５４：３２６－３３を参照のこと）、それらの研究は、結果が様々である。例えば、Ｎｅｍｅｃｋｏｖａの研究では、ＧＭ－ＣＳＦを発現するワクシニアウイルスＭＶＡの腫瘍内注射及びＤＮＡワクチンによる免疫が、ＨＰＶ１６誘発性腫瘍を有するマウスの生存期間を延長することが見出された（Ｎｅｍｅｃｋｏｖａの文献のアブストラクトを参照のこと）。別法として、Ｗｈｉｔｅらの研究では、ＭＶＡの腫瘍内注射後、膵臓腫瘍の増殖阻害を示すことはできなかった（Ｗｈｉｔｅの文献のアブストラクトを参照のこと）。

【0058】

本開示の一環で、ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードする１つ以上の核酸を含む組み換えＭＶＡを対象に腫瘍内投与した。図９に示されているように、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射では、組み換えＭＶＡ ＴＡＡの場合と比較して腫瘍体積の顕著な減少が示された。

【0059】

免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストと組み合わせた４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、抗腫瘍効果が増大する。様々な実施形態では、本発明は、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを、免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストと組み合わせて投与することを含む。好ましくは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与は、静脈内投与または腫瘍内投与である。免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストと組み合わされる本発明のＭＶＡは、組み合わせでさらに有効ながん治療が得られることから、有益である。例えば、本発明の組み合わせ及び／または併用療法は、がん患者の免疫応答の複数局面を増強する。少なくとも１つの態様では、組み合わせにより、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方が相乗的に増強され、免疫チェックポイント分子のアンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせた場合に、がん患者の腫瘍体積が縮小し、生存率が上昇する。

【0060】

本願に提示されているデータは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬが、免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストと組み合わせた場合に抗腫瘍効果増大を生じさせることを示している。事実、図１１に示されているように、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与をＰＤ－１抗体の腹腔内投与と組み合わせた場合、ＰＤ－１単独と比較して腫瘍体積の減少があった。

【0061】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体と組み合わせて投与される、４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、抗腫瘍効果が増大する。様々な実施形態では、本発明は、ＴＡＡに特異的な抗体と組み合わせたＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与を含む。好ましくは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与は、静脈内投与または腫瘍内投与である。本発明のＭＶＡを、ＴＡＡ特異的抗体と組み合わせることは有益であり、これらは協働して、より有効ながん治療をもたらすことができる。

【0062】

例示的な一態様では、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与によって誘導される、ＮＫ細胞応答の増強は、ＴＡＡ特異的抗体と相乗的に作用して、対象の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する。がんである対象におけるＡＤＣＣがこのように増強されると、腫瘍細胞の殺傷及び腫瘍の破壊が増加する。

【0063】

本願に提示されているデータは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬが、ＴＡＡ特異的抗体と組み合わせた場合に抗腫瘍効果増大を生じさせることを示している。事実、図１１に示されているように、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与をＴＲＰ－１抗体の腹腔内投与と組み合わせた場合、ＴＲＰ－１抗体単独と比較して腫瘍体積の減少があった。

【0064】

本発明による、プライム免疫及びブースト免疫の一環としてのＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与では、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加が増大する。別の態様では、本発明は、同種及び／または異種でのプライム－ブーストレジメンの一環として、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬを投与する方法を提供する。好ましくは、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの投与は、静脈内投与または腫瘍内投与である。図７に示されているように、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加は、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの静脈内投与によるプライミング及びブースティングの際に増大した。

【0065】

定義
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数形の言及が含まれる。したがって、例えば、「核酸」という場合には、その核酸が１つ以上含まれ、「その方法」という場合には、当業者に知られている同等の工程及び方法であって、修正可能であるか、または本明細書に記載されている方法と置き換え可能である工程及び方法への言及が含まれる。

【0066】

別段に示されていない限り、一連の要素の前に付された「少なくとも」という用語は、その一連の要素のあらゆる要素を指すと理解されたい。当業者は、慣用的に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載されている発明の具体的実施形態の均等物を数多く認識するか、または確認できるであろう。そのような均等物は、本発明に含まれるように意図されている。

【0067】

本明細書及び下記の特許請求の範囲の全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、示されている整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群を含むことを示唆しているが、いずれかの他の整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群を除外しないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、または場合によっては、本明細書で使用する場合、「有する」という用語に置き換えることができる。あまり好ましくはないが、上記の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する）のいずれも、本明細書において、本発明の態様または実施形態の関連で使用する場合にはいずれも、「～からなる」という用語に置き換えることができる。本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の要素で指定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「～から本質的になる」という場合には、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を及ぼさない材料または工程は除外されない。

【0068】

本明細書で使用する場合、示されている複数の要素間に置かれた「及び／または」という接続語は、個々の選択肢、及び選択肢の組み合わせの両方を含むものとして理解する。例えば、２つの要素が、「及び／または」によって接続されている場合、第１の選択肢では、第１の要素が第２の要素を用いずに適用可能であることを指す。第２の選択肢では、第２の要素が第１の要素を用いずに適用可能であることを指す。第３の選択肢では、第１の要素及び第２の要素を併せて適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、意味の範囲内に入り、したがって、本明細書で使用する場合の「及び／または」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上を同時に適用することもまた、意味の範囲内に入り、したがって、「及び／または」という用語の要件を満たすことが理解される。

【0069】

本明細書に記載されているような「変異」または「改変」タンパク質または抗原は、本明細書では、欠失、付加、挿入及び／または置換等のいずれかの改変を核酸またはアミノ酸に加えたものとして定義する。

【0070】

本明細書に記載されている核酸配列に関する「配列相同性パーセント（％）または配列同一性パーセント（％）」は、候補配列と参照配列をアラインメントし、必要に応じて、配列同一性パーセントが最大になるように、ギャップを導入した後、いずれの保存的置換も配列同一性の一部としてみなさない場合に、候補配列内のヌクレオチドのうち、参照配列（すなわち、由来元の核酸配列）内のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドのパーセンテージとして定義する。ヌクレオチドの配列同一性パーセントまたは配列相同性パーセントを求めるためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）というソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野の技術の範囲内である様々な方法で行うことができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたって、アラインメントを最大限にするのに必要ないずれかのアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを定めることができる。

【0071】

例えば、核酸配列の適切なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）によって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３）によって標準化されたスコアリングマトリックスを用いることによって、アミノ酸配列に適用できる。配列の同一性パーセントを求めるための、このアルゴリズムの例示的なインプリメンテーションは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）によって、「ＢｅｓｔＦｉｔ」というユーティリティアプリケーション内に供給されている。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から入手可能）に記述されている。本発明の関連において、同一性パーセントを求めるための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｔｕｒｒｏｋが開発し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）が流通させているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いることができ、その際、デフォルトパラメーターをスコア表に使用する（例えば、ギャップオープンペナルティー：１２、ギャップエクステンションペナルティー：１、ギャップ：６）。生成されたデータから、「マッチ」値に「配列同一性」が反映される。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の好適なプログラムは概して、当該技術分野において知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで使用するＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ、ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ、ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ、ｃｕｔｏｆｆ＝６０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ、Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲというデフォルトパラメーターを用いて使用できる。これらのプログラムの詳細は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／というインターネットアドレスで見ることができる。

【0072】

「プライム－ブーストワクチン接種」または「プライム－ブーストレジメン」という用語は、特定の抗原を標的とするワクチンの１回目のプライミング注射を行ってから、間隔を空けて、同じワクチンのブースティング注射を１回以上行うことを用いるワクチン接種の戦略またはレジメンを指す。プライム－ブーストワクチン接種は、同種であっても異種であってもよい。同種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射と１回以上のブースティング注射の両方に、同じ抗原及び同じベクターを含むワクチンを使用する。異種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射と１回以上のブースティング注射の両方で、同じ抗原を含むが、プライミング注射と１回以上のブースティング注射で、異なるベクターを含むワクチンを使用する。例えば、同種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射で、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射で、１つ以上の抗原を発現する同じ組み換えポックスウイルスを使用してよい。これに対して、異種でのプライム－ブーストワクチン接種では、プライミング注射で、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射で、１つ以上の抗原を発現する異なる組み換えポックスウイルスを使用してよい。

【0073】

「組み換え」という用語は、天然では見られないか、または天然では見られない構成で、別のポリヌクレオチドに連結されている、半合成または合成の供給源のポリヌクレオチド、ウイルスまたはベクターを意味する。「組み換えＭＶＡ」または「ｒＭＶＡ」とは、本明細書で使用する場合、概して、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）が意図されている。

【0074】

本明細書で使用する場合、腫瘍体積を縮小することまたは腫瘍体積の縮小は、腫瘍の体積及び／またはサイズの縮小として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解されている臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。腫瘍の体積及び／またはサイズの縮小と関連するいくつかの例示的な臨床試験エンドポイントとしては、奏効率（ＲＲ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0075】

本明細書で使用する場合、生存率の上昇は、がん患者の生存率の上昇として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解される臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。生存率の上昇と関連付けられた例示的ないくつかの臨床試験エンドポイントとしては、全生存率（ＯＳ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0076】

本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」または「異種」遺伝子は、野生型ポックスウイルスゲノム（例えば、ワクシニア、鶏痘ウイルスまたはＭＶＡ）に存在しない核酸配列またはアミノ酸配列であると理解されたい。当業者は、「導入遺伝子」または「異種遺伝子」は、ワクシニアウイルス等のポックスウイルスに存在する場合、宿主細胞への組み換えポックスウイルスの投与後に、その遺伝子が、対応する異種遺伝子産物として、すなわち「異種抗原」及び／または「異種タンパク質」として発現するような方法でポックスウイルスゲノムに組み込まれるべきであると理解する。発現は通常、ポックスウイルス感染細胞での発現を可能にする調節エレメントに、異種遺伝子を機能的に連結することによって行われる。好ましくは、調節エレメントは、天然または合成のポックスウイルスプロモーターを含む。

【0077】

「ベクター」とは、異種のポリヌクレオチドを含むことができる組み換えＤＮＡプラスミド、組み換えＲＮＡプラスミド、または組み換えウイルスを指す。異種のポリヌクレオチドは、予防または療法を目的として、対象とする配列を含んでよく、任意に、発現カセットの形態であってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、最終標的の細胞または対象において複製能がある必要はない。この用語には、クローニングベクター及びウイルスベクターが含まれる。

【0078】

組み合わせ及び方法
様々な実施形態では、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡであって、腫瘍内に投与した場合に、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内投与によって誘導される炎症応答及びＴ細胞応答と比較して、炎症応答及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される組み換えＭＶＡを含む。

【0079】

様々な追加の実施形態では、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸であって、腫瘍内に投与した場合に、ＴＡＡをコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの腫瘍内投与によって誘導される腫瘍内炎症応答及びＴ細胞応答と比較して、腫瘍内炎症応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方が誘導される核酸を含む。

【0080】

腫瘍での炎症応答増強．
本開示の様々な態様では、ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、組み換えＭＶＡ単独での投与と比較して、腫瘍での炎症応答の増強が誘導されることが確認された。少なくとも１つの態様では、本開示による、腫瘍における「炎症応答の増強」は、腫瘍及び／または腫瘍細胞における、１）ＩＦＮ－γの発現の増加、及び／または２）グランザイムＢ（ＧｒａＢ）の発現の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本開示に従って、腫瘍及び／または腫瘍細胞において炎症応答が増強されたか否かは、当該技術分野において知られているように、ケモカイン及びサイトカインの分泌を含め、炎症応答の増大を示す１つ以上の分子の発現が増加したか判断するために測定することによって判断できる。例示的な炎症応答マーカーには、ＮＫ細胞の出現頻度及び／または活性を測定するのに有用であるマーカーのうちの１つ以上が含まれ、ＩＦＮ－γ及び／またはグランザイムＢ（ＧｒａＢ）のうちの１つ以上が含まれる。これらの分子及びその測定は、当該技術分野において理解されている実証済みのアッセイであり、既知の技法に従って行うことができる。例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（（１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：１５９－１６５）を参照のこと。

【0081】

ＮＫ細胞応答の増強．
本開示の様々な追加の態様では、ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与または静脈内投与により、組み換えＭＶＡ単独での投与と比較して、腫瘍または腫瘍環境におけるＮＫ細胞応答の増強が誘導されることが確認された。一態様では、本開示による「ＮＫ細胞応答の増強」は、１）ＮＫ細胞出現頻度の上昇、２）ＮＫ細胞の活性化の増大、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本開示に従って、ＮＫ細胞応答が増強されたか否かは、ＮＫ細胞出現頻度の上昇、ＮＫ細胞の活性化の増大、及び／またはＮＫ細胞の増殖の増加を示す１つ以上の分子の発現を測定することによって判断できる。ＮＫ細胞の出現頻度及び／または活性を測定するのに有用である例示的なマーカーには、ＮＫｐ４６、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ、ＣＤ５６及び／またはＢｃｌ－ＸＬのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の活性化を測定するのに有用である例示的なマーカーには、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ－ＸＬのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の増殖を測定するのに有用である例示的なマーカーには、Ｋｉ６７が含まれる。これらの分子及びその測定は、当該技術分野において理解されている実証済みのアッセイであり、既知の技法に従って行うことができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：１５９－１６５を参照のこと）。加えて、それらの分子を測定するためのアッセイは、本開示の実施例５及び６に見ることができる。少なくとも一態様では、１）ＮＫ細胞出現頻度の上昇は、ＣＤ３－ＮＫｐ４６＋細胞が、治療前／ベースラインと比較して、少なくとも２倍増加することとして定義でき、２）ＮＫ細胞の活性化の増大は、ＩＦＮ－γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ－ＸＬの発現が、治療前／ベースラインの発現と比較して、少なくとも２倍増加することとして定義でき、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加は、Ｋｉ６７の発現が、治療前／ベースラインの発現と比較して、少なくとも１．５倍増加することとして定義する。

【0082】

Ｔ細胞応答の増強．
本願によれば、「Ｔ細胞応答の増強」は、１）ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度の上昇、２）ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大、及び／または３）ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加のうちの１つ以上によって特徴付けられる。したがって、本願に従って、Ｔ細胞応答が増強されたか否かは、１）ＣＤ８ Ｔ細胞出現頻度の上昇、２）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の増大、及び／または３）ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加を示す１つ以上の分子の発現を測定することによって判断できる。ＣＤ８ Ｔ細胞の出現頻度、活性化及び増殖を測定するのに有用である例示的なマーカーにはそれぞれ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４、ならびにＫｉ６７が含まれる。抗原特異的Ｔ細胞の出現頻度は、ＭＨＣマルチマー（ペンタマー、もしくは本願によって示されているようデキストラマー等）によって測定することができる。そのような測定及びアッセイ、ならびに本発明の方法及び組成物を評価するのに好適な他の測定及びアッセイは、当該技術分野において、確立及び理解されている。

【0083】

一態様では、ＣＤ８ Ｔ細胞出現頻度の上昇は、ＩＦＮ－γ及び／またはデキストラマー＋ＣＤ８ Ｔ細胞が、治療前／ベースラインと比較して、少なくとも２倍増加することによって特徴付けられる。ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大は、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４の発現が、治療前／ベースラインの発現と比較して、少なくとも２倍増大することとして特徴付けられる。ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加は、Ｋｉ６７の発現が、治療前／ベースラインの発現と比較して、少なくとも２倍増加することとして特徴付けられる。

【0084】

代替的な態様では、Ｔ細胞応答の増強は、ＣＤ８ Ｔ細胞のエフェクターサイトカインの発現の増加、及び／または細胞傷害性エフェクター機能の増加によって特徴付けられる。エフェクターサイトカインの発現の増加は、治療前／ベースラインと比較した、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－２のうちの１つ以上の発現によって測定できる。細胞傷害性エフェクター機能の増加は、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ及び／またはパーフォリンのうちの１つ以上の発現、及び／または標的細胞の抗原特異的な殺傷によって測定できる。

【0085】

本明細書に記載されているアッセイ、サイトカイン、マーカー及び分子、ならびにその測定は、当該技術分野において確立及び理解されており、既知の技法に従って行うことができる。加えて、Ｔ細胞応答を測定するためのアッセイは、Ｔ細胞応答を解析した実施例に見ることができ、その実施例としては、実施例２、３、８、１３及び１４が挙げられるが、これらに限定されない。

【0086】

本発明によって実現されるＴ細胞応答の増強は、ＮＫ細胞応答の増強及び炎症応答の増強と組み合わさると、増強されたＴ細胞が、がん患者の初期自然免疫応答を回避し、及び／または生き延びた腫瘍細胞を効果的に標的として殺傷するため特に有益である。

【0087】

さらに追加の実施形態では、本明細書に記載されている組み合わせ及び方法は、ヒトがん患者の治療に用いるものである。好ましい実施形態では、がん患者は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、尿路上皮、子宮頸部または結腸直腸の癌からなる群から選択されるがんに、罹患している、及び／またはそれであると診断されている。さらに追加の実施形態では、本明細書に記載されている組み合わせ及び方法は、乳癌、結腸直腸癌またはメラノーマ、好ましくはメラノーマ、より好ましくは結腸直腸癌、最も好ましくは結腸直腸癌に、罹患している、及び／またはそれであると診断されている、ヒトがん患者の治療に用いるものである。

【0088】

特定の例示的な腫瘍関連抗原．
特定の実施形態では、免疫応答は、対象において、細胞関連ポリペプチド抗原に対して起きるものである。特定のそのような実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。

【0089】

「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸が、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに連結したポリマーを指す。アミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または天然アミノ酸の化学的類似体であってよい。この用語は、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子も指し、少なくとも２つのポリペプチドを含むときには、それらのポリペプチドは、複合体を形成するか、共有結合されているか、または非共有結合されていてよい。タンパク質におけるポリペプチド（複数可）は、糖化及び／または脂質化されていることができ、及び／または補欠分子族を含むことができる。

【0090】

内在性レトロウイルスタンパク質（ＥＲＶ）．
好ましくは、本発明のＴＡＡは、内在性レトロウイルスタンパク質（ＥＲＶ）に含まれる。より好ましくは、ＥＲＶは、ヒトＨＥＲＶ－Ｋタンパク質ファミリーのＥＲＶである。最も好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋタンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ群特異抗原（ｇａｇ）タンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ「メラノーマリスクマーカー」（ｍｅｌ）タンパク質から選択される（例えば、Ｃｅｇｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：４を参照のこと）。

【0091】

ＥＲＶは、ヒトゲノムの８％を占め、数百年前における生殖細胞系列への感染に由来する。ヒトゲノムに挿入されたこれらのエレメントの大半は、大きく変異しているので、転写または翻訳は行われない。しかしながら、わりと最近獲得したほんの一部のＥＲＶは依然として機能しており、翻訳されて、場合によっては、ウイルス粒子を産生さえする。ＥＲＶの転写は、その座位が通常、高度にメチル化されており、その結果、体細胞では転写されないため、非常に制限されている。（Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ（２０１６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２０７－１９）。細胞ストレス（化学物質、ＵＶ照射、ホルモン、サイトカイン）のような一部の状況下でのみ、ＥＲＶは再活性化し得る。重要なことには、ＥＲＶは、多種多様ながんでも発現するが、正常組織では発現しない（Ｃｅｇｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：４、Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：１５２８－３５）。この非常に制限された発現パターンにより、ＥＲＶは、免疫寛容機序に暴露されないか、またはまれにしか暴露されないようになり、おそらく、その結果、コンピテントなＥＲＶ特異的Ｔ細胞レパートリーが得られる。このように、ＥＲＶは、ＭＶＡで腫瘍抗原（「ＴＡＡ」）として用いることができる。

【0092】

様々な追加の実施形態では、ＴＡＡには、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、サバイビン、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２もしくはＢｒａｃｈｙｕｒｙが単独で含まれるか、またはこれらを組み合わせたものが含まれるが、これらに限定されない。そのような例示的な組み合わせとしては、例えばＭＶＡにおけるＣＥＡ及びＭＵＣ－１（ＣＶ３０１としても知られる）を挙げてよい。他の例示的な組み合わせとしては、ＰＡＰ及びＰＳＡを挙げてよい。

【0093】

さらなる実施形態では、追加のＴＡＡとしては、５アルファレダクターゼ、アルファ－フェトプロテイン、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＣＡ－１２５、ＣＡＳＰ－８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３ ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ－ｍｙｃ、Ｃｏｘ－２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－ファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、サイモシン－ベータ－１５、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを挙げてよいが、これらに限定されない。

【0094】

好ましいＰＳＡ抗原は、１５５位におけるイソロイシンのロイシンへのアミノ酸変化を含む（米国特許第７，２４７，６１５号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。

【0095】

本発明の１つ以上の好ましい実施形態では、異種ＴＡＡは、ＨＥＲ２及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙから選択される。

【0096】

それを含有するＭＶＡの投与後に、本発明の少なくとも１つの目的または所望の結果（例えば免疫応答の刺激等）が達成されるならば、いずれのＴＡＡを用いてもよい。本明細書で言及されているＴＡＡを含むＴＡＡの例示的な配列は、当該技術分野において知られており、本発明の組成物及び方法での使用に好適である。本発明の組成物及び方法で用いるＴＡＡの配列は、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に開示されている配列と同一であってよく、あるいは、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に開示されているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかとの配列同一性が１００％未満（少なくとも９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える値等）であってもよい。すなわち、本発明の少なくとも１つの目的または所望の結果が達成されるならば、本発明の組成物または方法で用いるＴＡＡの配列は、当該技術分野において知られており、及び／または本明細書に開示されている参照配列と、ヌクレオチドまたはアミノ酸が２０個未満、または１９個未満、１８個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、１１個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満もしくは１個未満異なっていてよい。当業者は、本発明のＭＶＡまたは方法で用いる際のＴＡＡの適合性を確保するために、ＴＡＡを評価する技法及びアッセイに精通している。

【0097】

改変腫瘍関連抗原．
特定の実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原は、ポリペプチド抗原に由来するエピトープが、ＡＰＣ表面にＭＨＣクラスＩ分子と会合した状態で提示されると、そのエピトープをその表面に提示する細胞に対して、ＣＴＬ応答が誘導されるように改変されている。特定のそのような実施形態では、少なくとも１つの第１の外来ＴＨエピトープは、提示される際、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子と会合している。特定のそのような実施形態では、細胞関連抗原は、腫瘍関連抗原である。

【0098】

エピトープを提示できる例示的なＡＰＣとしては、樹状細胞及びマクロファージが挙げられる。追加の例示的なＡＰＣとしては、１）ＭＨＣクラスＩ分子に結合したＣＴＬエピトープ、及び２）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したＴＨエピトープを同時に提示できるいずれかの飲作用ＡＰＣまたは食作用ＡＰＣが挙げられる。

【0099】

特定の実施形態では、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇ、ＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、サバイビン、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２またはＢｒａｃｈｙｕｒｙ等（これらに限らない）のＴＡＡのうちの１つ以上に対する改変は、本明細書に記載されているＴＡＡのうちの１つ以上と主に反応するポリクローナル抗体が、対象への投与後に誘発されるように行われている。そのような抗体は、腫瘍細胞を攻撃及び排除することができると共に、転移性細胞が発現して転移に至るのを防ぐことができる。この抗腫瘍効果のエフェクター機構は、補体依存性及び抗体依存性の細胞傷害によって媒介されることになる。加えて、誘導された抗体は、成長因子依存性のオリゴ二量化と、受容体のインターナリゼーションの阻害を通じて、がん細胞の成長を阻害することもできる。特定の実施形態では、そのような改変ＴＡＡは、腫瘍細胞によって提示される既知のＴＡＡエピトープ及び／または推定ＴＡＡエピトープに対するＣＴＬ応答を誘導できる。

【0100】

特定の実施形態では、改変ＴＡＡポリペプチド抗原は、細胞関連ポリペプチド抗原のＣＴＬエピトープ及び変異型を含み、変異型は、ＣＴＬエピトープまたは外来ＴＨエピトープを少なくとも１つ含む。特定のそのような改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例では、ＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む１つ以上のポリペプチド抗原ＨＥＲ２と、外来のＴＨエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む変異型を含むことができ、このＴＡＡの作製方法は、米国特許第７，００５，４９８号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び同第２００６／０００８４６５号に記載されている。

【0101】

特定のそのような改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例では、ＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む１つ以上のポリペプチド抗原ＭＵＣ－１と、外来のエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含む変異型を含むことができ、このＴＡＡの作製方法は、米国特許出願公開第２０１４／０３６３４９５号に記載されている。

【0102】

追加のプロミスキャスなＴ細胞エピトープは、様々なＨＬＡ－ＤＲによってコードされる大部分のＨＬＡ－ＤＲ分子と結合できるペプチドを含む。例えば、ＷＯ９８／２３６３５（Ｆｒａｚｅｒ ＩＨ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄに譲渡）、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３ ３３７３、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：７７８ ７８０、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８ ２２８、Ｃｈｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７ ４７、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：１９７ ２０３、及びＦａｌｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：２３０ ２４２を参照のこと。この最後の参考文献では、ＨＬＡ－ＤＱリガンド及びＨＬＡ－ＤＰリガンドについても論じられている。これらの参考文献に列挙されているすべてのエピトープは、本明細書に記載されているような天然エピトープの候補として関連がある。これらのエピトープ候補と共通のモチーフを共有するエピトープであるからである。

【0103】

特定の他の実施形態では、プロミスキャスなＴ細胞エピトープは、ハプロタイプの大部分と結合できる人工のＴ細胞エピトープである。特定のそのような実施形態では、人工のＴ細胞エピトープは、ＷＯ９５／０７７０７及び対応する論文Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１ ７６１に記載されているようなｐａｎ ＤＲエピトープペプチド（「ＰＡＤＲＥ」）である。

【0104】

４－１ＢＢＬ（本明細書では、「４１ＢＢＬ」または「４－１ＢＢリガンド」ともいう）．
本開示によって例示されているように、組み換えＭＶＡ及び関連する方法の一部として、４－１ＢＢＬを含めると、がんである対象において、腫瘍内投与または静脈内投与の際に、抗腫瘍効果の増大及び増強が誘導される。したがって、様々な実施形態では、ＴＡＡをコードすることに加えて、４－１ＢＢＬ抗原をコードする組み換えＭＶＡが存在する。

【0105】

４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬは、ＴＮＦＲ／ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。４－１ＢＢＬは、活性化Ｂ細胞、単球及びＤＣで発現する共刺激リガンドである。４－１ＢＢは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＤＣ、単球及び好中球を含むいくつかの自然免疫細胞集団によって構成的に発現される。興味深いことに、４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞に発現するが、休止Ｔ細胞には発現しない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２９：１９２－２１５）。４－１ＢＢの結合により、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）の増殖及び産生が誘導され、また、Ｂｃｌ－ｘＬ等の抗アポトーシス分子のアップレギュレーションを介してＴ細胞の生存が増強される（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４４：１９７－２１７）。重要なことには、４－１ＢＢの刺激により、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を介した、ＮＫ細胞増殖、ＩＦＮ－γ産生及び細胞溶解活性が増強される（Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：２４２３－３２）。

【0106】

１つ以上の好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、本発明のＭＶＡによってコードされる。１つ以上の他の好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、ヒト４－１ＢＢＬである。さらに好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、配列番号３との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である配列、すなわち、配列番号３に示されているアミノ酸配列と異なるアミノ酸が１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。さらに好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、配列番号３を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む。追加の実施形態では、４－１ＢＢＬをコードする核酸は、配列番号４との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列、すなわち、その配列において、配列番号４に示されている核酸配列と異なる核酸が２０個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である核酸配列を含む。より好ましい実施形態では、４－１ＢＢＬは、配列番号４を含む核酸を含む。

【0107】

ＣＤ４０Ｌ．
本開示によって示されているように、組み合わせ及び関連方法の一部としてＣＤ４０Ｌを含めることによってさらに、腫瘍体積減少が増大し、無増悪生存期間が延長し、本発明により実現される生存率が上昇する。したがって、様々な実施形態では、組み合わせは、ＣＤ４０Ｌをがん患者に投与することをさらに含む。好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、本明細書に記載されているような組み換えＭＶＡの一部としてコードされる。

【0108】

ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞を含む多くの種類の細胞上に構成的に発現するが、そのリガンドＣＤ４０Ｌは、主に活性化ヘルパーＴ細胞上に発現する。感染または免疫後早期の、樹状細胞とヘルパーＴ細胞との同族相互作用により、樹状細胞に、ＣＴＬ応答を刺激するための「ライセンスを付与」される。樹状細胞へのライセンシングにより、共刺激分子のアップレギュレーション、生存率上昇及びより良好な交差提示能がもたらされる。この過程は主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によって媒介される。しかしながら、ＣＤ４０Ｌでは、多様な刺激を誘導する、膜結合型の構成から、可溶性（単量体または三量体）の構成まで、様々な構成が説明されており、ＡＰＣの活性化、増殖及び分化を誘導または抑制する。

【0109】

１つ以上の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、本発明のＭＶＡによってコードされる。１つ以上の他の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌである。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である配列、すなわち、配列番号１に示されているアミノ酸配列と異なるアミノ酸が１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む。追加の実施形態では、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、配列番号２との同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列、すなわち、その配列において、配列番号２に示されている核酸配列と異なる核酸が２０個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満である核酸配列を含む。より好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号２を含む核酸を含む。

【0110】

免疫チェックポイント分子アンタゴニスト．
本明細書に記載されているように、少なくとも一態様では、本発明は、免疫チェックポイントアンタゴニストの使用を含む。そのような免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能を妨げるよう、及び／またはブロックするように機能する。いくつかの好ましい免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、ならびにＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）のアンタゴニストが挙げられる。

【0111】

加えて、例示的な免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、Ｉｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0112】

そのような免疫チェックポイント分子アンタゴニストとしては、免疫チェックポイント分子に特異的に結合して、その免疫チェックポイント分子の生物学的な活性及び機能を阻害及び／またはブロックする抗体を挙げることができる。

【0113】

他の免疫チェックポイント分子アンタゴニストとしては、免疫チェックポイント分子の発現に干渉するアンチセンス核酸ＲＮＡ、及び免疫チェックポイント分子の発現に干渉する低分子干渉ＲＮＡを挙げることができる。

【0114】

加えて、アンタゴニストは、免疫チェックポイントの機能を阻害またはブロックする低分子の形態であり得る。これらの低分子のいくつかの非限定的な例としては、ＮＰ１２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖによる（Ｄ）ＰＰＡ－１、高親和性ＰＤ－１（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）、ＢＭＳ－２０２及びＢＭＳ－８（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ））、ＣＡ１７０／ＣＡ３２７（Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、ならびにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の低分子阻害剤が挙げられる。

【0115】

加えて、アンタゴニストは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害またはブロックするＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）の形態であり得る。例えば、Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（（２０１８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３２（３）：２３３－２４３）を参照のこと。

【0116】

加えて、アンタゴニストは、Ａｆｆｉｍｅｒ（登録商標）の形態であり得ることが想定されている。Ａｆｆｉｍｅｒは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害またはブロックするＦｃ融合タンパク質である。免疫チェックポイントアンタゴニストとして機能できる他の融合タンパク質は、免疫チェックポイント融合タンパク質（例えば、抗ＰＤ－１タンパク質ＡＭＰ－２２４）、及びＵＳ２０１７／０１８９４７６に記載されているような抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質である。

【0117】

免疫チェックポイント分子アンタゴニスト候補は、当該技術分野において知られている様々な技法及び／または本願で開示されている様々な技法によって、インビトロまたはマウスモデルで、機能（免疫チェックポイント分子の機能に干渉する能力等）に関してスクリーニングできる。

【0118】

ＩＣＯＳアゴニスト．
本発明は、ＩＣＯＳアゴニストをさらに含む。ＩＣＯＳアゴニストは、ＩＣＯＳを活性化する。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上に発現する正の共刺激分子であり、そのリガンドに結合すると、活性化Ｔ細胞の増殖を促す（Ｄｏｎｇ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：９７－１０１）。

【0119】

一実施形態では、アゴニストは、ＩＣＯＳの天然のリガンドであるＩＣＯＳ－Ｌである。アゴニストは、結合特性及び活性化特性を保持する変異形態のＩＣＯＳ－Ｌであり得る。変異形態のＩＣＯＳ－Ｌは、インビトロで、ＩＣＯＳを刺激する活性についてスクリーニングできる。

【0120】

免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストの抗体．
好ましい実施形態では、免疫チェックポイント分子アンタゴニスト及び／または免疫チェックポイント分子アゴニストはそれぞれ、抗体を含む。本明細書に記載されているように、様々な実施形態では、抗体は、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、当該技術分野において周知の技法によって作製できる。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位を介して免疫チェックポイント分子に（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、免疫チェックポイントのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質等をその免疫原として用いることができる。より具体的には、ポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含有する。

【0121】

より好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒトがん患者の治療用として、主権国家の政府から認可されている抗体、または認可過程にある抗体である。すでに認可済みであるか、または認可過程にあるこれらの抗体のいくつかの非限定的な例としては、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（登録商標）及びトレメリムマブ）、ＰＤ－１（ペムブロリズマブ、ランブロリズマブ、アンプリミューン－２２４（ＡＭＰ－２２４））、アンプリミューン－５１４（ＡＭＰ－５１４）、ニボルマブ、ＭＫ－３４７５（Ｍｅｒｃｋ）、ＢＩ７５４０９１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））、ＰＤ－Ｌ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）、ＭＥＤ１４７３６（ＡＺＮ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ））、ＬＡＧ－３（ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ－９８６０１６、ＢＩ７５４１１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＭＫ－４２８９（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＳＲ－０３３（Ｔｅｓａｒｏ））に対する抗体が挙げられる。

【0122】

例示的な一態様では、免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、ならびにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドを用いて、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３またはＩＣＯＳに特異的に結合する抗体を調製できる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはナノボディ）、二価抗体断片（ダイアボディ）等）、ならびに組み換え及び合成によって作製したいずれかの結合パートナーが含まれるように意図されている。

【0123】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体．
本発明の様々な実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、ＴＡＡに特異的な抗体と組み合わせるか、またはその抗体と組み合わせて投与が行われる。より具体的な実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的な抗体と組み合わせるか、またはその抗体と組み合わせて投与が行われる。当該技術分野では、多くのがんにおいて、１つ以上の抗原が腫瘍細胞膜に発現または過剰発現すると理解されている。例えば、Ｄｕｒｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６：３０－５、Ｍｏｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８３６：１８７－９６、Ａｒｔｅａｇａ（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１１．１７７；Ｆｉｎｎ（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．５：３４７－５４、Ｇｉｎａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５１：３６４－９を参照のこと。抗原が腫瘍細胞上に発現または過剰発現しているか判断するアッセイは、特定の抗原に対する抗体の作製方法と共に、当該技術分野において容易に理解される（上記文献を参照のこと）。

【0124】

より具体的な実施形態では、本発明の医薬組み合わせ及び関連する方法には、抗体が含まれ、抗体は、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む。少なくとも１つの態様では、抗体の特徴（例えばａ）及びｂ））によって、その抗体が、ＮＫ細胞、マクロファージ、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マスト細胞及び／または樹状細胞等のエフェクター細胞に結合して、それと相互作用できるようになり、また、抗体が、腫瘍細胞上に発現している腫瘍抗原に結合できるようになる。好ましい実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。追加の好ましい実施形態では、抗体は、ＮＫ細胞に結合して、それと相互作用することができる。

【0125】

腫瘍細胞上に発現する抗原に対するいくつかの例示的な抗体であって、本開示によって想定されている抗体としては、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブ Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ－５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブ Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標））、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ－２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７－Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えば、オレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えば、ＭＯｖ１８－ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ－２０２）、抗メソセリン（例えば、ＭＯＲＡｂ－００９）、抗ＴＲＰ２、ならびに抗ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、ハジュマ、ＡＢＰ９８０及び／またはペルツズマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0126】

より好ましい実施形態では、本発明の一部として含まれる抗体には、患者に投与すると、腫瘍細胞上の対応する抗原に結合して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体が含まれる。さらに好ましい実施形態では、抗体は、がんの治療用として認可済みまたは認可前の状態である抗体を含む。

【0127】

さらに好ましい実施形態では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＣＤ２０抗体である。

【0128】

最も好ましい実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ハジュマ、ＡＢＰ９８０及びアド－トラスツズマブエムタンシンから選択される。

【0129】

最も好ましい実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブであり、抗ＣＤ２０はリツキシマブである。

【0130】

本明細書に記載されているように、様々な実施形態では、抗体は、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、当該技術分野において周知の技法によって作製できる。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位を介してＴＡＡに（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、ＴＡＡのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質等をその免疫原として用いることができる。より具体的には、ポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含有する。

【0131】

抗体．
本発明の様々な実施形態では、本明細書に記載されている組み換えＭＶＡ及び方法は、１）免疫チェックポイントのアンタゴニストもしくはアゴニストである抗体、または２）ＴＡＡ特異的抗体のいずれかと、組み合わされる、及び／または組み合わせて投与が行われる。

【0132】

抗体が、合成のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得ること、及び当該技術分野において周知の技法によって作製され得ることが想定されている。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、免疫チェックポイント分子またはＴＡＡに（非特異的結合とは対照的に）特異的に結合する。免疫原と免疫反応する抗体を作製する際には、免疫チェックポイント及び／またはＴＡＡのペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質等をその免疫原として用いることができる。より具体的には、ポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基、すなわちエピトープを含有する。

【0133】

これらの抗原決定基、すなわちエピトープは、線状エピトープまたは立体構造（不連続）エピトープのいずれであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドのうちの単一のアミノ酸セクションで構成され、立体構造エピトープ、すなわち不連続エピトープは、ポリペプチド鎖の異なる領域からの複数のアミノ酸セクションであって、タンパク質フォールディングにより、近接するようになるアミノ酸セクションで構成される（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９６））。折り畳まれたタンパク質は、複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数は非常に多いが、タンパク質の立体構造及び立体障害性により、それらのエピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数よりも少ない（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ． ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９６））。エピトープは、当該技術分野において知られている方法のいずれかによって特定できる。

【0134】

ＴＡＡ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３もしくはＩＣＯＳ等の免疫チェックポイント分子に特異的に結合し、その機能をブロックする抗体（「アンタゴニスト抗体」）またはその機能を増強／活性化する抗体（「アゴニスト抗体」）が、ｓｃＦＶ断片を含め、本発明に含まれる。そのような抗体は、従来の手段によって作製できる。

【0135】

一実施形態では、本発明には、ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子に対するモノクローナル抗体であって、そのＴＡＡもしくは免疫チェックポイント分子の機能を、ブロックする抗体（「アンタゴニスト抗体」）かまたは増強／活性化する抗体（「アゴニスト抗体」）が含まれる。

【0136】

抗体は、その標的に、高いアビディティかつ高い特異性で結合できる。それらは比較的大きい分子（約１５０ｋＤａ）であり、抗体結合部位が、２つのタンパク質（例えば、ＰＤ－１とその標的リガンド）間の相互作用部位の近傍となる場合、それらのタンパク質間の相互作用を立体的に阻害できる。本発明にはさらに、免疫チェックポイント分子リガンド結合部位に近接するエピトープに結合する抗体が含まれる。

【0137】

様々な実施形態では、本発明には、分子間相互作用（例えばタンパク質間相互作用）に干渉する抗体、及び分子内相互作用（例えば、分子内の立体構造の変化）を妨げる抗体が含まれる。抗体は、免疫チェックポイント分子の生物学的な活性をブロックするか、または増強／活性化する能力についてスクリーニングできる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも、従来の技法によって調製できる。

【0138】

例示的な一態様では、ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、ならびにＴＡＡまたはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドを用いて、ＴＡＡ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３もしくはＩＣＯＳに特異的に結合する抗体を調製できる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはナノボディ）、二価抗体断片（ダイアボディ）等）、ならびに組み換え及び合成によって作製したいずれかの結合パートナーが含まれるように意図されている。別の例示的な態様では、抗体は、免疫チェックポイント分子に、Ｋｄ約１０^７Ｍ^－１以上で結合する場合には、免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものと定義する。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技法、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄらにより記載されている技法（（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０）を用いて、容易に決定することができる。

【0139】

ポリクローナル抗体は、様々な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから、当該技術分野において周知である手順を用いて、容易に作製できる。概して、精製したＴＴＡもしくはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳ、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアミノ酸配列ベースのペプチドであって、適切にコンジュゲートされているペプチドを宿主動物に、典型的には非経口注射によって投与する。ブースター免疫後、少量の血清試料を採取し、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのポリペプチドに対する反応性について試験する。そのような測定に有用である各種アッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されているアッセイ、ならびに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットプロットアッセイ及びサンドイッチアッセイのような手順が挙げられる。米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号を参照のこと。

【0140】

モノクローナル抗体は、周知の手順を用いて容易に調製できる。例えば、米国特許再発行特許第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、同第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｍ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）に記載されている手順を参照のこと。

【0141】

例えば、マウス等の宿主動物に、単離及び精製した免疫チェックポイント分子を少なくとも１回、好ましくは、約３週間の間隔で少なくとも２回、腹腔内注射できる。その後、従来のドットプロット法または抗体捕捉（ＡＢＣ）によって、マウス血清をアッセイして、融合するにはどのマウスが最良かを判断する。約２～３週間後、マウスに、免疫チェックポイント分子の静脈内ブーストを行う。その後、マウスを屠殺し、確立されたプロトコールに従って、脾臓細胞を市販のミエローマ細胞（Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）等）と融合する。簡潔に述べると、ミエローマ細胞を培地中で数回洗浄し、１つのミエローマ細胞に対して約３個の脾臓細胞という比率で、マウス脾臓細胞に融合する。融合剤は、当該技術分野において用いられているいずれかの好適な融合剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。融合細胞を選択的に増殖させる培地を含有するプレートに、融合細胞を播種する。その後、融合細胞を約８日間成長させることができる。得られたハイブリドーマの上清を回収し、最初にヤギ抗マウスＩｇでコーティングしたプレートに加える。洗浄後、標識免疫チェックポイント分子ポリペプチド等の標識を各ウェルに加えてから、インキュベートする。その後、陽性のウェルを検出することができる。陽性のクローンをバルク培養で増殖させることができ、その後、上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製する。

【0142】

本発明のモノクローナル抗体は、Ａｌｔｉｎｇ－Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．（（１９９０）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：１－９，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”）に記載されているような代替的な技法を用いて作製でき、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を導入するための組み換えＤＮＡ技法を用いて構築できる。そのような技法は、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：３９４）に記載されている。

【0143】

従来の技法によって作製できる、そのような抗体の抗原結合断片も、本発明に含まれる。そのような断片の例としては、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子操作技法によって作製される抗体断片及び誘導体も提供する。

【0144】

本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ヒト化型のマウスモノクローナル抗体が含まれる。そのようなヒト化抗体は、既知の技法によって調製でき、その抗体をヒトに投与した際に、免疫原性が低下するという利点をもたらすことができる。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）と、ヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位、及びヒト抗体に由来する可変領域断片（抗原結合部位が欠如している）を含むことができる。キメラ抗体、及びさらに操作されたモノクローナル抗体の作製手順としては、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３４３９）、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４）、ならびにＷｉｎｔｅｒ及びＨａｒｒｉｓ （（１９９３）ＴＩＰＳ １４：１３９）に記載されている手順が挙げられる。抗体を遺伝子導入で作製する手順は、ＧＢ２，２７２，４４０、ならびに米国特許第５，５６９，８２５号及び同第５，５４５，８０６号に見ることができ、これらの特許はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

遺伝子操作法によって作製した抗体（ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体等）であって、標準的な組み換えＤＮＡ技法を用いて作製できる抗体を使用できる。そのようなキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている標準的なＤＮＡ技法を用いる遺伝子操作によって、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際公開第ＷＯ８７／０２６７１号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願公開第０１８４１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．の欧州特許出願公開第０１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願公開第０１７３４９４号、ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらのＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願公開第０１２５０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２ ５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０に記載されている方法を用いて作製できる。

【0146】

合成及び半合成の抗体に関しては、そのような用語は、抗体断片、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（例えば、マウス－ヒト抗体、ヒト－マウス抗体）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、及び完全合成の抗体様分子（ただし、これらに限らない）を網羅するように意図されている。

【0147】

治療用途では、患者の、抗体に対する免疫応答を最小限にするために、ヒトの定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が好ましい場合が多い。そのような抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニック動物を免疫することよって作製できる。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７６４：５２５－５３５（１９９５）を参照のこと。

【0148】

ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子に対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製した、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを用いて、ＦａｂファージディスプレイライブラリーまたはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー等のコンビナトリアルな免疫グロブリンライブラリーを構築することによって調製することもできる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７、及びＧｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４を参照のこと。加えて、抗体可変領域のコンビナトリアルなライブラリーは、既知のヒト抗体を変異させることによって作製できる。例えば、ランダムに改変された変異誘発済みオリゴヌクレオチドを例えば用いることによって、免疫チェックポイント分子と結合することが知られているヒト抗体の可変領域を変異させて、変異可変領域のライブラリーを作製することができ、次いで、それを、免疫チェックポイント分子に結合するようにスクリーニングできる。免疫グロブリンの重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ領域内でランダム変異誘発を誘導する方法、ランダム化した重鎖及び軽鎖を掛け合わせて、対を形成する方法、ならびにスクリーニング方法は、例えば、ＢａｒｂａｓらのＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０７７５４号、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４５７－４４６１に見ることができる。

【0149】

免疫グロブリンライブラリーは、ディスプレイパッケージの集団、好ましくは、繊維状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団によって発現させて、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーを作製する際に用いるのに特に適している方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、ＫａｎｇらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号、ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号、ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号、ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号、ＬａｄｎｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０ １３７２、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１、Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ｓｕｐｒａ、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３５７６－３５８０、Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３－１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：４１３３－４１３７及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７９７８－７９８２に見ることができる。ディスプレイパッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面に提示させたら、その抗体ライブラリーをスクリーニングして、ＴＡＡまたは免疫チェックポイント分子と結合する抗体を発現するパッケージを特定及び単離する。

【0150】

組み換えＭＶＡ．
本発明のより好ましい実施形態では、本発明で開示されている１つ以上のタンパク質及びヌクレオチドは、組み換えＭＶＡに含まれている。本開示によって説明及び例示されているように、様々な態様において、本開示の組み換えＭＶＡの静脈内投与により、がん患者における免疫応答の増強が誘導される。したがって、１つ以上の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているＴＡＡのうちの１つ以上をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを含む。

【0151】

本発明を実施する際に有用であると共に、ブダペスト条約の規定下で寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）に、寄託番号ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７で、１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、及びＥＣＡＣＣ００１２０７０７で、２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５株であり、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、Ｖ０００８３００８という番号で寄託されたＭＶＡ－ＢＮ株及びその誘導体が、追加の例示的な株である。

【0152】

ＭＶＡ－ＢＮの「誘導体」とは、本明細書に記載されているようなＭＶＡ－ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、それらのゲノムの１つ以上の部分に差異を示すウイルスを指す。ＭＶＡ－ＢＮ及びその誘導体は、複製能力がなく、複製能力がないとは、インビボ及びインビトロで、生殖複製できないことを意味する。より具体的には、インビトロのＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で生殖複製できるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：７６１－７７１）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ受託番号９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ受託番号８５１２０６０２）及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ－２）では増殖的に複製できないものとして説明されている。加えて、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株において、ウイルス増幅率が、ＭＶＡ－５７５の少なくとも２分の１、より好ましくは３分の１である。ＭＶＡ－ＢＮ及びその誘導体のこれらの特性に関する試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０（米国特許出願公開第２００３／０２０６９２６号）及びＷＯ０３／０４８１８４（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９９号）に記載されている。

【0153】

前の段落で説明したように、インビトロでのヒト細胞株における「生殖複製不能である」または「生殖複製能力がない」という用語は、例えば、ＷＯ０２／４２４８０に記載されており、これはまた、上記のような望ましい特性を有するＭＶＡを得る方法も教示する。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを使用して、感染後４日でインビトロでウイルス増幅率が１未満であるウイルスに当てはまる。

【0154】

「生殖複製の失敗」という用語は、感染後４日で１未満という、前段落に記載されているような、インビトロでのヒト細胞株におけるウイルス増幅率を有するウイルスを指す。ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイは、ウイルス増幅率の決定に適用可能である。

【0155】

前の段落で説明したように、インビトロでのヒト細胞株におけるウイルスの増幅または複製は、通常、「増幅率」と呼ばれる、感染細胞から産生されたウイルス（出力）と、最初の段階で細胞に感染するために最初に使用された量（投入量）との比率として表される。増幅率「１」は、感染細胞から産生されるウイルスの量が、細胞に感染するために最初に使用された量と同じである増幅状態を定義し、すなわち、感染細胞がウイルスの感染及び増殖を許容することを意味する。これに対して、増幅率が１未満である、すなわち、投入量と比べた出力の減少は、増殖的複製の欠如、したがってウイルスの減弱を示す。

【0156】

本明細書では、「アジュバント作用」とは、組み換えＭＶＡの特定のコードされたタンパク質または成分によって、その組み換えＭＶＡの他のコードされているタンパク質（複数可）または成分（複数可）により生じる免疫応答が増大することが意図されている。

【0157】

発現カセット／制御配列．
様々な態様では、本明細書に記載されている１つ以上の核酸は、１つ以上の発現カセット内に組み込まれており、このカセットでは、その１つ以上の核酸が、発現制御配列に機能的に連結されている。「機能的に連結された」とは、記載されている構成要素が、意図した形式で機能可能になる関係にあること、例えば、プロモーターに、核酸を転写させて発現させるような関係にあることを意味する。コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、そのコード配列の発現が、その発現制御配列と適合する条件下で行われるように連結されている。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの初めにある開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及びフレーム内終止コドンが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期Ｉプロモーター、ならびに各種ポックスウイルスプロモーター（３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、ＰｒＨｙｂプロモーター、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ－４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター及びＰＲ１２３８プロモーターといったワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来のプロモーター及びＦＰＶ由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限らない）が挙げられるが、これらに限定されない。追加のプロモーターは、ＷＯ２０１０／０６０６３２、ＷＯ２０１０／１０２８２２、ＷＯ２０１３／１８９６１１、ＷＯ２０１４／０６３８３２及びＷＯ２０１７／０２１７７６にさらに記載されており、これらの特許は、参照により、本明細書に全体が組み込まれる。

【0158】

追加の発現制御配列としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに所望の宿主系において、所望の組み換えタンパク質（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸配列の適切な転写及びその後の翻訳に必要ないずれかの他の配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポックスウイルスベクターは、所望の宿主系において、核酸配列を含有する発現ベクターの移入及びその後の複製に必要な追加のエレメントも含有してよい。当業者はさらに、そのようなベクターが、従来の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ｉｎ“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を用いて容易に構築されると共に、市販されていることを理解するであろう。

【0159】

本発明の組み合わせの投与を行うための方法及び投与レジメン．
１つ以上の態様では、本発明の組み合わせは、同種及び／または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与できる。図７に示されているデータによって部分的に示されているように、同種でのプライムブーストレジメンは、対象の特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答を増大させる。したがって、１つ以上の実施形態では、本開示の組み合わせをがん患者に投与することを含む、がん患者での腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための組み合わせ及び／または方法が存在し、その組み合わせは、同種または異種でのプライム－ブーストレジメンの一部として投与される。

【0160】

導入遺伝子を含む組み換えＭＶＡウイルスの作製
本発明で提供する組み換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において知られている常法によって作製できる。組み換えポックスウイルスを得るか、または外来のコード配列をポックスウイルスゲノムに挿入するための方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡの単離、ＲＮＡの単離、ウエスタンブロット解析、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅技法のような標準的な分子生物学的技法の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載されており、ウイルスの取扱い及び操作の技法は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｈｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））に記載されている。同様に、ＭＶＡの取扱い、操作及び遺伝子組み換えの技法及びノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｅｌｌｉｏｔｔ（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）（例えば、“Ｃｈａｐｔｅｒ ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ”を参照のこと）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ：“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ”を参照のこと））に記載されている。

【0161】

本発明で開示されている様々な組み換えＭＶＡウイルスの作製には、様々な方法を適用可能である場合がある。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミドコンストラクトに配置されてもよい。これとは別に、挿入するＤＮＡ配列は、プロモーターにライゲーションできる。このプロモーター－遺伝子連結体は、そのプロモーター－遺伝子連結体が両端で、非必須の座位を含有するポックスウイルスＤＮＡ領域に隣接しているＤＮＡ配列と相同なＤＮＡと隣接するよう、プラスミドコンストラクト内に配置することができる。得られたプラスミドコンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内での増殖により増幅させ、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドは、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）等の細胞培養物に、培養物がＭＶＡウイルスに感染すると同時にトランスフェクトすることができる。プラスミド内の相同ＭＶＡウイルスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列の存在によって改変されたポックスウイルスを生成し得る。

【0162】

好ましい実施形態によれば、細胞培養に好適な細胞、例えばＣＥＦ細胞に、ＭＶＡウイルスを感染させることができる。続いて、感染した細胞に、本開示で提供される核酸のうちの１つ以上のような、外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第１のプラスミドベクターを、好ましくはポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で、トランスフェクトすることができる。上で説明したように、プラスミドベクターは、ＭＶＡウイルスゲノムの所定部分への外来配列の挿入を誘導できる配列も含む。任意に、プラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに機能的に連結されたマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含有するカセットも含む。好適なマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ネオマイシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼまたは他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットの使用により、作製した組み換えポックスウイルスの特定及び単離が簡略になる。ただし、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定され得る。その後、上記のようにして得た組み換えポックスウイルスを、さらなる細胞に感染させて、その細胞に、第２の外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第２のベクターをトランスフェクトすることができる。念のため、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入するべきであり、第２のベクターにおいても、ポックスウイルスと相同な配列であって、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子（複数可）の組み込みを誘導する配列が異なる。相同組み換えが行われた後、外来遺伝子または異種遺伝子を２つ以上含む組み換えウイルスを単離できる。追加の外来遺伝子を組み換えウイルスに導入するには、前の感染工程で単離した組み換えウイルスを用いることによって、かつトランスフェクション用のさらなる外来遺伝子を１つまたは複数含むさらなるベクターを用いることによって、感染及びトランスフェクションの工程を繰り返すことができる。

【0163】

あるいは、上記のような感染及びトランスフェクションの工程は置き換えることが可能であり、すなわち、好適な細胞に、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによって最初にトランスフェクションし、その次に、ポックスウイルスを感染させることができる。さらなる代替策として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、得られたすべての組み換えウイルスを細胞に共感染させ、すべての外来遺伝子を含む組み換え体についてスクリーニングすることも可能である。第３の代替策は、ＤＮＡゲノムと外来配列をインビトロでライゲーションし、ヘルパーウイルスを用いて、組み換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムを再構築することである。第４の代替策は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の細菌種において、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたＭＶＡウイルスゲノムと、そのＭＶＡウイルスゲノム内の所望の組み込み部位に隣接する配列と相同なＤＮＡ配列に挟まれた線状外来配列との間で相同組み換えを起こすことである。

【0164】

本開示の核酸の１つ以上は、ＭＶＡウイルスまたはＭＶＡウイルスベクターの好適ないずれかの部分に挿入し得る。ＭＶＡウイルスの好適な部分は、ＭＶＡゲノムの非必須部分である。ＭＶＡゲノムの非必須部分は、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域または既知の欠失部位１～６であってよい。この代わりに、またはこれに加えて、組み換えＭＶＡの非必須部分は、ＭＶＡゲノムのコード領域のうち、ウイルスの成長には必須ではないコード領域であり得る。ただし、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）等の少なくとも１つの細胞培養系において増幅及び増殖できる組み換え体を得ることが可能な限りは、ウイルスゲノムのいずれの位置にも、本発明の核酸（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、ＰＲＡＭＥ、ＦＯＬＲ１、ＣＤ４０Ｌ及び／または４－１ＢＢＬ）、ならびに本明細書に記載されているようないずれかの付随のプロモーターを挿入し得ることは、本発明の範囲内であるため、挿入部位は、ＭＶＡゲノム内の上記の好ましい挿入部位に限定されない。

【0165】

好ましくは、本発明の核酸は、ＭＶＡウイルスの遺伝子間領域（ＩＧＲ）の１つ以上に挿入してよい。「遺伝子間領域」という用語は好ましくは、ＭＶＡウイルスゲノムの隣接する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間、好ましくは、ＭＶＡウイルスゲノムの２つの必須ＯＲＦの間に位置するウイルスゲノム部分を指す。ＭＶＡにおいては、特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７及びＩＧＲ１４８／１４９から選択される。

【0166】

これに加えてまたはこの代わりに、ＭＶＡウイルスでは、ヌクレオチド配列は、ＭＶＡゲノムの既知の欠失部位、すなわち、欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのうちの１つ以上に挿入し得る。「既知の欠失部位」という用語は、ＣＥＦ細胞での連続継代を通じて欠失したＭＶＡゲノム部分を指し、この部分は、５１６代目の継代時に、そのＭＶＡの由来元である親ウイルス、特には、例えばＭｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．（（２００７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９～３２５９）に記載されているような親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）のゲノムと比べて特徴付けられたものである。

【0167】

ワクチン
特定の実施形態では、本開示の組み換えＭＶＡは、ワクチンの一部として配合できる。ワクチンの調製の際には、ＭＶＡウイルスを生理学的に許容可能な形態に変換できる。

【0168】

例示的な調製法は、以下のとおりである。精製ウイルスを５×１０^８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に配合した状態で、－８０℃で保存する。ワクチン注射剤の調製の際には、例えば、１×１０^８～１×１０^９個のウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２％のペプトン及び１％のヒトアルブミンの存在下で、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で凍結乾燥できる。あるいは、ワクチン注射剤は、ウイルスを製剤中で段階凍結乾燥することによって調製できる。特定の実施形態では、製剤は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン等の追加の添加剤、またはインビボ投与に好適な抗酸化剤、不活性ガス、安定剤、もしくは組み換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含む（ただし、これらに限らない）他の添加剤を含有する。その後、アンプルを密閉し、好適な温度、例えば４℃～室温で、数カ月保存することができる。しかしながら、必要がない限りは、そのアンプルは、好ましくは－２０℃未満、最も好ましくは約－８０℃の温度で保存する。

【0169】

ワクチン接種または療法を伴う様々な実施形態では、凍結乾燥体は、０．１～０．５ｍｌの水溶液、好ましくは、生理食塩水、または１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．７）のようなトリス緩衝液に溶解する。本開示の組み換えＭＶＡ、ワクチンまたは医薬組成物は、溶液において、１０^４～１０^１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０^５～５×１０^９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０^６～５×１０^９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたは１０^７～５×１０^９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲で配合できることが想定されている。ヒトに対して好ましい用量には、１０^６～１０^１０ ＴＣＩＤ５０が含まれ、１０^６ ＴＣＩＤ５０、１０^７ ＴＣＩＤ５０、１０^８ ＴＣＩＤ５０、５×１０^８ ＴＣＩＤ５０、１０^９ ＴＣＩＤ５０、５×１０^９ ＴＣＩＤ５０または１０^１０ ＴＣＩＤ５０という用量が含まれる。投与用量及び投与数の最適化は、当業者の技術及び知識の範囲内である。

【0170】

１つ以上の好ましい実施形態では、本明細書に定められているように、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に静脈内投与する。他の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に腫瘍内投与する。他の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に静脈内投与及び腫瘍内投与の両方を同時または異なる時間に行う。

【0171】

いくつかの実施形態では、ＭＶＡは、ＴＡＡと共刺激分子の両方を含有するよう設計されており、静脈内または腫瘍内のいずれかへの投与、または両方の投与経路に好適であることが意図されている。そのようなＭＶＡは、例えば、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ、またはＨＥＲＶ－Ｋ－ｍｅｌ等のヒト内在性レトロウイルスＫスーパーファミリー（ＨＥＲＶ－Ｋ）タンパク質を含む１つ以上のＴＡＡ、または実施例３８に記載されているようなその合成バリアントを発現することができる。

【0172】

追加の実施形態では、組み換えＭＶＡは患者に投与され、また、免疫チェックポインアンタゴニストもしくは免疫チェックポイントアゴニスト、または好ましくは抗体は、全身投与または局所投与、すなわち、腹腔内経路、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮内経路または熟練施術者に知られているいずれかの他の投与経路によって投与できる。

【0173】

キット、組成物、及び使用方法．
様々な実施形態では、本発明には、ａ）本明細書に記載されている核酸を含む組み換えＭＶＡ、及び／またはｂ）本明細書に記載されている１つ以上の抗体を含む、キット、医薬組み合わせ、医薬組成物及び／または免疫原性の組み合わせが含まれる。

【0174】

キット及び／または組成物は、本開示の組み換えポックスウイルスの入った１つまたは複数の容器またはバイアル、本開示の抗体の入った１つ以上の容器またはバイアルを、その組み換えＭＶＡ及び抗体の投与に関する説明と共に含むことができることが想定されている。より具体的な実施形態では、キットは、最初のプライミング投与で組み換えＭＶＡ及び抗体を投与し、その後、組み換えＭＶＡ及び抗体の後続ブースティング投与を１回以上行うことについての説明を含むことができることが想定されている。

【0175】

本発明で提供するキット及び／または組成物は概して、薬学的に許容される、及び／または認可されている、担体、添加剤、抗生物質、保存剤、希釈剤及び／または安定剤を１つ以上含んでよい。そのような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質等であり得る。好適な担体は典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体等のような緩徐に代謝される大きな分子である。

【0176】

特定の例示的な実施形態
実施形態１は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、方法である。

【0177】

実施形態２は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し静脈内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの静脈内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内注射と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される、方法である。

【0178】

実施形態３は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの投与により、組み換えＭＶＡ及び４－１ＢＢＬ抗原の単独での投与と比較して、その対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、方法である。

【0179】

実施形態４は、対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法であって、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、異種の腫瘍関連抗原及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比較して、腫瘍での炎症応答増強を生じさせる、方法である。そのような炎症応答の増強は、本明細書の別の箇所で考察されており、増強としては例えば、ＮＫ細胞及びＴ細胞の誘導を挙げることができる。

【0180】

実施形態５は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、内在性レトロウイルス抗原（ＥＲＶ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの投与により、組み換えＭＶＡ及び４－１ＢＢＬ抗原の単独での投与と比較して、その対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、方法である。

【0181】

実施形態６は、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法であって、その対象がヒトである、方法である。

【0182】

実施形態７は、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である、方法である。

【0183】

実施形態８は、実施形態７に記載の方法であって、そのＥＲＶが、腫瘍細胞で発現するＥＲＶタンパク質である、方法である。

【0184】

実施形態９は、実施形態７～８のいずれか１つに記載の方法であって、そのＥＲＶが、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する、方法である。

【0185】

実施形態１０は、実施形態９に記載の方法であって、そのＨＥＲＶ－Ｋタンパク質が、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌタンパク質から選択される、方法である。

【0186】

実施形態１１は、実施形態９に記載の方法であって、そのＨＥＲＶ－Ｋタンパク質が、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌペプチド及びそれらの免疫原性断片から選択される、方法である。

【0187】

実施形態１２は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＯＬＲ１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択される、方法である。

【0188】

実施形態１３は、実施形態１～６及び１２のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）及びムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）からなる群から選択されるか、または、例えば、実施例１に記載されているような、ＡＨ１Ａ５、ｐ１５Ｅ、及びＴＲＰ２の、混成もしくは組み合わせであるＴＡＡである、方法である。

【0189】

実施形態１４は、実施形態１～６、及び１２のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、ＰＡＰまたはＰＳＡからなる群から選択される、方法である。

【0190】

実施形態１５は、実施形態１～６、１２及び１４のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、ＰＳＡである、方法である。

【0191】

実施形態１６は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法であって、そのＴＡＡが、５－α－レダクターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ－１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β－カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ－１２５、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８、ＦＬＩＣＥとしても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ－ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ－１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ－ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｏｘ－２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞成長因子－８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞成長因子－８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ－１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥ－ファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド－モノシアル酸－２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１－６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎ（α１－６）］β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ－１００－ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質－１（ｇｐ７５／ＴＲＰ－１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦＲ－１）、インターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ－ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（ＭＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（ＭＡＧＥ－２）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（ＭＡＧＥ－３）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（ＭＡＧＥ－４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン－Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原－１（ＭＡＲＴ－１）、メソセリン、ＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＭＴ－ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ－１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ－１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ－７２、トランスフォーミング増殖因子－アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、サイモシン－ベータ－１５、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、ＴＰ１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙからなる群、ならびにこれらを組み合わせたものから選択される、方法である。

【0192】

実施形態１７は、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法であって、その組み換えＭＶＡが、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第３の核酸をさらに含む、方法である。

【0193】

実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法であって、少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストをその対象に投与することをさらに含む、方法である。

【0194】

実施形態１９は、実施形態１８に記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳから選択される、方法である。

【0195】

実施形態２０は、実施形態１８～１９のいずれか１つに記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１である、方法である。

【0196】

実施形態２１は、実施形態２０に記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＬＡＧ－３のアンタゴニストをさらに含む、方法である。

【0197】

実施形態２２は、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載の方法であって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、抗体を含む、方法である。

【0198】

実施形態２３は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法であって、第２のＴＡＡに特異的な抗体をその対象に投与することをさらに含む、方法である。

【0199】

実施形態２４は、実施形態２３に記載の方法であって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的である、方法である。

【0200】

実施形態２５は、実施形態２３に記載の方法であって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む、方法である。

【0201】

実施形態２６は、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法で用いる医薬組成物である。

【0202】

実施形態２７は、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法で用いるワクチンである。

【0203】

実施形態２８は、がんである対象を治療するための組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ｂ）４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む、組み換えＭＶＡである。

【0204】

実施形態２９は、実施形態２８に記載の組み換えＭＶＡであって、そのＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質である、組み換えＭＶＡである。

【0205】

実施形態３０は、実施形態２９に記載の組み換えＭＶＡであって、そのＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来する、組み換えＭＶＡである。

【0206】

実施形態３１は、実施形態３０に記載の組み換えＭＶＡであって、そのレトロウイルスタンパク質Ｋが、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｍｅｌタンパク質から選択される、組み換えＭＶＡである。

【0207】

実施形態３２は、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡであって、ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸をさらに含む、組み換えＭＶＡである。

【0208】

実施形態３３は、ａ）実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡと、ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストとを含む医薬組み合わせである。

【0209】

実施形態３４は、実施形態３３に記載の医薬組み合わせであって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＩＣＯＳのアンタゴニストまたはアゴニストから選択される、医薬組み合わせである。

【0210】

実施形態３５は、実施形態３４に記載の医薬組み合わせであって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストである、医薬組み合わせである。

【0211】

実施形態３６は、実施形態３５に記載の医薬組み合わせであって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、ＬＡＧ－３のアンタゴニストをさらに含む、医薬組み合わせである。

【0212】

実施形態３７は、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、その免疫チェックポイント分子アンタゴニストが、抗体を含む、医薬組み合わせである。

【0213】

実施形態３８は、ａ）実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡと、ｂ）第２のＴＡＡに特異的な抗体と、を含む、医薬組み合わせである。

【0214】

実施形態３９は、実施形態３８に記載の医薬組み合わせであって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的である、医薬組み合わせである。

【0215】

実施形態４０は、実施形態３９に記載の医薬組み合わせであって、その第２のＴＡＡに特異的な抗体が、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む、医薬組み合わせである。

【0216】

実施形態４１は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させる、及び／または生存率を上昇させるのに用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせである。

【0217】

実施形態４２は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせをその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。

【0218】

実施形態４３は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせをその対象に対し静脈内に投与することを含み、静脈内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与と比較して、その対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。

【0219】

実施形態４４は、がんである対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせをその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強されるものである。

【0220】

実施形態４５は、対象のがんを治療する方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせである。

【0221】

実施形態４６は、がんを治療するための方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、そのがんが、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、尿路上皮、子宮頸部または結腸直腸の癌からなる群から選択されるものである。

【0222】

実施形態４７は、実施形態４４に記載の組み換えＭＶＡであって、その炎症応答の増強が、その腫瘍に局在化する、組み換えＭＶＡである。

【0223】

実施形態４８は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し腫瘍内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの腫瘍内投与により、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌをコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスを非腫瘍内注射する場合と比較して、その対象のがん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、方法である。

【0224】

実施形態４９は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に対し静脈内に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの静脈内投与により、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内注射と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される、方法である。

【0225】

実施形態５０は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）をその対象に投与することを含み、その組み換えＭＶＡの投与により、組み換えＭＶＡ単独及びＣＤ４０Ｌ抗原単独での投与と比較して、その対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、方法である。

【0226】

実施形態５１は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせをその対象に対し静脈内及び／または腫瘍内に投与することを含み、前記静脈内投与及び／または腫瘍内投与により、１）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、２）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、または３）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの群から選択されるいずれかのＭＶＡを非静脈内または非腫瘍内投与する場合と比較して、その対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。

【0227】

実施形態５２は、がん性腫瘍を有する対象において、腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法で用いるための、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせであって、その方法が、実施形態２８～３２に記載の組み換えＭＶＡ、実施形態２７に記載のワクチン、実施形態２６に記載の医薬組成物、または実施形態３３～４０のいずれか１つに記載の医薬組み合わせをその対象に対し静脈内及び腫瘍内に投与することを含み、前記静脈内投与及び腫瘍内投与により、１）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、２）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルス、または３）ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの群から選択されるいずれかのＭＶＡの非静脈内または非腫瘍内の投与と比較して、その対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇するものである。前記静脈内投与及び腫瘍内投与は、当業者には明らかなように、同時または異なる時間に行うことができる。

【0228】

なおさらなる実施形態
一態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
（ｃ）ＴＡＡをコードする少なくとも１つのさらなる核酸と、を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を提供する。

【0229】

一実施形態では、組み換えＭＶＡはさらに、
（ｄ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸、を含む。

【0230】

一実施形態では、組み換えＭＶＡは、それぞれが異なるＴＡＡをコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の核酸を含む。

【0231】

組み換えＭＶＡの一実施形態では、ＴＡＡは、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）ペプチド、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ｐ１５、ＡＨ１Ａ５、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、及びＭＥＬ、ならびにそれらを組み合わせたものからなる群から選択される。

【0232】

組み換えＭＶＡの一実施形態では、ＥＲＶタンパク質は、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ）タンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択される。

【0233】

組み換えＭＶＡの一実施形態では、ＥＲＶペプチドは、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ）の偽遺伝子から選択される。

【0234】

別の態様では、本発明は、
（ｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする核酸と、
（ｉｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇをコードする核酸と、
（ｉｉｉ）ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードし、好ましくは、融合タンパク質として発現される核酸と、
（ｉｖ）４－１ＢＢＬをコードする核酸と、を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を提供する。

【0235】

一実施形態では、組み換えＭＶＡはさらに、
（ｖ）ＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む。

【0236】

一実施形態では、（ｉ）の核酸は、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ表面（ＳＵ）及び膜貫通（ＴＭ）ユニットを含むＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードし、ＴＭユニットは、変異しており、好ましくは、ＴＭユニットは、免疫抑制ドメインが不活性化されるよう変異している。好ましくは、ＨＥＲＶＫ－ＭＥＬは、変異ＴＭユニット内に挿入される。より好ましくは、ＨＥＲＶＫ－ＭＥＬが、ＴＭユニットの免疫抑制ドメインの一部に取って代わる。

【0237】

一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号７に示されているようなアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。

【0238】

一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号８に示されているような核酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0239】

一実施形態では、（ｉ）の核酸は、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ表面（ＳＵ）及び膜貫通（ＴＭ）ユニットを含むＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードし、ＴＭユニットは、２０アミノ酸未満、好ましくは１０アミノ酸未満、より好ましくは８アミノ酸未満、最も好ましくは６アミノ酸に短縮される。

【0240】

一実施形態では、（ｉ）の核酸は、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ表面（ＳＵ）ユニットを含むＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードし、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ ＳＵユニットのＲＳＫＲフューリン切断部位が欠失している。好ましくは、ＨＥＲＶＫ－ＭＥＬは、ＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ ＳＵユニットのＣ末端に結合している。

【0241】

一実施形態では、（ｉ）の核酸は、異種膜アンカー、好ましくは、ヒトＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）受容体に由来するものを含むＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする。

【0242】

一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号１１に示されているようなアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。

【0243】

一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号１２に示されているような核酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0244】

一実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮに由来する。

【0245】

別の態様では、本発明は、本発明の組み換えＭＶＡを含む、医薬調製物または医薬組成物を提供する。

【0246】

一実施形態では、医薬調製物または医薬組成物は、腫瘍内及び／または静脈内の投与、好ましくは腫瘍内投与に適応している。

【0247】

別の態様では、本発明は、医薬品またはワクチンとしての使用のための組み換えＭＶＡを提供する。

【0248】

別の態様では、本発明は、がん、好ましくは、メラノーマ、乳癌、結腸癌、または卵巣癌の治療に用いるための組み換えＭＶＡを提供する。

【0249】

別の態様では、本発明は、がん性腫瘍での炎症応答の増強、がん性腫瘍のサイズの縮小、がん性腫瘍の増殖の遅延もしくは停止、及び／または対象、好ましくはヒトの全生存率の上昇に用いるための、本発明の組み換えＭＶＡを提供する。

【0250】

一実施形態では、用いるための組み換えＭＶＡは、腫瘍内及び／または静脈内に、好ましくは腫瘍内に投与される。

【0251】

２３．一実施形態では、用いるための組み換えＭＶＡは、ＴＡＡ特異的抗体と組み合わせて用いられる。

【0252】

２４．一実施形態では、用いるための組み換えＭＶＡは、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストのいずれかと組み合わせて用いられる。

【0253】

さらに別の態様では、本発明は、投与される組み換えＭＶＡが、本発明による組み換えＭＶＡである治療方法を提供する。

【実施例】

【0254】

以下の実施例は、本発明を例示してはいるが、いかなる形であっても特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：組み換えＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ＴＡＡ－ＣＤ４０Ｌの構築
本開示の要素を実現させる組み換えＭＶＡウイルスの作製は、示されている導入遺伝子を、かかる導入遺伝子のプロモーターと共にベクターＭＶＡ－ＢＮに挿入することによって行った。導入遺伝子は、導入遺伝子及び選択カセット、ならびにＭＶＡ－ＢＮ内の標的座位と相同な配列を含有する、組み換えプラスミドを用いて挿入された。ウイルスゲノムと組み換えプラスミド間の相同組み換えは、ＭＶＡ－ＢＮに感染させたＣＥＦ細胞への組み換えプラスミドのトランスフェクションによって達成した。選択カセットをその後、第２の工程中に除去したが、その際、選択カセットを挟んでいるｌｏｘＰ部位を特異的に標的として介在配列を切り出すＣＲＥリコンビナーゼを発現しているプラスミドを利用した。別法として、選択カセットの除去を、ＭＶＡ由来の内部反復配列を用いたＭＶＡを介した組み換えによって達成した。

【0255】

ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＯＶＡまたはＯＶＡ及び４－１ＢＢＬ（それぞれにプロモーター配列が先行する）、ならびにウイルスゲノムへの相同組み換えを可能にするための、ＭＶＡ－ＢＮ内部の標的挿入部位と同一な配列を含めた。

【0256】

ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌの構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＯＶＡ及びＣＤ４０Ｌ（それぞれにプロモーター配列が先行する）、ならびにウイルスゲノムへの相同組み換えを可能にするための、ＭＶＡ－ＢＮ内部の標的挿入部位と同一な配列を含めた。

【0257】

ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの構築の際には、組み換えプラスミドには、２つの導入遺伝子ｇｐ７０及び４－１ＢＢＬ（それぞれにプロモーター配列が先行する）、ならびにウイルスゲノムへの相同組み換えを可能にするための、ＭＶＡ－ＢＮ内部の標的挿入部位と同一な配列を含めた。

【0258】

ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの構築の際には、組み換えプラスミドには、それぞれ、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＨＥＲＶ－Ｋ及び４－１ＢＢＬ、ＨＥＲＶ－Ｋ、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌの導入遺伝子を含めた。各導入遺伝子または一連の導入遺伝子に先行して、プロモーター配列、ならびにウイルスゲノムへの相同組み換えを可能にするための、ＭＶＡ－ＢＮ内部の標的挿入部位と同一な配列を配した。

【0259】

ＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５Ｅ－ＴＲＰ２及びＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５Ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌの構築の際には、組み換えプラスミドには、導入遺伝子ＡＨ１Ａ５－ｐ１５Ｅ－ＴＲＰ２またはＡＨ１Ａ５－ｐ１５Ｅ－ＴＲＰ２及びＣＤ４０Ｌ（それぞれにプロモーター配列が先行する）、ならびにウイルスゲノムへの相同組み換えを可能にするための、ＭＶＡ－ＢＮ内部の標的挿入部位と同一な配列を含めた。

【0260】

上記のｍＢＮ ＭＶＡの作製の際には、ＣＥＦ細胞培養物にそれぞれＭＶＡ－ＢＮを接種し、それぞれに、対応する組み換えプラスミドをトランスフェクトした。次に、これらの細胞培養物からの試料を、選択圧をかける薬物を含有する培地中のＣＥＦ培養物に接種し、蛍光を発現しているウイルスクローンをプラーク精製によって単離した。これらのウイルスクローンからの蛍光タンパク質含有選択カセットの欠失は、第２の工程において、各コンストラクトでの選択カセットを挟んでいる２つのｌｏｘＰ部位を含むＣＲＥを介した組み換え、またはＭＶＡを介した内部組み換えによって媒介された。第２の組み換え工程後、ＭＶＡ－ＢＮの標的座位に挿入された導入遺伝子配列（例えば、ＯＶＡ、４－１ＢＢＬ、ｇｐ７０、ＨＥＲＶ－Ｋ及び／またはＣＤ４０Ｌ）及びそのプロモーターのみを保持した。選択カセットを欠くプラーク精製済みウイルスのストックを調製した。

【0261】

同定導入遺伝子の発現は、記載されているコンストラクトを接種した細胞で実証される。

【0262】

本明細書に記載されているコンストラクトの作製は、ＭＶＡ－ＢＮのクローン型を細菌人工染色体（ＢＡＣ）で用いることにより行った。組み換えプラスミドは、記載されている導入遺伝子配列をそれぞれプロモーターの下流に含有した。プラスミドには、ＭＶＡにも存在し、これにより、組み込み部位の特異的な標的化を可能にする配列を含めた。簡潔に述べると、ＢＡＣ ＤＮＡをＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクトし、それらの細胞に、ヘルパーウイルスとしてのショープ線維腫ウイルスを重感染させることによって、感染性ウイルスをＢＡＣから再構築した。ＣＥＦ細胞培養液で３代追加継代した後、コンストラクトのヘルパーウイルス不含型を得た。例示的なＭＶＡ作製法は、Ｂａｕｒ ｅｔ ａｌ．（（２０１０） Ｖｉｒｏｌ． ８４：８７４３－５２，“Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｂｒｅａｋｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｖｅｃｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ８Ｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”）にも見られる。

【0263】

実施例２：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞によるＣＤ８ Ｔ細胞の４－１ＢＢＬ媒介性共刺激は、ＤＣを必要とせずにサイトカイン産生に影響を及ぼす
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後に生成された。Ｂ１６．Ｆ１０（メラノーマモデル）細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを１０のＭＯＩで感染させ、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、感染した腫瘍細胞を採取し、指示されている場合には、１：１の比率でのＤＣの存在下で３７℃、５％ＣＯ２で４時間共培養した。ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。その後、培養上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘによるサイトカイン濃度分析用に採取した。結果は、図１に、ＩＬ－６（図１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図１Ｂ）、ＩＬ－２（図１Ｃ）及びＩＦＮ－γ（図１Ｄ）の上清濃度として示されている。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。

【0264】

以前報告された内容と一致して、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌは、ＤＣの活性化、及びその抗原提示能に大きな影響を及ぼした。すなわち、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染したＦＬＤＣによって大量のＩＬ－６が産生された（図１Ａ）。重要なことには、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答は、ＤＣ存在下でのみ誘導可能であり、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌに感染させたＢ１６．Ｆ１０細胞自体が直接誘導することはできなかった（図１Ｂ及び１Ｃ）。これらの結果は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌの効果を得るには、ＤＣが明らかに必要であることを示している。これに対して、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬがＤＣでのＩＬ－６産生を誘導することはなかったが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染したＢ１６．Ｆ１０細胞では、Ｔ細胞活性化サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＧＭ－ＣＳＦの分泌がＤＣに依存せずに誘導された（図１Ａ～１Ｄ）。

【0265】

実施例３：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに感染した腫瘍細胞は、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化エフェクターＴ細胞への分化を直接（すなわち、ＤＣを必要とせずに）誘導する
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後に生成された。Ｂ１６．Ｆ１０（メラノーマモデル）細胞に、ＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを１０のＭＯＩで感染させ、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、感染した腫瘍細胞を採取し、指示されている場合には、１：１の比率でのＤＣの存在下で３７℃、５％ＣＯ２で４時間共培養した。その一方で、ナイーブＯＶＡ（２５７－２６４）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。その後、細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。結果は、図２に、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＴ－ｂｅｔのＧＭＦＩ（図２Ａ）、及びＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４＋ グランザイムＢ＋ ＩＦＮ－γ＋ ＴＮＦα＋のパーセンテージ（図２Ｂ）として示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0266】

結果から、交差提示するＤＣの非存在下では、グランザイムＢ＋及びＩＦＮγ＋の細胞傷害性エフェクターＴ細胞の誘導が４－１ＢＢＬ依存性であったことが示されている（図２Ｂ）。図１に示されている結果と併せると、これらの所見は、ＭＶＡによってコードされる４－１ＢＢＬは、ＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌ（ＤＣの活性化を介して作用する）とは対照的に、ＤＣに依存せずにＴ細胞に直接作用することを実証している。

【0267】

実施例４：ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかをコードするＭＶＡによる感染は、腫瘍細胞株及びマクロファージでの腫瘍細胞死を誘導する
腫瘍細胞株Ｂ１６．ＯＶＡ（図３Ａ及び３Ｂ）、ＭＣ３８（図３Ｃ）ならびにＢ１６．Ｆ１０（図３Ｄ）を、示されているＭＯＩで２０時間感染させた。その後、細胞を、その生存率についてフローサイトメトリーにより解析した。図３Ａからの試料の血清ＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡによって定量した（図３Ｂ）。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、示されているＭＯＩで２０時間感染させた。その後、細胞を、その生存率についてフローサイトメトリーにより解析した。結果は、図３Ａ～３Ｅに示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0268】

図３Ａ及び３Ｂに示されているように、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌによる感染では、ＰＢＳ処理した腫瘍細胞と比較して、細胞死の軽度な誘導がもたらされた。興味深いことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬへの感染では、感染から１８時間後、腫瘍細胞死が顕著に増強された。

【0269】

これらの結果を非抗原性細胞株でさらに確認するため、ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ（いずれも、ＴＡＡをコードさせなかった）に感染させたＭＣ３８腫瘍細胞（図３Ｃ）及びＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞（図３Ｄ）を用いて、同様のアッセイを行った。一貫して、これらのＭＶＡへの感染では、これらの腫瘍細胞株での細胞死が誘導され、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を効率的に死滅させた（図３Ｅ）。勘案すると、これらのデータから、ＭＶＡへの感染は、腫瘍細胞及びマクロファージの死をもたらし、これが、組み換えＭＶＡによってＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬを発現させた場合に増加することが示された。

【0270】

腫瘍細胞の腫瘍溶解性ウイルス感染により、いわゆる免疫原性細胞死（ＩＣＤ）が誘導される（Ｗｏｒｋｅｎｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：２５１－５６）。ＩＣＤは、免疫系に対してアラーミンとして作用して、抗原提示を増強させることによって、抗腫瘍免疫を誘導するカルレティキュリン、ＡＴＰまたはＨＭＧＢ１等の細胞内タンパク質の放出を含む。ＭＶＡ感染が、分泌ＨＭＧＢ１によるＩＣＤの誘導をもたらすかを検討した。予想外にも、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌでは、ＭＶＡ－ＯＶＡと比べてＨＭＧＢ１の顕著な増加が誘導されたことが見出された（図３Ｂ）。

【0271】

実施例５：４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡはインビボでＮＫ細胞活性化を誘導する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図４の「ｒＭＶＡ」）、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図４の「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）、もしくは２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせた５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡのいずれかにより静脈内免疫した。２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓をフローサイトメトリー解析用に処理した。結果は、図４Ａ及び図４Ｂに示されている。ＣＤ６９（図４Ａ）及びＣＤ７０（図４Ｂ）の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）が示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されており、２回の独立した実験を表すものである。

【0272】

結果から、ＮＫ細胞応答の質は、４－１ＢＢＬを含まないＭＶＡ－ＯＶＡのＩＶ投与と比較して、ＭＶＡ－ＯＶＡに４－１ＢＢＬを加えることによって増強され、ＮＫ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９及びＣＤ７０の両方が、ＭＶＡ－ＯＶＡの場合と比較して著しくアップレギュレートされたことが示された（図４Ａ及びＢ）。４－１ＢＢＬブロッキング抗体の同時注射では、ＭＶＡ－ＯＶＡにより誘導されるＮＫ細胞活性化は、完全に４－１ＢＢＬ非依存的であるが、過剰な４－１ＢＢＬシグナルがＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって送達された場合に増強できることが示された。

【0273】

実施例６：４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡによる静脈内免疫はインビボでの血清ＩＦＮ－γ分泌を促進する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０の「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）、もしくは２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせた５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡのいずれかにより静脈内免疫した。結果は、図５Ａ及び５Ｂに示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。図５Ａ：６時間後、マウスから採血し、全血から血清を分離して、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。図５Ｂ：３時間後、２１時間後、及び４５時間後に、マウスにブレフェルジンＡを静脈内注射してタンパク質の分泌を停止させた。免疫から６時間後、２４時間後、及び４８時間後にマウスを屠殺し、脾細胞をフローサイトメトリーによって解析した。

【0274】

４－１ＢＢ媒介性のＮＫ細胞活性化は、ＮＫエフェクターサイトカインＩＦＮγの血清濃度の上昇と一致していた（図５Ａ）。ＮＫ細胞は、活性化すると大量のＩＦＮ－γを産生することが知られている。血清中のＩＦＮ－γ濃度の上昇がＮＫ細胞に由来した可能性を判断するため、ＩＦＮ－γ産生ＮＫ細胞の割合を、示されている組み換えＭＶＡベクターの静脈内注射後の様々な時点で測定した。注射から６時間後の、血清ＩＦＮ－γ高値が測定された際、ＩＦＮ－γ＋ ＮＫ細胞のパーセンテージが最も高くなり、その後、徐々に低下した（図５Ｂ）。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを用いた場合にＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞の頻度が最も高いことが観察された。勘案すると、これらのデータから、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬの静脈内免疫により、ＮＫ細胞の強力な活性化、及びＮＫ細胞エフェクターサイトカインＩＦＮ－γの産生増加がもたらされることが示されている。

【0275】

実施例７：静脈内ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ免疫はＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスでの血清ＩＦＮ－γ分泌を促進する
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）をｉ．ｖ．（静脈内）投与した。６時間後、マウスから採血し、全血から血清を分離して、血清中のＩＦＮ－γ濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。結果は、図６に示されている。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0276】

図６に示されているデータは、他の実験で報告されているＮＫ細胞に対する作用と同様の作用がメラノーマ腫瘍モデルでも得ることができたことを示している。免疫から６時間後、血清ＩＦＮ－γ濃度は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫した腫瘍担持マウスで大きく上昇しており、強力なＮＫ細胞活性化が示された（図６）。

【0277】

実施例８：静脈内へのｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬによるプライム及びブースト免疫は、抗原及びベクターに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を増強する
図７Ａ～７Ｄは、静脈内へのｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬによるプライム及びブースト免疫後の抗原特異的及びベクター特異的を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４匹／群）に、生理食塩水、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡ（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ）、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ（＝ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）、もしくは２００μｇの抗４－１ＢＢＬ抗体（クローンＴＫＳ－１）と組み合わせた５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡのいずれかによる静脈内プライム免疫を０日目に行い、４１日目にブースト免疫を行った。プライム免疫後、６日目、２１日目、３５日目、４８日目、及び６４日目にマウスから採血し、末梢血のフローサイトメトリー解析を行った。プライム免疫後、７０日目に、マウスを屠殺した。脾臓を採取し、フローサイトメトリー解析を行った。

【0278】

結果は、図７Ａ～７Ｄに示されている。図７Ａは、末梢血白血球（ＰＢＬ）のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示しており、図７Ｂは、ＰＢＬのうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。図７Ｃは、生細胞のうちの抗原（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。図７Ｄは、生細胞のうちのベクター（Ｂ８Ｒ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0279】

結果は、Ｂ８特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は、初回免疫後７日目に最大に達し、４１日目の２回目の免疫後にさらに増殖したことを示している（図７Ａ及びＢ）。４１日目の時点において、Ｂ８及びＯＶＡのいずれについても、ｒＭＶＡと比較して、抗原特異的Ｔ細胞応答という点でｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬの明らかな有益性があった。興味深いことに、４－１ＢＢＬブロッキング抗体の同時注射では、ｒＭＶＡにより誘導されるＴ細胞応答は、完全に４－１ＢＢＬ非依存的であるが、過剰な４－１ＢＢＬシグナルがｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬによって送達された場合に増強できることが示された（図７Ａ及びＢ）。これらの結果と一致して、ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬによるプライム／ブースト免疫はまた、初回免疫から７０日後、脾臓でのＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答及びＢ８特異的なＴ細胞応答の改善をもたらした（図７Ｃ及びＤ）。

【0280】

実施例９：ＴＡＡと４－１ＢＢＬとをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍効果増大
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくは５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬをｉ．ｖ．（静脈内）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。図８に示されているように、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内投与では、腫瘍の増殖遅延の延長による、ＭＶＡまたはコントロール（ＰＢＳ）と比較した場合の腫瘍体積の縮小がもたらされた。

【0281】

実施例１０：４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射の抗腫瘍効果増強
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、１２日目及び１５日目（灰色の破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ（図では「ｒＭＶＡ」）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」）もしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ（図では「ｒＭＶＡ－４－１ＢＢＬ」）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。図９Ａ～９Ｄに示されているように、ＴＡＡと、４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬのいずれかとをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射によって、抗腫瘍効果増強が実現された。より具体的には、図９Ｄに示されているように、腫瘍増殖の著しく大きな低下が、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスで見られた。本発明は、いかなる特定の機序または作用様式にも拘束されないが、４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌの間で観察された相違についての仮説の１つは、４－１ＢＢＬがＮＫ細胞及びＴ細胞を活性化することを目的とするのに対し、ＣＤ４０ＬはＤＣを活性化することを目的とすることである。Ｂ１６メラノーマ腫瘍はＴ細胞による浸潤が多い（Ｍｏｓｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．５（１）：２９－４１）ため、こうした状況では、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡよりも４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡの方が有効である。

【0282】

４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌが、腫瘍の増殖または直径に対してその作用を及ぼす正確な機序または経路にかかわらず、図９のデータから、４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡの腫瘍内注射が、長期の腫瘍増殖制御、場合によっては、腫瘍の完全拒絶をもたらすことが示された。

【0283】

実施例１１：確立された大腸癌に対する、ＴＡＡ及びＣＤ４０Ｌを用いてコードさせたＭＶＡウイルスの腫瘍内注射の抗腫瘍効果増強
ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から１４日目（黒い点線）、１９日目及び２２日目（黒い破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５Ｅ－ＴＲＰ２（図では「ｒＭＶＡ」と表記）もしくはＭＶＡ－ＡＨ１Ａ５－ｐ１５Ｅ－ＴＲＰ２－ＣＤ４０Ｌ（図では「ｒＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ」と表記）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。結果は、図１０に、確立された非抗原性ＭＣ３８大腸癌について示されている。

【0284】

これらのベクターは、１つのメラノーマ関連ＴＲＰ２由来エピトープ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ、Ｈ２－Ｋ^ｂ）ならびに２つのマウス白血病ウイルスｇｐ７０由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープのｐ１５Ｅ（ＫＳＰＷＦＴＴＬ、Ｈ２－Ｋ^ｂ）及び改変ＡＨ１のＡＨ１Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ、Ｈ２－Ｌ^ｄ）からなる一連の腫瘍関連エピトープをコードする。これらの結果は、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌの腫瘍内注射が、ＭＣ３８結腸癌モデルでの腫瘍増殖を顕著に遅延させることを示している。

【0285】

実施例１２：免疫チェックポイント阻害及び腫瘍抗原特異的抗体は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と相乗作用する
Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ細胞（５×１０^５）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍が直径約５ｍｍに達したら、マウスを群分けし（ｎ＝５匹／群）、指示されている場合（チェック印）には、２００μｇのＩｇＧ２ａ、抗ＴＲＰ－１または抗ＰＤ－１を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍の接種から１３日目（黒い点線）、１８日目及び２１日目（灰色の破線）に、マウスをＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した。腫瘍増殖を定期的に測定した。結果は、図１１に示されている。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）Ｔｒｐ１（抗Ｔｒｐ１）に特異的な抗体をＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と組み合わせた場合に、抗ＰＤ－１単独の場合と比較して、腫瘍体積縮小が増大した（図１１、中央の列）。免疫チェックポイント分子ＰＤ－１に対する抗体をＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と組み合わせた場合に、抗ＰＤ－１単独の場合と比較して、腫瘍体積縮小が増大した（図１１、下の列）。

【0286】

これらの実験は、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＴＲＰ－１抗体が単剤として腫瘍増殖制御を増強させた一方で、いずれかの抗体とＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの組み合わせでは、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによってもたらされる治療効果が改善されたことを示している。この実施例では、腫瘍内ＭＶＡ ４－１ＢＢＬと、チェックポイント阻害またはＴＡＡ標的化抗体のいずれかとの併用療法は、いずれの単剤療法よりも治療活性が大きかった。このデータはまた、相乗作用を得るために、ＡＤＣＣを誘導する可能性のある腫瘍特異的抗体を、４－１ＢＢＬを発現しているＭＶＡの腫瘍内注射と組み合わせてよいことも示している。

【0287】

実施例１３：抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体治療と比較した腫瘍内へのＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ注射の優れた抗腫瘍効果
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目、１２日目及び１５日目（黒い破線）に、ＰＢＳ、５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ、または１０μｇの抗４－１ＢＢ（３Ｈ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のいずれかを腫瘍内注射した。腫瘍増殖を定期的に測定した。

【0288】

図１２Ａは、抗４－１ＢＢＬアゴニスト抗体（３Ｈ３）と比較したＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの優れた抗腫瘍効果を示す。図１２Ｂは、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内免疫の場合にのみ血液中でのＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答が誘導され、抗４－１ＢＢＬアゴニスト抗体では、血液中のＯＶＡ特異的Ｔ細胞がまったく誘導されなかったことを示す。

【0289】

したがって、これらのデータから、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内処置は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答及び腫瘍増殖制御の両方の点で、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体よりも強力であることが示されている。

【0290】

実施例１４：ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４０Ｌを用いてコードさせた内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡの静脈内注射の抗腫瘍効果増大
ＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、マウスへの腫瘍導入後１２日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。図１３Ａ及び１３Ｂに示されているように、内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡウイルスの静脈内投与では、ＭＶＡまたはコントロール（ＰＢＳ）の場合と比較して腫瘍体積縮小がもたらされた。加えて、抗腫瘍効果は、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬによってＣＤ４０Ｌが追加でコードされた場合にさらに改善された。

【0291】

図１３Ｃには、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌの静脈内注射の際の、血液中でのＧｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導が示されている。

【0292】

したがって、これらの実験では、ＭＶＡは、マウスタンパク質ｇｐ７０（マウス白血病ウイルスのエンベロープタンパク質）であるモデルＥＲＶをコードするように構築した（「ＭＶＡ－ｇｐ７０」）。共刺激分子ＣＤ４０Ｌをさらに含むＭＶＡも作製した（「ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ」）。ＣＴ２６．ｗｔ大腸癌モデルを用いて、これらの新規コンストラクトの抗腫瘍能を試験した。ＣＴ２６．ｗｔ細胞は、高レベルのｇｐ７０を発現することが示されている（例えば、Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ（２０１３）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２：ｅ２６８８９を参照のこと）。ＣＴ２６．ｗｔ腫瘍担持マウスを作製し、腫瘍が少なくとも５ｍｍ×５ｍｍになったら、上記のように、静脈内免疫した。ＭＶＡ単独での免疫では、軽度の腫瘍増殖遅延が誘導された。これに対して、ＭＶＡ－ｇｐ７０による免疫では、５個中３個の腫瘍の完全拒絶が生じた（図１３のＡ及びＢ）。さらに顕著な結果がＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる免疫の場合に得られ、５個中４個の腫瘍で拒絶が生じた（図１３のＡ及びＢ）。

【0293】

これらの抗腫瘍応答が、免疫後のｇｐ７０特異的Ｔ細胞の誘導と相関するか判断するため、Ｈ－２Ｋｄ拘束性ｇｐ７０エピトープＡＨ１を用いて、血液の再刺激を行った。これらの結果（図１３Ｃ）は、ＭＶＡ－Ｇｐ７０処置マウス及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ処置マウスにおける、ｇｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の強力な誘導を示している（図１３Ｃ）。

【0294】

実施例１５：Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍モデルにおける、ＣＤ４０Ｌを用いてコードさせた内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡの静脈内注射の抗腫瘍効果増大
腫瘍接種後、腫瘍測定値が約５×５ｍｍとなった７日目（黒い点線）に、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０もしくはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍増殖を定期的に測定した。図１４Ａに示されているように、内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０とＣＤ４０ＬとをコードするＭＶＡウイルスの静脈内投与により、ＭＶＡまたはコントロール（ＰＢＳ）の場合と比較した腫瘍体積縮小がもたらされた。

【0295】

図１４Ｂは、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌの静脈内注射時の血液中でのＧｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞誘導を示す。

【0296】

したがって、これらの実験で、ＭＶＡ－Ｇｐ７０及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる治療の有効性が、追加の独立した腫瘍モデルにおいて示された。Ｂ１６．Ｆ１０は、Ｃ５７ＢＬ／６に由来するメラノーマ細胞株であり、高レベルのＧｐ７０を発現する（Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ（２０１３）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ ２：ｅ２６８８９）。ＭＶＡ単独（「ＭＶＡ－ＢＮ」）による処置では、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍の増殖遅延がある程度もたらされ、アジュバント非添加ＭＶＡ－Ｇｐ７０の作用に匹敵していた（図１４Ａ）。しかしながら、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌでは、コントロールであるＭＶＡ骨格単独の場合よりも強い抗腫瘍効果がもたらされた（図１４Ａ）。追加の実験により、Ｇｐ７０抗原をコードするＭＶＡの投与を受けた群はいずれも、Ｈ－２Ｋｂ拘束性ｇｐ７０エピトープｐ１５ｅに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を示したが、ＭＶＡによってＣＤ４０Ｌもコードされた場合には、末梢Ｔ細胞応答の大幅な増大は示されなかったことが示された（図１４Ｂ）。

【0297】

実施例１６：ｇｐ７０及び４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡウイルスの静脈内注射の抗腫瘍効果増大［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを静脈内に投与する。腫瘍増殖を定期的に測定する。ヒト内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質のマウスホモログは、正常マウス組織での高発現も、マウス腫瘍組織での主要発現もしないため、ヒトＥＲＶの有効性は、マウスモデルで効果的に研究することはできない。Ｇｐ７０は、十分に研究されてきたマウスＥＲＶタンパク質である（例えば、Ｂｒｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（１２）：６３９６－６４０５、Ｂａｓｈｒａｔｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：５７５－５８４及びＮｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １８：１１５－１２０を参照のこと）。したがって、ｇｐ７０特異的ながんワクチンのマウスにおける研究は、ヒトにおけるＥＲＶ特異的ながんワクチンの有効性に関する強力な予測値が得られる可能性が非常に高い。

【0298】

実施例１７：ｇｐ７０と、４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬのいずれかとをコードするＭＶＡウイルスの腫瘍内注射の抗腫瘍効果増強［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）、１２日目及び１５日目（灰色の破線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与する。腫瘍増殖を定期的に測定した。

【0299】

実施例１８：ｒＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬを用いた投与は、感染腫瘍細胞の直接抗原提示によりサイトカイン産生に影響を及ぼす［仮想実施例］
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後に生成される。Ｂ１６．Ｆ１０細胞に、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを１０のＭＯＩで感染させ、一晩放置する。その翌日、感染した腫瘍細胞を採取し、指示されている場合には、１：１の比率でのＤＣの存在下で３７℃、５％ＣＯ２にて４時間共培養する。ＨＥＲＶ－Ｋ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＨＥＲＶ－Ｋ免疫マウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養する。その後、培養上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘによるサイトカイン濃度分析用に採取する。サイトカイン濃度の測定には、（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＧＭ－ＣＳＦ、（Ｃ）ＩＬ－２及び（Ｄ）ＩＦＮγを含める。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。

【0300】

実施例１９：ｒＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬを用いた投与は、感染腫瘍細胞の直接抗原提示により、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化エフェクターＴ細胞に誘導する［仮想実施例］
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来骨髄細胞を組み換えＦｌｔ３Ｌの存在下で１４日間培養した後に生成される。Ｂ１６．Ｆ１０細胞に、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌを１０のＭＯＩで感染させ、一晩放置する。その翌日、感染した腫瘍細胞を採取し、指示されている場合には、１：１の比率でのＤＣの存在下で３７℃、５％ＣＯ２にて４時間共培養する。その一方で、ＨＥＲＶ－Ｋ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＨＥＲＶ－Ｋ免疫マウスから磁気精製し、上記の共培養物に１：５の比率で加える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養する。その後、細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析する。サイトカイン解析は、（Ａ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＴ－ｂｅｔのＧＭＦＩ、及び（Ｂ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４＋ グランザイムＢ＋ ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋のパーセンテージについて行う。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0301】

実施例２０：ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかを用いてコードさせるｒＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｋによる感染は、腫瘍細胞株での腫瘍細胞死及びマクロファージを誘導する［仮想実施例］
腫瘍細胞株Ｂ１６．ＯＶＡ（Ａ及びＢ）、ＭＣ３８（Ｃ）、ならびにＢ１６．Ｆ１０（Ｄ）を、示されているＭＯＩで２０時間感染させる。その後、細胞を、その生存率についてフローサイトメトリーによって解析する。（Ａ）からの試料における血清ＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡによって定量する。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、示されているＭＯＩで２０時間感染させる。その後、細胞を、その生存率についてフローサイトメトリーによって解析する。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0302】

実施例２１：４－１ＢＢＬをコードする組み換えＭＶＡの腫瘍内投与は、腫瘍における、Ｔｒｅｇ細胞減少及びＴ細胞疲弊軽減をもたらす［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、腫瘍の接種から７日目（黒い点線）に、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与する。５日後、マウスを屠殺し、脾臓及び腫瘍を採取して染色し、蛍光色素コンジュゲート抗体によってＴｒｅｇ浸潤及びＴ細胞疲弊を評価する。（Ａ）ＣＤ４５＋ 腫瘍浸潤白血球のうちのＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージ、腫瘍内浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ－１（Ｂ）及びＬａｇ－３（Ｃ）の幾何平均蛍光強度。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。

【0303】

実施例２２：免疫チェックポイント阻害及び腫瘍抗原特異的抗体はｒＭＶＡ ｇｐ－７０－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与と相乗作用する［仮想実施例］
Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５匹／群）を群分けし、指示されている場合（チェック印）には、２００μｇのＩｇＧ２ａ、抗ＴＲＰ－１または抗ＰＤ－１を投与する。腫瘍の接種から１３日目（黒い点線）、１８日目及び２１日目（灰色の破線）に、マウスをＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内免疫する。腫瘍増殖を定期的に測定する。

【0304】

実施例２３：サイトカイン／ケモカインＭＶＡ－ＢＮ骨格のＩＴ免疫に対する応答は４－１ＢＢＬアジュバント作用により増大され得る
組み換えＭＶＡが、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内部で炎症を誘導する可能性を評価するため、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍からの組織でサイトカイン及びケモカインを分析した。まず、５×１０^５のＢ１６．ＯＶＡ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した。１０日目、マウスをＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＢＮ、ＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫した（ｎ＝５～６匹のマウス／群）。

【0305】

注射から６時間後、サイトカイン及びケモカインの発現を測定した（図１５）。ＰＢＳで処理した組織でのサイトカイン／ケモカインの発現は、腫瘍への針の挿入及び生理食塩水のせん断圧力によって誘導される基本炎症プロファイルを表す。ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１５及びＴＮＦ－αを含むサイトカイン、ならびにＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２及びＭＩＰ２等のケモカインがアップレギュレートされた（図１５）。ヒトにおいて、ＮＦ－κβの活性化により誘導され、ＩＬ－８の産生を刺激するＩＬ－２５（ＩＬ－１７Ｅとしても知られる）も検出された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６６０－６４）。興味深いことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを注射した腫瘍では、ＭＶＡ－ＢＮを注射した腫瘍、またはＭＶＡ－ＯＶＡを注射した腫瘍病変と比較して、ＩＬ－６、ＩＦＮ－αまたはＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒα等の炎症誘発性サイトカインの顕著な増加が示された。

【0306】

実施例２４：腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫に対するサイトカイン／ケモカインの炎症誘発性応答はＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって増大する
マウス及び腫瘍を実施例２３に記載のように処置した。際だったことに、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦを含め、いくつかの炎症誘発性サイトカインは、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内免疫後にしか産生されなかった（図１６）。ＩＬ－１８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ３及びＩＬ－２２を含め、他の炎症誘発性サイトカインの産生は、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかによる腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫により増強されたが、ＭＶＡ－ＢＮまたはＰＢＳ単独では増強されなかった。

【0307】

勘案すると、このデータから、腫瘍内（ｉ．ｔ．）へのＭＶＡでの免疫により、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）での炎症性サイトカイン／ケモカインシフトが誘導され、それにより、炎症応答が増強され得ることが示される。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内免疫した場合に、ＭＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡと比較して作用増大が観察された。このことから、４－１ＢＢＬの追加は、組み換えＭＶＡへの「アジュバント作用」と言うことができる。

【0308】

実施例２５：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射後のＴＭＥ及び流入領域ＬＮの定量的及び定性的Ｔ細胞分析
ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後に炎症により誘導される細胞プロセスをさらに深く理解するため、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後の様々な時点における自然免疫及び適応免疫の浸潤の詳細な分析を行った。Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスに、ＰＢＳ、または２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。プライム免疫から１日後、３日後及び７日後にマウスを屠殺した。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）を切除し、コラゲナーゼ及びＤＮａｓｅで処理し、単一細胞をフローサイトメトリーによって解析した。免疫細胞集団を分析して、それらのサイズ、増殖挙動及び機能状態を決定した。

【0309】

結果から、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかによるＢ１６．ＯＶＡ腫瘍の注射により、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫から７日後に、ＣＤ４５^＋白血球の腫瘍内への浸潤が誘導されたことが示された（図１７、最上列左のヒストグラム）。興味深いことに、ＴｄＬＮにおけるＣＤ４５^＋白血球数の増加は、すでにｉ．ｔ．（腫瘍内）免疫後の３日目（図１７、最上列右のヒストグラム）、特に、４－１ＢＢＬを発現しているＭＶＡの注射後に観察された。この違いは、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫から７日後にＴｄＬＮでさらに拡大しており、このことから、ＭＶＡ免疫に媒介される抗腫瘍効果が、ＴｄＬＮでは、免疫から３日目にすぐに開始されることが示唆された。

【0310】

ワクチン接種に基づく抗腫瘍療法の一態様は、腫瘍特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖及び再活性化、ならびに腫瘍でのそれらの富化である。ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のいずれも、免疫から１週間後に腫瘍において増加した（それぞれ、図１７の２列目及び３列目、左側のヒストグラム）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでのｉ．ｔ．免疫後、腫瘍内では７日目までに増加し、ＴｄＬＮでは３日目に増加が開始し、７日目でピークに達した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は主に、７日目までに腫瘍内でのＣＤ４５^＋細胞の増加に寄与した。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの注射では、ＭＶＡ－ＯＶＡの注射の場合と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団が腫瘍（７日目）及びｄＬＮ（３日目及び７日目）の両方でさらに増加した。

【0311】

ＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の定量により、特に、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで処置した群において、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫から７日後の腫瘍微小環境内部での増加が明らかになった（図１７、左下）。際だったことに、ＴｄＬＮにおけるＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖は、免疫から３日目にピークに達し、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ処置群において高かった（図１７、右下）。勘案すると、これらのデータは、ＭＶＡ－ＯＶＡ、特にＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの腫瘍内免疫により、適応免疫応答の発生が増強され（腫瘍流入領域リンパ節では処置後３日目に開始）、７日目までに、腫瘍微小環境での抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の顕著な増加をもたらすことを示している。

【0312】

実施例２６：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射による抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導
ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射によって誘導された、腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）内のＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、高い増殖能を示した。Ｋｉ６７（細胞増殖の指標）を発現するＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＰＢＳの場合と比較してＭＶＡ－ＯＶＡ処置後のＴｄＬＮで高く、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫したマウスでさらに上昇した（図１８Ａ）。さらに、ＭＶＡ－ＯＶＡでの免疫後及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの免疫後の７日目までに、腫瘍内のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞により疲弊マーカーＰＤ－１がダウンレギュレートされたことから、機能性の回復が示唆された（図１８Ｂ）。

【0313】

Ｔｒｅｇ細胞（「制御性Ｔ細胞」ともいう）は、抗腫瘍免疫応答の強力な阻害因子である（例えば、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２７：１０９－１１８を参照のこと）。ＭＶＡ－ＯＶＡの腫瘍内注射により、腫瘍におけるＯＶＡ特異的Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比（すなわち、Ｔｒｅｇ細胞に対する「Ｔｅｆｆ」細胞、すなわち、「エフェクターＴ細胞」の比率）が上昇し、さらなる上昇がＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの処置後７日目に見られた（図１８Ｃ）。したがって、ＭＶＡ－ＯＶＡ、特にＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内処置は、腫瘍内Ｔｒｅｇの頻度を低下させてＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞優位にしたため、抗腫瘍免疫応答にとって有益である。

【0314】

実施例２７：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射後のＴＭＥ及び流入領域ＬＮの定量的及び定性的ＮＫ細胞分析
ＭＶＡ－ＯＶＡでのｉ．ｔ．免疫後のＮＫ細胞の定量では、腫瘍内免疫から１日後、腫瘍におけるＮＫ細胞の減少が見られた（図１９、最上列左のヒストグラム）。これらの変化は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを用いた場合に、より顕著であった。同時に、腫瘍流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）内のＮＫ細胞は、ＭＶＡ－ＯＶＡでの免疫及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの免疫のいずれでも免疫から３日後及び７日後に増加したが（図１９、最上列右のヒストグラム）、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでは、ＴｄＬＮにおけるＮＫ細胞の最も大きい増加が誘導された。

【0315】

ＣＤ６９は、ＮＫ細胞の初期活性化マーカーである。ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれのウイルスベクターでも、腫瘍及び流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ、図１９、２列目）における活性化マーカーＣＤ６９の即時アップレギュレーションがもたらされた。さらに、ｉ．ｔ．免疫により、腫瘍及びＴｄＬＮのいずれでも様々な時点においてＮＫ細胞においてグランザイムＢの誘導がもたらされ、このことは、細胞傷害性ＮＫ細胞の機能増強を示している（図１９、３列目）。

【0316】

最後に、Ｋｉ６７発現を手段とするＮＫ細胞の増殖能を解析した。３日目、ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現は、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかで腫瘍内に処置されたマウスの腫瘍及びＴｄＬＮにおいて顕著に増加していた（図１９、最終列）。

【0317】

これらの結果は、４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡ－ＯＶＡ（すなわちＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ）が、ＭＶＡ－ＯＶＡと比較して、腫瘍内注射後にＮＫ細胞上での表面マーカーＣＤ６９、グランザイムＢ及びＫｉ６７の発現をさらに増加させたことを示している。これらの実験からはまた、腫瘍内免疫療法後のＴ細胞及びＮＫ細胞の抗腫瘍応答開始における流入領域リンパ節（ＴｄＬＮ）の重要な役割も明らかなる。

【0318】

本発明は、いかなる特定の作用機序にも拘束されないが、３日目のＴｄＬＮでのＴ細胞増殖、７日目の腫瘍内でのＴ細胞の浸潤遅延（図１７を参照のこと）は、腫瘍特異的Ｔ細胞がＴｄＬＮにおいてプライミングされて増殖し、その後、腫瘍に移行して腫瘍細胞を殺傷するというシナリオを支持することを物語っている。ウイルスベクターの腫瘍内注射はまた、ＴｄＬＮにおいて直接ＮＫ細胞活性化をもたらし、それにより、さらになるＤＣ活性化を誘導する可能性もある。

【0319】

実施例２８：腫瘍内ＭＶＡがん療法におけるＣＤ８ Ｔ細胞の役割
腫瘍及びＴｄＬＮにおけるＴ細胞応答の分析（例えば、図１７）により、腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置後の両部位における腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖が示された。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに媒介された抗腫瘍効果へのＴ細胞の寄与を調べるために実験を行った。これらの実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６．ＯＶＡメラノーマ細胞（５×１０^５細胞）を注射し、数回の処置のうちの１回の後、腫瘍増殖をモニタリングした。処置には、１００μｇのＣＤ８－Ｔ細胞枯渇抗体（「αＣＤ８」、クローン２．４３）またはアイソタイプコントロール抗体の存在下または非存在下での、ＰＢＳまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射を含めた。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの（ｉ．ｔ．）注射は、腫瘍が直径５ｍｍに達した時点で行われ、１週間以内に２回繰り返した。ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－ＢＢＬの初回注射の前日、マウスに、抗ＣＤ８抗体またはＩｇＧ２ｂ抗体のいずれかをｉ．ｐ．注射し、この処置を以降の２週間以内に４回繰り返した。図２０に示されているデータから、ＣＤ８ Ｔ細胞が、有効なＭＶＡ腫瘍療法に不可欠であったことが示される。勘案すると、これらのデータは、腫瘍及びＴｄＬＮにおける腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のＭＶＡ誘導性の活性化及び増殖が、腫瘍増殖制御にとって重要な事象であることを示している。

【0320】

実施例２９：ＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬに媒介される抗腫瘍効果のＢａｔｆ３＋ ＤＣ依存性
ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによって誘導される抗腫瘍免疫応答に寄与する基礎となる細胞体及び分子体を解明するため、様々な免疫細胞が果たす役割を調べた。強力に貪食を行って、適応免疫系の細胞に抗原及び共刺激シグナルを提示する能力を持つ樹状細胞（ＤＣ）は、抗腫瘍免疫における重要な因子とされている。ＣＤ８α＋ ＤＣ（「ｃＤＣ１」としても知られる）を含め、ＤＣの様々なサブタイプが、腫瘍に対する強力な免疫応答の活性化に関与することが示唆されている。このＤＣサブセットには、免疫応答の際に抗原を交差提示する特有の能力があり、ＣＤ８α＋ ＤＣは、感染（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５４４８－５５、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１１９－２９）及びがん（Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２６：６３８－５２）に応答してＩＬ－１２を産生する主要細胞である。ＣＤ８α＋ ＤＣはまた、腫瘍関連抗原の交差提示により抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞を強力に誘導する細胞でもある（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐａｕｌｅｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６：７１－７９、Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４：９２４－３８）。ＣＤ８α＋ ＤＣの発生は、転写因子Ｂａｔｆ３に極めて依存している（Ｈｉｌｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１０９７－１１００）。

【0321】

腫瘍内ＭＶＡがん療法にとってのこのＤＣサブセットの重要性を評価するために、野生型Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウス、及びＢａｔｆ３欠損（Ｂａｔｆ３－／－）Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスを使用した。図２１Ａは、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍が、交差提示するＤＣの非存在下（Ｂａｔｆ３－／－）で劇的に速く増殖したことを示しており、これは、腫瘍に対する免疫応答の誘導における、この抗原提示細胞（ＡＰＣ）サブセットの重要な役割を示している。これまでの実験と一致して、野生型マウスでは、ＭＶＡ－ＯＶＡの腫瘍内注射により腫瘍増殖遅延がもたらされ、症例の１例では、腫瘍の完全消失がもたらされた。この効果は、マウスにＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを注射した場合に改善されており、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬにより処置された５匹中３匹のマウスで腫瘍が拒絶された（図２１Ａ）。興味深いことに、交差提示しているＤＣの非存在下（Ｂａｔｆ３－／－）、腫瘍内ＭＶＡ免疫療法は、野生型群と比較してまったく損なわれなかった（図２１Ａ）。しかしながら、Ｂａｔｆ３－ＤＣは、４－１ＢＢＬにより誘導される抗腫瘍応答に関与すると思われる（図２１Ａ、下図）。

【0322】

初回免疫から１１日後の末梢血中ＣＤ８^＋Ｔリンパ球集団のフローサイトメトリー解析（図２１Ｂ）では、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫したＢａｔｆ３^－／－腫瘍担持マウスにおけるＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の出現頻度は、対応する野生型マウスと比較してわずかしか低下しなかったことが示された。本発明は、いかなる特定の作用機序にも拘束または依存しないが、これらのデータは、Ｂａｔｆ３依存性ＤＣが、ＭＶＡを用いる腫瘍内がん療法に重複した役割を果たすことを示唆している。

【0323】

実施例３０：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与に対するＮＫ細胞の役割
ＮＫ細胞は、４－１ＢＢを発現することが知られており、ＮＫ細胞上での４－１ＢＢの結合は、これらの細胞の増殖及び細胞傷害性の増大をもたらすことが示されている（Ｍｕｎｔａｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７３－８１）。前の実験（図１９を参照のこと）では、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射が、増殖増強と併せて、ＮＫ細胞上での活性化マーカーＣＤ６９及び細胞傷害性マーカーのグランザイムＢを強力にアップレギュレートすることが見出された。

【0324】

４－１ＢＢＬにより誘導される抗腫瘍免疫応答におけるＮＫ細胞の役割を調べるために、ＩＬ１５Ｒα^－／－マウスを使用した。ＩＬ－１５受容体アルファサブユニット（ＩＬ－１５Ｒα）は、ＮＫ細胞の発生に不可欠なことが示されている多機能サイトカインであるＩＬ－１５の高親和性結合を媒介する（Ｌｏｄｏｌｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：６６９－７６）。野生型のＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスと、ＩＬ１５Ｒα欠損（ＩＬ１５Ｒα^－／－）Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスを作製し、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかにより腫瘍内免疫した。ＭＶＡ－ＯＶＡで処置したマウスでは、ＩＬ－１５Ｒαの有無にかかわらず同程度の治療効果が示された（図２２Ａ）。興味深いことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを用いた場合に野生型マウスで観察された有益性（５匹中３匹のマウスで腫瘍拒絶）は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで処置したＩＬ１５Ｒα欠損腫瘍担持マウスでは完全に失われていた（５匹中１匹のマウスで腫瘍拒絶；図２２Ａを参照のこと）。これらの結果は、腫瘍接種後のマウスの生存率にも表れている（図２２Ｂ）。

【0325】

ＩＬ１５Ｒαの欠損は、マウスにおいて、ＮＫ細胞の発生に影響を及ぼすのみならず、Ｔ細胞のホメオスタシス及びＬＮへの移行も低減させ、ＣＤ８メモリーＴ細胞を選択的に減少させることが知られている（Ｌｏｄｏｌｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：６６９－７６）。したがって、これらの処置に対するＴ細胞応答も調べた。我々の先のデータと一致して、野生型動物において、ＭＶＡ－ＯＶＡによる腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫時にＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導され、これが、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによってさらに増大することが観察された（図２２Ｃ）。しかしながら、ＩＬ１５Ｒα^－／－マウスにおけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答は、野生型マウスで見られた応答と同等であった。

【0326】

本発明は、いかなる特定の作用機序または作用経路にも拘束されないが、これらの所見は、ＩＬ１５Ｒα^－／－腫瘍担持マウスで腫瘍特異的Ｔ細胞応答が開始され得ることを示しており、したがって、４－１ＢＢＬにより増強される、ＮＫ細胞活性化及び機能が、腫瘍内ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ処置の治療効果に寄与するという考えが支持される。

【0327】

実施例３１：ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによる腫瘍内免疫に応答したＮＫ細胞依存性サイトカイン／ケモカインプロファイル
ＮＫ細胞上の４－１ＢＢＬ－４－１ＢＢ相互作用によって選択的に誘導されたサイトカインを特定するため、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ＯＶＡもしくはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬで腫瘍内処置した野生型またはＩＬ１５Ｒα^－／－のＢ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスからの腫瘍組織において、サイトカイン及びケモカインを分析した。

【0328】

先の実験では、組み換えＭＶＡの腫瘍内注射から６時間後に、多数のサイトカイン及びケモカインが増加したことが示された（図１５及び図１６）。これらの実験では、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍の注射により、ＭＶＡ－ＯＶＡの注射と比較して、４－１ＢＢＬでの刺激時にＮＫ細胞により産生されることが知られているＩＦＮ－γ、ＣＣＬ３及びＣＣＬ５等の炎症誘発性のサイトカインまたはケモカインの顕著な産生増加が示された（図２３）。４－１ＢＢＬによって誘導されるこの増加は、ＩＬ１５Ｒα^－／－マウスでは完全に抑制されていたことから、ｒＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内注射が、注射から６時間後、ＮＫ細胞から発生する、腫瘍微小環境における別個のサイトカインプロファイル及びケモカインプロファイルを誘導することが示された。

【0329】

実施例３２：ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬと比較したＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫の抗腫瘍効果
Ｇｐ７０は、間質及び免疫細胞の組成の点で別個の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）をそれぞれ示す多くの同系腫瘍モデル（Ｂ１６．Ｆ１０、ＣＴ２６、ＭＣ３８、４Ｔ１、ＥＬ４等）で発現する自己腫瘍抗原である。この実施例では、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍内免疫において、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかに加えて腫瘍抗原ｇｐ７０をコードするＭＶＡの効力を試験した。

【0330】

Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍が約５０ｍｍ^３のサイズに達した時点で、マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌにより腫瘍内免疫した。結果は、図２４に示されている。

【0331】

ＭＶＡ－ｇｐ７０による免疫では、一過性の軽度の腫瘍増殖制御が誘導された。この抗腫瘍効果は、ウイルスがＣＤ４０Ｌを発現した場合に増強させることができた。しかしながら、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬによる腫瘍内免疫が最も強力な治療効果を生じ、５匹中２匹の処置動物において完全腫瘍消失をもたらした（図２４Ａ）。

【0332】

際だったことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬでの処置後に腫瘍が治癒したマウスでは、腫瘍があった局部の色素沈着の消失が示された（図２４Ｂ）。この色素脱失は、自己免疫病態の白斑を示すものであり、自己反応性Ｔ細胞によるメラニン細胞の破壊の結果である。このメラニン細胞の破壊は、組み換えＭＶＡによる免疫系の活性化が、ＭＶＡによりコードされるＴＡＡ（この実施例ではｇｐ７０）に限定されたものではないことを示唆している。むしろ、免疫系の活性化の他の抗原に対するこうした拡大（エピトープ拡大として知られる現象）は、より広範な免疫応答をもたらし、より優れた治療転帰を提供し得る。

【0333】

免疫によって誘導される抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、初回免疫から１１日後、血液を採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在について分析した。ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ならびにＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれで免疫した場合も、測定可能なｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞応答が誘導され、その範囲は１～２％であった（図２４Ｃ）。重要なことには、この応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを投与されたマウスにおいて著しく（５倍超）増大した。ｐ１５Ｅペプチドによる再刺激に対するこの抗原特異的Ｔ細胞応答は、異なる処置群における治療効果と相関した。

【0334】

実施例３３：ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの腫瘍内免疫の抗腫瘍効果
４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌと共に腫瘍抗原ｇｐ７０を発現する組み換えＭＶＡを作製し、Ｂ１６メラノーマモデルにおいて腫瘍内試験を行った。Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍が約５０ｍｍ^３に達した時点で、マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ、またはｇｐ７０を発現しない対応するＭＶＡコンストラクトにより腫瘍内免疫した。

【0335】

ＭＶＡ－ｇｐ７０による免疫では、一過性の顕著な腫瘍増殖制御が誘導された（図２５Ａ）。この抗腫瘍効果は、ウイルスがＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬを発現した場合に増強させることができた。しかしながら、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫が、最も強力な治療効果をもたらし、処置マウス５匹中４匹において完全腫瘍消失がもたらされた（図２５Ａ）。際だったことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌで処置した治癒マウス４匹中３匹で、腫瘍のあった場所の色素沈着消失が示され、上記実施例３２で考察したように、自己免疫病態の白斑を示している。

【0336】

加えて、初回免疫から１１日後、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞応答を血液中で測定した。ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ならびにＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬで免疫した場合に、測定可能な腫瘍特異的Ｔ細胞応答が誘導され、その範囲は１～２％であった。この応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを投与されたマウスにおいて劇的に（５倍超）増大した（図２５Ｂ）。

【0337】

勘案すると、Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマモデルでは、抗腫瘍効果は、ＭＶＡ－ｇｐ７０にＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬのいずれかをアジュバント添加した場合に増強させることができたが、さらに強力な作用が、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌにして４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌとを併せて発現させた場合に観察された。

【0338】

実施例３４：ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍における、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる腫瘍内免疫療法
その後、コンストラクトを、Ｔ細胞及び骨髄系細胞が豊富であることが報告され、免疫原性があるとされているＣＴ２６大腸癌モデルを用いて、試験した（例えば、Ｍｏｓｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．５：２９－４１を参照のこと）。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６．ｗｔ大腸癌細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３に達した時点で、マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌにより腫瘍内免疫した。

【0339】

ＭＶＡ－ｇｐ７０によるｉ．ｔ．免疫では、一過性の顕著な腫瘍増殖制御が誘導された。この抗腫瘍効果は、ＭＶＡがＣＤ４０Ｌを発現した場合には増強されなかったが、際だったことに、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬによる免疫では最も強力な治療効果が得られ、全処置動物で完全腫瘍消失がもたらされた（図２６Ａ）。しかしながら、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる処置では、より優れた治療効果は得られなかった。留意すべきことに、共刺激分子のみを含有し、ｇｐ７０を含有しないウイルスでも、大幅な腫瘍増殖遅延がもたらされたが、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬに匹敵する結果を得ることはできなかった。これらの所見は、処置マウスの全生存率に表れた（図２６Ｂ）。

【0340】

Ｈ２－Ｌｄ ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープＡＨ－１に対するＧｐ７０特異的Ｔ細胞応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌにより処置された動物の血液において容易に検出された（図２６Ｃ）。この応答は、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを投与されたマウスで劇的に（１０倍超）増大し、このことは、図２６Ａ及び２６Ｂに示されている治療効果と相関した。ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる処置ではまた、血液におけるＡＨ－１特異的Ｔ細胞応答も増強された（図２６Ｃ）。

【0341】

実施例３５：Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスへのＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬのＩＴ注射後の腫瘍微小環境及び腫瘍流入領域ＬＮの包括的分析
上記のデータから、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０ＬによるＢ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍内処置が、処置マウスの８０％に腫瘍拒絶をもたらすことが示された（図２６を参照のこと）。この腫瘍モデルの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）及びＴｄＬＮを調べるため、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスに、ＰＢＳ、または５×１０^７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬもしくはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかを腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与した。プライム免疫から３日後にマウスを屠殺した。３日目という選択は、その時点において自然免疫系成分及び適応免疫系成分の両方で変化が示された、ＯＶＡ系での先の実験に基づいた（図１７を参照のこと）。腫瘍及びＴｄＬＮを切除し、フローサイトメトリーを用いて単一細胞を解析するためにコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化した。免疫細胞集団の存在量、ならびにそれらの増殖挙動及び機能状態を評価した。

【0342】

４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡ及びＣＤ４０Ｌアジュバント添加ＭＶＡの腫瘍内注射では、ペンタマー染色によって測定した場合、３日目時点で、腫瘍内のＣＤ８ Ｔ細胞またはｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞の数においての有益性は得られなかった。しかしながら、ＴｄＬＮでは、ＭＶＡ－ｇｐ７０及びＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬによりＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を生じさせ、４－１ＢＢＬの付加により、さらに大きい効果を生じさせた（図２７、右上）。４－１ＢＢＬの付加により生じた増加は、ＴｄＬＮ内のｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞でさらに顕著であり、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌのいずれかによるｉ．ｔ．免疫では、腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が増加した（図２７、右中央）。ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数は、それらの細胞の増殖状態とも相関し、例えば、４－１ＢＢＬをｇｐ７０と併せて、また任意でＣＤ４０Ｌを加えてＭＶＡに付加することにより、最多数のＫｉ６７＋ ｇｐ７０－ｐ１５Ｅ ＣＤ８ Ｔ細胞がＴｄＬＮで誘導された（図２７、右下）。

【0343】

これらのデータは、ＭＶＡ－ｇｐ７０による腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫では、処置後３日目、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節における適応免疫応答の生成が増強されるが、４－１ＢＢＬ、または４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌによるアジュバント作用は、ＴｄＬＮにおけるｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を特異的に増大させることを示している。

【0344】

実施例３６：ＭＶＡの腫瘍内注射後の腫瘍及びＴｄＬＮにおけるＮＫ細胞の誘導
ＭＶＡ－ＯＶＡの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により、１日目及び３日目にそれぞれ、ＮＫ細胞の活性化及び増殖が生じた（図１９）。次いで、様々なＭＶＡコンストラクトの注射後３日目の、ＮＫ細胞の浸潤、活性化及び増殖を調べた。組み換えＭＶＡによるｉ．ｔ．免疫後のＮＫ細胞の定量から、腫瘍（図２８、左上）及びＴｄＬＮ（図２８、右上）に浸潤しているＮＫ細胞の増加が示された。ＭＶＡが４－１ＢＢＬをコードした場合（例えば、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ及びＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ）に浸潤が増加した。ＭＶＡ－ｇｐ７０の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により、腫瘍（図２８、左中央を参照のこと）及びＴｄＬＮ（図２８、右中央）においてＮＫ細胞（Ｋｉ６７＋）の増殖が誘導され、４－１ＢＢＬ、または４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌによるアジュバント作用により、ＴｄＬＮにおいてこの作用が増強された。

【0345】

グランザイムＢは、ＮＫ細胞の細胞傷害性のマーカーである（例えば、Ｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１５：３１５－２２を参照のこと）。グランザイムＢ＋ ＮＫ細胞は、組み換えＭＶＡによる腫瘍内注射に続いて腫瘍及びＴｄＬＮにおいて誘導された（図２８、左下）。この実施例でも、組み換えＭＶＡへの４－１ＢＢＬまたは４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの付加は、ＴｄＬＮにおける細胞傷害性ＮＫ細胞の数をわずかに増加させた（図２８、右下）。

【0346】

勘案すると、これらのデータは、腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫療法後のＮＫ細胞及びＴＡＡ特異的Ｔ細胞の増殖及び機能における、ＭＶＡがコードする４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの重要な役割を強調している。したがって、ｇｐ７０及び４－１ＢＢＬ、またはｇｐ７０、４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡによる腫瘍内処置により、ｇｐ７０等の内在性レトロウイルス自己抗原に対するＴ細胞応答を増強することができる。

【0347】

実施例３７：ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおける、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる静脈内免疫療法
上述の実験では、腫瘍抗原ｇｐ７０を共刺激分子４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌと共にコードする新規ＭＶＡコンストラクトが、腫瘍内に適用した場合に非常に強力であったことが示された（図２５及び２６）。加えて、Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（（２０１３）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２５１）は、ＭＶＡにコードされたＣＤ４０Ｌが、静脈内に投与された場合に自然免疫応答及び適応免疫応答を増強することを見出した。この実施例では、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによる静脈内（ｉ．ｖ．）免疫でも、腫瘍増殖制御が得られるかを問うた。

【0348】

ＣＴ２６．ＷＴ大腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３に達した時点で、マウスをＰＢＳ、またはＭＶＡ－Ｇｐ７０、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ７０不含）で静脈内免疫した。ＭＶＡ－ｇｐ７０によるｉ．ｖ．免疫では、動物５匹中２匹で腫瘍消失がもたらされた（図２９Ａ）。４－１ＢＢＬまたはＣＤ４０Ｌのいずれかを含有するｇｐ７０発現ウイルスにより処置したマウスでは、抗腫瘍応答の著しい改善が示され、それぞれ、治癒マウスは５匹中３匹、及び５匹中４匹という結果であった。重要なことには、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌによるｉ．ｖ．処置により、全処置マウスで腫瘍増殖制御の延長がもたらされ、５匹中３匹のマウスで腫瘍が拒絶された（図２９Ａ）。留意すべきことに、共刺激分子のみを含有し、ｇｐ７０は含有しない組み換えＭＶＡでも、顕著な腫瘍増殖遅延がもたらされたが、ＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌの場合に観察されたような腫瘍拒絶には至らなかった（図２９Ａ）。これらの所見は、処置マウスの全生存率に表れた（図２９Ｂ）。

【0349】

ＰＢＬのペプチド再刺激による、血液中の腫瘍指向性ＣＤ８ Ｔ細胞応答の解析から、ＭＶＡ処置全群でのＡＨ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の顕著な誘導、それにより、この誘導がＣＤ４０Ｌの存在下（すなわち、ＭＶＡ－ｇｐ７０－ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ－ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ）でさらに増大し得ることが明らかになった（図２９Ｃ）。

【0350】

実施例３８：ＨＥＲＶ－Ｋ抗原を含む組み換えＭＶＡ
ヒト内在性レトロウイルスＫスーパーファミリータンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ）、具体的には、ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇであるＴＡＡを含む、ＭＶＡ系ベクター（「ＭＶＡ－ｍＢＮ４８９」、「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ１－４－１－ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ」ともいう）が設計された。ＭＶＡはまた、ヒトのＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードするよう、またｈ４－１ＢＢＬ及びｈＣＤ４０Ｌを発現するようにも設計された。

【0351】

同様の「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ１－４－１－ＢＢＬ」と呼ばれるＭＶＡ系ベクターは、ＴＡＡ ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇならびにヒトのＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥを発現するよう、またｈ４－１ＢＢＬを発現するよう設計された。具体的には、ベクター「ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ」（「ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４」または「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ」）は、図３０Ａに概略的に例示されている。エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質及び群特異抗原（ｇａｇ）タンパク質をコードするＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子は通常、健全なヒト組織では休眠状態であるが、多くの腫瘍で活性化されている。ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥは、乳癌及び卵巣癌の細胞において特異的にアップレギュレートされる遺伝子である。共刺激分子４－１－ＢＢＬの追加発現は、ＴＡＡに対する免疫応答を増強させることを意図している。

【0352】

「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ－ＣＤ４０Ｌと呼ばれる別のＭＶＡ系ベクターは、ＴＡＡ ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇならびにヒトのＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥを発現するよう、またｈＣＤ４０Ｌを発現するよう設計された。これらのコンストラクトの各々は、本発明の方法において有用である。

【0353】

例示的配列は当該技術分野で既知であり、また提供されている配列表にも記載されている。関連するＭＶＡに対して必要な機能を提供する限り、どの配列も本発明の組成物及び方法に使用することができる。

【0354】

上記のＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ及びｇａｇの配列では、少なくとも１０の代表的配列からアミノ酸コンセンサス配列が生成され、以下に示すように、潜在的な免疫抑制ドメインが変異により不活性化され、部分的に免疫優勢Ｔ細胞エピトープＨＥＲＶ－Ｋ－ｍｅｌに置き換えられた。好適な配列は、配列番号５（ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ合成タンパク質コンセンサス配列）、配列番号６（ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ合成ヌクレオチド配列）、配列番号７（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ合成タンパク質配列）、及び配列番号８（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬヌクレオチド配列）に記載されている。

【化1】

【0355】

これらのＭＶＡのうちいくつかでは、ｈＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥは、融合タンパク質として産生されるよう設計された。ＦＯＬＲ１（葉酸受容体アルファ）は、葉酸受容体のファミリーに属する。これは、葉酸及びその誘導体に対する高親和性を有し、膜タンパク質として分泌されるかまたは細胞表面に発現される。膜貫通タンパク質は、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーを介して原形質膜に係留されており、タンパク質のＣ末端領域のセリン（Ｓｅｒ）残基を介して小胞体（ＥＲ）内で結合している可能性が高い。ＧＰＩ－アンカーによるＦＯＬＲ１の修飾と、ＥＲでのｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質の完全なプロセシングを回避するため、アミノ酸２３４～２５７のＣ末端領域（Ｓｅｒ残基を含む）を欠失させた。

【0356】

ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優先発現抗原）は、転写調節因子タンパク質である。これは、ヒトメラノーマの抗原として最初に報告され、自己細胞傷害性のＴ細胞媒介性免疫応答を引き起こし、様々な固形がん及び血液がんで発現する。ＰＲＡＭＥは、レチノイン酸受容体への結合を介してレチノイン酸シグナル伝達を阻害し、それにより、がん細胞に増殖優位性を提供し得る。ＰＲＡＭＥの機能性には核局在化を必要とするため、ＰＲＡＭＥの潜在的な核局在化シグナル（ＮＬＳ）を、ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質の標的変異によって改変した。

【0357】

したがって、ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質のアミノ酸配列では、ＦＯＬＲ１を、Ｃ末端のＧＰＩアンカーシグナルを欠失させることにより改変し、ＰＲＡＭＥでは、２つの潜在的な核局在化シグナルをアミノ酸置換により不活性化させた。この融合タンパク質では、ｈＦＯＬＲ１のＮ末端シグナル配列は、ＰＲＡＭＥの核局在化を回避するための追加的保護機構として働くよう、融合タンパク質のＥＲ指向性及び不完全プロセシングをもたらすはずである。

【0358】

ヒトＦＯＬＲ１及びヒトＰＲＡＭＥのタンパク質配列はそれぞれ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００７９３．１及びＮＰ＿００１２７８６４４．１に基づいた。上記の改変に加え、融合タンパク質のヌクレオチド配列をヒトのコドン使用について最適化し、ポリヌクレオチド区間、反復エレメント、及び負のシス作用エレメントを除去した。なお、ヌクレオチド配列は、配列番号１０（「ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合」ヌクレオチド配列）に記載され、融合タンパク質配列は、配列番号９に記載されている。

【化2】

【0359】

このＭＶＡに使用した膜結合型ヒト４－１ＢＢＬのタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１と１００％の同一性を示し、使用された膜結合型ヒトＣＤ４０Ｌのタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１と１００％の同一性を示す。４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌいずれの場合も、ヌクレオチド配列をヒトのコドン使用について最適化し、ポリヌクレオチド区間、反復エレメント、及び負のシス作用エレメントを除去した。

【0360】

ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１．からのｈＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列は配列番号１に記載されており、ｈＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列は配列番号２に記載されている。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬのアミノ酸配列は配列番号３に記載されており、ｈ４－１ＢＢＬのヌクレオチド配列は配列番号４に記載されている。

【0361】

各コード領域は、ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ及びｈ４－１ＢＢＬがいずれもＰｒ１３２８プロモーターの制御下に置かれた以外は、異なるプロモーターの制御下に置かれた。Ｐｒ１３２８プロモーター（１００ｂｐの長さ）は、ワクシニアウイルスプロモーターＰｒＢ２Ｒの正確なホモログである。これは、前初期の強い発現及び後期の低レベルでの発現を誘導する。組み換えＭＶＡ－ｍＢＮ４８９では、Ｐｒ１３．５長プロモーターがＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬの発現を誘導する。このプロモーターは、天然ＭＶＡ１３．５Ｌ遺伝子の発現を誘導する０１４Ｌ／１３．５Ｌ間の１２４ｂｐの遺伝子間領域を含み、２つの初期プロモーターコア配列によって生じる非常に強い初期発現を示す（Ｗｅｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ７３５１１を参照のこと）。ここでｈＣＤ４０Ｌの発現を誘導するために用いたＭＶＡ１－４０ｋプロモーターは、ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｈ領域から１６１ｂｐの断片として１９８６年に最初に単離された。これは、１５８ｂｐのワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ、及び後期遺伝子転写因子ＶＬＴＦ－４を誘導する０９４Ｌ／０９５Ｒの遺伝子間領域内のＭＶＡゲノムを含む。ここでｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質の発現を誘導するために用いたプロモーターＰｒＨ５ｍは、ワクシニアウイルスＨ５遺伝子プロモーターの改変型である。これは、強い初期及び後期エレメントからなり、組み換えＭＶＡの感染の初期及び後期の両段階における発現をもたらす（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｖａｃｃｉｎｅ １４：１４５１－５８を参照のこと）。

【0362】

ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４に基づいて（上記を参照のこと）、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬに改変が含有されるよう、さらに別のベクターが設計された。得られたベクターは「ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２」と呼ばれ、図３１Ｃに概略的に例示されている。ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２はまた、改変ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬに加え、ＥＲＶＫ－ｇａｇ、ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質、及びｈ４－１ＢＢＬもコードする。

【0363】

本来、ＨＥＲＶＫ－ｅｎｖは、翻訳後に切断されるシグナルペプチド、表面（ＳＵ）及び膜貫通ユニット（ＴＭ）からなる。２つのドメインへの切断は、細胞のプロテアーゼにより達成される。ＲＳＫＲ切断モチーフは、全長９０ｋＤａのタンパク質を切断してＳＵ（およそ６０ｋＤａ）ドメインとＴＭ（およそ４０ｋＤａ）ドメインにするのに必要かつ十分である。上記のＭＶＡ－ｍＢＮ４９４の調製についての記載のように、少なくとも１０の代表的配列に由来するｅｎｖのアミノ酸コンセンサス配列が生成され、ＴＭの潜在的な免疫抑制ドメインが変異によって不活性化された。導入された変異により、免疫抑制ドメインのかなりの部分が免疫優勢Ｔ細胞エピトープＨＥＲＶ－Ｋ－ｍｅｌに置き換えられた。この導入遺伝子（ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４に使用）をＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬと命名した（図３１Ａ）。
ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４と比較して、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬのＴＭドメインは、ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２では欠失している。このＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬバリアントを「ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３」と呼ぶことにし、欠失させたＲＳＫＲフューリン切断部位を除くＳＵドメイン全体で構成されている。ＭＥＬペプチドをＣ末端に挿入し、続けてＴＭドメインの６つのアミノ酸（疎水性の強い融合ペプチド配列を除外）を挿入した。さらに、この改変ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬを、ヒトＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）受容体に由来する膜アンカーを付加することにより原形質膜に指向させた。この膜アンカーを、可動性のグリシン含有リンカーを介してＳＵドメインに結合させた（図３１Ｂ）。得られたＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬバリアント、すなわち、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３は、ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２に含有されている（図３１Ｃ）。バリアントの好適な配列は、配列番号１１（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３合成タンパク質配列）及び配列番号１２（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３ヌクレオチド配列）に記載されている。

【0364】

実施例３９：ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ（ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ）の生物活性
ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ（すなわち、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ；上記実施例３８も参照のこと）による感染が、ヒト細胞でのＨＬＡ分子によるワクチン由来腫瘍抗原の提示をもたらすかどうかを調べた。このために、抗原提示細胞上のＨＬＡ－ＡＢＣペプチド複合体を免疫沈降させ、質量分析法により同定することができるのはどちらのＨＬＡ結合ペプチドなのかを分析した。

【0365】

抗原はＨＬＡクラスＩに搭載され得るため（Ｎｙａｍｂｕｒａ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６）、まず、ヒト単核球細胞株ＴＨＰ－１を、抗原提示能を示すマクロファージに分化させた（Ｄａｉｇｎｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０）。事実、ＴＨＰ－１細胞は、米国及びヨーロッパで最も頻度が高いハプロタイプの１つである（母集団の約３０％）ＨＬＡ－Ａ＊０２０１^＋を発現する。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇとは別に、ＴＨＰ－１細胞は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５及びＨＬＡ－Ｃ＊０３を発現するという報告があった（Ｂａｔｔｌｅ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）。ここでは、８×１０^５／ｍｌのＴＨＰ－１細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート）の存在下で３日間培養してから培地を交換し、細胞を、ＰＭＡの非存在下でさらに２日間培養した。５日目、細胞に、４のＩｎｆＵ（感染単位）のＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴを１２時間感染させた。図３０Ｂに示されるように、ＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ、ＨＥＲＶＫ－ｇａｇ及び融合タンパク質ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥは、ＴＨＰ－１細胞のＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ感染後に発現された（図３０Ｂの「ｍＢＮ４９４」）。対照的に、非感染ＴＨＰ－１細胞では抗原は内因性発現されなかった（図３０Ｂの「ｃｔｒ」）。

【0366】

次に、「ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ」ＨＬＡ－ＡＢＣリガンドーム分析（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を実施した。ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ感染細胞では、４つの腫瘍抗原由来ペプチド、すなわち、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖペプチドＩＬＴＥＶＬＫＧＶ、ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇペプチドＹＬＳＦＩＫＩＬＬ及びＰＲＡＭＥペプチドのＡＬＱＳＬＬＱＨＬ及びＳＬＬＱＨＬＩＧＬが同定された。同定された２つのＰＲＡＭＥペプチドは大部分が重複しており、共通のコアエピトープを共有している可能性が高い。どちらのペプチドも、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に非常に強く結合することが予測されているため、ＡＬＱＳＬＬＱＨＬは、結合順位がＨＬＡ－Ｂ＊１５とほぼ同様である。注目すべきことに、ＰＲＡＭＥペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬは、ヒトにおいて、免疫原性ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に提示される細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープとしてすでに報告されている（Ｋｅｓｓｌｅｒ ＪＨ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，２００１）。勘案すると、データから、ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴにより発現された抗原は、感染細胞のＨＬＡに取り込まれ得ることが示されている。

【0367】

さらに、ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴが、４－１－ＢＢＬを、その受容体である４－１－ＢＢに結合する機能性形態で発現する能力について試験した。その目的のため、市販キット（「４－１ＢＢ Ｂｉｏａｓｓａｙ」、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。アッセイは、ｈ４－１－ＢＢを発現している遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株、及び４－１－ＢＢリガンド刺激に応答することができる応答エレメント（ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターからなる。ｈ４－１－ＢＢがｈ４－１－ＢＢＬによって刺激されると、ＲＥは、細胞内部での細胞ルシフェラーゼ産生を活性化させる。細胞を溶解させ、「Ｂｉｏ－Ｇｌｏ」試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した後、ルミノメーターを使用して発光を測定し、定量する。簡潔に述べると、ＨｅＬａ細胞を播種し（１×１０^６）、それぞれに、図３０Ｃに示すＭＶＡに基づくコンストラクトを感染させ（ＴＣＩＤ_５０＝２）、一晩（３７℃、５％ＣＯ_２）培養した後、Ｊｕｒｋａｔ－ｈ４－１－ＢＢ細胞と共に（ＨｅＬａ：Ｊｕｒｋａｔ＝４：１の比）６時間共培養した。Ｆｃと架橋させたＨｉｓタグ付きｈ４－１ＢＢＬを参照（陽性コントロール）として使用し、１μｇ／ｍｌの架橋ｈ４－１ＢＢｌと共に培養したＪｕｒｋａｔ－ｈ４－１ＢＢ細胞によるルシフェラーゼ発現を１に設定した（図３０Ｃ、点線）。ＭＶＡ－ＢＮ（すなわち、ｈ４－１－ＢＢＬをコードしない）を骨格コントロールとして使用した。図３０Ｃに示されるように、ｈ４－１－ＢＢＬを発現しているＭＶＡに基づくベクターで感染させたＨｅＬａ細胞では、参照と比較して（共培養Ｊｕｒｋａｔ－ｈ４－１－ＢＢ細胞により）６倍高いルシフェラーゼ産生が誘導された。注目すべきことに、ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴにより媒介されたルシフェラーゼ産生は、ＭＶＡベクターを発現している他の２つのｈ４－１－ＢＢＬにより媒介されたものよりもさらに高かった。したがって、ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４は、自身の４－１ＢＢ受容体に効果的に結合する機能性ｈ４－１－ＢＢＬを発現する。

【0368】

実施例４０：ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードするＭＶＡによる腫瘍内免疫
極めて弱毒化された非複製ワクシニアウイルスＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、様々ながんに対して特異的かつ強い免疫応答を誘発させるために４つのヒト導入遺伝子からなるよう設計されている。ベクターは、ｂｒａｃｈｙｕｒｙヒトＴＡＡ、ならびに３つのヒト共刺激分子、すなわち、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても知られる）、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５４としても知られる）及び白血球機能関連抗原－３（ＬＦＡ－３、ＣＤ５８としても知られる）を共発現する。３つの共刺激分子（すなわち、ＴＲＩａｄ ｏｆ ＣＯｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（共刺激分子の三連構造）（ＴＲＩＣＯＭ（商標））は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙヒトＴＡＡに対する免疫応答を最大限にするために含まれている。

【0369】

Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、Ｔ－ｂｏｘファミリー内の転写因子であり、がんの進行と関連する過程であるＥＭＴのドライバーである。正常組織と比較して、がん細胞で過剰発現し、いくつかの治療法に対する、がん細胞の抵抗性、及び転移能と関連付けられている。ｂｒａｃｈｙｕｒｙを発現することが知られているがんとしては、肺癌、乳癌、卵巣癌、脊索腫、前立腺癌、結腸直腸癌及び膵臓腺癌が挙げられる。

【0370】

ｂｒａｃｈｙｕｒｙをコードするＭＶＡの安全性及び潜在的な治療効果を示すために、インビトロ試験及び臨床試験が行われた。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ４：１７７７－９０（“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｖｉａ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ｙｅａｓｔ ｖａｃｃｉｎｅ”）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５ａ）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ３：１３２（“Ｐｈａｓｅ Ｉ，ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＭＶＡ－ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ＴＲＩＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”）、Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５ｂ）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：１２４８－５６（“Ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｙｅａｓｔ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ（ＧＩ－６３０１）ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｒａｃｈｙｕｒｙ”））を参照のこと。

【0371】

ＧＬＰ準拠の反復投与毒性試験を実施して、第１相臨床開発段階での静脈内経路の使用の裏付けとなる、ＮＨＰ（カニクイザル）にけるＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ＭＶＡ－ｍＢＮ２４０Ｂ）の潜在的な毒性を評価する。毒性試験には、ＮＨＰにおけるＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの空間的及び時間的分布を評価する生体内分布パートが含まれる。

【0372】

ＭＶＡ－ＢＮ－Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、第ＩＩＩ相試験で使用され、その際、がん患者は、任意に、例えば、放射線及び／またはチェックポイント阻害剤等の別の治療と組み合わせた、ＭＶＡの腫瘍内注射により治療される。

【0373】

本明細書に記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載されている発明の趣旨から逸脱せずに変更または修正してよいことは明らかであろう。以下の特許請求の範囲及び趣旨の範囲内となるような修正または変更のすべてを特許請求する。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．がん性腫瘍を有する対象において腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に対し腫瘍内に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記腫瘍内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射と比較して、前記対象の前記がん性腫瘍での炎症応答が増強され、腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、前記方法。
２．がん性腫瘍を有する対象において腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に対し静脈内に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記静脈内投与により、ＴＡＡ及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内注射と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答が増強され、前記ＴＡＡに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が増強される、前記方法。
３．がん性腫瘍を有する対象において腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記投与により、組み換えＭＶＡ及び４－１ＢＢＬ抗原の単独での投与と比較して、前記対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、前記方法。
４．対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法であって、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に対し腫瘍内に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記腫瘍内投与により、異種の腫瘍関連抗原及び４－１ＢＢＬ抗原をコードする第１及び第２の核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比較して、前記腫瘍での炎症応答増強を生じさせる、前記方法。
５．がん性腫瘍を有する対象において腫瘍サイズを縮小する、及び／または生存率を上昇させる方法であって、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記投与により、組み換えＭＶＡ及び４－１ＢＢＬ抗原の単独での投与と比較して、前記対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、前記方法。
６．がん性腫瘍を有する対象において腫瘍サイズを縮小させるため、及び／または生存率を上昇させるための方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬをコードする第２の核酸と、ＣＤ４０Ｌをコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記投与により、組み換えＭＶＡ、４－１ＢＢＬ抗原、及びＣＤ４０Ｌ抗原の単独での投与と比較して、前記対象の腫瘍縮小が増大し、及び／または全生存率が上昇する、前記方法。
７．対象のがん性腫瘍での炎症応答増強を誘導する方法であって、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を前記対象に対し腫瘍内に投与することを含み、前記組み換えＭＶＡの前記腫瘍内投与により、異種の腫瘍関連抗原をコードする第１の核酸と、４－１ＢＢＬ抗原をコードする第２の核酸と、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする第３の核酸とを含む組み換えＭＶＡウイルスの非腫瘍内注射によって生じる炎症応答と比較して、前記腫瘍での炎症応答増強を生じさせる、前記方法。
８．（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
（ｃ）ＴＡＡをコードする少なくとも１つのさらなる核酸と、
を含む、組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
９．（ｄ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸をさらに含む、前記８に記載の組み換えＭＶＡ。
１０．それぞれが異なるＴＡＡをコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の核酸を含む、前記８または９に記載の組み換えＭＶＡ。
１１．前記ＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）ペプチド、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ｐ１５、ＡＨ１Ａ５、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、及びＭＥＬ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記８～１０のいずれかに記載の組み換えＭＶＡ。
１２．前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ）タンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択される、前記１１に記載の組み換えＭＶＡ。
１３．前記ＥＲＶペプチドが、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリーに由来し、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ）の偽遺伝子から選択される、前記１２に記載の組み換えＭＶＡ。
１４．（ｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする核酸と、
（ｉｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇをコードする核酸と、
（ｉｉｉ）ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードし、好ましくは、融合タンパク質として発現される核酸と、
（ｉｖ）４－１ＢＢＬをコードする核酸と、
を含む、組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
１５．（ｖ）ＣＤ４０Ｌをコードする核酸をさらに含む、前記１４に記載の組み換えＭＶＡ。
１６．前記組み換えＭＶＡがＭＶＡ－ＢＮに由来する、前記８～１５のいずれかに記載の組み換えＭＶＡ。
１７．前記８～１６のいずれかに記載の組み換えＭＶＡを含む、医薬調製物または医薬組成物。
１８．腫瘍内及び／または静脈内の投与、好ましくは腫瘍内投与に適応している、前記１７に記載の医薬調製物または医薬組成物。
１９．医薬品またはワクチンとしての使用のための、前記８～１６のいずれかに記載の組み換えＭＶＡ。
２０．がん、好ましくは、メラノーマ、乳癌、結腸癌、または卵巣癌の治療での使用のための、前記８～１６のいずれかに記載の組み換えＭＶＡ。
２１．がん性腫瘍での炎症応答の増強、がん性腫瘍のサイズの縮小、がん性腫瘍の増殖の遅延もしくは停止、及び／または対象、好ましくはヒトの全生存率の上昇に用いるための、前記８～１６のいずれかに記載の組み換えＭＶＡ。
２２．前記組み換えＭＶＡが、腫瘍内及び／または静脈内に、好ましくは腫瘍内に投与される、前記１９～２１のいずれかに記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
２３．前記組み換えＭＶＡが、ＴＡＡ特異的抗体と組み合わせて用いられる、前記１９～２２のいずれかに記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
２４．前記組み換えＭＶＡが、免疫チェックポイント分子アンタゴニストまたは免疫チェックポイント分子アゴニストのいずれかと組み合わせて用いられる、前記１９～２２のいずれかに記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
２５．前記組み換えＭＶＡが、前記８～１６のいずれかに記載されている、前記１～７のいずれかに記載の方法。

【0374】

配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列及びアミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基については標準的な略号を、またアミノ酸については１文字表記または３文字表記のいずれかを用いて示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、表示されている鎖へのいかなる言及によっても、その相補鎖が含まれると理解される。

【0375】

配列表中の配列：
配列番号１：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列（２６１アミノ酸）
配列番号２：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌ（７９２ヌクレオチド）
配列番号３：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬ（２５４アミノ酸）
配列番号４：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬ
配列番号５：ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ（６６６アミノ酸）の合成コンセンサス配列
配列番号６：ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ；ヌクレオチド配列
配列番号７：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ（６９９アミノ酸）の合成配列
配列番号８：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬのヌクレオチド配列
配列番号９：ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）
配列番号１０：ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）のヌクレオチド配列
配列番号１１：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３（５１７アミノ酸）の合成配列
配列番号１２：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３のヌクレオチド配列

【0376】

配列番号１
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌ（２６１アミノ酸）
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ

【0377】

配列番号２
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌ（７９２ヌクレオチド）
ヌクレオチド配列：
ａｔｇａｔｃｇａｇａｃａｔａｃａａｃｃａｇａｃａａｇｃｃｃｔａｇａａｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｇａｃｔｇｃｃｔａｔｃａｇｃａｔｇａａｇａｔｃｔｔｃａｔｇｔａｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇａｔｃａｃｃｃａｇａｔｇａｔｃｇｇｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｇａｃｇｇｃｔｇｇａｃａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｇａｇａｇａａａｃｃｔｇｃａｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｔｇｔｔｃａｔｇａａｇａｃｃａｔｃｃａｇｃｇｇｔｇｃａａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａｇａａｇｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｇｃｇａｇｇａａａｔｃａａｇａｇｃｃａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｔｔｃｇｔｇａａｇｇａｃａｔｃａｔｇｃｔｇａａｃａａａｇａｇｇａａａｃｇａａｇａａａｇａｇａａｃｔｃｃｔｔｃｇａｇａｔｇｃａｇａａｇｇｇｃｇａｃｃａｇａａｔｃｃｔｃａｇａｔｃｇｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｇａｔｃａｇｃｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｃａａｃａａｇｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｇｇｇｃｃｇａｇａａｇｇｇｃｔａｃｔａｃａｃｃａｔｇａｇｃａａｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｔｇｇａｇａａｃｇｇｃａａｇｃａｇｃｔｇａｃａｇｔｇａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｔａｃｔａｃａｔｃｔａｃｇｃｃｃａａｇｔｇａｃｃｔｔｃｔｇｃａｇｃａａｃａｇａｇａｇｇｃｃａｇｃｔｃｔｃａｇｇｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇａａｇｔｃｔｃｃｔｇｇｃａｇａｔｔｃｇａｇｃｇｇａｔｔｃｔｇｃｔｇａｇａｇｃｃｇｃｃａａｃａｃａｃａｃａｇｃａｇｃｇｃｃａａａｃｃｔｔｇｔｇｇｃｃａｇｃａｇｔｃｔａｔｔｃａｃｃｔｃｇｇｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｃａａｇｃｇｔｇｔｔｃｇｔｇａａｔｇｔｇａｃａｇａｃｃｃｔａｇｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃａｃｇｇｃａｃｃｇｇｃｔｔｔａｃａｔｃｔｔｔｃｇｇａｃｔｇｃｔｇａａｇｃｔｇｔｇａｔｇａｔａｇ

【0378】

配列番号３
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１．からのｈ４－１ＢＢＬ（２５４アミノ酸）
ＭＥＹＡＳＤＡＳＬＤＰＥＡＰＷＰＰＡＰＲＡＲＡＣＲＶＬＰＷＡＬＶＡＧＬＬＬＬＬＬＬＡＡＡＣＡＶＦＬＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ

【0379】

配列番号４
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１．からのｈ４－１ＢＢＬ
ヌクレオチド配列：
ａｔｇｇａａｔａｃｇｃｃａｇｃｇａｃｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｃｔｃｃｔｔｇｇｃｃｔｃｃａｇｃｔｃｃｔａｇａｇｃｃａｇｇｇｃｔｔｇｔａｇａｇｔｇｃｔｇｃｃｔｔｇｇｇｃｔｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｔｇｃｔｔｃｔｇｔｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｇｃｇｃａｇｔｇｔｔｔｃｔｔｇｃｔｔｇｔｃｃａｔｇｇｇｃｔｇｔｇｔｃａｇｇａｇｃｃａｇａｇｃａｔｃｔｃｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｃｇｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａｃｔｇａｇａｇａｇｇｇａｃｃｔｇａａｃｔｇａｇｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｃｔｇｃｔｃｇａｃｃｔｇａｇａｃａｇｇｇｃａｔｇｔｔｔｇｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｇｃｃｃａｇａａｔｇｔｇｃｔｇｃｔｇａｔｔｇａｔｇｇｃｃｃｔｃｔｇａｇｃｔｇｇｔａｃａｇｃｇａｔｃｃｔｇｇａｃｔｔｇｃｔｇｇｃｇｔｔａｇｃｃｔｇａｃｔｇｇａｇｇｃｃｔｇａｇｃｔａｃａａｇｇａｇｇａｃａｃｃａａａｇａａｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃａａｇｇｃｔｇｇｃｇｔｇｔａｃｔａｃｇｔｇｔｔｃｔｔｔｃａｇｃｔｇｇａａｃｔｇｃｇｇａｇａｇｔｇｇｔｇｇｃａｇｇｃｇａａｇｇａｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｇｃａｔｃｔｇｃａｇｃｃｔｃｔｇａｇａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇａｃａｇｔｔｇａｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｃｇａａｇｃｃａｇａａａｃａｇｃｇｃｃｔｔｔｇｇｃｔｔｃｃａａｇｇｃａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｇａｇａｃｔｇｇｇａｇｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃａｃａｇａａｇｃａａｇａｇｃａａｇａｃａｃｇｃｃｔｇｇｃａｇｃｔｔａｃａｃａａｇｇｃｇｃｔａｃａｇｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｔｔｃａｇａｇｔｇａｃａｃｃｔｇａｇａｔｔｃｃａｇｃｔｇｇｃｔｔｇｃｃａｔｃｔｃｃｔｃｇｃａｇｃｇａｇｔａａｔｇａ

【0380】

配列番号５
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ（６９９アミノ酸）
ＭＮＰＳＥＭＱＲＫＡＰＰＲＲＲＲＨＲＮＲＡＰＬＴＨＫＭＮＫＭＶＴＳＥＥＱＭＫＬＰＳＴＫＫＡＥＰＰＴＷＡＱＬＫＫＬＴＱＬＡＴＫＹＬＥＮＴＫＶＴＱＴＰＥＳＭＬＬＡＡＬＭＩＶＳＭＶＶＳＬＰＭＰＡＧＡＡＡＡＮＹＴＹＷＡＹＶＰＦＰＰＭＩＲＡＶＴＷＭＤＮＰＩＥＶＹＶＮＤＳＶＷＶＰＧＰＩＤＤＲＣＰＡＫＰＥＥＥＧＭＭＩＮＩＳＩＧＹＲＹＰＰＩＣＬＧＲＡＰＧＣＬＭＰＡＶＱＮＷＬＶＥＶＰＴＶＳＰＩＳＲＦＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬＲＰＲＶＮＹＬＱＤＦＳＹＱＲＳＬＫＦＲＰＫＧＫＰＣＰＫＥＩＰＫＥＳＫＮＴＥＶＬＶＷＥＥＣＶＡＮＳＡＶＩＬＱＮＮＥＦＧＴＩＩＤＷＡＰＲＧＱＦＹＨＮＣＳＧＱＴＱＳＣＰＳＡＱＶＳＰＡＶＤＳＤＬＴＥＳＬＤＫＨＫＨＫＫＬＱＳＦＹＰＷＥＷＧＥＫＧＩＳＴＰＲＰＫＩＩＳＰＶＳＧＰＥＨＰＥＬＷＲＬＴＶＡＳＨＨＩＲＩＷＳＧＮＱＴＬＥＴＲＤＲＫＰＦＹＴＶＤＬＮＳＳＬＴＶＰＬＱＳＣＶＫＰＰＹＭＬＶＶＧＮＩＶＩＫＰＤＳＱＴＩＴＣＥＮＣＲＬＬＴＣＩＤＳＴＦＮＷＱＨＲＩＬＬＶＲＡＲＥＧＶＷＩＰＶＳＭＤＲＰＷＥＡＳＰＳＶＨＩＬＴＥＶＬＫＧＶＬＮＲＳＫＲＦＩＦＴＬＩＡＶＩＭＧＬＩＡＶＴＡＴＡＡＶＡＧＶＡＬＨＳＳＶＱＳＶＮＦＶＮＤＷＱＫＮＳＴＲＬＷＮＳＱＳＳＩＤＱＫＭＬＡＶＩＳＣＡＶＱＴＶＩＷＭＧＤＲＬＭＳＬＥＨＲＦＱＬＱＣＤＷＮＴＳＤＦＣＩＴＰＱＩＹＮＥＳＥＨＨＷＤＭＶＲＲＨＬＱＧＲＥＤＮＬＴＬＤＩＳＫＬＫＥＱＩＦＥＡＳＫＡＨＬＮＬＶＰＧＴＥＡＩＡＧＶＡＤＧＬＡＮＬＮＰＶＴＷＶＫＴＩＧＳＴＴＩＩＮＬＩＬＩＬＶＣＬＦＣＬＬＬＶＣＲＣＴＱＱＬＲＲＤＳＤＨＲＥＲＡＭＭＴＭＡＶＬＳＫＲＫＧＧＮＶＧＫＳＫＲＤＱＩＶＴＶＳＶ

【0381】

配列番号６
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ
ヌクレオチド配列
ａｔｇａａｃｃｃｔａｇｃｇａｇａｔｇｃａｇａｇａａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔａｇａｃｇｇａｇａａｇａｃａｃａｇａａａｃａｇｇｇｃｔｃｃｔｃｔｇａｃａｃａｃａａｇａｔｇａａｃａａｇａｔｇｇｔｃａｃｃａｇｃｇａｇｇａａｃａｇａｔｇａａａｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａａｇａａｇｇｃｃｇａｇｃｃｔｃｃａａｃａｔｇｇｇｃｔｃａｇｃｔｇａａｇａａａｃｔｇａｃｃｃａｇｃｔｇｇｃｃａｃｃａａｇｔａｃｃｔｇｇａｇａａｃａｃｃａａａｇｔｇａｃｃｃａｇａｃａｃｃｔｇａｇａｇｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃｔｃｔｇａｔｇａｔｃｇｔｇｔｃｃａｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｃｃｔａｔｇｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃａａｃｔａｃａｃａｔａｃｔｇｇｇｃｃｔａｃｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｃｔａｔｇａｔｃａｇａｇｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａｔｇｇａｃａａｃｃｃｔａｔｔｇａｇｇｔｇｔａｃｇｔｇａａｃｇａｃａｇｃｇｔｇｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｇａｃｃｔａｔｃｇａｃｇａｔａｇａｔｇｔｃｃｔｇｃｃａａａｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃａａｃａｔｃａｇｃａｔｃｇｇｃｔａｃｃｇｇｔａｔｃｃｔｃｃａａｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃａｇａｇｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｃｔｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔｇｃａｇａａｔｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇａａｇｔｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｔｃｔｃｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇｔｔｃａｃｃｔａｃｃａｃａｔｇｇｔｇｔｃｃｇｇｃａｔｇａｇｃｃｔｃａｇａｃｃｔａｇａｇｔｇａａｃｔａｃｔｔｇｃａｇｇａｃｔｔｃａｇｃｔａｔｃａｇｃｇｇａｇｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｇａｃｃｃａａｇｇｇａａａｇｃｃｃｔｇｔｃｃｔａａａｇａｇａｔｔｃｃｃａａａｇａｇｔｃｃａａｇａａｃａｃｃｇａｇｇｔｇｃｔｃｇｔｇｔｇｇｇａａｇａｇｔｇｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔｃｔｇｃｃｇｔｇａｔｃｃｔｇｃａｇａａｃａａｃｇａｇｔｔｃｇｇｃａｃｃａｔｃａｔｔｇａｃｔｇｇｇｃｔｃｃｔａｇａｇｇｃｃａｇｔｔｃｔａｃｃａｃａａｔｔｇｃａｇｃｇｇａｃａｇａｃａｃａｇａｇｃｔｇｔｃｃｔａｇｃｇｃａｃａａｇｔｇｔｃａｃｃａｇｃｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇａｔｃｔｇａｃｃｇａｇａｇｃｃｔｇｇａｃａａｇｃａｃａａａｃａｃａａｇａａａｃｔｔｃａｇａｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｔｇｇｇｇａｇａｇａａｇｇｇｃａｔｃｔｃｔａｃａｃｃａａｇｇｃｃｔａａｇａｔｃａｔｔａｇｃｃｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｃｃａｇａａｃａｔｃｃｃｇａａｃｔｔｔｇｇａｇａｃｔｇａｃａｇｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｃａｃａｔｃａｇａａｔｃｔｇｇａｇｃｇｇｃａａｔｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａａｃａｃｇｇｇａｃａｇａａａｇｃｃｃｔｔｃｔａｃａｃｃｇｔｃｇａｔｃｔｇａａｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｔｇｔｇｔｇａａｇｃｃｔｃｃｔｔａｃａｔｇｃｔｇｇｔｃｇｔｇｇｇｃａａｃａｔｔｇｔｇａｔｃａａｇｃｃｃｇａｃｔｃｃｃａｇａｃｃａｔｃａｃａｔｇｃｇａｇａａｃｔｇｃａｇａｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｃｇａｃａｇｃａｃｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃａｃｃｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｃｇａｇｃｔａｇａｇａａｇｇｃｇｔｇｔｇｇａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔａｔｇｇａｃａｇｇｃｃｔｔｇｇｇａａｇｃｃａｇｃｃｃｔａｇｃｇｔｇｃａｃａｔｔｃｔｇａｃａｇａｇｇｔｇｃｔｇａａｇｇｇｃｇｔｇｃｔｃａａｃａｇａｔｃｃａａｇｃｇｇｔｔｃａｔｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｔｃｇｃｃｇｔｃａｔｃａｔｇｇｇｃｃｔｇａｔｔｇｃｔｇｔｇａｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇｃｔｇｇｃｇｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｔａｇｃｔｃｔｇｔｇｃａｇａｇｃｇｔｇａａｃｔｔｃｇｔｇａａｃｇａｔｔｇｇｃａｇａａｇａａｃａｇｃａｃａｃｇｇｃｔｇｔｇｇａａｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃａｔｃｇａｃｃａｇａａｇａｔｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｇｃｃｇｔｇｃａｇａｃａｇｔｔａｔｃｔｇｇａｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｃｔｇａｔｇａｇｃｃｔｇｇａａｃａｃｃｇｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｃａｇｔｇｃｇａｃｔｇｇａａｔａｃｃａｇｃｇａｃｔｔｃｔｇｃａｔｃａｃａｃｃｔｃａｇａｔｃｔａｃａａｃｇａｇａｇｃｇａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｇａｔａｔｇｇｔｃｃｇａａｇｇｃａｔｃｔｇｃａｇｇｇｃａｇａｇａｇｇａｃａａｃｃｔｇａｃａｃｔｇｇａｃａｔｃａｇｃａａｇｃｔｇａａａｇａｇｃａｇａｔｃｔｔｃｇａｇｇｃｃａｇｃａａｇｇｃｔｃａｃｃｔｇａａｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｇａａｃｃｇａａｇｃｔａｔｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｇｃａｇａｔｇｇｃｃｔｇｇｃｃａａｔｃｔｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｃｃｔｇｇｇｔｃａａｇａｃｃａｔｃｇｇｃａｇｃａｃｃａｃａａｔｃａｔｃａａｃｃｔｇａｔｃｃｔｇａｔｃｃｔｃｇｔｇｔｇｃｃｔｇｔｔｔｔｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｔｇｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｃｃａｇｃａｇｃｔｇａｇａａｇａｇａｃａｇｃｇａｃｃａｔａｇａｇａａａｇａｇｃｃａｔｇａｔｇａｃｃａｔｇｇｃｃｇｔｃｃｔｇａｇｃａａｇａｇａａａｇｇｇａｇｇｃａａｃｇｔｇｇｇｃａａｇａｇｃａａｇｃｇｇｇａｔｃａｇａｔｃｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｔｔｔｇａｔａａ

【0382】

配列番号７
ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ（６６６アミノ酸）
ＭＧＱＴＫＳＫＩＫＳＫＹＡＳＹＬＳＦＩＫＩＬＬＫＲＧＧＶＫＶＳＴＫＮＬＩＫＬＦＱＩＩＥＱＦＣＰＷＦＰＥＱＧＴＬＤＬＫＤＷＫＲＩＧＫＥＬＫＱＡＧＲＫＧＮＩＩＰＬＴＶＷＮＤＷＡＩＩＫＡＡＬＥＰＦＱＴＥＥＤＳＶＳＶＳＤＡＰＧＳＣＩＩＤＣＮＥＮＴＲＫＫＳＱＫＥＴＥＳＬＨＣＥＹＶＡＥＰＶＭＡＱＳＴＱＮＶＤＹＮＱＬＱＥＶＩＹＰＥＴＬＫＬＥＧＫＧＰＥＬＶＧＰＳＥＳＫＰＲＧＴＳＰＬＰＡＧＱＶＰＶＴＬＱＰＱＫＱＶＫＥＮＫＴＱＰＰＶＡＹＱＹＷＰＰＡＥＬＱＹＲＰＰＰＥＳＱＹＧＹＰＧＭＰＰＡＰＱＧＲＡＰＹＰＱＰＰＴＲＲＬＮＰＴＡＰＰＳＲＱＧＳＥＬＨＥＩＩＤＫＳＲＫＥＧＤＴＥＡＷＱＦＰＶＴＬＥＰＭＰＰＧＥＧＡＱＥＧＥＰＰＴＶＥＡＲＹＫＳＦＳＩＫＭＬＫＤＭＫＥＧＶＫＱＹＧＰＮＳＰＹＭＲＴＬＬＤＳＩＡＨＧＨＲＬＩＰＹＤＷＥＩＬＡＫＳＳＬＳＰＳＱＦＬＱＦＫＴＷＷＩＤＧＶＱＥＱＶＲＲＮＲＡＡＮＰＰＶＮＩＤＡＤＱＬＬＧＩＧＱＮＷＳＴＩＳＱＱＡＬＭＱＮＥＡＩＥＱＶＲＡＩＣＬＲＡＷＥＫＩＱＤＰＧＳＴＣＰＳＦＮＴＶＲＱＧＳＫＥＰＹＰＤＦＶＡＲＬＱＤＶＡＱＫＳＩＡＤＥＫＡＲＫＶＩＶＥＬＭＡＹＥＮＡＮＰＥＣＱＳＡＩＫＰＬＫＧＫＶＰＡＧＳＤＶＩＳＥＹＶＫＡＣＤＧＩＧＧＡＭＨＫＡＭＬＭＡＱＡＩＴＧＶＶＬＧＧＱＶＲＴＦＧＧＫＣＹＮＣＧＱＩＧＨＬＫＫＮＣＰＶＬＮＫＱＮＩＴＩＱＡＴＴＴＧＲＥＰＰＤＬＣＰＲＣＫＫＧＫＨＷＡＳＱＣＲＳＫＦＤＫＮＧＱＰＬＳＧＮＥＱＲＧＱＰＱＡＰＱＱＴＧＡＦＰＩＱＰＦＶＰＱＧＦＱＧＱＱＰＰＬＳＱＶＦＱＧＩＳＱＬＰＱＹＮＮＣＰＰＰＱＡＡＶＱＱ

【0383】

配列番号８
ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ
ヌクレオチド配列
ａｔｇｇｇａｃａｇａｃｃａａｇａｇｔａａｇａｔｃａａｇｔｃｔａａｇｔａｃｇｃｃａｇｃｔａｃｃｔｃａｇｃｔｔｃａｔｃａａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｇｇｃｇｔｇａａａｇｔｇｔｃｃａｃｃａａｇａａｃｃｔｇａｔｃａａｇｃｔｇｔｔｃｃａｇａｔｃａｔｃｇａｇｃａｇｔｔｃｔｇｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｇｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇａｔｃｔｇａａｇｇａｃｔｇｇａａｇｃｇｇａｔｃｇｇｃａａａｇａｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇｃａｇａａａｇｇｇｃａａｃａｔｃａｔｃｃｃｔｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｇｇａａｃｇａｃｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａａａｇｃａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｃｃｔｔｃｃａｇａｃｃｇａａｇａｇｇａｔａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｔｇｔｃｔｇａｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃａｇｃｔｇｃａｔｃａｔｃｇａｃｔｇｃａａｃｇａｇａａｃａｃｃｃｇｇａａｇａａｇｔｃｃｃａｇａａａｇａｇａｃａｇａｇａｇｃｃｔｇｃａｃｔｇｃｇａｇｔａｃｇｔｇｇｃｃｇａａｃｃｔｇｔｇａｔｇｇｃｔｃａｇａｇｃａｃｃｃａｇａａｃｇｔｇｇａｃｔａｃａａｃｃａｇｃｔｃｃａａｇａａｇｔｇａｔｃｔａｔｃｃｃｇａａａｃａｃｔｇａａｇｃｔｇｇａａｇｇｃａａｇｇｇａｃｃｔｇａａｃｔｃｇｔｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｇａｇｔｃｔａａｇｃｃｃａｇａｇｇｃａｃａｔｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃａｇｇｔｇｃｃａｇｔｇａｃａｃｔｇｃａｇｃｃｔｃａｇａａａｃａａｇｔｇａａａｇａｇａａｃａａｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｔｇｇｃｃｔａｃｃａｇｔａｔｔｇｇｃｃｔｃｃａｇｃｃｇａｇｃｔｇｃａｇｔａｃａｇａｃｃｔｃｃｔｃｃａｇａｇａｇｃｃａｇｔａｃｇｇｃｔａｃｃｃｔｇｇａａｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｔｃａａｇｇｃａｇａｇｃｔｃｃｔｔａｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｃｃｔａｃｃａｇａｃｇｇｃｔｇａａｃｃｃｔａｃａｇｃｔｃｃｔｃｃｔａｇｃａｇａｃａｇｇｇｃｔｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｇａｇａｔｃａｔｔｇａｃａａｇａｇｃｃｇｇａａａｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｇａｇｇｃｔｔｇｇｃａｇｔｔｔｃｃｃｇｔｔａｃａｃｔｇｇａａｃｃｃａｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｃｇａａｇｇｃｇｃｔｃａａｇａａｇｇｃｇａａｃｃｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａａｇｃｃａｇｇｔａｃａａｇａｇｃｔｔｃａｇｃａｔｃａａｇａｔｇｃｔｇａａｇｇａｃａｔｇａａｇｇａａｇｇｃｇｔｃａａｇｃａｇｔａｃｇｇａｃｃｔａａｃａｇｃｃｃａｔａｃａｔｇｃｇｇａｃｃｃｔｇｃｔｇｇａｔｔｃｔａｔｔｇｃｃｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｇｃｔｇａｔｃｃｃｔｔａｃｇａｔｔｇｇｇａｇａｔｃｃｔｇｇｃｔａａｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇａｇｃｃｃｔａｇｃｃａｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｔｃａａｇａｃｃｔｇｇｔｇｇａｔｃｇａｃｇｇｃｇｔｇｃａａｇａａｃａａｇｔｇａｇａｃｇｇａａｃａｇａｇｃｔｇｃｃａａｔｃｃｔｃｃｔｇｔｇａａｃａｔｃｇａｃｇｃｃｇａｃｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｇａａｔｃｇｇｃｃａｇａａｔｔｇｇａｇｃａｃｃａｔｃｔｃｔｃａｇｃａｇｇｃｔｃｔｇａｔｇｃａｇａａｃｇａｇｇｃｃａｔｔｇａａｃａａｇｔｃａｇａｇｃｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｇａｇｃｔｔｇｇｇａｇａａｇａｔｔｃａｇｇａｃｃｃａｇｇｃａｇｃａｃａｔｇｔｃｃｃａｇｃｔｔｃａａｔａｃｃｇｔｔｃｇｇｃａｇｇｇｃａｇｃａａａｇａｇｃｃｃｔａｔｃｃｔｇａｃｔｔｔｇｔｇｇｃｔａｇａｃｔｇｃａｇｇａｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａａｇｔｃｔａｔｔｇｃｃｇａｃｇａｇａａｇｇｃｔｃｇｇａａａｇｔｇａｔｃｇｔｇｇａａｃｔｇａｔｇｇｃｃｔａｃｇａｇａａｃｇｃｔａａｔｃｃａｇａｇｔｇｃｃａｇａｇｃｇｃｃａｔｃａａｇｃｃｃｔｔｇａａｇｇｇｃａａａｇｔｇｃｃｔｇｃｃｇｇａｔｃｃｇａｔｇｔｇａｔｃａｇｃｇａｇｔａｔｇｔｇａａｇｇｃｃｔｇｃｇａｃｇｇａａｔｃｇｇａｇｇｔｇｃｃａｔｇｃａｃａａａｇｃｃａｔｇｃｔｇａｔｇｇｃａｃａｇｇｃｃａｔｃａｃｔｇｇｃｇｔｔｇｔｇｃｔｃｇｇａｇｇａｃａａｇｔｔｃｇｇａｃｃｔｔｔｇｇａｇｇｃａａｇｔｇｃｔａｃａａｃｔｇｔｇｇｃｃａｇａｔｃｇｇａｃａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｃｔｇｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇａａｃａａｇｃａｇａａｃａｔｃａｃｃａｔｃｃａｇｇｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｇｃａｇａｇａａｃｃｔｃｃａｇａｔｃｔｇｔｇｃｃｃｔａｇａｔｇｃａａｇａａｇｇｇｃａａｇｃａｃｔｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｔｇｃａｇａａｇｃａａｇｔｔｃｇａｃａａｇａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｃｔｇａｇｃｇｇｃａａｃｇａａｃａａａｇａｇｇａｃａｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｇｃａｇａｃｔｇｇｃｇｃａｔｔｔｃｃａａｔｃｃａｇｃｃｃｔｔｃｇｔｇｃｃｔｃａａｇｇｃｔｔｃｃａｇｇｇａｃａａｃａｇｃｃｔｃｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇｔｔｃｃａｇｇｇｃａｔｔａｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｃａｇｔａｃａａｃａａｃｔｇｃｃｃｔｃｃａｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｃｔｇｔｇｃａｇｃａｇｔｇａｔｇａ

【0384】

配列番号９
ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）
ＭＡＱＲＭＴＴＱＬＬＬＬＬＶＷＶＡＶＶＧＥＡＱＴＲＩＡＷＡＲＴＥＬＬＮＶＣＭＮＡＫＨＨＫＥＫＰＧＰＥＤＫＬＨＥＱＣＲＰＷＲＫＮＡＣＣＳＴＮＴＳＱＥＡＨＫＤＶＳＹＬＹＲＦＮＷＮＨＣＧＥＭＡＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＤＱＳＷＲＫＥＲＶＬＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥＱＷＷＥＤＣＲＴＳＹＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷＮＷＴＳＧＦＮＫＣＡＶＧＡＡＣＱＰＦＨＦＹＦＰＴＰＴＶＬＣＮＥＩＷＴＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＰＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＥＲＲＲＬＷＧＳＩＱＳＲＹＩＳＭＳＶＷＴＳＰＲＲＬＶＥＬＡＧＱＳＬＬＫＤＥＡＬＡＩＡＡＬＥＬＬＰＲＥＬＦＰＰＬＦＭＡＡＦＤＧＲＨＳＱＴＬＫＡＭＶＱＡＷＰＦＴＣＬＰＬＧＶＬＭＫＧＱＨＬＨＬＥＴＦＫＡＶＬＤＧＬＤＶＬＬＡＱＥＶＲＰＲＲＷＫＬＱＶＬＤＬＲＫＮＳＨＱＤＦＷＴＶＷＳＧＮＲＡＳＬＹＳＦＰＥＰＥＡＡＱＰＭＴＴＫＡＫＶＤＧＬＳＴＥＡＥＱＰＦＩＰＶＥＶＬＶＤＬＦＬＫＥＧＡＣＤＥＬＦＳＹＬＩＥＫＶＡＡＫＫＮＶＬＲＬＣＣＫＫＬＫＩＦＡＭＰＭＱＤＩＫＭＩＬＫＭＶＱＬＤＳＩＥＤＬＥＶＴＣＴＷＫＬＰＴＬＡＫＦＳＰＹＬＧＱＭＩＮＬＲＲＬＬＬＳＨＩＨＡＳＳＹＩＳＰＥＫＥＥＱＹＩＡＱＦＴＳＱＦＬＳＬＱＣＬＱＡＬＹＶＤＳＬＦＦＬＲＧＲＬＤＱＬＬＲＨＶＭＮＰＬＥＴＬＳＩＴＮＣＲＬＳＥＧＤＶＭＨＬＳＱＳＰＳＶＳＱＬＳＶＬＳＬＳＧＶＭＬＴＤＶＳＰＥＰＬＱＡＬＬＥＲＡＳＡＴＬＱＤＬＶＦＤＥＣＧＩＴＤＤＱＬＬＡＬＬＰＳＬＳＨＣＳＱＬＴＴＬＳＦＹＧＮＳＩＳＩＳＡＬＱＳＬＬＱＨＬＩＧＬＳＮＬＴＨＶＬＹＰＶＰＬＥＳＹＥＤＩＨＧＴＬＨＬＥＲＬＡＹＬＨＡＲＬＲＥＬＬＣＥＬＧＲＰＳＭＶＷＬＳＡＮＰＣＰＨＣＧＤＲＴＦＹＤＰＥＰＩＬＣＰＣＦＭＰＮ

【0385】

配列番号１０
ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）
ヌクレオチド配列
ｔｇｇｃｃｃａｇａｇａａｔｇａｃｃａｃａｃａａｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｔｔｇｃｃｇｔｔｇｔｔｇｇａｇａｇｇｃｃｃａｇａｃｃａｇａａｔｔｇｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｇｃｔｇａａｃｇｔｇｔｇｃａｔｇａａｃｇｃｃａａｇｃａｔｃａｃａａａｇａｇａａｇｃｃｔｇｇａｃｃｔｇａａｇａｃａａｇｃｔｇｃａｔｇａａｃａｇｔｇｔｃｇｇｃｃｔｔｇｇａｇａａａｇａａｔｇｃｔｔｇｃｔｇｔａｇｃａｃｃａａｃａｃｃａｇｃｃａａｇａｇｇｃｃｃａｃａａｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｔａｃｃｔｇｔａｃｃｇｇｔｔｃａａｃｔｇｇａａｃｃａｃｔｇｃｇｇａｇａａａｔｇｇｃｔｃｃｔｇｃｃｔｇｃａａｇａｇａｃａｃｔｔｃａｔｃｃａｇｇａｔａｃｃｔｇｃｃｔｇｔａｃｇａｇｔｇｃｔｃｔｃｃｃａａｔｃｔｃｇｇａｃｃｔｔｇｇａｔｃｃａｇｃａａｇｔｇｇａｃｃａｇａｇｃｔｇｇｃｇｇａａａｇａａｃｇｇｇｔｇｃｔｇａａｔｇｔｇｃｃｃｔｔｇｔｇｃａａａｇａｇｇａｔｔｇｃｇａｇｃａｇｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔｔｇｃｃｇｇａｃｃａｇｃｔａｃａｃａｔｇｔａａｇａｇｃａａｃｔｇｇｃａｃａａａｇｇｃｔｇｇａａｃｔｇｇａｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａａｃａａｇｔｇｔｇｃｃｇｔｇｇｇａｇｃｔｇｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃａｃｔｔｃｔａｃｔｔｃｃｃａａｃａｃｃｔａｃｃｇｔｇｃｔｇｔｇｃａａｃｇａａａｔｃｔｇｇａｃｃｃａｃａｇｃｔａｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃｔａｃａｇｃａｇａｇｇｃａｇｃｇｇｃａｇｇｔｇｔａｔｃｃａｇａｔｇｔｇｇｔｔｃｇａｔｃｃｃｇｃｔｃａｇｇｇｃａａｔｃｃｃａａｔｇａｇｇａａｇｔｇｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｃｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｔｇｇａａａｇａａｇａａｇｇｃｔｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｃｃａｇａｇｃｃｇｇｔａｃａｔｔａｇｃａｔｇａｇｃｇｔｇｔｇｇａｃａａｇｃｃｃｔａｇａｃｇｇｃｔｇｇｔｔｇａａｃｔｇｇｃｔｇｇａｃａｇａｇｃｃｔｇｃｔｃａａｇｇａｔｇａｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔａｇａｇａｇｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃｔｃｔｇｔｔｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇａｃｇｇｃａｇａｃａｃａｇｃｃａｇａｃａｃｔｇａａａｇｃｃａｔｇｇｔｇｃａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｃａｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｔｇａｔｇａａｇｇｇｃｃａｇｃａｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｇａａａｃｃｔｔｃａａｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｃｔｇｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｇｃｔｃａａｇａｇｇｔｇａｇｇｃｃｔｃｇｇｃｇｔｔｇｇａａａｃｔｇｃａｇｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｇｇａａｇａａｃｔｃｔｃａｃｃａｇｇａｔｔｔｃｔｇｇａｃｃｇｔｔｔｇｇｔｃｃｇｇｃａａｃａｇａｇｃｃａｇｃｃｔｇｔａｃａｇｃｔｔｔｃｃｔｇａａｃｃｔｇａｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃａｔｇａｃｃａｃａａａｇｇｃｃａａａｇｔｇｇａｔｇｇｃｃｔｇａｇｃａｃａｇａｇｇｃｃｇａｇｃａｇｃｃｔｔｔｃａｔｔｃｃｃｇｔｃｇａａｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇａａａｇａａｇｇａｇｃｃｔｇｃｇａｔｇａｇｃｔｇｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｔｔｇａｇａａｇｇｔｇｇｃａｇｃｃａａｇａａｇａａｃｇｔｇｃｔｇｃｇｇｃｔｇｔｇｃｔｇｃａａｇａａｇｃｔｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｃｃａｔｇｃｃｔａｔｇｃａｇｇａｔａｔｃａａｇａｔｇａｔｃｃｔｇａａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇａｃａｇｃａｔｃｇａｇｇａｃｃｔｇｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇｃｃｃａｃａｃｔｇｇｃｃａａｇｔｔｃａｇｃｃｃｔｔａｃｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｇａｔｔａａｃｃｔｇｃｇｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃａｃａｔｃｃａｃｇｃｃａｇｃｔｃｃｔａｃａｔｃａｇｃｃｃｔｇａｇａａａｇａｇｇａａｃａｇｔａｔａｔｃｇｃｃｃａｇｔｔｃａｃａａｇｃｃａｇｔｔｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｃａｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｔａｃｇｔｇｇａｃａｇｃｃｔｇｔｔｃｔｔｔｃｔｇａｇａｇｇｃａｇｇｃｔｇｇａｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｃｇｇｃａｃｇｔｇａｔｇａａｃｃｃｔｃｔｇｇａａａｃｃｃｔｇａｇｃａｔｃａｃｃａａｃｔｇｔａｇａｃｔｇａｇｃｇａｇｇｇｃｇａｃｇｔｇａｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｇｇｃｇｔｇａｔｇｃｔｇａｃｃｇａｔｇｔｇａｇｃｃｃｔｇａａｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｔｇｇａａａｇａｇｃｃｔｃｃｇｃｔａｃｔｃｔｇｃａｇｇａｃｃｔｇｇｔｇｔｔｃｇａｔｇａｇｔｇｃｇｇｃａｔｃａｃｃｇａｔｇａｃｃａｇｃｔｇｃｔｔｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｃａａｇｃｃｔｇａｇｃｃａｃｔｇｔａｇｃｃａｇｃｔｇａｃａａｃｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔａｃｇｇｃａａｃａｇｃａｔｃｔｃｃａｔｃｔｃｔｇｃｃｃｔｇｃａｇｔｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｃａｔｃｔｇａｔｃｇｇｃｃｔｇｔｃｃａａｔｃｔｇａｃｃｃａｃｇｔｇｃｔｇｔａｃｃｃｔｇｔｇｃｃａｃｔｇｇａａａｇｃｔａｃｇａｇｇａｃａｔｃｃａｃｇｇａａｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｃｇａｇａｇａｃｔｇｇｃｃｔａｔｃｔｇｃａｔｇｃｔｃｇｇｃｔｇａｇａｇａａｃｔｇｃｔｇｔｇｃｇａａｃｔｇｇｇｃａｇａｃｃｃａｇｃａｔｇｇｔｔｔｇｇｃｔｇａｇｃｇｃｃａａｔｃｃａｔｇｔｃｃｔｃａｃｔｇｔｇｇｃｇａｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａｃｇａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔａｔｃｃｔｇｔｇｔｃｃｔｔｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｃａａｃｔａａｔａｇ

【0386】

配列番号１１
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３（５１７アミノ酸）
ＭＮＰＳＥＭＱＲＫＡＰＰＲＲＲＲＨＲＮＲＡＰＬＴＨＫＭＮＫＭＶＴＳＥＥＱＭＫＬＰＳＴＫＫＡＥＰＰＴＷＡＱＬＫＫＬＴＱＬＡＴＫＹＬＥＮＴＫＶＴＱＴＰＥＳＭＬＬＡＡＬＭＩＶＳＭＶＶＳＬＰＭＰＡＧＡＡＡＡＮＹＴＹＷＡＹＶＰＦＰＰＭＩＲＡＶＴＷＭＤＮＰＩＥＶＹＶＮＤＳＶＷＶＰＧＰＩＤＤＲＣＰＡＫＰＥＥＥＧＭＭＩＮＩＳＩＧＹＲＹＰＰＩＣＬＧＲＡＰＧＣＬＭＰＡＶＱＮＷＬＶＥＶＰＴＶＳＰＩＳＲＦＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬＲＰＲＶＮＹＬＱＤＦＳＹＱＲＳＬＫＦＲＰＫＧＫＰＣＰＫＥＩＰＫＥＳＫＮＴＥＶＬＶＷＥＥＣＶＡＮＳＡＶＩＬＱＮＮＥＦＧＴＩＩＤＷＡＰＲＧＱＦＹＨＮＣＳＧＱＴＱＳＣＰＳＡＱＶＳＰＡＶＤＳＤＬＴＥＳＬＤＫＨＫＨＫＫＬＱＳＦＹＰＷＥＷＧＥＫＧＩＳＴＰＲＰＫＩＩＳＰＶＳＧＰＥＨＰＥＬＷＲＬＴＶＡＳＨＨＩＲＩＷＳＧＮＱＴＬＥＴＲＤＲＫＰＦＹＴＶＤＬＮＳＳＬＴＶＰＬＱＳＣＶＫＰＰＹＭＬＶＶＧＮＩＶＩＫＰＤＳＱＴＩＴＣＥＮＣＲＬＬＴＣＩＤＳＴＦＮＷＱＨＲＩＬＬＶＲＡＲＥＧＶＷＩＰＶＳＭＤＲＰＷＥＡＳＰＳＶＨＩＬＴＥＶＬＫＧＶＬＮＭＬＡＶＩＳＣＡＶＡＧＶＡＬＨＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ

【0387】

配列番号１２
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３
ヌクレオチド配列
ａｔｇａａｃｃｃｔａｇｃｇａｇａｔｇｃａｇａｇａａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔａｇａｃｇｇａｇａａｇａｃａｃａｇａａａｃａｇｇｇｃｔｃｃｔｃｔｇａｃａｃａｃａａｇａｔｇａａｃａａｇａｔｇｇｔｃａｃｃａｇｃｇａｇｇａａｃａｇａｔｇａａａｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａａｇａａｇｇｃｃｇａｇｃｃｔｃｃａａｃａｔｇｇｇｃｔｃａｇｃｔｇａａｇａａａｃｔｇａｃｃｃａｇｃｔｇｇｃｃａｃｃａａｇｔａｃｃｔｇｇａｇａａｃａｃｃａａａｇｔｇａｃｃｃａｇａｃａｃｃｔｇａｇａｇｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃｔｃｔｇａｔｇａｔｃｇｔｇｔｃｃａｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｃｃｔａｔｇｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃａａｃｔａｃａｃａｔａｃｔｇｇｇｃｃｔａｃｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｃｔａｔｇａｔｃａｇａｇｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａｔｇｇａｃａａｃｃｃｔａｔｔｇａｇｇｔｇｔａｃｇｔｇａａｃｇａｃａｇｃｇｔｇｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｇａｃｃｔａｔｃｇａｃｇａｔａｇａｔｇｔｃｃｔｇｃｃａａａｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃａａｃａｔｃａｇｃａｔｃｇｇｃｔａｃｃｇｇｔａｔｃｃｔｃｃａａｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃａｇａｇｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｃｔｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔｇｃａｇａａｔｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇａａｇｔｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｔｃｔｃｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇｔｔｃａｃｃｔａｃｃａｃａｔｇｇｔｇｔｃｃｇｇｃａｔｇａｇｃｃｔｃａｇａｃｃｔａｇａｇｔｇａａｃｔａｃｔｔｇｃａｇｇａｃｔｔｃａｇｃｔａｔｃａｇｃｇｇａｇｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｇａｃｃｃａａｇｇｇａａａｇｃｃｃｔｇｔｃｃｔａａａｇａｇａｔｔｃｃｃａａａｇａｇｔｃｃａａｇａａｃａｃｃｇａｇｇｔｇｃｔｃｇｔｇｔｇｇｇａａｇａｇｔｇｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔｃｔｇｃｃｇｔｇａｔｃｃｔｇｃａｇａａｃａａｃｇａｇｔｔｃｇｇｃａｃｃａｔｃａｔｔｇａｃｔｇｇｇｃｔｃｃｔａｇａｇｇｃｃａｇｔｔｃｔａｃｃａｃａａｔｔｇｃａｇｃｇｇａｃａｇａｃａｃａｇａｇｃｔｇｔｃｃｔａｇｃｇｃａｃａａｇｔｇｔｃａｃｃａｇｃｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇａｔｃｔｇａｃｃｇａｇａｇｃｃｔｇｇａｃａａｇｃａｃａａａｃａｃａａｇａａａｃｔｔｃａｇａｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｔｇｇｇｇａｇａｇａａｇｇｇｃａｔｃｔｃｔａｃａｃｃａａｇｇｃｃｔａａｇａｔｃａｔｔａｇｃｃｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｃｃａｇａａｃａｔｃｃｃｇａａｃｔｔｔｇｇａｇａｃｔｇａｃａｇｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｃａｃａｔｃａｇａａｔｃｔｇｇａｇｃｇｇｃａａｔｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａａｃａｃｇｇｇａｃａｇａａａｇｃｃｃｔｔｃｔａｃａｃｃｇｔｃｇａｔｃｔｇａａｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｔｇｔｇｔｇａａｇｃｃｔｃｃｔｔａｃａｔｇｃｔｇｇｔｃｇｔｇｇｇｃａａｃａｔｔｇｔｇａｔｃａａｇｃｃｃｇａｃｔｃｃｃａｇａｃｃａｔｃａｃａｔｇｃｇａｇａａｃｔｇｃａｇａｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｃｇａｃａｇｃａｃｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃａｃｃｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｃｇａｇｃｔａｇａｇａａｇｇｃｇｔｇｔｇｇａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔａｔｇｇａｃａｇｇｃｃｔｔｇｇｇａａｇｃｃａｇｃｃｃｔａｇｃｇｔｇｃａｃａｔｔｃｔｇａｃａｇａｇｇｔｇｃｔｇａａｇｇｇｃｇｔｇｃｔｃａａｃａｔｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｇｃｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｇｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇａａｇｃｇｇｃｇａｇｔｔｃｇｔｇｇｔｃａｔｃｔｃｔｇｃｃａｔｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔｇａｔｔａｔｇｃｔｇｔｇｇｃａｇａａｇａａｇｃｃｃｃｇｇｔｇａｔａａ

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図31】

【配列表】

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