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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-03
(45)【発行日】2025-03-11
(54)【発明の名称】Ｌ－リジン産生組換え菌株、その構築方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20250304BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250304BHJP
C07K 14/34 20060101ALI20250304BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250304BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20250304BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20250304BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12N1/21 ZNA
C07K14/34
C12N15/63 Z
C12N15/11 Z
C12P13/08 A
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2022552166
(86)(22)【出願日】2020-12-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-03
(86)【国際出願番号】 CN2020141539
(87)【国際公開番号】W WO2021248890
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2022-12-06
(31)【優先権主張番号】202010514023.X
(32)【優先日】2020-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010790877.0
(32)【優先日】2020-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CGMCC 12856
(73)【特許権者】
【識別番号】522077960
【氏名又は名称】黒竜江伊品生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】孟剛
(72)【発明者】
【氏名】魏愛英
(72)【発明者】
【氏名】賈慧萍
(72)【発明者】
【氏名】馬風勇
(72)【発明者】
【氏名】周暁群
(72)【発明者】
【氏名】趙春光
(72)【発明者】
【氏名】郭小▲うぃ▼
(72)【発明者】
【氏名】田斌
(72)【発明者】
【氏名】高暁航
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００２－１９１３７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０６９６２９８９（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】中国特許出願公開第１１１１９７０２１（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０３６３０１４（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／３１
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｐ １３／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－リジンを生成する微生物であって、当該微生物がコリネバクテリウム属に属し、当該微生物は、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの改善された発現を有し、前記改善された発現は、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が増強されること、又は配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有すること、又は配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有するとともに、発現が増強されることであり；
配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点突然変異は、配列番号３のアミノ酸配列の１７６位のリジン残基のアスパラギン残基への置換をもたらし；
かつ／又は、配列番号２９に示されるプロモーター領域の－４９位のヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に変異され、－５１位のヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）に変異され、かつ－５４～－５８位のヌクレオチド配列が、ＣＴＧＣＡからＧＧＴＧＴに変異されており、
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰ９７１５８である、
微生物。
【請求項2】
配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、又は、前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、
請求項１に記載の微生物。
【請求項3】
当該プロモーター領域のヌクレオチド配列は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列である、請求項１に記載の微生物。
【請求項4】
組換え菌株であって、
配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は、
配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
を含み、
宿主菌株が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰ９７１５８である、組換え菌株。
【請求項5】
組換え菌株であって、
配列番号３０に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列と当該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されたコード配列とを含む発現カセット、又は配列番号３０に示されるヌクレオチド配列を含む組換えベクター、を含有し、
宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰ９７１５８である、組換え菌株。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物又は請求項４若しくは５に記載の組換え菌株を培養すること、及び培養物からＬ－リジンを回収することを含む、Ｌ－リジンを生産するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２０年８月７日に中国国家知識産権局に提出された、特許出願番号が２０２０１０７９０８７７．０、発明の名称が「Ｌ－リジン産生組換え菌株、その構築方法及び使用」、及び２０２０年６月８日に中国国家知識産権局に提出された、特許出願番号が２０２０１０５１４０２３．Ｘ、発明の名称が「ｄａｐＢ遺伝子改変組換え菌株、その構築方法及び使用」である先行出願の優先権を主張している。前記２つの先行出願の全内容が引用により本願に組み込まれるものとする。
【0002】
本発明は遺伝子工学及び微生物の技術分野に属し、具体的には、Ｌ－リジン産生能が向上した組換え菌株、その構築方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｌ－リジンは発育促進、免疫力増強、中枢神経組織の機能向上などの生理的効果があり、人体と動物が自身で合成できず、かつ成長に必要な８種類の基本アミノ酸の一つである。現在、Ｌ－リジンは世界で２番目に大きいアミノ酸の種類で、主な生産方法は発酵法であり、コリネバクテリウムはアミノ酸生産に使用される最も重要な菌種であり、これにはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・フラバム（Ｃ．ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・クレナタム（Ｃ．ｃｒｅｎａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ペキネンスなどが含まれ、このうちコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）はリジンの重要な生産菌株である。Ｌ－リジンの工業的な生産量の約９０％は飼料産業における栄養強化剤として、１０％は食品産業におけるうま味料や甘味料、医薬品産業における医薬品中間体として使用されている。
【0004】
発酵法によるＬ－リジンの生産の改良は、撹拌及び酸素供給などの発酵技術、発酵中の糖濃度などの栄養培地の組成、発酵液の乾燥及び造粒又はイオン交換クロマトグラフィー等により発酵液を適切な製品形態に加工すること、又は関連する微生物自体の固有の性能特性に関することができる。
【0005】
これらの微生物の性能や性質を改善するための方法は、誘発突然変異、突然変異体の選択やスクリーニングを含む。このようにして得られた菌株は、代謝物に対して耐性を有するか、又は調節的に重要な代謝物に対して栄養要求性であり、Ｌ－リジンを産生する。
【0006】
コリネバクテリウム・グルタミカムの場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生合成経路ではＬ－リジン１ｍｏｌの合成に４ｍｏｌのＮＡＤＰＨを消費する。したがって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生合成経路におけるＬ－リジンの蓄積を向上させるためには、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ代謝経路におけるＮＡＤＰＨ量の上昇、又はＬ－リジン合成経路におけるＮＡＤＰＨ要求量の低下が重要な手段である。
【0007】
ジヒドロピリジンジカルボン酸レダクターゼ（ＤＨＤＰＲ：Ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）は細菌と高等植物がジアミノピメリン酸とＬ－リジンを生合成する過程における第２の重要な酵素であり、ジヒドロピリジンジカルボン酸のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－依存性の還元反応を触媒し、ヘキサヒドロピリジンジカルボン酸を生成する。この酵素は細胞壁の形成に重要な役割を果たす。ＤＨＤＰＲはＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを補因子とすることができ、異なる細菌のＤＨＤＰＲは異なる補因子に対する親和性も異なり、例えばＥ．ｃｏｌｉはＮＡＤＨを好んでいるが、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＤＨＤＰＲは主にＮＡＤＰＨを補因子とし、Ｌ－リジンの合成に関与する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＤＨＤＰＲは、他の発見された生物におけるＤＨＤＰＲと同様に、遺伝子ｄａｐＢによってコードされており、その酵素活性は合成経路の最終産物によって調節されないが、２,６－ピリジンジカルボン酸（２,６－ＰＤＣ）によって阻害される。
【0008】
リジンの収率は生合成経路における酵素活性に関連しており、この活性は、一般に、リジン生合成経路における１つ以上の遺伝子を増幅することにより、又は遺伝子の修飾プロモーターを適用することにより、向上することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善され、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるプロモーター領域の－４９番目、－５１番目、－５４～－５８番目の塩基が変異した、Ｌ－リジンを生成する微生物又は組換え菌株を提供する。本発明はまた、前記微生物又は組換え菌株を用いたＬ－リジンの生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの改善された発現を有する、Ｌ－リジンを生成するコリネバクテリウム属に属する微生物又は組換え菌株を提供する。本発明によれば、前記改善された発現は前記ポリヌクレオチドの発現増強、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有すること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有するとともに、発現が増強されることである。
【0011】
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列は遺伝子ＮＣｇｌ２１７６がコードするタンパク質である。
【0012】
前記微生物又は組換え菌株は、野生型又は親株に比べて増強されたＬ－リジン産生能を有する。
【0013】
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列とは約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードしてもよい。本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、２種のポリヌクレオチド又は２種のペプチドモジュールの間の同一性百分率である。１つのモジュールと別のモジュールとの間の配列相同性は本分野で公知の方法によって測定されてもよい。このような配列相同性は例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムによって測定されてもよい。
【0014】
ポリヌクレオチドの発現は、発現調節配列の置換又は変異、ポリヌクレオチド配列への変異導入、染色体を介して挿入された又はベクターを介して導入されたポリヌクレオチドのコピー数の増加、又はこれらの組み合わせなどによって増強されてもよい。
ポリヌクレオチドの発現調節配列は修飾されてもよい。発現調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、また、例えばプロモーター、ターミネータ、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドが染色体の特定部位に組み込まれることで、コピー数を増加させてもよい。本明細書では、特定部位は例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することで、コピー数を増加させてもよい。
ポリヌクレオチドの発現調節配列は修飾されてもよい。発現調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、また、例えばプロモーター、ターミネータ、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドが染色体の特定部位に組み込まれることで、コピー数を増加させてもよい。本明細書では、特定部位は例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することで、コピー数を増加させてもよい。
【0015】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチド又は点突然変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定部位に組み込むことで、コピー数を増加させる。
【0016】
本発明の一実施形態では、プロモーター配列を有するポリヌクレオチド又はプロモーター配列を有し点突然変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定部位に組み込むことで、前記核酸配列を過剰発現する。
【0017】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチド又は点突然変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することで、コピー数を増加させる。
【0018】
本発明の一実施形態では、プロモーター配列を有するポリヌクレオチド又はプロモーター配列を有し点突然変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことで、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記核酸配列を過剰発現する。
【0019】
本発明の一特定実施形態では、前記ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0020】
本発明の一実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有することにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の１７６番目のリジンが異なるアミノ酸で置換される。
【0021】
本発明によれば、好ましくは、１７６番目のリジンがアスパラギンで置換される。
【0022】
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、その１７６番目のリジン（Ｋ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
【0023】
本発明の一実施形態では、前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５２８番目の塩基が変異したものである。
【0024】
本発明によれば、前記突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５２８番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への突然変異を含む。
【0025】
本発明の一実施形態では、前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【0026】
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」という用語は調節配列とポリヌクレオチド配列とが機能的に連結されることにより、調節配列がポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御することを指す。調節配列はポリヌクレオチドの発現レベルを向上させ得る強力なプロモーターである。調節配列は、コリネバクテリウム属の微生物に由来のプロモーター又は他の微生物に由来のプロモーターとしてもよい。例えば、プロモーターはｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター又はｃｊ７プロモーターであってもよい。
【0027】
本発明の一特定実施形態では、前記プロモーターはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＮＣｇｌ２１７６遺伝子）のプロモーターである。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、遺伝子の調節配列及び遺伝子配列を含有し、適切な宿主細胞にて標的遺伝子を発現させるように構成されるポリヌクレオチド構築体を指す。また、ベクターは、ポリヌクレオチド構築体を指してもよく、ベクターが相同組換えに利用可能な配列を含むことで、宿主細胞へ導入されたベクターによって、宿主細胞のゲノム中の内因性遺伝子の調節配列を変化したり、発現させ得る標的遺伝子を宿主のゲノムの特定部位に挿入したりすることができる。これに関しては、本発明で使用されるベクターは、宿主細胞へのベクターの導入又は宿主細胞の染色体へのベクターの挿入を確認するために選択的マーカーをさらに含んでもよい。選択的マーカーは、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する抗性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーを含んでもよい。このような選択剤で処理された環境では、選択的マーカーを発現させた細胞が生存するか又は異なる表現型形質を示すので、形質転換細胞の選択が可能になる。
【0029】
本発明のいくつかの特定実施形態では、使用されるベクターはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
【0030】
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより、ポリヌクレオチドがゲノム外要素として機能するか、又は宿主細胞のゲノムに挿入されて複製可能になることを指す。本発明で使用されるベクターの形質転換方法は、核酸を細胞に導入する方法を含んでもよい。また、関連技術で開示した通り、宿主細胞によって電気パルス方法を実施してもよい。
【0031】
本発明によれば、コリネバクテリウム属に属する微生物又は組換え菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）であってもよい。
【0032】
本発明の一実施態様では、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＹＰ９７１５８であり、受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２８５６、受託日：２０１６年８月１６日、受託機関：中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５であり、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１）に記載されている。
【0033】
本発明によれば、前記微生物又は組換え菌株は、Ｌ－リジン産生量の向上に関する他の改良、例えば、ＮＡＤＰＨ生成に関連する遺伝子（例えばグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、グルコノキナーゼをコードする遺伝子、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、又は６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）及び／又はＬ－リジン生合成又は分泌に関連する他の遺伝子（例えばアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子、ｍ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、ｌｙｓＥ）の向上又は低下した発現、又は外来遺伝子による遺伝子の置換をさらに有してもよい。
【0034】
本発明の第２態様は、ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含有する組換え菌株を提供する。
【0035】
本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、１７６番目のリジンが異なるアミノ酸で置換される。
【0036】
本発明によれば、好ましくは、１７６番目のリジンがアスパラギンで置換される。
【0037】
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、その１７６番目のリジン（Ｋ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
【0038】
本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列を含有する。
【0039】
本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５２８番目の塩基が変異したものである。
【0040】
本発明によれば、前記変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを指し、前記変異方法は、誘発変異、ＰＣＲ部位特異的変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から選ばれる少なくとも１種であってもよい。本発明では、好ましくは、ＰＣＲ部位特異的変異法及び／又は相同組換えが使用される。
【0041】
本発明によれば、前記変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５２８番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への変異を含む。
【0042】
本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【0043】
本発明によれば、前記アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含む。
【0044】
本発明によれば、前記組換えベクターは前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築されるものである。
【0045】
本発明の一実施形態では、前記プラスミドはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。
【0046】
本発明の別の実施形態では、前記プラスミドはｐＸＭＪ１９プラスミドである。
【0047】
具体的には、前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドとをＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組換えベクターに構築してもよい。
【0048】
本発明によれば、前記組換え菌株は前記ポリヌクレオチド配列を含有する。
【0049】
本発明の一実施態様として、前記組換え菌株の出発菌はＹＰ９７１５８である。
【0050】
本発明の第３態様はまた、コリネバクテリウム・グルタミカム組換え菌株の構築方法を提供する。
【0051】
本発明によれば、前記構築方法は、
５２８番目の塩基が変異するように、宿主菌株中の、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＮＣｇｌ２１７６のポリヌクレオチド配列を改変し、変異ＮＣｇｌ２１７６コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップを含む。
５２８番目の塩基が変異するように、宿主菌株中の、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＮＣｇｌ２１７６のポリヌクレオチド配列を改変し、変異ＮＣｇｌ２１７６コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップを含む。
【0052】
本発明の構築方法によれば、前記改変は、誘発変異、ＰＣＲ部位特異的変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも１種を含む。
【0053】
本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の５２８番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への変異を指し、具体的には、前記変異ＮＣｇｌ２１７６コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
【0054】
さらに、前記構築方法は、
５２８番目の塩基が変異するように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＮＣｇｌ２１７６遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、変異ＮＣｇｌ２１７６遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異したポリヌクレオチド配列をプラスミドに連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入して、前記変異ＮＣｇｌ２１７６コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
５２８番目の塩基が変異するように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＮＣｇｌ２１７６遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、変異ＮＣｇｌ２１７６遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異したポリヌクレオチド配列をプラスミドに連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入して、前記変異ＮＣｇｌ２１７６コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
【0055】
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点突然変異ＮＣｇｌ２１７６遺伝子の構築を含み、すなわち、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子断片を増幅する２対のプライマーであるＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を合成し、ＰＣＲ部位特異的突然変異法によって野生型ＮＣｇｌ２１７６遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に点突然変異を導入し、点突然変異ＮＣｇｌ２１７６遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を得て、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃとする。
【0056】
本発明の一実施形態では、前記コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムは、ＡＴＣＣ１３０３２菌株に由来してもよく、そのゲノム配列はＮＣＢＩウェブサイトから取得してもよい。
【0057】
本発明の一実施態様では、前記ステップ（１）では、前記プライマーは以下の通りである。
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
【0058】
本発明の一実施態様では、前記ＰＣＲ増幅は、以下のように行われる。９４℃、３０ｓ（秒）変性、５２℃、３０ｓアニーリング、及び７２℃、４０ｓ伸長（３０サイクル）。
【0059】
本発明の一実施態様では、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、以下のように行われる。９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、及び７２℃、９０ｓ伸長（３０サイクル）。
【0060】
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、分離精製したＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８ＣとｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、組換えプラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを得ることを含む組換えプラスミドの構築を含む。
【0061】
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換えプラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得ることを含む組換え菌株の構築を含む。
【0062】
本発明の一実施態様では、前記ステップ（３）の形質転換は電気的形質転換法である。
【0063】
本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＹＰ９７１５８である。
【0064】
本発明の一実施形態では、前記組換えは相同組換えによって行われる。
【0065】
本発明の第４態様はまた、コリネバクテリウム組換え菌株の構築方法を提供する。
【0066】
本発明によれば、前記構築方法は、
ＮＣｇｌ２１７６遺伝子の上下流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列、又は、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を導入することで、前記菌株でＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を過剰発現するステップを含む。
ＮＣｇｌ２１７６遺伝子の上下流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列、又は、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を導入することで、前記菌株でＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を過剰発現するステップを含む。
【0067】
本発明の一実施形態では、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下の通りである。
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)。
本発明の一実施形態では、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下の通りである。
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)。
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)。
本発明の一実施形態では、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下の通りである。
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)。
【0068】
本発明の一実施形態では、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは以下の通りである。
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)。
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)。
【0069】
本発明の一実施形態では、前述Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとして、増幅により得られた上流相同断片、下流相同断片及び自体のプロモーターを有するＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃの３つの断片を混合してテンプレートとして増幅を行い、組み込み相同アーム断片を得る。
【0070】
本発明の一実施形態では、使用されるＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬであり、ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ（分）予備変性、９４℃、 ３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、１２０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。
【0071】
本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を用いて、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと組み込み相同アーム断片とを組み立て、組み込みプラスミドを得る。
【0072】
本発明の一実施形態では、組み込みプラスミドを宿主菌株にトランスフェクションし、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を導入する。
【0073】
本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＹＰ９７１５８である。
【0074】
本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を持つ菌株である。
【0075】
本発明の第５態様はまた、コリネバクテリウム組換え菌株の構築方法を提供する。
【0076】
本発明によれば、前記構築方法は、
ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に形質導入することで、前記菌株でＮＣｇｌ ２１７６又はＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を過剰発現するステップを含む。
ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に形質導入することで、前記菌株でＮＣｇｌ ２１７６又はＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を過剰発現するステップを含む。
【0077】
本発明の一実施形態では、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは以下の通りである。
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)。
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)。
【0078】
本発明の一実施形態では、前記ＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。
【0079】
本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を用いて、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自体のプロモーターを持つＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ断片とを組み立て、過剰発現プラスミドを得る。
【0080】
本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＹＰ９７１５８である。
【0081】
本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を持つ菌株である。
【0082】
本発明により得られた組換え菌株は単独でＬ－リジンの発酵生産に用いられて、Ｌ－リジンを産生する他の細菌と混合して発酵し、Ｌ－リジンを生産してもよい。
【0083】
本発明のさらなる態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるプロモーター領域の－４９番目、－５１番目、－５４～－５８番目の塩基が変異したヌクレオチド配列を含むプロモーターヌクレオチド配列を提供する。
【0084】
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるプロモーター領域の－４９番目のヌクレオチドシトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）に変異し、－５１番目のヌクレオチドグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に変異し、－５４～－５８番目のヌクレオチドＣＴＧＣＡがＧＧＴＧＴに変異する。
【0085】
本発明によれば、前記プロモーターヌクレオチド配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列、又は、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列とは９０％以上、好ましくは、９５％以上、又は９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であって、、（ａ）前記プロモーターの増強活性を保留し、かつ－４９番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）として保持され、－５１番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）として保持され、－５４～－５８番目のヌクレオチドがＧＧＴＧＴとして保持されるヌクレオチド配列である。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列、又は、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列とは９０％以上、好ましくは、９５％以上、又は９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であって、、（ａ）前記プロモーターの増強活性を保留し、かつ－４９番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）として保持され、－５１番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）として保持され、－５４～－５８番目のヌクレオチドがＧＧＴＧＴとして保持されるヌクレオチド配列である。
【0086】
本発明はまた、前記プロモーターと前記プロモーターの後に操作可能に連結されたコード配列とを含む上記プロモーターを含む発現カセットを提供する。本発明の一実施態様では、前記コード配列はｄａｐＢ遺伝子のコード配列である。
【0087】
本発明はまた、本発明のプロモーターヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供する。
【0088】
本発明によれば、本発明のプロモーターヌクレオチド配列をシャトルプラスミドに連結して前記組換えベクターを構築し、本発明の一実施態様として、前記シャトルプラスミドはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。
【0089】
本発明はまた、上記プロモーターヌクレオチド配列又は上記組換えベクターを含む組換え菌株を提供する。
【0090】
本発明による組換え菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列を含む。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列はｄａｐＢ遺伝子のプロモーター領域である。さらに、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるヌクレオチド配列はｄａｐＢ遺伝子コード配列に連結される。具体的には、前記組換え菌株は、本発明の上記発現カセット又は組換えベクターを含んでもよい。具体的には、本発明の組換え菌株は発現カセット又は組換えベクターで形質転換されたものである。本発明による組換え菌株は、上記変異したプロモーターヌクレオチド配列を宿主菌株に導入して組換えたものであり、前記宿主菌株は、本分野で公知のＬ－リジン産生菌株、例えばコリネバクテリウムから選ばれる少なくとも１種であってもよく、前記コリネバクテリウムはコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・クレナタム、コリネバクテリウム・ペキネンスであってもよいが、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムである。本発明の一実施態様として、前記宿主菌株はＹＰ９７１５８である。
【0091】
本発明による組換え菌株は、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドをベクターとする。
【0092】
本発明による組換え菌株は、他の改変をさらに含んでもよい。
【0093】
本発明はまた、
－４９番目、－５１番目及び－５４～－５８番目の塩基が変異するようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるプロモーター領域を改変し、変異したプロモーター領域を含むヌクレオチド配列を得るステップ（１）を含むＬ－リジン産生組換え菌株の構築方法を提供する。
－４９番目、－５１番目及び－５４～－５８番目の塩基が変異するようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるプロモーター領域を改変し、変異したプロモーター領域を含むヌクレオチド配列を得るステップ（１）を含むＬ－リジン産生組換え菌株の構築方法を提供する。
【0094】
本発明によれば、前記変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるプロモーター領域の－４９番目のヌクレオチドシトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）に変異し、－５１番目のヌクレオチドグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に変異し、－５４～－５８番目のヌクレオチドＣＴＧＣＡがＧＧＴＧＴに変異することを指す。具体的には、前記変異したプロモーター領域のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される。さらに、前記構築方法は、前記変異したプロモーター領域ヌクレオチド配列をプラスミドに連結し、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異したプロモーター領域を含むＬ－リジン産生組換え菌株を得るステップ（３）とをさらに含む。
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異したプロモーター領域を含むＬ－リジン産生組換え菌株を得るステップ（３）とをさらに含む。
【0095】
本発明によれば、前記ステップ（１）では、前記変異方法は、誘発変異、ＰＣＲ部位特異的突然変異又は相同組換えを含むが、好ましくは、ＰＣＲ部位特異的突然変異法である。
【0096】
本発明によれば、前記ステップ（１）は、
ｄａｐＢ遺伝子のプロモーター領域を増幅する２対のプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によって、変異したプロモーター領域ヌクレオチド配列を得ることを含む。
ｄａｐＢ遺伝子のプロモーター領域を増幅する２対のプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によって、変異したプロモーター領域ヌクレオチド配列を得ることを含む。
【0097】
本発明の一実施態様では、前記ステップ（１）のプライマーは以下の通りである。
P1’:5' CCGGAATTC ACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGC GAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
P1’:5' CCGGAATTC ACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGC GAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
【0098】
本発明の一実施態様では、前記ステップ（１）は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１’とＰ２’、Ｐ３’とＰ４’でＰＣＲ増幅を行い、点突然変異を含む２本のＤＮＡ断片を得ることと、上記２本のＤＮＡ断片をテンプレート、Ｐ１’とＰ４’をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲ増幅（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）によって、本発明のプロモーター領域ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）を含むＤＮＡ断片を得ることとを含む。
【0099】
本発明によれば、ステップ（１）では、オーバーラップＰＣＲ増幅（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）によって得られたＤＮＡ断片の両端のそれぞれにＥｃｏＲ ＩとＳｐｈ Ｉ制限酵素切断部位を含有する。
【0100】
本発明によれば、前記ステップ（２）は、オーバーラップＰＣＲ反応で増幅された産物を分離精製し、断片を二重制限酵素切断（ダブルダイジェスト（Double digestion））（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ）に供した後、同様に二重制限酵素切断（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ）を受けたシャトルプラスミドに連結し、対立遺伝子置換組換えベクターを得ることを含む。
【0101】
本発明によれば、前記シャトルプラスミドはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドであり、構築された組換えベクターはｐＫ１８－Ｐ ｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）である。
【0102】
本発明の一実施態様では、前記組換えプラスミドはカナマイシン耐性マーカーを有する。
【0103】
本発明の一実施態様では、前記ステップ（３）の形質転換は電気的形質転換法であり、例示的には、前記ステップ（３）では、組換えプラスミドは菌株ＹＰ９７１５８に形質転換される。
【0104】
本発明はまた、本発明の前述微生物又は組換え菌株のＬ－リジン製造における使用、又はＬ－リジン発酵量の向上方法、又はＬ－リジンの生産方法を提供する。
【0105】
本発明による前記使用及び方法は、前記微生物又は組換え菌株を培養して発酵し、前記培養物からＬ－リジンを回収し、Ｌ－リジンを得るステップを含む。本発明による前記使用及び方法は、本発明の組換え菌株を単独で使用してもよいし、他のＬ－リジン産生細菌として混合して使用してもよい。
【0106】
本分野で既知の培養条件下で適切な培地にて微生物を培養してもよい。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。培養中、培養物のｐＨを調節することができる。さらに、培養するときに、気泡の発生、例えば消泡剤を用いて気泡の発生を防止することを含んでもよい。さらに、培養するときに、ガスを培養物に注射することを含んでよい。ガスは培養物の好気条件を維持しうる任意のガスを含んでもよい。培養中、培養物の温度は２０～４５℃であってもよい。培養物から生成したＬ－リジンを回収してもよく、即ち、硫酸又は塩化水素酸で培養物を処理した後、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、濃縮、結晶化や等電点沈殿の方法の組み合わせを行う。
【0107】
本発明において各配列番号は、以下のとおりである：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １：ＮＣｇｌ２１７６野生型ＯＲＦ配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２：ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８ＣＯＲＦ配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３：ＮＣｇｌ２１７６野生型コードタンパク質のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４：ＮＣｇｌ２１７６Ｋ１７６Ｎコードタンパク質のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２９：野生型プロモーター配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３０：突然変異后プロモーター配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １：ＮＣｇｌ２１７６野生型ＯＲＦ配列
【0108】
有利な効果
本発明は、ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子を弱化又はノックアウトした結果、該遺伝子によってコードされる産物がＬ－リジン産生能に影響を与え、コード配列に点突然変異を導入したり、該遺伝子のコピー数を増加したり、得た組換え菌株を過剰発現したりすることで、得た菌株が未改変の菌株に比べて、高濃度のＬ－リジンの生産に有利であることを見出した。
さらに、ｄａｐＢ遺伝子のプロモーター領域に点突然変異を導入することで、組換え型菌株を得る場合、得られた菌株も、未突然変異的菌株に比べて、Ｌ－リジンの産生量を大幅に向上させ、生成効率をさらに高め、生成コストを低下させ、普及に有利である。
本発明は、ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子を弱化又はノックアウトした結果、該遺伝子によってコードされる産物がＬ－リジン産生能に影響を与え、コード配列に点突然変異を導入したり、該遺伝子のコピー数を増加したり、得た組換え菌株を過剰発現したりすることで、得た菌株が未改変の菌株に比べて、高濃度のＬ－リジンの生産に有利であることを見出した。
さらに、ｄａｐＢ遺伝子のプロモーター領域に点突然変異を導入することで、組換え型菌株を得る場合、得られた菌株も、未突然変異的菌株に比べて、Ｌ－リジンの産生量を大幅に向上させ、生成効率をさらに高め、生成コストを低下させ、普及に有利である。
【発明を実施するための形態】
【0109】
以下、具体的な実施例を参照して本発明の技術的解決手段についてさらに詳細に説明する。なお、以下の実施例は本発明を例示的に説明、解説するものに過ぎず、本発明の特権利範囲を限定するものとして理解すべきではない。本発明の上記内容に基づいて実現され得るる技術であれば、本発明が特許しようとする範囲に含まれる。特に断らない限り、以下の実施例に使用される原料及び試薬は全て市販商品であるか、又は既知の方法によって製造することができ、行われる操作は全て本分野で公知のものであるか、又は市販品のユーザーマニュアルに従って行われる。
【0110】
以下の実施例では、前記菌株の培養に使用される基礎培地の組成が同じであり、この基礎培地の組成に所望のスクロース、カナマイシンやクロラムフェニコールなどが添加されており、基礎培地の組成は以下に示される。
【0111】
以下の実施例では、ＳＳＣＰ電気泳動ＰＡＧＥの製造及び条件は以下に示される。
【0112】
以下の実施例では、Ｌ－リジンの発酵培地処方及び発酵制御のプロセスは以下に示される。
【0113】
【0114】
実施例１ 点突然変異ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃの構築
ＮＣＢＩによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株ＹＰ９７１５８（受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２８５６、受託日期：２０１６年８月１６日、受託機関：中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）中）の背景に記載のＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に点突然変異を導入し、コードタンパク質を対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子のヌクレオチド配列の５２８番目のＡはＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ）に変わり、コードタンパク質を対応するアミノ酸配列の１７６番目のリジンはアスパラギン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＮＣｇｌ２１７６Ｋ１７６Ｎ）に変わった。
プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）。
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４でＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、４０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。サイズがそれぞれ７９６ｂｐ及び７８６ｂｐであり、ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域を含有する２本のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ２１７６ＵｐとＮＣｇｌ２１７６Ｄｏｗｎ）が得られた。
上記２本のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、上記２本のＤＮＡ断片をテンプレート、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲによって、長さ約１５５２ｂｐの断片を増幅した。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃ １０ｍｉｎ過剰伸長。
このＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ）によって、ＹＰ９７１５８ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域の５２８番目のアデニン（Ａ）はシトシン（Ｃ）に変わり、最終的には、コードタンパク質の１７６番目のアミノ酸はリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変わった。
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入）をＸｂａ Ｉで制限酵素切断した後、アガロースゲル電気泳動によってＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃと線形化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドとを分離精製し、次に、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを得て、該プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含有されている。ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを配列決定会社に送って配列決定同定を行い、正しい点突然変異（Ａ－Ｃ）を含むベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを保管して、使用に備えた。
ＮＣＢＩによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株ＹＰ９７１５８（受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１２８５６、受託日期：２０１６年８月１６日、受託機関：中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）中）の背景に記載のＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に点突然変異を導入し、コードタンパク質を対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子のヌクレオチド配列の５２８番目のＡはＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ）に変わり、コードタンパク質を対応するアミノ酸配列の１７６番目のリジンはアスパラギン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＮＣｇｌ２１７６Ｋ１７６Ｎ）に変わった。
プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）。
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４でＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、４０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。サイズがそれぞれ７９６ｂｐ及び７８６ｂｐであり、ＮＣｇｌ ２１７６遺伝子コード領域を含有する２本のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ２１７６ＵｐとＮＣｇｌ２１７６Ｄｏｗｎ）が得られた。
上記２本のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、上記２本のＤＮＡ断片をテンプレート、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲによって、長さ約１５５２ｂｐの断片を増幅した。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃ １０ｍｉｎ過剰伸長。
このＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ）によって、ＹＰ９７１５８ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域の５２８番目のアデニン（Ａ）はシトシン（Ｃ）に変わり、最終的には、コードタンパク質の１７６番目のアミノ酸はリジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変わった。
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入）をＸｂａ Ｉで制限酵素切断した後、アガロースゲル電気泳動によってＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃと線形化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドとを分離精製し、次に、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを得て、該プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含有されている。ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを配列決定会社に送って配列決定同定を行い、正しい点突然変異（Ａ－Ｃ）を含むベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを保管して、使用に備えた。
【0115】
実施例２ 点突然変異ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを含む改変菌株の構築
構築方法：対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを電気ショックによりＬ－リジン生産菌株ＹＰ９７１５８（その構築方法はＷＯ２０１４１２１６６９Ａ１を参照する。配列決定した結果、該菌株染色体に野生型のＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域が保留されている）に形質転換し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれプライマーＰ１及びユニバーサルプライマーＭ１３Ｒで同定し、サイズが約１５５９ｂｐのバンドを増幅できる菌株を陽性菌株とした。１５％スクロース含有培地で陽性菌株を培養し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培で成長していない菌株を、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）でＰＣＲ同定を行った。
P5:5'GAAAACACCGCCCGAATC 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'GGAGTGCGTGTTTGTTGATG 3'(SEQ ID NO:10)
上記ＰＣＲ増幅産物を高温で変性し、氷浴処理をした後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ増幅断片を陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片の構造が異なるので、電気泳動位置が異なり、このため、断片の電気泳動位置が陰性対照の断片位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する菌株は対立遺伝子置換に成功した菌株であった。プライマーＰ５とＰ６を用いて、再度ＰＣＲによって対立遺伝子置換に成功した菌株の目的断片を増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結して、配列決定を行い、配列アラインメントの結果塩基配列が突然変異した配列は、菌株の対立遺伝子置換が成功したと検証し、ＹＰＬ－４－０１１と命名された。
構築方法：対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを電気ショックによりＬ－リジン生産菌株ＹＰ９７１５８（その構築方法はＷＯ２０１４１２１６６９Ａ１を参照する。配列決定した結果、該菌株染色体に野生型のＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域が保留されている）に形質転換し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれプライマーＰ１及びユニバーサルプライマーＭ１３Ｒで同定し、サイズが約１５５９ｂｐのバンドを増幅できる菌株を陽性菌株とした。１５％スクロース含有培地で陽性菌株を培養し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培で成長していない菌株を、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）でＰＣＲ同定を行った。
P5:5'GAAAACACCGCCCGAATC 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'GGAGTGCGTGTTTGTTGATG 3'(SEQ ID NO:10)
上記ＰＣＲ増幅産物を高温で変性し、氷浴処理をした後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ増幅断片を陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片の構造が異なるので、電気泳動位置が異なり、このため、断片の電気泳動位置が陰性対照の断片位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する菌株は対立遺伝子置換に成功した菌株であった。プライマーＰ５とＰ６を用いて、再度ＰＣＲによって対立遺伝子置換に成功した菌株の目的断片を増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結して、配列決定を行い、配列アラインメントの結果塩基配列が突然変異した配列は、菌株の対立遺伝子置換が成功したと検証し、ＹＰＬ－４－０１１と命名された。
【0116】
実施例３ ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子をゲノムで過剰発現させた改変菌株の構築
ＮＣＢＩによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する３対のプライマーを設計して合成し、相同組換えによって菌株ＹＰ９７１５８にＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を導入した。
プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司より合成）。
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０１１をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２のそれぞれでＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約７２０ｂｐ、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子及びそのプロモーター断片約１０９２ｂｐ、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子及びそのプロモーター断片約１０９２ｂｐ、並びに下流相同アーム断片約６５３ｂｐを得た。次に、Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとして、以上で増幅させた３つの断片（上流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子及びそのプロモーター断片、下流相同アーム断片、又は、上流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子及びそのプロモーター断片、下流相同アーム断片）を混合してテンプレートとして増幅を行い、組み込み相同アーム断片を得た。
ＰＣＲ反応終了後、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムＤＮＡゲル回収キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）で所望の約２５０４ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により、Ｘｂａ Ｉで消化されて回収されたシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに連結し、組み込みプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ２１７６又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃをそれぞれ取得し、プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含有されており、カナマイシンによるスクリーニングによって、プラスミドがゲノムに組み込まれた組換え体が得られた。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、１２０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。
２つの組み込みプラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌の菌株ＹＰ９７１５８にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをＰ１３／Ｐ１４プライマーでＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲによりサイズ約１６０９ｂｐの断片が増幅されたものを陽性菌株、断片が増幅されなかったものを原菌とした。陽性菌株を１５％スクロースによるスクリーニングに供した後、それぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらにＰ１５／Ｐ１６プライマーでＰＣＲ同定を行い、サイズ約１１２３ｂｐが増幅された菌はＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに組み込まれた菌株であり、それぞれＹＰＬ－４－０１２（点突然変異無し）とＹＰＬ－４－０１３（点突然変異有り）と命名された。
P13:5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:17)
P14:5'CCTGAGCGGAATAGTCCTGTG3'(SEQ ID NO:18)
P15:5'ACGCACCCGTGTTCTACCT3'(SEQ ID NO:19)
P16:5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:20)
ＮＣＢＩによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する３対のプライマーを設計して合成し、相同組換えによって菌株ＹＰ９７１５８にＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子を導入した。
プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司より合成）。
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０１１をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２のそれぞれでＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約７２０ｂｐ、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子及びそのプロモーター断片約１０９２ｂｐ、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子及びそのプロモーター断片約１０９２ｂｐ、並びに下流相同アーム断片約６５３ｂｐを得た。次に、Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとして、以上で増幅させた３つの断片（上流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子及びそのプロモーター断片、下流相同アーム断片、又は、上流相同アーム断片、ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子及びそのプロモーター断片、下流相同アーム断片）を混合してテンプレートとして増幅を行い、組み込み相同アーム断片を得た。
ＰＣＲ反応終了後、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムＤＮＡゲル回収キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）で所望の約２５０４ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により、Ｘｂａ Ｉで消化されて回収されたシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに連結し、組み込みプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ２１７６又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃをそれぞれ取得し、プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含有されており、カナマイシンによるスクリーニングによって、プラスミドがゲノムに組み込まれた組換え体が得られた。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、１２０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。
２つの組み込みプラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌の菌株ＹＰ９７１５８にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをＰ１３／Ｐ１４プライマーでＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲによりサイズ約１６０９ｂｐの断片が増幅されたものを陽性菌株、断片が増幅されなかったものを原菌とした。陽性菌株を１５％スクロースによるスクリーニングに供した後、それぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらにＰ１５／Ｐ１６プライマーでＰＣＲ同定を行い、サイズ約１１２３ｂｐが増幅された菌はＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに組み込まれた菌株であり、それぞれＹＰＬ－４－０１２（点突然変異無し）とＹＰＬ－４－０１３（点突然変異有り）と命名された。
P13:5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:17)
P14:5'CCTGAGCGGAATAGTCCTGTG3'(SEQ ID NO:18)
P15:5'ACGCACCCGTGTTCTACCT3'(SEQ ID NO:19)
P16:5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:20)
【0117】
実施例４ ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子をプラスミドで過剰発現させた改変菌株の構築
ＮＣＢＩによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する１対のプライマーを設計して合成し、プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成）。
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)
構築方法：野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０１１をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子及びそのプロモーター断片１１４０ｂｐを得て、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムＤＮＡゲル回収キットで所望の１１４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により、ＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で切断されて回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９に連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ２１７６又はｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを得た。プラスミドにはクロラムフェニコール耐性マーカーが含有されており、クロラムフェニコールによるスクリーニングによって、プラスミドが形質転換された菌株が得られた。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、 １０ｍｉｎ過剰伸長。
プラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌の菌株ＹＰ９７１５８にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをＭ１３Ｒ（－４８）及びＰ１８プライマーでＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲ増幅によりサイズ約１１４７ｂｐの断片を含むものを導入菌株とし、それぞれＹＰＬ－４－０１４（点突然変異無し）とＹＰＬ－４－０１５（点突然変異有り）と命名した。
ＮＣＢＩによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する１対のプライマーを設計して合成し、プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成）。
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)
構築方法：野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０１１をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＮＣｇｌ２１７６又はＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ遺伝子及びそのプロモーター断片１１４０ｂｐを得て、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムＤＮＡゲル回収キットで所望の１１４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により、ＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で切断されて回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９に連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ２１７６又はｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃを得た。プラスミドにはクロラムフェニコール耐性マーカーが含有されており、クロラムフェニコールによるスクリーニングによって、プラスミドが形質転換された菌株が得られた。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長（３０サイクル）、７２℃、 １０ｍｉｎ過剰伸長。
プラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌の菌株ＹＰ９７１５８にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをＭ１３Ｒ（－４８）及びＰ１８プライマーでＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲ増幅によりサイズ約１１４７ｂｐの断片を含むものを導入菌株とし、それぞれＹＰＬ－４－０１４（点突然変異無し）とＹＰＬ－４－０１５（点突然変異有り）と命名した。
【0118】
実施例５ ＮＣｇｌ２１７６遺伝子をゲノムで欠損した改変菌株の構築
ＮＣＢＩによるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域の両端の断片を増幅する２対のプライマーを合成して、上下流相同アーム断片とした。プライマーは以下のように設計される（上海英俊公司により合成）。
P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCAAAGAGGGCGAGATAAT3'(SEQ ID NO:23)
P20:5'GTTCATGAGACACCCAGTAGGACGACCTACAGAATACTAGTCAGTG 3'(SEQ ID NO:24)
P21:5'CACTGACTAGTATTCTGTAGGTCGTCCTACTGGGTGTCTCATGAAC 3'(SEQ ID NO:25)
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACCGCACGATGGTTCACT3'(SEQ ID NO:26)
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０及びＰ２１／Ｐ２２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片８５２ｂｐ及び下流相同アーム断片７８７ｂｐを得て、次に、プライマーＰ１９／Ｐ２２でオーバーラップＰＣＲを行い、完全な相同アーム断片１６３９を得て、ＰＣＲ反応終了後、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムＤＮＡゲル回収キットで所望の１６３９ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によりＸｂａ Ｉ制限酵素で切断されて回収されたシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドに連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含有されている。
ノックアウトプラスミドをリジン生産菌株ＹＰ９７１５８にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをそれぞれ下記プライマー（上海英俊公司により合成）によってＰＣＲ同定を行った。
P23:5'TCAAAGAGGGCGAGATAAT 3'(SEQ ID NO:27)
P24:5'ACCGCACGATGGTTCACT 3'(SEQ ID NO:28)
上記ＰＣＲによりサイズ１５２１ｂｐ及び２５５６ｂｐのバンドが増幅された菌株は陽性菌株であり、２５５６ｂｐバンドだけが増幅された菌株は原菌である。陽性菌株を１５％スクロース培地でスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらにＰ２３／Ｐ２４プライマーでＰＣＲ同定を行い、サイズ１５２１ｂｐのバンドが増幅された菌株はＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子改変菌株であり、ＹＰＬ－４－０１６と命名された。
ＮＣＢＩによるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域の両端の断片を増幅する２対のプライマーを合成して、上下流相同アーム断片とした。プライマーは以下のように設計される（上海英俊公司により合成）。
P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCAAAGAGGGCGAGATAAT3'(SEQ ID NO:23)
P20:5'GTTCATGAGACACCCAGTAGGACGACCTACAGAATACTAGTCAGTG 3'(SEQ ID NO:24)
P21:5'CACTGACTAGTATTCTGTAGGTCGTCCTACTGGGTGTCTCATGAAC 3'(SEQ ID NO:25)
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACCGCACGATGGTTCACT3'(SEQ ID NO:26)
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０及びＰ２１／Ｐ２２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片８５２ｂｐ及び下流相同アーム断片７８７ｂｐを得て、次に、プライマーＰ１９／Ｐ２２でオーバーラップＰＣＲを行い、完全な相同アーム断片１６３９を得て、ＰＣＲ反応終了後、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムＤＮＡゲル回収キットで所望の１６３９ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によりＸｂａ Ｉ制限酵素で切断されて回収されたシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドに連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含有されている。
ノックアウトプラスミドをリジン生産菌株ＹＰ９７１５８にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをそれぞれ下記プライマー（上海英俊公司により合成）によってＰＣＲ同定を行った。
P23:5'TCAAAGAGGGCGAGATAAT 3'(SEQ ID NO:27)
P24:5'ACCGCACGATGGTTCACT 3'(SEQ ID NO:28)
上記ＰＣＲによりサイズ１５２１ｂｐ及び２５５６ｂｐのバンドが増幅された菌株は陽性菌株であり、２５５６ｂｐバンドだけが増幅された菌株は原菌である。陽性菌株を１５％スクロース培地でスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらにＰ２３／Ｐ２４プライマーでＰＣＲ同定を行い、サイズ１５２１ｂｐのバンドが増幅された菌株はＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子改変菌株であり、ＹＰＬ－４－０１６と命名された。
【0119】
実施例６ Ｌ－リジン発酵実験
実施例２～５で構築された菌株と原菌株ＹＰ９７１５８とを、ＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司より購入）にて、表１に示される培地及び表２に示される制御プロセスによって、発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返して、結果を表３に示す。
表３に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてＮＣｇｌ２１７６遺伝子を過剰発現することや、ＮＣｇｌ２１７６遺伝子コード領域に対する点突然変異ＮＣｇｌ２１７６Ａ５２８Ｃ及び過剰発現は、Ｌ－リジン産生量の上昇に有利であり、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトは、リジンの蓄積に不利である。
実施例２～５で構築された菌株と原菌株ＹＰ９７１５８とを、ＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司より購入）にて、表１に示される培地及び表２に示される制御プロセスによって、発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返して、結果を表３に示す。
【0120】
実施例７ 点突然変異ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）の構築
ＮＣＢＩによるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株ＹＰ９７１５８背景中のｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）に点突然変異を導入し、ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列の－４９ｂｐ番目のＣはＡに変わり、－５１ｂｐ発酵槽のＧはＴに変わり、－５４－－５８ｂｐ ＣＴＧＣＡはＧＧＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）に変わった。
プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成）。
P1’:5' CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１’とＰ２’、Ｐ３’とＰ４’でＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、６０ｓ伸長、３０サイクル、７２℃、 １０ｍｉｎ過剰伸長。
点突然変異を有し、長さがそれぞれ６６５ｂｐ及び６４４ｂｐの２本のＤＮＡ断片（ｄａｐＢ ＵｐとｄａｐＢ Ｄｏｗｎ断片）を得た。上記２本のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、精製した２本のＤＮＡ断片をテンプレートとして、Ｐ１’とＰ４’をプライマーとして、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲによって、長さ約１２７９ｂｐの断片（Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。
Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長、３０サイクル、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。
上記Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製し、該断片は、ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域及びその上下流配列を含み、断片の両端のそれぞれにＥｃｏＲ ＩとＳｐｈ Ｉ制限酵素切断部位を有する。このＤＮＡ断片によって、ＹＰ９７１５８ ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域の－４９ｂｐ番目のＣはＡに変わり、－５１ｂｐ番目のＧはＴに変わり、－５４～－５８ｂｐ ＣＴＧＣＡはＧＧＴＧＴに変わった。
断片を二重制限酵素切断（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ）に供した後、精製して回収し、同様に二重制限酵素切断（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ）を受けたシャトルプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ公司より購入）に連結し、対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を得て、該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含有されている。ベクターｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を配列決定会社に送って配列決定同定を行い、正しい点突然変異を有するベクターｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を保管して、使用に備えた。
ＮＣＢＩによるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株ＹＰ９７１５８背景中のｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）に点突然変異を導入し、ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列の－４９ｂｐ番目のＣはＡに変わり、－５１ｂｐ発酵槽のＧはＴに変わり、－５４－－５８ｂｐ ＣＴＧＣＡはＧＧＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）に変わった。
プライマーは以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成）。
P1’:5' CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、それぞれプライマーＰ１’とＰ２’、Ｐ３’とＰ４’でＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、６０ｓ伸長、３０サイクル、７２℃、 １０ｍｉｎ過剰伸長。
点突然変異を有し、長さがそれぞれ６６５ｂｐ及び６４４ｂｐの２本のＤＮＡ断片（ｄａｐＢ ＵｐとｄａｐＢ Ｄｏｗｎ断片）を得た。上記２本のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、精製した２本のＤＮＡ断片をテンプレートとして、Ｐ１’とＰ４’をプライマーとして、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲによって、長さ約１２７９ｂｐの断片（Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。
Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、全体積５０μＬ。
前記Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ増幅は以下のように行われる。９４℃、５ｍｉｎ予備変性、９４℃、３０ｓ変性、５２℃、３０ｓアニーリング、７２℃、９０ｓ伸長、３０サイクル、７２℃、１０ｍｉｎ過剰伸長。
上記Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製し、該断片は、ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域及びその上下流配列を含み、断片の両端のそれぞれにＥｃｏＲ ＩとＳｐｈ Ｉ制限酵素切断部位を有する。このＤＮＡ断片によって、ＹＰ９７１５８ ｄａｐＢ遺伝子プロモーター領域の－４９ｂｐ番目のＣはＡに変わり、－５１ｂｐ番目のＧはＴに変わり、－５４～－５８ｂｐ ＣＴＧＣＡはＧＧＴＧＴに変わった。
断片を二重制限酵素切断（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ）に供した後、精製して回収し、同様に二重制限酵素切断（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ）を受けたシャトルプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ公司より購入）に連結し、対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を得て、該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含有されている。ベクターｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を配列決定会社に送って配列決定同定を行い、正しい点突然変異を有するベクターｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を保管して、使用に備えた。
【0121】
実施例８ 点突然変異ｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を含む改変菌株の構築
対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を電気ショックによりＬ－リジン生産菌株ＹＰ９７１５８（配列決定の結果、該菌株の染色体には野生型ｄａｐＢ遺伝子プロモーターが保留されている）に形質転換し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれプライマーＰ１’及びユニバーサルプライマーＭ１３Ｆで同定し、サイズ１３５０ｂｐのバンドが増幅された菌株は陽性菌株であった。陽性菌株を１５％スクロース含有培地で培養し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養した。
カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらに下記プライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成）でＰＣＲ同定を行った。
P5’:5'AGATCGTCGGACTCATTGAC3'(SEQ ID NO:35)
P6’:5'CAAACATAGTTCCACCTGTG 3'(SEQ ID NO:36)
上記ＰＣＲ増幅産物を高温で変性し、氷浴処理した後、ＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）増幅断片を陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なるので、電気泳動位置が異なり、このため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、陽性対照断片の位置と一致する菌株は対立遺伝子置換に成功した菌株であった。次に、ＰＣＲによって陽性菌株の目的断片を増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結して配列決定を行い、配列アラインメントの結果塩基配列が突然変異した配列は、菌株の対立遺伝子置換に成功したと検証し、ＹＰＬ－４－０１０と命名された。
対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を電気ショックによりＬ－リジン生産菌株ＹＰ９７１５８（配列決定の結果、該菌株の染色体には野生型ｄａｐＢ遺伝子プロモーターが保留されている）に形質転換し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれプライマーＰ１’及びユニバーサルプライマーＭ１３Ｆで同定し、サイズ１３５０ｂｐのバンドが増幅された菌株は陽性菌株であった。陽性菌株を１５％スクロース含有培地で培養し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養した。
カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらに下記プライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成）でＰＣＲ同定を行った。
P5’:5'AGATCGTCGGACTCATTGAC3'(SEQ ID NO:35)
P6’:5'CAAACATAGTTCCACCTGTG 3'(SEQ ID NO:36)
上記ＰＣＲ増幅産物を高温で変性し、氷浴処理した後、ＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）増幅断片を陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なるので、電気泳動位置が異なり、このため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、陽性対照断片の位置と一致する菌株は対立遺伝子置換に成功した菌株であった。次に、ＰＣＲによって陽性菌株の目的断片を増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結して配列決定を行い、配列アラインメントの結果塩基配列が突然変異した配列は、菌株の対立遺伝子置換に成功したと検証し、ＹＰＬ－４－０１０と命名された。
【0122】
実施例９ Ｌ－リジン発酵実験
実施例８で構築された菌株ＹＰＬ－４－０１０及び原菌株ＹＰ９７１５８を、ＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司（bailun bio）より購入）にて、表１に示される培地及び表２に示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返して、結果を表４に示す。
表４に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにｄａｐＢ遺伝子プロモーターの点突然変異したＰｄａｐＢ（Ｃ（－４９）Ａ,Ｇ（－５１）Ｔ,ＣＴＧＣＡ（－５４－－５８）ＧＧＴＧＴ）を供することは、Ｌ－リジン産生量の上昇に有利である。
実施例８で構築された菌株ＹＰＬ－４－０１０及び原菌株ＹＰ９７１５８を、ＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司（bailun bio）より購入）にて、表１に示される培地及び表２に示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返して、結果を表４に示す。
【0123】
以上は、本発明の実施形態を説明した。ただし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の主旨及び原則を逸脱することなく行われる全ての修正、同等置換、改良などは本発明の特許範囲に含まれるものとする。
【配列表】