特許 7644457 高純度ヒアルロン酸およびそのオリゴ糖を効率的に合成するための組換えコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-03-04

(45)【発行日】2025-03-12

(54)【発明の名称】高純度ヒアルロン酸およびそのオリゴ糖を効率的に合成するための組換えコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20250305BHJP

   C12P 19/26 20060101ALI20250305BHJP

   C07K 14/22 20060101ALN20250305BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20250305BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20250305BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20250305BHJP

   C12R 1/15 20060101ALN20250305BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12P19/26

C07K14/22

C12N9/10

C12N15/31

C12N15/54

C12R1:15

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2022524109

(86)(22)【出願日】2019-12-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-07

(86)【国際出願番号】 CN2019126013

(87)【国際公開番号】W WO2021077580

(87)【国際公開日】2021-04-29

【審査請求日】2022-09-30

(31)【優先権主張番号】201911018182.4

(32)【優先日】2019-10-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】521282033

【氏名又は名称】ブルーメイジ バイオテクノロジー コーポレイション リミティド

(73)【特許権者】

【識別番号】522163986

【氏名又は名称】チアンナン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】カン チェン

(72)【発明者】

【氏名】チェン チエン

(72)【発明者】

【氏名】フー リータオ

(72)【発明者】

【氏名】トゥー クオチョン

(72)【発明者】

【氏名】ワン ヤン

(72)【発明者】

【氏名】リー チアンホア

(72)【発明者】

【氏名】リー チアリエン

(72)【発明者】

【氏名】チャン ティエンモン

【審査官】藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０３９３７７３４（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７３５４１１９（ＣＮ，Ａ）

【文献】TANIGUCHI et al.，BMC Microbiology，2017年，Vol. 17, No. 1，DOI: 10.1186/s12866-017-1067-6

【文献】PFEIFER-SANCAR et al.，BMC Genomics，2013年，Vol. 14, No. 1，DOI: 10.1186/1471-2164-14-888

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エキソポリサッカライド遺伝子ｃｇ０４２０および／またはｃｇ０４２４がサイレンシングまたはノックアウトされた、およびヒアルロン酸合成酵素が発現されたことを特徴とする、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)であって、前記ヒアルロン酸合成酵素は、下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)に由来し、そして配列番号３に示すアミノ酸配列を有する酵素；
（ｂ）配列番号３に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、そしてヒアルロン酸合成活性を有する酵素
で示される、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)。

【請求項2】

ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよび／またはＵＤＰ－グルクロン酸経路が促進された、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)。

【請求項3】

前記ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン経路が、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼ、及びＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ／グルコース－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼの二機能性酵素を含み；およびＵＤＰ-グルクロン酸経路がホスホグルコムターゼ、グルコース－６－リン酸ウレアアミドトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ－グルコースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする、請求項２に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)。

【請求項4】

Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ由来のヘモグロビンＶＨｂも発現していることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)。

【請求項5】

前記ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよび／またはＵＤＰ－グルクロン酸経路をコードする遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)で発現するようにベクターにライゲートされていることを特徴とし、前記ベクターがｐＸＭＪ１９、ｐＥＣＸＫ９９Ｅ、ｐＥＣ－ＸＴ９９Ａ、ｐＥＫＥｘ１、ｐＥＫＥｘ２、ｐＶＷＥｘ１、ｐＶＷＥｘ２、ｐＺ８－１、ｐＥＣＴＡＣ－Ｋ９９およびｐＡＰＥ１２のいずれか一つを含み、ここで前記ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよび／またはＵＤＰ－グルクロン酸経路をコードする遺伝子は、ｐｇＭ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭ、及びｇｌｍＵから選ばれる少なくとも１の遺伝子である、請求項２又は３に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)。

【請求項6】

前記ヘモグロビンＶＨｂをコードする遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)で発現するようにベクターにライゲートされていることを特徴とし、前記ベクターがｐＸＭＪ１９、ｐＥＣＸＫ９９Ｅ、ｐＥＣ－ＸＴ９９Ａ、ｐＥＫＥｘ１、ｐＥＫＥｘ２、ｐＶＷＥｘ１、ｐＶＷＥｘ２、ｐＺ８－１、ｐＥＣＴＡＣ－Ｋ９９およびｐＡＰＥ１２のいずれか一つを含む、請求項４に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)。

【請求項7】

下記工程：
（１）エキソポリサッカライド合成遺伝子ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４を段階的または同時にノックアウトする工程、および（２）ヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子、ヘモグロビンＶＨｂをコードする遺伝子、およびｐｇＭ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵから選択される少なくとも一つの遺伝子をベクターにライゲートしてコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の細胞中に形質転換される工程、
を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の構築方法。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を使用して発酵を実施し、炭素源、窒素源、無機塩類、金属イオンおよび酸素を含む培養環境下で、２５～３５℃で２４～７２時間発酵を行うことを特徴とする、ヒアルロン酸の製造方法。

【請求項9】

ヒアルロン酸加水分解酵素またはヒアルロン酸リアーゼを発酵初期の段階で添加し、前記ヒアルロン酸加水分解酵素またはヒアルロン酸リアーゼの添加量が５００～５００００Ｕ／ｍＬである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

グルコースが前記発酵の工程中で補充されることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

ヒアルロン酸およびその誘導体生成物の調製における、請求項１から７のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野
本発明は、高純度ヒアルロン酸およびそのオリゴ糖を効率的に合成するための組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に関し、生体工学の技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
ヒアルロン酸は、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸から構成される二糖類単位が重合することによる直鎖の酸性ムコ多糖類である。超高分子量のヒアルロン酸は、良好な粘弾性、保湿性および抗炎症性などの機能を有し、眼科手術における粘弾性剤、関節内注入による治療などに使用され得る。高分子量のヒアルロン酸は保湿効果および潤滑効果に優れ、化粧品分野で使用され得る。高純度のヒアルロン酸およびオリゴ糖は、抗腫瘍、創傷治癒促進、骨形成および血管新生促進、および免疫調整などの作用を有する。２０１６年、ヒアルロン酸の世界市場は７２億米ドルであり、および２０２０年には世界全体で１０８億米ドルに達すると予測される。

【0003】

現在、市販のヒアルロン酸は、天然にヒアルロン酸を産生するスプレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）の発酵により主に得られる。しかしながら、スプレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）は病原性のある菌株であり、多くの疾患を引き起こし得るため、スプレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）により産生されるヒアルロン酸は、医療、食品およびその他の分野の要求を満たすことが困難であった。さらに、それらから産生されるヒアルロン酸は、低純度を有し、製品の品質が低下する。この問題を解決するため、遺伝子工学技術が枯草菌(Bacillus subtilis)およびコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)などのいくつかの工学菌株にヒアルロン酸合成酵素を異種発現させて、ヒアルロン酸を合成することに使用された。しかしながら、枯草菌（Bacillus subtilis）自体は細胞溶解性の傾向があり、および細胞溶解により放出されたＤＮＡがヒアルロン酸生成物へのコンタミネーションを引き起こすことになる。対照的に、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は枯草菌(Bacillus subtil)より細胞壁が厚く、耐性が強く、および細胞の安定性が高い。しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は細胞外でより多くのエキソポリサッカライドを合成することになる。これらのポリサッカライドはヒアルロン酸合成経路において基質と競合するだけでなく、下流のヒアルロン酸の精製を困難にし、それによってヒアルロン酸生成物の品質を低下させる。

【発明の概要】

【0004】

本発明の概要
発明の第一目的は、エキソポリサッカライド遺伝子ｃｇ０４２０および／またはｃｇ０４２４がサイレンシングまたはノックアウトされ、かつヒアルロン酸合成酵素が発現している組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を提供することである；遺伝子ｃｇ０４２０は配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み；ｃｇ０４２４は配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含み；およびヒアルロン酸合成酵素は（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示される通りである。
（ａ）化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)および配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有するそのアミノ酸配列に由来する酵素；
（ｂ）配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する酵素。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に基づいて置換または欠失され、およびヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。

【0005】

一実施形態において、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のエキソポリサッカライド遺伝子ｃｇ０４２０（配列番号１）およびｃｇ０４２４（配列番号２）がサイレンシングまたはノックアウトされ、ヒアルロン酸合成酵素が組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)で発現される。

【0006】

一実施形態において、ヒアルロン酸合成酵素は化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes） (配列番号３)由来である。

【0007】

一実施形態において、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよび／またはＵＤＰ－グルクロン酸経路はコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)において促進される。

【0008】

一実施形態において、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン経路は、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ／グルコース－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼの二機能性酵素を含む。

【0009】

一実施形態において、ＵＤＰ-グルクロン酸経路は、ホスホグルコムターゼ、グルコース－６－リン酸ウレアアミドトランスフェラーゼ、ＵＤＰ－グルコースデヒドロゲナーゼを含む。

【0010】

一実施形態において、ホスホグルコムターゼｐｇｍ（配列番号４）、グルコース－６－リン酸ウレアアミドトランスフェラーゼＧａｌＵ（配列番号５）、ＵＤＰ－グルコースデヒドロゲナーゼＵｇｄ（配列番号６）、グルタミンフルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼＧｌｍＳ（配列番号７）、ホスホグルコムターゼＧｌｍＭ（配列番号８）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ／グルコース－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼの二機能性酵素ＧｌｍＵ（配列番号９）は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０由来である。

【0011】

いくつかの実施形態において、上記で説明した任意のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)において、ｐｇＭ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍｓ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵから選択される少なくとも一つの遺伝子発現が促進される。

【0012】

一実施形態において、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は、工業的に安全なコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の菌株由来であり、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｈａｓＡを異種発現させたものである。組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)エキソポリサッカライド遺伝子ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４をノックアウトして細胞外表面からヘテロポリサッカライドを除去し、発現カセットを構築して経路遺伝子ｐｇＭ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍｓ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵの発現を高めることによって、ヒアルロン酸の合成基質である、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよびＵＤＰ－グルクロン酸の産生を増加させたものである。

【0013】

一実施形態において、上記で説明したコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のいずれか一つはまた、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の微好気環境での増殖およびヒアルロン酸合成能力を改善するために、ＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンＶＨｂ（配列番号１０）を発現する。本発明の第二の目的は、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の構築方法を提供することであり、当該方法は（１）段階的または同時にノックアウトボックスを構築することによりエキソポリサッカライド遺伝子ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４をノックアウトすること；（２）ヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子およびｐｇＭ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵから選択される少なくとも一つの遺伝子をベクターにライゲートし、これを目的の菌株の細胞に形質転換させること、を含む。

【0014】

一実施形態において、ベクターは、ｐＸＭＪ１９、ｐＥＣＸＫ９９Ｅ、ｐＥＣ－ＸＴ９９Ａ、ｐＥＫＥｘ１、ｐＥＫＥｘ２、ｐＶＷＥｘ１、ｐＶＷＥｘ２、ｐＺ８－１、ｐＥＣＴＡＣ－Ｋ９９またはｐＡＰＥ１２であってよい（上記ベクターは、Eggeling, L. and Bott, M., Handbook of corynebacterium glutamicum. 2005, Boca Raton: Taylor & Francis. 616 pに開示されている。）

【0015】

一実施形態において、当該方法は、ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｕｇｄをベクターｐＸＭＪ１９にライゲートすることに関する。

【0016】

一実施形態において、当該方法は、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭ、ｇｌｍＵをベクターｐＥＣＸＫ９９Ｅにライゲートすることに関する。

【0017】

本方法の第三の目的は、ヒアルロン酸の製造方法を提供することであり、当該方法は組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を発酵することを含む。

【0018】

一実施形態において、その発酵は２４時間～７２時間、２５～３５℃で実施される。

【0019】

一実施形態において、当該方法はまた、発酵の初期にヒアルロン酸加水分解酵素またはヒアルロン酸リアーゼを添加することも含み、ヒアルロン酸加水分解酵素またはヒアルロン酸リアーゼは５００～５００００Ｕ／ｍＬの量で添加される。

【0020】

本発明の第四の目的は、ヒアルロン酸およびその誘導体生成物の調製における組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の使用を提供することである。

【0021】

有益な効果：本発明では、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｈａｓＡを異種発現する工業的に安全な菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)におけるヒアルロン酸の合成経路を構築する。コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のエキソポリサッカライド遺伝子ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４をノックアウトし、それによって細胞質外表面からヘテロポリサッカライドを除去することによりヒアルロン酸の純度を向上させた。ヒアルロン酸の合成基質であるＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよびＵＤＰ－グルクロン酸の合成を増加する経路遺伝子ｐｇＭ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍｓ、ｇｌｍＭ、およびｇｌｍＵの発現を高める発現カセットを構築し、ヒアルロン酸合成時の基質供給不足の課題を解決することによって、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のヒアルロン酸合成能力を高める。また、発酵過程中の溶存酸素不足の問題を解決するために、ＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビンＶＨｂを組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に発現させ、微好気環境での組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の増殖およびヒアルロン酸合成能力を向上させる。ｃｇ０４２０をノックアウトすることにより、ヒアルロン酸の収率および純度の両方がある程度改善された。粗生成物の収率は１８ｇ／Ｌから２３ｇ／Ｌへと２７．８％増加し、純度は７５％から８６％へと増加した。ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４の両方をノックアウトすることにより、ヒアルロン酸の収率は５８．３％増加し、２８．５ｇ／Ｌに達し、粗生成物の純度は９５％に達する。ダブルノックアウトおよびＶＨｂ発現により、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の生産能力は４０ｇ／Ｌに達し、オリジナル株と比較して４０．３％向上している。ヒアルロン酸のオリゴ糖の生産は、発酵プロセス中に６０００Ｕ／ｍＬの外来性ヒアルロン酸加水分解酵素を添加することにより達成される。最終的に、ヒアルロン酸の生産能力は７２ｇ／Ｌに達し、オリジナル株に比べて１５２．６％増加し、これまでに報告された最高生産株より２．５倍高かった。

【図面の簡単な説明】

【0022】

図面の説明

【図1】図１：組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)によるヒアルロン酸産生のための代謝経路および関連酵素。

【図2】図２：組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)によるヒアルロン酸の収量および純度を示すグラフ。

【図3】図３：５Ｌの発酵タンクにおける組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)によるヒアルロン酸の収量を示すグラフ。

【図4】図４：ヒアルロン酸加水分解酵素を外添した組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum）の５Ｌ発酵タンクにおけるヒアルロン酸の収量を示すグラフ。

【図5】図５：組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)により産生された二糖類単位のヒアルロン酸のマススペクトル。

【0023】

発明の詳細な説明
株：コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３０３２、プラスミド：ｐＸＭＪ１９、ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ、ｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢ
ＬＢ培地：イースト粉末５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、および塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ
ＢＨＩ：脳心臓抽出物１７ｇ／Ｌ、ソルビトール２１ｇ／Ｌ
発酵培地：グルコース：４０ｇ／Ｌ、コーンスティープ粉末：２０ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄：１５ｇ／Ｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄：５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄：１ｇ／Ｌ

【0024】

ヒアルロン酸収量の測定：発酵ブロスを適宜採取して１０倍希釈し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取して４×容量の予め冷やしたエタノールを添加し、－２０で６時間エタノール沈殿を行い、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、元の容量まで水で再懸濁し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物を廃棄し、上清を採取して、４×容量の予め冷やしたエタノールと混合し、－２０で６時間エタノール沈殿を行い、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、元の容量まで水で再懸濁し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取し、沈殿物を廃棄した。上清を採取して５０倍希釈し、最終的に５００倍希釈した。試料の測定は、試料を直線有効範囲内で希釈し、その後カルバゾール硫酸法により測定した。

【0025】

カバゾール硫酸法による測定：１ｍＬ試料を５ｍＬのホウ砂硫酸（５００ｍＬの濃Ｈ₂ＳＯ₄中に４．７７ｇのホウ砂を溶解した）を含むガラスチューブに添加し、十分に混合し、沸騰水浴中で１５分間煮沸した後、氷上で冷却した。２５０μＬのカルバゾール試薬（０．１２５ｇのカルバゾールを１００ｍＬの完全エタノールに溶解）を加え、よく混合し、沸騰水浴で１５分間煮沸した。試料を等量の蒸留水に置き換えた以外は同じ条件でブランクコントロールを調製し、波長５３０ｎｍの吸光度値を測定した。標準試料として異なる濃度（１０、２０、３０、４０、５０μｇ ｍＬ^-1）のＤ－グルクロン酸で標準曲線をプロットし、その吸光度値を標準曲線にフィッティングしてヒアルロン酸の含有量を算出した。標準曲線の式：ｙ＝１２６．８８ｘ－９．２６３９、Ｒ²＝０．９９９１（ｘ、Ａ５３０吸光度；ｙ、試料中のグルクロン酸含有量（μｇ ｍＬ^-1））。コンドロイチンの収率の計算式：ヒアルロン酸含量（ｇ／Ｌ）＝（標準曲線で求めた濃度＊希釈倍率＊２．０６７）／１０００。試料の測定に際しては、直線有効範囲に合わせて試料を希釈した。

【0026】

ヒアルロン酸の分子量の測定：発酵物の上清をアルコール沈殿を繰り返すことで不純物を除去し、高純度のヒアルロン酸を得て、分子量をＨＰＬＣにより測定した。

【0027】

ＬＣ－ＭＳによるヒアルロン酸の構造の測定：発酵物の上清をアルコール沈殿を繰り返すことにより不純物を除去し、高純度のヒアルロン酸を得た後、このサンプルをヒアルロニダーゼにより３７℃で一晩処理し、ヒアルロン酸を二糖類単位に切断した。その後、試料に９倍量の無水メタノールを添加した。不純物および未加水分解ヒアルロン酸を遠心分離で除去し、ＬＣ－ＭＳにより二糖類単位の構造を解析する前に、不溶性の不純物を有機膜で濾過した。

【実施例】

【0028】

実施例１：組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の構築
（１）遺伝子ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４のノックアウト
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にして、かつ０４２０－ｕｐ－Ｆおよび０４２０－ｕｐ－Ｒをプライマーとして使用し、ＰＣＲにより、ｃｇ０４２０から約５００ｂｐ上流の断片、０４２０－ｕｐを得て、そのＰＣＲ産物を精製した。

【0029】

コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にして、かつ０４２０－ｄｏｗｎ－Ｆおよび０４２０－ｄｏｗｎ－Ｒをプライマーとして使用してＰＣＲにより、ｃｇ０４２０から約５００ｂｐ下流の断片、０４２０－ｄｏｗｎを得て、そのＰＣＲ産物を精製した。

【0030】

コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) スーサイトプラスミド ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢをＥｃｏＲＩ／ＢａｍｈＩで二重消化し、消化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに０４２０－ｕｐおよび０４２０－ｄｏｗｎ断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットで一段階ライゲートし、得られた組換えプラスミドをｐＫ１８－０４２０と名付けた。

【0031】

コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２はエレクトロポレーションによりプラスミド ｐＫ１８－０４２０でトランスフェクションし、およびその電気ショック条件は、電圧１．５ＫＶ、５ｍｓ（エレクトロポレーション管の幅は１ｍｍであった）であり、その電気ショックは２回実施した。組換え菌の第一スクリーニングは、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＢＨＩプレートで行った。陽性組換え菌をピックアップし、液体ＬＢ培地で一晩さらに培養した後、１００ｇ／Ｌスクロースを含むＢＨＩプレートで２回目のスクリーニングを実施した。このコロニーに対し、プライマー０４２０－ｕｐ－Ｆおよび０４２０－ｄｏｗｎ－Ｒを使用してＰＣＲを行ったところ、０４２０遺伝子ノックアウト組換え株から１Ｋｂの断片を増幅することができ、この組換え株をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍΔ０４２０と命名した。ｃｇ０４２４遺伝子も上記の方法でノックアウトし、ｃｇ０４２４シングルノックアウト株、ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４ダブルノックアウト株を得て、それぞれC. glutamicum Δ０４２０、C. glutamicum Δ０４２０およびΔ０４２４と名付けた。

【0032】

それらのなかで、使用されたプライマー配列は次に示す通りである：
０４２０－ＵＰ－Ｆ：ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＣＡＴＧＣＴＴＧＡＡＣ（配列番号１１）
０４２０－ＵＰ－Ｒ：ＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＧＣＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＧＡＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧ（配列番号１２）
０４２０－ｄｏｗｎ－Ｆ：ＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＣ（配列番号１３）
０４２０－ｄｏｗｎ－Ｒ：ＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＡ（配列番号１４）

【0033】

（２）遺伝子ＨａｓＡおよびＶＨｂのインテグレーション
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にして、かつＵ－ｕｐ－ＦおよびＵ－ｕｐ－Ｒをプライマーとして使用して、ＰＣＲにより５００ｂｐ Ｕ－ｕｐ断片を増幅し、そのＰＣＲ産物を精製した。

【0034】

コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にして、かつＵ－ｄｏｗｎ－ＦおよびＵ－ｄｏｗｎ－Ｒをプライマーとして使用して、ＰＣＲにより約５００ｂｐ Ｄ－ｄｏｗｎ断片を増幅し、そのＰＣＲ産物を精製した。

【0035】

Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ ＤＳＭ ５１３）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、かつＨａｓＡ－ＦおよびＨａｓＡ－Ｒをプライマーとして使用して、ＰＣＲにより配列番号１０に示す断片を増幅し、そのＰＣＲ産物を精製した。

【0036】

コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)スーサイドプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢをＥｃｏＲＩ／ＢａｍｈＩで二重消化し、消化されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢにＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットで断片Ｕ－ｕｐ、Ｄ－ｄｏｗｎ、およびＶＨｂを一段階でライゲートし、得られた組換えプラスミドをｐＫ１８－ＶＨＢと名づけた。

【0037】

Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍΔ０４２０株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍΔ０４２４株およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍΔ０４２０ Δ０４２４株、および野生株は、エレクトロポレーションによりプラスミドｐＫ１８－ＶＨＢを導入し、電気ショック条件は：電圧１．５ＫＶ、５ｍｓ、（エレクトロポレーション管の幅は１ｍｍであった）であり、電気ショックは２回実施した。組換え菌の最初のスクリーニングは、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＢＨＩプレートで行った。陽性の組換え体をピックアップし、液体ＬＢ培地で一晩さらに培養した後、１００ｇ／Ｌのスクロースを含むＢＨＩプレートで２回目のスクリーニングを行った。そのコロニーにおいてプライマーＵ－ｕｐ－ＦおよびＤ－ｄｏｗｎ－Ｒを使用してＰＣＲを行い、ＨａｓＡ遺伝子を組み込んだ組み換え体から１．３Ｋｂの断片を増幅することができ、得られた組み換え株をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ－ＨａｓＡと命名した。ＶＨｂ遺伝子の組み込みにも上記の方法を使用して、最終的に得られた株はそれぞれＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍΔ０４２０－ＨａｓＡ－ＶＨＢ、Δ０４２４－ＨａｓＡ－ＶＨＢ、Δ０４２０＆Δ０４２４－ＨａｓＡ－ＶＨＢ、およびＷＴ－ＨａｓＡ－ＶＨＢであった。
Ｕ－ｕｐ－Ｆ：ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴ（配列番号１５）
Ｕ－ｕｐ－Ｒ：ＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＴＡＴＡＣＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧＡＡＣ（配列番号１６）
Ｄ－ｄｏｗｎ－Ｆ：ＧＴＴＡＣＣＧＡＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣ（配列番号１７）
Ｄ－ｄｏｗｎ－Ｒ：ＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡ ＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＡＣ（配列番号１８）
ＨａｓＡ－Ｆ：ＡＡＧＧＡＧＣＧＴＡＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴ（配列番号１９）
ＨａｓＡ－Ｒ：ＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＴＡＴＡＣＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧ（配列番号２０）

【0038】

（３）組換えプラスミドｐＸＭＪ１９－ｐｇｍ－ｇａｌＵ－ｕｇｄおよびｐＥＣＸＫ９９Ｅ－ｇｌｍＳ－ｇｌｍＭ－ｇｌｍＵの構築
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０を３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで２４時間培養した。菌を回収し、細胞ゲノム抽出キットでゲノムＤＮＡを抽出した。プライマー ｐｇｍ－Ｆ／ｐｇｍ－Ｒ、ｇａｌＵ－Ｆ／ｇａｌＵ－Ｒ、ｕｇｄ－Ｆ／ｕｇｄ－Ｒ、ｇｌｍＳ－Ｆ／ｇｌｍＳ－Ｒ、ｇｌｍＭ－Ｆ／ｇｌｍＭ－Ｒ、およびｇｌｍＵ－Ｆ／ｇｌｍＵ－Ｒを設計し、抽出したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅系および手順で遺伝子ｐｇｍ、ｕｇｄ、ｇａｌＵ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳおよびｇｌｍＭを増幅し、取得した。プラスミドｐＸＭＪ１９およびｐＥＣＸＫ９９Ｅを選択した制限部位で酵素消化し、線状プラスミドｐＸＭＪ１９およびｐＥＣＸＫ９９Ｅを得て、増幅断片ｐｇｍ、ｕｇｄ、ｇａｌＵおよび線状プラスミドｐＸＭＪ１９、およびｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭおよび線状プラスミドｐＥＣＸＫ９９Ｅについてギブソンアッセンブリー反応を実施した。ＪＭ１０９コンピテントセルをギブソンアッセンブリー反応系で形質転換した。この形質転換体はプラスミド配列決定反応および配列アラインメントのために選択され、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９－ｐｇｍ－ｕｇｄ－ｇａｌＵおよびｐＥＣＸ９９Ｅ－ｇｌｍＵ－ｇｌｍＭ－ｇｌｍＳを構築することに成功した。当該組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍΔ０４２０－ＨａｓＡ－ＶＨＢ、Δ０４２４－ＨａｓＡ－ＶＨＢ、Δ０４２０＆Δ０４２４－ＨａｓＡ－ＶＨＢおよびＷＴ－ＨａｓＡ－ＶＨＢ、株に電気的形質転換し、得られた組換え株をそれぞれＷＴ、Δ０４２０、Δ０４２４およびΔ０４２０＆Δ０４２４と名づけた。

【0039】

【表1】

【0040】

【表2】

【0041】

実施例２：組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)によるヒアルロン酸の産生
構築された組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のためグルタミカム株ＷＴ、Δ０４２０、Δ０４２４およびΔ０４２０＆Δ０４２４の各単クローンを５ｍｌのＢＨＩ培地に、２００ｒｐｍ、３０℃で一晩接種した。１０時間後、接種物の１％を２５０ｍｌ三角フラスコ（２５ｍｌ発酵培地を含む）に移した。２００ｒｐｍ、２８℃でインキュベートした３時間後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．２５Ｍｍで添加し、遺伝子発現を誘導した。発酵期間は４８時間であった。発酵終了後、上清を取り、４倍量のエタノールを添加してアルコール沈殿を行い、不純物を除去した。アルコール沈殿を２回繰り返した後、カルバゾール硫酸法によりヒアルロン酸の含有量を測定した。図２から、ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２０をノックアウトすることにより、ヒアルロン酸の収量および純度がある程度向上したことを見ることができる。ダブルノックアウト株では、振とうボトルによるヒアルロン酸の収量および純度はそれぞれ６．９ｇ／Ｌおよび９５％まで向上した。

【0042】

実施例３：５Ｌ発酵タンクにおける組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の発酵培養
構築された組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＨａｓＡ－ＶＧＢ／ｐＸＭＪ１９－ｐｇｍ－ｕｇｄ－ｇａｌＵおよびｐＥＣＸ９９Ｅ－ｇｌｍＵ－ｇｌｍＭ－ｇｌｍＳ（ｃｇ０４２０およびｃｇ０４２４ノックアウト）の各単クローンを５ｍｌのＢＨＩ培地で、２００ｒｐｍ、３０℃、一晩で接種した。１０時間後、接種物の１％を２５０ｍｌの三角フラスコ（２５ｍｌの発酵培地を含む）に移した。２００ｒｐｍ、２８℃で１０時間培養し、接種物の１０％を発酵タンクに接種した。発酵中は、グルコースの投入によりタンク内のグルコース含量を約１０ｇ／Ｌに維持し、ＮａＯＨの投入によりｐＨを中性に制御した。発酵２０時間後にヒアルロン酸加水分解酵素を最終濃度６０００Ｕ／ｍＬで外添した。発酵時間は７２時間であった。図３から、ヒアルロン酸加水分解酵素を添加無しで、４８時間でＯＤは最高レベルに達したことを見ることができる。ヒアルロン酸は２４時間から４８時間まで急速に蓄積し、６０時間後には収量が４０ｇ／Ｌまで上昇した。図４から、４時間から３６時間までは対数増殖期であり、菌は急速に増殖し、３６時間で定常期に入ったことを見ることができる。さらに、２４時間から６０時間まで、ヒアルロン酸が急速に蓄積された。図３と比較すると、発酵期間が１２時間長くなり、ヒアルロン酸の収量も大幅に増加した。７２時間において、ヒアルロン酸の収量は７２ｇ／Ｌに達し、加水分解酵素を添加しない場合より３２ｇ／Ｌ高く、ＯＤもある程度増加した。

【0043】

比較例
実施例１と同様の戦略で、他の経路競合前駆体のＣｇｌ１１１８（ＮＣ＿００３４５０．３）およびＣｇｌ０４５２（ＮＣ＿００３４５０．３）をコードする遺伝子がノックアウトされた。実施例１の工程（２）および（３）に従って構築した組換えプラスミドを、Ｃｇｌ１１１８（ＮＣ＿００３４５０．３）およびＣｇｌ０４５２（ＮＣ＿００３４５０．３）のノックアウト細胞に形質転換した。実施例２または３の方法に従って発酵を行った。その結果、これらの遺伝子ノックアウト株では、ヒアルロン酸の収量が大幅に減少した。振とうボトルによる収量はわずか３．１ｇ／Ｌであった。この主な理由は、これらの遺伝子をノックアウトすることにより、菌の増殖に影響を与え、結果として株の増殖が遅くなることである。また、４８時間の発酵のＯＤ値は３４であり、同じ条件下で培養した野生型株のわずか半分程度であった。

【0044】

本発明を上記の好ましい実施形態とともに開示したものの、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、この技術に精通した者が様々な変更および修正を行うことができる。それゆえ、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲によって規定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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