知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許7645238ヘモグロビンの影響軽減方法、糖化ヘモグロビンの測定方法、糖化ヘモグロビン測定試薬、及び糖化ヘモグロビン測定キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-05
(45)【発行日】2025-03-13
(54)【発明の名称】ヘモグロビンの影響軽減方法、糖化ヘモグロビンの測定方法、糖化ヘモグロビン測定試薬、及び糖化ヘモグロビン測定キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/26 20060101AFI20250306BHJP
C12Q 1/28 20060101ALI20250306BHJP
G01N 33/72 20060101ALI20250306BHJP
C12P 3/00 20060101ALN20250306BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/26 ZNA
C12Q1/28
G01N33/72 A
C12P3/00 Z
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2022509274
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(86)【国際出願番号】 JP2020047934
(87)【国際公開番号】W WO2021192466
(87)【国際公開日】2021-09-30
【審査請求日】2023-10-26
(31)【優先権主張番号】P 2020055731
(32)【優先日】2020-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000162478
【氏名又は名称】キヤノンメディカルダイアグノスティックス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100163496
【弁理士】
【氏名又は名称】荒 則彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134359
【弁理士】
【氏名又は名称】勝俣 智夫
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(72)【発明者】
【氏名】林 達也
(72)【発明者】
【氏名】荒武 知子
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０１２６０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１０－１８７６０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０２１５３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第０１／００２４３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５４４３１５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定するヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、６，６－ジチオジニコチン酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－ベンジルマレイミド、及びＮ－シクロヘキシルマレイミドからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させることを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定方法における、ヘモグロビンの影響軽減方法。
【請求項2】
前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、糖化ヘモグロビンの変性剤存在下に反応させる、請求項１に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
【請求項3】
前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１又は２に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
【請求項4】
前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、請求項３に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
【請求項5】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項４に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
【請求項6】
前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項５に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
【請求項7】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、６，６－ジチオジニコチン酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－ベンジルマレイミド、及びＮ－シクロヘキシルマレイミドからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項8】
前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、糖化ヘモグロビンの変性剤存在下に反応させる、請求項７に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項9】
前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項７又は８に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項10】
前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、請求項９に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項11】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項１０に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項12】
前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項１１に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項13】
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び６，６－ジチオジニコチン酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－ベンジルマレイミド、及びＮ－シクロヘキシルマレイミドからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
【請求項14】
さらに、糖化ヘモグロビンの変性剤を含む、請求項１３に記載の測定試薬。
【請求項15】
さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項１３又は１４に記載の測定試薬。
【請求項16】
前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、請求項１５に記載の測定試薬。
【請求項17】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項１６に記載の測定試薬。
【請求項18】
前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項１７に記載の測定試薬。
【請求項19】
６，６－ジチオジニコチン酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－ベンジルマレイミド、及びＮ－シクロヘキシルマレイミドからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬と、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項20】
糖化ヘモグロビンの変性剤を、第１試薬と第２試薬のいずれか一方又は両方に含む、請求項１９に記載の測定キット。
【請求項21】
さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、請求項１９又は２０に記載の測定キット。
【請求項22】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項２１に記載の測定キット。
【請求項23】
前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項２２に記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘモグロビンの影響軽減方法、糖化ヘモグロビンの測定方法、糖化ヘモグロビン測定試薬、及び糖化ヘモグロビン測定キットに関する。
本願は、２０２０年３月２６日に、日本に出願された特願２０２０－５５７３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２０年３月２６日に、日本に出願された特願２０２０－５５７３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
糖化タンパク質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化タンパク質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、臨床診断分野において、血液中の糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている（非特許文献１参照）。ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２種類のサブユニットを各々２つ持つ、分子量６４，０００のヘムタンパク質である。ＨｂＡ１ｃは特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されている。このＨｂＡ１ｃを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を用いる機器分析的方法（非特許文献２参照）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（非特許文献３）等が知られていた。
【0003】
近年、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なＨｂＡ１ｃの酵素的測定法の開発が進んでおり、種々の方法が報告されている。これまで報告されているＨｂＡ１ｃの酵素的測定法は、主として、プロテアーゼと糖化ペプチドオキシダーゼとを用いる方法である。すなわち、血球中のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルジペプチド(Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ)を生成させ、生成した当該フルクトシルジペプチドに対して、フルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、検体中のＨｂＡ１ｃを測定する方法（特許文献１参照）や、血球中のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルヘキサペプチド(Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ)を生成させ、生成した当該フルクトシルヘキサペプチドに対して、フルクトシルヘキサペプチドオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、検体中のＨｂＡ１ｃを測定する方法（特許文献２～４参照）である。一方で、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いて、検体中の糖化ヘモグロビンを測定する方法も知られている（特許文献４～７、非特許文献４参照）。
【0004】
また、プロテアーゼと糖化ペプチドオキシダーゼとを用いる糖化ヘモグロビン測定方法において、糖化ヘモグロビン測定用試料に添加されたヘモグロビン安定化剤であるチオール化合物の影響を軽減するためにチオール封鎖剤を用いる方法が報告されている（特許文献８参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００１－９５５９８号公報
【文献】国際公開第２００８／１０８３８５号
【文献】国際公開第２０１３／１６２０３５号
【文献】国際公開第２０１５／００５２５８号
【文献】国際公開第２０１５／００５２５７号
【文献】国際公開第２０１５／０６０４２９号
【文献】国際公開第２０１８／０２１５３０号
【文献】特開２０１０－１８７６０４号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Clin Chem Lab Med，第36巻、p.299-308(1998).
【文献】Diabetes，第27巻、第2号、p.102-107(1978).
【文献】日本臨床検査自動化学会会誌、第18巻、第4号、p.620 (1993).
【文献】Scientific Reports(2019) 9:942
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法においては、ヘモグロビン含有試料中に存在する還元性物質であるヘモグロビンの影響を受け、正確に検体中の糖化ヘモグロビンの濃度を測定できないという課題がある。
従って、本発明の目的は、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法において、ヘモグロビン含有試料中に存在するヘモグロビンの影響を軽減する方法、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定を簡便かつ正確に測定する方法、糖化ヘモグロビン測定試薬及び糖化ヘモグロビン測定キットを提供することにある。
従って、本発明の目的は、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法において、ヘモグロビン含有試料中に存在するヘモグロビンの影響を軽減する方法、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定を簡便かつ正確に測定する方法、糖化ヘモグロビン測定試薬及び糖化ヘモグロビン測定キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、本課題を解決すべく鋭意検討し、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いるヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させることにより、ヘモグロビン含有試料中に存在するヘモグロビンの影響が軽減され、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【0009】
すなわち、本発明は以下の［１］～［２７］に関する。
［１］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定するヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、
前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させることを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定方法における、ヘモグロビンの影響軽減方法。
［２］ 前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、糖化ヘモグロビンの変性剤存在下に反応させる、［１］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［３］ 前記ジチオ系化合物が、６，６－ジチオジニコチン酸又はその誘導体である、［１］又は［２］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［４］ 前記マレイミド系化合物が、６－マレイミドヘキサン酸又はその誘導体である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［５］ 前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］～［４］のいずれか一項に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［６］ 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［５］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［７］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［６］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［８］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［７］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［９］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１０］ 前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、糖化ヘモグロビンの変性剤存在下に反応させる、［９］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１１］ 前記ジチオ系化合物が、６，６－ジチオジニコチン酸又はその誘導体である、［９］又は［１０］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１２］ 前記マレイミド系化合物が、６－マレイミドヘキサン酸又はその誘導体である、［９］～［１１］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１３］ 前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［９］～［１２］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１４］ 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［１３］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１５］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［１４］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１６］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［１５］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１７］ 糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及びジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
［１８］ さらに、糖化ヘモグロビンの変性剤を含む、［１７］に記載の測定試薬。
［１９］ さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［１７］又は［１８］に記載の測定試薬。
［２０］ 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［１９］に記載の測定試薬。
［２１］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［２０］に記載の測定試薬。
［２２］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［２１］に記載の測定試薬。
［２３］ ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬と、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
［２４］ 糖化ヘモグロビンの変性剤を、第１試薬と第２試薬のいずれか一方又は両方に含む、［２３］に記載の測定キット。
［２５］ さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、［２３］又は［２４］に記載の測定キット。
［２６］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［２５］に記載の測定キット。
［２７］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［２６］に記載の測定キット。
［１］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定するヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、
前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させることを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定方法における、ヘモグロビンの影響軽減方法。
［２］ 前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、糖化ヘモグロビンの変性剤存在下に反応させる、［１］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［３］ 前記ジチオ系化合物が、６，６－ジチオジニコチン酸又はその誘導体である、［１］又は［２］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［４］ 前記マレイミド系化合物が、６－マレイミドヘキサン酸又はその誘導体である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［５］ 前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］～［４］のいずれか一項に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［６］ 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［５］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［７］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［６］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［８］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［７］に記載のヘモグロビンの影響軽減方法。
［９］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１０］ 前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、糖化ヘモグロビンの変性剤存在下に反応させる、［９］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１１］ 前記ジチオ系化合物が、６，６－ジチオジニコチン酸又はその誘導体である、［９］又は［１０］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１２］ 前記マレイミド系化合物が、６－マレイミドヘキサン酸又はその誘導体である、［９］～［１１］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１３］ 前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［９］～［１２］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１４］ 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［１３］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１５］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［１４］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１６］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［１５］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１７］ 糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及びジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
［１８］ さらに、糖化ヘモグロビンの変性剤を含む、［１７］に記載の測定試薬。
［１９］ さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［１７］又は［１８］に記載の測定試薬。
［２０］ 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［１９］に記載の測定試薬。
［２１］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［２０］に記載の測定試薬。
［２２］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［２１］に記載の測定試薬。
［２３］ ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬と、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
［２４］ 糖化ヘモグロビンの変性剤を、第１試薬と第２試薬のいずれか一方又は両方に含む、［２３］に記載の測定キット。
［２５］ さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、［２３］又は［２４］に記載の測定キット。
［２６］ 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［２５］に記載の測定キット。
［２７］ 前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［２６］に記載の測定キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いるヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの影響を軽減する方法、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを簡便かつ正確に測定する方法、糖化ヘモグロビン測定試薬及び糖化ヘモグロビン測定キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＦＰＯＸ－４７△３を第２試薬に含むキットＡを用いる、ヘモグロビン含有試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度差△Ｅとの関係を示すグラフである。縦軸は吸光度差△Ｅ（Ａｂｓ×１００００）を、横軸はＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
（１）糖化ヘモグロビン測定方法における、ヘモグロビンの影響軽減方法
本発明の糖化ヘモグロビン測定方法における、ヘモグロビンの影響軽減方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定するヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させることを特徴とする方法である。
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法は、具体的には、以下の工程を含む方法である。
本発明の糖化ヘモグロビン測定方法における、ヘモグロビンの影響軽減方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定するヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させることを特徴とする方法である。
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法は、具体的には、以下の工程を含む方法である。
【0013】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）及び（ｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）及び（ｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【0014】
上記工程（ｉ）において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させる工程は、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンとを水性媒体中で反応させた後に、前記水性媒体に糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させる工程であってもよい。具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0015】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）～（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）～（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【0016】
また、本発明のヘモグロビンの影響軽減方法における、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総量）に対する割合を算出する工程をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビンの影響軽減方法における、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0017】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した前記過酸化水素を測定する工程；
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した前記過酸化水素を測定する工程；
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
【0018】
上記工程（ｉｉ）において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させる工程は、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンとを水性媒体中で反応させた後に、前記水性媒体に糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させる工程であってもよい。具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0019】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）～（ｉｖ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｖ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｖｉ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）～（ｉｖ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｖ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｖｉ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
【0020】
尚、前記工程（ｉ）の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を添加した後に行うこともできる。
【0021】
また、前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、糖化へモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応を促進するように、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの構造を変化させる、糖化ヘモグロビンの変性剤の存在下で行うこともできる。糖化へモグロビンの変性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えばアルキルグルコシド、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルモノグリセリルエーテル等が挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、イソキノリニウム塩等が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、例えばN－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、N－アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、アルキルスルホン酸、アルケニルスルホン酸、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩等が挙げられる。両性界面活性剤としては、例えばアルキルカルボキシベタイン、アルキルジメチルアミンオキシド等が挙げられる。
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法における、糖化ヘモグロビンの変性剤の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法における、糖化ヘモグロビンの変性剤の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
【0022】
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明における糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
【0023】
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃ等が挙げられ、ＨｂＡ１ｃが好ましい。
【0024】
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法においては、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物が使用される。
【0025】
本発明のヘモグロビンの影響軽減方法における、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、０．０１～１０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～１ｇ／Ｌがより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｇ／Ｌである。
【0026】
前記ジチオ系化合物としては、特に制限はなく、例えば、６，６－ジチオジニコチン酸、２，２－ジチオジ安息香酸、５，５－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）、４，４－ジチオ二酪酸、５，５－ジチオビス（１－フェニル－１Ｈテトラゾール）等が挙げられるが、６，６－ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮ）又はその誘導体が好ましい。これらは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0027】
前記マレイミド系化合物としては、特に制限はなく、例えば、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－ベンジルマレイミド、Ｎ－シクロヘキシルマレイミド等が挙げられるが、６－マレイミドヘキサン酸（６－ＭＨ）又はその誘導体が好ましい。これらは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、前記ジチオ系化合物と前記マレイミド系化合物とを組み合わせて用いることもできる。
【0028】
総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等によって測定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料に、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等を適用することによっても測定することができる。
【0029】
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中での、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。
【0030】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。
水性媒体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
水性媒体のｐＨは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４、５、６、７、８、９、１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
水性媒体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
水性媒体のｐＨは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４、５、６、７、８、９、１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【0031】
グッドの緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
緩衝液の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍｏｌ／Ｌである。
緩衝液の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍｏｌ／Ｌである。
【0032】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はないが、１０～５０℃が好ましく、２０～４０℃がより好ましく、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３７、４０、４５、５０℃である。また、当該反応における反応時間は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、１分間～３時間が好ましく、２．５分間～１時間がより好ましく、例えば、１分、１．５分、２分、２．５分、３分、３．５分、４分、４．５分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間である。糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、０．１～３０ｋＵ／Ｌが好ましく、０．２～１５ｋＵ／Ｌがより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｋＵ／Ｌである。
【0033】
本発明において、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の酵素活性（Ｕ）は、以下の方法により算出することができる。
＜酵素活性測定用試薬＞
第１試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ） ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３ｋＵ／Ｌ
４－アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
＜酵素活性測定用試薬＞
第１試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ） ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３ｋＵ／Ｌ
４－アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
【0034】
第２試薬
フルクトシルバリン水溶液 １．７ｍｍｏｌ／Ｌ
なお、上記フルクトシルバリン水溶液は、J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製することができる。
フルクトシルバリン水溶液 １．７ｍｍｏｌ／Ｌ
なお、上記フルクトシルバリン水溶液は、J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製することができる。
【0035】
＜検体希釈液＞
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
牛血清アルブミン ０．１５％
＜サンプル＞
ＦＰＯＸ－４７△３（糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素）を上記の検体希釈液で希釈したもの
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
牛血清アルブミン ０．１５％
＜サンプル＞
ＦＰＯＸ－４７△３（糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素）を上記の検体希釈液で希釈したもの
【0036】
＜測定＞
反応セルへ、上記サンプル（２μＬ）と上記酵素活性測定用試薬の第１試薬（１５０μＬ）とを添加し、３７℃で３分間反応（第１反応）させた後、上記酵素活性測定用試薬の第２試薬（２０μＬ）を添加し、当該第２試薬を添加した３分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（３分後）］、及び、当該第２試薬を添加した５分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（５分後）］を、共に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ａｂｓ酵素（５分後）からＡｂｓ酵素（３分後）を差し引き、吸光度差△Ａｂｓ’酵素を算出し、さらに算出した吸光度差△Ａｂｓ’酵素を２（分）で除して、１分間当たりの吸光度変化量△Ａｂｓ’酵素／分を算出した。
上記サンプルの代わりに上記検体希釈液を用いる以外は、同様の方法により、吸光度差△Ａｂｓ’ブランク／分を算出した。
算出した△Ａｂｓ’酵素／分から△Ａｂｓ’ブランク／分を差し引き、当該酵素に対する吸光度差△Ａｂｓ酵素／分を決定した。
反応セルへ、上記サンプル（２μＬ）と上記酵素活性測定用試薬の第１試薬（１５０μＬ）とを添加し、３７℃で３分間反応（第１反応）させた後、上記酵素活性測定用試薬の第２試薬（２０μＬ）を添加し、当該第２試薬を添加した３分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（３分後）］、及び、当該第２試薬を添加した５分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（５分後）］を、共に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ａｂｓ酵素（５分後）からＡｂｓ酵素（３分後）を差し引き、吸光度差△Ａｂｓ’酵素を算出し、さらに算出した吸光度差△Ａｂｓ’酵素を２（分）で除して、１分間当たりの吸光度変化量△Ａｂｓ’酵素／分を算出した。
上記サンプルの代わりに上記検体希釈液を用いる以外は、同様の方法により、吸光度差△Ａｂｓ’ブランク／分を算出した。
算出した△Ａｂｓ’酵素／分から△Ａｂｓ’ブランク／分を差し引き、当該酵素に対する吸光度差△Ａｂｓ酵素／分を決定した。
【0037】
＜酵素活性＞
上記で決定した△Ａｂｓ酵素／分を基に、以下の式（Ｉ）により酵素活性を算出した。
上記で決定した△Ａｂｓ酵素／分を基に、以下の式（Ｉ）により酵素活性を算出した。
【0038】
【数1】
上記式（Ｉ）において、０．５は、１ｍｏｌの過酸化水素により生成されるキノイミン色素のｍｏｌ数である。
【0039】
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば国際公開第２０１５／００５２５８号に記載の酵素、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載のアマドリア一ゼ等が挙げられ、それらの内容をここに援用する。具体的には、国際公開公報第２０１５／００５２５８号に記載されたFPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX19～46等が挙げられる。該酵素の改変体の具体例としては、例えば後述する参考例１で製造されるＦＰＯＸ－４７△３等が挙げられる。
【0040】
生成した過酸化水素の測定方法としては、過酸化水素を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
【0041】
検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。
【0042】
本発明において、ロイコ型色原体とは、過酸化水素および過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質をいう。過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。
ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
フェノチアジン系色原体としては、例えば１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）が特に好ましい。
トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
フェノチアジン系色原体としては、例えば１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）が特に好ましい。
トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【0043】
本発明において、酸化カップリング型色原体とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、酸化的カップリングにより色素が生成される、２つの化合物をいう。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－メチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ビス（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（Ｆ－ＤＡＯＳ）等があげられる。
フェノール類としては、フェノール、４－クロロフェノール、３－メチルフェノール、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
カプラーとしては、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－メチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ビス（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（Ｆ－ＤＡＯＳ）等があげられる。
フェノール類としては、フェノール、４－クロロフェノール、３－メチルフェノール、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【0044】
検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【0045】
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0046】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）及び（ｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）及び（ｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【0047】
上記工程（ｉ）において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させる工程は、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンとを水性媒体中で反応させた後に、前記水性媒体中に糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させる工程であってもよい。具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0048】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）～（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）～（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【0049】
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総量）に対する割合を算出する工程をも包含する。この場合、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0050】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した前記過酸化水素を測定する工程；
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した前記過酸化水素を測定する工程；
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
【0051】
上記工程（ｉｉ）において、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中で反応させる工程は、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンとを水性媒体中で反応させた後に、前記水性媒体中に糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させる工程であってもよい。具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【0052】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）～（ｉｖ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｖ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｖｉ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉｉ）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉｉ）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｖ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）～（ｉｖ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｖ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（ｖｉ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量とから、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
【0053】
尚、前記工程（ｉ）の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を添加した後に行うこともできる。
【0054】
また、前記ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、糖化へモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応を促進するように、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの構造を変化させる、糖化ヘモグロビンの変性剤の存在下で行うこともできる。糖化へモグロビンの変性剤としては、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤が挙げられる。
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法における、糖化ヘモグロビンの変性剤の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤の反応液中の濃度が挙げられる。
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法における、糖化ヘモグロビンの変性剤の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤の反応液中の濃度が挙げられる。
【0055】
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法における、ヘモグロビン含有試料、及び糖化ヘモグロビンは、前述のヘモグロビン含有試料、及び糖化ヘモグロビンが挙げられる。
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法における、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物は、前述のジチオ系化合物及びマレイミド系化合物が挙げられる。
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法における、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物は、前述のジチオ系化合物及びマレイミド系化合物が挙げられる。
【0056】
総ヘモグロビン量の測定方法は、前述の総ヘモグロビン量の測定方法が挙げられる。また、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中での、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、前述のジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む水性媒体中での、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応が挙げられる。
【0057】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度と反応時間は、前述のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度と反応時間が挙げられる。また、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、該酵素の濃度、及び、生成した過酸化水素の測定方法は、前述の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、該酵素の濃度、及び、過酸化水素の測定方法が挙げられる。
【0058】
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及びジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及びジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
【0059】
本発明の測定試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物；及び、過酸化水素測定試薬としては、例えば、前述の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物；及び、過酸化水素測定試薬等がそれぞれ挙げられる。
【0060】
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態の試薬を用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．１～３０ｋＵ／Ｌである含量が好ましく、０．２～１５ｋＵ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｋＵ／Ｌである含量である。
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．１～３０ｋＵ／Ｌである含量が好ましく、０．２～１５ｋＵ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｋＵ／Ｌである含量である。
【0061】
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．０１～１０ｇ／Ｌである含量が好ましく、０．１～１ｇ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｇ／Ｌである含量である。
【0062】
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、糖化へモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応を促進するように、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの構造を変化させる、糖化ヘモグロビンの変性剤を含むこともできる。糖化へモグロビンの変性剤としては、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における、糖化ヘモグロビンの変性剤の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．０１～５０ｇ／Ｌである含量が好ましく、０．１～５ｇ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤、グリセリン、アルキレングリコール等が挙げられる。アルキレングリコールとしては、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における、糖化ヘモグロビンの変性剤の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．０１～５０ｇ／Ｌである含量が好ましく、０．１～５ｇ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤、グリセリン、アルキレングリコール等が挙げられる。アルキレングリコールとしては、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【0063】
（４）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。
本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。
本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
【0064】
本発明において、２試薬系キットを用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、例えば反応セルに、ヘモグロビン含有試料と第１試薬とを添加し、一定時間、一定温度で反応を行った後、第２試薬を添加し、生成した過酸化水素を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定することができる。
【0065】
・キット１
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含むキット。
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含むキット。
【0066】
・キット２
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
【0067】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【0068】
・キット３
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第２試薬
を含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第２試薬
を含むキット。
【0069】
・キット４
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第２試薬
を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第２試薬
を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
【0070】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【0071】
・キット５
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
【0072】
・キット６
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、過酸化水素測定試薬とを含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、過酸化水素測定試薬とを含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
【0073】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【0074】
・キット７
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第２試薬
を含むキット。
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む第２試薬
を含むキット。
【0075】
・キット８
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、過酸化水素測定試薬を含む第２試薬を含むキット。
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物と、過酸化水素測定試薬を含む第２試薬を含むキット。
【0076】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットに含まれる試薬は、糖化へモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応を促進するように、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの構造を変化させる、糖化ヘモグロビンの変性剤を含むこともできる。糖化へモグロビンの変性剤としては、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンの変性剤の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤の水性媒体で溶解された状態での濃度となる含量が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンの変性剤の含量としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、前述の糖化ヘモグロビンの変性剤の水性媒体で溶解された状態での濃度となる含量が挙げられる。
【0077】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【0078】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態のキットを用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、当該キットを構成する試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明の測定キットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．１～６０ｋＵ／Ｌである含量が好ましく、０．４～３０ｋＵ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｋＵ／Ｌである含量である。
本発明の測定キットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．１～６０ｋＵ／Ｌである含量が好ましく、０．４～３０ｋＵ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｋＵ／Ｌである含量である。
【0079】
本発明の測定キットを構成する試薬における、ジチオ系化合物及びマレイミド系化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物の含量は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はないが、水性媒体で溶解された状態での濃度が、０．０１～１０ｇ／Ｌである含量が好ましく、０．１～１ｇ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｇ／Ｌである含量である。
【実施例】
【0080】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
【0081】
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＤＡ－６７（和光純薬工業社製）、４－アミノアンチピリン（アクテック社製）、ＥＭＳＥ（同仁化学研究所社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）、フルクトシルバリン（J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製）、６，６－ジチオジニコチン酸（東京化成工業社製）、２，２－ジチオジ安息香酸（東京化成工業社製）、６－マレイミドヘキサン酸（東京化成工業社製）、Ｎ－エチルマレイミド（東京化成工業社製）、Ｎ－メチルマレイミド（東京化成工業社製）、Ｎ－ベンジルマレイミド（東京化成工業社製）、Ｎ－シクロヘキシルマレイミド（東京化成工業社製）
ＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴ［Ｎ－アシルタウリン塩（Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ サルコシネートＬＮ［Ｎ－アシルアミノ酸塩（Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ ＥＣＴＤ－３ＮＥＸ［ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム）；日光ケミカルズ社製）］
ＫリポランＰＪ－４００Ｊ［アルケニルスルホン酸（テトラデセンスルホン酸ナトリウム）；花王社製］
ＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴ［Ｎ－アシルタウリン塩（Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ サルコシネートＬＮ［Ｎ－アシルアミノ酸塩（Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ ＥＣＴＤ－３ＮＥＸ［ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム）；日光ケミカルズ社製）］
ＫリポランＰＪ－４００Ｊ［アルケニルスルホン酸（テトラデセンスルホン酸ナトリウム）；花王社製］
【0082】
［参考例１］FPOX-47△3の造成
（１）FPOX-47発現ベクターpTrc-FPOX-47の造成
配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-42をテンプレートDNAとして用い、配列番号２で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-F及び配列番号３で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCRを行い、PCR産物を得た。pTrc-FPOX-42は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるFPOX-42をコードするDNAを含む発現プラスミドであり、国際公開第２０１５／００５２５８号に開示されている方法に従って造成することができる。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
（１）FPOX-47発現ベクターpTrc-FPOX-47の造成
配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-42をテンプレートDNAとして用い、配列番号２で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-F及び配列番号３で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCRを行い、PCR産物を得た。pTrc-FPOX-42は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるFPOX-42をコードするDNAを含む発現プラスミドであり、国際公開第２０１５／００５２５８号に開示されている方法に従って造成することができる。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
【0083】
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-42） 1～2 ng/μL
・フォワードプライマー（FPOX-42 F342V-F） 0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-42 F342V-R） 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-） 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-42） 1～2 ng/μL
・フォワードプライマー（FPOX-42 F342V-F） 0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-42 F342V-R） 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-） 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
【0084】
（PCR条件）
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 6分
5. 2～4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 10分
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 6分
5. 2～4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 10分
【0085】
得られたPCR産物50 μLにニューイングランドバイオラボ社製「制限酵素Dpn I」1μLを添加し、37℃、1時間インキュベーションすることでテンプレートDNAを分解した。制限酵素処理したPCR産物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、PCR産物の精製試料を得た。
次いで、得られたPCR産物の精製試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを抽出した。
抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、FPOX-47をコードする、配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミド、pTrc-FPOX-47が造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクター（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。
次いで、得られたPCR産物の精製試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを抽出した。
抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、FPOX-47をコードする、配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミド、pTrc-FPOX-47が造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクター（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。
【0086】
（２）FPOX-47△3発現ベクターpTrc-FPOX-47△3の造成
プラスミドpTrc-FPOX-47に含まれるFPOX-47をコードする塩基配列の3’末端側の終止コドンの直前に位置する9塩基を除き、終止コドンおよびBam HI制限酵素認識サイトを付加した、配列番号７で表される塩基配列からなるFPOX-47△3-R、及び、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-Fを設計し、化学合成した。
pTrc-F及びFPOX-47△3-Rをプライマー対として用い、pTrc-FPOX-47をテンプレートとして、以下の試薬組成及びPCR条件によりPCRを行い、FPOX-47のＣ末端の３つのアミノ酸を欠失した欠失体FPOX-47△3をコードする塩基配列を含むDNA断片を含んだPCR産物を得た。
PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
プラスミドpTrc-FPOX-47に含まれるFPOX-47をコードする塩基配列の3’末端側の終止コドンの直前に位置する9塩基を除き、終止コドンおよびBam HI制限酵素認識サイトを付加した、配列番号７で表される塩基配列からなるFPOX-47△3-R、及び、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-Fを設計し、化学合成した。
pTrc-F及びFPOX-47△3-Rをプライマー対として用い、pTrc-FPOX-47をテンプレートとして、以下の試薬組成及びPCR条件によりPCRを行い、FPOX-47のＣ末端の３つのアミノ酸を欠失した欠失体FPOX-47△3をコードする塩基配列を含むDNA断片を含んだPCR産物を得た。
PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
【0087】
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-47） 0.2～0.5 ng/μL
・フォワードプライマー（pTrc-F） 0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-47△3-R） 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-） 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-47） 0.2～0.5 ng/μL
・フォワードプライマー（pTrc-F） 0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-47△3-R） 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-） 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
【0088】
（PCR条件）
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 2分
5. 2～4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 5分
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 2分
5. 2～4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 5分
【0089】
得られたPCR産物の一部を用いて1%アガロースTAEゲルで電気泳動し、想定したサイズのDNA断片が得られていることを確認した。
得られたPCR産物を、Promega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、FPOX-47△3をコードするDNAを含むDNA断片を得た。得られた当該DNA断片を２種類の制限酵素Nco I及びBam HI（共に、タカラバイオ社製）により37℃で1時間処理し、得られた反応混合物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従い精製し、制限酵素処理断片を得た。
得られたPCR産物を、Promega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、FPOX-47△3をコードするDNAを含むDNA断片を得た。得られた当該DNA断片を２種類の制限酵素Nco I及びBam HI（共に、タカラバイオ社製）により37℃で1時間処理し、得られた反応混合物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従い精製し、制限酵素処理断片を得た。
【0090】
また、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されているフルクトシルヘキサペプチドを酸化する活性のない糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15を発現させるpTrc-FPOX-15を同じ制限酵素で同様に処理し、1% アガロースTAEゲルで電気泳動し、ベクターに相当するDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up systemを用いてDNA断片を精製し、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片を得た。
得られた制限酵素処理断片と、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片とを混合し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションした後、ライゲーション産物を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に導入した。
ライゲーション産物が導入された大腸菌を50 mg/L アンピシリンを含むLB寒天培地に植菌し、37℃で14時間培養し、出現したコロニーを選択した。選択したコロニーを、50 mg/L アンピシリンを含むLB液体培地で、37℃で14時間培養し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを調製した。配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いてPCRを行い、調製したプラスミドの塩基配列を確認し、当該プラスミド上に、FPOX-47の塩基配列の、終止コドンを除いた3’側9塩基が欠失した配列番号８で表される塩基配列が含まれることを確認した。同プラスミドをpTrc-FPOX-47△3と称する。
得られた制限酵素処理断片と、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片とを混合し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションした後、ライゲーション産物を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に導入した。
ライゲーション産物が導入された大腸菌を50 mg/L アンピシリンを含むLB寒天培地に植菌し、37℃で14時間培養し、出現したコロニーを選択した。選択したコロニーを、50 mg/L アンピシリンを含むLB液体培地で、37℃で14時間培養し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを調製した。配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いてPCRを行い、調製したプラスミドの塩基配列を確認し、当該プラスミド上に、FPOX-47の塩基配列の、終止コドンを除いた3’側9塩基が欠失した配列番号８で表される塩基配列が含まれることを確認した。同プラスミドをpTrc-FPOX-47△3と称する。
【0091】
（３）FPOX-47△3の取得
上記（２）で得られたpTrc-FPOX-47△3を含む大腸菌を、アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地で、37℃、14時間振盪培養した。得られた培養液を用いて、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の精製方法に従って精製し、精製FPOX-47△3の溶液を得た。FPOX-47のアミノ酸配列を配列番号９に、FPOX-47△3のアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。
上記（２）で得られたpTrc-FPOX-47△3を含む大腸菌を、アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地で、37℃、14時間振盪培養した。得られた培養液を用いて、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の精製方法に従って精製し、精製FPOX-47△3の溶液を得た。FPOX-47のアミノ酸配列を配列番号９に、FPOX-47△3のアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。
【0092】
（４）FPOX-47△3の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素活性（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性と称する）の確認
上記（３）で得られた精製FPOX-47△3の溶液を用いて、以下の測定キット及び測定手順により、FPOX-47△3のＨｂＡ１ｃに対する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を確認した。
上記（３）で得られた精製FPOX-47△3の溶液を用いて、以下の測定キット及び測定手順により、FPOX-47△3のＨｂＡ１ｃに対する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を確認した。
【0093】
＜測定キットＡ＞
第１試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ－６７ ４０μｍｏｌ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴ １ｇ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
第１試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ－６７ ４０μｍｏｌ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴ １ｇ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
【0094】
＜測定キットａ＞
第１試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ－６７ ４０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
第１試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ－６７ ４０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
【0095】
測定キットａは、第１試薬中にＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴが含まれていないこと以外は、測定キットＡと同じである。
【0096】
＜サンプル＞
ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、総ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ－ヘモグロビン法とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が２．６μｍｏｌ／Ｌ、４．５μｍｏｌ／Ｌ、６．４μｍｏｌ／Ｌ、８．４μｍｏｌ／Ｌと値付けされている溶血試料をサンプルとして用いた。
ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、総ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ－ヘモグロビン法とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が２．６μｍｏｌ／Ｌ、４．５μｍｏｌ／Ｌ、６．４μｍｏｌ／Ｌ、８．４μｍｏｌ／Ｌと値付けされている溶血試料をサンプルとして用いた。
【0097】
＜測定手順＞
反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットＡの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットＡの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’Ａを算出した。
反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットａの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ３）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ４）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ４からＥ３を差し引き、吸光度差△Ｅ’ａを算出した。
△Ｅ’Ａから△Ｅ’ａを差し引き、各サンプルに対する吸光度差△Ｅとした。各サンプルにおけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を図１に示す。
反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットＡの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットＡの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’Ａを算出した。
反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットａの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ３）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ４）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ４からＥ３を差し引き、吸光度差△Ｅ’ａを算出した。
△Ｅ’Ａから△Ｅ’ａを差し引き、各サンプルに対する吸光度差△Ｅとした。各サンプルにおけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を図１に示す。
【0098】
第１図から明らかな様に、アニオン性界面活性剤であるＮ－アシルタウリンを含む本発明のキット（キットＡ）を用いた測定において、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との間に定量関係が認められた。従って、ＦＰＯＸ－４７△３が、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する活性を有する酵素であることを確認した。
【0099】
［実施例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１Ａ～１Ｏ）を調製した。
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１Ａ～１Ｏ）を調製した。
【0100】
第１試薬
（１－Ａ）試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴ ３ｇ／Ｌ
ＤＡ－６７ ８０μｍｏｌ／Ｌ
（１－Ｂ）試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオ系化合物又はマレイミド系化合物（表１参照）
（１－Ｂ）試薬を４℃又は３０℃で１週間保存した後、（１－Ａ）試薬と容量比１：１で混合し、第１試薬とした。
第２試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
（１－Ａ）試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ ＬＭＴ ３ｇ／Ｌ
ＤＡ－６７ ８０μｍｏｌ／Ｌ
（１－Ｂ）試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオ系化合物又はマレイミド系化合物（表１参照）
（１－Ｂ）試薬を４℃又は３０℃で１週間保存した後、（１－Ａ）試薬と容量比１：１で混合し、第１試薬とした。
第２試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
【0101】
［比較例１］
（１－Ｂ）試薬が、ジチオ系化合物又はマレイミド系化合物を含まない以外は実施例１と同様にして、第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１ａ）を調製した。
（１－Ｂ）試薬が、ジチオ系化合物又はマレイミド系化合物を含まない以外は実施例１と同様にして、第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１ａ）を調製した。
【0102】
［実施例２］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のキット１Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ５．１１％、５．７３％、６．４０％、７．４５％、８．５５％及び１０．５６％と値付けされている、６濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のキット１Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ５．１１％、５．７３％、６．４０％、７．４５％、８．５５％及び１０．５６％と値付けされている、６濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。
【0103】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ－テストワコー（ＳＬＳ－ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）及びヘモグロビンＢ－テストワコーに付属の標準品（総ヘモグロビン濃度：１５．０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、以下の手順に従って測定を行い、当該標準品に対する吸光度を測定した。
反応セルヘ、当該標準品（１０μＬ）とヘモグロビンＢ－テストワコー（２５０μＬ）とを添加し、３７℃で１０分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ）を主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定し、当該標準品に対する吸光度とした。当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により測定し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該標準品に対する吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該標準品に対するブランク補正吸光度とした。当該標準品に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０Ａｂｓ）とから、総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ－テストワコー（ＳＬＳ－ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）及びヘモグロビンＢ－テストワコーに付属の標準品（総ヘモグロビン濃度：１５．０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、以下の手順に従って測定を行い、当該標準品に対する吸光度を測定した。
反応セルヘ、当該標準品（１０μＬ）とヘモグロビンＢ－テストワコー（２５０μＬ）とを添加し、３７℃で１０分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ）を主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定し、当該標準品に対する吸光度とした。当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により測定し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該標準品に対する吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該標準品に対するブランク補正吸光度とした。当該標準品に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０Ａｂｓ）とから、総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
【0104】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
Ｋ０５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が３．９４μｍｏ１／Ｌ、１０．８２μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの溶血した血球画分について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルヘ、上記の溶血した各血球画分（９．６μＬ）と実施例１のキットの第１試薬（１２０μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’１Ａを算出し、各血球画分に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△Ｅ’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
Ｋ０５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が３．９４μｍｏ１／Ｌ、１０．８２μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの溶血した血球画分について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルヘ、上記の溶血した各血球画分（９．６μＬ）と実施例１のキットの第１試薬（１２０μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’１Ａを算出し、各血球画分に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△Ｅ’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
【0105】
（３）各血球画分における総ヘモグロビン濃度の決定
６濃度の全血試料の各々について、２５℃、３０００ｒｐｍ（１５００×Ｇ）で５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球分画１００μＬに、精製水４ｍLを添加し、溶血した血球分画を得た。溶血した各血球画分について、ヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
６濃度の全血試料の各々について、２５℃、３０００ｒｐｍ（１５００×Ｇ）で５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球分画１００μＬに、精製水４ｍLを添加し、溶血した血球分画を得た。溶血した各血球画分について、ヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
【0106】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
（３）で得られた溶血した各血球画分について、本発明の測定キット１Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（３）で得られた溶血した各血球画分について、本発明の測定キット１Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
【0107】
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（II）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。
上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（II）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。
【0108】
【数2】
【0109】
（６）本発明の測定方法とＫＯ５００法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、予めＫＯ５００法を用いて値付けされたＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を表１に示す。
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、予めＫＯ５００法を用いて値付けされたＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を表１に示す。
【0110】
実施例１のキット１Ａの代わりに、実施例１のキット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ及び１Ｏの各キットを用いる以外は上記と同様の手順により、各試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ及び１Ｏの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を表１に示す。
【0111】
［比較例２］
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例１のキット１ａを用いる以外は実施例２と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット１ａを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を表１に示す。
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例１のキット１ａを用いる以外は実施例２と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット１ａを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を表１に示す。
【0112】
【表1】
【0113】
表１に示したように、本発明のキット１Ａ～１Ｏを用いる測定においては、ＫＯ５００法との間の相関係数がジチオ系化合物又はマレイミド系化合物の濃度によらず、又、第１試薬調製時の（１－Ｂ）試薬の保存温度が４℃の場合でも、３０℃の場合でも、０．９９８～１．０００となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１のキット１Ａ～１Ｏを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
【0114】
［実施例３］
（１）溶血検体の調製
ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分１００μＬに、精製水４ｍLを添加し、溶血した血球分画を得た。次いで、該溶血した血球分画を、総ヘモグロビン測定試薬であるヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて上記実施例２の（１）と同様の測定を行い、得られた吸光度と実施例２の（１）で作成した総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、該血球画分の総ヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して、総ヘモグロビン濃度が４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ及び８ｍｇ／ｍＬの各溶血検体を調製した。
（１）溶血検体の調製
ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分１００μＬに、精製水４ｍLを添加し、溶血した血球分画を得た。次いで、該溶血した血球分画を、総ヘモグロビン測定試薬であるヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて上記実施例２の（１）と同様の測定を行い、得られた吸光度と実施例２の（１）で作成した総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、該血球画分の総ヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して、総ヘモグロビン濃度が４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ及び８ｍｇ／ｍＬの各溶血検体を調製した。
【0115】
（２）各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
（１）で調製した各溶血検体について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて上記実施例２の（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と上記実施例２の（２）で作成したＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を測定した。
（１）で調製した各溶血検体について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて上記実施例２の（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と上記実施例２の（２）で作成したＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を測定した。
【0116】
（３）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（１）で調製した各溶血検体における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（２）で測定した各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、上記式（II）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。
上記（１）で調製した各溶血検体における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（２）で測定した各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、上記式（II）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。
【0117】
（４）総ヘモグロビン濃度の影響の評価
総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍｌである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表２に示す。
総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍｌである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表２に示す。
【0118】
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの代わりに、実施例１のキット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ及び１Ｏの各キットを用いて同様の測定を行い、各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍｌである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表２に示す。
【0119】
［比較例３］
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例１のキット１ａを用いる以外は、実施例３と同様の方法により、キット１ａに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表２に示す。
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例１のキット１ａを用いる以外は、実施例３と同様の方法により、キット１ａに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表２に示す。
【0120】
【表2】
【0121】
前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、総ヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの割合（％）は、総ヘモグロビン濃度に拠らず一定である。従って、△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）が０に近い程、ヘモグロビンの影響を受けない、ということになる。表２から明らかな通り、本発明のキット１Ａ～１Ｏの各キットを用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、比較例１のキット１ａを用いる糖化ヘモグロビンの測定方法と比較して、ヘモグロビンの影響が軽減されていることが判明した。
【0122】
［実施例４］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２Ａ～２Ｅ）を調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ－６７ ４０μｍｏｌ／Ｌ
６，６－ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮ） ０．３ｇ／Ｌ
界面活性剤（表３参照）
第２試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２Ａ～２Ｅ）を調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ－６７ ４０μｍｏｌ／Ｌ
６，６－ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮ） ０．３ｇ／Ｌ
界面活性剤（表３参照）
第２試薬
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ－４７△３ １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２００ｋＵ／Ｌ
【0123】
［比較例４］
第１試薬が、６，６－ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮ）を含まない以外は実施例４と同様にして、第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２ａ～２ｅ）を調製した。
第１試薬が、６，６－ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮ）を含まない以外は実施例４と同様にして、第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２ａ～２ｅ）を調製した。
【0124】
［実施例５］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの代わりに、実施例４のＨｂＡ１ｃ測定用キット２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅの各キットを用いる以外は、実施例２と同様の手順により、各試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの代わりに、実施例４のＨｂＡ１ｃ測定用キット２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅの各キットを用いる以外は、実施例２と同様の手順により、各試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
【0125】
また、ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの代わりに、実施例４のＨｂＡ１ｃ測定用キット２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅの各キットを用いる以外は、実施例３と同様の測定を行い、各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍｌである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表３に示す。
【0126】
［比較例５］
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例４のキット２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅの各キットを用いる以外は、実施例３と同様の方法により、キット２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅの各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表３に示す。
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例４のキット２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅの各キットを用いる以外は、実施例３と同様の方法により、キット２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅの各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を表３に示す。
【0127】
【表3】
【0128】
表３から明らかな通り、本発明のキット２Ａ～２Ｅの各キットを用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、比較例４のキット２ａ～２ｅの各キットを用いる糖化ヘモグロビンの測定方法と比較して、ヘモグロビンの影響を受けなかった。このことから、糖化ヘモグロビンの変性剤の種類を変えた場合でも、ジチオ系化合物である６，６－ジチオジニコチン酸を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビンの影響が軽減されていることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【0129】
本発明により、糖尿病等の診断に有用なヘモグロビンの影響軽減方法、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定方法、及び、糖化ヘモグロビン測定試薬及び糖化ヘモグロビン測定キットが提供される。
【図1】
【配列表】