7645500 改善されたＴ細胞受容体共刺激分子キメラ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-03-06

(45)【発行日】2025-03-14

(54)【発明の名称】改善されたＴ細胞受容体共刺激分子キメラ

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/725 20060101AFI20250307BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250307BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250307BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250307BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250307BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250307BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250307BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20250307BHJP

【ＦＩ】

C07K14/725 ZNA

C07K19/00

C12N5/10

A61K35/17

A61P35/00

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N5/0783

【請求項の数】 54

(21)【出願番号】P 2023509453

(86)(22)【出願日】2021-05-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-16

(86)【国際出願番号】 CN2021091897

(87)【国際公開番号】W WO2021223707

(87)【国際公開日】2021-11-11

【審査請求日】2023-02-08

(31)【優先権主張番号】202010377726.2

(32)【優先日】2020-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202010449454.2

(32)【優先日】2020-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202011549176.4

(32)【優先日】2020-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522260986

【氏名又は名称】ブリスター イムノテック リミテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】513244281

【氏名又は名称】チンファ ユニヴァーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＴＳＩＮＧＨＵＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジアシェン

(72)【発明者】

【氏名】ユー， リ

(72)【発明者】

【氏名】ジア， レメイ

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ユエ

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ， シュエチアン

(72)【発明者】

【氏名】ルイ， ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ， ジーシャオ

(72)【発明者】

【氏名】リウ， グァンナ

(72)【発明者】

【氏名】リン， シン

【審査官】鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５００８４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／２００５８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０２０－５０６７００（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０９６４１２２（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０８１８８０２（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２４３７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】J Biol Chem.，1994年，Vol. 269, No. 36，pp. 22758-22763

【文献】Eur J Immnol.，1997年，Vol. 27，pp. 1433-1441

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／０－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
前記ＴＣＲが、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を含み、少なくとも１つのＯＸ４０が、前記ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のうちの少なくとも１つのＣ末端に接続しており、
前記ＴＣＲα鎖が、第１の標的結合領域及び第１の定常領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖が、第２の標的結合領域及び第２の定常領域を含み、
前記第１及び／又は第２の標的結合領域が抗原結合領域である、
改変Ｔ細胞受容体。

【請求項2】

前記抗原結合領域が、
ｉ）抗体、
ｉｉ）受容体、又は
ｉｉｉ）リガンド
に由来する、請求項１に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項3】

前記ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のうちの少なくとも１つの天然のエンドドメインが欠失している、請求項１又は２に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項4】

前記ＯＸ４０が、前記天然のエンドドメインが欠失している前記ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のうちの少なくとも１つのＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている、請求項３に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項5】

前記リンカーが（Ｇ_４Ｓ）ｎであり、式中、ｎが１～１０の整数を表す、請求項４に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項6】

ｎが３である、請求項５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項7】

少なくとも１つのＯＸ４０が、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のうちの１つのみのＣ末端に接続している、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項8】

少なくとも１つのＯＸ４０が、ＴＣＲα鎖のＣ末端に接続している、請求項７に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項9】

前記ＴＣＲα鎖の天然のエンドドメインが欠失している、請求項８に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項10】

前記ＯＸ４０が、前記天然のエンドドメインが欠失している前記ＴＣＲα鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている、請求項９に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項11】

前記リンカーが（Ｇ_４Ｓ）ｎであり、式中、ｎが１～１０の整数を表す、請求項１０に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項12】

ｎが３である、請求項１１に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項13】

少なくとも１つのＯＸ４０が、ＴＣＲβ鎖のＣ末端に接続している、請求項７に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項14】

前記ＴＣＲβ鎖の天然のエンドドメインが欠失している、請求項１３に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項15】

前記ＯＸ４０が、前記天然のエンドドメインが欠失している前記ＴＣＲβ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結されている、請求項１４に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項16】

前記リンカーが（Ｇ_４Ｓ）ｎであり、式中、ｎが１～１０の整数を表す、請求項１５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項17】

ｎが３である、請求項１６に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項18】

少なくとも１つのＯＸ４０が、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれのＣ末端に接続している、請求項１～５のいずれか一項記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項19】

前記ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれの天然のエンドドメインが欠失している、請求項１８に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項20】

前記ＯＸ４０が、前記天然のエンドドメインがそれぞれ欠失しているＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して接続している、請求項１９に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項21】

前記リンカーが（Ｇ_４Ｓ）ｎであり、式中、ｎが１～１０の整数を表す、請求項２０に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項22】

ｎが３である、請求項２１に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項23】

１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＯＸ４０が、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の少なくとも１つのＣ末端に接続している、請求項１～２２のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項24】

前記第１の定常領域が天然のヒトＴＣＲα鎖定常領域又は天然のマウスＴＣＲα鎖定常領域である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項25】

前記第１の定常領域が、改変ＴＣＲα鎖定常領域である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項26】

前記改変ＴＣＲα鎖定常領域が、４８位のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する、請求項２５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項27】

前記改変ＴＣＲα鎖定常領域が、１１２位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、１１５位のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する、請求項２５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項28】

前記改変ＴＣＲα鎖定常領域が、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、６位のアミノ酸であるＥがＤで置換され、１３位のＫがＲで置換され、１５～１８位のアミノ酸が欠失している、請求項２５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項29】

前記改変ＴＣＲα鎖定常領域が、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、４８位のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がシステイン（Ｃ）に変異しており、１１２位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、１１５位のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）に変異している、請求項２５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項30】

前記改変ＴＣＲα鎖定常領域が、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、６位のアミノ酸であるＥがＤで置換されており、１３位のＫがＲで置換されており、１５～１８位のアミノ酸が欠失しており、４８位のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がシステイン（Ｃ）に変異しており、１１２位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に変異しており、１１４位のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、１１５位のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）に変異している、請求項２５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項31】

前記第１の定常領域が、配列番号１、３、５、７、８、２６、４１、４２及び５６のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項32】

前記第２の定常領域が天然のヒトＴＣＲβ鎖定常領域又は天然のマウスＴＣＲβ鎖定常領域である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項33】

前記第２の定常領域が、改変ＴＣＲβ鎖定常領域である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項34】

前記改変ＴＣＲβ鎖定常領域が、５６位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する、請求項３３に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項35】

前記改変ＴＣＲβ鎖定常領域が、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、３位のアミノ酸であるＲがＫに置換され、６位のアミノ酸であるＴがＦに置換され、９位のＫがＥに置換され、１１位のＳがＡに置換され、１２位のＬがＶに置換され、１７、２１～２５位のアミノ酸が欠失している、請求項３３に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項36】

前記改変ＴＣＲβ鎖定常領域が、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、５６位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）に変異しており、３位のアミノ酸であるＲがＫに置換され、６位のアミノ酸であるＴがＦに置換され、９位のＫがＥに置換され、１１位のＳがＡに置換され、１２位のＬがＶに置換され、１７、２１～２５位のアミノ酸が欠失している、請求項３３に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項37】

前記改変ＴＣＲβ鎖定常領域が、配列番号２、４、６、９、２７、４３及び５７のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項38】

前記第１の標的結合領域及び前記第２の標的結合領域が独立して又は組み合わせて標的抗原に特異的に結合する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項39】

前記標的抗原が、ホスファチジルイノシトールプロテオグリカン３（ＧＰＣ３）、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α胎児グロブリン（ＡＦＰ）、外因性レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、Ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍マトリックス抗原、フィブロネクチンのエクトドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクトドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）及びＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）からなる群から選択される癌関連抗原である、請求項３８に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項40】

前記第１の標的結合領域が、標的抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、前記第２の標的結合領域が、前記抗体の軽鎖可変領域を含み、又は前記第１の標的結合領域が、標的抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、前記第２の標的結合領域が、前記抗体の重鎖可変領域を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項41】

ｉ）第１の標的結合領域は配列番号５０に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、かつ第２の標的結合領域は配列番号５１に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むか、若しくは、第１の標的結合領域は配列番号５１に示されるように軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、かつ第２の標的結合領域は配列番号５０に示されるように重鎖可変領域アミノ酸配列を含むか；又は
ｉｉ）第１の標的結合領域は配列番号５４に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、かつ第２の標的結合領域は配列番号５５に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むか、若しくは、第１の標的結合領域は配列番号５５に示されるように軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、かつ第２の標的結合領域は配列番号５４に示されるように重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、
それにより改変Ｔ細胞受容体がＣＤ１９に特異的に結合する、請求項１～４０のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項42】

前記第１の標的結合領域が、標的抗原に特異的に結合する一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含み、及び／又は前記第２の標的結合領域が、標的抗原に特異的に結合する一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項43】

ｉ）第１の標的結合領域及び／又は第２の標的結合領域が、配列番号５０に示す重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む一本鎖抗体を含むか；及び／又は
ｉｉ）第１の標的結合領域及び／又は第２の標的結合領域が、配列番号５４に示す重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５５に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む一本鎖抗体を含み、
それにより改変Ｔ細胞受容体がＣＤ１９に特異的に結合する、請求項４２に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項44】

前記一本鎖抗体が、リンカーによって連結された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項４２又は４３に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項45】

リンカーが（Ｇ_４Ｓ）ｎである、請求項４４に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項46】

ｎが１又は３である、請求項４５に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項47】

前記第１の標的結合領域及び前記第２の標的結合領域が同じ標的抗原に結合する、請求項４２に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項48】

前記第１の標的結合領域及び前記第２の標的結合領域が前記同じ標的抗原の異なる領域に結合する、請求項４７に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項49】

前記第１の標的結合領域及び前記第２の標的結合領域が異なる標的抗原に結合する、請求項４２に記載の改変Ｔ細胞受容体。

【請求項50】

請求項１～４９のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体を含む単離された治療用免疫細胞。

【請求項51】

Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、請求項５０に記載の治療用免疫細胞。

【請求項52】

請求項５０又は５１に記載の治療用Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項53】

対象における疾患を治療するための薬物の調製における、請求項５０若しくは５１に記載の治療用Ｔ細胞又は請求項５２に記載の医薬組成物の使用。

【請求項54】

疾患が癌である、請求項５３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医学の分野、改善されたＴ細胞受容体－共刺激分子キメラ、特に共刺激分子を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＴＣＲ複合体、ＴＣＲ又はＴＣＲ複合体を含む免疫細胞、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞療法、特にＴ細胞関連療法が今年急速に発展しており、その中でもキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法及びＴＣＲ－Ｔ療法が大きな注目を集めている。

【0003】

ＣＡＲ－Ｔ療法は、Ｔ細胞におけるＣＡＲ分子の発現に基づく。ＣＡＲ分子は、抗体由来の抗原認識ドメインであり、標的抗原の認識を担うエクトドメイン；膜貫通ドメイン；及びＴ細胞受容体に由来するシグナル分子及び共刺激シグナル分子であり、刺激を受けた後にＴ細胞活性化シグナルを伝達する役割を果たすエンドドメインの３つの部分からなる。ＣＡＲ分子がその対応する抗原に結合すると、それらは凝集し、Ｔ細胞のエフェクター機能を開始し、標的腫瘍細胞を殺傷させる。

【0004】

ＴＣＲ－Ｔ療法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく。ＴＣＲはＴ細胞の同一性であり、ＴＣＲの種類に基づいてαβＴ細胞とγδＴ細胞とに分けることができる。発生において、Ｔ前駆細胞は、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖においてＶＤＪ再編成を受け、これは、再編成が成功した場合、γδＴ細胞に発達するか、又は再編成が失敗して終わる場合、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖においてＶＤＪ組換えを受け、次いでαβＴ細胞に発達する。αβＴ細胞は末梢血Ｔ細胞の９０％～９５％を占め、γδＴ細胞は末梢血Ｔ細胞の５％～１０％を占める。２種類のＴ細胞は、それぞれＭＨＣ拘束性及びＭＨＣ非拘束性の方法で抗原を認識し、病原体及び腫瘍に対する免疫において重要な役割を果たす。

【0005】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体分子は複数の鎖を含み、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖（又はＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖）はＭＨＣポリペプチド分子の認識を担い、他の６つのＣＤ３サブユニットはＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ／δ鎖）に結合してシグナル伝達の役割を果たす。天然のＴＣＲ複合体は１０個のＩＴＡＭシグナル配列を含み、これは理論上ＣＡＲよりも強いシグナルを伝達することができる。天然のＴＣＲのシグナル伝達機能を利用することにより、Ｔ細胞障害を緩和するための新しい受容体を構築することが可能であり、これはより良好な抗固形腫瘍の役割を果たすことができる。ＴＣＲのエクトドメインは、抗体のＦａｂドメインと非常に類似しているため、ＴＣＲの可変領域配列を抗体の可変領域配列で置き換えて、抗体特異性を有するだけでなく、Ｔ細胞活性化を媒介することに対する天然ＴＣＲの優れたシグナル伝達機能も有する合成ＴＣＲ及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）を得ることができる。

【0006】

しかしながら、天然のＴＣＲに由来するＳＴＡＲ－Ｔは、Ｔ細胞活性化における共刺激シグナルを欠き、その増殖及び活性化能がしばしば影響を受ける。したがって、この分野では、改善されたＴＣＲ及び対応するＴＣＲ－Ｔ療法が依然として必要とされている。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】定常領域システイン改変、膜貫通ドメイン及びエンドドメイン改変によるＳＴＡＲの最適化の概略図である。

【図2】共刺激分子受容体エンドドメインをα鎖及び／又はβ鎖に付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図である。

【図3】α鎖及び／又はβ鎖エンドドメインの欠失後に、共刺激分子受容体エンドドメインを直接又はリンカーを介して付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図である。

【図4】共刺激分子受容体エンドドメインをＣＤ３サブユニットに付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図である。

【図5】サイトカイン受容体シグナル伝達ドメインをα鎖及び／又はβ鎖に付加することによるＳＴＡＲの最適化の概略図である。

【図6】ＷＴ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞とｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞との腫瘍標的細胞殺傷能の比較の図である。

【図7】異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でのＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する異なる共刺激受容体エンドドメインの効果の図である。

【図8】異なる共培養時間でのＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する異なる共刺激受容体エンドドメインの効果の図である。

【図9】異なるＥ：Ｔ比でのＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する、α鎖、β鎖、α鎖及びβ鎖に付加されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図10】異なる共培養時間でのＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する、α鎖、β鎖、α鎖及びβ鎖に付加されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図11】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌に対する異なる共刺激受容体エンドドメインの効果の図である。

【図12】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖に対する異なる共刺激受容体エンドドメインの効果の図である。

【図13】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能に対する、α鎖、β鎖、α鎖及びβ鎖に付加されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図14】ＴＣＲα鎖に連結された異なる共刺激受容体エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺傷能力の図である。

【図15】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する、異なるＣＤ３サブユニットに付加された異なる共刺激受容体エンドドメインの効果の図である。

【図16】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の増殖に対する、異なるＣＤ３サブユニットに付加された異なる共刺激受容体エンドドメインの効果の図である。

【図17】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠失α鎖に連結されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図18】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠失β鎖に連結されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図19】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠失α鎖及び／又はβ鎖に連結されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図20】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠失α鎖及び／又はβ鎖に連結されたＯＸ４０エンドドメインの効果の図である。

【図21】セントラルメモリーＴ細胞分化に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠失α鎖に連結されたＯＸ４０エンドドメインの効果を示す図である。

【図22】Ｔ細胞分化に対する、異なるＧ４Ｓリンカーを介してエンドドメイン欠失α鎖に連結されたＯＸ４０エンドドメインの効果を示す図である。

【図23】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリジン改変の効果の図である。

【図24】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリジン改変の効果の図である。

【図25】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリジン改変の効果の図である。

【図26】セントラルメモリーＴ細胞分化に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリジン改変の効果の図である。

【図27】Ｔ細胞分化に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるリジン改変の効果の図である。

【図28】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の標的殺傷能力に対する、α鎖及び／又はβ鎖に連結された異なるサイトカイン受容体シグナル伝達形質導入ドメインの効果の図である。

【図29】接続された異なるサイトカイン受容体刺激ドメインを有する変異型ＳＴＡＲとα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲとの間の殺傷効果の比較の図である。

【図30】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌に対する、α鎖及び／又はβ鎖に連結された異なるサイトカイン受容体シグナル伝達形質導入ドメインの効果の図である。

【図31】ＳＴＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌に対する、α鎖及び／又はβ鎖に連結された異なるサイトカイン受容体シグナル伝達形質導入ドメインの効果の図である。

【図32】セントラルメモリーＴ細胞分化に対する、α鎖及び／又はβ鎖に連結された様々なサイトカイン受容体シグナル伝達形質導入ドメインの効果の図である。

【図33】Ｔ細胞分化に対する、α鎖及び／又はβ鎖に連結された様々なサイトカイン受容体シグナル伝達形質導入ドメインの効果の図である。

【図34】インビボでのマウス腫瘍モデルにおけるαβ ＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ及びＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍インビボ効果の図である。

【図35】αβ ＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ及びＣＡＲ－Ｔを投与したマウスの生存曲線の図である。

【図36】マウスにおけるαβ ＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ及びＣＡＲ－Ｔのインビボ増殖の図である。

【図37】マウス腫瘍モデルにおける異なるＳＴＡＲ構造及びＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍インビボ効果の図である。

【図38】αβＴＣＲと定常領域変異体の模式図である。

【図39】ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲの例示的な模式図である。

【図40】ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３の例示的な模式図である。

【図41】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、異なるＴＣＲ定常領域に組み込まれた共刺激エンドドメインを有するａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の図である。

【図42】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、異なる共刺激ドメインによって改変されたａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の図である。Ａ：Ｅ１４１－ＴＣＲ；Ｂ：Ｅ３１５－ＴＣＲ。

【図43】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、ＴＣＲ分子のエンドドメインが欠失しているか又は欠失していない（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー含ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の図である。

【図44】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、４－１ＢＢエンドドメインに接続したＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、又はＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を有するａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の図である。Ａ：Ｅ１４１－ＴＣＲ；Ｂ：Ｅ３１５－ＴＣＲ。

【図45】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、ＯＸ４０エンドドメインに接続したＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、又はＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を有するａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の図である。Ａ：Ｅ１４１－ＴＣＲ；Ｂ：Ｅ３１５－ＴＣＲ。

【図46】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、ＴＣＲα、αβの欠失又はＣＤ３δ分子への付加を伴う又は伴わない、ＴＣＲ－Ｔ細胞増殖及び標的細胞殺傷能力に対する、Ｇ４Ｓリンカーによって連結されたＯＸ４０及びＣＤ４０細胞内ドメインの効果の図である。

【図47】ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞機能の評価のためのマウス腫瘍モデルの実験スキーム及び腫瘍進行のインビボイメージング結果の図である。

【図48】マウスにおけるヒトＴＣＲ Ｔ細胞の増殖の統計グラフである。

【図49】ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の再注入後の担癌マウスの生存曲線の図である。

【図50】インビトロでの過剰な標的細胞による長期刺激下での、ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を発現するＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の図である。

【図51】インビトロでの７日間の過剰な標的細胞刺激後の、ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を発現するＴＣＲ Ｔ細胞の殺傷能力の検出の図である。

【図52】インビトロでの７日間の過剰な標的細胞刺激後の、ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を発現するＴＣＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出の図である。

【図53】ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を発現するＴＣＲ Ｔ細胞の機能の評価のためのマウス腫瘍モデルの実験スキーム及び腫瘍進行のインビボイメージング結果の図である。

【図54】マウスにおけるヒトａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３を発現するＴＣＲ Ｔ細胞の増殖の統計グラフである。

【図55】ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の再注入後の担癌マウスの生存曲線の図である。

【図56】ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＴＣＲγ及びδ鎖の定常領域Ｃ末端に直接連結されるか、Ｇ４Ｓリンカーを介してＴＣＲγ鎖及びδ鎖のＣ末端に直接連結されるか、又は細胞内アミノ酸が欠失したＴＣＲγ鎖及びδ鎖のＣ末端に連結されたＯＸ４０エンドドメインを有するγδＴＣＲ Ｔ細胞の殺傷能に対する効果の図である。

【図57】ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＴＣＲγ及びδ鎖の定常領域Ｃ末端に直接連結されるか、Ｇ４Ｓリンカーを介してＴＣＲγ鎖及びδ鎖のＣ末端に直接連結されるか、又は細胞内アミノ酸が欠失したＴＣＲγ鎖及びδ鎖のＣ末端に連結されたＯＸ４０エンドドメインを有するγδＴＣＲ Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌に対する効果の図である。

【図58】定常領域システイン改変、膜貫通ドメイン及びＮ末端再編成によるＳＴＡＲの最適化の概略図である。

【図59】共刺激分子ドメインとＳＴＡＲ構造との連結位置の例の図である。α鎖への接続のみが示されている。

【図60】共刺激分子ドメインを含むＳＴＡＲ構造の例の図である。

【図61】共刺激因子を含むＳＴＡＲ及びＳＴＡＲの殺傷能力の図である。

【図62】共刺激因子を含むＳＴＡＲ及び複数のＳＴＡＲの増殖シグナルに関連する核ＲｅｌＢレベルの図である。

【図63】異なるＳＴＡＲに対する抗ＣＤ１９の結果の図である。

【図64】異なるＳＴＡＲに対する抗ＣＤ１９及びＣＤ２０の結果の図である。

【発明の詳細な説明】

【0008】

別段の指示又は定義がない限り、使用される全ての用語は、当業者によって理解されるように、当分野で共通の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ’’；Ｌｅｗｉｎ，’’Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ’’、及びＲｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，’’Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’（８ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）等の標準マニュアル、及び本明細書に引用される一般的な先行技術を参照されたく、更に、特に明記しない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、ステップ、技術及び動作は、それ自体公知の方法で実行されてもよく、実行され、当業者には理解されるであろう。また、例えば、標準マニュアル、上記の一般的な先行技術、及びそこに引用されている他の参考文献を参照されたい。

【0009】

本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、その用語に関連する項目の全ての組合わせを包含し、本明細書で別個に列挙されたと見なされるものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ」、「Ａ及びＢ」、「Ｂ」を網羅する。例えば、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ及びＢ」、「Ａ及びＣ」、「Ｂ及びＣ」、及び「Ａ及びＢ及びＣ」を網羅する。

【0010】

「含む」という用語は、本明細書では、タンパク質又は核酸の配列を記載するために使用され、前記配列からなり得るか、又は前記タンパク質又は核酸の一方又は両方の末端に追加のアミノ酸又はヌクレオチドを有し得るが、依然として本明細書に記載の活性を有する。更に、当業者は、ポリペプチドのＮ末端の開始コドンによってコードされるメチオニンが、特定の実際の状況（例えば、特定の発現系で発現される場合）では保持されるが、ポリペプチドの機能に実質的に影響を及ぼさないことを理解するであろう。したがって、特定のポリペプチドアミノ酸配列の説明では、それはそのＮ末端に開始コドンによってコードされるメチオニンを含有し得ないが、その時点までにメチオニンを含む配列を依然として包含し、それに対応して、そのコードヌクレオチド配列はまた、開始コドンを含有し得、逆もまた同様である。

【0011】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸番号が配列番号ｘを参照している」（配列番号ｘは、本明細書に列挙される特定の配列である）は、記載される特定のアミノ酸の位置番号が、配列番号ｘ上のそのアミノ酸に対応するアミノ酸の位置番号であることを意味する。異なるアミノ酸配列間のアミノ酸対応は、当技術分野で公知の配列アラインメント方法によって決定することができる。例えば、アミノ酸対応は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩオンラインアライメントツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／）によって決定することができ、このツールでは、デフォルトパラメータを用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列をアライメントすることができる。例えば、ポリペプチドのＮ末端から開始する４６位のアラニンが、配列番号ｘの４８位のアミノ酸と配列アライメントにおいてアライメントされる場合、ポリペプチド中のアミノ酸は、本明細書において「ポリペプチドの４８位におけるアラニンであり、アミノ酸位置が、配列番号ｘを参照する」とも記載され得る。本発明において、α鎖定常領域に関するアミノ酸位置については、配列番号３を参照する。本発明において、β鎖定常領域に関するアミノ酸位置については、配列番号４を参照する。

【0012】

一態様では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体が本明細書で提供され、ここで、ＴＣＲはαβＴＣＲであり得、αβＴＣＲ複合体は、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζを含み、少なくとも１つの機能的ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの少なくとも１つのＣ末端に接続しており、式中、ＴＣＲα鎖は第１の定常領域を含み、ＴＣＲβ鎖は第２の定常領域を含むか、又は
ＴＣＲは、γδＴＣＲであり得、γδＴＣＲ複合体は、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζを含み、少なくとも１つの機能的ドメインは、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの少なくとも１つのＣ末端に接続しており、ＴＣＲγ鎖は第１の定常領域を含み、ＴＣＲδ鎖は第２の定常領域を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖は第１の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ鎖は、第２の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖は第１の標的結合領域を更に含み、ＴＣＲβ鎖は第２の標的結合領域を更に含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲγ鎖は第１の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲδ鎖は第２の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲγ鎖は第１の標的結合領域を更に含み、ＴＣＲδ鎖は第２の標的結合領域を更に含む。

【0015】

一般に、ＴＣＲでは、標的結合領域は定常領域のＮ末端に配置され、その両方は直接又はリンカーを介して接続することができる。

【0016】

一態様では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が本明細書で提供され、ここで、ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖及びβ鎖を含むαβＴＣＲであり得、少なくとも１つの機能的ドメインは、ＴＣＲα鎖及び／又はβ鎖のＣ末端に接続しており、式中、ＴＣＲα鎖は第１の定常領域を含み、ＴＣＲβ鎖は第２の定常領域を含むか、又は
ＴＣＲは、ＴＣＲγ鎖及びδ鎖を含むγδＴＣＲであり得、少なくとも１つの機能的ドメインは、ＴＣＲγ鎖及び／又はδ鎖のＣ末端に接続しており、式中、ＴＣＲγ鎖は第１の定常領域を含み、ＴＣＲδ鎖は第２の定常領域を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖は第１の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ鎖は、第２の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖は第１の標的結合領域を更に含み、ＴＣＲβ鎖は第２の標的結合領域を更に含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲγ鎖は第１の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲδ鎖は第２の標的結合領域を更に含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲγ鎖は第１の標的結合領域を更に含み、ＴＣＲδ鎖は第２の標的結合領域を更に含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、αβＴＣＲ複合体中のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの少なくとも１つの天然のエンドドメインが欠失しているか、又はγδＴＣＲ複合体中のＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの少なくとも１つの天然のエンドドメインが欠失している。

【0020】

いくつかの実施形態では、αβＴＣＲ中のＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖の天然のエンドドメインが欠失しているか、又はγδＴＣＲ複合体中のＴＣＲγ鎖及び／又はＴＣＲδ鎖の天然のエンドドメインが欠失している。

【0021】

いくつかの実施形態では、αβＴＣＲ複合体において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に、直接又はリンカーを介して連結されている。

【0022】

いくつかの実施形態では、αβＴＣＲ複合体において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結される。

【0023】

いくつかの実施形態では、γδＴＣＲ複合体において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に、直接又はリンカーを介して連結されている。

【0024】

いくつかの実施形態では、γδＴＣＲ複合体において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖の少なくとも１つのＣ末端に直接又はリンカーを介して接続される。

【0025】

いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表す。好ましくは、ｎは１～６の整数であり、より好ましくはｎは２～５の整数であり、最も好ましくはｎは３である。

【0026】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲ複合体においてＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの１つのＣ末端に接続している。

【0027】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲ中のＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖のＣ末端に接続している。

【0028】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲ複合体においてＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの１つのＣ末端に接続している。

【0029】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲ中のＴＣＲγ鎖及び／又はＴＣＲδ鎖のＣ末端に接続している。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ複合体中のＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζは、そのＣ末端に更に接続された少なくとも１つの機能的ドメインを含まない。

【0031】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲ複合体中のＴＣＲα鎖のＣ末端に接続している。

【0032】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲのＴＣＲα鎖のＣ末端に接続している。

【0033】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖の天然のエンドドメインは、欠失している。

【0034】

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲα鎖のＣ末端に直接、又はリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、最も好ましくはｎは３である。

【0035】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲ複合体中のＴＣＲβ鎖のＣ末端に接続している。

【0036】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲのＴＣＲβ鎖のＣ末端に接続している。

【0037】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲβ鎖の天然のエンドドメインは、欠失している。

【0038】

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲβ鎖のＣ末端に直接、又はリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、最も好ましくはｎは３である。

【0039】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲ複合体中のＴＣＲγ鎖のＣ末端に接続している。

【0040】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲにおいてＴＣＲγ鎖のＣ末端に接続している。

【0041】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲγ鎖の天然のエンドドメインは、欠失している。

【0042】

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲγ鎖のＣ末端に直接、又はリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、最も好ましくはｎは３である。

【0043】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲ複合体中のＴＣＲδ鎖のＣ末端に接続している。

【0044】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲにおいてＴＣＲδ鎖のＣ末端に接続している。

【0045】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲδ鎖の天然のエンドドメインは、欠失している。

【0046】

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲδ鎖のＣ末端に直接、又はリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、最も好ましくはｎは３である。

【0047】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲ複合体においてＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの２つのＣ末端に接続している。

【0048】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲ複合体においてＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの２つのＣ末端に接続している。

【0049】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲ複合体中のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれのＣ末端に接続している。

【0050】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、αβＴＣＲのＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれのＣ末端に接続している。

【0051】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれの天然のエンドドメインは、欠失している。

【0052】

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の各々のＣ末端に直接又はリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、最も好ましくはｎは３である。

【0053】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲ複合体中のＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖のそれぞれのＣ末端に接続している。

【0054】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは、γδＴＣＲのＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖のそれぞれのＣ末端に接続している。

【0055】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖のそれぞれの天然のエンドドメインは、欠失される。

【0056】

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、天然のエンドドメインが欠失しているＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖の各々のＣ末端に直接又はリンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは２～５の整数を表し、最も好ましくはｎは３である。

【0057】

いくつかの実施形態では、αβＴＣＲ複合体中のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの２つ以上は、同じ又は異なる機能的ドメインと接続している。

【0058】

いくつかの実施形態では、αβＴＣＲ中のＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖は、同じ又は異なる機能的ドメインに接続されている。

【0059】

いくつかの実施形態では、γδＴＣＲ複合体中のＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの２つ以上は、同じ又は異なる機能的ドメインに接続されている。

【0060】

いくつかの実施形態では、γδＴＣＲ中のＴＣＲγ鎖及び／又はＴＣＲδ鎖は、同じ又は異なる機能的ドメインに接続されている。

【0061】

いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える機能的ドメインが、αβＴＣＲ複合体におけるＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に接続している。

【0062】

いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える機能的ドメインが、αβＴＣＲ中のＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖のＣ末端に接続している。

【0063】

いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える機能的ドメインが、γδＴＣＲ複合体中のＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの少なくとも１つのＣ末端に接続している。

【0064】

いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える機能的ドメインが、γδＴＣＲ中のＴＣＲγ鎖及び／又はＴＣＲδ鎖のＣ末端に接続している。

【0065】

いくつかの実施形態では、共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインは、複合体中のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの１、２、３、４、５又は６つのＣ末端に結合している。

【0066】

いくつかの実施形態では、共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインは、複合体中のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの１つのＣ末端に結合している。

【0067】

例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの機能的ドメイン（例えば、共刺激分子エンドドメイン等）が複合体におけるＴＣＲα鎖のＣ末端に接続される。いくつかの好ましい実施形態において、共刺激分子エンドドメインはＯＸ４０又はＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζは、そのＣ末端に更に結合した共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインを含まない。

【0068】

あるいは、いくつかの実施形態において、共刺激分子エンドドメイン等少なくとも１つの機能的ドメインが複合体におけるＣＤ３δのＣ末端に接続される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζは、そのＣ末端に接続した、共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインを含有しない。

【0069】

いくつかの実施形態では、共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインは、複合体中のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζの２つのＣ末端に結合している。

【0070】

例えば、いくつかの実施形態では、共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインは、複合体中のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のＣ末端に結合している。いくつかの好ましい実施形態において、共刺激分子エンドドメインはＯＸ４０又はＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζは、そのＣ末端に更に結合した共刺激分子エンドドメイン等の少なくとも１つの機能的ドメインを含まない。

【0071】

いくつかの実施形態では、機能的ドメインは外因性機能的ドメインである。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは外因性エンドドメイン、例えば細胞内形質導入機能を担うドメインである。

【0072】

本明細書で使用される場合、「外因性」は、外来種に由来するタンパク質又は核酸配列を意味するか、又は同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によってその天然の形態から組成及び／又は位置の有意な変化を受けたタンパク質又は核酸配列を意味する。

【0073】

本明細書で使用される場合、「機能的ドメイン」は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、及びＣＤ１３７等の共刺激分子のエンドドメイン；又はＴＩＭ３、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４及びＬＡＧ３等の共阻害分子のエンドドメイン；又はインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７α受容体、又はＩＬ－２１受容体）、インターフェロン受容体、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体、コロニー刺激因子受容体、ケモカイン受容体、成長因子受容体、若しくは他の膜タンパク質等のサイトカイン受容体のエンドドメイン、又はＮＩＫ等の細胞内タンパク質のドメインから選択される。機能的ドメインはまた、サイトカイン受容体エンドドメインとヒトＳＴＡＴ５活性化部分（配列番号３５に示されるアミノ酸配列）との直接又はリンカー（例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１～１０の整数を表す））を介したいずれかの融合であり得る。

【0074】

いくつかの好ましい実施形態において、機能的ドメインは、共刺激分子エンドドメイン、好ましくはＯＸ４０又はＩＣＯＳエンドドメイン、より好ましくはＯＸ４０エンドドメインである。

【0075】

例示的なＣＤ４０エンドドメインは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含有する。例示的なＯＸ４０エンドドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。例示的なＩＣＯＳエンドドメインは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含有する。例示的なＣＤ２８エンドドメインは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含有する。例示的な４－１ＢＢエンドドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。例示的なＣＤ２７エンドドメインは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含有する。例示的なＩＬ－２β受容体エンドドメインは、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。例示的なＩＬ－１７α受容体エンドドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。例示的なＩＬ－２１受容体エンドドメインは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含有する。ＩＬ－２β受容体エンドドメインとヒトＳＴＡＴ５活性化部分との例示的な融合アミノ酸配列を配列番号３６に示す。ＩＬ－１７α受容体エンドドメインとヒトＳＴＡＴ５活性化部分との例示的な融合アミノ酸配列を配列番号３７に示す。

【0076】

いくつかの実施形態において、第１の定常領域は天然のＴＣＲα鎖定常領域であり、例えば天然のヒトＴＣＲα鎖定常領域（例示的なヒトＴＣＲα鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号１に示す）若しくは天然のマウスＴＣＲα鎖定常領域（例示的なマウスＴＣＲα鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号３に示す）であり、又は第１の定常領域は、天然のＴＣＲγ鎖定常領域、例えば、天然のヒトＴＣＲγ鎖定常領域（例示的なヒトＴＣＲγ鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号５８に示す）若しくは天然のマウスＴＣＲγ鎖定常領域（例示的なマウスＴＣＲγ鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号５９に示す）である。

【0077】

いくつかの実施形態では、第１の定常領域は、改変ＴＣＲα鎖定常領域又は改変ＴＣＲγ鎖定常領域である。

【0078】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲα鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、トレオニン（Ｔ）等の４８位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する。

【0079】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲα鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、セリン（Ｓ）等の１１２位のアミノ酸がロイシン（Ｌ）に変異しており、メチオニン（Ｍ）等の１１４位のアミノ酸がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、グリシン（Ｇ）等の１１５位のアミノ酸がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する。

【0080】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲα鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、６位のアミノ酸（例えば、Ｅ）がＤで置換され、１３位のＫがＲで置換され、１５～１８位のアミノ酸が欠失しているマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する。

【0081】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲα鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、チロシン（Ｔ）等の４８位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）に変異しており、セリン（Ｓ）等の１１２位のアミノ酸がロイシン（Ｌ）に変異しており、メチオニン（Ｍ）等の１１４位のアミノ酸がイソロイシン（Ｉ）に変異しており、グリシン（Ｇ）等の１１５位のアミノ酸がバリン（Ｖ）に変異している、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する。

【0082】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲα鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、６位のアミノ酸（例えば、Ｅ）がＤに置換され、１３位のＫがＲに置換され、１５～１８位のアミノ酸が欠失し、トレオニン（Ｔ）等の４８位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）に変異し、セリン（Ｓ）等の１１２位のアミノ酸がロイシン（Ｌ）に変異し、メチオニン（Ｍ）等の１１４位のアミノ酸がイソロイシン（Ｉ）に変異し、グリシン（Ｇ）等の１１５位のアミノ酸がバリン（Ｖ）に変異しているマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する。

【0083】

いくつかの実施形態において、改変ＴＣＲα鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、定常領域エンドドメインが欠失している、例えば、１３６～１３７位のアミノ酸が欠失している、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する。

【0084】

いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、配列番号１、３、５、７、８、２６、４１、４２及び５６のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、第２の定常領域は、天然のＴＣＲβ鎖定常領域、例えば、天然のヒトＴＣＲβ鎖定常領域（例示的なヒトＴＣＲβ鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号２に示す）若しくは天然のマウスＴＣＲβ鎖定常領域（例示的なマウスＴＣＲβ鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号４に示す。）であるか、又は第２の定常領域は、天然のＴＣＲδ鎖定常領域、例えば天然のヒトＴＣＲδ鎖定常領域（例示的なヒトＴＣＲδ鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号６０に示す）若しくは天然のマウスＴＣＲδ鎖定常領域（例示的なマウスＴＣＲδ鎖定常領域アミノ酸配列を配列番号６１に示す）である。

【0086】

いくつかの実施形態において、第２の定常領域は、改変ＴＣＲβ鎖定常領域、又は改変ＴＣＲδ鎖定常領域である。

【0087】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲβ鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、トレオニン（Ｓ）等の５６位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）に変異しているマウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する。

【0088】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲβ鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、６位のアミノ酸（例えば、Ｒ）がＫに置換され、６位のアミノ酸（例えば、Ｔ）がＦに置換され、９位のＫがＥに置換され、１１位のＳがＡに置換され、１２位のＬがＶに置換され、１７及び２１～２５位のアミノ酸が欠失しているマウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する。

【0089】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲβ鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、セリン（Ｓ）等の５６位のアミノ酸がシステイン（Ｃ）に変異しており、３位のアミノ酸（例えば、Ｒ）がＫに置換されており、６位のアミノ酸（例えば、Ｔ）がＦに置換され、９位のＫがＥに置換され、１１位のＳがＡに置換され、１２位のＬがＶに置換されており、１７位及び２１～２５位のアミノ酸が欠失している、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する。

【0090】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲβ鎖定常領域は、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、定常領域エンドドメインが欠失している、例えば１６７～１７２位のアミノ酸が欠失しているマウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する。

【0091】

いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲβ鎖定常領域は、配列番号２、４、６、９、２７、４３、及び５７のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0092】

本明細書で使用される場合、「標的結合領域」は、標的分子に結合することができる（好ましくは特異的に結合する）ドメインを指す。いくつかの実施形態において、標的は抗原である。したがって、いくつかの実施形態において、標的結合領域は、「抗原結合領域」である。

【0093】

いくつかの実施形態では、標的結合領域（好ましい抗原結合領域）は、単独で、又は別の標的結合領域（好ましい抗原結合領域）と組み合わせて、標的分子（好ましい標的抗原）に特異的に結合し得る。

【0094】

いくつかの実施形態において、第１の標的結合領域及び第２の標的結合領域は、標的抗原に特異的に結合するために互いに組み合わされる。

【0095】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する抗体に由来する。いくつかの実施形態では、抗原結合領域はまた、受容体のリガンドが標的とされる抗原として機能し得る特異的受容体に由来し得る。例えば、特異的受容体は天然Ｔ細胞受容体であり得る。いくつかの実施形態において、抗原結合領域は天然Ｔ細胞受容体由来の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合領域はまた、特に標的となる抗原が受容体である場合、リガンドに由来し得る。

【0096】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域は天然特異的Ｔ細胞受容体に由来する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号４４に示される可変領域を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４５に示される可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号４６に示される可変領域を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４７に示される可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号４８に示される可変領域を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４９に示される可変領域を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、標的抗原は、疾患関連抗原、好ましくは癌関連抗原、例えばホスファチジルイノシトールプロテオグリカン３（ＧＰＣ３）、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α胎児グロブリン（ＡＦＰ）、外因性レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、Ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍マトリックス抗原、フィブロネクチンのエクトドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクトドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）及びＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）からなる群から選択される癌関連抗原である。

【0098】

いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＲＳＶＦ（呼吸器合胞体ウイルスの予防）、ＰＡ（吸入炭疽）、ＣＤ４（ＨＩＶ感染症）等の病原体に由来する抗原又は病原体に感染した細胞の表面抗原である。

【0099】

いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ３（移植拒絶を含む）、ＣＤ２５（腎移植の急性拒絶を含む）、Ｃ５（発作性夜間ヘモグロビン尿症を含む）、ＩＬ－１β（クリオピリン関連周期性症候群）、ＲＡＮＫＬ（癌関連骨損傷を含む）、フォン・ヴィルブランド因子（成人後天性血栓性血小板紫斑病を含む）、血漿カリクレイン（血管浮腫を含む）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体（成人片頭痛を含む）、ＦＧＦ２３（Ｘ連鎖低リン血症を含む）等の、細胞によって産生され分泌される疾患原因細胞又は分子である。

【0100】

抗原結合領域は、ＦＭＣ６３、リツキシマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ビバツズマブ、セツキシマブ、ラベツズマブ、パリビズマブ、セビルマブ、ツビルマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、ケリキシマブ、シプリズマブ、ナタリズマブ、クレノリキシマブ、ペムツモマブ、エドレコロマブ、カンツズマブ等の任意の市販の抗体を含む１つ以上の公知の抗体に由来し得る。

【0101】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、第２の抗原結合領域は、抗体の軽鎖可変領域を含み、又は第１の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、第２の抗原結合領域は、抗体の重鎖可変領域を含む。

【0102】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含み、及び／又は第２の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、一本鎖抗体は、（Ｇ４Ｓ）ｎ等のリンカーによって連結された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくはｎは１又は３である。

【0104】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は同じ標的抗原に結合する。

【0105】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は同じ標的抗原の異なる領域（例えば異なるエピトープ）に結合する。

【0106】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、異なる標的抗原に結合する。

【0107】

例えば、いくつかの例示的実施形態において、２つの抗原結合領域はそれぞれＣＤ１９及びＣＤ２０に、又はそれぞれＣＤ１９及びＣＤ２２に、又はそれぞれＣＤ３８及びＢＣＭＡに、又はそれぞれＰＤＬ１及びＥＧＦＲに結合し得る。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域はＣＤ１９に特異的に結合する。

【0108】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域は配列番号５０に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号５１に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、あるいは、第１の抗原結合領域は配列番号５１に示されるように軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号５０に示されるように重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、それによってＴＣＲ又はＴＣＲ複合体はＣＤ１９に特異的に結合する。

【0109】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域は配列番号５２に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号５３に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、あるいは、第１の抗原結合領域は配列番号５３に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号５２に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、それによってＴＣＲ又はＴＣＲ複合体はＧＰＣ３に特異的に結合する。

【0110】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域は配列番号５４に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号５５に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、あるいは、第１の抗原結合領域は配列番号５５に示されるように軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号５４に示されるように重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、それによってＴＣＲ又はＴＣＲ複合体はＣＤ１９に特異的に結合する。

【0111】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域は配列番号６２に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号６３に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、あるいは、第１の抗原結合領域は配列番号６３に示されるように軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号６２に示されるように重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、それによってＴＣＲ又はＴＣＲ複合体はＣＤ２０に特異的に結合する。

【0112】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、配列番号５０に示す重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む一本鎖抗体を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域はＣＤ１９に特異的に結合する。特定の実施形態において、配列番号５０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくはｎは１又は３である。

【0113】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、配列番号６２に示す重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号６３に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む一本鎖抗体を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域はＣＤ２０に特異的に結合する。特定の実施形態において、配列番号６２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号６３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくはｎは１又は３である。

【0114】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、配列番号５２に示す重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５３に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む一本鎖抗体を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域はＧＰＣ３に特異的に結合する。特定の実施形態において、配列番号５２に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５３に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくはｎは１又は３である。

【0115】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、配列番号５４に示す重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５５に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む一本鎖抗体を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域はＣＤ１９に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号５４に示される重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５５に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列は、リンカーを介して接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中、ｎは１～１０の整数を表し、好ましくはｎは１又は３である。

【0116】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合領域は配列番号３８に示すｓｃＦｖアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号３９に示すｓｃＦｖアミノ酸配列を含み、あるいは、第１の抗原結合領域は配列番号３９に示されるｓｃＦｖアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号３８に示されるｓｃＦｖアミノ酸配列を含み、それによってＴＣＲ又はＴＣＲ複合体はＣＤ１９及びＣＤ２０の両方に特異的に結合する。

【0117】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及び／又はＣＤ３ζはヒト化されている。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３γは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３γは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３γは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３γは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0118】

別の態様では、本発明の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＴＣＲ複合体を含む単離された治療用免疫細胞が本明細書で提供される。

【0119】

いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。他の実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。

【0120】

別の態様において、本発明は、上で定義されるようなＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、少なくとも１つの外因性機能性エンドドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζのうちの少なくとも１つのＣ末端に接続している。

【0121】

別の態様では、本発明は、上に定義されるＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0122】

いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、そのＣ末端において少なくとも１つの共刺激分子エンドドメインに接続されているＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉ）α鎖をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）β鎖をコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）同じリーディングフレーム内のｉ）とｉｉ）との間に配置される自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。α鎖をコードするヌクレオチド配列は、β鎖をコードするヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に配置され得る。

【0124】

いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、そのＣ末端において少なくとも１つの共刺激分子エンドドメインに接続されているＴＣＲγ鎖及び／又はＴＣＲδ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0125】

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｉ）γ鎖をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）δ鎖をコードするヌクレオチド配列、及び同じ読み枠でｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との間に配置される自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。γ鎖をコードするヌクレオチド配列は、δ鎖をコードするヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に配置され得る。

【0126】

本明細書において、「自己開裂ペプチド」とは、細胞内で自己開裂を行うことができるペプチドを意味する。例えば、自己切断ペプチドは、細胞内のプロテアーゼによって認識され、特異的に切断されるように、プロテアーゼ認識部位を含み得る。

【0127】

あるいは、自己切断ペプチドは２Ａポリペプチドであり得る。２Ａポリペプチドは、ウイルス由来の短いペプチドの一種であり、その自己切断は翻訳中に起こる。２つの異なる標的タンパク質が２Ａポリペプチドによって連結され、同じ読み枠で発現される場合、２つの標的タンパク質はほぼ１：１の比で生成される。一般的な２Ａポリペプチドは、ブタテッショウウイルス（ｔｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）－１由来のＰ２Ａ、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ、ウマ鼻炎Ａウイルス由来のＥ２Ａ、及び口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａであり得る。これらの中でも、Ｐ２Ａが最も切断効率が高く、したがって好ましい。これらの２Ａポリペプチドの様々な機能的変異体も当技術分野で公知であり、これも本発明で使用することができる。

【0128】

別の態様において、本発明は、調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

【0129】

本発明の「発現ベクター」は、直鎖状核酸断片、環状プラスミド、ウイルスベクター又は翻訳可能なＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターである。

【0130】

「調節配列」及び「調節要素」という用語は、コード配列の上流（５’非コード配列）、中間又は下流（３’非コード配列）に配置され、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すために互換的に使用される。発現調節エレメントは、目的のヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳を制御することができるヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、及びポリアデニル化認識配列を含み得るが、これらに限定されない。

【0131】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、ヌクレオチド配列転写が転写調節要素によって制御及び調節されるように、調節要素（例えば、限定されないが、プロモーター配列、転写終結配列等）が核酸配列（例えば、コード配列又はオープンリーディングフレーム）に連結されていることを意味する。調節エレメント領域を核酸分子に作動可能に連結するための技術は、当技術分野で公知である。

【0132】

別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを免疫細胞に導入することを含む、本発明の治療用免疫細胞の調製方法を提供する。

【0133】

Ｔ細胞又はＮＫ細胞等の本発明の免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から様々な非限定的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、健康なドナー又は癌と診断された患者に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型プロファイルを示す細胞の混合集団の一部であり得る。例えば、Ｔ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、次いで、特定の抗体で活性化及び増幅することによって得ることができる。

【0134】

本発明の実施形態のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞等の免疫細胞は、対象の自己細胞に由来する。本明細書で使用される場合、「自家」は、対象を治療するために使用される細胞、細胞株、又は細胞の集団が対象に由来することを意味する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞等の免疫細胞は、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と適合するドナー等の同種細胞に由来する。ドナー由来の細胞を、標準的なプロトコルを使用して非アロ反応性細胞に変換し、必要に応じて複製して、１人以上の患者に投与することができる細胞を産生することができる。

【0135】

別の態様では、本発明は、本発明の治療用免疫細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0136】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入によって）に適している。

【0137】

別の態様では、本発明は、対象の疾患を治療するための医薬品の調製における本発明の治療用免疫細胞の使用を提供する。

【0138】

本明細書で使用される場合、「対象」は、本発明の細胞、方法、又は医薬組成物によって治療することができる疾患（例えば、癌）に罹患しているか、又は罹患する傾向がある生物を指す。非限定的な例には、ヒト、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、及び他の非哺乳動物が含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、対象はヒトである。

【0139】

別の態様では、本発明は、対象の癌等の疾患を治療する方法を提供し、有効量の本発明の治療用免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0140】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」又は「治療有効用量」又は「有効量」は、対象への投与後に治療効果を生じるのに少なくとも十分な物質、化合物、材料又は細胞の量を指す。したがって、疾患又は障害の症状を予防、治癒、改善、遮断又は部分的に遮断するのに必要な量である。例えば、本発明の細胞又は医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、障害症状の重症度の低下、障害の無症候期間の頻度及び持続期間の増加、又は障害に罹患した結果としての傷害若しくは障害の予防をもたらし得る。例えば、腫瘍の治療のために、本発明の細胞又は医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、未処置の被験体と比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、腫瘍細胞成長又は腫瘍成長を阻害し得る。腫瘍成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測し得る動物モデル系において評価することができる。あるいは、当業者に公知の試験によってインビトロで決定され得る腫瘍細胞の成長を阻害する能力を調べることによって評価を行うことが可能である。

【0141】

実際には、本発明の医薬組成物中の細胞の用量レベルは、患者に対する毒性なしに特定の患者、組成物及び投与経路に対する所望の治療応答を効果的に達成することができる有効成分の量を得るために変動し得る。選択された用量レベルは、適用された本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、適用された特定の化合物の排泄速度、治療期間、適用された特定の組成物と組み合わせた適用された他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態及び病歴、並びに医療分野で公知の同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存する。

【0142】

本発明による治療用免疫細胞又は医薬組成物又は薬物の投与は、注射、注入、埋込み又は移植等の任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の細胞又は組成物の投与は、静脈内、リンパ内、皮内、腫瘍内、髄内、筋肉内、又は腹腔内投与であり得る。一実施形態では、本発明の細胞又は組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。

【0143】

本発明の様々な実施形態の実施形態では、疾患は、例えば、癌であり、そのような癌の例には、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、悪性血液疾患、頭頸部癌、神経膠腫、胃癌、上咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、子宮体腫瘍、骨肉腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮癌、肛門癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、腎盂腎癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性癌（アスベスト誘発性癌を含む）、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0144】

本発明の様々な実施形態の実施形態では、疾患は、例えば、病原体感染のものであり、病原体の例には、呼吸器合胞体ウイルス、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ヒト免疫不全ウイルス等が含まれるが、これらに限定されない。

【0145】

本発明の様々な実施形態の実施形態では、疾患は、例えば、心血管疾患、糖尿病、神経疾患、移植後の拒絶反応等の疾患である。

【実施例】

【0146】

実施例１ ＳＴＡＲの改良
１．野生型Ｔ細胞受容体及びその定常領域変異ＳＴＡＲ分子の設計
１．１ ＳＴＡＲのプロトタイプ設計
Ｂ細胞によって産生される分泌抗体（抗体、Ａｂ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は、遺伝子構造、タンパク質構造及び空間的立体配座の点でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と大きな類似性を有する。抗体及びＴＣＲの両方は、可変領域及び定常領域からなり、可変領域は抗原認識及び結合の役割を果たし、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達の役割を果たす。ＴＣＲα鎖及びβ鎖（又はＴＣＲγ鎖及びδ鎖）の可変領域を抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）で置き換えることによって、合成Ｔ細胞受容体及び抗体受容体（ＳＴＡＲ／ＷＴ－ＳＴＡＲ）と呼ばれる人工的に合成されたキメラ分子を、図１（左）に示されるその構造で構築することができる。

【0147】

ＳＴＡＲ分子は２本の鎖を有し、第１の鎖は、抗原認識配列（例えば、抗体重鎖可変領域）をＴ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）の定常領域（Ｃ α）と融合することによって得られ、第２の鎖は、抗原認識配列（例えば、抗体軽鎖可変領域）をＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）の定常領域（Ｃ β）と融合することによって得られる。構築物中の抗原認識ドメイン（ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖ等）及び定常ドメイン（ＴＣＲα、β、γ及びδの定常ドメイン）を配置及び組み合わせて、異なる構成であるが同様の機能を有する様々な構築物を形成することができる。

【0148】

ＳＴＡＲ分子の第１及び第２の鎖は、Ｔ細胞で発現した後、小胞体内の内因性ＣＤ３εδ、ＣＤ３γε及びＣＤ３ζ鎖と結合して８サブユニット複合体を形成し、これは複合体の形態で細胞膜の表面に存在する。免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）は、ＹｘｘＬ／Ｖのその保存された配列を有するＴＣＲ分子中のシグナル伝達モチーフである。ＣＤ３ε鎖、δ鎖、γ鎖及びε鎖のエンドドメインは１つのＩＴＡＭ配列を含み、ＣＤ３ζ鎖のエンドドメインは３つのＩＴＡＭ配列を含むので、完全なＳＴＡＲ複合体は合計１０個のＩＴＡＭ配列を有する。ＳＴＡＲ受容体の抗原認識配列がその特異的抗原に結合すると、細胞内ＩＴＡＭ配列が連続的にリン酸化され、次いで下流のシグナル伝達経路を活性化し、ＮＦ－κβ、ＮＦＡＴ、及びＡＰ－１等の転写因子を活性化して、Ｔ細胞の活性化を開始し、エフェクター機能を産生する。本発明者による以前の研究は、ＳＴＡＲが従来のキメラ抗原受容体ＣＡＲよりも良好にＴ細胞を活性化することができ、抗原刺激の非存在下でのバックグラウンド活性化が有意に減少し、したがって有意な利点を有することを示した（中国発明特許出願第２０１８１０８９８７２０．２号明細書を参照されたい）。しかしながら、ＳＴＡＲに対する更なる改善が依然として望まれている。

【0149】

１．２．変異型ＳＴＡＲ（ｍｕｔ－ＳＴＡＲ）並びに膜貫通ドメイン及びエンドドメインが改変されたＳＴＡＲ（ｕｂ－ＳＴＡＲ）の設計
ＳＴＡＲプロトタイプ設計は、ヒト化ＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）定常領域配列（野生型ヒトＴＣＲα定常領域、配列番号１；野生型ヒトＴＣＲβ定常領域、配列番号２）を使用した。ヒト、霊長類及びマウスのＴＣＲα／β鎖（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ、配列番号３；マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ、配列番号４）の定常領域配列は高度に保存されており、同じ重要なアミノ酸配列も有するため、それらは互いに置換することができる。

【0150】

Ｔ細胞に移入された後、ＳＴＡＲ分子は、定常領域を介してＴ細胞の内因性ＴＣＲとミスマッチする。一方で、このミスマッチ問題は、ＳＴＡＲ分子の正しいペアリングの効率を低下させ、それらの機能を弱め、他方で、ミスマッチに起因する未知の特異性の可能性を増加させ、セキュリティリスクを増加させ得る。この問題を解決するために、本発明者らは、ヒトＴ細胞に移入された後のＳＴＡＲ分子の機能を高めるために、ＳＴＡＲ分子の定常領域をマウス配列に置き換えた。ＳＴＡＲ分子の設計を更に最適化するために、本発明者らは、分子間ジスルフィド結合を導入するためにＳＴＡＲ分子にシステイン変異を実施し、それによってＳＴＡＲ分子の２つの鎖間の相互対合を強化し、内因性ＴＣＲとのミスマッチを減少させた。具体的には、ＴＣＲα鎖定常領域において、４８位のトレオニン（Ｔ）がシステイン（Ｃ）（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ、配列番号５）に変異し、ＴＣＲβ鎖定常領域において、５６位のセリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ、配列番号６）に変異した。２つの新たに付加されたシステインは、ＳＴＡＲの２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成し、それにより、内因性ＴＣＲ鎖とのＳＴＡＲの２つの鎖の間のミスマッチを低減し、ＳＴＡＲ分子がより安定な複合体を形成するのを助け、それにより、より良好な機能を得る。更に、ＳＴＡＲ分子の設計を更に最適化するために、本発明者らは、ＳＴＡＲ分子の安定性を高め、より持続的な機能を果たすのを助けるために、ＳＴＡＲ分子の膜貫通ドメインに対して疎水性アミノ酸置換を行った。具体的には、ＴＣＲα鎖定常領域の膜貫通ドメインの１１１～１１９のアミノ酸位置において、３つのアミノ酸変異を実施し、１１２位のセリン（Ｓ）をロイシン（Ｌ）に変異させ、１１４位のメチオニン（Ｍ）をイソロイシン（Ｉ）に変異させ、１１５位のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｖ）に変異させた。この領域の全アミノ酸配列をＬＳＶＭＧＬＲＩＬからＬＬＶＩＶＬＲＩＬに変更し、この改変をマウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９と呼び、配列番号７の定常領域配列を産生した。この設計は、膜貫通ドメインの疎水性を高め、ＴＣＲ膜貫通ドメインによって運ばれる正電荷によって引き起こされる不安定性を打ち消し、ＳＴＡＲ分子を細胞膜上でより安定にし、したがって、図１（中央）に示されるその構造でより良好な機能を得る。

【0151】

ＴＣＲが抗原に結合し、活性化が完了した後、ＴＣＲ分子のエンドドメイン及び膜貫通ドメイン中のリジンは、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素及びユビキチンリガーゼユビキチナートによる一連のユビキチン化反応を介してユビキチン改変を受け、それによってＴ細胞エンドサイトーシスを生成し、リソソームによる更なる分解のための細胞内へのＴＣＲ分子のエンドサイトーシスをもたらし、したがってＴ細胞膜の表面上のＴＣＲ分子の濃度を低下させ、Ｔ細胞活性化の効果の連続的な低下をもたらした。ｍｕｔ－ＳＴＡＲ分子中のα鎖及びβ鎖の膜貫通ドメイン又はエンドドメイン中のアミノ酸は、本発明者らによって改変され、それは、ＳＴＡＲ分子のα鎖定常領域のエンドドメイン及びβ鎖定常領域の膜貫通ドメイン中のリジンをアルギニンに変異させることと、マウスＴＣＲαＣ－Ａｒｇ ｍｕｔの定常領域配列（配列番号８）及びマウスＴＣＲβＣ－Ａｒｇ ｍｕｔの定常領域配列（配列番号９）をそれぞれ生成して、リジンユビキチン化によって引き起こされるＳＴＡＲ分子のエンドサイトーシスを減少させることと、を含む。この設計は、ＳＴＡＲ分子の膜貫通ドメイン及びエンドドメインのユビキチン化の可能性を低下させ、したがって、ＳＴＡＲ分子のエンドサイトーシスを低下させ、図１（右）に示されるその構造を用いて、ＳＴＡＲ分子を細胞膜上でより安定にし、より良好な機能を得ることを可能にする。

【0152】

２．共刺激受容体エンドドメインを含む野生型及び変異型ＳＴＡＲ分子の設計
ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞のインビボでの増殖能、有効生存時間及び腫瘍微小環境に浸潤して標的細胞を効率的に殺傷させる能力を改善するために、本発明者らによって新しい構造が設計され、ここで、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ複合体は改変され、増強されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞は、ＴＣＲ－Ｔの臨床応答を改善し、持続的な治癒効果を実現するために、必要に応じて調整することができる。

【0153】

２．１．共刺激分子受容体エンドドメインを含むｍｕｔ－ＳＴＡＲ分子（ｃｏ－ＳＴＡＲ）の設計
ＴＣＲは、全てのＴ細胞の表面上の特別なマーカーであり、αβＴＣＲ及びγδＴＣＲに分けることができ、その対応するＴ細胞はそれぞれαβＴ細胞及びγδＴ細胞である。αβ－ＳＴＡＲ及びγδ－ＳＴＡＲは、αβＴ細胞及びγδＴ細胞の性能をそれぞれ改善するために、本発明者らによって共刺激シグナルでそれぞれ改変された。

【0154】

αβＴ細胞のＴＣＲは、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖からなり、全Ｔ細胞の９０％～９５％を占める。αβＴＣＲは、可変領域と定常領域とからなり、可変領域は広い多様性を有し、抗原認識及び結合の役割を果たすが、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達の役割を果たす。Ｔ細胞の毒性及び増殖持続性を増強するために、本発明によれば、ヒト化共刺激受容体のエンドドメイン配列をαβ－ＳＴＡＲ定常領域のＣ末端に導入して（図２）、ＳＴＡＲ Ｔ細胞機能に対する影響を試験する。本発明のＳＴＡＲ定常領域は、未改変のＷＴ－ＳＴＡＲ定常領域、付加的な分子間ジスルフィド結合を含むｃｙｓ－ＳＴＡＲ定常領域、マウス化ｈｍ－ＳＴＡＲ定常領域、及び、サブセクション１に記載した３つの改変を組み合わせたｍｕｔ－ＳＴＡＲを含む。共刺激シグナル伝達構造は、それぞれ配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の配列を有するＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。共刺激エンドドメインは、ＴＣＲα鎖若しくはＴＣＲβ鎖、又はＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に接続することができる（ｃｏ－ＳＴＡＲ）。更に、共刺激エンドドメインは、ＴＣＲ定常領域のＣ末端、又はＴＣＲ分子のエンドドメイン配列が欠失した（システイン置換及び疎水性領域改変の両方を含むエンドドメイン欠失ＴＣＲα鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ、配列番号２６）、システイン置換を含むエンドドメイン欠失ＴＣＲβ鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ、配列番号２７））（ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ、図３）のＴＣＲ定常領域のＣ末端に、直接又はリンカーＧ４Ｓ／（Ｇ４Ｓ）ｎ（Ｇ４Ｓリンカー配列は、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５である）を介して連結され得る。

【0155】

γδＴ細胞のＴＣＲは、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖からなり、γδＴ細胞は、ＴＣＲδ鎖のタイプに基づいて３つのサブグループ：γδ１、γδ２及びγδ３に分割することができ、異なるサブグループはヒト体内で異なる分布を有する。γδＴ細胞は、病原体及び腫瘍の監視において重要な役割を果たすＭＨＣ拘束性の様式で抗原を認識する。実験は、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ及び同様の共刺激シグナルが、γδＴ細胞の活性化及び増殖において重要な役割を果たすことを示した。ヒト共刺激分子受容体のエンドドメイン配列を、本発明者らによって、ＴＣＲγ及びＴＣＲδのＣ末端にそれぞれ導入して（図２、右）、γδＴ細胞の性能を改善した。

【0156】

２．２．共刺激分子受容体エンドドメインを含むＣＤ３分子（ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ）の設計
ＣＤ３サブユニットは、γ鎖、δ鎖、ε鎖及びζ鎖を含み、細胞の状態及び刺激に対する応答を調節するために、エクトドメインからエンドドメインにシグナルを伝達するＴＣＲ分子とＴ細胞受容体複合体を形成する。増強されたＴＣＲ Ｔ細胞を設計し、インビボでのＴ細胞の腫瘍殺傷能力、増殖能力及び生存時間を改善するために、ＣＤ３γ鎖（配列番号２８）、δ鎖（配列番号２９）、ε鎖（配列番号３０）及びζ鎖（配列番号３１）のＣ末端にヒト共刺激分子受容体エンドドメインを導入することによってＣＤ３分子を本発明者らによって改変した（図４）。改変されたＣＤ３分子を、その機能を改善するためにｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞において発現させた。

【0157】

２．３．サイトカイン受容体（サイトカイン－ＳＴＡＲ、ＣＫ－ＳＴＡＲ）の刺激領域を含むＣＤ３分子の設計
サイトカインは、Ｔ細胞の増殖、抗腫瘍及び分化において重要な役割を果たす。様々なサイトカインがそれらのそれぞれの受容体と組み合わさって、細胞の状態及び刺激に対する応答を調節するように、エクトドメインからエンドドメインにシグナルを伝達する。更に、研究は、下流分子ＳＴＡＴ５（配列番号３５）がＩＬ－２受容体エンドドメインでのカスケード反応によって活性化され、したがってＴ細胞増殖関連分子の転写を増強し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を増強することを示した。増強されたＳＴＡＲ－Ｔ細胞を設計し、インビボでのＴ細胞の腫瘍殺傷能力、増殖能及び生存時間を改善するために、ＳＴＡＲ分子を、本発明者らによって、ヒトサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－２β受容体エンドドメインＩＬ２Ｒｂ、配列番号３２；ＩＬ－７α受容体エンドドメイン、配列番号３３；ＩＬ－２１受容体エンドドメイン、配列番号３４等）の細胞内シグナル伝達ドメインを、ＴＣＲα鎖若しくはβ鎖又はα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に連結することによって、又はＳＴＡＴ５活性化部分をＧ４Ｓ（ＩＬ－２ＲｂＱ、配列番号３６；ＩＬ－７ＲｂＱ、配列番号３７）を介してＩＬ－２β若しくはＩＬ－７Ｒα受容体エンドドメインに更に連結することによって改変した（図５）。

【0158】

３．共刺激分子受容体エンドドメインを含む野生型及び変異型ＳＴＡＲ分子のベクターの構築
３．１ ベクター供給源
本発明で使用されるウイルスベクター、プラスミドベクター等のベクターは、商業的企業から購入又は合成され、これらのベクターの全長配列が得られ、特定の切断部位は公知である。

【0159】

３．２．断片供給源
本発明で言及されるＴＣＲは、本発明で使用されるＷＴ－ＳＴＡＲ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ｕｂ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ、ＣＫ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ等を含む任意の機能性ＴＣＲであり得る。本発明で用いられる遺伝子断片、例えば、ＴＣＲの可変領域、ＴＣＲの定常領域、共刺激分子受容体のエンドドメイン、サイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達領域、タグ配列、リンカー等は、いずれも商業的企業によって合成された。これらの遺伝子断片をＰＣＲで連結した。

【0160】

この実施例では、ＴＣＲ複合体の最適化を、配列番号３８（ＣＤ２０標的化抗体、ＯＦＡに由来する）に示されるＳｃＦｖ及び／又は配列番号３９（ＣＤ１９標的化抗体ＦＭＣ６３由来）に示されるＳｃＦｖを含むＳＴＡＲを使用して検証し、配列番号４０（赤色蛍光タンパク質、ＲＦＰ）に示されるＲＦＰタンパク質のみを発現するブランク対照群Ｍｏｃｋと比較した。

【0161】

３．３．ベクター構築
ここで用いたレンチウイルスベクターはｐＨＡＧＥ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ＲＦＰであり、直鎖状ベクターは制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉによって得られ、遺伝子断片は合成及びＰＣＲによって得られ、完全ベクターは相同組換えによって得られた。

【0162】

４細胞株の構築：
４．１プラスミドｐＨＡＧＥ－ルシフェラーゼ－ＧＦＰの構築
レンチウイルスベクターとして、ｐＨＡＧＥは、標的細胞のゲノムに標的遺伝子を安定に挿入することができ、安定な細胞株を構築するための重要な方法である。ルシフェラーゼは、基質の化学的自己発光を触媒して、標的細胞にルシフェラーゼを安定に発現させることができる触媒活性を有する酵素の一種であり、基質を添加した後に標的細胞の数を示すことができ、したがって、標的細胞に対する機能性細胞の効果を反映している。制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ／ＣｌａＩ切断部位を持つｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａベクターを２つの酵素で切断し、ＮＣＢＩによりルシフェラーゼ及びＧＦＰ配列を取得し、市販のＲｕｉｂｏｘｉｎｇｋｅによりＯｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを用いてルシフェラーゼ遺伝子とＧＦＰ遺伝子を組み合わせて断片を合成した後、相同組換えによりルシフェラーゼ－ＧＦＰ断片をｐＨＡＧＥベクターに連結した。

【0163】

４．２ ルシフェラーゼを有する標的細胞株の構築
ルシフェラーゼ及びＧＦＰを有するレンチウイルスベクターの構築に成功し、レンチウイルスをＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔでパッキングし、ＰＥＧ８０００でレンチウイルス溶液を濃縮した後、勾配希釈法でウイルス力価を測定し、次いでリンパ腫細胞株Ｒａｊｉに感染させ、感染７２時間後、蛍光顕微鏡でＧＦＰ陽性細胞の有無を観察した後、フロー分類器でＧＦＰ陽性細胞を分取し、ライブラリ構築及び保存用にモノクローナル細胞を選択した。同時に、ルシフェラーゼ基質を使用して標的細胞とインキュベートし、ルシフェラーゼの発現及び検出レベルを検出して発現レベルを決定した。

【0164】

４．３ ＴＣＲα－βノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞株の構築
ＴＣＲの構造及び配列特性に基づいて、α鎖及びβ鎖の定常領域にガイド配列を設計して、ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築した。ＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域のエクソン配列をＮＣＢＩで取得し、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域のエクソン１配列をガイド配列の設計のためにｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇのウェブサイトに提出し、その結果に基づいてオリゴ配列を合成し、次いでｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクター（Ａｉｄｉ ｇｅｎｅから購入）を構築した。α鎖のガイド配列をＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏに連結し、β鎖のガイド配列をＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤに連結した。

【0165】

ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルス：ＨＥＫ－２９３Ｔのパッケージングを予め１０ｃｍディッシュにプレーティングし、細胞が８０％～９０％まで成長したら、トランスフェクションシステムをＨＥＫ－２９３Ｔに加え、細胞を３７℃のインキュベータに戻して培養した。この時間を０時間としてカウントし、トランスフェクションの１２時間後、新鮮な１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを添加した。トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後にウイルスを回収した。ウイルスを含有する培養培地を遠心分離し、濾過し、ＰＥＧ８０００と混合し、４℃で１２時間超置いた後、次いで３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を廃棄した後、適切な体積の培地で再懸濁し、沈殿させた。－８０℃で凍結又は直接使用した。

【0166】

Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の感染及びスクリーニング並びにモノクローナル細胞株の同定：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１２又は２４ウェルプレートに接種し、続いてα鎖及びβ鎖のｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲウイルスを適切な体積で同時に、並びにポリブレン（総体積に基づいて１：１０００の比で添加）を添加し、十分に混合した。遠心分離感染を１０００ｒｐｍ、３２℃で９０分間行った。得られたものを０時間としてカウントしながら３７℃のインキュベータに入れた。１０～１２時間後に液体を交換し、４８時間後、ピューロマイシンを適切な最終濃度まで添加し、更に４８時間処理した後、示されるように、非感染対照群の細胞は全て殺傷した。生存している細胞を吸引し、遠心分離し、完全培地で培養して、ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞バンクを得た。ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞バンクからの単一細胞をフロー分類器Ａｒｉａによって９６ウェルプレートに選別し、２週間の培養後、増殖したモノクローンを増幅培養のために吸引した。モノクローナル細胞株をＴＣＲα鎖及びβ鎖抗体でそれぞれ同定し、両方の鎖が欠損した細胞株を増幅して、内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔ－Ｔ細胞株を得た。

【0167】

５．Ｔ細胞を形質導入するためのウイルスパッケージング系の構築物
５．１ レンチウイルス系及びパッケージング方法（異なる世代）
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を５×１０５／ｍＬで１０ｃｍ培養ディッシュに接種し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ内で培養し、細胞密度が約８０％に達したときにトランスフェクションを行った（顕微鏡下で観察）。３つのプラスミドを、１：２：３の比率のＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：移入プラスミドに従って５００μＬの無血清ＤＭＥＭと混合した。５４μＬのＰＥＩ－Ｍａｘ及び５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭを均一に混合し、室温で５分間放置した（ＰＥＩ－Ｍａｘとプラスミドとの体積質量比３：１）。ＰＥＩ－ｍａｘ混合物をプラスミド混合物にゆっくり添加し、穏やかに吹き込み、均一に混合し、次いで室温で１５分間放置した。最終混合物を培養培地にゆっくり添加し、均一に混合し、次いで別の培養のために１２時間～１６時間インキュベータに戻し、次いで別の培養のために６％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に交換し、ウイルス溶液を４８時間及び７２時間で回収した。

【0168】

５．２ ウイルス力価測定
Ｊｕｒｋａｔ－Ｃ５細胞を１．５×１０５細胞／ｍＬで平底９６ウェルプレートに接種し、１０％ＦＢＳ及び０．２μＬの１０００×ポリブレンを含有する１００ｕＬの１６４０培地を各ウェルに添加した。１０倍希釈の１６４０完全培地を用いてウイルス希釈を行い、第１のウェル中のウイルス投与量は、ウイルス原液と判定した場合は１００μＬ、濃縮液と判定した場合は１μＬであった。希釈した細胞を１００μＬ／ウェルでウイルスウェルに添加し、３２℃で混合し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベータ内で７２時間培養した。平底９６ウェルプレートからの細胞を丸底９６ウェルプレートに吸引し、４℃及び１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。２００ｕＬの１×ＰＢＳを添加した後、４℃、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。４％組織固定液を２００ｕＬ添加し、得られた溶液を遮光し、フローサイトメトリーで測定した。感染効率をフローサイトメトリーで測定し、力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１．５×１０４×陽性率／ウイルス量（μＬ）×１０００の式に従って力価を算出する際に、有効率２～３０％のウェルを選択した。以下のプラスミドのウイルスを上記の方法によってパッケージングした。ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ、ＷＴ－ＳＴＡＲ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ｃｏ－ＷＴ－ＳＴＡＲ（αβ－４－１ＢＢ－ＷＴ、αβ－ＣＤ２７－ＷＴ、αβ－ＣＤ２８－ＷＴ、αβ－ＩＣＯＳ－ＷＴ、αβ－ＯＸ４０－ＷＴ、αβ－ＯＸ４０－ＷＴ）、ｃｏ－ＳＴＡＲ（αβ－４－１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８、αβ－ＩＣＯＳ、αβ－ＯＸ４０、αβ－ＯＸ４０）、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ（ＣＤ３δ－４－１ＢＢ、ＣＤ３δ－ＣＤ２８、ＣＤ３δ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ε－４－１ＢＢ、ＣＤ３ε－ＣＤ２８、ＣＤ３ε－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ε－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－４１ＢＢ、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０）、ｃｏ－リンカー－ＳＴＡＲ（ＴＣＲβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０、ＴＣＲα－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲα－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０、ＴＣＲβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０）、Ｃ Ｋ－ＳＴＡＲ（β－ＩＬ－２Ｒｂ ＳＴＡＲ、β－ＩＬ－２ＲｂＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－２ＲｂＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－７ＲＡ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－７ＲＡＱ ＳＴＡＲ、α－ＩＬ－２１Ｒ ＳＴＡＲ）等。

【0169】

６．Ｔ細胞培養及び感染方法の確立
６．１ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株培養
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、３＊１０５／ｍｌ及び３＊１０６／ｍｌまでの培養密度を有する１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、１～２日ごとに継代培養した。細胞計数後、必要な数の細胞を採取し、培養培地を補充して上記密度に調整し、培養のためにＣＯ２インキュベータに入れた。

【0170】

６．２ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株感染
細胞を計数し、１×１０６／ｍｌの細胞を採取し、遠心分離し、液体で交換し、１０％ ＦＢＳを含有する１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、適切な量のウイルス溶液も添加した２４ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、培養のためにＣＯ２インキュベータに入れた。感染の１２時間後に１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地で液体を完全に変化させ、７２時間後に陽性率を検出した。

【0171】

６．３ ヒト初代Ｔ細胞培養
初代Ｔ細胞をＦｉｃｏｉｌ法によって単離し、１０％ＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地中で培養し、初期培養密度は１×１０６／ｍＬであり、次いで、ＣＤ３－及びレトロネクチンのｒ－フィブロネクチン（それぞれ最終濃度５ｕｇ／ｍｌ）プレコートウェルプレートに加えた。後期培養の密度は５×１０５／ｍＬから３×１０６／ｍＬまでであり、継代培養は１～２日ごとに行った。

【0172】

６．４ ヒト初代Ｔ細胞感染
４８時間培養した後、初代Ｔ細胞にＭＯＩ＝２０のウイルス溶液を添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、次いで培養のためにＣＯ２インキュベータに入れた。２４時間感染させた後、１０％ＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地を補充し、ウェルを回転させ、７２時間後、タグタンパク質又は抗体によって感染効率を検出した。

【0173】

６．５．感染効率の検出方法
７２時間の感染後、細胞を均一に吹き込み、計数し、５×１０５／ｍｌで採取し、遠心分離し、次いで上清を捨て、使用した染色溶液はＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡであり、対応する抗体を３０分間のインキュベーションのために添加し、次いでＰＢＳを洗浄のために２回添加し、検出をコンピュータで行った。

【0174】

７．ＷＴ－ＳＴＡＲ受容体及びその変異型ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のインビトロ機能アッセイ
７．１．Ｔ細胞及び標的細胞のインビトロ共培養方法
標的細胞であるＲａｊｉ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ１９ＫＯ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ２０ＫＯ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は浮遊細胞であり、共インキュベーションのために、対応する数の細胞を採取し、標的細胞培地と混合し、培養のために遠心分離した。具体的な工程は以下の通りであった。初代Ｔ細胞をパッケージング及び精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に、フローサイトメトリーによって感染効率を検出し、標的細胞に対するエフェクター細胞の比を決定し、１：１の比で一般的に使用し、Ｔ細胞の総数を感染効率に従って計算し、標的細胞の一般的な使用法は１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）であった。

【0175】

７．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的抗原は、一般に、Ｔ細胞の機能を検出するためのＴ細胞活性化に直接使用することができる細胞表面タンパク質である。陽性Ｔ細胞を通常１×１０５個／ウェルで加え、遠心分離し、２４時間活性化した後、Ｔ細胞又は標的細胞を回収してＴ細胞機能を検出した。

【0176】

７．３．Ｔ細胞殺傷機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共培養し、次いで、細胞懸濁液を穏やかに均一に吹き込み、ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を採取し、白色の９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を採取し、室温で１５分間溶解するための細胞溶解物を添加し、次いで、４０００ｒｐｍ／分で１５分間４℃で遠心分離し、次いで、各ウェルに２つの平行ウェルを採取して上清を採取し、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）を添加し、次いで、ゲイン値を１００に固定して多機能性マイクロプレートリーダーによって検出して化学発光値を得た。細胞殺傷計算：細胞殺傷効率＝１００％－（ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。

【0177】

７．４．ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺傷機能試験の検出結果は、図６及び表１に示されるように、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的とするｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞が、Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ、ＲａｊｉＣＤ１９ＫＯ－ルシフェラーゼ及びＲａｊｉＣＤ２０ＫＯ－ルシフェラーゼを殺傷させた後、変異型ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞がより強いＴ細胞殺腫瘍能を示すことを示し、残存腫瘍の生存率はそれぞれ２．４１％、１３．９４％及び２４．４０％であり、ＷＴ－ＳＴＡＲの生存率よりも４５．７３％、７７．００％及び７６．１６％有意に良好であり、変異型ｍｕｔ－ＳＴＡＲがより有意な殺腫瘍効果を有することを示した。

【表1】

【0178】

８．ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の両方のＣ末端、又はＴＣＲα鎖若しくはＴＣＲβ鎖のＣ末端に接続した共刺激エンドドメインの、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する効果
８．１．Ｔ細胞及び標的細胞のインビトロ共培養方法
標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は浮遊細胞であり、共インキュベーションのために、対応する数の細胞を採取し、標的細胞培養培地と混合し、次いで培養のために遠心分離した。具体的な工程は以下の通りであった。初代Ｔ細胞をパッケージング及び精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に、感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、エフェクター細胞対標的細胞の比を決定し、共インキュベーションを通常８：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４及び１：８の比で行い、共インキュベーションの時間との差も通常６時間、１２時間、２４時間、３６時間及び４８時間に検出された。ｃｏ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の増殖を検出するために、標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼを初代Ｔ細胞と７日間インキュベートして細胞増殖数及びＩＬ－２分泌の変化を観察し、次いで陽性Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって選別し、抗原刺激なしで２日間休止培養し、次いで標的細胞と２４時間再び共培養してＴ細胞の殺傷を検出し、標的細胞の一般的な使用量は１×１０５／ウェル（９６ウェルプレート）であった。

【0179】

８．２．標的抗原によってＴ細胞を刺激する方法
本発明の標的抗原は、一般に細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞を活性化してＴ細胞の機能を検出するために直接使用することができ、特に、標的抗原に通常１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞を添加し、２４時間遠心分離及び活性化してＴ細胞機能を検出するための細胞懸濁液又は培養上清を回収するか、又は６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間若しくは７日間活性化してＴ細胞の殺傷機能を検出した。

【0180】

８．３．Ｔ細胞殺傷機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と異なる時間共培養し、次いで、細胞懸濁液を穏やかに均一に吹き込み、ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を採取し、白色の９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を採取し、室温で１５分間溶解するための細胞溶解物を添加し、次いで、４０００ｒｐｍ／分で１５分間４℃で遠心分離し、次いで、各ウェルに２つの平行ウェルを採取して上清を採取し、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）を添加し、次いで、ゲイン値を１００に固定して多機能性マイクロプレートリーダーによって検出して化学発光値を得た。細胞殺傷計算：細胞殺傷効率＝１００％－（ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。

【0181】

ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺傷機能試験の検出結果から、図７及び表２に示されるように、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に連結された共刺激エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲは、Ｔ細胞及び標的細胞の異なるＥ：Ｔ比で同様の腫瘍殺傷効果を示し、異なるＥ：Ｔ比での残存腫瘍生存率に有意差はないことが示された。しかしながら、異なる時点での腫瘍殺傷の検出結果に関して、図８及び表３に示されるように、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に接続したＯＸ４０エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）及びＲａｊｉ－ルシフェラーゼとの４８時間のインキュベーションを伴うｍｕｔ－ＳＴＡＲは、同様の腫瘍殺傷効果をそれぞれ約２４％及び１９％示し、これらは、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に接続した他の共刺激エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－４１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８、αβ－ＩＣＯＳ）よりも有意に優れていた。以上の結果から、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインをＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に連結しても、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺傷効果に影響を及ぼさないことが見出された。加えて、上記の結果から、ルシフェラーゼアッセイにより、ＴＣＲα鎖（α－ＯＸ４０）又はβ鎖（β－ＯＸ４０）のＣ末端にＯＸ４０エンドドメインが連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲのみがＴ細胞の殺傷機能上で検出され、検出結果は、Ｔ細胞と共インキュベートした腫瘍細胞との異なるＥ：Ｔ比又は２４時間の共インキュベートでは、図９及び１０、並びに表４及び５に示すように、α－ＯＸ４０及びβ－ＯＸ４０は、α－β－ＯＸ４０と有意な差を表さないことを示した。上記の殺傷結果から、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方（αβ－ＯＸ４０）のＣ末端に連結されたｍｕｔ－ＳＴＡＲと、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがＴＣＲα鎖のＣ末端に連結されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（α－ＯＸ４０）又はβ鎖のＣ末端に連結されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（β－ＯＸ４０）単独との間に有意な差はなかったが、それらの殺腫瘍能はｍｕｔ－ＳＴＡＲよりも有意に優れていた。

【0182】

８．４．Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化の間、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等の多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷させるか、又はＴ細胞自体の増殖を促進するのを助けた。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を収集し、遠心分離し、上清を採取した。使用したＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットは、ヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡ、ヒトＴＮＦ－α非被覆ＥＬＩＳＡ及びヒトＩＦＮ－γ非被覆ＥＬＩＳＡ（それぞれ、第８８－７０２５号、第８８－７３４６号、第８８－７３１６号）であった。具体的な工程は以下の通りであった。１０Ｘコーティング緩衝液をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティング抗体（２５０Ｘ）を添加し、ウェルを混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。ラップで封止し、４℃で一晩静置した後、１×ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１×ＰＢＳ）を用いて、毎回２６０μＬ／ウェルで３回洗浄し、５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ ＤｉｌｕｅｎｔをｄｄＨ２Ｏで１×に希釈した後、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで１回洗浄し、検量線（それぞれ２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈し、１ｘＤｉｌｕｅｎｔで２０～５０倍に希釈した。検量線に従って希釈した試料を１００マイクロリットル／ウェルで添加し、２つの並列ウェルを採取し、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを３回洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈した検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを３回の洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈したＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、発色時間が１５分未満であるＴＭＢを発色のために添加し、終了のために２ＮのＨ２ＳＯ４を添加し、４５０ｎｍでの光吸収を検出した。

【0183】

ＥＬＩＳＡの結果は、Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共インキュベートした後、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端にＯＸ４０エンドドメインが連結されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）のＩＬ－２分泌が約１００００ｐｇ／ｍｌであり、これは他の構造を有するＳＴＡＲのＩＬ－２分泌よりも有意に高く、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、αβ－４１ＢＢ、αβ－ＣＤ２７、αβ－ＣＤ２８及びαβ－ＩＣＯＳのＩＬ－２分泌はそれぞれ約７７００ｐｇ／ｍｌ、６４５０ｐｇ／ｍｌ、６６９０ｐｇ／ｍｌ、６０００ｐｇ／ｍｌ及び６０５０ｐｇ／ｍｌであったことを示し、ＴＮＦα及びＩＦＮ－γの分泌に関して、αβ－ＯＸ４０もまた、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと同様の結果を示したが、図１１及び表６に示されるように、他の構造は異なる減少を示した。ＥＬＩＳＡの結果から、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインがＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に連結されたｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）によるＩＬ－２分泌は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲよりも有意に高いことが示された。

【0184】

８．５．Ｔ細胞増殖変化の検出：フローサイトメトリーによる計数
Ｔ細胞活性化の間、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷させるか又はＴ細胞自体の増殖を促進するのを助けるために多数のサイトカインが放出され、Ｔ細胞増殖の最も明白な発生は、Ｔ細胞の数の有意な変化であった。Ｔ細胞を標的細胞と７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、ＰＢＳで２００ｕＬに再懸濁し、陽性Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。Ｔ細胞増殖の変化：増殖倍率＝７日後の陽性Ｔ細胞の数／添加した陽性Ｔ細胞の初期数。

【0185】

分取後、種々の構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞を、０日目として計数しながら１：３のＥ：Ｔ比でＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、その後、細胞を１日目及び７日目にそれぞれフロー分析のために回収した。このうち、使用した培地はＩＬ－２を含まない１６４０完全培地であり、ＴＣＲ Ｔ細胞の初期数は１×１０５細胞であり、各時点の試料を独立してインキュベートし、残りの共インキュベートした試料を翌日に液体で半交換し、標的細胞を補充した。フロー分析に使用した細胞を予め抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、その特定の体積を収集し、機械で分析したときに記録し、システム中のＴ細胞の数及び割合を変換によって知った。図１２及び表７に示されるように、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞の絶対数の増殖倍率曲線から、ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に接続したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（αβ－ＯＸ４０）は、標的細胞エピトープを認識した後、より良好な活性化及び増殖を示し、これはｍｕｔ－ＳＴＡＲよりも有意に高かった。ＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖（α－ＯＸ４０）又はβ鎖（β－ＯＸ４０）のみのＣ末端に結合したｍｕｔ－ＳＴＡＲの増殖を図１３及び表８に示すと、７日後におけるＯＸ４０エンドドメインがＴＣＲα鎖のみ（α－ＯＸ４０）のＣ末端に結合したｍｕｔ－ＳＴＡＲのＴ細胞増殖は１１．７５倍であったのに対して、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、β－ＯＸ４０及びαβ－ＯＸ４０のような他の構造はそれぞれ２．７５５倍、４．１２８倍及び６．７４４倍であり、α－ＯＸ４０の増殖効果は他の構造よりも有意に高かった。上記の腫瘍殺傷結果、ＥＬＩＳＡ結果及びＴ細胞増殖結果を組み合わせると、ＴＣＲα鎖のＣ末端に接続したＯＸ４０エンドドメイン（α－ＯＸ４０）のみを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲは、他の構造よりも増強された増殖及び腫瘍殺傷能力を示した。

【0186】

以上の結果より、Ｔ細胞の殺傷効果にも影響を与えずに、共刺激分子ＯＸ４０をＴＣＲ－α鎖に連結することにより、最良の増殖効果が得られることが見出された。したがって、異なる共刺激分子の細胞内ドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲがＴＣＲα鎖にタンデムに連結した。異なるＴ細胞及び標的細胞のエフェクター対標的比は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲに連結された共刺激分子ＯＸ４０の細胞内ドメインの殺傷効果が、他の共刺激ドメインが連結されたＳＴＡＲの殺傷効果よりも良好であることを示した。１：２及び１：４のＥ：Ｔ比では、共刺激分子ＯＸ４０のエンドドメインが結合した（α－ＯＸ４０）ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の効果は、αβ－ＯＸ４０の効果と同様であり、他の共刺激分子が結合したｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の効果よりも優れていた。結果を図１４及び表９に示した。上記の殺傷結果に基づいて、ＴＣＲα鎖にＯＸ４０エンドドメインを連結したｍｕｔ－ＳＴＡＲ（α－ＯＸ４０）によって得られた殺腫瘍能及び増殖能は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺腫瘍能及び増殖能よりも有意に優れていた。

【0187】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0188】

９．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する異なるＣＤ３鎖（ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲ）に接続した共刺激構造の効果
９．１．Ｔ細胞及び標的細胞のインビトロ共培養方法
標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は浮遊細胞であり、共インキュベーションのために、対応する数の細胞を採取し、標的細胞培養培地と混合し、次いで培養のために遠心分離した。具体的な工程は以下の通りであった。初代Ｔ細胞をパッケージング及び精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に、感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、エフェクター細胞対標的細胞の比を決定し、通常１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、更に、標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして細胞増殖数の変化を観察した。感染効率に基づいて総Ｔ細胞数を算出し、標的細胞の一般的な用法は１×１０５個／ウェル（９６ウェルプレート）であった。

【0189】

９．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的抗原は、一般に、Ｔ細胞の機能を検出するためのＴ細胞活性化に直接使用することができる細胞表面タンパク質である。陽性Ｔ細胞に通常１×１０５／ウェルを添加され、遠心分離し、２４時間活性化し、細胞懸濁液又は培養上清を回収してＴ細胞機能を検出した。

【0190】

９．３．Ｔ細胞殺傷機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と異なる時間共培養し、次いで、細胞懸濁液を穏やかに均一に吹き込み、ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を採取し、白色の９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を採取し、室温で１５分間溶解するための細胞溶解物を添加し、次いで、４０００ｒｐｍ／分で１５分間４℃で遠心分離し、次いで、各ウェルに２つの平行ウェルを採取して上清を採取し、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）を添加し、次いで、ゲイン値を１００に固定して多機能性マイクロプレートリーダーによって検出して化学発光値を得た。細胞殺傷計算：細胞殺傷効率＝１００％－（ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。

【0191】

ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺傷機能試験の検出結果は、共刺激エンドドメインがＣＤ３δ又はＣＤ３γ又はＣＤ３ε又はＣＤ３ζ鎖のＣ末端に接続され、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ上で共発現される場合、標的細胞に対する異なるＴ細胞の１：１のＥ：Ｔ比での結果は、全てのｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲがαβ－ＯＸ４０よりも良好な標的細胞殺傷効果を示さないが、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－４１ＢＢ、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０と比較して、同様の腫瘍殺傷効果を示し、ｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲの残存腫瘍生存率は、図１５及び表１０に示されるように、１：１のＥ：Ｔ比で有意に異ならなかったことを示した。上記の結果に基づいて、共刺激エンドドメインを異なるＣＤ３鎖のＣ末端に連結することによって、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺傷効果は有意に改善されなかったが、ＣＤ３ζ鎖のＣ末端に連結された共刺激エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲの効果は有意に減少しなかった。

【0192】

９．４ Ｔ細胞増殖変化の検出：フローサイトメトリーによる計数
Ｔ細胞活性化の間、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷させるか又はＴ細胞自体の増殖を促進するのを助けるために多数のサイトカインが放出され、Ｔ細胞増殖の最も明白な発生は、Ｔ細胞の数の有意な変化であった。Ｔ細胞を標的細胞と７日間インキュベートし、次いで遠心分離し、ＰＢＳで２００ｕＬに再懸濁し、陽性Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。Ｔ細胞増殖の変化：増殖倍率＝７日後の陽性Ｔ細胞の数／添加した陽性Ｔ細胞の初期数。

【0193】

分取後、種々の構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞を、０日目として計数しながら１：３のＥ：Ｔ比でＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、その後、細胞を１日目及び７日目にそれぞれフロー分析のために回収した。このうち、使用した培地はＩＬ－２を含まない１６４０完全培地であり、ＴＣＲ Ｔ細胞の初期数は１×１０５細胞であり、各時点の試料を独立してインキュベートし、残りの共インキュベートした試料を翌日に液体で半交換し、標的細胞を補充した。フロー分析に使用した細胞を予め抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、その特定の体積を収集し、機械で分析したときに記録し、システム中のＴ細胞の数及び割合を変換によって知った。図１６及び表１１に示されるように、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ細胞の絶対数の増殖倍率曲線から、αβ－ＯＸ４０－ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較して、全てのｃｏ－ＣＤ３－ＳＴＡＲはより良好な標的細胞殺傷効果を示さなかったが、ＣＤ３ε－ＣＤ２８、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ－ＯＸ４０等は同様の増殖効果を示したことが分かる。ルシフェラーゼアッセイによる殺傷の検出結果及びＴ細胞増殖の結果を考慮すると、共刺激エンドドメインがＣＤ３δ又はＣＤ３γ又はＣＤ３ε又はＣＤ３ζ鎖のＣ末端に連結され、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ上で共発現される構造は、αβ－ＯＸ４０－ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞と比較して、腫瘍殺傷及び増殖のより良好な効果を示さなかった。

【0194】

【表10】

【表11】

【0195】

１０．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する、エンドドメイン欠失α又はβ定常領域に連結されたリンカーＧ４Ｓを含む共刺激エンドドメインの効果
１０．１．Ｔ細胞及び標的細胞のインビトロ共培養方法
標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は浮遊細胞であり、共インキュベーションのために、対応する数の細胞を採取し、標的細胞培養培地と混合し、次いで培養のために遠心分離した。具体的な工程は以下の通りであった。初代Ｔ細胞をパッケージング及び精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に、感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、エフェクター細胞対標的細胞の比を決定し、通常１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、更に、標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして細胞増殖数の変化を観察した。感染効率に基づいて総Ｔ細胞数を算出し、標的細胞の一般的な用法は１×１０５個／ウェル（９６ウェルプレート）であった。

【0196】

１０．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的抗原は、一般に細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞を活性化してＴ細胞の機能を検出するために直接使用することができ、特に、標的抗原に通常１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞を添加し、２４時間遠心分離及び活性化してＴ細胞機能を検出するための細胞懸濁液又は培養上清を回収した。

【0197】

１０．３．Ｔ細胞殺傷機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と異なる時間共培養し、次いで、細胞懸濁液を穏やかに均一に吹き込み、ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色の９６ウェルプレートに採取し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を採取し、室温で１５分間溶解するための細胞溶解物を添加し、次いで、４０００ｒｐｍ／分で１５分間４℃で遠心分離し、次いで、各ウェルに２つの平行ウェルを採取して上清を採取し、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）を添加し、次いで、ゲイン値を１００に固定して多機能性マイクロプレートリーダーによって検出して化学発光値を得た。細胞殺傷計算：細胞殺傷効率＝１００％－（ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。

【0198】

ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺傷機能試験の検出結果は、異なる長さのＧ４Ｓリンカーを有する共刺激エンドドメインが、エンドドメイン欠失α又はβ定常領域に連結されていることを示し、Ｔ細胞対標的細胞の１：１のＥ：Ｔ比における結果は、リンカーがα定常領域エンドドメインに連結されている場合、α－ｄｅｌ－ＯＸ４０、α－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０及びα－β－ｏｘ４０は、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０及びα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）１０－ＯＸ４０よりも優れた同様の殺傷効果を示し、リンカーがβ定常領域エンドドメインに連結されている場合、β－ｄｅｌ－ＯＸ４０、β－ｏｘ４０、β－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０及びα－β－ｏｘ４０は同様の殺傷効果を示したが、それでもリンカーが長いほどＴ細胞の殺傷効果は弱かった。定常領域エンドドメインを除去した後のＯＸ４０（α－ｄｅｌ－ＯＸ４０又はβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０）との接続は、そのような除去がない場合と比較して効果の差をほとんど示さなかったが、リンカーを添加した後（リンカーの数は３以下であった）、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）１－３－ＯＸ４０又はβ－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）１－３－ＯＸ４０の効果は、α－ｄｅｌ－ＯＸ４０又はβ－ｄｅｌ－ＯＸ４０の効果よりも良好であった。リンカーをα定常領域エンドドメインに連結した場合の効果と、リンカーをβ定常領域エンドドメインに連結した場合の効果とを比較すると、リンカーをα定常領域エンドドメインに連結した場合の効果の方が、リンカーをβ定常領域エンドドメインに連結した場合よりも優れていた。しかし、図１７及び図１８、並びに表１２及び表１３に示すように、２：１のＥ：Ｔ比で残存腫瘍生存率に有意差はなかった。上記の結果に基づいて、エンドドメイン欠失α又はβ定常領域に連結されたＧ４Ｓリンカーを含む共刺激エンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの腫瘍殺傷効果に影響せず、α定常領域エンドドメインに連結した場合の効果は、β定常領域エンドドメインに連結した場合よりも良好であったが、リンカーの長さが長いほど、代わりに腫瘍殺傷効果が弱くなった。

【0199】

１０．４．Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化の間、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等の多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷させるか、又はＴ細胞自体の増殖を促進するのを助けた。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を収集し、遠心分離し、上清を採取した。使用したＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットは、ヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡ、ヒトＴＮＦ－α非被覆ＥＬＩＳＡ及びヒトＩＦＮ－γ非被覆ＥＬＩＳＡ（それぞれ、第８８－７０２５号、第８８－７３４６号、第８８－７３１６号）であった。具体的な工程は以下の通りであった。１０Ｘコーティング緩衝液をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティング抗体（２５０Ｘ）を添加し、ウェルを混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。ラップで封止し、４℃で一晩静置した後、１×ＰＢＳＴ（洗浄緩衝液とも呼ばれる、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１×ＰＢＳ）を用いて、毎回２６０μＬ／ウェルで３回洗浄し、５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ ＤｉｌｕｅｎｔをｄｄＨ２Ｏで１×に希釈した後、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで１回洗浄し、検量線（それぞれ２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈し、１ｘＤｉｌｕｅｎｔで２０～５０倍に希釈した。検量線による試料を１００マイクロリットル／ウェルで添加し、２つの並列ウェルを採取し、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを３回洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈した検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを３回の洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈したＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、発色時間が１５分未満であるＴＭＢを発色のために添加し、終了のために２ＮのＨ２ＳＯ４を添加し、４５０ｎｍでの光吸収を検出した。

【0200】

ＥＬＩＳＡの結果は、Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共インキュベートした後、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）７－ＯＸ４０ＯＸ４０の構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの分泌よりも有意に低かったが、他の構造β－ｄｅｌ－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－ＯＸ４０、α－ｄｅｌ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０及びα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０のＩＬ－２分泌は、それぞれｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２分泌と同様であったことを示し、図１９及び図２０並びに表１４及び表１５に示されるように、β－ｄｅｌ－ＯＸ４０のみがｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＦＮ－γ分泌と同様のＩＦＮ－γ分泌を示したが、他の構造のＩＦＮ－γ分泌は異なる減少を示した。ＥＬＩＳＡの結果によれば、α又はβ定常領域のエンドドメインを有する構造では、α鎖のエンドドメインの欠失はＩＦＮ－γ分泌に影響を及ぼしたが、ＩＬ－２分泌には影響を及ぼさず、β鎖のエンドドメインの欠失はＩＬ－２及びＩＦＮ－γのいずれの分泌にも影響を及ぼさず、同時に、α鎖のエンドドメインを欠失させた後、リンカーを使用してＯＸ４０エンドドメインに連結し、７未満の長さを有するリンカーの場合、ＩＬ－２分泌に影響を及ぼさないが、ＩＦＮ－γ分泌を減少させた。

【0201】

１０．５．Ｔ細胞分化変化の検出：フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞活性化中に、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、シグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を介して核内に伝達されてＴ細胞の分化を調節した。Ｔ細胞は、初期Ｔ細胞（ナイーブ）からセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）、そして最後にエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）に分化する。しかしながら、インビボでのＴ細胞の増殖及び持続性は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）からエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）に分化したＴ細胞の数によって影響される。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類され得る。セントラルメモリーＴ細胞の分化比は、インビボでのＴ細胞の持続的殺傷効果に影響を及ぼす。エフェクターＴ細胞に対する初期Ｔ細胞の比は、インビボでのＴ細胞の腫瘍殺傷効果及び持続性に影響を及ぼす。Ｔ細胞の表面におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーにより検出することにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再度遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。

【0202】

フローサイトメトリーの結果から、図２１及び表１６に示されるように、Ｇ４Ｓリンカーを含む共刺激性エンドドメインと、α又はβ定常領域のエンドドメインが欠失した構造とを連結させた場合、得られたα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０は、セントラルメモリーＴ細胞の有意な分化を示したが、α（α－ｄｅｌ－ＯＸ４０）又はβ（β－ｄｅｌ－ＯＸ４０）定常領域のエンドドメインにＯＸ４０が直接連結した構造も、セントラルメモリーＴ細胞の分化を促進した。同時に、種々の改変構造を有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞の数は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのエフェクターＴ細胞の数よりも有意に少なかったが、図２２及び表１７に示すように、ナイーブＴ細胞の割合はそれぞれ、ｍｕｔ－ＳＴＡＲのエフェクターＴ細胞の割合よりも有意に高かった（２８．３％）。腫瘍殺傷結果、ＥＬＩＳＡ結果及び細胞分化のフローサイトメトリー検出を組み合わせると、欠失し、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介してＯＸ４０エンドドメインに接続されたα又はβ定常領域のエンドドメインを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲは、腫瘍殺傷効果及びＩＬ－２分泌に影響を及ぼすことなく、Ｔ細胞のメモリー細胞集団の分化を有意に改善することができる。

【0203】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【0204】

１１．変異型ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるアルギニンへのＴＣＲエンドサイトーシス関連リジン改変の効果
１１．１．Ｔ細胞及び標的細胞のインビトロ共培養方法
標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は浮遊細胞であり、共インキュベーションのために、対応する数の細胞を採取し、標的細胞培養培地と混合し、次いで培養のために遠心分離した。具体的な工程は以下の通りであった。初代Ｔ細胞をパッケージング及び精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に、感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、エフェクター細胞対標的細胞の比を決定し、通常１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、更に、標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして細胞増殖数の変化を観察した。感染効率に基づいて総Ｔ細胞数を算出し、標的細胞の一般的な用法は１×１０５個／ウェル（９６ウェルプレート）であった。

【0205】

１１．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的は、一般に細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞を活性化してＴ細胞の機能を検出するために直接使用することができ、特に、標的抗原に通常１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞を添加し、２４時間遠心分離及び活性化してＴ細胞機能を検出するための細胞懸濁液又は培養上清を回収した。

【0206】

１１．３．Ｔ細胞殺傷機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と異なる時間共培養し、次いで、細胞懸濁液を穏やかに均一に吹き込み、ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を白色の９６ウェルプレートに採取し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を採取し、室温で１５分間溶解するための細胞溶解物を添加し、次いで、４０００ｒｐｍ／分で１５分間４℃で遠心分離し、次いで、各ウェルに２つの平行ウェルを採取して上清を採取し、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）を添加し、次いで、ゲイン値を１００に固定して多機能性マイクロプレートリーダーによって検出して化学発光値を得た。細胞殺傷計算：細胞殺傷効率＝１００％－（ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。

【0207】

ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺傷機能試験の検出結果は、図２３及び表１８に示されるように、Ｔ細胞対標的細胞の２：１又は１：１のＥ：Ｔ比での、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおいてアルギニンに改変されたＴＣＲエンドサイトーシス関連リジンを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲであるｕｂ－ＳＴＡＲの腫瘍細胞殺傷効果が、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷効果よりも有意に低いことを示した。

【0208】

１１．４．Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化の間、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等の多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷させるか、又はＴ細胞自体の増殖を促進するのを助けた。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を収集し、遠心分離し、上清を採取した。使用したＩＦＮ－γ及びＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットは、ヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡ、ヒトＩＦＮ－γ非被覆ＥＬＩＳＡ（それぞれ、第８８－７０２５号、第８８－７３４６号、第８８－７３１６号）であった。具体的な工程は以下の通りであった。１０Ｘコーティング緩衝液をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティング抗体（２５０Ｘ）を添加し、ウェルを混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。ラップで封止し、４℃で一晩静置した後、１×ＰＢＳＴ（洗浄緩衝液とも呼ばれる、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１×ＰＢＳ）を用いて、毎回２６０μＬ／ウェルで３回洗浄し、５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ ＤｉｌｕｅｎｔをｄｄＨ２Ｏで１×に希釈した後、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで１回洗浄し、検量線（それぞれ２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈し、１ｘＤｉｌｕｅｎｔで２０～５０倍に希釈した。検量線に従って希釈した試料を１００マイクロリットル／ウェルで添加し、２つの並列ウェルを採取し、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを３回洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈した検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを３回の洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈したＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、発色時間が１５分未満であるＴＭＢを発色のために添加し、終了のために２ＮのＨ２ＳＯ４を添加し、４５０ｎｍでの光吸収を検出した。

【0209】

ＥＬＩＳＡの結果は、図２４、２５及び表１９、２０に示されるように、Ｔ細胞対標的細胞の２：１又は１：１又は１：２のＥ：Ｔ比で標的細胞と２４時間共インキュベートした、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおいてアルギニンに改変されたＴＣＲエンドサイトーシス関連リジンを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲである、ｕｂ－ＳＴＡＲによるＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌が、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のｕｂ－ＳＴＡＲによるＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌よりも有意に低いことを示した。

【0210】

１１．５．Ｔ細胞分化変化の検出：フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞活性化中に、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、シグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を介して核内に伝達されてＴ細胞の分化を調節し、インビボでのＴ細胞の増殖及び持続性は、メモリーＴ細胞に分化したＴ細胞の数によって影響された。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類され得る。Ｔ細胞の表面におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーにより検出することにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再度遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。

【0211】

フローサイトメトリーの結果は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ及びｕｂ－ＳＴＡＲ（膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおいてアルギニンに改変されたＴＣＲエンドサイトーシス関連リジンを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲ）の間で、セントラルメモリーＴ細胞の分化及びナイーブＴ細胞とエフェクターＴ細胞との比のいずれにも有意差が見られないことを示し、図２６及び図２７並びに表２１及び表２２に示されるように、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおけるアルギニンへのＴＣＲエンドサイトーシス関連リジン改変が、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞の分化に有意な影響を及ぼさなかったことを示した。腫瘍殺傷結果、ＥＬＩＳＡ結果及び細胞分化のフローサイトメトリー試験を組み合わせると、ｕｂ－ＳＴＡＲ、すなわち、膜貫通ドメイン又はエンドドメインにおいてアルギニンに改変されたＴＣＲエンドサイトーシス関連リジンを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲ改変に対する効果的な促進効果を有さなかった。

【0212】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【表22】

【0213】

１２．ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能に対する、α又はβ定常領域エンドドメインに接続された異なるサイトカイン受容体刺激領域を有する変異型ＳＴＡＲの効果
１２．１．Ｔ細胞及び標的細胞のインビトロ共培養方法
標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞は浮遊細胞であり、共インキュベーションのために、対応する数の細胞を採取し、標的細胞培養培地と混合し、次いで培養のために遠心分離した。具体的な工程は以下の通りであった。初代Ｔ細胞をパッケージング及び精製されたＷＴ－ＳＴＡＲ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔウイルスに感染させ、共培養の１日前に、感染効率をフローサイトメトリーによって検出し、エフェクター細胞対標的細胞の比を決定し、通常１：１又は２：１の比で共インキュベーションを行い、更に、標的細胞Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ及び初代Ｔ細胞を７日間共インキュベートして細胞増殖数の変化を観察した。感染効率に基づいて総Ｔ細胞数を算出し、標的細胞の一般的な用法は１×１０５個／ウェル（９６ウェルプレート）であった。

【0214】

１２．２．標的抗原によるＴ細胞の刺激
本発明の標的は、一般に細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞を活性化してＴ細胞の機能を検出するために直接使用することができ、特に、標的抗原に通常１×１０５／ウェルの陽性Ｔ細胞を添加し、２４時間遠心分離及び活性化してＴ細胞機能を検出するための細胞懸濁液又は培養上清を回収した。

【0215】

１２．３．Ｔ細胞殺傷機能の検証：ルシフェラーゼアッセイ
Ｔ細胞を標的細胞と異なる時間共培養し、次いで、細胞懸濁液を穏やかに均一に吹き込み、ウェル当たり１５０μＬの細胞懸濁液を採取し、白色の９６ウェルプレートに添加し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を採取し、室温で１５分間溶解するための細胞溶解物を添加し、次いで、４０００ｒｐｍ／分で１５分間４℃で遠心分離し、次いで、各ウェルに２つの平行ウェルを採取して上清を採取し、ルシフェラーゼ基質（ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬）を添加し、次いで、ゲイン値を１００に固定して多機能性マイクロプレートリーダーによって検出して化学発光値を得た。細胞殺傷計算：細胞殺傷効率＝１００％－（ウェル当たりのエフェクター細胞－標的細胞値／ウェル当たりの対照細胞－標的細胞値）。

【0216】

ルシフェラーゼアッセイによるＴ細胞殺傷機能試験の検出結果は、図２８及び表２３に示されるように、異なるサイトカイン受容体刺激領域が変異型ＳＴＡＲのα又はβ領域エンドドメインに接続されたとき、Ｔ細胞対標的細胞の２：１のＥ：Ｔ比において、β－ＩＬ－２Ｒｂ、α－ＩＬ－２Ｒｂ、α－ＩＬ－７ＲＡ、α－ＩＬ２１Ｒは全て、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺傷効果と同様の殺傷効果を示したが、β－ＩＬ２ＲｂＱ、α－ＩＬ２ＲｂＱ及びα－ＩＬ７ＲＡＱは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲの殺傷効果よりも有意に低い殺腫瘍効果を示した。更に、異なるサイトカイン受容体刺激領域が連結された変異型ＳＴＡＲの殺傷効果を検出し、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの殺傷効果と比較したところ、図２９及び表２４に示すように、２：１及び１：１のＥ：Ｔ比では、α－ＩＬ７ＲＡの殺傷効果はα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの殺傷効果よりもわずかに低かったが、他のサイトカイン受容体構造が連結されたＳＴＡＲの殺傷効果はα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲの殺傷効果よりも有意に低かった。

【0217】

１２．４．Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞活性化の間、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２等の多数のサイトカインが放出されて、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷させるか、又はＴ細胞自体の増殖を促進するのを助けた。Ｔ細胞を標的細胞又は抗原によって刺激した後、Ｔ細胞を収集し、遠心分離し、上清を採取した。使用したＩＦＮ－γ及びＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットは、ヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡ、ヒトＩＦＮ－γ非被覆ＥＬＩＳＡ（それぞれ、第８８－７０２５号、第８８－７３４６号、第８８－７３１６号）であった。具体的な工程は以下の通りであった。１０Ｘコーティング緩衝液をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティング抗体（２５０Ｘ）を添加し、ウェルを混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。ラップで封止し、４℃で一晩静置した後、１×ＰＢＳＴ（洗浄緩衝液とも呼ばれる、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１×ＰＢＳ）を用いて、毎回２６０μＬ／ウェルで３回洗浄し、５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ ＤｉｌｕｅｎｔをｄｄＨ２Ｏで１×に希釈した後、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで１回洗浄し、検量線（それぞれ２～２５０、４～５００、４～５００の範囲）に従って希釈し、１ｘＤｉｌｕｅｎｔで２０～５０倍に希釈した。検量線に従って希釈した試料を１００マイクロリットル／ウェルで添加し、２つの並列ウェルを採取し、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴを３回洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈した検出抗体を添加し、１時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴを３回の洗浄に使用し、次いで１ｘＤｉｌｕｅｎｔで希釈したＨＲＰを添加し、３０分間のインキュベーション後、溶液を６回洗浄し、発色時間が１５分未満であるＴＭＢを発色のために添加し、終了のために２ＮのＨ２ＳＯ４を添加し、４５０ｎｍでの光吸収を検出した。

【0218】

ＥＬＩＳＡの結果は、Ｔ細胞を標的細胞と２４時間、１：１又は１：２のＥ：Ｔ比でインキュベートした場合、β－ＩＬ－２ＲｂのＩＬ－２分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２分泌よりも有意に高かったが、α－ＩＬ－２Ｒｂ、β－ＩＬ－２ＲｂＱ及びα－ＩＬ－７ＲＡＱは同様のＩＬ－２分泌を示したが、図３０及び表２５に示すように、α－ＩＬ－２ＲｂＱのＩＬ－２分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＬ－２分泌よりも有意に低かったことを示した。図３１及び表２６に示すように、β－ＩＬ－２ＲｂのＩＦＮ－γ分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＦＮ－γ分泌よりも有意に高かったが、他の構造のＩＦＮ－γ分泌はｍｕｔ－ＳＴＡＲのＩＦＮ－γ分泌よりも有意に低かった。

【0219】

１２．５．Ｔ細胞分化変化の検出：フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞活性化中に、多数のサイトカイン及び他のケモカインが放出され、シグナルがサイトカイン又はケモカイン受容体を介して核内に伝達されてＴ細胞の分化を調節し、インビボでのＴ細胞の増殖及び持続性は、メモリーＴ細胞に分化したＴ細胞の数によって影響された。メモリーＴ細胞は、幹細胞Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞に分類され得る。Ｔ細胞の表面におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現をフローサイトメトリーにより検出することにより、Ｔ細胞の分化を知ることができる。Ｔ細胞を標的細胞と共に７日間インキュベートし、遠心分離し、抗ヒト－ＣＤ４５ＲＡ－Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５及び抗ヒト－ＣＣＲ７－ＡＰＣフロー抗体で３０分間染色し、再度遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、Ｔ細胞の分化をフローサイトメトリーによって検出した。

【0220】

α又はβ定常領域エンドドメインに連結された異なるサイトカイン受容体刺激領域を有する変異型ＳＴＡＲは、セントラルメモリーＴ細胞の分化及びナイーブＴ細胞とエフェクターＴ細胞との比において様々な差異を示し、ここで、α－ＩＬ－２Ｒｂ、β－ＩＬ－２Ｒｂ、α－ＩＬ－２ＲｂＱ、β－ＩＬ－２ＲｂＱは、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較して有意差を示さなかったが、α－ＩＬ－７ＲＡ、α－ＩＬ－７ＲＡＱ及びα－ＩＬ－２１Ｒは、図３２及び図３３、並びに表２７及び表２８に示されるように、ｍｕｔ－ＳＴＡＲと比較して有意差を示さなかった。上記の結果に基づいて、ｍｕｔ型ＳＴＡＲ Ｔ細胞の分化は、異なるサイトカイン受容体刺激領域が変異型ＳＴＡＲのα又はβ定常領域エンドドメインに接続した場合に有意に影響を受けた。

【0221】

【表23】

【表24】

【表25】

【表26】

【表27】

【表28】

【0222】

１３．様々なＳＴＡＲ様Ｔ細胞のインビボ増殖及び抗腫瘍能力の評価
１）実験動物モデル
本実験では、ＮＳＧ免疫不全マウスをモデルとして用いた。マウス遺伝子型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を欠くＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６／Ｎｊｕであり、マクロファージ及び樹状細胞も欠損していた。ＮＳＧマウスは、現時点で最も完全な免疫不全マウス系統であり、移植腫瘍及びＴ細胞を拒絶しないため、Ｔ細胞療法の前臨床研究において広く使用することができる。この実験では、６～８週齢の雌ＮＳＧマウスを使用し、各バッチのマウスの体重差を２ｇ以内に制御した。マウスを、特定の病原体フリー（ＳＰＦ）バリア内の独立した換気ケージで飼育し、病原体の汚染を防ぐために、通常の食餌及びｐＨがわずかに酸性の飲料水を与えた。

【0223】

２）腫瘍モデルの構築
血液腫瘍モデルの構築では、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞を異種移植に使用した。Ｒａｊｉ細胞は、レンチウイルスベクターによってルシフェラーゼ遺伝子を発現する細胞株であり、Ｒａｊｉ腫瘍の発生及び変化を、マウスのフルオレセイン化学発光及びインビボイメージングによってリアルタイムで監視した。このモデルでは、異なる用量（一般に約１～３×１０６細胞）のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞をマトリクスゲルと混合し、腹腔内注射によって６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに接種した。３日後、マウスにフルオレセインカリウム塩溶液を腹腔内注射し、腫瘍細胞の蛍光シグナルをインビボイメージングによって検出した。Ｒａｊｉ細胞は、腹腔内に固形腫瘍を生じ、マウスの体重減少等の症状を引き起こし、マウスにおいて急速に増殖した。治療的処置の非存在下では、Ｒａｊｉ腫瘍量はマウスにおいて約４０日間で死亡をもたらした。

【0224】

３）動物実験操作
全ての動物操作は、Ａｎｉｍａｌプロトコルの承認後に実施した。

【0225】

４）腫瘍成長をモニタリングするための手段
この実験では、インビボ蛍光イメージングを、基本的に、ルシフェラーゼ遺伝子を有する腫瘍細胞をコロニー形成のために動物に注射することによって使用した。酵素の存在下で特定の波長の光を基質として放出するフルオレセインカリウム塩溶液をマウスの腹腔内に注射し、インビボイメージングによってインビボで腫瘍細胞の蛍光シグナルを検出した。蛍光シグナルの定量分析を行い、ヒートマップを描画して腫瘍成長を定量的に反映させた。

【0226】

５）動物におけるＴ細胞活性及び増幅を検出する方法
インビボでのＴ細胞の生存及び増殖は、それらの最終的な抗腫瘍効果に直接関係している。動物におけるＴ細胞の活性及び増殖を検出するために、血液試料をマウスから定期的に採取し、末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の割合、細胞状態及び細胞グループ分けを分析した。具体的な操作は以下の通りであった。３～４日ごとに、マウスをイソフルランで麻酔し、マウスの眼窩から約１００ｕＬの血液を採取した。血液試料を抗凝固、血漿収集及び赤血球切断に供し、次いで残りの細胞をフロー染色に供して、ＣＤ４対ＣＤ８の比並びにＴ細胞サブセット分析及び細胞状態分析に使用したＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３等の分子を検出した。同時に、マウスの末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の絶対数をフローサイトメトリー又はデジタルＰＣＲによって得た。更に、実験の最後に、マウスを解剖して、マウスの他の免疫器官におけるＴ細胞の割合を検出することができる。

【0227】

６）動物におけるＴ細胞安全性の評価方法
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の毒性及び安全性を評価するために、実験動物においてＳＴＡＲ－Ｔ細胞によって副作用が引き起こされているかどうかを調べた。マウスの行動状態を観察し、マウスの病態を解析し、マウスの重要な器官から採取した切片を解析することにより、再注入されたＴ細胞が有意な毒性を有するかどうかを評価することができた。同時に、マウスの非腫瘍組織におけるＴ細胞の浸潤を分析することによって、Ｔ細胞がマウスの非腫瘍組織に対してオフターゲット殺傷効果を有するかどうかを決定することができる。更に、マウス血液中のＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα又はＩＬ－６等のサイトカインのレベルを検出することによって、Ｔ細胞が全身性サイトカインストームを引き起こし得るかどうかを決定することができる。

【0228】

７）Ｔ細胞腫瘍浸潤能の評価方法
Ｔ細胞が腫瘍に浸潤する能力は、固形腫瘍をチャレンジするＴ細胞の中核能力である。Ｔ細胞の浸潤能を検出するために、腫瘍組織を最初に分離し、続いて消化及び粉砕して単一細胞を得ることができ、これをフロー染色に供して腫瘍組織中のＴ細胞の割合を検出した。同時に、腫瘍懸濁液中の腫瘍細胞、腫瘍間質細胞及び免疫細胞を密度勾配遠心分離（例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配、Ｆｉｃｏｌｌ勾配等）によって更に分離して、精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞を得ることができ、精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞の特徴、例えばケモカイン受容体発現、Ｔ細胞枯渇等を配列決定及び他の方法によって詳細に分析することができる。

【0229】

８）結果
上記のインビトロ機能の結果に従って、５×１０５個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を、６週齢～８週齢のＮＣＧ雌マウスに尾静脈を介して接種して、マウス腫瘍モデルを構築し（図３４）、αβ ＯＸ４０－ＳＴＡＲ又はｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞を発現するインビボ機能を更に評価した。６日目に、担癌マウスを４つの群に分けた。Ａ：ＰＢＳ注射群（等量のＰＢＳを注射）；Ｂ：ｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群；Ｃ：αβ ＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群；Ｄ：ＢＢｚ－ＣＡＲ－Ｔ細胞注射群。Ｂ／Ｃ／Ｄ群のマウスには、尾静脈によって５×１０５個のＴＣＲ Ｔ細胞を注射し、Ａ群のマウスには等量の２００μＬのＰＢＳを注射した。次の数週間で、腫瘍細胞成長、インビボでのＴＣＲ Ｔ細胞増殖及びマウス生存をモニタリングした。図３４及び図３５に示すように、対照群と比較して、本実施例で構築したαβ ＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞は、担癌マウスの生存時間を有意に延長することができるが、腫瘍が消失し、腫瘍細胞を異なる時点でマウスに再注入した後、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ及びｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔは腫瘍細胞を適切に排除することができ、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔの効果はｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔの効果よりも良好であり、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ群のマウスの生存時間はＳＴＡＲ－Ｔ群及びＣＡＲ－Ｔ群の生存率よりも高かった。また、図３６に示すように、ＳＴＡＲ－Ｔ群と比較して、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のインビボでの増殖効果はＳＴＡＲ－Ｔ細胞よりも良好であり、腫瘍再注入の場合、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞ではわずかに増殖したが、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞では生じなかった。以上の動物実験の結果から、αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ構造のインビトロ及びインビボでの効果は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲよりも良好であることを見出すことができる。

【0230】

上記インビトロ機能の結果に従って、２×１０６個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を６週齢～８週齢のＮＣＧ雌マウスに腹腔内接種して、マウス腫瘍モデルを構築し（図３７）、異なる効果を発現するｍｕｔ－ＳＴＡＲ Ｔ細胞のインビボ機能を更に評価した。８日目に、担癌マウスを７つの群に分けた。Ａ：ＰＢＳ注射群（等量のＰＢＳを注射）；Ｂ：ｄｕａｌ－ｃａｒ；Ｃ：ｄｕａｌ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群；Ｄ：αβＯＸ４０－ＳＴＡＲ Ｔ細胞注射群；Ｅ：α－ｄｅｌ－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群；Ｆ：α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注入群；及びＧ：α－ＩＬ７Ｒ－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞注射群。Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ群のマウスには、尾静脈によって２×１０６個のＴＣＲ Ｔ細胞を注射し、Ａ群のマウスには等体積の２００μＬのＰＢＳを注射した。次の数週間で、腫瘍細胞成長、インビボでのＳＴＡＲ－Ｔ細胞増殖及びマウス生存をモニタリングした。図３７に示すように、本実施例で構築したα－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞は、コントロール群と比較して担癌マウスの腫瘍細胞を有意に殺傷させることができ、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の効果は他の群よりも優れていた。動物実験の結果から、α－ｄｅｌ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０－ＳＴＡＲ構造のインビトロ及びインビボでの効果は、ｍｕｔ－ＳＴＡＲよりも良好であることを見出すことができる。

【0231】

実施例２ 改善されたＴＣＲ
１．定常領域変異を有するＴ細胞受容体及びＴ細胞受容体の変異体の設計
Ｔ細胞に移入された後、外因性ＴＣＲ分子は、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲとミスマッチしてミスマッチを形成し得、これは一方では、ＴＣＲ分子の正しい対合の効率を低下させ、ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を弱め得、他方、潜在的なオフターゲット毒性をもたらし、治療のリスクを増加させる可能性がある。この問題を解決するために、本発明によれば、野生型αβＴＣＲ配列（ｗｔＴＣＲ、図３８の左側）の定常領域を変異改変し、それぞれｃｙｓＴＣＲ、ｈｍＴＣＲ及びｍｕｔ－ｏｈｍＴＣＲの設計をもたらした（図３８）。

【0232】

１．１．定常領域に分子間ジスルフィド結合を導入したｃｙｓＴＣＲの設計
本発明者らは、ＴＣＲα鎖定常領域の４８位のトレオニン（Ｔｈｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）に変異させ、ＴＣＲβ鎖定常領域の５６位のセリン（Ｓｅｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）に変異させた。２つの新たに付加されたシステインは、外因性ＴＣＲ（ｃｙｓＴＣＲ、図３８の左側の２つ目）の２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成し、それによってＴＣＲ分子がより安定な複合体を形成するのを助け、したがってより良好な機能を得る。

【0233】

１．２．マウスｈｍＴＣＲの設計
ＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域配列は、ヒト及びマウス等の異なる種において高度に保存されている。研究により、マウスＴＣＲ定常領域はヒト化ＴＣＲ定常領域とのミスマッチを形成しにくく、マウス定常領域はヒトＣＤ３分子との親和性がより高く、ヒトＴ細胞においてより安定な複合体を形成し、ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を大幅に改善することができることが示されている。したがって、ヒト化ＴＣＲの定常領域配列をマウスＴＣＲの定常領域配列に置き換えて、マウス定常領域を有するＴＣＲ分子、すなわちｈｍＴＣＲを構築した（図３８の右側の２つ目）。

【0234】

１．３．膜貫通疎水性アミノ酸置換及び更なる分子間ジスルフィド結合を有するマウスｍｕｔ－ｏｈｍＴＣＲの設計
ＴＣＲ分子の設計を更に最適化するために、ｈｍＴＣＲ用に設計されたマウス定常領域を、ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ分子の発現に適合するようにコドンヒト化した。同時に、マウスＴＣＲα鎖定常領域の４８位のトレオニン（Ｔｈｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）に変異させ、ＴＣＲβ鎖定常領域の５６位のセリン（Ｓｅｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）に変異させて、更なる分子間ジスルフィド結合を形成してＴＣＲ分子がより安定な複合体を形成するのを助けた。また、研究は、ＴＣＲα鎖膜貫通領域の１１１から１１９のアミノ酸領域をＬＳＶＭＧＬＲＩＬからＬＬＶＩＶＬＲＩＬに変更したこと、すなわち、１１２位のセリン（Ｓｅｒ）をロイシン（Ｌｅｕ）に、１１４位のメチオニン（Ｍｅｔ）をイソロイシン（Ｉｌｅ）に、１１５位のグリシン（Ｇｌｙ）をバリン（Ｖａｌ）に変異させたことにより、膜貫通領域の疎水性を高め、ＴＣＲ膜貫通領域が有する正電荷による不安定性を相殺し、ＴＣＲ分子を細胞膜上でより安定にすることができ、したがってより良好な機能が得られることを示した。したがって、これら３つの考え方（図３８の右側）を組み合わせて、Ｍｕｔ－ｏｈｍＴＣＲ構造を設計して、ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を向上させた。

【0235】

２．共刺激分子受容体エンドドメインを含むＴＣＲ－ＣＤ３分子の設計
ＴＣＲ Ｔ細胞の、インビボでの増殖能力、効果生存時間、及び標的細胞を効率的に殺傷させるために腫瘍微小環境に浸潤する能力を改善するために、本発明者らによってＴＣＲ－ＣＤ３複合体を改変することによって新しい構造が設計され、それによって、ＴＣＲ－Ｔの臨床応答を改善して持続的な治癒効果を達成するために、必要に応じて調節強化されたＴＣＲ－ＣＤ３細胞を可能にした。

【0236】

２．１．共刺激分子受容体エンドドメインを含むＴＣＲ分子（ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ）の設計
ＴＣＲは、全てのＴ細胞表面の特別なマーカーであり、αβＴＣＲ及びγδＴＣＲに分割され、対応するＴ細胞：αβＴ細胞及びγδＴ細胞を有していた。αβＴＣＲ及びγδＴＣＲは、それぞれαβＴ細胞及びγδＴ細胞の性能を改善するために、本発明者らによって共刺激シグナルでそれぞれ改変された。

【0237】

αβＴ細胞のＴＣＲは、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖からなり、全Ｔ細胞の９０％～９５％を占めた。αβＴＣＲは、可変領域と定常領域とからなり、可変領域は広い多様性を有し、抗原認識及び結合の役割を果たしたが、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達の役割を果たした。Ｔ細胞の毒性及び増殖持続性を増強するために、本発明によれば、ヒト化共刺激分子受容体のエンドドメイン配列をαβＴＣＲ定常領域のＣ末端に導入して（左、図３９）、ＳＴＡＲ Ｔ細胞の機能に対する効果を研究した。本発明のαβＴＣＲ定常領域は、改変されていないｗｔＴＣＲ定常領域、追加の分子間ジスルフィド結合を含むｃｙｓＴＣＲ定常領域、マウスｈｍＴＣＲ定常領域、及びサブセクション１に記載の３つの改変の組合わせを有するｍｕｔ－ＳＴＡＲを含んでいた。共刺激シグナル伝達構造は、ＣＤ４０／ＯＸ４０／ＩＣＯＳ／ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいた。共刺激エンドドメインは、ＴＣＲα鎖若しくはＴＣＲβ鎖、又はＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に接続することができた。更に、共刺激分子ドメインは、ＴＣＲ分子のエンドドメイン配列を欠失させた後に、直接又はＧ４Ｓ／（Ｇ４Ｓ）ｎを介して、ＴＣＲ定常領域のＣ末端に、又はＴＣＲ定常領域のＣ末端に接続することができた。

【0238】

γδＴ細胞のＴＣＲは、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖からなり、γδＴ細胞は、ＴＣＲδ鎖のタイプに基づいて３つのサブグループ：γδ１、γδ２及びγδ３に分割することができ、異なるサブグループはヒト体内で異なる分布を有する。γδＴ細胞は、ＭＨＣ拘束性の様式で非ペプチド抗原を認識し、病原体及び腫瘍の監視において重要な役割を果たした。実験は、ＣＤ２８／４－１ＢＢ及び同様の共刺激シグナルが、γδＴ細胞の活性化及び増殖において重要な役割を果たすことを示した。ヒト共刺激分子受容体のエンドドメイン配列を、本発明者らによって、ＴＣＲγ及びＴＣＲδのＣ末端にそれぞれ導入して（右、図３９）、γδＴ細胞の性能を改善した。

【0239】

２．２．共刺激分子受容体エンドドメインを含むＣＤ３分子（ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３）の設計
ＣＤ３サブユニットは、γ鎖、δ鎖、ε鎖及びζ鎖を含み、細胞の状態及び刺激に対する応答を調節するために、エクトドメインからエンドドメインにシグナルを伝達するＴＣＲ分子とＴ細胞受容体複合体を形成した。増強されたＴＣＲ Ｔ細胞を設計し、インビボでのＴ細胞の腫瘍殺傷能力、増殖能力及び生存時間を改善するために、ＣＤ３γ鎖、δ鎖、ε鎖及びζ鎖のＣ末端にヒト共刺激分子受容体エンドドメインを導入することによってＣＤ３分子を本発明者らによって改変し（図４０）、改変されたＣＤ３分子をＴＣＲ Ｔ細胞において発現させてＴＣＲ Ｔ細胞の機能を改善した。

【0240】

３．共刺激分子受容体エンドドメイン及びその変異体を含むＴＣＲのプラスミド構築
３．１ プラスミド供給源
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、タンパク質発現ベクター、食細胞、レンチウイルスパッケージングプラスミド、レトロウイルスパッケージングプラスミド等を含む本発明で使用されるベクターは、商業的企業から購入されるか、又は商業的企業によって合成され、これらのベクターの全長配列が得られ、特異的切断部位は既知であった。

【0241】

３．２．断片供給源
本発明で言及されるＴＣＲは、本発明で使用されるＴＣＲ－Ｅ １４１、ＴＣＲ－Ｅ ３１５、ＴＣＲ－Ｅ ３１６を含む任意の機能性ＴＣＲであり得る。本発明で使用される遺伝子断片には、ＴＣＲ－Ｅ１４１／ＴＣＲ－Ｅ３１５／ＴＣＲ－Ｅ３１６の可変領域、ｗｔＴＣＲ定常領域、ｃｙｓＴＣＲ定常領域、ｈｍＴＣＲ定常領域、ｍｕｔ－ｏｈｍＴＣＲ定常領域、共刺激受容体エンドドメイン、タグ配列及びリンカー等が含まれ、これらは全て商業的会社から合成された。１つ以上の標的断片を、対応する機能的配列を得るためにプライマーを合成するＰＣＲによって連結した。

【0242】

３．３ ベクター構築
ここで用いたレンチウイルスベクターはｐＨＡＧＥ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ＲＦＰであり、直鎖状ベクターは制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉによって得られ、遺伝子断片は合成及びＰＣＲによって得られ、完全ベクターは相同組換えによって得られた。

【0243】

４．ヒト初代ＴＣＲ Ｔ細胞及び標的細胞株の構築
４．１ レンチウイルスパッケージング
無菌的に抽出した標的遺伝子プラスミド及びパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇを一定の割合でＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＰＥＩ）と混合してＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、細胞培養上清を４８時間及び７２時間で収集し、次いでこれを濾過し、ＰＥＧ８０００（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）と混合し、続いて４℃で一晩静置し、上清を廃棄した後、３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、次いで少量の培地で再懸濁して、濃縮レンチウイルスを得た。

【0244】

４．２ ヒト初代Ｔ細胞の単離、培養及びレンチウイルス感染
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、リンパ球の分離に使用される溶液であるＦｉｃｏｌｌを用いてボランティアの末梢血から単離し、次いで、Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の製品説明書に従って陰性選択によってＰＢＭＣから得、これをＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）を含有する１６４０完全培地を用いて１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁し、次いで、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされた培養皿で活性化した。４８時間の活性化の後、３２℃で２時間、１５００ｒｐｍで遠心分離することによって、レンチウイルス系を用いて、ＴＣＲ又は／及びＣＤ３がロードされたウイルス粒子でＴ細胞に感染させ、次いで取り出し、３７℃の細胞培養インキュベータ内で１０時間インキュベートし、次いで培地の添加によって感染を終了させ、細胞を３７℃の細胞培養インキュベータ内で連続培養した。感染の３日後に、ＴＣＲ陽性細胞をフローサイトメトリーによって選別した。

【0245】

４．３ 標的細胞株の構築
対数増殖期のＲａｊｉ細胞に、レンチウイルス系を使用して、ＬＭＰ２－ＲＦＰ、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤ及びルシフェラーゼ－ＧＦＰをそれぞれ負荷したウイルス粒子を感染させた。薬物スクリーニング及びフローソーティングにより、ＬＭＰ２、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１分子及びルシフェラーゼを同時に安定に発現するＲａｊｉ細胞が得られ、これをＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ細胞と命名した。

【0246】

５．異なる定常領域を有するＴＣＲ Ｔ細胞の機能に対する共刺激シグナルの効果
共刺激シグナルがインビボでの増殖を改善し、ＴＣＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷効果を増強することができるかどうかを調べるために、ＯＸ４０、ＣＤ４０及びＩＣＯＳエンドドメインを、４つの異なる定常ドメインを有するＴＣＲα鎖及びβ鎖のＣ末端（ｗｔＥ１４１、ｃｙｓＥ１４１、ｈｍＥ１４１、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１）にそれぞれ付加し、したがってプラスミドｗｔＥ１４１－αβ－ＯＸ４０、ｃｙｓＥ１４１－αβ－ＯＸ４０、ｈｍＥ１４１－αβ－ＯＸ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ４０、ｃｙｓＥ１４１－αβ－ＣＤ４０、ｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ４０、ｗｔＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳ、ｃｙｓＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳ、ｈｍＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳ、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳ及びｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳを構築した。更に、様々な定常領域を有するＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６のα鎖及びβ鎖のＣ末端にＯＸ４０、ＣＤ４０又はＩＣＯＳを付加することによってもプラスミドを構築した。ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドでパッケージングし、次いで、これを初代Ｔ細胞に感染させ、陽性細胞を選別するために使用した。選別したＴＣＲ Ｔ細胞を、０日目として計数しながら、セクション５のスキームに従ってＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、次いで、フロー分析のためにそれぞれ１日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目に細胞を回収した。このうち、使用した培地はＩＬ－２を含まない１６４０完全培地であり、ＴＣＲ Ｔ細胞の初期数は１×１０５細胞であり、各時点の試料を独立してインキュベートし、残りの共インキュベートした試料を翌日に液体で半交換し、標的細胞を補充した。フロー分析に使用した細胞を予め抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、その特定の体積を収集し、機械で分析したときに記録し、システム中のＴ細胞の数及び割合を変換によって得た（図４１Ａ）。Ｅ１４１ ＴＣＲ Ｔ細胞（左、図４１Ａ）の絶対数の増殖曲線から分かるように、標的細胞エピトープを認識した後、ＴＣＲ定常領域のＣ末端にＯＸ４０受容体が付加されたＴＣＲ Ｔ細胞は、より良好な活性化及び増殖を示した。更に、システム中のＴ細胞及び残存標的細胞の割合を分析し（右、図４１Ａ）、ＯＸ４０を添加したＴＣＲ Ｔ細胞が、特にｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１ ＴＣＲ Ｔ細胞について、より強い腫瘍クリアランス能力を示し、共刺激シグナルがＴ細胞の機能を有意に改善することが見出された。更に、ＣＤ４０又はＩＣＯＳを添加したＴＣＲ－Ｅ１４１のインビトロでの長期共培養もまた、キメラ共刺激シグナルが細胞増殖を有意に改善し、Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力を増強し得ることを示した。ＴＣＲをＴＣＲ－Ｅ３１５（図４１Ｂ）及びＴＣＲ－Ｅ３１６に置き換えた場合、同様の結果が得られた。上記の実験結果によれば、ＴＣＲのＣ末端におけるＯＸ４０、ＣＤ４０及びＩＣＯＳ等の共刺激ドメインのエンドドメインの融合は、ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖能力及び腫瘍細胞を殺傷させる能力を有意に増強することができ、その中で、共刺激ドメインのエンドドメインをｍｕｔ－ｏｈｍ ＴＣＲの定常領域に付加することによって、対応するＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力の改善が最も有意であった。

【0247】

６．ＴＣＲ Ｔ細胞機能に対する異なる共刺激シグナルの効果
異なる共刺激シグナルによって改変されたＴＣＲ Ｔ細胞の性能を比較するために、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＯＸ４０、ＣＤ２７及びＣＤ４０分子のエンドドメインをそれぞれｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１ ＴＣＲ定常領域のＣ末端に付加し、次いで、構築したｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－４－１ＢＢ、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ２８、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳ、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＯＸ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ２７、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ２７、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ４０ＴＣＲ Ｔ細胞を、セクション５の共培養スキームに従ってＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、システム中のＴ細胞の数及び割合をフローサイトメトリーによって分析した。増殖曲線及びＴ細胞の絶対数のＥ：Ｔ比（図４２Ａ）の結果から、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ又はＣＤ２８をＴＣＲ定常領域のＣ末端に添加したＴＣＲ Ｔ細胞は、共刺激シグナル改変を伴わないｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｗｔと比較して、優れた活性化及び増殖能及び有意に改善された殺傷機能を示したことが分かる。これらの中で、ＣＤ４０及びＯＸ４０を添加したＴＣＲ Ｔ細胞は、より有意な活性化、増殖及び腫瘍クリアランスを示した。加えて、同様に、この実施例に記載される共刺激分子に接続されたα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端を有するＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６プラスミドを構築し、いずれかのＴＣＲ Ｔ細胞による標的細胞の殺傷に対する異なる共刺激分子の効果を分析した。結果は、ＴＣＲ－Ｅ１４１と同様の結果がＴＣＲ－Ｅ３１５（図４２Ｂ）及びＴＣＲ－Ｅ３１６からも得られたことを示し、機能的ＴＣＲ定常領域のいずれかのＣ末端で共刺激シグナルを選択的にキメラ化することによって、対応するＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力を有意に増加させることができたことを示した。これに基づいて、ＴＣＲ Ｔ細胞は、共刺激シグナル又はＴＣＲ Ｃ末端の他の機能的ドメインをキメラ化することによってＴＣＲ Ｔ細胞の性能を改善するための要件に従ってカスタマイズすることができる。

【0248】

７．ａｒｍｏｒｅｄ－－ＴＣＲ Ｔ細胞の機能に対するＴＣＲ分子の（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー及びエンドドメイン配列の効果
（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーは、タンパク質工学において広く使用され、融合分子に融合分子の機能を改善するためのより良好な柔軟性を与えることができる。共刺激受容体エンドドメインを組み込んだＴＣＲ分子の機能を更に改善するために、融合タンパク質ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ分子の機能に対する（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーの効果を研究した。ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０及びｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０プラスミドを、共刺激受容体ドメインとｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１ＴＣＲ分子のＣ末端との間に１つ又は３つのＧ４Ｓリンカーを導入することによって構築し、加えて、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０及びｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＯＸ４０プラスミドも、ｍｕｔ－ｏｈｍＴＣＲαβ定常領域のＣ末端のエンドドメインを欠失させ、次いで１つ又は３つのＧ４Ｓリンカーを介して共刺激受容体ドメインに接続することによって設計した。同様に、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳ、並びにＯＸ４０、ＣＤ４０及びＩＣＯＳ改変を有するＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６にリンカーを導入し、対応するプラスミドを構築した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔを第２世代のパッケージングプラスミドでトランスフェクションした後、ウイルスを得、これを使用して初代Ｔ細胞を感染させ、陽性細胞を選別した。選別したＴＣＲ Ｔ細胞を、０日目として計数しながら、セクション５のスキームに従ってＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、次いで、フロー分析のためにそれぞれ１日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目に細胞を回収した。Ｔ細胞の増殖曲線及び絶対数のＥ：Ｔ比（図４３Ａ）の結果から、ＴＣＲ定常領域のＣ末端とＯＸ４０エンドドメインとの間に１つ又は３つのＧ４Ｓを導入すると、ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力を高めることができ、ＴＣＲ定常領域のＣ末端における細胞内アミノ酸の欠失は、リンカーを添加しないｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｗｔと比較して、ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を更に改善することができることが分かる。ＯＸ４０をＣＤ４０又はＩＣＯＳで更に置換した後、ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び殺傷能力もまた、対照群のｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＣＤ４０及びｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ＩＣＯＳと比較して、上記改変後に有意に増強された。一方、ＴＣＲ－Ｅ３１５（図４３Ｂ）及びＴＣＲ－Ｅ３１６からも同様の結果が得られた。

【0249】

８．ＴＣＲ Ｔ細胞の機能に対する異なるＴＣＲ鎖への共刺激構造の連結の効果
Ｔ細胞機能に対する異なるＴＣＲ鎖への共刺激ドメインの連結の効果を調べるために、４－１ＢＢ及びＯＸ４０のエンドドメインをＴＣＲα鎖、又はＴＣＲβ鎖、又はＴＣＲα鎖とβ鎖の両方のＣ末端に付加して、以下のようにプラスミドを構築した。ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－４－１ＢＢ、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－β－４－１ＢＢ、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－４－１ＢＢ、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－ＯＸ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－β－ｏｘ４０、及びｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｏｘ４０。同様に、ＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６の異なる鎖にＯＸ４０又は４－１ＢＢエンドドメインを付加したプラスミドも構築した。ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドでパッケージングし、次いで、これを初代Ｔ細胞に感染させるために使用した。ＴＣＲ陽性Ｔ細胞を、０日目として計数しながら、セクション５のスキームに従ってＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、次いで、フロー分析のためにそれぞれ１日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目に細胞を回収した。増殖曲線の結果及びＴ細胞の絶対数のＥ：Ｔ比（図４４、図４５；ＡはＥ１４１であり、ＢはＥ３１５である）から分かるように、共刺激シグナルが付加されていないｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－ｗｔと比較して、ＴＣＲα鎖又はβ鎖定常領域の一方のみのＣ末端に４－１ＢＢドメインが導入されたＴＣＲ Ｔ細胞は、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方のＣ末端に導入された場合よりも良好な活性化及び増殖を示し、このような導入はＴＣＲα鎖のみで行われた場合の方が、ＴＣＲβ鎖のみで行われた場合よりもわずかに良好な効果を示した。対照的に、ＯＸ４０ドメインをＴＣＲα鎖定常領域のみのＣ末端に導入する設計は、ＴＣＲβ鎖のみに導入する設計又は両鎖に導入する設計よりも有意に優れていた（図４５）。一方、ＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６からも同様の結果が得られた。上記の実験結果は、ＴＣＲα鎖のＣ末端における共刺激エンドドメインの導入が、標的細胞の抗原性エピトープの認識後のＴＣＲ Ｔ細胞の最良の活性化及び増殖を促進し、ＴＣＲβ鎖のみ又はＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方において同時に共刺激ドメインをキメラ化することと比較して、強力な殺傷機能の改善を示すことを示した。

【0250】

９．ＴＣＲ Ｔ細胞の機能に対するＴＣＲα鎖のＣ末端へのＧ４Ｓリンカーを含む共刺激エンドドメインの連結の効果
サブセクション６、７及び８の結果を組み合わせて、共刺激受容体エンドドメインを組み込んだａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を更に改善するために、細胞内アミノ酸を除去した後、共刺激受容体エンドドメインをＴＣＲα鎖のＣ末端に直接又はＴＣＲα鎖のＣ末端に連結することによる、ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞の機能に対する効果を試験した。プラスミド：ｗｔＥ１４１－α－ＯＸ４０、ｗｔＥ１４１－α－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｗｔＥ１４１－α－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｗｔＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｈｍＥ１４１－α－ＯＸ４０、ｈｍＥ１４１－α－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｈｍＥ１４１－α－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｈｍＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｃｙｓＥ１４１－α－ＯＸ４０、ｃｙｓＥ１４１－α－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｃｙｓＥ１４１－α－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｃｙｓＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－ＯＸ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０及びｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０を構築した。プラスミド：ＣＤ４０及びＩＣＯＳを付加したＴＣＲ－Ｅ１４１、並びにＯＸ４０、ＣＤ４０及びＩＣＯＳを付加したＴＣＲ－Ｅ３１５、ＴＣＲ－Ｅ３１６も構築した。ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドでパッケージングし、次いで、これを初代Ｔ細胞に感染させるために使用した。ＴＣＲ陽性Ｔ細胞を、０日目として計数しながら、セクション５のスキームに従ってＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ細胞と共培養し、次いで、フロー分析のためにそれぞれ１日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目に細胞を回収した。結果（図４６）から、ＴＣＲα鎖のＣ末端と共刺激分子との間に１つのＧ４Ｓを導入することにより、ＴＣＲ Ｔ細胞の増殖能及び殺傷能が増大し、ＴＣＲ定常領域のＣ末端の細胞内アミノ酸を欠失させることにより、リンカーを添加しない対照群と比較して、ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を更に向上させることができることが示された。キメラ分子をＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方に同時に付加した群と比較して、α鎖に対する同じ改変は、両方の鎖に対する同時の同じ改変よりも有意に良好な効果を示した。更に、ＯＸ４０をＣＤ４０又はＩＣＯＳで更に置換した後、対照群と比較して、α鎖の細胞内アミノ酸を除去した後にＧ４Ｓを介してＣＤ４０又はＩＣＯＳに連結されたＴＣＲＴの増殖及び殺傷能力も有意に増強された。一方、ＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６からも同様の結果が得られた。

【0251】

１０．ａｒｍｏｒｅｄ－ＴＣＲ Ｔ細胞のインビボ増殖及び抗腫瘍能力の評価
共刺激ドメインを含むＴＣＲ Ｔ細胞の増殖及び抗腫瘍効果をインビボで検証するために、４×１０５個のＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を、５週齢～６週齢のＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒ γ ｎｕｌｌ（ＮＣＧ）雌マウスに尾静脈によって接種して、マウス腫瘍モデルを構築した（図４７参照）。６日目に、マウスを以下のように５つの群に分けた。Ａ：ＰＢＳ注射群（等量のＰＢＳを注射）；Ｂ：ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１ ＴＣＲ Ｔ細胞注入群；Ｃ：ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｏｘ４０ ＴＣＲ Ｔ細胞注射群、Ｄ：ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－ＯＸ４０ ＴＣＲ Ｔ細胞注射群、及びＥ：ｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－αβ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０ ＴＣＲ Ｔ細胞注射群であり、Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ群のマウスに尾静脈によって４×１０５個のＴＣＲ Ｔ細胞を注射し、Ａ群には等容量の２００μＬのＰＢＳを注射した。次の数週間において、マウスにおける腫瘍細胞成長、マウスにおけるヒトＴＣＲ Ｔ細胞増殖及びマウス生存をモニタリングした。図４８に示されるように、本実施例において構築された共刺激分子を含むＴＣＲ Ｔ細胞は、コントロール群と比較して、マウスにおいてより良好な増殖を示した。また、図４７及び図４９に示されるように、コントロール群と比較して、この実施例において構築されたｍｕｔ－ｏｈｍＥ１４１－α－ＯＸ４０ ＴＣＲ Ｔ細胞は、担癌マウスの生存期間を有意に延長し、したがって、マウスの生存率を改善した。

【0252】

１１．ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を発現するＴＣＲ Ｔ細胞の機能の評価
（１）インビトロでの機能評価
ＴＣＲ Ｔ細胞の機能に対するδ鎖、ε鎖、γ鎖及びζ鎖を含む異なるＣＤ３サブユニットのＣ末端へのヒト共刺激受容体エンドドメインの導入の効果を比較するために、本発明によれば、ＣＤ３分子を改変して以下のプラスミド：ＣＤ３δ－４－１ＢＢ、ＣＤ３δ－ＣＤ２８、ＣＤ３δ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３δ－ＯＸ４０、ＣＤ３ε－４－１ＢＢ、ＣＤ３ε－ＣＤ２８、ＣＤ３ε－ＩＣＯＳ、ＣＤ３ε－ＯＸ４０、ＣＤ３γ－４－１ＢＢ、ＣＤ３γ－ＣＤ２８、ＣＤ３γ－ＩＣＯＳ、ＣＤ３γ－ＯＸ４０、ＣＤ３ζ－４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ－ＣＤ２８、ＣＤ３ζ－ＩＣＯＳ、及びＣＤ３ζ－ＯＸ４０を構築し、ここで、ＣＤ３は、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介して共刺激受容体ドメインに連結されていた。改変されたａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子及びｃｙｓＥ１４１ ＴＣＲ分子をＴ細胞において同時に発現させ、次いで、フローソーティングによって得られた二重陽性細胞を、Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼとセクション５に従って共培養して、ＴＣＲ Ｔ細胞の機能を評価した。インビボでのＴ細胞増殖曲線、図５０に示すＥ：Ｔ比、及び図５１に示す７日目のＥ：Ｔ比の結果から、ＣＤ３δ－ＯＸ４０分子又はＣＤ３γ－ＩＣＯＳ分子を発現しているｃｙｓＥ１４１ ＴＣＲ Ｔ細胞は、他のａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３ＴＣＲ Ｔ細胞又はａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を有さないｃｙｓＥ１４１ ＴＣＲ Ｔ対照群と比較して、増殖能及び殺傷能が有意に優れていた。同時に、７日目に収集した共培養上清中のサイトカインＩＦＮγレベル（図５２）は、ａｒｍｏｒｅｄ－ＣＤ３分子を含まないｃｙｓＥ１４１と比較して、ＣＤ３δ－ＯＸ４０又はＣＤ３γ－ＩＣＯＳの発現がｃｙｓＥ１４１ ＴＣＲ Ｔ細胞のより良好な活性化を促進することを示した。一方、ＴＣＲ－Ｅ３１５及びＴＣＲ－Ｅ３１６からも同様の結果が得られた。

【0253】

（２）インビボでの機能評価
上記のインビトロ機能の結果に従って、４×１０５個のＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を、５週齢～６週齢のＮＣＧ雌マウスに尾静脈により接種して、マウス腫瘍モデルを構築し（図５３）、ＣＤ３δ－ＯＸ４０又はＣＤ３γ－ＩＣＯＳ分子を発現するｃｙｓＥ１４１ ＴＣＲ Ｔ細胞のインビボ機能を更に評価した。６日目に、担癌マウスを以下の４つの群に分けた。Ａ：ＰＢＳ注射群（等量のＰＢＳを注射）；Ｂ：ｃｙｓＥ１４１ＴＣＲ Ｔ細胞注入群；Ｃ：ＣＤ３δ－ＯＸ４０ｃｙｓＥ１４１ＴＣＲ Ｔ細胞注入群；及びＤ：ＣＤ３γ－ＩＣＯＳ ｃｙｓＥ１４１ＴＣＲ Ｔ細胞注射群であり、Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ群のマウスに４×１０５個のＴＣＲ Ｔ細胞を尾静脈によって注射し、一方、Ａ群のマウスに等量の２００μＬのＰＢＳを注射した。次の数週間で、腫瘍細胞成長、インビボでのＴＣＲ Ｔ細胞増殖及びマウス生存をモニタリングした。図５３及び図５５に示すように、対照群と比較して、この実施例で構築されたＣＤ３δ－ＯＸ４０ｃｙｓＥ１４１ＴＣＲ Ｔ細胞は、担癌マウスの生存期間を有意に延長した。更に、図５４に示すように、対照群と比較して、ＣＤ３δ－ＯＸ４０分子を発現するｃｙｓＥ１４１ＴＣＲ Ｔ細胞は、マウスにおいてより良好な増殖を示した。

【0254】

１２．ＴＣＲ Ｔ細胞機能に対する共刺激シグナルの効果
共刺激分子がγδＴＣＲ Ｔ細胞の機能に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ヒト共刺激分子のエンドドメイン配列を、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖定常領域の両方のＣ末端にそれぞれ導入した。共刺激受容体エンドドメインを組み込んだγδＴＣＲ Ｔ細胞の機能を更に改善するために、共刺激受容体ドメインを、Ｇ４Ｓリンカーを介してＴＣＲγ鎖及びδ鎖のＣ末端に直接連結し、その細胞内アミノ酸を除去して、又は除去せずに、以下のようにプラスミドを構築した。ＴＣＲ－Ｇ１１５－γ－ＯＸ４０、ＴＣＲ－Ｇ１１５－δ－ＯＸ４０、ＴＣＲ－Ｇ１１５－γδ－ＯＸ４０、ＴＣＲ－Ｇ１１５－γδ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０、ＴＣＲ－Ｇ１１５－γδ－ｄｅｌＣ－Ｇ４Ｓ－ＯＸ４０。ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドでパッケージングし、次いで、これを初代Ｔ細胞に感染させ、陽性細胞を選別するために使用した。選別したγδＴＣＲ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、ヒトＤａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫）を標的細胞として使用した。ＩＬ２を含まない１６４０の完全培地を培地として、５：１のＥ：Ｔ比で２４時間共培養した。操作は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出法（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って行った。細胞殺傷率は以下のように計算した。細胞殺傷率（％）＝［（Ａ実験細胞－Ａエフェクター細胞自発的放出ウェル－Ａ標的細胞自発的ウェル）／（Ａ標的細胞自発的最大放出ウェル－Ａ標的細胞自発的ウェル）］×１００％。また、２４時間共培養した後の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って操作し、上清中のＩＦＮ－γレベルを検出した。結果（図５６及び５７）から、コントロール群と比較して、ＴＣＲのＣ末端に共刺激分子のエンドドメインが付加されたγδＴ細胞の方が、より強い腫瘍クリアランス能を有しており、ＴＣＲγ鎖及びδ鎖の両方のＣ末端にＯＸ４０を導入する設計は、ＴＣＲγ鎖及びδ鎖の一方のみのＣ末端にＯＸ４０を導入する設計よりも有意に優れていた。そのような導入のない対照群と比較して、細胞内アミノ酸の欠失を伴うＴＣＲ定常領域のＣ末端と共刺激分子との間にＧ４Ｓを導入することによる設計は、γδＴＣＲ Ｔ細胞の殺傷能力を増加させた。

【0255】

実施例３ ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端改変によるＳＴＡＲへの効果
１．ＳＴＡＲ受容体定常領域ドメインの設計
この実施例では、ｈＳＴＡＲは、ヒトＴＣＲ定常領域を含むＳＴＡＲを指した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲは、実施例１に示すシステイン置換及び膜貫通ドメイン改変を有する定常領域を含むＳＴＡＲを指し、マウスＴＣＲα鎖定常領域はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲα（配列番号４１）であり、マウスＴＣＲβ鎖定常領域はｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂ（配列番号６）であり、具体的な構造は図５８に示す。

【0256】

ＳＴＡＲ分子の設計を更に最適化するために、α鎖定常領域における定常領域マウス化、システイン部位変異及び疎水性アミノ酸変異に基づいて、より良好な結果を得るために、ＳＴＡＲ分子の定常領域のＮ末端を特異的に再配置した。再配置は、いくつかの配列が欠失され、一方、いくつかの配列のヒト化変異が行われたことを意味する。ヒト化突然変異の重要性は、ＳＴＡＲ分子の機能を保証しながら、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞が臨床応用における受容体によって拒絶される可能性を最大限回避するために、ＳＴＡＲ分子中の非ヒト配列を可能な限り減少させることにあった。

【0257】

ＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端における１８アミノ酸再編成（マウス配列はＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱであった）のスケジュールをアミノ酸特性に基づいて分析したところ、マウス及びヒト化配列におけるＥ６Ｄ、Ｋ１３Ｒ、Ｒ１６Ｋ及びＱ１８Ｓは相同アミノ酸置換に属し、一方、Ｐ１５Ｓ置換は非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換に属していたことが見出されたため、この部位付近のタンパク質は本質的に保存的ではなく、タンパク質機能に影響を及ぼすことなく改変することができると考えることができた。要約すると、１～１４位のアミノ酸配列を保持し、ヒト化し、１５～１８位のアミノ酸を欠失させた。

【0258】

ＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端における２５アミノ酸再編成（マウス配列はＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫであった）のスケジュールをアミノ酸特性に基づいて分析したところ、マウス及びヒト化配列中のＲ３Ｋ及びＬ１２Ｖのみが相同なアミノ酸置換であり、Ｔ６Ｆ、Ｋ９Ｅ、Ｓ１１Ａ、Ｋ１７Ｅ、Ａ２１Ｓ、Ｎ２２Ｈ及びＫ２３Ｔは不均一なアミノ酸置換であることが見出されたため、これらの部位付近のタンパク質は本質的に保存的ではなく、タンパク質の機能に影響を及ぼすことなく改変することができると考えることができた。要約すると、１～１６位のアミノ酸配列を保持し、ヒト化し、１７及び２１～２５位のアミノ酸を欠失させた。

【0259】

図５８に具体的な構造を示すと、Ｎ末端配置後、得られたＴＣＲα鎖定常領域はＮｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲａ（配列番号４２）であり、得られたＴＣＲβ鎖定常領域はＮｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂ（配列番号４３）であった。

【0260】

２．ＳＴＡＲ共刺激因子の設計
１）ＳＴＡＲの異なる最適化手法の組合わせ
異なるＳＴＡＲ機能に対する共刺激因子の効果を検証するために、元の最適化されていないＳＴＡＲ構造（ヒトＴＣＲα／β ＳＴＡＲ、ｈＳＴＡＲ）、Ｃ領域マウス化、シスチン改変及び膜貫通改変を伴うｈＳＴＡＲに基づくｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、並びにＮ末端改変を伴うｈｍｃｔ ＳＴＡＲに基づくＮｒｅｃ ＳＴＡＲを選択した。

【0261】

２）共刺激因子を含むＳＴＡＲ構造の設計
本発明によれば、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の毒性及びＴ細胞増殖持続性を増強するために、ＳＴＡＲ定常領域のＣ末端にヒト化共刺激受容体のエンドドメイン配列を導入して（図５９）、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞機能に対する効果を研究した。本発明のＳＴＡＲ定常領域構造として、元の非最適化ＳＴＡＲ構造（ヒトＴＣＲα／βＳＴＡＲ、ｈＳＴＡＲ）、ｈＳＴＡＲをベースに改変したｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、及びＮ末端を改変したｈｍｃｔ ＳＴＡＲをベースとしたＮｒｅｃ ＳＴＡＲの上記３つの構造を選択した。共刺激シグナル伝達構造は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいた。本発明では、改変は、ＴＣＲα鎖、β鎖、並びにα鎖及びβ鎖で起こり得る。本発明では、共刺激分子改変は、図６０に示すように、ＴＣＲα鎖及びβ鎖で生じた。

【0262】

３．ＧＰＣ３９を標的とするＧＣ３３－ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
公開されたｓｃＦｖ配列ＦＭＣ６３を、ＧＰＣ３標的化抗体重鎖可変領域（抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ＶＨ、配列番号５３）及び抗体軽鎖可変領域（（抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３－ＶＬ、配列番号５２）として選択した。

【0263】

２）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むベクターの構築
ＳＴＡＲは、２つのポリペプチド鎖：抗ＧＰＣ３ ＦＭＣ６３－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ｂＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第１のポリペプチド鎖、及び抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ａＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第２のポリペプチド鎖を含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドを両方の鎖に使用した。ｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２つの鎖配列は、Ｆｕｒｉｎ－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片によって連結され、一緒にタンパク質に転写及び翻訳され、次いで、Ｆｕｒｉｎ及びｐ２Ａに対応するプロテアーゼによって切断され、最終的に２つの独立したタンパク質鎖を産生した。遺伝子全体を、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介してレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ １ αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子と共に有していた。以下のプラスミドを遺伝子断片：ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのクローニング、アセンブリング、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって得た。

【0264】

共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：３つのＧＰＣ３標的化ＳＴＡＲベクター：ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲに基づき、共刺激因子ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＣＤ２７を含むＳＴＡＲベクターを構築し、上記の配列を遺伝子合成によって得た。共刺激因子を、ＰＣＲによってＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに加え、同時にＴＣＲα鎖及びβ鎖に同じ共刺激因子を付加することによる相同組換えを付加した。ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を最終的に構築した。

【0265】

３）共刺激因子を含むＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ－Ｔの殺傷能力の検出
非感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、並びにＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を発現するＴ細胞を、２４ウェルプレート中で２４時間、ＨＵＨ－７－ｌｕｃ細胞と共培養した。Ｔ細胞の陽性数をＲＦＰ陽性率に従ってそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数は４Ｅ５であり、合計１ｍＬの共培養系であった。２４時間共培養した後、細胞を１５００ｒｐｍ及び室温で５分間遠心分離し、上清を穏やかに廃棄した後、４００マイクロリットルのタンパク質溶解物を室温で添加して１０分間振盪下で溶解し、次いでＥＰチューブに移し、４℃で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ウェル当たり２０マイクロリットルで２つの複数のウェルを各試料について採取し、白色９６ウェルプレートに添加し、５０μＬのルシフェラーゼ基質を添加して多機能マイクロプレートリーダーによって蛍光値を検出し、各群の標的細胞の殺傷を計算した。結果は、ｈＳＴＡＲの殺傷効率がｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲの殺傷効率よりも有意に低いことを示し、そのうち、Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲが最も高かった。共刺激因子を含む同じＳＴＡＲの結果は、ＯＸ４０及びＩＣＯＳがＳＴＡＲの殺傷効果を有意に増加させ得ることを示したが、他の共刺激因子はＳＴＡＲの殺傷能力に有意な効果を有さず、４１ＢＢはＳＴＡＲの殺傷機能を低下させたが、有意差はなかった（図６１）。

【0266】

図４．共刺激因子を含むＧＰＣ３標的化ＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ－Ｔの核ＲｅｌＢレベルの検出
得られた以下のウイルス：ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７をＪｕｒｋａｔ細胞でＭＯＩ＝１の力価で感染させ、感染の４日後、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞が４Ｅ６であり、標的細胞が２Ｅ５である１２ウェルプレート中でＴ細胞株をＨＵＨ－７－ｌｕｃ細胞株と共培養し（標的細胞を１日前に１２ウェルプレートに接種した）、６時間共培養した後、核タンパク質の抽出のために細胞を回収し、核ＲｅｌＢレベルについてウェスタンブロット法によって検出した。結果は、図６２に示すように、共刺激因子を添加した後、共刺激因子を含まないＧＣ３３－ｈＳＴＡＲ、ＧＣ３３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＧＣ３３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ群では核ＲｅｌＢレベルが非常に低いことを示し、これは非感染ＳＴＡＲ－Ｔ群と一致し、ＣＤ２８を除く他の共刺激因子は核ＲｅｌＢレベルを有意に増加させ、そのうち４１ＢＢは核ＲｅｌＢレベルを最も改善した。

【0267】

４．ＣＤ１９標的化ＦＭＣ６３－ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
公開されたｓｃＦｖ配列ＦＭＣ６３を、ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＨ、配列番号５０）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬ、配列番号５１）として選択した。

【0268】

２）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むベクターの構築
ＳＴＡＲは、２つのポリペプチド鎖：抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ｂＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第１のポリペプチド鎖、及び抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ａＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第２のポリペプチド鎖を含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両方の鎖に使用した。ｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２つの鎖配列は、Ｆｕｒｉｎ－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片によって連結され、一緒にタンパク質に転写及び翻訳され、次いで、Ｆｕｒｉｎ及びｐ２Ａに対応するプロテアーゼによって切断され、最終的に２つの独立したタンパク質鎖を産生した。遺伝子全体を、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介してレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ １ αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子と共に有していた。以下のプラスミドを遺伝子断片：ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのクローニング、アセンブリング、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって得た。

【0269】

共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：３つのＣＤ１９標的化ＳＴＡＲベクター、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲに基づいて、共刺激因子ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＣＤ２７を構築し、遺伝子合成によって上記の配列を得た。共刺激因子を、ＰＣＲ及びＴＣＲα鎖及びβ鎖に同時に同じ共刺激因子を付加することによる相同組換えによって、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに付加した。ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を最終的に構築した。

【0270】

３）共刺激因子を含むＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ－Ｔの殺傷能力の検出
非感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７を、２４ウェルプレート中で２４時間、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と共培養した。Ｔ細胞の陽性細胞数をＲＦＰ陽性率に従ってそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数は４Ｅ５であり、合計１ｍＬの共培養系であった。２４時間の共培養の後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質を加え、暗所で１０分間低速振盪した後、多機能マイクロプレートリーダーによって蛍光値を検出し、各群の標的細胞殺傷効果を計算した。結果は、ｈＳＴＡＲの殺傷効率がｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＮｒｅｃ ＳＴＡＲの殺傷効率よりも有意に低いことを示し、そのうち、Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲが最も高かった。共刺激因子を含む同じＳＴＡＲの結果は、ＯＸ４０及びＩＣＯＳがＳＴＡＲの殺傷効果を有意に増加させ得ることを示したが、他の共刺激因子はＳＴＡＲの殺傷能力に有意な効果を有さず、４１ＢＢはＳＴＡＲの殺傷機能を低下させたが、有意差はなかった（図６１）。

【0271】

４）共刺激因子を含むＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ－Ｔの核ＲｅｌＢレベルの検出
得られたウイルス：ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＩＣＯＳ、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２８、ＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－４１ＢＢ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＣＤ２７をＭＯＩ＝１の力価でＪｕｒｋａｔ細胞で感染させ、感染４日後に、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞が４Ｅ６であり、標的細胞が２Ｅ５である１２ウェルプレート（２μｇ／ｍＬ、５００μＬを１２ウェルプレートにコーティングし、４℃の冷蔵庫に一晩放置した）中で、Ｔ細胞株及びＣＤ１９タンパク質を共培養し（標的細胞を１日前に１２ウェルプレートに接種した）、６時間培養した後、核タンパク質の抽出のために細胞を回収し、これを核ＲｅｌＢレベルについてウェスタンブロッティングにより検出した。結果は、図６２に示すように、共刺激因子を添加した後、共刺激因子を含まないＦＭＣ６３－ｈＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ群では核ＲｅｌＢレベルが非常に低いことを示し、これは非感染ＳＴＡＲ－Ｔ群と一致し、ＣＤ２８を除く他の共刺激因子は核ＲｅｌＢレベルを有意に増加させ、そのうち４１ＢＢは核ＲｅｌＢレベルを最も改善した。

【0272】

５．ＣＤ１９標的化３３４－ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９標的化抗体配列の決定
本発明者らによって開発された３３４抗体配列を、ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＨ、配列番号５４）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＬ、配列番号５５）として選択した。

【0273】

２）ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及び共刺激因子を含むベクターの構築
ＳＴＡＲは、２つのポリペプチド鎖：抗ＣＤ１９ ３３４－ＶＬをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ｂＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第１のポリペプチド鎖、及び抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨをｈＳＴＡＲ／ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ａＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第２のポリペプチド鎖を含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両方の鎖に使用した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２つの鎖配列は、Ｆｕｒｉｎ－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片によって連結され、一緒にタンパク質に転写及び翻訳され、次いで、Ｆｕｒｉｎ及びｐ２Ａに対応するプロテアーゼによって切断され、最終的に２つの独立したタンパク質鎖を産生した。遺伝子全体を、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介してレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ １ αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子と共に有していた。以下のプラスミドを遺伝子断片：３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのクローニング、アセンブリング、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって得た。

【0274】

共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：ＣＤ１９標的化ＳＴＡＲベクター、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲに基づいて、共刺激因子ＯＸ４０を構築し、上記の配列を遺伝子合成によって得た。共刺激因子を、ＰＣＲ及びＴＣＲα鎖及びβ鎖に同時に同じ共刺激因子を付加することによる相同組換えによって、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに付加した。最後に、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を構築した。

【0275】

３）共刺激因子を含むＣＤ１９標的化ＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ－Ｔの殺傷能力の検出
非感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、３３４－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及び３３４－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を、２４ウェルプレートにおいてＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。Ｔ細胞の陽性細胞数をＲＦＰ陽性率に従ってそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数は４Ｅ５であり、合計１ｍＬの共培養系であった。２４時間の共培養の後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質を加え、暗所で１０分間低速振盪した後、多機能マイクロプレートリーダーによって蛍光値を検出し、各群の標的細胞殺傷効果を計算した。結果は、ｈｍｃｔ ＳＴＡＲの殺傷効率が、最も高かったＮｒｅｃ ＳＴＡＲの殺傷効率よりも有意に低いことを示した。更に、ＯＸ４０は、ＳＴＡＲの殺傷効果及び核ＲｅｌＢレベルを有意に増加させることができる。図６３を参照されたい。

【0276】

６．ＣＤ１９及びＣＤ２０の二重標的化ＳＴＡＲ－Ｔ機能
１）ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化抗体配列の決定
ＣＤ１９標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＨ、配列番号５０）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３－ＶＬ、配列番号５１）；ＣＤ２０標的化抗体重鎖可変領域（抗ＣＤ２０ ２Ｃ６－ＶＨ、配列番号６２）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＣＤ２０ ２Ｃ６－ＶＬ、配列番号６３）。

【0277】

２）共刺激因子を含む、ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲ及びベクターの構築
ＳＴＡＲは、２つのポリペプチド鎖：抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨをｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ｂＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第１のポリペプチド鎖、及びｎｔｉ－ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨをｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのＴＣＲ ａＣ鎖と融合することによってそれぞれ形成された第２のポリペプチド鎖を含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドを両方の鎖に使用した。ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ／Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲの２つの鎖配列は、Ｆｕｒｉｎ－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位のポリペプチド断片によって連結され、一緒にタンパク質に転写及び翻訳され、次いで、Ｆｕｒｉｎ及びｐ２Ａに対応するプロテアーゼによって切断され、最終的に２つの独立したタンパク質鎖を産生した。遺伝子全体を、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを介してレンチウイルス発現ベクターｐＨＡＧＥに挿入した。ベクターは、アンピシン耐性遺伝子、ＥＦ １ αプロモーター及びＩＲＥＳ－ＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子と共に有していた。以下のプラスミドを遺伝子断片：ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲのクローニング、アセンブリング、形質転換、配列決定及びプラスミド抽出によって得た。

【0278】

共刺激因子を含むＳＴＡＲベクターの構築：ＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲベクター、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲに基づいて、共刺激因子ＯＸ４０を構築し、上記の配列を遺伝子合成によって得た。共刺激因子を、ＰＣＲ及びＴＣＲα鎖及びβ鎖に同時に同じ共刺激因子を付加することによる相同組換えによって、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲベクターに付加した。最後に、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を構築した。

【0279】

３）共刺激因子を含むＣＤ１９及びＣＤ２０標的化ＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ－Ｔの殺傷能力の検出
非感染Ｔ細胞（ＮＣ群）、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ、ＦＭＣ６３－２Ｃ６－ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０及びＦＭＣ６３－２Ｃ６－Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０を、２４ウェルプレートにおいてＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養した。Ｔ細胞の陽性数をＲＦＰ陽性率に従ってそれぞれ４Ｅ５に調整し、ＲＡＪＩ－ｌｕｃ細胞の数は４Ｅ５であり、合計１ｍＬの共培養系であった。２４時間の共培養の後、共培養した細胞を均一に混合し、１５０μＬの懸濁液を吸い出し、７０μＬのルシフェラーゼ基質を加え、暗所で１０分間低速振盪した後、多機能マイクロプレートリーダーによって蛍光値を検出し、各群の標的細胞殺傷効果を計算した。結果は、ｈｍｃｔ ＳＴＡＲの殺傷効率が、最も高かったＮｒｅｃ ＳＴＡＲの殺傷効率よりも有意に低いことを示した。更に、ＯＸ４０は、ＳＴＡＲの殺傷効果及び核ＲｅｌＢレベルを有意に増加させることができる。図６４を参照されたい。

【0280】

配列表
配列番号１ 野生型ヒトＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列
ＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦ ＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳ ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ＊
配列番号２ 野生型ヒトＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列
ＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴ ＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫ ＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫ ＲＫＤＦ＊
配列番号３ 野生型マウスＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列
ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＴＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
配列番号４ 野生型マウスＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列
ＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ
配列番号５ システイン置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲ ＬＷＳＳ
配列番号６ システイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－Ｃｙｓ）
ＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ
配列番号７ 疎水性アミノ酸置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９）
ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＴＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＬＶＩＶＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬ ＷＳＳ
配列番号８ 膜貫通ドメインにシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ａｒｇ ｍｕｔ）
ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＬＶＩＶＬＲＩＬＬＬＲＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
配列番号９ エンドドメインにシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－Ａｒｇ ｍｕｔ）
ＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＲＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＲＲＲＮＳ
配列番号１０ ＣＤ４０エンドドメインのアミノ酸配列
ＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶ
配列番号１１ ＯＸ４０エンドドメインのアミノ酸配列
ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
配列番号１２ ＩＣＯＳエンドドメインのアミノ酸配列
ＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬ
配列番号１３ ＣＤ２８エンドドメインのアミノ酸配列
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
配列番号１４ ４－１ＢＢエンドドメインのアミノ酸配列
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
配列番号１５ ＣＤ２７エンドドメインのアミノ酸配列
ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ
配列番号１６ Ｇ４Ｓリンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳ
配列番号１７ （Ｇ４Ｓ）２リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１８ （Ｇ４Ｓ）３リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１９ （Ｇ４Ｓ）４リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２０ （Ｇ４Ｓ）５リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２１ （Ｇ４Ｓ）６リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２２ （Ｇ４Ｓ）７リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２３ （Ｇ４Ｓ）８リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２４ （Ｇ４Ｓ）９リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２５ （Ｇ４Ｓ）１０リンカーのアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２６ システイン置換及び疎水性改変を有するエンドドメイン欠失マウスＴ細胞受容体α鎖定常領域（マウスＴＣＲαＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ）
ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＬＶＩＶＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ
配列番号２７ システイン置換されたエンドドメイン欠失マウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲβＣ－ｄｅｌ ｍｕｔ）
ＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭ
配列番号２８ ヒトＣＤ３γのアミノ酸配列
ＭＥＱＧＫＧＬＡＶＬＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＣＱＮＣＩＥＬＮＡＡＴＩＳＧＦＬＦＡＥＩＶＳＩＦＶＬＡＶＧＶＹＦＩＡＧＱＤＧＶＲＱＳＲＡＳＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬＱＧＮＱＬＲＲＮ
配列番号２９ ヒトＣＤ３δのアミノ酸配列
ＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＣＱＳＣＶＥＬＤＰＡＴＶＡＧＩＩＶＴＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴＧＲＬＳＧＡＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬＧＧＮＷＡＲＮＫ
配列番号３０ ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ
配列番号３１ ヒトＣＤ３ζのアミノ酸配列
ＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号３２ ヒトＩＬ－２β受容体エンドドメインのアミノ酸配列
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ
配列番号３３ ヒトＩＬ－７α受容体エンドドメインのアミノ酸配列
ＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＬＥＥＳＥＫＱＲＬＧＧＤＶＱＳＰＮＣＰＳＥＤＶＶＩＴＰＥＳＦＧＲＤＳＳＬＴＣＬＡＧＮＶＳＡＣＤＡＰＩＬＳＳＳＲＳＬＤＣＲＥＳＧＫＮＧＰＨＶＹＱＤＬＬＬＳＬＧＴＴＮＳＴＬＰＰＰＦＳＬＱＳＧＩＬＴＬＮＰＶＡＱＧＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱ
配列番号３４ ヒトＩＬ－２１受容体エンドドメインのアミノ酸配列
ＳＬＫＴＨＰＬＷＲＬＷＫＫＩＷＡＶＰＳＰＥＲＦＦＭＰＬＹＫＧＣＳＧＤＦＫＫＷＶＧＡＰＦＴＧＳＳＬＥＬＧＰＷＳＰＥＶＰＳＴＬＥＶＹＳＣＨＰＰＲＳＰＡＫＲＬＱＬＴＥＬＱＥＰＡＥＬＶＥＳＤＧＶＰＫＰＳＦＷＰＴＡＱＮＳＧＧＳＡＹＳＥＥＲＤＲＰＹＧＬＶＳＩＤＴＶＴＶＬＤＡＥＧＰＣＴＷＰＣＳＣＥＤＤＧＹＰＡＬＤＬＤＡＧＬＥＰＳＰＧＬＥＤＰＬＬＤＡＧＴＴＶＬＳＣＧＣＶＳＡＧＳＰＧＬＧＧＰＬＧＳＬＬＤＲＬＫＰＰＬＡＤＧＥＤＷＡＧＧＬＰＷＧＧＲＳＰＧＧＶＳＥＳＥＡＧＳＰＬＡＧＬＤＭＤＴＦＤＳＧＦＶＧＳＤＣＳＳＰＶＥＣＤＦＴＳＰＧＤＥＧＰＰＲＳＹＬＲＱＷＶＶＩＰＰＰＬＳＳＰＧＰＱＡＳ
配列番号３５ ヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
ＹＲＨＱ
配列番号３６ ヒトＩＬ－２β受容体エンドドメイン及びヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶＧＧＧＧＳＹＲＨＱ
配列番号３７ ヒトＩＬ－７α受容体エンドドメイン及びヒトＳＴＡＴ５活性化部分のアミノ酸配列
ＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＬＥＥＳＥＫＱＲＬＧＧＤＶＱＳＰＮＣＰＳＥＤＶＶＩＴＰＥＳＦＧＲＤＳＳＬＴＣＬＡＧＮＶＳＡＣＤＡＰＩＬＳＳＳＲＳＬＤＣＲＥＳＧＫＮＧＰＨＶＹＱＤＬＬＬＳＬＧＴＴＮＳＴＬＰＰＰＦＳＬＱＳＧＩＬＴＬＮＰＶＡＱＧＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱＧＧＧＧＳＹＲＨＱ
配列番号３８ 抗ＣＤ２０ ＯＦＡ ＳｃＦｖのアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＤＩＱＹＧＮＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３９ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＳｃＦｖのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号４０ 赤色蛍光タンパク質のアミノ酸配列
ＭＡＳＳＥＤＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＲＭＥＧＳＶＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＡＷＤＩＬＳＰＱＦＱＹＧＳＫＡＹＶＫＨＰＡＤＩＰＤＹＬＫＬＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＶＶＴＶＴＱＤＳＳＬＱＤＧＥＦＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＳＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＭＹＰＥＤＧＡＬＫＧＥＩＫＭＲＬＫＬＫＤＧＧＨＹＤＡＥＶＫＴＴＹＭＡＫＫＰＶＱＬＰＧＡＹＫＴＤＩＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＩＶＥＱＹＥＲＡＥＧＲＨＳＴＧＡ＊
配列番号４１ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（ｈｍｃｔ ＳＴＡＲ ＴＣＲａＣ）
ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＬＶＩＶＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
配列番号４２ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ（Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲａＣ）
ＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＬＶＩＶＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
配列番号４３ Ｎ末端改変及びシステイン置換を有するマウスＴ細胞受容体β鎖定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ，Ｎｒｅｃ ＳＴＡＲ ＴＣＲｂＣ）
ＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＡＥＩＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ
＞配列番号４４ ＴＣＲ－Ｅ１４１α可変領域のアミノ酸配列
ＭＫＲＩＬＧＡＬＬＧＬＬＳＡＱＶＣＣＶＲＧＩＱＶＥＱＳＰＰＤＬＩＬＱＥＧＡＮＳＴＬＲＣＮＦＳＤＳＶＮＮＬＱＷＦＨＱＮＰＷＧＱＬＩＮＬＦＹＩＰＳＧＴＫＱＮＧＲＬＳＡＴＴＶＡＴＥＲＹＳＬＬＹＩＳＳＳＱＴＴＤＳＧＶＹＦＣＡＶＬＮＮＮＤＭＲＦＧＡＧＴＲＬＴＶＫＰ
＞配列番号４５ ＣＲ－Ｅ１４１β可変領域のアミノ酸配列
ＭＧＣＲＬＬＣＣＡＶＬＣＬＬＧＡＶＰＩＤＴＥＶＴＱＴＰＫＨＬＶＭＧＭＴＮＫＫＳＬＫＣＥＱＨＭＧＨＲＡＭＹＷＹＫＱＫＡＫＫＰＰＥＬＭＦＶＹＳＹＥＫＬＳＩＮＥＳＶＰＳＲＦＳＰＥＣＰＮＳＳＬＬＮＬＨＬＨＡＬＱＰＥＤＳＡＬＹＬＣＡＳＳＱＧＲＷＹＥＱＹＦＧＰＧＴＲＬＴＶＴ
＞配列番号４６ ＴＣＲ－Ｅ３１５α可変領域のアミノ酸配列
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＱＳＳＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＧＫＴＳＹＤＫＶＩＦＧＰＧＴＳＬＳＶＩＰ
＞配列番号４７ ＴＣＲ－Ｅ３１５β可変領域のアミノ酸配列
ＭＧＴＲＬＬＣＷＡＡＬＣＬＬＧＡＥＬＴＥＡＧＶＡＱＳＰＲＹＫＩＩＥＫＲＱＳＶＡＦＷＣＮＰＩＳＧＨＡＴＬＹＷＹＱＱＩＬＧＱＧＰＫＬＬＩＱＦＱＮＮＧＶＶＤＤＳＱＬＰＫＤＲＦＳＡＥＲＬＫＧＶＤＳＴＬＫＩＱＰＡＫＬＥＤＳＡＶＹＬＣＡＳＳＶＦＰＴＳＶＥＱＹＦＧＰＧＴＲＬＴＶＴ
＞配列番号４８ ＴＣＲ－Ｅ３１６α可変領域のアミノ酸配列
ＭＳＬＳＳＬＬＫＶＶＴＡＳＬＷＬＧＰＧＩＡＱＫＩＴＱＴＱＰＧＭＦＶＱＥＫＥＡＶＴＬＤＣＴＹＤＴＳＤＱＳＹＧＬＦＷＹＫＱＰＳＳＧＥＭＩＦＬＩＹＱＧＳＹＤＥＱＮＡＴＥＧＲＹＳＬＮＦＱＫＡＲＫＳＡＮＬＶＩＳＡＳＱＬＧＤＳＡＭＹＦＣＡＭＶＳＧＡＧＧＧＡＤＧＬＴＦＧＫＧＴＨＬＩＩＱＰ
＞配列番号４９ ＴＣＲ－Ｅ３１６β可変領域のアミノ酸配列
ＭＳＮＱＶＬＣＣＶＶＬＣＬＬＧＡＮＴＶＤＧＧＩＴＱＳＰＫＹＬＦＲＫＥＧＱＮＶＴＬＳＣＥＱＮＬＮＨＤＡＭＹＷＹＲＱＤＰＧＱＧＬＲＬＩＹＹＳＱＩＶＮＤＦＱＫＧＤＩＡＥＧＹＳＶＳＲＥＫＫＥＳＦＰＬＴＶＴＳＡＱＫＮＰＴＡＦＹＬＣＡＳＳＩＧＶＧＬＳＮＴＥＡＦＦＧＱＧＴＲＬＴＶＶ
配列番号５０ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨ
ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号５１ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ
配列番号５２ 抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＲＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ
配列番号５３ 抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＬＤＰＫＴＧＤＴＡＹＳＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＦＹＳＹＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５４ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＬＧＦＩＦＴＤＹＥＩＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧＡＦＨＰＧＳＧＧＳＡＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＦＥＤＳＡＶＹＨＣＴＲＱＬＧＰＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
配列番号５５ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＥＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５６ Ｎ末端改変、システイン置換及び膜貫通ドメインに疎水性改変を有するエンドドメイン欠失マウスＴ細胞受容体α鎖定常領域
ＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＬＶＩＶＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ
配列番号５７ Ｎ末端改変及びシステイン置換を有するエンドドメイン欠失マウスＴ細胞受容体β鎖定常領域
ＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＡＥＩＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭ
配列番号５８ ＴＣＲγ鎖定常領域の野生型ヒトのアミノ酸配列
ＤＫＱＬＤＡＤＶＳＰＫＰＴＩＦＬＰＳＩＡＥＴＫＬＱＫＡＧＴＹＬＣＬＬＥＫＦＦＰＤＶＩＫＩＨＷＱＥＫＫＳＮＴＩＬＧＳＱＥＧＮＴＭＫＴＮＤＴＹＭＫＦＳＷＬＴＶＰＥＫＳＬＤＫＥＨＲＣＩＶＲＨＥＮＮＫＮＧＶＤＱＥＩＩＦＰＰＩＫＴＤＶＩＴＭＤＰＫＤＮＣＳＫＤＡＮＤＴＬＬＬＱＬＴＮＴＳＡＹＹＭＹＬＬＬＬＬＫＳＶＶＹＦＡＩＩＴＣＣＬＬＲＲＴＡＦＣＣＮＧＥＫＳ
配列番号５９ 野生型マウスＴＣＲγ鎖定常領域のアミノ酸配列
ＸＫＲＬＤＡＤＩＳＰＫＰＴＩＦＬＰＳＶＡＥＴＮＬＨＫＴＧＴＹＬＣＬＬＥＫＦＦＰＤＶＩＲＶＹＷＫＥＫＤＧＮＴＩＬＤＳＱＥＧＤＴＬＫＴＮＤＴＹＭＫＦＳＷＬＴＶＰＥＲＡＭＧＫＥＨＲＣＩＶＫＨＥＮＮＫＧＧＡＤＱＥＩＦＦＰＳＩＫＫＶＡＶＳＴＫＰＴＴＣＷＱＤＫＮＤＶＬＱＬＱＦＴＩＴＳＡＹＹＴＹＬＬＬＬＬＫＳＶＩＹＬＡＩＩＳＦＳＬＬＲＲＴＳＶＣＧＮＥＫＫＳ
配列番号６０ ＴＣＲδ鎖定常領域の野生型ヒトのアミノ酸配列
ＸＳＱＰＨＴＫＰＳＶＦＶＭＫＮＧＴＮＶＡＣＬＶＫＥＦＹＰＫＤＩＲＩＮＬＶＳＳＫＫＩＴＥＦＤＰＡＩＶＩＳＰＳＧＫＹＮＡＶＫＬＧＫＹＥＤＳＮＳＶＴＣＳＶＱＨＤＮＫＴＶＨＳＴＤＦＥＶＫＴＤＳＴＤＨＶＫＰＫＥＴＥＮＴＫＱＰＳＫＳＣＨＫＰＫＡＩＶＨＴＥＫＶＮＭＭＳＬＴＶＬＧＬＲＭＬＦＡＫＴＶＡＶＮＦＬＬＴＡＫＬＦＦＬ＊
配列番号６１ 野生型マウスＴＣＲδ鎖定常領域のアミノ酸配列
ＸＳＱＰＰＡＫＰＳＶＦＩＭＫＮＧＴＮＶＡＣＬＶＫＤＦＹＰＫＥＶＴＩＳＬＲＳＳＫＫＩＶＥＦＤＰＡＩＶＩＳＰＳＧＫＹＳＡＶＫＬＧＱＹＧＤＳＮＳＶＴＣＳＶＱＨＮＳＥＴＶＨＳＴＤＦＥＰＹＡＮＳＦＮＮＥＫＬＰＥＰＥＮＤＴＱＩＳＥＰＣＹＧＰＲＶＴＶＨＴＥＫＶＮＭＭＳＬＴＶＬＧＬＲＬＬＦＡＫＴＩＡＩＮＦＬＬＴＶＫＬＦＦ＊
配列番号６２ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＨ
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＴＫＤＮＱＹＧＳＧＳＴＹＧＬＧＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６３ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧ ＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

【図1】

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【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【配列表】

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