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特許7646137精神神経疾患を予防または改善するための鰹由来抽出物を含む機能性食品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-07
(45)【発行日】2025-03-17
(54)【発明の名称】精神神経疾患を予防または改善するための鰹由来抽出物を含む機能性食品
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20250310BHJP
A23L 33/175 20160101ALI20250310BHJP
A23L 33/13 20160101ALI20250310BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A23L33/175
A23L33/13
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2023572498
(86)(22)【出願日】2023-01-10
(86)【国際出願番号】 JP2023000272
(87)【国際公開番号】W WO2023132372
(87)【国際公開日】2023-07-13
【審査請求日】2024-06-17
(31)【優先権主張番号】63/266,531
(32)【優先日】2022-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】591040513
【氏名又は名称】株式会社マルハチ村松
(73)【特許権者】
【識別番号】500557048
【氏名又は名称】学校法人日本医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】保苅 義則
(72)【発明者】
【氏名】関根 亜矢
(72)【発明者】
【氏名】柿沼 由彦
【審査官】田畑 利幸
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第１９９４／０００１３２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００４－５２５１３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－０８０１３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－１１８９１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０６８８０５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒスチジンおよびイノシン酸を有効成分として有することを特徴とする血液脳関門バリア性を改善する機能性食品。
【請求項2】
請求項１記載の機能性食品において、ヒスチジン濃度は０．８３６ｍｇ／ｍＬ、イノシン酸濃度は０．０５３７ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする機能性食品。
【請求項3】
請求項１記載の機能性食品において、前記ヒスチジンおよびイノシン酸は、鰹由来抽出物であることを特徴とする機能性食品。
【請求項4】
請求項３記載の機能性食品において、前記鰹由来抽出物の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、精神神経疾患を予防または改善するための鰹由来抽出物を含む機能性食品に関するものである。
【背景技術】
【0002】
高齢者人口の増加に伴い、アルツハイマー型認知症やパーキンソン病、統合失調症といった精神神経疾患に罹患する患者は増加傾向にあるものの、いずれも根治療法は未だ確立されておらず、予防または発症遅延のための方法を見出だすことが重要な課題となっている。
【0003】
このような社会的背景を踏まえ、近年、食品成分が脳機能に影響を及ぼすことが徐々に明らかとなり、機能性食品の日常的な摂取による予防効果について関心が高まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１７－００８１０４
【文献】特開２０１５－０９３８４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、精神神経疾患を合理的に予防または改善する用途を有する機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、精神神経疾患の予防もしくは改善する機能性食品について以下のような知見を得、鋭意実験等を行い、本発明を完成するに至ったものである。
【0007】
すなわち、近年、アルツハイマー型認知症やパーキンソン病、統合失調症といった精神神経疾患において、血液脳関門（ＢＢＢ）の機能異常が関わっていることが報告されている。血液脳関門は、血液を介して脳実質に流入してくる物質から脳を隔離して脳内外の物質循環を制御して脳内環境を一定に保つ重要な役割を担っているが、その機能が破綻すると、脳にとって有害な物質等と神経細胞との直接的接触が起き、脳内炎症をともなう神経細胞死や神経活動低下を引き起こすといわれている。
【0008】
ここで、本発明者らは、心臓の心筋細胞自らがアセチルコリン（ＡＣｈ）を産生するシステム（ＮＮＣＣＳ）を有することを見出したものである。そして、心筋細胞に備わるＮＮＣＣＳの生理学的機能は、循環器系に加え、迷走神経を介し中枢神経系機能を修飾することが明らかとなり、一例として血液脳関門（ＢＢＢ）維持にこのＮＮＣＣＳが関与し、本システムによる臓器間クロストークの担い手となるという新規機能に関する知見を得たものである。ＢＢＢ機能を、神経を介して間接的に亢進させるシステムの報告はこれまでにはなく特異的な様式であり、非常に新規性が高いと考えられる。また本システムの活性化は循環器機能の亢進と疾患予防へつながる可能性も示唆され、現在ＮＮＣＣＳ機能亢進候補物質の一種が確認されている。
【0009】
本発明者らは鰹由来抽出物に着目し、この鰹由来抽出物の新たな健康機能として、抗炎症作用、血液脳関門バリア性の改善、非神経性非中枢性心臓アセチルコリン産生系の活性化を見いだし、上記知見の観点から、その機能性食品としての有効性について鋭意実験等を行い、本発明を完成するに至ったものである。
【0010】
すなわち、本願発明によれば、以下が提供される。
【0011】
（１） 鰹由来抽出物を含むことを特徴とする、精神神経疾患予防または改善用の機能性食品。
【0012】
（２） 上記（１）記載の食品において、前記精神神経疾患は、脳内炎症を要因とするものであることを特徴とする、機能性食品。
【0013】
（３） 上記（２）記載の食品であって、抗炎症作用を有する、機能性食品。
【0014】
（４） 上記（３）記載の食品であって、前記抗炎症作用は、脳内における炎症性サイトカイン産生抑制および／またはミクログリア活性化抑制である、機能性食品。
【0015】
（５） 上記（３）記載の食品において、前記鰹由来抽出物は、前記鰹由来抽出物が有する量のＤＨＡ、ＥＰＡ、並びに、ＤＨＡおよびＥＰＡの同等濃度組成物と比較して、炎症性サイトカインの産生を減少させるものである、機能性食品。
【0016】
（６） 上記（３）記載の食品において、前記鰹由来抽出物は、前記鰹由来抽出物が有する量のヒスチジン、アンセリン、クレアチン、クレアチニン、ベタイン、カルノシン、イノシン酸、並びに、ヒスチジン、アンセリン、クレアチン、クレアチニン、ベタインおよびカルノシンの同等濃度組成物と比較して、炎症性サイトカインの産生を減少させるものである、機能性食品。
【0017】
（７） 上記（１）記載の食品において、前記精神神経疾患は、血液脳関門破綻を要因とするものであることを特徴とする、機能性食品。
【0018】
（８） 上記（７）記載の食品であって、血液脳関門バリア性の改善作用を有する、機能性食品。
【0019】
（９） 上記（８）記載の食品において、前記血液脳関門バリア性の改善作用における有効成分は、ヒスチジンおよびイノシン酸である、機能性食品。
【0020】
（１０） 上記（７）記載の食品であって、心臓アセチルコリン産生系の活性化作用を有する、機能性食品。
【0021】
（１１） 上記（１）記載の食品において、前記鰹由来抽出物の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬである、機能性食品。
【0022】
（１２） 上記（９）記載の食品において、前記鰹由来抽出物の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ、あるいは、ヒスチジン濃度は０．８３６ｍｇ／ｍＬ、イノシン酸濃度は０．０５３７ｍｇ／ｍＬである、機能性食品。
【0023】
（１３） 上記（１０）記載の食品において、前記鰹由来抽出物の濃度は１０ｍｇ／ｍＬである、機能性食品。
【0024】
上記のような構成により、本発明に係る鰹由来抽出物を含むことを特徴とする機能性食品は、抗炎症作用、血液脳関門バリア性の改善、非神経性非中枢性心臓アセチルコリン産生系の活性化の効果を奏することができる。
【0025】
なお、上記以外の本発明の特徴については、以下で説明する本発明の実施形態の説明中で明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図12】図１２は、ゲルろ過活性画分ＩＩのフラクション７から量的に多く検出された成分（クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、グリコール酸（Ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ））について、抗炎症作用を評価した実験結果を示す。
【図13】図１３は、ゲルろ過活性画分ＩＩのフラクション１７から量的に多く検出された成分（イノシン酸（Ｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、リボース－５－リン酸（Ｒｉｂｏｓｅ ５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ））について、抗炎症作用を評価した実験結果を示す。
【図17】図１７は、鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションについて、ラット脳毛細血管内皮細胞を用いてタイトジャンクション関連分子のタンパク質発現に対する影響を評価した実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下、この発明の一実施形態を、図面等を参照しながら説明する。
【0028】
（本発明の実施形態）
まず、以下、鰹由来抽出物が抗炎症作用、血液脳関門バリア性の改善、非神経性非中枢性心臓アセチルコリン産生系の活性化の効果を有するという結論に至った経緯について説明する。
まず、以下、鰹由来抽出物が抗炎症作用、血液脳関門バリア性の改善、非神経性非中枢性心臓アセチルコリン産生系の活性化の効果を有するという結論に至った経緯について説明する。
【0029】
（抗炎症作用）
日本の伝統的な発酵食品である鰹節（荒節、本枯節、なまり節）、その他、様々な魚種（うるめ、サバ、宗田鰹、まぐろ）の節抽出物について、マウス脳ミクログリア由来の培養細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で抗炎症作用のスクリーニングを行った。その結果、ほとんどの節抽出物に抗炎症作用が認められたが、すでに魚特有のω－３系多価不飽和脂肪酸であるＤＨＡやＥＰＡの抗炎症作用は知られており、各種節抽出物の抗炎症作用がこれら脂肪酸によるものである可能性も考えられた。
日本の伝統的な発酵食品である鰹節（荒節、本枯節、なまり節）、その他、様々な魚種（うるめ、サバ、宗田鰹、まぐろ）の節抽出物について、マウス脳ミクログリア由来の培養細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で抗炎症作用のスクリーニングを行った。その結果、ほとんどの節抽出物に抗炎症作用が認められたが、すでに魚特有のω－３系多価不飽和脂肪酸であるＤＨＡやＥＰＡの抗炎症作用は知られており、各種節抽出物の抗炎症作用がこれら脂肪酸によるものである可能性も考えられた。
【0030】
そこで、ＧＣＭＳ分析により各種節抽出物中のＤＨＡとＥＰＡ含有濃度を算出、その濃度を参考にして試薬のＤＨＡ、ＥＰＡを用いて各抽出物と同等濃度の組成物を調製して抗炎症作用を調べたところ、鰹節抽出物に含有されるＤＨＡとＥＰＡ量は抗炎症効果を認めるには極めて濃度が低いこと、鰹荒節抽出物はＤＨＡ＋ＥＰＡの同等濃度組成物よりも抗炎症効果が高いことが明らかとなり、鰹節抽出物においてはＤＨＡやＥＰＡとは異なる、抗炎症効果の高い成分の存在が推察された。これに対し、他の節抽出物では鰹節抽出物と比較してＤＨＡとＥＰＡ含量が多いものがほとんどで、各抽出物とＤＨＡ＋ＥＰＡの同等濃度組成物の抗炎症効果が同程度であったことから、その責任物質はＤＨＡとＥＰＡである可能性が高いと考えられた。このような経緯を経て、研究材料を鰹荒節とすることにした。
【0031】
また、鰹節に特徴的な既知成分（ヒスチジン、アンセリン（Ａｎｓｅｒｉｎｅ）、クレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）、クレアチニン、ベタイン（Ｂｅｔａｉｎｅ）、カルノシン（Ｃａｒｎｏｓｉｎｅ）、イノシン酸）について同じ評価系で抗炎症作用を調べたが、いずれも単体では鰹節抽出物に匹敵するような抗炎症作用を示す物質はなく、これらを混合（イノシン酸を除く）しても顕著な抗炎症作用は認められなかった。このことから、鰹節抽出物には強力な抗炎症作用を示す未知物質の存在が考えられた。
【0032】
（血液脳関門バリア性の改善作用）
マウス脳ミクログリア由来の培養細胞の抗炎症作用を指標として、鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣにより順次分離精製して活性成分を同定する過程で得られた活性フラクションや活性フラクションからＬＣＭＳ分析により推定された化合物（ヒスチジン、イノシン酸）について、ラット脳血管内皮細胞におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５（Ｃｌａｕｄｉｎ－５）、オクルディン（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ））の発現を調べたところ、遺伝子レベルならびにタンパク質レベルでの発現亢進が認められた。マウスに鰹荒節熱水抽出物や活性フラクションを経口投与してもその効果が確認された。さらに、ＢＢＢ破綻モデルである凍結損傷においても、鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスではＢＢＢ破綻が有意差をもって抑制された。
マウス脳ミクログリア由来の培養細胞の抗炎症作用を指標として、鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣにより順次分離精製して活性成分を同定する過程で得られた活性フラクションや活性フラクションからＬＣＭＳ分析により推定された化合物（ヒスチジン、イノシン酸）について、ラット脳血管内皮細胞におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５（Ｃｌａｕｄｉｎ－５）、オクルディン（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ））の発現を調べたところ、遺伝子レベルならびにタンパク質レベルでの発現亢進が認められた。マウスに鰹荒節熱水抽出物や活性フラクションを経口投与してもその効果が確認された。さらに、ＢＢＢ破綻モデルである凍結損傷においても、鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスではＢＢＢ破綻が有意差をもって抑制された。
【0033】
（非神経性非中枢性心臓アセチルコリン産生系の活性化）
マウスに鰹荒節熱水抽出物を経口投与した結果、心臓ではアセチルコリン濃度が上昇し、アセチルコリン合成酵素（ＣｈＡＴ）のタンパク質レベルでの発現亢進が心臓や脳でも確認されたことから、心臓アセチルコリン産生系が活性化していることが確認できた。さらに、鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスの心拍数が有意差をもって低下したことから、全身の副交感神経をも同時に亢進させることが確認された。
マウスに鰹荒節熱水抽出物を経口投与した結果、心臓ではアセチルコリン濃度が上昇し、アセチルコリン合成酵素（ＣｈＡＴ）のタンパク質レベルでの発現亢進が心臓や脳でも確認されたことから、心臓アセチルコリン産生系が活性化していることが確認できた。さらに、鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスの心拍数が有意差をもって低下したことから、全身の副交感神経をも同時に亢進させることが確認された。
【0034】
以下、鰹由来抽出物が抗炎症作用、血液脳関門バリア性の改善、非神経性非中枢性心臓アセチルコリン産生系の活性化の効果を有するか検討するために行った実験及びその実験結果を説明する。
【0035】
［実験１］
マウス脳ミクログリア由来ＭＧ６細胞を理研バイオリソース研究センター（ＢＲＣ）より購入し、鰹節をはじめとする様々な抽出物の抗炎症作用を検証した（図１参照）。まず、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＭＧ６細胞を播種（５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・９０μＬ）し、ＣＯ２インキュベーター内で培養を開始する（３７℃、ＣＯ２濃度５％）。次に、０．５時間後に各種抽出物を各ｗｅｌｌに添加、さらに１時間後にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加してＭＧ６細胞を活性化させ炎症状態を惹起させる。６時間後、各ｗｅｌｌの培地上清を１０μＬ回収してから各ｗｅｌｌに生細胞数計測試薬（ＷＳＴ－８）を１０μＬ添加して、１時間後と２時間後にプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度（参照波長６３０ｎｍ）を測定した。
マウス脳ミクログリア由来ＭＧ６細胞を理研バイオリソース研究センター（ＢＲＣ）より購入し、鰹節をはじめとする様々な抽出物の抗炎症作用を検証した（図１参照）。まず、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＭＧ６細胞を播種（５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・９０μＬ）し、ＣＯ２インキュベーター内で培養を開始する（３７℃、ＣＯ２濃度５％）。次に、０．５時間後に各種抽出物を各ｗｅｌｌに添加、さらに１時間後にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加してＭＧ６細胞を活性化させ炎症状態を惹起させる。６時間後、各ｗｅｌｌの培地上清を１０μＬ回収してから各ｗｅｌｌに生細胞数計測試薬（ＷＳＴ－８）を１０μＬ添加して、１時間後と２時間後にプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度（参照波長６３０ｎｍ）を測定した。
【0036】
先に回収していた培養上清はＢｕｆｆｅｒで２５倍に希釈してＥＬＩＳＡ法により培地上清中に産生された炎症性サイトカインの一種であるＴＮＦ－α産生量を測定した（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ社のＫｉｔであるＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ－αを使用）。ＬＰＳ添加試験区に対し、各種抽出物の事前添加によりＴＮＦ－α産生量が減少しているほど抗炎症作用が高く、減少していないほど抗炎症作用が低いと判断できる。
【0037】
［実験２］
鰹荒節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図２参照）。鰹荒節の部位（表面、内部）や抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
鰹荒節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図２参照）。鰹荒節の部位（表面、内部）や抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
【0038】
さらに、ＧＣＭＳ分析により各抽出物中のＤＨＡとＥＰＡ含有濃度を算出、その濃度を参考にして試薬のＤＨＡ、ＥＰＡを用いて各抽出物と同等濃度の組成物を調製して抗炎症作用を調べたところ、鰹荒節抽出物に含有されるＤＨＡとＥＰＡ量では抗炎症効果を認めるには極めて濃度が低く、抗炎症効果もＤＨＡ＋ＥＰＡの同等濃度組成物より鰹荒節抽出物の方が高かったことから、ＤＨＡやＥＰＡとは異なる、高い抗炎症を示す成分の存在が推察された。
【0039】
［実験３］
鰹本枯節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図３参照）。鰹本枯節の部位（表面、内部）や抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
鰹本枯節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図３参照）。鰹本枯節の部位（表面、内部）や抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
【0040】
さらに、ＧＣＭＳ分析により各抽出物中のＤＨＡとＥＰＡ含有濃度を算出したところ、鰹本枯節抽出物に含有されるＤＨＡとＥＰＡ量では抗炎症効果を認めるには極めて濃度が低かったことから、ＤＨＡやＥＰＡとは異なる高い抗炎症を示す成分の存在が推察された。
【0041】
［実験４］
なまり節の熱水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図４参照）。なまり節の部位（雄節、雌節／表面、内部）にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
なまり節の熱水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図４参照）。なまり節の部位（雄節、雌節／表面、内部）にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
【0042】
さらに、ＧＣＭＳ分析により各なまり節抽出物中のＤＨＡとＥＰＡ含有濃度を算出したところ、なまり節抽出物に含有されるＤＨＡとＥＰＡ量では抗炎症効果を認めるには極めて濃度が低かったことから、ＤＨＡやＥＰＡとは異なる高い抗炎症を示す成分の存在が推察された。
【0043】
［実験５］
うるめ節、サバ節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図５参照）。うるめ節、サバ節の抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
うるめ節、サバ節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図５参照）。うるめ節、サバ節の抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
【0044】
しかしながら、ＧＣＭＳ分析により各抽出物中のＤＨＡとＥＰＡ含有濃度を算出、その濃度を参考にして試薬のＤＨＡ、ＥＰＡを用いて各抽出物と同等濃度の組成物を調製して抗炎症作用を調べたところ、各抽出物とそれぞれのＤＨＡ＋ＥＰＡの同等濃度組成物の抗炎症効果が同程度であったことから、各抽出物で認められた抗炎症作用の責任物質はＤＨＡとＥＰＡである可能性が高いと考えられた。
【0045】
［実験６］
宗田節、まぐろ節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図６参照）。宗田節、まぐろ節の抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
宗田節、まぐろ節の熱水抽出物、水抽出物（０．０１ｍｇ，０．０３ｍｇ，０．１ｍｇ，０．３ｍｇ，１ｍｇ／ｍＬ）について、ＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用を評価した（図６参照）。宗田節、まぐろ節の抽出方法にかかわらず、濃度依存的にＴＮＦ－α産生量が低下したことから、抗炎症作用を有することが明らかとなった。ＷＳＴ－８アッセイでは、コントロール試験区（ＬＰＳ±）と比較しても各種抽出物の試験区に吸光値の減少が見られないことから、細胞生存率に影響を与えず抗炎症作用を示すことが確認できた。
【0046】
さらに、ＧＣＭＳ分析により各抽出物中のＤＨＡとＥＰＡ含有濃度を算出、その濃度を参考にして試薬のＤＨＡ、ＥＰＡを用いて各抽出物と同等濃度の組成物を調製して抗炎症作用を調べたところ、ＤＨＡ、ＥＰＡ含有量は高い抗炎症効果を認める濃度ではなかったが、各抽出物とそれぞれのＤＨＡ＋ＥＰＡの同等濃度組成物の抗炎症効果が同程度であったことから、各抽出物で認められた抗炎症効果の責任物質はＤＨＡとＥＰＡである可能性が高いと考えられた。
【0047】
［実験７］
各種節抽出物の抗炎症作用をマウス脳ミクログリア由来ＭＧ６細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で明らかにできたことから、次のステップとして、ｉｎ ｖｉｖｏでも効果を示すのかを検証すべく、マウス経口投与による動物実験をおこなった。
各種節抽出物の抗炎症作用をマウス脳ミクログリア由来ＭＧ６細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で明らかにできたことから、次のステップとして、ｉｎ ｖｉｖｏでも効果を示すのかを検証すべく、マウス経口投与による動物実験をおこなった。
【0048】
鰹荒節熱水抽出物を蒸留水で１１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して給水瓶に入れ、飼育ゲージに設置して４日間、自由飲水させた。その後、拘束ストレス（２時間）を負荷してから、脳内における炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）の遺伝子発現および血中コルチコステロン（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）濃度を測定した。さらに、視床下部におけるミクログリアの活性化を免疫組織学的手法により観察した。
【0049】
その結果、脳内のＩＬ－１β、ＴＮＦ－αについては、鰹荒節熱水抽出物（Ｅ）の投与群において有意な減少が認められた（図７Ａ参照）。また、拘束ストレス条件下で認められるミクログリアの活性化（黒三角でマークされた部分）も鰹荒節熱水抽出物（Ｅ）の投与群は顕著に抑制されており、拘束ストレス負荷前と同様な状態を観察することが出来た（図７Ｂ参照）。
【0050】
これらの結果から、ｉｎ ｖｉｖｏ実験においても鰹荒節熱水抽出物の抗炎症作用（脳内における炎症性サイトカイン産生抑制、ミクログリア活性化抑制）を示すことが明らかとなった。
【0051】
［実験８］
ＬＰＳで炎症を惹起させたマウスにおける鰹荒節熱水抽出物の抗炎症作用について検討を行った。
ＬＰＳで炎症を惹起させたマウスにおける鰹荒節熱水抽出物の抗炎症作用について検討を行った。
【0052】
鰹荒節熱水抽出物を水で１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して給水瓶に入れ、飼育ゲージに設置して３日間、自由飲水させた。その後、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して４時間後に肝臓における炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６）の遺伝子発現および血中炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β）を測定した。
【0053】
その結果、肝臓におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６については、鰹荒節熱水抽出物（Ｅ）の投与群において有意な減少が認められた（図８Ａ参照）。このとき肝臓内でのα７ニコチン受容体（α７ ＡＣｈＲ）タンパク発現が低下し、炎症応答の鰹荒節熱水抽出物（Ｅ）による抑制効果が示唆された（図８Ｂ参照）。また、血中におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６については、鰹荒節熱水抽出物（Ｅ）の投与群において有意な減少が認められた（図８Ｃ参照）。
【0054】
これらの結果から、ｉｎ ｖｉｖｏ実験においても鰹荒節熱水抽出物の抗炎症作用（肝臓、血中における炎症性サイトカイン産生抑制）を示すことが明らかとなった。
【0055】
［実験９］
鰹荒節の熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより分離精製し、得られたフラクションについてＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を検証した。
鰹荒節の熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより分離精製し、得られたフラクションについてＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を検証した。
【0056】
まず鰹荒節熱水抽出物（Ｌｏｔ：２００７２９）１８５１．６ｍｇを移動相（０．１Ｍ酢酸）１２．３ｍＬに再溶解し［２２５ｍｇ／１．５ｍＬ］、これをゲルろ過クロマトグラフィーにより分離精製した。ゲルろ過の条件としては、カラムＸＫ１６／７０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社）にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社、Ｐ／Ｎ：１７－００３３－０２ Ｌｏｔ：１００３４１８６）をゲルろ過担体として充填し、０．１Ｍ酢酸で流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ．で試料を溶出し、ＵＶ検出器で吸光度（２１４ｎｍ）を測定した。分離された溶出液はフラクションコレクターを用いて、１フラクション１０分（３ｍＬ／フラクション）となるように分取した。次に、得られた各フラクションを減圧乾固して超純水に再溶解し、回収固形分重量が５ｍｇ以上のフラクションは１００ｍｇ／ｍＬに、５ｍｇ未満のフラクションについては一律５０μＬの超純水に再溶解した後、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。このようにして調製した各フラクションについて、ＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を評価した。
【0057】
その結果、図９に示すフラクション２６～２８（ゲルろ過活性画分Ｉ）に極めて高い抗炎症活性が認められ、フラクション３４～３６（ゲルろ過活性画分ＩＩ）、フラクション３９～４１（ゲルろ過活性画分ＩＩＩ）、フラクション４８～５１（ゲルろ過活性画分ＩＶ）にも抗炎症活性が認められた。しかし、ゲルろ過活性画分ＩＶは吸光値が殆どなく検出が難しいことが予想されたため、それ以外の抗炎症活性画分について、さらに分離精製を進め、活性成分の単離同定を試みることにした。
【0058】
まず、鰹荒節の熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより分離精製して得られたゲルろ過活性フラクションＩについて、さらに逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製を行い、得られたフラクションについてＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を検証した。
【0059】
分離条件としては、分取用逆相カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３、５μｍ、１０×２５０ｍｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｃ／Ｎ５０２０－０６８１２、Ｓ／Ｎ０ＢＩ４１２４０）、移動相Ａ；０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ；８０％アセトニトリル－０．１％ＴＦＡを用いてアセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて、流速３ｍＬ／ｍｉｎ．で試料を溶出し、ＵＶ検出器で吸光度（２１４ｎｍ）を測定した。分離された溶出液は、１フラクション１分（３ｍＬ／フラクション）となるように分取した。次に、得られた各フラクションを減圧乾固して超純水に再溶解し、回収固形分重量が５ｍｇ以上のフラクションは１００ｍｇ／ｍＬに、５ｍｇ未満のフラクションについては一律５０μＬの超純水に再溶解した後、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。このようにして調製した各フラクションについて、ＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を評価した。
【0060】
その結果、図１０に示すフラクション５～７に極めて高い抗炎症活性が認められた。また、ＬＣＭＳ分析により得られた精密質量をもとに化合物を推定したところ、フラクション５に尿素（Ｕｒｅａ）、ギ酸（Ｆｏｒｍａｔｅ）、５－ヒドロキシオロチン酸（５－ｈｙｄｒｏｘｙｏｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ）、フラクション６に５－メチルシチジン（５－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、２－メチルシチジン（２－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ベンセラジド（Ｂｅｎｓｅｒａｚｉｄｅ）、フラクション７にリシン－リシン（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）、リシン無水物（Ｌｙｓｉｎｅ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、リシン－ヒスチジン（Ｌｙｓ－Ｈｉｓ）（もしくはヒスチジン－リシン（Ｈｉｓ－Ｌｙｓ））、カドララジン（Ｃａｄｒａｌａｚｉｎｅ）が含まれている可能性が示唆された。
【0061】
次に、鰹荒節の熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより分離精製して得られたゲルろ過活性画分ＩＩについて、さらに逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製を行い、得られたフラクションについてＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を検証した。
【0062】
分離条件としては、分取用逆相カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３、５μｍ、１０×２５０ｍｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｃ／Ｎ５０２０－０６８１２、Ｓ／Ｎ０ＢＩ４１２４０）、移動相Ａ；０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ；８０％アセトニトリル－０．１％ＴＦＡを用いてアセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて、流速３ｍＬ／ｍｉｎ．で試料を溶出し、ＵＶ検出器で吸光度（２１４ｎｍ）を測定した。分離された溶出液は、１フラクション１分（３ｍＬ／フラクション）となるように分取した。次に、得られた各フラクションを減圧乾固して超純水に再溶解し、回収固形分重量が５ｍｇ以上のフラクションは１００ｍｇ／ｍＬに、５ｍｇ未満のフラクションについては一律５０μＬの超純水に再溶解した後、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。このようにして調製した各フラクションについて、ＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を評価した。
【0063】
その結果、図１１に示すフラクション７とフラクション１７に抗炎症活性が認められた。また、ＬＣＭＳ分析により得られた精密質量をもとに化合物を推定したところ、フラクション７にクレアチン、クレアチニン、グリコール酸、乳酸、フラクション１７にイノシン酸、ＡＭＰ、コハク酸、リボース－５－リン酸、ヒポキサンチンが含まれている可能性が示唆された。
【0064】
抗炎症作用を示す物質の単離同定を試みるため、フラクション７から量的に多く検出された４成分（クレアチン、クレアチニン、グリコール酸、乳酸）について、各成分単体で抗炎症作用を評価した。
【0065】
フラクション７に多く含まれた４成分（クレアチン、クレアチニン、グリコール酸、乳酸）のうち、３成分（クレアチニン、グリコール酸、乳酸）で抗炎症活性が認められた（図１２参照）。このうち乳酸については抗炎症活性を有することが既に報告されているが（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｌ－ｌａｃｔａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０２２ Ｊｕｌ ２６；１－８）、他の２成分（クレアチニン、グリコール酸）については新規の抗炎症成分であった。
【0066】
次に、フラクション１７から量的に多く検出された５成分（イノシン酸、ＡＭＰ、コハク酸、リボース－５－リン酸、ヒポキサンチン）について、各成分単体で抗炎症作用を評価した。
【0067】
その結果、イノシン酸、ＡＭＰ、コハク酸、リボース－５－リン酸、ヒポキサンチンのそれぞれの成分について、抗炎症活性が認められた（図１３参照）。
【0068】
すなわち、クレアチニン、グリコール酸、イノシン酸、ＡＭＰ、コハク酸、リボース－５－リン酸、ヒポキサンチンの７成分が、鰹節熱水抽出物に含まれる新規な抗炎症成分である可能性が示唆された。
【0069】
最後に、鰹荒節の熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより分離精製して得られたゲルろ過活性画分ＩＩＩについて、さらに逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製を行い、得られたフラクションについてＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を検証した。
【0070】
分離条件としては、分取用逆相カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３、５μｍ、１０×２５０ｍｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｃ／Ｎ５０２０－０６８１２、Ｓ／Ｎ０ＢＩ４１２４０）、移動相Ａ；０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ；８０％アセトニトリル－０．１％ＴＦＡを用いてアセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて、流速３ｍＬ／ｍｉｎ．で試料を溶出し、ＵＶ検出器で吸光度（２１４ｎｍ）を測定した。分離された溶出液は、１フラクション１分（３ｍＬ／フラクション）となるように分取した。次に、得られた各フラクションを減圧乾固して超純水に再溶解し、回収固形分重量が５ｍｇ以上のフラクションは１００ｍｇ／ｍＬに、５ｍｇ未満のフラクションについては一律５０μＬの超純水に再溶解した後、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。このようにして調製した各フラクションについて、ＭＧ６細胞を用いて抗炎症作用を評価した。
【0071】
その結果、図１４に示すフラクション２０に極めて高い抗炎症活性が認められた。また、ＬＣＭＳ分析により得られた精密質量をもとに化合物を推定したところ、フラクション２０にイノシン（Ｉｎｏｓｉｎｅ）、アラビノシルヒポキサンチン（Ａｒａｂｉｎｏｓｙｌｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）が含まれている可能性が示唆された。
【0072】
［実験１０］
鰹荒節熱水抽出物のＢＢＢ機能への影響を調べるために、ラット脳毛細血管内皮細胞におけるタイトジャンクション関連タンパク質であるクローディン５およびオクルディンのタンパク発現を指標として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験にて検証した。血管内皮細胞間隙のバリアであるタイトジャンクションを構成するクローディン５及びオクルディンは、ＢＢＢ機能を評価するマーカーとしてよく用いられるものである（脳循環代謝 ２４：１１１－１１５， ２０１３参照）。
鰹荒節熱水抽出物のＢＢＢ機能への影響を調べるために、ラット脳毛細血管内皮細胞におけるタイトジャンクション関連タンパク質であるクローディン５およびオクルディンのタンパク発現を指標として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験にて検証した。血管内皮細胞間隙のバリアであるタイトジャンクションを構成するクローディン５及びオクルディンは、ＢＢＢ機能を評価するマーカーとしてよく用いられるものである（脳循環代謝 ２４：１１１－１１５， ２０１３参照）。
【0073】
・ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子のタンパク質発現（図１５参照）
ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）、培地等をファーマコセル社より購入し、鰹荒節熱水抽出物のタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現への影響を検証した。
ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）、培地等をファーマコセル社より購入し、鰹荒節熱水抽出物のタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現への影響を検証した。
【0074】
まず、４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＲＢＥＣｓを播種（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・４４０μＬ）し、ＣＯ２インキュベーター内で培養を開始する（３７℃、ＣＯ２濃度５％）。次に、７２時間後に各種抽出物を添加して調製した評価培地に各ｗｅｌｌの培地を置換、その時点からさらに２４時間後、７２時間後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、そのプロトコルにしたがってＲＮＡとＰｒｏｔｅｉｎを培養していた細胞から回収した。抽出ＰｒｏｔｅｉｎはＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより評価を行い、抽出ＲＮＡは逆転写して得たＤＮＡをｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより評価した。
【0075】
その結果、クローディン５は２４時間および７２時間後に無血清培地試験区（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）と比較してタンパク質発現が亢進しており、オクルディンもクローディン５と相互作用するかのように特に２４時間後にその発現が亢進していた［ＥＸＰ １］。また、さらに継代を２回行ったＲＢＥＣｓ（総継代数５）についても同様に検証したところ、クローディン５は無血清培地試験区と比較してタンパク発現が亢進しているのを確認できた［ＥＸＰ ２］。
【0076】
・マウス脳におけるアセチルコリン合成酵素（図１６参照）
マウスに１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を経口投与し、その後、脳全体を調製した試料から、アセチルコリン合成酵素（ＣｈＡＴ）のタンパク質レベルの発現を検証した（コントロール群；３匹、鰹荒節熱水抽出物投与群；５匹）。
マウスに１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を経口投与し、その後、脳全体を調製した試料から、アセチルコリン合成酵素（ＣｈＡＴ）のタンパク質レベルの発現を検証した（コントロール群；３匹、鰹荒節熱水抽出物投与群；５匹）。
【0077】
その結果、脳全体より抽出した調製物において、ＣｈＡＴタンパク質発現亢進が認められたことから、脳内における神経細胞でのアセチルコリン産生が亢進していることが示唆された。
【0078】
これらの結果から、鰹荒節熱水抽出物はｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において脳毛細血管内皮細胞のタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現を亢進することが明らかとなった。
【0079】
［実験１１］
鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションについて、ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現の影響を検証した（図１７参照）。
鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションについて、ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現の影響を検証した（図１７参照）。
【0080】
ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）、培地等をファーマコセル社より購入し、鰹荒節熱水抽出物のタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現への影響を検証した。まず、４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＲＢＥＣｓを播種（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・４４０μＬ）し、ＣＯ２インキュベーター内で培養を開始する（３７℃、ＣＯ２濃度５％）。次に、７２時間後に各種抽出物を添加して調製した評価培地に各ｗｅｌｌの培地を置換、さらに２４時間後、７２時間後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、そのプロトコルにしたがってＲＮＡとＰｒｏｔｅｉｎを培養していた細胞から回収した。抽出ＰｒｏｔｅｉｎはＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより評価を行い、抽出ＲＮＡは逆転写して得たＤＮＡをｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより評価した（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲデータはここには示していない）。
【0081】
その結果、活性フラクション添加濃度が０．１ｍｇ／ｍＬの場合、２４時間後ではサンプル４、５、６（それぞれ図１４のフラクション２０、図１０のフラクション５、６に該当）、さらに７２時間後ではサンプル７、８（それぞれ図１０のフラクション７、図１１のフラクション７に該当）で無血清培地試験区に比較してクローディン５のタンパク発現が亢進していた。また、活性フラクション添加濃度が１．０ｍｇ／ｍＬの場合、２４時間後ではサンプル５（図１０のフラクション５に該当）とサンプル８（図１１のフラクション７に該当）、７２時間後ではサンプル８（図１１のフラクション７に該当）で無血清培地試験区に比較してクローディン５のタンパク発現が亢進していた。
【0082】
これらの結果から、鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションについて、ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現を亢進することが明らかになった。
【0083】
［実験１２］
鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションに含まれる成分をＬＣＭＳ分析により得られた精密質量数から推定された化合物（イノシン酸、ヒスチジン）、Ｄａｓｈｉ－ｐｒｅｓｓｏ（マルハチ村松社の鰹だし製品）について、ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現の影響を検証した（図１８参照）。
鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションに含まれる成分をＬＣＭＳ分析により得られた精密質量数から推定された化合物（イノシン酸、ヒスチジン）、Ｄａｓｈｉ－ｐｒｅｓｓｏ（マルハチ村松社の鰹だし製品）について、ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現の影響を検証した（図１８参照）。
【0084】
ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）、培地等をファーマコセル社より購入し、鰹荒節熱水抽出物のタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現への影響を検証した。まず、４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＲＢＥＣｓを播種（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・４４０μＬ）し、ＣＯ２インキュベーター内で培養を開始する（３７℃、ＣＯ２濃度５％）。次に、７２時間後に各成分および抽出物を添加して調製した評価培地に各ｗｅｌｌの培地を置換、さらに２４時間後、７２時間後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、そのプロトコルにしたがってＲＮＡとＰｒｏｔｅｉｎを培養していた細胞から回収した。抽出ＰｒｏｔｅｉｎはＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより評価を行い、抽出ＲＮＡは逆転写して得たＤＮＡをｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより評価した（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲデータはここには示していない）。
【0085】
その結果、２４時間後において、イノシン酸（添加濃度が０．０５３７ｍｇ／ｍＬ）、ヒスチジン（添加濃度が０．８３６ｍｇ／ｍＬ）が無血清培地試験区に比較してクローディン５のタンパク発現が亢進していた。また、Ｄａｓｈｉ－ｐｒｅｓｓｏ（添加濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ）では７２時間後、無血清培地試験区に比較してクローディン５のタンパク発現が亢進していた。
【0086】
これらの結果から、鰹荒節熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを順次用いて分離精製して得た抗炎症高活性フラクションに含まれることが予想された成分（イノシン酸、ヒスチジン）について、ラット脳毛細血管内皮細胞（ＲＢＥＣｓ、初代細胞）におけるタイトジャンクション関連分子（クローディン５、オクルディン）のタンパク質発現の亢進することが明らかになった。
【0087】
［実験１３］
血液脳関門を物理的に損傷させ、その前後に鰹荒節熱水抽出物を経口投与させた場合の脳血管透過性をエバンスブルー法（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ；ＥＢ）により評価した（図１９参照）。
血液脳関門を物理的に損傷させ、その前後に鰹荒節熱水抽出物を経口投与させた場合の脳血管透過性をエバンスブルー法（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ；ＥＢ）により評価した（図１９参照）。
【0088】
具体的には、まずマウスに１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を３日間経口投与し、４日目も経口投与をしながら冷却した金属棒（直径３ｍｍ）を５秒間、右頭頂頭蓋骨に接触させることで血液脳関門に直接ダメージを与えた。凍結損傷を与えてから２４時間後に、３％ＥＢを投与、３～４時間後に脳右半球を厚さ３ｍｍ切片にして３日間、５０℃、８００μＬのホルムアルデヒドに浸漬した。その後、６３４ｎｍの吸光度を測定した。
【0089】
その結果、鰹荒節熱水抽出物の投与群は、非投与群と比較して明らかに脳内へ漏出したＥＢ量が少なかったことから、鰹荒節熱水抽出物の血液脳関門の機能を維持し、改善する効果が高いということが明らかとなった。
【0090】
［実験１４］
心臓におけるアセチルコリン産生能および血行動態変化に対する影響を検討した。
心臓におけるアセチルコリン産生能および血行動態変化に対する影響を検討した。
【0091】
マウスに１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を２週間経口投与すると水投与群と比較して明らかに心臓でのアセチルコリン濃度が上昇（図２０Ａ参照）、心臓に加えて脳でのアセチルコリン合成酵素（ＣｈＡＴ）のタンパク質レベルでの発現が亢進していることが分かった（図１６参照）。
【0092】
マウスに鰹荒節熱水抽出物を１週間、２週間経口投与した時の、血圧、心拍数に対する影響を検討した。１週目よりも２週目では水投与群と比較して明らかに心拍数（ＨＲ）が顕著に低下し、収縮期血圧（ＳＢＰ）および張期血圧（ＤＢＰ）に関しても２週間目ではやや低下傾向にあることが分かった。すなわち、鰹荒節熱水抽出物は、マウスの副交感神経系を亢進させ、心臓アセチルコリン産生能も亢進させることが示唆された（図２０Ｂ参照）。
【0093】
［実験１５］
１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスを用いた強制水泳試験（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ；ＦＳＴ）を行い、うつ病様行動に対する抑制作用を検討した（図２１参照）。
１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスを用いた強制水泳試験（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ；ＦＳＴ）を行い、うつ病様行動に対する抑制作用を検討した（図２１参照）。
【0094】
具体的には、１日ないし５日間、鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスを用いて水を張った水槽に入れて強制的に水泳を行わせ、１０分間観察したうち、最後の４分間、マウスが無動状態の時間の長さを測定した。無動時間が長いとうつ状態が強く、無動時間が短いと抗うつ作用があると考えられている。
【0095】
その結果、鰹荒節熱水抽出物の経口投与期間の異なる２つの実験において、抗うつ作用にかかわる役割を果たしていることが明らかとなった。
【0096】
［実験１６］
１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスを用いた尾懸垂試験（Ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ；ＴＳＴ）を行い、うつ病様行動に対する抑制作用を検討した（図２２参照）。
１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスを用いた尾懸垂試験（Ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ；ＴＳＴ）を行い、うつ病様行動に対する抑制作用を検討した（図２２参照）。
【0097】
具体的には、１日ないし２日間、鰹荒節熱水抽出物を経口投与したマウスの尾を固定し逆さの状態で吊るし、１０分間観察したうち、マウスが無動状態の時間の長さを測定した。無動時間が長いとうつ状態が強く、無動時間が短いと抗うつ作用があると考えられている。
【0098】
その結果、鰹荒節熱水抽出物の経口投与期間の異なる２つの実験において、抗うつ作用にかかわる役割を果たしていることが明らかとなった。
【0099】
［実験１７］
マウスが新奇性を好むという性質を利用して、図２３に示す視覚的認知記憶を評価する手法である新奇物質探索試験を行い、鰹荒節熱水抽出物非投与群と投与群の２群間で新奇物質の認識記憶に対する影響を比較した。
マウスが新奇性を好むという性質を利用して、図２３に示す視覚的認知記憶を評価する手法である新奇物質探索試験を行い、鰹荒節熱水抽出物非投与群と投与群の２群間で新奇物質の認識記憶に対する影響を比較した。
【0100】
まずオブジェクト（対象となる物体）を設置しない実験装置（直径約５０ｃｍの円筒形の筒）にマウスを入れて１０分間環境に慣らした後（Ｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎ）、２つの同じオブジェクトを置いた実験装置の中で１０分間自由に探索をさせた（Ｔｒａｉｎｉｎｇ；訓練試行）。その後、一方のオブジェクトを新奇オブジェクトに置き換えて１０分間自由に探索させた（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ；保持試行）。マウスの動きは、設置したカメラで上から記録した。訓練試行および保持試行では，２つのオブジェクトに対するそれぞれの探索時間ならびに総探索時間を測定した。訓練試行時においては、総探索時間に対するいずれかのオブジェクトへの探索時間の割合（％）を、保持試行においては総探索時間に対する新奇オブジェクトに対する探索時間の割合（％）を探索嗜好性として算出し、後者を視覚的認知記憶の指標とした。
【0101】
その結果、１０ｍｇ／ｍＬの鰹荒節熱水抽出物非投与群と投与群で３日目の総移動距離に関してはほとんど差が認められなかったが、中央部分として定めた実験装置内のエリアにマウスが侵入した時間、滞在時間、中央部分においての移動距離においては、鰹荒節熱水抽出物投与群で有意な増加が認められた。さらに、鰹荒節熱水抽出物非投与群（コントロール；水）では新奇オブジェクトのほうが既知オブジェクトよりも探索行動を行うまでの時間（探索潜時）が長かったのに対して、鰹荒節熱水抽出物投与群では新奇オブジェクトと既知オブジェクトに対する探索潜時にほとんど差が無かった（図２４参照）。
【0102】
これらのことから、鰹荒節熱水抽出物を摂取することにより、恐怖心が軽減されたためか、新奇と既知のオブジェクトに対して区別なく、探索する傾向にあることが明らかとなった。すなわち、鰹荒節熱水抽出物には新奇な物体に対する恐怖心を緩和するような作用があるのではないかと考えられた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
