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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-10
(45)【発行日】2025-03-18
(54)【発明の名称】（Ｒ）－レチクリンの生産方法
(51)【国際特許分類】
C12P 17/12 20060101AFI20250311BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20250311BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250311BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20250311BHJP
【ＦＩ】
C12P17/12 ZNA
C12N15/53
C12N1/21
C12N15/29
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021528257
(86)(22)【出願日】2020-06-16
(86)【国際出願番号】 JP2020023561
(87)【国際公開番号】W WO2020262107
(87)【国際公開日】2020-12-30
【審査請求日】2023-06-14
(31)【優先権主張番号】P 2019116701
(32)【優先日】2019-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】723012515
【氏名又は名称】ファーメランタ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】中川 明
(72)【発明者】
【氏名】南 博道
【審査官】山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１７３５９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／２０７６４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】WINZER T.et al.，Morphinan biosynthesis in opium poppy requires a P450-oxidoreductase fusion protein，Science，2015年07月17日，Vol.349, Issue 6245，p.309-312
【文献】NAKAGAWA A.et al.，Total biosynthesis of opiates by stepwise fermentation using engineered Escherichia coli，Nature Communications，2016年02月05日，7:10390，DOI:10.1038/ncomms10390
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｐ
Ｃ１２Ｎ ９／００－９９
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子１と、配列番号３のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子２と、を宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップと、
前記組換え宿主細胞において、前記（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質と、前記オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップと、
前記組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップと、
を含み、
前記宿主細胞が原核生物である、（Ｒ）－レチクリンの生産方法。
【請求項2】
配列番号１のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子３を、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子１と、
配列番号３のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子２と、に分けるステップと、
前記遺伝子１と、前記遺伝子２とを宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップと、
前記組換え宿主細胞において、前記（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質と、
前記オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップと、
前記組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップと、
を含み、
前記宿主細胞が原核生物である、（Ｒ）－レチクリンの生産方法。
【請求項3】
前記（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質のＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列を、前記遺伝子１から削除するステップ、配列番号４のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子４を、前記宿主細胞に導入して、前記５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子５を、前記宿主細胞に導入して、前記ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップのうち、
少なくともいずれか一つのステップを更に含む、請求項１または２に記載の（Ｒ）－レチクリンの生産方法。
【請求項4】
前記（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質のＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列を、前記遺伝子１から削除するステップ、配列番号４のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子４を、前記宿主細胞に導入して、前記５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子５を、前記宿主細胞に導入して、前記ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ、
を更に含む、請求項１または２に記載の（Ｒ）－レチクリンの生産方法。
【請求項5】
前記原核生物が、大腸菌である、請求項４に記載の（Ｒ）－レチクリンの生産方法。
【請求項6】
配列番号１のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子３を、
配列番号２のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子１と、
配列番号３のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子２と、に分けるステップと、
前記遺伝子１と、前記遺伝子２と、
配列番号４のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子４と、
配列番号５のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子５と、を宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップと、
前記組換え宿主細胞において、前記（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有するタンパク質と、
前記オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質と、前記５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質と、前記ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップと、
前記組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップと、を含む、（Ｒ）－レチクリンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物ベンジルイソキノリンアルカロイドである、（Ｒ）－レチクリンの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ベンジルイソキノリンアルカロイドに属する医薬上有用な化合物として、モルヒネをはじめとするオピオイド系鎮痛剤が知られている。従来、オピオイド系鎮痛剤は、天然の植物から抽出する方法により生産されてきた。植物の二次代謝産物を利用するこの方法で得られる鎮痛剤は、その他の方法で生産される鎮痛剤と比較して高価であるため、別の方法が望まれていた。
【0003】
モルヒネをはじめとする、いくつかのベンジルイソキノリンアルカロイドは、化学合成による全合成も可能ではある。しかし、アルカロイドが有する複雑な構造やキラリティーのため、低コストでこれらの生産を行うことは困難である。
【0004】
そこで本発明者らはこれまで、ベンジルイソキノリンアルカロイドの全生合成工程を微生物系において行う試みをしてきた（特許文献１、非特許文献１，２）。宿主細胞として微生物を用いるこの方法では、植物および微生物の酵素を組み合わせてイソキノリンアルカロイド生合成経路を再構築する。
【0005】
ところで、ベンジルイソキノリンアルカロイドは、モクレン科、キンポウゲ科、メギ科、ケシ科、およびその他の多くの植物種において、チロシンから合成され、その多くが（Ｓ）－レチクリンを生合成中間体としている。
【0006】
オピオイド系鎮痛剤の原料であるテバインは、（Ｓ）－レチクリンが光学異性体の（Ｒ）－レチクリンに転換される反応を経て得られる。（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンに転換する酵素は、長らく同定されていなかったが、非特許文献３において、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンに転換する酵素である、ＳＴＯＲＲ（（Ｓ）－ｔо－（Ｒ）－ｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）タンパク質が同定された（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２０１２／０３９４３８号
【文献】特表２０１７－５０００２４号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ａｋｉｒａ Ｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｔｏｔａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｐｉａｔｅｓ ｂｙ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ７： １０３９０
【文献】Ａｋｉｒａ Ｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｌｋａｌｏｉｄｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２： ３２６
【文献】Ｔｈｉｌｏ Ｗ， ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｍｏｒｐｈｉｎａｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｏｐｉｕｍ ｐｏｐｐｙ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ Ｐ４５０－ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３４９（６２４５）： ３０９－３１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかし非特許文献３では、微生物を用いて、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産する具体的な方法は開示されていない。
【0010】
他方、特許文献２では、酵母等の真核生物を宿主細胞とし、ＳＴＯＲＲと同一又は類似のアミノ酸配列を利用して、（Ｒ）－レチクリンを生産する方法が開示されている（特許文献２）。
【0011】
しかし特許文献２では、原核生物を宿主細胞として用いて（Ｒ）－レチクリンを生産する方法は開示されていない。これは、原核生物においてＰ４５０酵素や、サルタジン合成酵素（ＳａｌＳ）を機能的に発現させることが困難であるためである。そのため、特許文献２では、宿主細胞として適用可能な対象は酵母などの真核生物に留まり、原核生物（例えば大腸菌など）を宿主細胞として（Ｒ）－レチクリンを生産することは困難である。
【0012】
また特許文献２では、生産された（Ｒ）－レチクリンに、（Ｓ）－レチクリンも混在しており、（Ｒ）－レチクリンだけを生成することは困難である。そのため、特許文献２の方法では、（Ｒ）－レチクリンのみを得るためには、キラルカラムによる光学分割等を行う必要があった。
【0013】
そこで本発明では、高い転換効率で（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、宿主細胞として原核生物を用いても、（Ｒ）－レチクリンを高い転換効率で生産することが可能な方法を提供することを目的とする。本発明はまた、実用上有用な原核生物である大腸菌に適用可能なテバイン生産系を構築することで、安価なオピオイド系鎮痛剤を供給することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者は、上述の課題に関し、本発明の方法をとることで、（Ｒ）―レチクリンを著しく高い転換効率で得られることを見出した。また本発明の方法により、宿主細胞として原核生物を用いても、（Ｒ）－レチクリンを著しく高い転換効率で産生させることが可能であることを見出した。本発明の方法では、最終的に（Ｓ）－レチクリンは、検出限界以下の量となり、産生された（Ｒ）－レチクリンの割合は、レチクリン総量に対して見かけ上１００％であった。
【0015】
本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子１（以下、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」ともいう。）と、配列番号３のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子２（以下、「オキシドリダクターゼをコードする遺伝子」ともいう。）と、を宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップと、前記組換え宿主細胞において、前記ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質と、前記オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップと、前記組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップと、を含むことを特徴とする。
【0016】
一態様において、本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、配列番号１のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子３（以下、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」ともいう。）を、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子１と、配列番号３のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子２と、に分けるステップと、前記遺伝子１と、前記遺伝子２とを宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップと、前記組換え宿主細胞において、前記ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質と、前記オキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップと、前記組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップと、を含むことを特徴とする。
【0017】
上述した本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法によれば、（Ｒ）－レチクリンを著しく高い転換効率で得ることができる。
【0018】
上述した本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、前記ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質のＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列を、前記遺伝子１から削除するステップ、配列番号４のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子４（以下、「５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子」ともいう。）を、前記宿主細胞に導入して、前記５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ、及び配列番号５のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子５（以下、「ＣＰＲをコードする遺伝子」ともいう。）を、前記宿主細胞に導入して、前記ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップのうち、少なくともいずれか一つのステップを更に含むものであってよい。これにより、原核生物を宿主細胞とした場合であっても、効率よく（Ｒ）－レチクリンを生産することができる。
【0019】
一態様において、上述した本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、前記ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質のＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列を、前記遺伝子１から削除するステップ、配列番号４のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子４を、前記宿主細胞に導入して、前記５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ、及び配列番号５のヌクレオチド配列に対して、７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである遺伝子５を、前記宿主細胞に導入して、前記ＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップを更に含むものであってよい。これにより、原核生物を宿主細胞とした場合であっても、より一層効率よく（Ｒ）－レチクリンを生産することができる。
【0020】
本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、前記宿主細胞が、原核生物であってもよい。
【0021】
本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、前記原核生物が、大腸菌であってもよい。
【0022】
本発明の生産方法によれば、最終的に（Ｓ）－レチクリンは、検出限界以下の量となり、産生された（Ｒ）－レチクリンの割合は、レチクリン総量に対して見かけ上１００％となる。
【0023】
本発明の生産方法は、宿主細胞として原核生物を用いても、上述のように（Ｒ）－レチクリンを著しく高い転換効率で産生させることが可能である。したがって、本発明の生産方法は、例えば、宿主細胞として原核生物である大腸菌を適用して（Ｒ）－レチクリンを生産させることが可能であるため、実用上有用である。
【発明の効果】
【0024】
本発明によれば、著しく高い転換効率で（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）―レチクリンを生産する方法を提供することができる。本発明の生産方法では、（Ｓ）－レチクリンを最終的に、検出限界以下の量とすることができる。したがって、本発明の生産方法では、（Ｒ）－レチクリンだけを得るためのプロセス（光学分割等）を行う必要がない。また本発明の生産方法では、宿主細胞として原核生物を用いても、上述のように（Ｒ）－レチクリンを高い転換効率で生産することが可能である。したがって、本発明によれば、例えば、実用上有用な原核生物である大腸菌に適用可能なテバイン生産系を構築可能であり、これにより（Ｒ）－レチクリンの大量生産も可能となるため、安価なオピオイド系鎮痛剤を供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】本発明において宿主細胞中に再構築される（Ｒ）－レチクリンの生合成経路を示す。
【図2】ＣＹＰ８０Ｙ２をコードするドメインとオキシドリダクターゼをコードするドメインとが融合したＳＴＯＲＲをコードする遺伝子（図２（ａ））と、本実施の形態で使用された、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードするドメインとオキシドリダクターゼをコードするドメインとが分断された遺伝子（図２（ｂ））を示す概略図である。
【図3】本実施の形態における（Ｒ）－レチクリンの生成を示すＬＣ－ＭＳ解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【0027】
本発明において「相同性」とは、２つのポリペプチド間、または２つのポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定される。相同性の数値（％）は、アラインメントされた両方の（アミノ酸または塩基）配列において同一のアミノ酸または塩基が存在する部位の数を決定し、次いで当該部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡなどのソフトウェアを用いて決定される。
【0028】
本発明の方法において遺伝子を導入する「宿主細胞」としては、特に限定されないが、例えば大腸菌および枯草菌などの原核生物、並びに酵母および糸状菌などの真核生物が挙げられる。本発明における宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。
【0029】
宿主細胞に遺伝子を導入する場合、遺伝子を直接宿主細胞ゲノムＤＮＡ上に導入してもよいが、遺伝子が組み込まれたベクターを宿主細胞に導入するのが好ましい。導入遺伝子はすべて同一のベクターに組み込んでもよいし、２以上の別々のベクターに分けて組み込んでもよい。
【0030】
ベクター（発現ベクター）は、その内部に組み込まれた導入遺伝子を発現させる。導入遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主細胞内で自律的に複製しうるプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ベクターは、導入される宿主細胞に適合した複製開始点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、および転写終結シグナル（ターミネーター配列）を含むものが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合には、ｐＥＴベクター系、ｐＱＥベクター系、ｐＣｏｌｄベクター系などが挙げられ、酵母で発現させる場合は、ｐＹＥＳ２ベクター系、ｐＹＥＸベクター系などが挙げられる。
【0031】
選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【0032】
発現制御配列とは、ＤＮＡ配列に適切に連結した場合、宿主細胞において、そのＤＮＡ配列からなる遺伝子の発現を制御すること、すなわち、該ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を誘導および／または促進すること、あるいは抑制することができる配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。
【0033】
本発明に用いる発現ベクターは、所望の遺伝子の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作成することができる。
【0034】
発現ベクターの宿主細胞への形質転換方法としては、従来公知の方法を用いることが出来、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法などが挙げられる。
【0035】
組換え宿主細胞の培養条件は、該組換え細胞が良好に発育し、かつ目的とする一群のタンパク質が全て発現し、それぞれの機能または酵素活性が発揮される条件であれば特に限定はされない。具体的には、培養条件は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常、液体培養で行われる。
【0036】
組換え宿主細胞の培養に用いられる培地の炭素源としては、宿主細胞が利用できる物質であれば特に限定されないが、糖およびグリセロールが挙げられる。糖の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖や、スクロース、ラクトース、マルトースなどの二糖が挙げられる。また窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。
【0037】
大腸菌を培養する培地としては、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、Ｍ９最少培地が挙げられる。酵母を培養する培地としては、例えば、ＳＣ培地、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地が挙げられる。
【0038】
培養温度は、宿主細胞が生育し、目的の酵素を発現し、その活性が発揮される範囲で適宜変更できる。大腸菌の場合、例えば、温度２５℃、８０時間、ｐＨ７．０の培養条件を用いることができる。酵母の場合、例えば、温度３０℃、６０時間、ｐＨ５．８の培養条件を用いることができる。
【0039】
生産された（Ｒ）－レチクリンは、当業者に周知のあらゆる手段によって確認することができる。具体的には、反応生成物と、目的の（Ｒ）－レチクリン標品とを、ＬＣ－ＭＳに供し、得られるスペクトルを比較することによって同定することができる。また、ＮＭＲ分析による比較によっても確認することができる。
【0040】
本明細書において、特定の遺伝子を「発現」するとは、該遺伝子を構成する核酸分子が少なくともＲＮＡ分子へ転写されることをいい、ポリペプチドをコードする遺伝子の場合には、該遺伝子を構成する核酸分子がＲＮＡ分子へ転写され、該ＲＮＡ分子がポリペプチドに翻訳されることをいう。
【0041】
遺伝子の発現レベルは、当該技術分野における公知の方法、例えばノーザンブロット、定量的ＰＣＲなどによって確認することができる。
【0042】
本明細書において、特定の酵素（タンパク質）を「発現」するとは、該酵素のポリペプチドをコードする核酸分子からＲＮＡ分子への転写および該ＲＮＡ分子からポリペプチドへの翻訳が正常に行われ、活性を有する酵素が生み出されて細胞内または細胞外に存在する状態となることをいう。
【0043】
酵素の発現レベルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなど公知の手法を用いて検出および定量することによって確認することができる。また、酵素活性のアッセイによっても確認することができる。
【0044】
次に、本発明に使用される、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」（遺伝子３）、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」（遺伝子１）、「オキシドリダクターゼをコードする遺伝子」（遺伝子２）、「５－アミノレブリン酸シンターゼをコードする遺伝子」（遺伝子４）、および「ＣＰＲをコードする遺伝子」（遺伝子５）について説明する。
【0045】
ＳＴＯＲＲは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓоｍｎｉｆｅｒｕｍ）由来の酵素であり、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換するエピメラーゼである。ＳＴＯＲＲは、ＣＹＰ８０Ｙ２のドメインとオキシドリダクターゼのドメインとを備えた融合ポリペプチドである。なお、配列番号９はＳＴＯＲＲのアミノ酸配列である。
【0046】
本発明に使用される「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」は、これらに限定されないが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡであってよい：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換するエピメラーゼ活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換するエピメラーゼ活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換するエピメラーゼ活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＳＴＯＲＲの酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換するエピメラーゼ活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【0047】
本発明において、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」としては、上記（ａ）～（ｃ）のうち、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが好適に使用される。
【0048】
ＣＹＰ８０Ｙ２は、Ｐ４５０酵素である。ＣＹＰ８０Ｙ２は、例えば、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性を有する。本発明の一実施形態において、ＣＹＰ８０Ｙ２は、例えば、上述のＳＴＯＲＲに含まれるＣＹＰ８０Ｙ２のドメインが、オキシドリダクターゼのドメインと分けられたものであってよい。配列番号１１に示したアミノ酸配列に開始メチオニンを加えたものが、このようにして得られるＣＹＰ８０Ｙ２（なお、配列番号１１に示したアミノ酸配列は、更にＮ末疎水性領域を削除したものである）のアミノ酸配列である。配列番号１０は、本実施の形態において削除したＮ末疎水性領域のアミノ酸配列である。ＳＯＳＵＩ解析ではＮ末疎水性領域のアミノ酸配列はＰＴＳＳＶＶＡＬＬＬＡＬＶＳＩＬＳＳＶＶＶであるが、本実施の形態では開始コドンから削除した。Ｎ末端疎水性領域をコードするヌクレオチド配列を削除するとともに、開始コドン配列（ａｔｇ）が挿入され、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子の直前までの配列に終始コドン配列（ｔａａ）が導入されることにより、配列番号１１に示したアミノ酸配列に開始メチオニンを加えたＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子が得られる。
【0049】
本発明に使用される「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」は、これらに限定されないが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡであってよい：
（ａ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性（例えば、（Ｓ）－レチクリンを酸化して１，２－デヒドロレチクリニウムを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【0050】
本発明において、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」としては、上記（ａ）～（ｃ）のうち、（ａ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが好適に使用される。
【0051】
本発明で使用される「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」は、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質のＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列が削除されたものであってもよい。Ｎ末疎水性領域の塩基配列が削除（カット）されることで、膜貫通領域が削除される。
【0052】
「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」のＮ末疎水性領域の塩基配列の削除は、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」のＮ末疎水性領域の塩基配列の削除によって行われてもよい。すなわち、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」は、Ｎ末側にＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子を有し、Ｃ末側にオキシドリダクターゼをコードする遺伝子を有しているため、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」のＮ末疎水性領域の塩基配列を削除すれば、該ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子のＮ末疎水性領域の塩基配列が削除されたこととなる。
【0053】
本発明において、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」（または「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」）の「Ｎ末疎水性領域」とは、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」（または「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」）のＮ末端側に存在する疎水性領域のことであり、例えば、配列番号８に示される塩基配列である。
【0054】
本発明でいうオキシドリダクターゼは、上述のＳＴＯＲＲに含まれるオキシドリダクターゼのドメインと同等の酵素活性を有する酸化還元酵素である。本発明の一実施形態において、オキシドリダクターゼは、例えば、上述のＳＴＯＲＲに含まれるオキシドリダクターゼのドメインが、ＣＹＰ８０Ｙ２のドメインと分けられたものであってよい。配列番号１２は、このようにして得られるオキシドリダクターゼのアミノ酸配列である。
【0055】
本発明に使用される「オキシドリダクターゼをコードする遺伝子」は、これらに限定されないが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡであってよい：
（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性（例えば、１，２－デヒドロレチクリニウムを還元して（Ｒ）－レチクリンを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性（例えば、１，２－デヒドロレチクリニウムを還元して（Ｒ）－レチクリンを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性（例えば、１，２－デヒドロレチクリニウムを還元して（Ｒ）－レチクリンを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、オキシドリダクターゼの酵素活性（例えば、１，２－デヒドロレチクリニウムを還元して（Ｒ）－レチクリンを生成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【0056】
本発明において、「オキシドリダクターゼをコードする遺伝子」としては、上記（ａ）～（ｃ）のうち、（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが好適に使用される。
【0057】
５－アミノレブリン酸シンターゼ１（５－ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １）は、スクシニルＣｏＡとグリシンを基質とし、ピリドキサールリン酸を補酵素として５－アミノレブリン酸を合成する酵素である。
【0058】
本発明に使用される「５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子」は、これらに限定されないが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡであってよい：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性（例えば、スクシニルＣｏＡとグリシンを基質とし、ピリドキサールリン酸を補酵素として５－アミノレブリン酸を合成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号４のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性（例えば、スクシニルＣｏＡとグリシンを基質とし、ピリドキサールリン酸を補酵素として５－アミノレブリン酸を合成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性（例えば、スクシニルＣｏＡとグリシンを基質とし、ピリドキサールリン酸を補酵素として５－アミノレブリン酸を合成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号４のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性（例えば、スクシニルＣｏＡとグリシンを基質とし、ピリドキサールリン酸を補酵素として５－アミノレブリン酸を合成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【0059】
本発明において、「５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子」としては、上記（ａ）～（ｃ）のうち、（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが好適に使用される。
【0060】
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるＤＮＡである遺伝子は、ＨｅｍＡ遺伝子と呼ばれる。ＨｅｍＡ遺伝子は、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）の、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子である。
【0061】
ＣＰＲ（ＮＡＤＰＨ－－ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ２）は、ミクロソームにおいてＮＡＤＰからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達するための酵素である。またヘムオキシゲナーゼおよびチトクロムＢ５へ電子を伝達する役割を担う。
【0062】
本発明に使用される「ＣＰＲをコードする遺伝子」は、これらに限定されないが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡであってよい：
（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＰＲの酵素活性（例えば、ミクロソームにおいてＮＡＤＰからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性（例えば、ミクロソームにおいてＮＡＤＰからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＰＲの酵素活性（例えば、ミクロソームにおいてＮＡＤＰからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ＣＰＲの酵素活性（例えば、ミクロソームにおいてＮＡＤＰからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【0063】
本発明において、「ＣＰＲをコードする遺伝子」としては、上記（ａ）～（ｃ）のうち、（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが好適に使用される。
【0064】
（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡである遺伝子は、ＡＴＲ２遺伝子と呼ばれる。ＡＴＲ２遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＣＰＲをコードする遺伝子である。
【0065】
「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、各配列番号のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと７０％以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに８０％以上の相同性を有することが好ましく、９０％以上の相同性を有することがより好ましく、９５％以上の相同性を有することが更により好ましい。
【0066】
上記遺伝子は、当業者に周知のＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術によって取得することが可能である。また上記遺伝子は、ＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行うことができる。
【0067】
（（Ｒ）－レチクリンの生産方法）
本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法を説明する。
本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法を説明する。
【0068】
図１は、本発明において宿主細胞中に再構築される（Ｒ）－レチクリンの生合成経路を示す。括弧は各培養工程の個々の株における反応を示す。本発明では、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換することで（Ｒ）－レチクリンを生産する。略語は以下の通りである：ＴＹＲ、チロシナーゼ；ＤＤＣ、ドーパデカルボキシラーゼ；ＭＡＯ、モノアミンオキシダーゼ；３，４－ＤＨＰＡＡ、３，４－ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド；ＳａｌＳ、サルタリジンシンターゼ；ＳａｌＲ、サルタリジンレダクターゼ；ＳａｌＡＴ、サルタリジノールアセチルトランスフェラーゼ；ＳＰＴ（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）。
【0069】
【0070】
本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへ変換するものであり、（Ｓ）－レチクリンは予め従前の方法に従い用意されている。本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、例えば、下記ステップ１～４を、この順に行うものである。ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子（遺伝子３）を、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子（遺伝子１）と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子（遺伝子２）とに分けるステップ（ステップ１）。ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子（遺伝子１）と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子（遺伝子２）とを宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップ（ステップ２）。組換え宿主細胞において、遺伝子１にコードされたＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質と、遺伝子２にコードされたオキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ（ステップ３）。組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップ（ステップ４）。
【0071】
なお、上述のステップ１は省略することができる。すなわち、本発明の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、例えば、下記ステップ２～４を、この順に行うものであってもよい。ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子（遺伝子１）と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子（遺伝子２）と、を宿主細胞に挿入して組換え宿主細胞を得るステップ（ステップ２）。組換え宿主細胞において、遺伝子１にコードされたＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質と、遺伝子２にコードされたオキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質を発現させるステップ（ステップ３）。組換え宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させるステップ（ステップ４）。
【0072】
宿主細胞が原核生物（例えば大腸菌）の場合の（Ｒ）－レチクリンの生産方法は、以下の通りである。
【0073】
「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」（遺伝子３）は、予めそのＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列が削除される（ステップＡ）。より具体的には、「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」のうち、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子のＮ末疎水性領域が削除（カット）されることで、膜貫通領域が削除されるとともに、開始コドン配列（ａｔｇ）が挿入され、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子の直前までの配列に終始コドン配列（ｔａａ）が導入されている。
【0074】
「ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子」（遺伝子３）を、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」（遺伝子１）と、「オキシドリダクターゼをコードする遺伝子」（遺伝子２）とに分ける（ステップＢ）。
【0075】
「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」（遺伝子１）と、「オキシドリダクターゼをコードする遺伝子」（遺伝子２）と、「５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子」（遺伝子４）と、「ＣＰＲをコードする遺伝子」（遺伝子５）を宿主細胞に導入して、組換え宿主細胞を得る（ステップＣ）。これらの遺伝子の導入は、必ずしもこの順番で行われる必要はない。同時に行われてもよく、順番が入れ替わってもよい。
【0076】
組換え宿主細胞において、遺伝子１にコードされたＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質と、遺伝子２にコードされたオキシドリダクターゼの酵素活性を有するタンパク質と、遺伝子４にコードされた５－アミノレブリン酸シンターゼ１の酵素活性を有するタンパク質と、遺伝子５にコードされたＣＰＲの酵素活性を有するタンパク質を発現させる（ステップＤ）。宿主細胞によって、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを生産させる（ステップＥ）。
【0077】
なお、上述のステップＡ及びステップＢは省略することができる。また、ステップＡ及びステップＢに代えて、ＣＹＰ８０Ｙ２の酵素活性を有するタンパク質のＮ末疎水性領域をコードするヌクレオチド配列を、「ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子」（遺伝子１）から削除するステップ（ステップＸ）を実施してもよい。
【実施例】
【0078】
本発明の方法により行われた一実施例を説明する。以下の実施例は、本発明を例示的に説明するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【0079】
（材料）
すべての合成遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．から入手した。（Ｓ）－レチクリンは、先行技術（例えば、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ）に記載の方法に従って作製した。
すべての合成遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．から入手した。（Ｓ）－レチクリンは、先行技術（例えば、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ）に記載の方法に従って作製した。
【0080】
（発現ベクターの構築）
（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを合成する経路を再構築するため、各種の遺伝子を含む発現ベクターを複数構築した。
（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを合成する経路を再構築するため、各種の遺伝子を含む発現ベクターを複数構築した。
【0081】
本実施例では、配列表の配列番号１に示すＳＴＯＲＲをコードする遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０ＤＫＩ７）から分断された、配列番号２に示すＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子と、配列番号３に示すオキシドリダクターゼをコードする遺伝子が使用された。また、配列番号４に示した、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０４５１２）と、配列番号５に示した、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＳＵＭ３）が使用された。各遺伝子はコドンを大腸菌用に最適化している。
【0082】
Ｔ７プロモーターによる制御を実現するため、いずれの遺伝子もｐＥＴ２３ａのＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位に挿入した。遺伝子を連結する場合、先にｐＥＴ２３ａのＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位に、前につなぎたい遺伝子を挿入し、ＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位の下流に位置するＸｈｏＩ部位に、後ろにつなぎたい遺伝子を挿入して、発現ベクターを作成した。例えば、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子の後ろにオキシドリダクターゼをコードする遺伝子を挿入する場合、先にｐＥＴ２３ａのＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位にＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子を挿入することで、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子を含む発現ベクターである、ＣＹＰ８０Ｙ２／ｐＥＴ２３ａを作成した。そして、表１に示すｐｒ５７６（配列番号６）とｐｒ５７７（配列番号７）のプライマーを用いて、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子をＰＣＲで増幅した。その後、ＣＹＰ８０Ｙ２／ｐＥＴ２３ａのＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位の下流に位置するＸｈｏＩ部位に、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子をＩｎｆｕｓｉｏｎによって挿入して、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子とを含む発現ベクターである、ＣＹＰ８０Ｙ２－ＯｘｉＲｅｄ／ｐＥＴ２３ａを作成した。
【0083】
【表1】
【0084】
本実施例では、上記同様の方法により、発現ベクターとして、ＣＹＰ８０Ｙ２Ｎｃｕｔ－ＯｘｉＲｅｄ／ｐＥＴ２３ａと、ＡＴＲ２／ｐＣＤＦ２３と、ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３と、ＡＴＲ２－ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３とを構築した。
【0085】
ＣＹＰ８０Ｙ２Ｎｃｕｔ－ＯｘｉＲｅｄ／ｐＥＴ２３ａとは、Ｎ末疎水性領域が削除されたＣＹＰ８０Ｙ２がコードされた遺伝子と、オキシドリダクターゼがコードされた遺伝子とを含む、ｐＥＴ２３ａプラスミドに基づく発現ベクターである。
ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３とは、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子を含む、ｐＣＤＦ２３プラスミドに基づく発現ベクターである。
ＡＴＲ２／ｐＣＤＦ２３とは、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子を含む、ｐＣＤＦ２３プラスミドに基づく発現ベクターである。
ＡＴＲ２－ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３とは、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子と、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子を含む、ｐＣＤＦ２３プラスミドに基づく発現ベクターである。
ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３とは、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子を含む、ｐＣＤＦ２３プラスミドに基づく発現ベクターである。
ＡＴＲ２／ｐＣＤＦ２３とは、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子を含む、ｐＣＤＦ２３プラスミドに基づく発現ベクターである。
ＡＴＲ２－ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３とは、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子と、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子を含む、ｐＣＤＦ２３プラスミドに基づく発現ベクターである。
【0086】
次に各種の大腸菌株、ＡＮ２５３４株、ＡＮ４４１５株、ＡＮ４３４０株、ＡＮ４３４１株を作成した。ＡＮ２５３４株は、大腸菌コンピテントセルであるＢＬ２１ＤＥ３株に、ＣＹＰ８０Ｙ２Ｎｃｕｔ－ＯｘｉＲｅｄ／ｐＥＴ２３ａを導入した株である。ＡＮ４４１５株は、ＡＮ２５３４株に空ベクターであるｐＣＤＦ２３を導入した株である。ＡＮ４３４０株は、ＡＮ２５３４株にＡＴＲ２／ｐＣＤＦ２３を導入した株である。ＡＮ４３４１株は、ＡＮ２５３４株にＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３を導入した株である。ＡＮ２０５１は、ＡＮ２５３４株にＡＴＲ２－ＨｅｍＡ／ｐＣＤＦ２３を導入した株である。
【0087】
各大腸菌株を５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）に植菌し、３７℃、１２時間振盪培養後、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含むＴＢ培地（１Ｌあたり：１２ｇ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）、２４ｇ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｆｃｏ）、９．４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ Ｋ２ＨＰＯ４ ａｎｄ ４ｍｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に１／１００量となるように培養液を加えた。２５℃、１２時間培養後ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加え、更に２５℃１２時間振盪培養した。そこに大腸菌を用いて生産した３２０μＭのＳ－レチクリンを含む培養上清（例えば、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎに記載の方法により作製）を当量まぜ、更に２５℃にて１２時間浸透培養した。培養上清を回収し、非特許文献１及び２に記載された方法により、レチクリンのキラリティーを観察した。結果を表２に示した。
【0088】
【表2】
【0089】
表２に示すように、Ｎ末疎水性領域が削除されたＣＹＰ８０Ｙ２がコードされた遺伝子と、オキシドリダクターゼがコードされた遺伝子と、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子と、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子とを導入したＡＮ２０５１株のみが（Ｒ）－レチクリンを作ることができる。
【0090】
図３は、本実施の形態における（Ｒ）－レチクリンの生成を示すＬＣ－ＭＳ解析結果である。図３（ａ）は、配列番号１に示したＳＴＯＲＲをコードする遺伝子を全長のまま（すなわちＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子とに分けずに）宿主細胞に導入した結果である。図３（ｂ）は、配列番号１に示したＳＴＯＲＲをコードする遺伝子を、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子とに分けて宿主細胞に導入した結果である。図３（ｃ）は、これらの試料を重ねうちした結果であり、図３（ａ）のピークと、図３（ｂ）のピークが重なっていないことを示す図である。
【0091】
図３（ａ）に示したように、ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子を全長のまま宿主細胞に導入しても、（Ｒ）－レチクリンを生成することはできないことが示された。そして図３（ｂ）に示したように、ＳＴＯＲＲをコードする遺伝子を、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子とに分けて宿主細胞に導入することで、（Ｒ）－レチクリンを得ることができることが示された。すなわちＳＴＯＲＲの２つのドメインを分けて発現させると強い活性が得られ、十分量（～１００μＭ）の（Ｒ）－レチクリンの生産が可能となった。
【0092】
また、表２および図３の結果から、Ｎ末疎水性領域が削除されたＣＹＰ８０Ｙ２がコードされた遺伝子と、オキシドリダクターゼがコードされた遺伝子と、５－アミノレブリン酸シンターゼ１をコードする遺伝子であるＨｅｍＡ遺伝子と、ＣＰＲをコードする遺伝子であるＡＴＲ２遺伝子とを宿主細胞に導入することで、（Ｒ）－レチクリンを著しく高い転換効率で得ることができることが示された。
【0093】
本実施例では、宿主細胞として原核生物を用いたが、これに限定されない。すなわち、宿主細胞として真核生物を用いることも可能である。真核生物ではＰ４５０酵素や、サルタジン合成酵素（ＳａｌＳ）が機能的に発現しているため、より容易に（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリン産生させることが可能である。例えば、真核生物（酵母）に、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子と、オキシドリダクターゼをコードする遺伝子とを導入すると、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを産生すると考えられる。また当然、真核生物（酵母）に、ＣＹＰ８０Ｙ２をコードする遺伝子とオキシドリダクターゼをコードする遺伝子に加えて、ＡＴＲ２をコードする遺伝子及び／またはＨｅｍＡをコードする遺伝子を導入しても、（Ｓ）－レチクリンから（Ｒ）－レチクリンを産生すると考えられる。このように、本発明はその趣旨を逸脱しない範囲において適用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】