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特許7650538血液由来エクソソームから見出した新規アルツハイマー病診断用バイオマーカー及びそれを用いたアルツハイマー病診断方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-14
(45)【発行日】2025-03-25
(54)【発明の名称】血液由来エクソソームから見出した新規アルツハイマー病診断用バイオマーカー及びそれを用いたアルツハイマー病診断方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20250317BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20250317BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20250317BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 D
G01N33/53 M
C12N15/11 Z
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2023532800
(86)(22)【出願日】2021-11-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-07
(86)【国際出願番号】 KR2021017876
(87)【国際公開番号】W WO2022114920
(87)【国際公開日】2022-06-02
【審査請求日】2023-07-18
(31)【優先権主張番号】10-2020-0164819
(32)【優先日】2020-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】518229021
【氏名又は名称】ピーシーエル インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＣＬ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】（Ｇａｓａｎ－ｄｏｎｇ， ＳｔａｒＶａｌｌｅｙ） Ｎｏ． ７０１， ９９， Ｄｉｇｉｔａｌ－ｒｏ ９ｇｉｌ， Ｇｅｕｍｃｈｅｏｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】パク、ゴンジュ
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００５／０２５０１２２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０２１－０１２１８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１９８６１８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１０８５０３（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
Ｃ１２Ｎ １５／１１
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＰＯＡ４及びＩＴＧＢ３をマーカータンパク質として含み、ＡＰＯＡ４がＭＣＩ（軽度認知障害）特異的マーカータンパク質である、アルツハイマー病診断用マーカー組成物。
【請求項2】
前記マーカータンパク質はＣＲＰをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
アルツハイマー病と軽度認知障害とを区別するためのマーカー組成物であって、前記組成物は、マーカータンパク質としてＡＰＯＡ４及びＩＴＧＢ３を含み、ＡＰＯＡ４がＭＣＩ（軽度認知障害）特異的マーカータンパク質である、前記組成物。
【請求項4】
アルツハイマー病と軽度認知障害とを区別する方法であって、（ａ）アルツハイマー病の発症が疑われるヒトを除く個体の血清試料において、マーカータンパク質であるＡＰＯＡ４及びＩＴＧＢ３の発現レベルを定量分析するステップと、
（ｂ）前記定量分析したマーカータンパク質のレベルを、アルツハイマー病と軽度認知障害との区別に関連付けるステップとを含み、
前記関連付けるステップは、アルツハイマー病の進行段階を確認することを含み、
前記進行段階は、正常、ＭＣＩ（軽度認知障害）、及びＡＤ（アルツハイマー病）のいずれかである、方法。
【請求項5】
アルツハイマー病発症有無診断用キットであって、前記キットは、ＡＰＯＡ４及びＩＴＧＢ３の発現レベルを測定する定量装置を含み、前記キットは、アルツハイマー病の進行段階を確認するためのものであり、前記進行段階は、正常、ＭＣＩ（軽度認知障害）、及びＡＤ（アルツハイマー病）のいずれかである、キット。
【請求項6】
アルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法であって、（ａ）アルツハイマー病の発症が疑われるヒトを除く個体の血清試料において、マーカータンパク質であるＡＰＯＡ４及びＩＴＧＢ３の発現レベルを定量分析するステップと、
（ｂ）前記定量分析したマーカータンパク質のレベルをアルツハイマー病発症有無判別に関連付けるステップとを含み、
前記関連付けるステップは、アルツハイマー病の進行段階を確認することを含み、
前記進行段階は、正常、ＭＣＩ（軽度認知障害）、及びＡＤ（アルツハイマー病）のいずれかである、方法。
【請求項7】
前記関連付けるステップは、各マーカータンパク質の定量分析結果を組み合わせて行うものである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記定量分析結果の組み合わせは、線形又は非線形回帰分析法、線形又は非線形分類分析法、ＡＮＯＶＡ、ニューラルネットワーク分析法、遺伝的分析法、サポートベクターマシン分析法、階層分析又はクラスター分析法、決定木アルゴリズム又はカーネル主成分分析法、マルコフブランケット、再帰的特徴量削減（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）又はエントロピーベースの再帰的特徴量削減分析法、前方フローティングサーチ（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）又は後方フローティングサーチ（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）分析法、それらの組み合わせからなる群から選択される分析法を用いて行うものである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記定量分析結果の組み合わせは、コンピュータアルゴリズムを用いて行うものである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液由来エクソソームから見出した新規アルツハイマー病診断用バイオマーカー及びそれを用いたアルツハイマー病診断方法に関し、より具体的には、本発明は、エクソソーム由来新規アルツハイマー病診断用バイオマーカー、前記バイオマーカーを含むアルツハイマー病診断用組成物、前記組成物を含むアルツハイマー病診断用キット、及び前記バイオマーカー、組成物又はキットを用いるアルツハイマー病診断のための情報提供方法に関する。
【背景技術】
【0002】
認知症の６０～７０％を占める退行性脳疾患であるアルツハイマー病は、老人において最も多く現れる代表的な疾患であり、６５～７４歳で１０％、７５～８４歳で１９％、８５歳以上では４７％が発症し、その発症率が年々増加しており、大きな社会問題となっている。
【0003】
従来の製品は、従来のアルツハイマー病研究において確認されたアミロイドβ（Amyloid β peptide）、総タウ（tau）、リン酸化タウ（phosphorylated tau）タンパク質の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットにより単に当該タンパク質に関する情報を提供するだけであり、診断にはそれほど役に立っていない現状である。
【0004】
アルツハイマー病診断キットにおける先導的製品の市場占有率及び認知度は僅かなものであり、１つのバイオマーカーによるアルツハイマー病の診断における正確度が低いので、アルツハイマー病の診断用バイオマーカーパネルを形成して診断率を高めることが求められている。
【0005】
一方、エクソソーム由来抽出物は、一般のプラズマ抽出物よりも疾病とバイオマーカーの関連性が明確であり、高純度に精製することができるので、エクソソーム由来抽出物からバイオマーカーを見出す研究が盛んに行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】韓国登録特許第１０－１２７４７６５号公報
【文献】韓国登録特許第１０－０７８４４３７号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１５４７６４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、より信頼性の高い血液由来エクソソームから新規アルツハイマー病診断用バイオマーカーを見出し、それを用いてアルツハイマー病の診断に必要な情報を提供する方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、血液由来エクソソームから見出した新規アルツハイマー病診断用バイオマーカーを提供することを主な目的とする。
また、本発明は、前記バイオマーカー、組成物又はキットを用いてアルツハイマー病診断に必要な情報を提供する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記バイオマーカー、組成物又はキットを用いてアルツハイマー病診断に必要な情報を提供する方法を提供することを目的とする。
【0009】
さらに、本発明は、前記バイオマーカーの発現レベルを測定する製剤を含むアルツハイマー病診断用組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記組成物を含むアルツハイマー病診断用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記組成物を含むアルツハイマー病診断用キットを提供することを目的とする。
【0010】
さらに、本発明は、前記バイオマーカー、組成物又はキットを用いてアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、アルツハイマー病診断用組成物の作製のための前記アルツハイマー病診断用バイオマーカーの用途を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、アルツハイマー病診断用組成物の作製のための前記アルツハイマー病診断用バイオマーカーの用途を提供することを目的とする。
【0011】
さらに、本発明は、アルツハイマー病診断のための前記アルツハイマー病診断用組成物の用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0012】
本発明において提供するアルツハイマー病診断用バイオマーカーを用いると、アルツハイマー病の診断率が高くなるだけでなく、アルツハイマー病の進行段階（正常、ＭＣＩ及びＡＤ）に応じて細分化された診断により、正確性、感度及び特異性を向上させることができるので、効果的なアルツハイマー病の診断、さらにはアルツハイマー病の治療に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明において提供するアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法を示す概略図である。
【図2a】エクソソームサンプルのプロテオミクス１次及び２次分析結果を増加又は減少するマーカーに区分して示す図である。
【図2b】エクソソームサンプルのプロテオミクス１次及び２次分析結果を増加又は減少するマーカーに区分して示す図である。
【図3】プロテオミクス１次及び２次分析結果において増減タイプが大幅に重なるバイオマーカー６種（ＭＹＨ９、ＴＳＰ１、ＴＥＲＡ、ＡＰＯＭ、ＡＰＯＣ３及びＡＰＯＡ４）を示す図である。
【図4a】正常群において発現差異が最も低く、軽度認知障害、アルツハイマー病の順に高くなる傾向を示す候補で設定したパターンである。
【図4b】軽度認知障害において特異的に高くなる傾向を示す候補で設定したパターンである。
【図4c】アルツハイマー病において特異的に高くなる傾向を示す候補で設定したパターンである。
【図4d】正常群において最も高い発現を示す候補で設定したパターンである。
【図5】標的ペプチドのトランジションを選択する過程を要約した概略図である。
【図6】ターゲットＳＩＳペプチドに対するトランジション最適化過程を要約した概略図である。
【図7】最適化が終了した最終ＳＩＳペプチドを用いてＭＲＭ分析を行った結果を示すグラフである。
【図8a】ＡＤ特異的試料のＡｕＤＩＴ分析によりトランジション発現差異を確認及び検証した結果を示すグラフである。
【図8b】ＭＣＩ特異的試料のＡｕＤＩＴ分析によりトランジション発現差異を確認及び検証した結果を示すグラフである。
【図9】トレーニングセット（Ｔｒａｉｎｉｎｇ ｓｅｔ）の個別試料分析結果を示すグラフである。
【図10】個別試料分析によるバイオマーカー候補１及び候補５のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図11】アルツハイマー病の各進行段階において３種のバイオマーカー（ＩＴＧＢ３、ＡＰＯＡ４及びＣＲＰ）の発現量を分析した結果を示すグラフである。
【図12】８つのクローン抗体を対象にサンドイッチＥＬＩＳＡによりペアテストを行った結果を示す図である。
【図13】８つのクローン抗体を対象にサンドイッチＥＬＩＳＡによりペアテストを行った結果を示すグラフである。
【図14a】抗原抗体親和性の測定過程を示す概略図である。
【図14b】抗体１と抗原の親和性の測定結果を示す図である。
【図14c】抗体３と抗原の親和性の測定結果を示す図である。
【図14d】抗体６と抗原の親和性の測定結果を示す図である。
【図15】アルツハイマー病診断キットの開発及び性能テスト過程を示す概略図である。
【図16】アルツハイマー病診断キットに含まれるバイオマーカーの組み合わせを示す概略図である。
【図17】アルツハイマー病に関連するマーカーＴａｕの例を挙げて模式化したキット作製の際に、バイオマーカー固定化後にアッセイを行う過程を示す概略図である。
【図18】バイオマーカー３種の固定化順序を示す概略図である。
【図19】固定化する抗体の濃度差によるＳｐｏｔの形状条件を確立する過程を示す写真である。
【図20a】ＡＰＯＡ４固定化条件探索実験の結果を示す写真である。
【図20b】前記ＡＰＯＡ４固定化組成のうち最も適するものと思われる条件について低力価、中力価、高力価検体によりテストした結果を示す図である。
【図21】ＩＴＧＢ３スクリーニングテストを行った結果を示す写真である。
【図22】ＣＲＰマーカーを対象に固定化テストを行った結果を示す写真及び図である。
【図23】ＡＰＯＡ４、ＣＲＰ、ＩＴＧＢ３における具体的な固定化組成を示す図である。
【図24】３種のマーカーのｓｐｏｔｔｉｎｇ後に固定した抗体を安定化させる条件をテストした結果を示す写真である。
【図25】３種のマーカーのｓｐｏｔｔｉｎｇ後に固定した抗体を対象にブロッキングテストを行った結果を示す写真である。
【図26】３種のマーカーのｓｐｏｔｔｉｎｇ後に固定した抗体を対象にｄｒｙテストを行った結果を示す写真である。
【図27】検体希釈液の条件をテストした結果を示す写真である。
【図28】接合体希釈液の条件をテストした結果を示す写真である。
【図29a】ＩＴＧＢ３に対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す写真及び図である。
【図29b】ＡＰＯＡ４に対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す写真及び図である。
【図29c】ＣＲＰに対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す写真である。
【図30】最終作製キットを用いて実検体を分析した結果を示す写真である。
【図31】ＩＴＧＢ３マーカーを対象にした相関関係分析結果を示すグラフである。
【図32】ＡＰＯＡ４マーカーを対象にした相関関係分析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
上記目的を達成するための本発明の一実施形態は、ＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含むアルツハイマー病診断用バイオマーカーを提供する。
【0015】
本出願人の有する中核技術であるＳＧ Ｃａｐテクノロジーを用いて、単一バイオマーカーではなく、従来のマーカーと新たに見出されたマーカーを同時に検出することのできる多重バイオマーカー診断キットを開発することにより、従来の単一バイオマーカーキットでは不足していた診断の正確性、感度及び特異性を向上させることができるものと予想される。当該中核技術の内容は特許文献１、２及び３に記載されている。
【0016】
本発明者らは、アルツハイマー病の発症有無を客観的に評価して診断する方法を開発するために、血清中のタンパク質のうちアルツハイマー病の発症有無により発現レベルが変化するタンパク質マーカーを見出すべく、様々な研究を行った。その結果、ＡＰＯＡ４及びＩＴＧＢ３においてアルツハイマー病の発症有無により発現レベルが変化することを確認し、それらをマーカーとして見出した。
【0017】
本発明における「診断」には、特定の疾病もしくは疾患に対する一客体の感受性（susceptibility）を判定すること、一客体が特定の疾病もしくは疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定の疾病もしくは疾患を有している一客体の予後（prognosis）を判定すること、又はセラメトリックス（therametrics）（例えば、治療効果に関する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること）が含まれる。
【0018】
本発明におけるアルツハイマー病診断は、目的とする患者がアルツハイマー病を発症しているか否かを客観的に判別する行為、又はアルツハイマー病を発症している場合はその進行レベルを客観的に判別する行為を意味するものと解釈される。
【0019】
本発明における「ＡＰＯＡ４（Apolipoprotein A-IV）」とは、ＡＰＯＡ４遺伝子により発現する血漿タンパク質の一種を意味し、ａｐｏＡ－ＩＶ、ａｐｏＡＩＶ又はａｐｏＡ４ともいう。前記遺伝子から３９６個のアミノ酸で構成されるタンパク質が発現し、その後成熟過程を経て３７６個のアミノ酸で構成される糖タンパク質であるＡＰＯＡ４が発現するが、ほとんどの哺乳動物においては腸で発現し、循環系に分泌されることが知られている。前記ＡＰＯＡ４の具体的なアミノ酸配列又はそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースに報告されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：ＮＰ＿０３１４９４、ＮＭ＿００７４６８、ＮＭ＿０００４８２などに報告されている。
【0020】
本発明における「ＩＴＧＢ３（Integrin β3）」とは、細胞表面タンパク質の一種であるインテグリンを構成するペプチドを意味し、インテグリンは、細胞接着及び細胞表面媒介シグナル伝達に関与することが知られている。前記ＩＴＧＢ３の具体的なアミノ酸配列又はそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースに報告されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：ＮＭ＿０００２１２、ＮＭ＿０１６７８０、ＮＰ＿０００２０３、ＮＰ＿０５８０６０などに報告されている。
【0021】
本発明において提供するアルツハイマー病診断用バイオマーカーは、ＣＲＰをさらに含んでもよい。
本発明における「ＣＲＰ（C-reactive protein）」とは、ヒトの血漿に見られる環状のペンタマータンパク質を意味し、肝臓で合成され、炎症状態のときに血中のＣＲＰの濃度が上昇するので、人体が炎症状態であるか否かを把握する際に検査する手段として頻繁に活用されている。前記ＣＲＰの具体的なアミノ酸配列又はそれをコードする遺伝子の塩基配列情報はＮＣＢＩなどのデータベースに報告されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：ＮＭ＿００７７６８、ＮＰ＿０３１７９４などに報告されている。
本発明における「ＣＲＰ（C-reactive protein）」とは、ヒトの血漿に見られる環状のペンタマータンパク質を意味し、肝臓で合成され、炎症状態のときに血中のＣＲＰの濃度が上昇するので、人体が炎症状態であるか否かを把握する際に検査する手段として頻繁に活用されている。前記ＣＲＰの具体的なアミノ酸配列又はそれをコードする遺伝子の塩基配列情報はＮＣＢＩなどのデータベースに報告されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：ＮＭ＿００７７６８、ＮＰ＿０３１７９４などに報告されている。
【0022】
本発明の他の実施形態は、前記バイオマーカー、組成物又はキットを用いてアルツハイマー病診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
具体的には、本発明のアルツハイマー病発症有無判別に必要な情報を提供する方法は、（ａ）アルツハイマー病の発症が疑われるヒトを除く個体の血清試料においてＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマーカータンパク質の発現レベルを定量分析するステップと、（ｂ）前記定量分析したマーカータンパク質のレベルをアルツハイマー病発症有無判別に関連付けるステップとを含む。
具体的には、本発明のアルツハイマー病発症有無判別に必要な情報を提供する方法は、（ａ）アルツハイマー病の発症が疑われるヒトを除く個体の血清試料においてＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマーカータンパク質の発現レベルを定量分析するステップと、（ｂ）前記定量分析したマーカータンパク質のレベルをアルツハイマー病発症有無判別に関連付けるステップとを含む。
【0023】
本発明における「個体」は、アルツハイマー病を発症したか、発症するリスクのある、マウス、家畜、ヒトなどが含まれる哺乳動物、養殖魚類などであればいかなるものでもよい。
【0024】
本発明において、タンパク質の発現レベルを定量分析するステップは、当業者に周知のいかなる方法を用いてもよい。具体例として、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅（transcription amplification）、自家持続配列複製、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）法などが用いられるが、これらに限定されるものではない。ここで、本発明による前記アルツハイマー病診断用マーカータンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする遺伝子の塩基配列はＮＣＢＩなどのデータベースに公開されているので、当業者であれば前記タンパク質の発現レベルの測定に求められる適切な手段を用いることができる。
【0025】
また、前記各タンパク質は患者のコンディションにより定量分析レベルに偏差が生じるため、前記タンパク質の断片的な定量分析レベルだけではアルツハイマー病発症有無判別に用いることが容易でないので、前記各タンパク質の定量分析レベルを組み合わせて分析することにより、アルツハイマー病の発症有無を判別するのに用いることができる。
【0026】
前記タンパク質に対する各定量分析結果を組み合わせて分析する方法の一例として、血清試料から測定された各タンパク質の定量分析レベルを単独で又は組み合わせてアルツハイマー病発症有無を判別する方法が用いられる。
【0027】
前記タンパク質に対する各定量分析結果を組み合わせて分析する方法の他の例として、通常の統計分析法が用いられる。ここで、統計分析法としては、特にこれらに限定されるものではないが、例えば線形又は非線形回帰分析法、線形又は非線形分類分析法、ＡＮＯＶＡ、ニューラルネットワーク分析法、遺伝的分析法、サポートベクターマシン分析法、階層分析又はクラスター分析法、決定木アルゴリズム又はカーネル主成分分析法、マルコフブランケット、再帰的特徴量削減（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）又はエントロピーベースの再帰的特徴量削減分析法、前方フローティングサーチ（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）又は後方フローティングサーチ（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）分析法などが単独で又は組み合わせて用いられる。
【0028】
また、前記定量分析結果の組み合わせは、これらの統計方法を自動的に行うコンピュータアルゴリズムを用いて行ってもよい。
本発明において提供するアルツハイマー病発症有無判別に必要な情報を提供する方法は、（ａ）ステップにおいて、ＣＲＰタンパク質の発現レベルを定量分析するステップをさらに含んでもよい。
本発明において提供するアルツハイマー病発症有無判別に必要な情報を提供する方法は、（ａ）ステップにおいて、ＣＲＰタンパク質の発現レベルを定量分析するステップをさらに含んでもよい。
【0029】
本発明のさらに他の実施形態は、前記バイオマーカーの発現レベルを測定する製剤を含むアルツハイマー病診断用組成物を提供する。
本発明における「発現レベルを測定する製剤」とは、前記タンパク質又はそれをコードするｍＲＮＡに特異的に結合して認識できるようにするか、又はｍｉＲＮＡを増幅する製剤を意味する。具体例として、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、前記ｍｉＲＮＡに特異的に結合するプライマー又はプローブが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者であれば発明の目的に合わせて適切な製剤を選択することができる。
本発明における「発現レベルを測定する製剤」とは、前記タンパク質又はそれをコードするｍＲＮＡに特異的に結合して認識できるようにするか、又はｍｉＲＮＡを増幅する製剤を意味する。具体例として、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、前記ｍｉＲＮＡに特異的に結合するプライマー又はプローブが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者であれば発明の目的に合わせて適切な製剤を選択することができる。
【0030】
前記製剤は、前記タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベル測定のために、直接又は間接的に標識される。具体的には、前記標識には、リガンド、ビーズ（bead）、放射性核種、酵素、基質、補因子、抑制剤、蛍光物質（fluorescer）、化学発光物質、磁性粒子、ハプテン、染料などが用いられるが、これらに限定されるものではない。具体例として、前記リガンドには、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどが含まれ、前記酵素には、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼなどが含まれ、前記蛍光物質には、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、フィコエリトリン、スルホローダミン酸クロリド（テキサスレッド：Texas red）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの検出可能な標識物として、公知の標識物であればほぼいかなるものでも用いることができ、当業者であれば発明の目的に合わせて適切な標識物を選択することができる。
【0031】
本発明における「抗体」とは、タンパク質又はペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合するタンパク質性分子を意味するが、このような抗体は、各遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニングし、前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を得て、得られたタンパク質から通常の方法により作製することができる。前記抗体の形態は特に限定されるものではなく、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、又は抗原結合性を有するものであればその一部も本発明の抗体に含まれ、あらゆる免疫グロブリン抗体が含まれるだけでなく、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。また、前記抗体には、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片も含まれる。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を有する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどである。
【0032】
本発明における「プライマー」とは、短い遊離３’末端のヒドロキシ基（free 3' hydroxyl group）を有する塩基配列であって、相補的な鋳型（template）と塩基対（base pair）を形成することができ、鋳型のコピーのための開始地点として機能する短い配列を意味する。本発明において、前記ｍｉＲＮＡの増幅に用いるプライマーは、適切なバッファー中の適切な条件（例えば、４種の異なるヌクレオチドトリホスフェート、及びＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの重合剤）及び適当な温度下で鋳型指示ＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドであるが、前記プライマーの適切な長さは、使用目的によって異なる。前記プライマー配列は、前記遺伝子のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチド又はその相補的なポリヌクレオチドと完全に相補的である必要はなく、ハイブリダイズできる程度に十分に相補的であればよい。
【0033】
本発明における「プローブ」とは、ｍｉＲＮＡと特異的に結合する標識化（labeling）された核酸断片又はペプチドを意味する。具体例として、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）プローブ、一本鎖ＤＮＡ（single stranded DNA）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（double stranded DNA）プローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド（oligonucleotide peptide）プローブ、ポリペプチドプローブ（polypeptide）などの形態に作製されてもよい。
【0034】
本発明のさらに他の実施形態は、前記バイオマーカーの発現レベルを測定する定量装置を含むアルツハイマー病診断用キットを提供する。
本発明の診断キットに含まれる定量装置は、前記マーカータンパク質の発現レベルを測定するものであってもよい。具体例として、ＲＴ－ＰＣＲキット、ＥＬＩＳＡキットが挙げられるが、ｍｉＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定できるものであれば、これらに限定されるものではない。
本発明の診断キットに含まれる定量装置は、前記マーカータンパク質の発現レベルを測定するものであってもよい。具体例として、ＲＴ－ＰＣＲキット、ＥＬＩＳＡキットが挙げられるが、ｍｉＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定できるものであれば、これらに限定されるものではない。
【0035】
ここで、前記ＲＴ－ＰＣＲキットは、ＲＴ－ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットであってもよい。例えば、ＲＴ－ＰＣＲキットは、前記遺伝子に対する特異的な各プライマー以外にも、テストチューブ又は他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は様々である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑポリメラーゼや逆転写酵素などの酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（DEPC-water）、滅菌水などを含んでもよい。また、定量対照群として用いられる遺伝子に特異的なプライマー対を含んでもよい。
【0036】
本発明のさらに他の実施形態は、前記バイオマーカー、組成物又はキットを用いてアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法を提供する。
具体的には、本発明のアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法は、（ａ）アルツハイマー病の発症が疑われるヒトを除く個体の血清試料においてＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマーカータンパク質の発現レベルを定量分析するステップと、（ｂ）前記定量分析したマーカータンパク質のレベルをアルツハイマー病発症有無判別に関連付けるステップとを含む。
具体的には、本発明のアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法は、（ａ）アルツハイマー病の発症が疑われるヒトを除く個体の血清試料においてＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマーカータンパク質の発現レベルを定量分析するステップと、（ｂ）前記定量分析したマーカータンパク質のレベルをアルツハイマー病発症有無判別に関連付けるステップとを含む。
【0037】
前記方法において、「個体」、「タンパク質の発現レベルの定量分析」、「定量分析結果の組み合わせ」などについては前述した通りである。
本発明において提供するアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法は、（ａ）ステップにおいて、ＣＲＰタンパク質の発現レベルを定量分析するステップをさらに含んでもよい。
本発明において提供するアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法は、（ａ）ステップにおいて、ＣＲＰタンパク質の発現レベルを定量分析するステップをさらに含んでもよい。
【0038】
本発明において提供するアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法において、アルツハイマー病の進行段階は、正常（ＨＣ）－軽度認知障害（ＭＣＩ）－アルツハイマー病（ＡＤ）の順にその深刻度が上昇し、それらの段階を区分して診断するようにしてもよい。例えば、ＡＰＯＡ４は、ＭＣＩ特異的マーカーであり、ＨＣとＡＤとＭＣＩを区分して診断するのに用いることができ、ＩＴＧＢ３は、ＨＣとＡＤを区分して診断するのに用いることができる（図１）。
【0039】
図１は本発明において提供するアルツハイマー病の進行段階を確認するための情報を提供する方法を示す概略図である。
本発明のさらに他の実施形態は、アルツハイマー病診断用組成物又はキットの作製のための前記アルツハイマー病診断用バイオマーカーの用途を提供する。
本発明のさらに他の実施形態は、アルツハイマー病診断用組成物又はキットの作製のための前記アルツハイマー病診断用バイオマーカーの用途を提供する。
【0040】
本発明のさらに他の実施形態は、アルツハイマー病診断のための前記アルツハイマー病診断用組成物又はキットの用途を提供する。
【実施例】
【0041】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0042】
バイオマーカーの選別
アルツハイマー病予測バイオマーカーの候補探索のために、正常群、軽度認知障害患者群、アルツハイマー病患者群の血液からエクソソームを抽出し、同一検体に対してプロテオミクス法により１、２次分析を行った。次に、１次分析と２次分析の結果、正常群と軽度認知障害患者群、アルツハイマー病患者群間のタンパク質増減幅の大きい５０種のバイオマーカーを各次においてそれぞれ選択した。最後に、１、２次の増減タイプが大幅に重なるバイオマーカーを整理した（図２ａ、図２ｂ及び図３）。
アルツハイマー病予測バイオマーカーの候補探索のために、正常群、軽度認知障害患者群、アルツハイマー病患者群の血液からエクソソームを抽出し、同一検体に対してプロテオミクス法により１、２次分析を行った。次に、１次分析と２次分析の結果、正常群と軽度認知障害患者群、アルツハイマー病患者群間のタンパク質増減幅の大きい５０種のバイオマーカーを各次においてそれぞれ選択した。最後に、１、２次の増減タイプが大幅に重なるバイオマーカーを整理した（図２ａ、図２ｂ及び図３）。
【0043】
図２ａ及び図２ｂはエクソソームサンプルのプロテオミクス１次及び２次分析結果を増加又は減少するマーカーに区分して示す図であり、図３はプロテオミクス１次及び２次分析結果において増減タイプが大幅に重なるバイオマーカー６種（ＭＹＨ９、ＴＳＰ１、ＴＥＲＡ、ＡＰＯＭ、ＡＰＯＣ３及びＡＰＯＡ４）を示す図である。
【実施例2】
【0044】
実施例１で選別したバイオマーカーにおけるアルツハイマー病との関連性の検証
実施例１により確保したアルツハイマー病早期診断のためのバイオマーカーの開発のために、スイス（Universite de Geneva, Neurix）から確保したアルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）及び正常な血漿試料を対象にエクソソームの抽出を行い、アルツハイマー病及び軽度認知障害予測バイオマーカーの開発及び検証研究を行った。
実施例１により確保したアルツハイマー病早期診断のためのバイオマーカーの開発のために、スイス（Universite de Geneva, Neurix）から確保したアルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）及び正常な血漿試料を対象にエクソソームの抽出を行い、アルツハイマー病及び軽度認知障害予測バイオマーカーの開発及び検証研究を行った。
【0045】
実施例２－１：バイオマーカー検証前に選択したタンパク質候補群の発現を各パターンに整理する
選択したタンパク質候補群において、アルツハイマー病患者群と軽度認知障害患者群の発現差異の比較により全４種類の発現パターンを構築した（図４ａ～図４ｄ）。
選択したタンパク質候補群において、アルツハイマー病患者群と軽度認知障害患者群の発現差異の比較により全４種類の発現パターンを構築した（図４ａ～図４ｄ）。
【0046】
図４ａは正常群において発現差異が最も低く、軽度認知障害、アルツハイマー病の順に高くなる傾向を示す候補で設定したパターンであり、図４ｂは軽度認知障害において特異的に高くなる傾向を示す候補で設定したパターンであり、図４ｃはアルツハイマー病において特異的に高くなる傾向を示す候補で設定したパターンであり、図４ｄは正常群において最も高い発現を示す候補で設定したパターンである。
【0047】
実施例２－２：バイオマーカー候補群のＭＲＭ検証のために代表ターゲットペプチドとトランジションを選択する
選択したアルツハイマー病及び軽度認知障害疾病予測バイオマーカー候補群に対するＭＲＭ検証のために、各タンパク質を特異的に代表するターゲットペプチドを選択した。当該ペプチドは、検知効率を考慮して約６～２０個のアミノ酸数を含むものとし、タンパク質の翻訳後修飾やトリプシンにより断片化されない配列を含むペプチドは除いた。ＭＲＭ分析の際に定量値を示すプリカーサーイオン（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ）（Ｑ１）とプリカーサーイオン（Ｑ３）の組み合わせであるトランジション（transition）も、研究室で用いる機器であるＡｇｉｌｅｎｔに合わせて５０～１３５０ｍ／ｚの範囲に設定し、１ペプチド当たり少なくとも３つのトランジションを選択した（図５）。
選択したアルツハイマー病及び軽度認知障害疾病予測バイオマーカー候補群に対するＭＲＭ検証のために、各タンパク質を特異的に代表するターゲットペプチドを選択した。当該ペプチドは、検知効率を考慮して約６～２０個のアミノ酸数を含むものとし、タンパク質の翻訳後修飾やトリプシンにより断片化されない配列を含むペプチドは除いた。ＭＲＭ分析の際に定量値を示すプリカーサーイオン（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ）（Ｑ１）とプリカーサーイオン（Ｑ３）の組み合わせであるトランジション（transition）も、研究室で用いる機器であるＡｇｉｌｅｎｔに合わせて５０～１３５０ｍ／ｚの範囲に設定し、１ペプチド当たり少なくとも３つのトランジションを選択した（図５）。
【0048】
図５は標的ペプチドのトランジションを選択する過程を要約した概略図である。
実施例２－３：ＳＩＳペプチドのトランジション最適化過程
ウェブ上のライブラリー（SRMAtlas, National Cancer Institute of Cancer Clinical Proteomics, PeptideAtlas）を参照して、各標的タンパク質当たり少なくとも３つの標的ペプチドを選択した。また、標的ペプチドと同じ配列を有するが、リシンとアルギニンの炭素と窒素に同位元素（１３Ｃと１５Ｎ）で標識したＳＩＳペプチドを優先的に合成して作製した。その後、ＳＩＳペプチドを分析してトランジション最適化を行った（図６）。
実施例２－３：ＳＩＳペプチドのトランジション最適化過程
ウェブ上のライブラリー（SRMAtlas, National Cancer Institute of Cancer Clinical Proteomics, PeptideAtlas）を参照して、各標的タンパク質当たり少なくとも３つの標的ペプチドを選択した。また、標的ペプチドと同じ配列を有するが、リシンとアルギニンの炭素と窒素に同位元素（１３Ｃと１５Ｎ）で標識したＳＩＳペプチドを優先的に合成して作製した。その後、ＳＩＳペプチドを分析してトランジション最適化を行った（図６）。
【0049】
図６はターゲットＳＩＳペプチドに対するトランジション最適化過程を要約した概略図である。
ＳＩＳペプチドにより最適化したトランジションを対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）、軽度認知障害、アルツハイマー病の各グループに分けてプールした試料にＳＩＳペプチドをｓｐｉｋｅ－ｉｎし、同時にＭＲＭ分析を行った。ＳＩＳペプチドとプール試料の同時分析を行うと、正確な溶出時間の把握と絶対定量により標準化が可能である。探知したトランジションは、ＡｕＤＩＴ（Automated Detection of Inaccurate and Imprecise Transition）プログラムの分析再現性（変動係数，ＣＶ＜２０％）と統計的基準値（ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５）を適用し、定量の際に信頼できるトランジションを再検証した（図７）。
ＳＩＳペプチドにより最適化したトランジションを対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）、軽度認知障害、アルツハイマー病の各グループに分けてプールした試料にＳＩＳペプチドをｓｐｉｋｅ－ｉｎし、同時にＭＲＭ分析を行った。ＳＩＳペプチドとプール試料の同時分析を行うと、正確な溶出時間の把握と絶対定量により標準化が可能である。探知したトランジションは、ＡｕＤＩＴ（Automated Detection of Inaccurate and Imprecise Transition）プログラムの分析再現性（変動係数，ＣＶ＜２０％）と統計的基準値（ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５）を適用し、定量の際に信頼できるトランジションを再検証した（図７）。
【0050】
図７は最適化が終了した最終ＳＩＳペプチドを用いてＭＲＭ分析を行った結果を示すグラフである。
ＡｕＤＩＴ分析の結果、２１５個のペプチドに相当する１５７２個のトランジションを個別試料の検証のための最終候補群として選択した。
ＡｕＤＩＴ分析の結果、２１５個のペプチドに相当する１５７２個のトランジションを個別試料の検証のための最終候補群として選択した。
【0051】
実施例２－４：キット開発に用いる最終バイオマーカーを選別し、最終バイオマーカーを患者検体で検証する
個別試料の検証の信頼性を高めるために、全試料を２つの独立したコホートであるトレーニングセットとテストセットに分けて分析を行った。トレーニングセットの個別試料分析の結果に基づいて、多項式回帰分析とＣ統計量によりアルツハイマー病、軽度認知障害、正常群において分析した結果をバイオマーカーの選択の根拠とし、次に示す様々な他の要因まで考慮して最終バイオマーカーを選択した。
個別試料の検証の信頼性を高めるために、全試料を２つの独立したコホートであるトレーニングセットとテストセットに分けて分析を行った。トレーニングセットの個別試料分析の結果に基づいて、多項式回帰分析とＣ統計量によりアルツハイマー病、軽度認知障害、正常群において分析した結果をバイオマーカーの選択の根拠とし、次に示す様々な他の要因まで考慮して最終バイオマーカーを選択した。
【0052】
ここで、一部の個別試料分析の結果、一部の候補群が各疾病群と正常群において有意な発現差異を示すことが確認された（図８ａ及び図８ｂ）。
図８ａはＡＤ特異的試料のＡｕＤＩＴ分析によりトランジション発現差異を確認及び検証した結果を示すグラフであり、図８ｂはＭＣＩ特異的試料のＡｕＤＩＴ分析によりトランジション発現差異を確認及び検証した結果を示すグラフである。
図８ａはＡＤ特異的試料のＡｕＤＩＴ分析によりトランジション発現差異を確認及び検証した結果を示すグラフであり、図８ｂはＭＣＩ特異的試料のＡｕＤＩＴ分析によりトランジション発現差異を確認及び検証した結果を示すグラフである。
【0053】
また、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線によりＡＵＣ値を確認してバイオマーカー候補を検証し、評価基準であるＡＵＣ値が０．７以上になるバイオマーカー候補群を選別した。その後、トレーニングセットにより検証した候補をテストセットの個別試料分析によりアルツハイマー病特異的バイオマーカーを再検証した（図９）。
【0054】
図９はトレーニングセットの個別試料分析結果を示すグラフである。
個別試料を分析した結果に基づいて、ＭＣＩ特異的なバイオマーカー候補５（ＡＰＯＡ）を診断キットに用いるバイオマーカーとして決定した。同じ群に属するＡＰＯＡバイオマーカーであってもＭＳ／ＭＳ結果は異なり、特にＡＰＯＡ４がＭＣＩ特異的であることが確認された（図１０）。
個別試料を分析した結果に基づいて、ＭＣＩ特異的なバイオマーカー候補５（ＡＰＯＡ）を診断キットに用いるバイオマーカーとして決定した。同じ群に属するＡＰＯＡバイオマーカーであってもＭＳ／ＭＳ結果は異なり、特にＡＰＯＡ４がＭＣＩ特異的であることが確認された（図１０）。
【0055】
図１０は個別試料分析によるバイオマーカー候補１及び候補５のＲＯＣ曲線を示す図である。
ＡＤ特異バイオマーカー候補１（ＩＴＧＢ３）においてＲＯＣ値が０．７１であったので、これをＡＰＯＡ４と共に診断キットに用いることに決定した。ＡＤ特異的マーカーは、正常群、ＭＣＩ群、ＡＤ群の順に疾病が悪化するとその発現量が次第に増加するので、アルツハイマー病の診断に有用であると判断して選択した。
ＡＤ特異バイオマーカー候補１（ＩＴＧＢ３）においてＲＯＣ値が０．７１であったので、これをＡＰＯＡ４と共に診断キットに用いることに決定した。ＡＤ特異的マーカーは、正常群、ＭＣＩ群、ＡＤ群の順に疾病が悪化するとその発現量が次第に増加するので、アルツハイマー病の診断に有用であると判断して選択した。
【0056】
最後に、ＣＲＰバイオマーカーも同じウェルに固定した。ＣＲＰはバイオマーカーを選択する際の内部基準であるＲＯＣ値を僅かに下回るが、当該バイオマーカーが炎症反応に関与するという特性と、文献上アルツハイマー病に関連するマーカーであるという点を考慮して、将来的に多くのデータが蓄積されれば、アルツハイマー病と当該バイオマーカーの有意な関連性を検討することにした。
【0057】
実施例２－５：エクソソームのプロテオミクス解析の結果
アルツハイマー病バイオマーカーの探索において、それぞれ正常、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）段階の患者の血液から抽出したエクソソーム（１６ＨＣ，９ＭＣＩ，１７ＡＤ）を同一疾病段階同士プーリングして疾病段階毎に３つのプーリングサンプルを準備し、前述したように確認した３種のバイオマーカー（ＩＴＧＢ３、ＡＰＯＡ４及びＣＲＰ）のプロテオミクス解析を行った（図１１）。
アルツハイマー病バイオマーカーの探索において、それぞれ正常、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）段階の患者の血液から抽出したエクソソーム（１６ＨＣ，９ＭＣＩ，１７ＡＤ）を同一疾病段階同士プーリングして疾病段階毎に３つのプーリングサンプルを準備し、前述したように確認した３種のバイオマーカー（ＩＴＧＢ３、ＡＰＯＡ４及びＣＲＰ）のプロテオミクス解析を行った（図１１）。
【0058】
図１１はアルツハイマー病の各進行段階において３種のバイオマーカー（ＩＴＧＢ３、ＡＰＯＡ４及びＣＲＰ）の発現量を分析した結果を示すグラフである。
図１１に示すように、アルツハイマー病の各進行段階において３種のバイオマーカーの発現量がそれぞれ異なるパターンであるので、前記３種のバイオマーカーの発現量パターンによりアルツハイマー病の進行段階を診断できるものと分析される。
図１１に示すように、アルツハイマー病の各進行段階において３種のバイオマーカーの発現量がそれぞれ異なるパターンであるので、前記３種のバイオマーカーの発現量パターンによりアルツハイマー病の進行段階を診断できるものと分析される。
【実施例3】
【0059】
検証したバイオマーカーに対する８種の抗体の開発及びサンドイッチＥＬＩＳＡによる抗体ペアの選択
選択したＭＣＩに特異的なバイオマーカーであるＡＰＯＡ４を診断に用いるために、まず抗体を作製した。ＡＰＯＡ４を除く他の２種のバイオマーカーであるＩＴＧＢ３とＣＲＰの抗体は、作製して用いるのではなく、市販されている抗体を開発に用いた。
選択したＭＣＩに特異的なバイオマーカーであるＡＰＯＡ４を診断に用いるために、まず抗体を作製した。ＡＰＯＡ４を除く他の２種のバイオマーカーであるＩＴＧＢ３とＣＲＰの抗体は、作製して用いるのではなく、市販されている抗体を開発に用いた。
【0060】
実施例３－１：検証したバイオマーカーに対する８種の抗体の開発
ＡＰＯＡ４抗原をマウス（ｍｏｕｓｅ）に注射して免疫反応を引き起こし、それらからハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を得て計５種のクローン（ｃｌｏｎｅ）抗体を作製し、ヤギ（Ｇｏａｔ）を用いて同様に３種のクローン抗体を作製した。前述した８種のクローン抗体を便宜上抗体１～抗体８と任意に命名し、その後ＡＰＯＡ４抗原と反応させてＥＬＩＳＡ法によりペアテスト（ｐａｉｒ ｔｅｓｔ）を行った。
ＡＰＯＡ４抗原をマウス（ｍｏｕｓｅ）に注射して免疫反応を引き起こし、それらからハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を得て計５種のクローン（ｃｌｏｎｅ）抗体を作製し、ヤギ（Ｇｏａｔ）を用いて同様に３種のクローン抗体を作製した。前述した８種のクローン抗体を便宜上抗体１～抗体８と任意に命名し、その後ＡＰＯＡ４抗原と反応させてＥＬＩＳＡ法によりペアテスト（ｐａｉｒ ｔｅｓｔ）を行った。
【0061】
前述したように作製した８種の抗体を対象にサンドイッチＥＬＩＳＡによりペアテストを行い、作製した８個の抗体をそれぞれ捕捉（Ｃａｐｔｕｒｅ）抗体及び検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）抗体として用いてテストした（図１２及び図１３）。
【0062】
図１２は８つのクローン抗体を対象にサンドイッチＥＬＩＳＡによりペアテストを行った結果を示す図であり、図１３は前記結果を示すグラフである。
図１２及び図１３から分かるように、診断キットに用いるｐａｉｒに適するものと思われる２組を選択した。（捕捉－抗体１，検出－抗体６），（Ｃ捕捉－抗体３，検出－抗体６）
実施例３－２：サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた親和性測定及び抗体ペアの選択
ペアテストの結果から選択した抗体１、抗体３、抗体６と抗原の親和性を測定した（図１４ａ）。ここで、親和性測定に用いた抗原は、抗体を作製する際に用いた抗原である。抗体３種（抗体１－抗体６，抗体３－抗体６）のそれぞれを対象に抗原抗体親和性を測定した。測定方法には基本的に直接ＥＬＩＳＡ法を用い、抗原抗体間の競合結合（Competition binding assay）を誘導する実験により親和性を測定した。抗原抗体間の競合結合実験を行う際に用いる検出抗体量をＫｌｏｔｚ ｐｌｏｔグラフにより決定した。
図１２及び図１３から分かるように、診断キットに用いるｐａｉｒに適するものと思われる２組を選択した。（捕捉－抗体１，検出－抗体６），（Ｃ捕捉－抗体３，検出－抗体６）
実施例３－２：サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた親和性測定及び抗体ペアの選択
ペアテストの結果から選択した抗体１、抗体３、抗体６と抗原の親和性を測定した（図１４ａ）。ここで、親和性測定に用いた抗原は、抗体を作製する際に用いた抗原である。抗体３種（抗体１－抗体６，抗体３－抗体６）のそれぞれを対象に抗原抗体親和性を測定した。測定方法には基本的に直接ＥＬＩＳＡ法を用い、抗原抗体間の競合結合（Competition binding assay）を誘導する実験により親和性を測定した。抗原抗体間の競合結合実験を行う際に用いる検出抗体量をＫｌｏｔｚ ｐｌｏｔグラフにより決定した。
【0063】
決定した検出抗体量で連続希釈（Serial dilution）した抗原と反応させ、その後それを抗原がコーティングされたウェルに分注し、４５０ｎｍで蛍光測定を行った。
測定したＯ．Ｄ値からＳｉｇｍａ ｐｌｏｔソフトウェアによりカーブを得て、抗原抗体親和性を示す解離定数Ｋｄ値を測定した。
測定したＯ．Ｄ値からＳｉｇｍａ ｐｌｏｔソフトウェアによりカーブを得て、抗原抗体親和性を示す解離定数Ｋｄ値を測定した。
【0064】
【0065】
図１４ｂは抗体１と抗原の親和性の測定結果を示す図である。
図１４ｂに示すように、Ｓｉｇｍａ ｐｌｏｔソフトウェアを用いて求めた解離定数Ｋｄ値は１１．３８ｎＭであり、これは評価基準である１ｎＭ以上の親和性を約１０倍下回る値であることが確認されたので、抗体１はキット開発に用いるのに適さないことが分かった。
図１４ｂに示すように、Ｓｉｇｍａ ｐｌｏｔソフトウェアを用いて求めた解離定数Ｋｄ値は１１．３８ｎＭであり、これは評価基準である１ｎＭ以上の親和性を約１０倍下回る値であることが確認されたので、抗体１はキット開発に用いるのに適さないことが分かった。
【0066】
【0067】
図１４ｃに示すように、Ｓｉｇｍａ ｐｌｏｔソフトウェアを用いて求めた解離定数Ｋｄ値は０．２０３５ｎＭであり、これは評価基準である１ｎＭ以上の親和性を約５倍上回る値であることが確認されたので、抗体３はキット開発に用いるのに適することが分かった。
【0068】
【0069】
図１４ｄに示すように、Ｓｉｇｍａ ｐｌｏｔソフトウェアを用いて求めた解離定数Ｋｄ値は０．２７５５ｎＭであり、これは評価基準である１ｎＭ以上の親和性を約４倍上回る値であることが確認されたので、抗体６はキット開発に用いるのに適することが分かった。
【0070】
前記親和性の測定結果から、抗体３と抗体６をそれぞれ捕捉抗体、検出抗体として用いて診断キットを開発した。
【実施例4】
【0071】
アルツハイマー病診断キットの開発
実施例４－１：診断キットの概要
キット作製から性能テストまでの各ステップは、大きく３ステップに分けられ、それぞれ抗体固定（Spotting）過程、固定した抗体の安定化過程、アッセイ（Assay）反応過程である。各ステップにおいてｐＨ、抗体の濃度などの条件がキットの性能を左右するので、それらの条件を探索して最適な条件を選択することがキット開発の核心であると言える（図１５）。
実施例４－１：診断キットの概要
キット作製から性能テストまでの各ステップは、大きく３ステップに分けられ、それぞれ抗体固定（Spotting）過程、固定した抗体の安定化過程、アッセイ（Assay）反応過程である。各ステップにおいてｐＨ、抗体の濃度などの条件がキットの性能を左右するので、それらの条件を探索して最適な条件を選択することがキット開発の核心であると言える（図１５）。
【0072】
図１５はアルツハイマー病診断キットの開発及び性能テスト過程を示す概略図である。
多重診断が可能になるという出願人の技術の利点を考慮し、１種のノーブルバイオマーカーでアルツハイマー病診断キットを作製するより、２種以上のバイオマーカーによる診断キットを作製するほうが、結果の信頼性及び正確性の面からより有利であると判断した。
多重診断が可能になるという出願人の技術の利点を考慮し、１種のノーブルバイオマーカーでアルツハイマー病診断キットを作製するより、２種以上のバイオマーカーによる診断キットを作製するほうが、結果の信頼性及び正確性の面からより有利であると判断した。
【0073】
最終的な診断キットの開発目標は、全３種の異なるバイオマーカーを用いた多重診断とし、３種のバイオマーカーの構成は、ＭＣＩに特異的なＡＰＯＡ４と、ＡＤに特異的なＩＴＧＢ３と、追加臨床の際に有意であるものと期待されるＣＲＰとからなるものとした（図１６）。
【0074】
図１６はアルツハイマー病診断キットに含まれるバイオマーカーの組み合わせを示す概略図である。
実施例４－２：バイオマーカーの固定
実施例３－２で測定した親和性分析の結果において最も優れた親和性を示す抗体３を用いて、ＰＣＬ（株）の中核技術であるゾルゲル工法で固定化する作業を行った。
実施例４－２：バイオマーカーの固定
実施例３－２で測定した親和性分析の結果において最も優れた親和性を示す抗体３を用いて、ＰＣＬ（株）の中核技術であるゾルゲル工法で固定化する作業を行った。
【0075】
固定化過程として、捕捉抗体をプレートウェル（ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ）の底にコーティング（spotting）し、その後抗原と検出抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で反応させ、次いで５３２ｎｍでスキャンして信号値を測定した（図１７）。
【0076】
図１７はアルツハイマー病に関連するマーカーＴａｕの例を挙げて模式化したキット作製の際に、バイオマーカー固定化後にアッセイを行う過程を示す概略図である。
実検体を用いる前のアッセイの際に、抗体作製時に用いた市販の抗原でアッセイを行ったが、これは実際の患者の検体については、後にゾルゲル固定化過程が確立されれば多量の実検体でより正確にバリデーションするためである。
実検体を用いる前のアッセイの際に、抗体作製時に用いた市販の抗原でアッセイを行ったが、これは実際の患者の検体については、後にゾルゲル固定化過程が確立されれば多量の実検体でより正確にバリデーションするためである。
【0077】
まず、ＭＣＩ特異的バイオマーカーであるＡＰＯＡ４マーカーの固定化組成を探索し、ＡＰＯＡ４マーカーの組成が確立されたら、その後ＩＴＧＢ３と共に固定化し、最終的にＣＲＰまで全３種のマーカーを全て共に固定化してキット作製を完成した（図１８）。
【0078】
図１８はバイオマーカー３種の固定化順序を示す概略図である。
特に、ＡＰＯＡ４においては、作製した抗体を用いてキット作製に用い、それを除く他のマーカーであるＩＴＧＢ３及びＣＲＰの固定及び反応抗体は、新たに作製した抗体ではなく、市販の抗体を用いたが、それら２種のマーカーに対する抗体もスクリーニングテストを行って適する抗体を選別し、それを用いた。
特に、ＡＰＯＡ４においては、作製した抗体を用いてキット作製に用い、それを除く他のマーカーであるＩＴＧＢ３及びＣＲＰの固定及び反応抗体は、新たに作製した抗体ではなく、市販の抗体を用いたが、それら２種のマーカーに対する抗体もスクリーニングテストを行って適する抗体を選別し、それを用いた。
【0079】
本出願人が事前にゾルゲルの組成に関連して予め定めておいたプロトコルに従って、捕捉抗体をゾルゲルとミキシングしてｓｐｏｔｔｉｎｇした結果、ｓｐｏｔが収縮する現象が見られ、当該現象は主に捕捉抗体の非常に低い濃度により発生するという経験的推論から、従来の捕捉抗体の濃度である０．５ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、同一ゾルゲル組成で再びｓｐｏｔｔｉｎｇしてｓｐｏｔの収縮現象を改善した（図１９）。
【0080】
図１９は固定化する抗体の濃度差によるＳｐｏｔの形状条件を確立する過程を示す写真である。
図１９の結果から、抗体とゾルゲル固定化の様々な組成を用いたその後の実験においても、当該結果を反映して捕捉抗体の濃度は１ｍｇ／ｍｌに設定した。
図１９の結果から、抗体とゾルゲル固定化の様々な組成を用いたその後の実験においても、当該結果を反映して捕捉抗体の濃度は１ｍｇ／ｍｌに設定した。
【0081】
【0082】
図２０ａはＡＰＯＡ４固定化条件探索実験の結果を示す写真であり、図２０ｂは前記ＡＰＯＡ４固定化組成のうち最も適するものと思われる条件について低力価、中力価、高力価検体によりテストした結果を示す図である。
【0083】
実施例４－３：ＩＴＧＢ３固定化テスト
ＩＴＧＢ３マーカーにおいて、出願人が定めたプロトコルに従って、１０～１２種の固定化組成でスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）テストを行い、有意であると思われる組成を選別した。その結果、何も添加していないＣＢＳ組性において有意な信号値が得られたので、それを固定化条件として選択した（図２１）。
ＩＴＧＢ３マーカーにおいて、出願人が定めたプロトコルに従って、１０～１２種の固定化組成でスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）テストを行い、有意であると思われる組成を選別した。その結果、何も添加していないＣＢＳ組性において有意な信号値が得られたので、それを固定化条件として選択した（図２１）。
【0084】
図２１はＩＴＧＢ３スクリーニングテストを行った結果を示す写真である。
実施例４－４：ＣＲＰ固定化テスト
ＣＲＰマーカーにおいて、ＩＴＧＢ３マーカーをスクリーニングしたのと同様に、出願人のプロトコルに従って確立した固定化組成を用いてｓｐｏｔｔｉｎｇし、当該組成のみでスクリーニングテストを行った結果、Ｓｏｌ－Ｇｅｌの比率を非常に低くしたＲ－１、Ｒ－１－１の２種の組成において有意な信号値が得られた。ただし、Ｒ－１－１においては組成の原材料中にＳｏｌ３という非常に粘りのある物質が添加されるため、後にキットを大量生産する際の工程上又は精度管理に困難を伴うものと思われるので、Ｒ－１組成を最終的に選択した（図２２）。
実施例４－４：ＣＲＰ固定化テスト
ＣＲＰマーカーにおいて、ＩＴＧＢ３マーカーをスクリーニングしたのと同様に、出願人のプロトコルに従って確立した固定化組成を用いてｓｐｏｔｔｉｎｇし、当該組成のみでスクリーニングテストを行った結果、Ｓｏｌ－Ｇｅｌの比率を非常に低くしたＲ－１、Ｒ－１－１の２種の組成において有意な信号値が得られた。ただし、Ｒ－１－１においては組成の原材料中にＳｏｌ３という非常に粘りのある物質が添加されるため、後にキットを大量生産する際の工程上又は精度管理に困難を伴うものと思われるので、Ｒ－１組成を最終的に選択した（図２２）。
【0085】
【0086】
図２３はＡＰＯＡ４、ＣＲＰ、ＩＴＧＢ３における具体的な固定化組成を示す図である。
その後、固定した抗体の安定化のためのプロセスである固定抗体のエージング（ａｇｉｎｇ）テスト、ブロッキングテスト及び乾燥（ｄｒｙ）テストを行った。
その後、固定した抗体の安定化のためのプロセスである固定抗体のエージング（ａｇｉｎｇ）テスト、ブロッキングテスト及び乾燥（ｄｒｙ）テストを行った。
【0087】
実施例４－４－１：固定化抗体のエージングテスト
ＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３、ＣＲＰの全てをｓｐｏｔｔｉｎｇし、その後当該ｓｐｏｔが安定して固定されるようにサポートするステップであるエージングステップの条件をテストした（図２４）。概略すると、エージング条件テストにおいて、場所は、湿度が約６０％と高い生産室と、湿度が約９％と低いデシケーターの２つの条件で行い、時間は、２時間と一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）の２つの条件で行った。
ＡＰＯＡ４、ＩＴＧＢ３、ＣＲＰの全てをｓｐｏｔｔｉｎｇし、その後当該ｓｐｏｔが安定して固定されるようにサポートするステップであるエージングステップの条件をテストした（図２４）。概略すると、エージング条件テストにおいて、場所は、湿度が約６０％と高い生産室と、湿度が約９％と低いデシケーターの２つの条件で行い、時間は、２時間と一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）の２つの条件で行った。
【0088】
図２４は３種のマーカーのｓｐｏｔｔｉｎｇ後に固定した抗体を安定化させる条件をテストした結果を示す写真である。
図２４から分かるように、デシケーターでエージングを行うと信号値が高くなり、一晩の条件よりも２時間の条件においてｓｐｏｔの形状がより安定することが確認され、エージング場所を常温のデシケーター、エージング時間を２時間とするとｓｐｏｔの安定性が向上したので、エージング条件をこれらに確定した。
図２４から分かるように、デシケーターでエージングを行うと信号値が高くなり、一晩の条件よりも２時間の条件においてｓｐｏｔの形状がより安定することが確認され、エージング場所を常温のデシケーター、エージング時間を２時間とするとｓｐｏｔの安定性が向上したので、エージング条件をこれらに確定した。
【0089】
実施例４－４－２：固定化抗体のブロッキングテスト
エージング条件を決定した後に、非特異的反応を除去する目的のプロセスであるブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）テストを行った。ブロッキングバッファーは、出願人の従来のプロトコルに用いていたバッファー（ＢＳＡ １％，ヤギ血清０．１％，Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ １ｇ，アジ化ナトリウム２ｇ）、ＳｔａｂｉｌＢｌｏｃｋ社の安定剤であるＳＧ０１、ＳＴ０１などの全３種でテストした（図２５）。
エージング条件を決定した後に、非特異的反応を除去する目的のプロセスであるブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）テストを行った。ブロッキングバッファーは、出願人の従来のプロトコルに用いていたバッファー（ＢＳＡ １％，ヤギ血清０．１％，Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ １ｇ，アジ化ナトリウム２ｇ）、ＳｔａｂｉｌＢｌｏｃｋ社の安定剤であるＳＧ０１、ＳＴ０１などの全３種でテストした（図２５）。
【0090】
図２５は３種のマーカーのｓｐｏｔｔｉｎｇ後に固定した抗体を対象にブロッキングテストを行った結果を示す写真である。
図２５に示すように、ＳＴ０１でブロッキングしたものにおいて、信号値の面とｓｐｏｔの安定性の面で最も良好な信号を示すことが確認された。
図２５に示すように、ＳＴ０１でブロッキングしたものにおいて、信号値の面とｓｐｏｔの安定性の面で最も良好な信号を示すことが確認された。
【0091】
実施例４－４－３：Ｄｒｙ条件テスト
ブロッキング過程後に、ウェルを乾燥させる目的で湿度と時間をそれぞれ２つの条件に分けてテストした。湿度は、６０％である生産室と、９％であるデシケーターの２つの条件に設定し、時間は、２時間と一晩の２つの条件に設定してテストを行った（図２６）。
ブロッキング過程後に、ウェルを乾燥させる目的で湿度と時間をそれぞれ２つの条件に分けてテストした。湿度は、６０％である生産室と、９％であるデシケーターの２つの条件に設定し、時間は、２時間と一晩の２つの条件に設定してテストを行った（図２６）。
【0092】
図２６は３種のマーカーのｓｐｏｔｔｉｎｇ後に固定した抗体を対象に乾燥テストを行った結果を示す写真である。
図２６に示すように、各乾燥条件における信号値の差は大きくなかったが、デシケーター一晩の条件を除く他の条件においてウェルが完璧には乾かないことを考慮して、最終ｄｒｙ条件はデシケーター一晩に確定した。
図２６に示すように、各乾燥条件における信号値の差は大きくなかったが、デシケーター一晩の条件を除く他の条件においてウェルが完璧には乾かないことを考慮して、最終ｄｒｙ条件はデシケーター一晩に確定した。
【0093】
実施例４－５：診断キットの最終アッセイ標準化テスト
診断キットのアッセイ過程の基準を出願人が確立したプロトコルに基づいて定め、それに基づいて検体希釈液、接合体希釈液などの条件を代えて最適なアッセイ条件を選択した。
診断キットのアッセイ過程の基準を出願人が確立したプロトコルに基づいて定め、それに基づいて検体希釈液、接合体希釈液などの条件を代えて最適なアッセイ条件を選択した。
【0094】
【0095】
図２７に示すように、検体と検体希釈液の比率を１：４とし、全１００ｕＬの体積を分注して反応させた結果、ヤギ血清を含む検体希釈液を用いたものにおいて最も向上した結果が得られた。
【0096】
実施例４－５－２：接合体希釈液条件テスト
検体との反応後に２番目の反応に分注する接合体希釈液の条件テストを行った（図２８）。
検体との反応後に２番目の反応に分注する接合体希釈液の条件テストを行った（図２８）。
【0097】
図２８は接合体希釈液の条件をテストした結果を示す写真である。
図２８に示すように、その結果、ＢＳＡを添加したバッファーで反応させたものにおいて、全てのマーカーに対して信号値が上昇することが確認された。
図２８に示すように、その結果、ＢＳＡを添加したバッファーで反応させたものにおいて、全てのマーカーに対して信号値が上昇することが確認された。
【0098】
実施例４－５－３：診断キットの最終アッセイ標準化情報
上記実施例の結果から最終確認した診断キットの最終アッセイ標準化情報は次の通りである。
上記実施例の結果から最終確認した診断キットの最終アッセイ標準化情報は次の通りである。
【0099】
ｉ．エージング情報
１．常温デシケーター２Ｈｒ
ｉｉ．ブロッキング情報
１．常温１Ｈｒ
ｉｉｉ．乾燥情報
１．常温デシケーター一晩
ｉｖ．駆動情報
１．使用装置：シェーカー
２．アッセイプロトコル
１．常温デシケーター２Ｈｒ
ｉｉ．ブロッキング情報
１．常温１Ｈｒ
ｉｉｉ．乾燥情報
１．常温デシケーター一晩
ｉｖ．駆動情報
１．使用装置：シェーカー
２．アッセイプロトコル
【0100】
【表1】
【0101】
ｖ．分析情報
１．撮影装置：Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ装置
実施例４－６：最終キットの作製及び実検体テスト
前記固定化条件に基づいてマーカー３種を１つのウェルに固定化し、その後ＨＣ、ＭＣＩ、ＡＤ実検体を用いて、作製したキットの性能テストを行った。３８０人の患者から抽出した検体を各３～４個ずつ疾病ステージ毎にプールした。最終的に、検体は、計６９個、各ＨＣ、ＭＣＩ、ＡＤグループ当たり２３個ずつに設定した。
１．撮影装置：Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ装置
実施例４－６：最終キットの作製及び実検体テスト
前記固定化条件に基づいてマーカー３種を１つのウェルに固定化し、その後ＨＣ、ＭＣＩ、ＡＤ実検体を用いて、作製したキットの性能テストを行った。３８０人の患者から抽出した検体を各３～４個ずつ疾病ステージ毎にプールした。最終的に、検体は、計６９個、各ＨＣ、ＭＣＩ、ＡＤグループ当たり２３個ずつに設定した。
【0102】
実施例４－６－１：エクソソームのウェスタンブロット分析結果
バイオマーカーであるＡＰＯＡ４、ＣＲＰ、ＩＴＧＢ３を評価するために、多量のエクソソームサンプル（各段階当たり２３個，計６９個）をウェスタンブロット分析により確認した。ここで、サンプルの順序は、ウェスタンブロットのゲルの違いを考慮して、患者の疾病ステージ毎に集めて実験を行うのではなく、任意に設定した（図２９ａ、図２９ｂ及び図２９ｃ）。
バイオマーカーであるＡＰＯＡ４、ＣＲＰ、ＩＴＧＢ３を評価するために、多量のエクソソームサンプル（各段階当たり２３個，計６９個）をウェスタンブロット分析により確認した。ここで、サンプルの順序は、ウェスタンブロットのゲルの違いを考慮して、患者の疾病ステージ毎に集めて実験を行うのではなく、任意に設定した（図２９ａ、図２９ｂ及び図２９ｃ）。
【0103】
図２９ａはＩＴＧＢ３に対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す写真及び図であり、図２９ｂはＡＰＯＡ４に対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す写真及び図であり、図２９ｃはＣＲＰに対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す写真である。
【0104】
図２９ａ、図２９ｂ及び図２９ｃに示すように、ＩＴＧＢ３とＡＰＯＡ４においては、ＷＢ結果がプロテオミクス結果に対応しているが、ＣＲＰにおいては、ＷＢで分析困難な結果が得られ、結果を添付したが、最終結論においては相関関係分析から除外した。
【0105】
実施例４－６－２：最終キット作製後の実検体分析結果
ウェスタンブロット分析実験と同じ患者の血漿サンプル６９個を用いて、作製したキットに反応させて結果を得た（図３０）。
ウェスタンブロット分析実験と同じ患者の血漿サンプル６９個を用いて、作製したキットに反応させて結果を得た（図３０）。
【0106】
図３０は最終作製キットを用いて実検体を分析した結果を示す写真である。
実施例４－６－３：実検体分析結果とＷＢ分析結果の相関関係
実施例４－６－２で得られたデータとウェスタンブロット強度の相関関係を比較分析した（図３１及び図３２）。
実施例４－６－３：実検体分析結果とＷＢ分析結果の相関関係
実施例４－６－２で得られたデータとウェスタンブロット強度の相関関係を比較分析した（図３１及び図３２）。
【0107】
まず、図３１はＩＴＧＢ３マーカーを対象にした相関関係分析結果を示すグラフである。
図３１に示すように、ＩＴＧＢ３マーカーにおいては、プロテオミクス解析結果、ウェスタンブロット分析結果及び作製したキットの分析結果の全てがＨＣ、ＭＣＩ、ＡＤと疾病が進行するほどタンパク質の発現量も共に増加する推移を示し、相関係数Ｒ２も８０％以上を示すことが確認された。
図３１に示すように、ＩＴＧＢ３マーカーにおいては、プロテオミクス解析結果、ウェスタンブロット分析結果及び作製したキットの分析結果の全てがＨＣ、ＭＣＩ、ＡＤと疾病が進行するほどタンパク質の発現量も共に増加する推移を示し、相関係数Ｒ２も８０％以上を示すことが確認された。
【0108】
次に、図３２はＡＰＯＡ４マーカーを対象にした相関関係分析結果を示すグラフである。
図３２に示すように、ＡＰＯＡ４マーカーにおいて、ＭＣＩ段階では非常に高い発現レベルであるが、ＡＤ段階では再び低くなる傾向を示すことが確認された。
図３２に示すように、ＡＰＯＡ４マーカーにおいて、ＭＣＩ段階では非常に高い発現レベルであるが、ＡＤ段階では再び低くなる傾向を示すことが確認された。
【0109】
診断キットの目標設定がアルツハイマー病の早期診断であることと、患者がＡＤ段階になると診断キットを用いなくても明確にアルツハイマー病であることが分かるということから、ＭＣＩ段階で迅速に診断することが重要である。
【0110】
ＡＰＯＡ４マーカーは、ＭＣＩ段階の検体で作製した診断キットとウェスタンブロット分析結果の相関係数Ｒ２が約８８％を示すことが確認された。
最後に、ＣＲＰマーカーにおいては、ウェスタンブロット分析により定量的な値を判断することは困難であるが、プロテオミクス解析結果と文献情報によりＭＣＩ段階でＣＲＰの発現量が少なくなるものと考えられるので、補助指標マーカーとして活用することが好ましいものと分析される。
最後に、ＣＲＰマーカーにおいては、ウェスタンブロット分析により定量的な値を判断することは困難であるが、プロテオミクス解析結果と文献情報によりＭＣＩ段階でＣＲＰの発現量が少なくなるものと考えられるので、補助指標マーカーとして活用することが好ましいものと分析される。
【0111】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20a】
【図20b】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29a】
【図29b】
【図29c】
【図30】
【図31】
【図32】
