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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-18
(45)【発行日】2025-03-27
(54)【発明の名称】試験カートリッジ
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20250319BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20250319BHJP
C12Q 1/6841 20180101ALN20250319BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20250319BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 B
C12M1/00 A
C12Q1/6841 Z
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021518616
(86)(22)【出願日】2019-10-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019054887
(87)【国際公開番号】W WO2020073018
(87)【国際公開日】2020-04-09
【審査請求日】2022-10-04
(31)【優先権主張番号】62/741,253
(32)【優先日】2018-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519433090
【氏名又は名称】ファースト ライト ダイアグノスティックス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ストラウス， ドン
【審査官】山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０３７８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５０３７７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０１０２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１１１６３０（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ １／００－５／２８
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
Ｃ１２Ｑ
Ｇ０１Ｎ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
個々の細胞標的および分子標的の検出および定量化ならびに抗微生物薬感受性試験を含む検体に対する種々の試験の１つを行うように構成されたカートリッジであって、前記カートリッジが、検体チャンバー；
前記検体チャンバーと流体連通するか、または流体連通しないかのいずれかを選択することができる複数の分割ウェル；
前記分割ウェルと選択可能に流体連通した複数の試薬ウェルであって、各試薬ウェルが、少なくとも１つの試薬を含有する、複数の試薬ウェル；
複数のイメージングウェルであって、各イメージングウェルが、前記複数の試薬ウェルの対応する１つと流体連通している、複数のイメージングウェル；
前記検体チャンバーと前記複数の分割ウェルとの間、および前記複数の分割ウェルと前記複数の試薬ウェルとの間の流体連通のチャネルを開放および閉鎖するために前記カートリッジの外側から操作可能な、複数の位置に移動できるスライド可能バルブであって、前記スライド可能バルブは、前記スライド可能バルブが前記複数の位置のうちの第１の位置にある場合には、前記検体チャンバーと前記複数の分割ウェルの少なくとも１つの分割ウェルとの間の直接的流体連通を提供し、前記複数の位置のうちの第２の位置にある場合には、前記少なくとも１つの分割ウェルから、対応する試薬ウェルへの接続を提供するチャネルを含む、スライド可能バルブ；および
流体工学モジュールとインターフェース接続して、前記カートリッジ内の圧力をマニピュレートして、前記カートリッジ内の検体を移動するように構成された空気圧ポート
を含み、前記空気圧ポートに印加される圧力または真空が、前記スライド可能バルブの位置と組み合わせて、前記検体および前記少なくとも１つの試薬の分配を制御するように構成される、カートリッジ。
【請求項2】
前記少なくとも１つの試薬が、磁気粒子および標的特異的な標識または非特異的な標識を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項3】
前記磁気粒子が、標的特異的ではない、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項4】
前記磁気粒子が、細菌細胞表面に非特異的に結合することができる、請求項３に記載のカートリッジ。
【請求項5】
前記標的特異的な標識または非特異的な標識のそれぞれが、特定の細菌標的のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項6】
各イメージングウェルが、検出表面および色素クッションを含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項7】
前記色素クッションが、前記検出表面に隣接した密度薬剤および色素を含み、前記少なくとも１つの試薬が、磁気粒子を含み、前記磁気粒子および色素クッションは、前記色素クッションにわたって磁場を印加する際に、前記磁気粒子およびそれに結合した標的が、前記色素クッションを介して前記検出表面に引き寄せられるように構成される、請求項６に記載のカートリッジ。
【請求項8】
前記磁気粒子および前記標的特異的な標識または非特異的な標識が、前記試薬ウェル中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズとして提供される、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項9】
前記標的特異的な標識または非特異的な標識が、分類群特異的である、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項10】
前記磁気粒子が、微生物細胞に非特異的に結合することができる、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項11】
前記磁気粒子が、細菌細胞表面の特定の特徴または分子に結合するように構成される、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項12】
その中に希釈剤を有する希釈剤リザーバー；および押すと、前記希釈剤リザーバーから前記希釈剤を分配して、前記検体と混合するように構成されるボタン
をさらに含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項13】
前記スライド可能バルブが、インキュベーション中に前記分割ウェル中の前記検体を保持し、
標識および磁気的なタグ化のために、前記分割ウェルから前記試薬ウェルへと前記検体を送達
するように配置されるように構成される、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項14】
前記スライド可能バルブが、前記第２の位置にあり、各分割ウェルが、対応する試薬ウェルと流体連通している、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項15】
前記カートリッジと関連付けられた患者、試験適用特異的および工場情報を含む識別子をさらに含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項16】
分析器の光学システムが、標識され磁気的にタグ化された標的細胞または分子が磁力によって沈着された検出面の近傍の焦点面に焦点を合わせることを可能にする焦点粒子をその中にさらに含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項17】
前記カートリッジが、詰まりまたは他のエラーを回避するために、１つの配向でのみ前記カートリッジの分析器のトレイへの挿入を可能にするように、非対称なフットプリントを有する、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項18】
前記分割ウェルの少なくとも１つが、１つまたは複数の抗微生物剤を含有する、請求項１に記載のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、感染を検出するため、感染性病原体を同定するため、および感染に有効な抗微生物処置を決定するために有用なシステム、デバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗生物質耐性細菌によって引き起こされる生命を脅かす感染の流行は、世界的な医療危機を煽っている。この問題は、１つには、従来の診断方法が、感染を処置するための最適な抗微生物処置を決定するのに数日を要するという事実によって悪化される。時間がかかる試験によって引き起こされる遅延は、最適に満たない処置、医学的転帰不良、および抗生物質耐性の伝播を引き起こす強力な広域スペクトル抗生物質の乱用をもたらす。耐性細菌によって引き起こされる感染に起因する死亡率は、急激に増加している。Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅによる２０１４年報告は、２０５０年までに、抗微生物薬耐性が毎年１千万人を超える致死率の原因となることを推定している。
【0003】
残念ながら、抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）法と呼ばれる、有効な標的化された抗生物質を同定するために使用される従来法は、結果を得るのに数日を要する。従来の抗微生物薬感受性試験にそれほど時間かかる１つの理由は、それらの試験が、多数の － 数百万のオーダーの － 精製された病原体細胞を必要とすることである。ペトリ皿中で培養することによってその数の細胞を精製するためには、１３０年を超える歴史があるコロニー精製法を使用して、１または複数日が必要である。精製された細胞が入手できると、病原体を同定し、どの抗生物質が患者を処置するために有効であるかを決定するのに、１または複数日が必要である。
【0004】
一方で、患者は、感染を引き起こし得る広範な病原体を死滅させる広域スペクトル抗生物質で「経験的に」処置されている。これらの薬物は、広範な病原体を処置することができるが、患者の特定の病原体に対する最適な治療であることは一般になく、感染を効果的に処置することができない可能性がある。広域スペクトル抗生物質の経験的な使用は、抗生物質耐性の伝播も引き起こす。これらの広域作用性の薬物は、疾患原因病原体だけでなく、ヒト身体に存在する数兆個の良性微生物においても耐性を引き起こす。抗生物質耐性の伝播をさらに悪化させるのは、どの患者が実際に感染を有するかを決定する迅速な診断法の非存在下では、未感染の患者が、耐性原因抗生物質によって不必要に処置される頻度が高いという事実である。
【0005】
有効な抗微生物処置をすぐに決定することで、医学的転帰を改善できるだけでなく、医療費を低下させることができる。例えば、一般的な生命を脅かす院内感染、例えば、手術部位感染および人工呼吸器関連肺炎は、米国においてほぼ１００億ドルの医療費の原因となっている。入院期間の長さは、これらの感染に帰せられる最大のコストである。症状の開始に近い段階で最適な抗微生物治療で患者を処置することで、患者の回復を顕著に加速することができ、長期にわたる費用のかかる入院期間を低減させることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
感染を有する患者を迅速かつ正確に同定し、これらの患者に対して有効な治療を迅速に実行することで、命を救い、抗微生物薬耐性の伝播を衰えさせることができる。本発明は、今日の方法によって要求される数日間と比較して、感染を有する患者を約３０分間で正確に同定することができ、患者の感染に対する標的化された治療を数時間で決定することができるカートリッジデバイスを提供する。症状の開始にかなり近い段階で感染を検出し、有効な標的化された抗微生物剤を同定することによって、本発明は、医学的転帰を劇的に改善し得、耐性原因広域スペクトル抗生物質による経験的処置を最小化し得る。
【0007】
本発明に従うカートリッジは、多数の精製された細胞を生成するための従来法によって必要とされる時間のかかるステップを排除するために使用することができる。カートリッジには、抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）を実施するための試薬が予めロードされ得る。
【0008】
感染を検出するために、本発明は、細菌、真菌、ウイルスおよび寄生生物を含む広範な病原体を検出、定量化および同定することができる。診断的に情報価値のある毒素、疾患特異的バイオマーカー、ヒトまたは宿主細胞、および宿主－応答バイオマーカーを検出および定量化する本発明の能力は、感染を有する患者を迅速かつ正確に同定するためにも有益である。本発明は、感染の存在について患者検体を最も効果的に評価し、感染性因子を決定するための単一の試験における上記性能の任意の組合せを含み得る。
【0009】
診断的に情報価値のある宿主細胞には、感染に対する炎症応答を示す細胞（例えば、好中球）、病原体が感染した細胞（例えば、ウイルス感染細胞）、または患者検体の品質および解剖学的起源を示す細胞（例えば、扁平上皮細胞）が含まれる。
【0010】
生命を脅かす感染を診断する毒素の例には、その存在がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を示すＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ、および疾患を示す炭疽感染を示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ致死毒素（即ち、毒素サブユニット致死因子）が含まれる。感染患者の同定を助け得る宿主因子には、サイトカイン、例えば、ＩＬ－４およびＩＬ－６が含まれる。
【0011】
感染を検出し、感染性病原体を同定および定量化した後、カートリッジ発明および関連の本発明の方法は、どの患者治療が最も有効であるかを決定することができる。この型の分析は、抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）と呼ばれる。本発明は、数日かかる現行の従来法ではなく、ほんの数時間で患者検体から直接的に正確な結果を得ることができるという点で、抗微生物薬感受性試験のための現行の方法とは異なっている。従来法は、本発明の方法とは異なり、数百万個の精製された病原体細胞を得るために、時間のかかる微生物学的培養ステップを必要とする。対照的に、本発明の新規抗微生物薬感受性試験法は、多数の細胞も細胞精製も必要としないので、時間のかかる培養ステップなしに、患者検体から直接的に有効な治療を迅速に決定することができる。
【0012】
本発明の新規かつ潜在的に医学的にインパクトのある性能および実用性は、患者検体からの直接的な情報価値のある生物学的標的の非拡大デジタルイメージングを使用する単一分子計数および単一細胞計数を可能にするための本発明のカートリッジならびに関連の本発明のシステムおよび方法によって可能にされる。顕微鏡的細胞および超顕微鏡的分子をデジタル的に計数するために複雑で高価な顕微鏡および光学なしの単純かつ低コストのカメラを使用することで、疾患原因毒素および疾患特異的バイオマーカーの迅速、高感度かつ自動化された定量化による、感染の検出が可能になる。病原体細胞を同定しデジタル的に計数するための本発明のシステムおよび方法は、抗微生物剤に対する感受性または耐性を迅速に決定する能力の基礎をなす。本発明の方法は、微生物学的栄養培地中でインキュベートした場合に正常な病原体成長（即ち、細胞分裂による細胞数の増加）をその薬剤が停止させるかどうかを決定することによって、病原体が抗微生物剤に対して感受性であるかどうかを決定する。これは、抗微生物薬を含む培地中でのインキュベーションの前および後に病原体細胞を計数することによって、本発明のカートリッジデバイスにおいて実施することができる。
【0013】
カートリッジは、検体入力のみを必要とし、診療現場から集中型病院および参照実験室までの範囲の種々の現場ですぐに実施可能な結果を提供する種々の試験を自動的かつ同時に実行する機器によって操作可能であり得る。かかる試験は、ユーザーのために実施時間を最小化するための、全ての必要な試薬を予めロードした適用特異的カートリッジ、カートリッジ中への直接的検体入力ならびに全ての処理および分析の完全な自動化、ならびに拡大縮小可能なスループットのために設計された機器の組合せによって可能になる。
【0014】
単一分子および単一細胞を計数するための方法を使用して試験を実施する自動化機器によって操作可能であり得る本発明のカートリッジは、標的分子または細胞を蛍光標識すること、標的を磁気的にタグ化すること、デバイスのイメージング表面上に蛍光標識された磁気標的を沈着させるために磁力を使用すること、拡大なしで（または最小限の拡大を用いて）標的をイメージングすること、およびイメージ分析を使用して標的を計数することを含み得る。
【0015】
本発明は、カートリッジデバイスにおける、上に概説したステップの同時処理を可能にする。単一のランダムアクセス機器は、異なる型の患者検体を含む、異なる診断法適用のための複数の試験カートリッジを、同時に処理することができる。本発明の機器およびカートリッジの自動化された性質により、著しい専門的訓練なしの医療専門家による操作が可能になる。さらに、この機器のための、機器と共に働くように設計された適用特異的カートリッジの潜在的試験メニューの幅は、ベンチトップ空間を低減させて、設備のよりコスト節約的な利用を可能にし、患者近くでの診断試験が、それらが最も大きい影響を有し得る感染の開始に近い段階で、潜在的に命を救う診断情報を臨床医に提供することを可能にする潜在性を提供する。
【0016】
適用特異的カートリッジには、試験試薬が予めロードされ得る。好ましくは、カートリッジは、製造の間に、アセンブルされ得、必要な試験試薬と共に包装され得、ユーザーが、試験される検体（例えば、患者からの呼吸器検体）を添加し、カートリッジを機器中に挿入する必要があるだけの状態で分配され得る。一部の場合には、試験される検体、例えば、血液検体は、予め富化され得る。例えば、血液検体は、分析前に培養による予めの富化を受け得るが、それは、多くの血液感染が、あまりに低い濃度の病原体細胞を有することに起因して、予めの富化なしに直接的に試験することができないからである。
【0017】
カートリッジには、標的細胞または分子を同定および定量化するための蛍光プローブおよび試薬が予めロードされ得る。例えば、ＦＩＳＨベースの方法を使用して細胞を検出するために、カートリッジは、標的細胞を透過処理するための予めロードされた試薬、ハイブリダイゼーション試薬、蛍光標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ、および標的結合性磁気粒子を含み得る。ＡＳＴカートリッジは、差次的成長後に標的細胞を定量化するためのＦＩＳＨベースの方法のための試薬に加えて、差次的成長を促進するための微生物学的培地および抗微生物剤を含み得る。
【0018】
本発明の好ましい実施形態では、カートリッジは、抗微生物薬感受性試験のために使用され、検体は、微生物学的細胞の複製または成長を促進するための栄養成長培地を含む別々の部分へと分割される。これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞の数および品質を決定するための、成長を促進する温度でのインキュベーション前に直接的に処理および分析される参照またはベースライン部分として使用され得る。これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞が生存可能かどうかを確認するために、病原体細胞の成長を促進する温度でインキュベートされ得る。さらに、他の部分は各々、特定の濃度の１つまたは複数の抗微生物剤を含み、病原体細胞複製に対する抗微生物剤の影響を決定するためにインキュベートされる。
【0019】
ユーザーが、検体をカートリッジ中にロードし、結果を受け取る必要があるだけになるように、カートリッジは、その中の検体をマニピュレートし、カートリッジをインキュベートし、必要な処理およびイメージングステップを実施するように動作可能な機器とインターフェース接続し得る。Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の感染が疑われる場合に、ユーザーが、Ｅ．ｃｏｌｉ特異的試薬（例えば、培地、抗微生物薬およびＦＩＳＨプローブ）を予めロードした適切なカートリッジを選択することができるように、カートリッジは、特定の微生物のために特異的に選択された成長培地および抗微生物剤を含み得る。全ての必要な試薬を予めロードしたＡＳＴ特異的カートリッジ、アッセイステップを実施するための別々のステーションおよび機器内でのそれへのランダムアクセスを有する自動機器、ならびに複数のカートリッジおよびアッセイのコンピューター化されたスケジューリングおよびマニピュレーションの組合せを介して、本発明のシステムおよび方法は、検体入力のみを必要とし、診療現場環境においてすぐに実施可能な結果を提供する種々のアッセイを自動的かつ同時に実行することができる。カートリッジおよび関連の機器の自動化された性質により、著しい専門的訓練なしの医療専門家による操作が可能になる。
【0020】
カートリッジには、製造の間に必要な試薬がセットアップされ得、ユーザーが、試験される検体（例えば、患者からの血液検体）を添加し、カートリッジを機器中に挿入する必要があるだけの状態で診療現場設備に分配され得る。本明細書に記載される機器は、実施されているアッセイに従って、アッセイ特異的カートリッジを受け入れ、格納し、ステーション間でアッセイ特異的カートリッジを移動させるために使用されるカルーセルの周囲に位置決めされる、異なるアッセイステップを実施するための種々の異なるステーションを使用する。
【0021】
カートリッジは、検体を受け入れるための検体チャンバー、および異なる抗微生物剤を予めロードしたいくつかの分割またはインキュベーションウェルを含み得る。カートリッジは、複数のイメージングウェルもまた含み得、各イメージングウェルは、単一の分割ウェルに対応する。イメージングウェルは、その差次的成長分析を提供し、特定の標的微生物による患者の感染に対する最も有効な処置を決定するために、種々の薬剤の存在下でのインキュベーション後に標的微生物を処理およびイメージングするための必要な試薬を含み得る。
【0022】
検体チャンバー、分割またはインキュベーションウェル、およびイメージングウェルは、一連のチャネルおよびバルブ、例えば、分割ウェルとイメージングウェルとの間に配置されたスライディングバーを介して、互いに連結され得る。チャネルが、分割ウェルの出口チャネルおよび対応するイメージングウェルの入口チャネルと整列して、それらの間に流体経路を創出することができるように、バーは、垂直チャネルを含み得、水平にスライド可能であり得る。いずれかの方向で水平にスライドされると、バーのチャネルは、これらのウェルと整列しなくなり、それによって、ウェルを隔離し、そこでの流体連通を防止し得る。バルブは、実施されるアッセイステップに依存して、本明細書に記載される機器によって外部からマニピュレートされ得る。
【0023】
カートリッジは、種々の区画間で検体を動かすためにカートリッジ内に圧力勾配を印加するための空気圧供給源への連結のための空気圧または他のインターフェースを含み得る。バルブと連動してマニピュレートされると、空気圧供給源は、カートリッジ内の種々の区画間のチャネルを開放し、次いで、開放チャネルを介して検体流体を指向させるために使用され得る。
【0024】
本発明のカートリッジは、上で概説した本発明のカートリッジデバイス上で異なる試験ステップを実施するための種々の異なるステーションを使用する本明細書に記載される機器によって操作可能であり得る。ステーションは、実施されている試験に従って、適用特異的カートリッジを受け入れ、格納し、ステーション間で適用特異的カートリッジを移動させるために使用されるカルーセルの周囲に位置決めされ得る。ステーションには、カートリッジとインターフェース接続し、その中の検体および試薬をマニピュレートするための流体工学ステーション、カートリッジのイメージングウェルの検出表面上に標的を磁気的に沈着させるための磁気選択ステーション、検体中の沈着した標的を検出するためのイメージングステーション、および使用したカートリッジの処分のための廃棄物ステーションが含まれ得る。
【0025】
好ましい実施形態では、試験は、全てのステップを通じて一定の温度もしくは周期的温度を使用し、または機器の内部が要求される温度で維持され得、カルーセルがインキュベーションステップのための格納ステーションとして働き得るように、改変される。温度は、生理的温度であってもよく、または生理的温度を下回っても上回ってもよい。
【0026】
カートリッジを操作する機器は、試験ステップが、種々の型の試験のために要求される順序およびタイミングで実施され得るように、異なるステーションにアクセスするためにカルーセルを使用することができる。正確なコンピュータースケジューリングおよび機器中の種々のステーションへのコンピューター制御されるアクセスは、さらなるユーザー入力なしに種々の試験の全てのステップを自動的に実施するために使用される。カートリッジを機器中にロードした後で、ユーザーの次のインタラクションは、機器の場所でまたは遠隔で、試験の結果を受け取ることまたは検分することであり得る。試験型に依存して、プラットフォームの自動的分析の報告された結果は、感染の検出；病原体、毒素、バイオマーカーもしくは診断的に情報価値のある宿主細胞の検出、同定および定量化；または抗微生物薬感受性結果およびプロファイルを示し得る。一部の試験適用は、同じ機器実行で、同じカートリッジ中の単一の検体に対して異なる種類の測定を実施する。この場合、複数の型の結果が、単一の試験について報告され得る。
【0027】
カートリッジは、患者、試験適用特異的または工場情報をカートリッジと関連付けるために、ヒトによって読み取られ得るまたは自動化機器によって自動的に読み取られ得る、１つまたは複数のバーコードまたは他の識別子で標識され得る。機器は、結果を報告するための、患者情報を含む、試験されている検体と関連する情報を記録および追跡するために、その入力を使用することもできる。機器は、結果を報告するための、患者情報を含む、試験されている検体と関連する情報を記録および追跡するために、その入力を使用することもできる。
【0028】
本発明のカートリッジを処理するための機器は、プロセッサーおよび非一時的な有形メモリ（ｔａｎｇｉｂｌｅ ｍｅｍｏｒｙ）を含んでおり、機器内で実施されている試験をスケジューリングおよび制御し、その中のカートリッジを追跡するように動作可能なコンピューターを含み得る。コンピューターは、ユーザーからの情報をもたらしかつ受け取り、結果およびステータス情報を表示するためのユーザーインターフェースを含み得る。コンピューターは、ネットワークに接続され得、試験結果を処理し、接続されたデバイスにネットワークを通じて送るように動作可能であり得る。
【0029】
カートリッジを操作するように設計された機器は、必要な試験ステップのパフォーマンスのために、カルーセルと種々のステーションとの間でカートリッジを動かすための機械的コンベアアームを含み得る。好ましい実施形態では、カルーセルおよびステーションは、ステーション内にカートリッジを受容し位置決めするようなサイズにされたスロットを含む。カルーセルの回転は、カルーセルスロットを、適切なステーション中の対応するスロットと整列させることができ、機械的コンベアアームは、カートリッジの側面に接触し、整列されたスロットに沿って選択されたステーション中にカートリッジをスライドさせるように動作可能であり得る。機械的コンベアアームは、カートリッジを握ることを回避し、握り機構と関連する詰まりを低減させる。機械的コンベアアームは、カートリッジに隣接し、その一方の側面に原動力を提供するように動作可能な、２つの回転可能なプロングを含み得る。カルーセルおよびステーションスロットの側面は、カートリッジがスライドされる際の側方ガイダンスを提供することができ、カートリッジを動かすための握り機構の必要を回避する。
【0030】
予めロードしたカートリッジは、製造側での試薬の体積および分配の制御を可能にし得、自動化機器は、試験ステップのパフォーマンスおよびそのタイミングを制御する。したがって、システムおよび方法は、ユーザーエラーの潜在性を大きく低減させることができ、未熟なスタッフが専門的訓練なしに種々の試験を実施し、専用の現場外試験の遅延およびコストなしに、信頼性のあるすぐに実施可能な結果を得ることを可能にする。
【0031】
好ましい実施形態では、適用特異的カートリッジは、病原体の正体に基づいて選択される種々の抗微生物剤および微生物学的成長培地の存在下での検体中の病原体の差次的成長を測定するための微生物特異的抗微生物薬感受性試験カートリッジを含む。本発明によれば、患者検体、例えば、尿、糞便または血液は、最小限の検体調製もしくは培養を伴って、または検体調製もしくは培養を伴わずに、直接的に分析される。本発明に従って処理される検体は、同定され、種々の抗微生物薬または他の処置モダリティに曝露され、最も有効な処置の選択を可能にする。微生物感染は同定され得、適切な処置はほんの数時間で決定され得、適切に標的化された治療の遅延を大きく低減させ、積極的な広域スペクトル抗微生物薬による経験的な処置の必要を回避する。本発明により、医療提供者が、感染患者を適切に処置するために、最初に有効な治療を処方することが可能になる。したがって、本発明は、患者転帰を改善し、抗微生物薬耐性の伝播を低減させる機会を提供する。
【0032】
カートリッジは、検体調製ステップをほとんどまたは全く伴わずに、患者検体、例えば、尿、痰もしくは他の呼吸器検体、血液、糞便、創傷検体または脳脊髄液から直接的に、感染検出、標的同定、および有効な処置の決定を実施するように設計され得る。例えば、尿検体は、数時間で完了する病原体同定（ＩＤ）および抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のために、カートリッジ試験デバイス中に直接的にピペッティングされる。これは、試験のために純粋な微生物培養物の大きい集団を産生するために１または複数日のコロニー精製を必要とする現行の培養ベースの方法とは対照的である。本発明は、全てカートリッジ試験デバイス内で、微生物もしくは細胞を同定するため、ならびに／または治療感受性および有効性を決定するために、患者検体を受け入れて内部で処理することが可能な試験デバイスおよび機器を提供する。検体中の複数の標的細胞または病原体が同定され得、複数の抗微生物薬または処置に対する感受性が、単一のカートリッジデバイス中で試験され得る。本発明の試験システムおよび方法は、検体マトリックス、可変の接種材料、および検体中の共生微生物の存在に関して頑強である。本発明の試験により、多微生物感染症についての正確な結果も得られる。
【0033】
本発明のカートリッジは、本発明のカートリッジデバイスにおける、検体中に存在する標的細胞の存在および正体を決定するための、検体の直接的処理およびイメージングを可能にし得る。上述のように、処理およびイメージングステップは、カートリッジの外側での検体調製をほとんど～全く必要としないことができるカートリッジ試験デバイス中で、検体により生じ得る。時間のかかる検体調製技術を捨て、標的特異的な識別可能な標識を使用することによって、本発明のシステムおよび方法は、わずか３０分間またはそれ未満での、検体中の標的の同定および列挙を可能にする。
【0034】
カートリッジは、感染を引き起こしている病原体を同定するために使用され得る。例えば、本発明のカートリッジは、培養ベースの微生物学的な予めの富化も核酸増幅も必要とせずに、患者検体中の病原体を直接的に同定および定量化するために使用され得る。好ましい方法は、本明細書に記載される機器中のマイクロタイタープレートまたはカートリッジ中で、約３０分間で実施することができる、磁気選択と組み合わせた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ベースの方法を使用して標識することによって、単一の反応混合物中の標的病原体（複数可）を列挙する。
【0035】
本発明のカートリッジは、診断的抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のために、即ち、どの抗微生物薬が患者の検体中の微生物病原体の成長を防止できるかを決定するために、使用され得る。この情報は、どの抗微生物薬をその特定の患者の感染を効果的に処置するために使用すべきかについての情報を、臨床医に提供する。
【0036】
抗微生物薬感受性試験は、段階的プロセスと考えることができる。目的は、抗微生物剤のパネルのどのメンバーが、患者の感染を引き起こしている特定の病原体株に対して有効であるかを決定することである。典型的には、感染が検出されると、病原体の種が最初に同定される。病原体の種を同定することは、その種を処置するために一般に使用され得る抗微生物薬および投薬を選択するために有用である。しかし、感染を引き起こしている特定の病原体株は、抗微生物薬のいずれかに対して耐性になっている場合があるので、その病原体が実際に感受性である潜在的処置を決定するために、抗微生物薬感受性試験を実施する必要がある。
【0037】
種の同定後、患者の検体からの病原体細胞は、種々の濃度の種々の抗微生物薬を含む栄養成長培地を含む一連の液体溶液へと割り振られ、またはアリコート化される。次いで、アリコートは、微生物複製につながる温度（一般には３５～３７℃）でインキュベートされる。病原体が抗微生物薬に対して感受性である場合、この病原体は正常に複製できる、即ち、病原体細胞の数は、抗微生物薬の非存在下での微生物学的成長培地中と同様に増加する。病原体が抗微生物薬に対して感受性である場合、この病原体は、複製できない、はるかに低い程度までしか複製しない、または形態学的もしくは他の異常を示し、これは、抗微生物剤の有効性を示す。最後に、病原体細胞の複製が、どの抗微生物剤が有効であるかを決定するために、種々のアリコート中で評価される。本発明者らは、一連の抗微生物薬についての病原体の抗微生物薬感受性／耐性結果のセットを、その抗微生物薬感受性プロファイルと呼ぶ。
【0038】
抗微生物薬感受性試験のための従来法および本発明のカートリッジにおけるより迅速な試験のために使用され得る方法は共に、上記ステップに従うが、本発明によって可能にされ得る方法は、病原体の抗微生物薬感受性プロファイルを数時間で決定し、一方で、従来法は数日を要する。本発明の方法を使用する迅速な抗微生物薬感受性試験結果は、高濃度の純粋な細胞を達成するための時間のかかる培養ベースの予めの富化成長なしに患者検体を直接的に試験する、新たな方法の能力から生じる。この富化および精製は、ペトリ皿上でのコロニー精製を使用して行われることが最も一般的である。
【0039】
従来法について、コロニー精製後に回収された細胞は、生化学的、微生物学的、核酸方法またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）を使用して最初に同定される。病原体種の正体が既知になると、その種の病原体についての抗微生物薬感受性プロファイルを決定するのに適切な、適切な抗微生物薬および濃度が選択され得る。
【0040】
本発明のカートリッジによって可能にされる方法のいくつかの新規態様は、患者検体から直接的に、抗微生物薬感受性結果を迅速に得ることを可能にする。
【0041】
最初に、患者検体は、一般に、従来の抗微生物薬感受性試験のために必要とされる細胞数よりも数桁少ない細胞を含む。現行の培養－予めの富化依存的方法とは対照的に、カートリッジは、非拡大デジタルイメージングを使用する高感度の単一細胞計数によって少数の病原体細胞を列挙するように操作され得る。さらに、この方法は、少数の個々の細胞を列挙するので、非常にすぐに － わずか数世代の細菌で － 抗微生物薬および成長培地を含むアリコート中で細胞が数を増加させたかどうかを決定することができる。
【0042】
第２に、患者検体は、試料マトリックスと、感染性病原体とは無関係の共生微生物とを含む。従来法のためのガイドライン（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｒまたはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇからのもの）は、ペトリ皿中の寒天ベースの成長培地上でのコロニーのクローン性成長から生じる精製された培養細胞を必要とする。これらの細胞は、単一の微生物種のみを含み、試料マトリックスを含まない。
【0043】
上で論じたように、病原体種の正体は、有効な臨床処置選択肢に到達するために抗微生物薬感受性試験結果を正確に解釈するために、既知でなければならない。これは、従来の最も新興の抗微生物薬感受性試験法が細胞の純粋な培養物をなぜ必要とするかの根底にある重要な理由である。
【0044】
上記のように抗微生物薬感受性プロファイルを決定するために、従来の最も新興の方法は、標的病原体の成長に対する異なる濃度の異なる抗微生物薬の影響を評価する。これらの方法が、抗微生物薬感受性試験結果を解釈するために、同定された細胞の純粋な集団を必要とする理由は、これらの方法が、抗微生物薬含有アリコートにおける成長を評価するために、非特異的方法、例えば、光散乱または顕微鏡法を使用するからである。１つよりも多くの種、例えば、病原体と、ヒトマイクロバイオームの一部である正常微生物の種とが存在した場合 － これは、ほとんどの初代患者検体においてあてはまる － を考慮する。成長が抗微生物薬含有アリコートにおいて観察された場合、疾患原因病原体、または共生種のうち１つもしくは複数が耐性であり、成長することが可能であったかどうかを、成長を検出するための一般的な方法を使用して言うことは不可能である。
【0045】
抗微生物薬の存在下で病原体が成長するかどうかを検出するために非特異的方法を使用することに起因して、精製された病原体細胞を要求する従来法などとは対照的に、本発明のカートリッジにおいて展開される方法は、抗微生物薬中での病原体の成長を評価するために、病原体特異的検出を使用する。疾患原因病原体細胞のみがインキュベーションステップ後に列挙される（いずれの共生微生物も列挙されない）ので、本発明の方法は、１つのまたは多くの共生微生物種を含む非滅菌初代検体において抗微生物薬感受性を直接的に決定するために使用され得る。
【0046】
カートリッジデバイスは、標的細胞または微生物を同定し、別々にまたは同じカートリッジ内で、検体中の標的の抗微生物薬感受性について試験するために、使用され得る。本発明の好ましい実施形態では、試験デバイスは、検体を別々の部分へと内部で分割し、そこで、これらの部分の一部は、差次的成長を決定するためのイメージングの前に、種々の抗微生物剤の存在下でインキュベートされ得る。これらの部分のうち１つまたは複数は、インキュベートされた部分における成長、成長阻害または形態変化を決定するためのベースライン参照を提供するために、直接的に処理およびイメージングされ得る。種々の抗微生物薬中でインキュベートされた部分の成長を定量化することによって、標的の成長を低減または防止することにおける各抗微生物剤の有効性が決定される。標的細胞計数または細胞形態における変化を観察することによって、処置の有効性が決定され得る。
【0047】
本明細書に記載されるカートリッジおよびそれらを操作する機器は、様々なクラスの標的（例えば、ウイルス、ヒト細胞、細菌細胞または真菌細胞）に対する薬剤の有効性を同定および試験すること、ならびにまた、単一のデバイスにおいて複数の異なる標的についてかかる同定および抗微生物薬感受性試験を同時に実施することが可能であり、それによって、異なる試験適用（例えば、血液、尿路、胃腸および呼吸器感染）のために設計された複数の試験デバイスによって典型的には実施される試験を実施する単一の機器の開発を可能にする。したがって、頑強な機能性が、本明細書に記載されるカートリッジおよびそれらを操作する機器によって提供される。
【0048】
本発明のカートリッジは、患者検体から直接的に抗微生物薬感受性結果を迅速に得るために使用される。患者検体は、一般に、従来の抗微生物薬感受性試験のために必要とされる細胞数よりも数桁少ない細胞を含む。本発明のカートリッジを使用して、少数の病原体細胞が、現行の培養－予めの富化依存的方法とは対照的に、非拡大デジタルイメージングを使用する高感度の単一細胞計数によって列挙され得る。さらに、少数の個々の細胞が列挙されるので、本発明は、非常にすぐに － わずか数世代の細菌で － 抗微生物薬および成長培地を含むアリコート中で細胞が数を増加させたかどうかを決定することができる。
【0049】
標的が同定されると、抗微生物薬感受性試験は、その標的に適切な抗微生物剤または処置（例えば、処置において一般に使用されるもの、または同定された標的の成長を阻害することが公知のもの）を含み得る。先に述べたように、標的細胞または微生物の同定は、適切な標的特異的治療を決定するために重要であり得る。同定は、本明細書に記載される抗微生物薬感受性試験法において使用されるのと同じ処理およびイメージング技術を使用して実施され得、差次的成長または治療有効性分析に使用されるのと同じ型のカートリッジデバイス、機器および方法を使用して実施され得る。ある特定の実施形態では、同定および治療感受性試験は、同じデバイスにおいて、同じ検体（別々の部分へと分割された）に対して実施され得る。標的同定は、本発明の範囲に入らない他の技術、例えば、標的特異的プライマーを用いた増幅、イムノアッセイ、質量分析、核酸配列決定またはオリゴヌクレオチドプローブアレイ分析を使用して実施することもできる。同定が別々に実施される場合、本発明のカートリッジは、適切な試薬を含む抗微生物薬感受性試験デバイスとして使用され得、同定された病原体に対する抗微生物薬が、本発明に従って使用され得る。
【0050】
種々の抗微生物剤の存在下で差次的成長を検出することは、標的病原体に依存して異なる時間量を必要とし得るが、標準的な抗微生物薬感受性試験技術のために必要とされる日数からは大きく低減される。例えば、尿路感染と一般に関連する微生物の差次的成長は、約４時間またはそれ未満の後に、本発明の技術を使用して尿検体において観察され得る。上述のように、検体中の微生物を同定および定量化することは、３０分間またはそれ未満で達成され得、それによって、試験デバイスへの検体の導入後数時間以内に抗微生物薬感受性試験結果が得られる。
【0051】
ある特定の実施形態では、カートリッジデバイスの試験スイートは、症候性感染（例えば、肺炎または尿路感染）についての感染検出ならびに病原体同定（ＩＤ）および抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のために使用され得る。かかる試験スイートは、ＩＤ／ＡＳＴ試験スイートと呼ばれ、ＩＤカートリッジとＡＳＴカートリッジの感染特異的ファミリーとを含み得、その各々は、個々の病原体または関連の群の病原体を試験するための適切な抗微生物薬を含む。例えば、尿路感染（ＵＴＩ）試験スイートは、ＵＴＩ ＩＤカートリッジとＵＴＩ ＡＳＴカートリッジのファミリーとを含み得る。
【0052】
かかる感染特異的試験スイート中のＩＤカートリッジは、感染を検出し、検体中の感染性病原体（複数可）のバイオバーデンまたは濃度を同定および定量化することができる。同じカートリッジは、同じデバイス上で、宿主応答バイオマーカー（例えば、サイトカイン）および炎症細胞（例えば、好中球）、または試料品質の細胞マーカー（例えば、扁平上皮細胞）を含む診断的に情報価値のあるマーカーについて、検体を同時に試験することもできる。同じ検体、カートリッジおよび機器における、病原体、バイオマーカーおよび診断的に情報価値のある宿主細胞の検出および定量化を組み合わせる能力は、本発明のシステムおよび方法の新規かつ潜在的に強力な利点である。
【0053】
ＩＤカートリッジ（または本発明の方法とは別の代替的な同定方法）を使用して感染が検出され、病原体が同定された場合、ＡＳＴカートリッジが、ＡＳＴ分析のためのＡＳＴカートリッジのファミリーから選択される。分析のために選択されるＡＳＴカートリッジは、特定の病原体を処置するために使用され得る適切な抗微生物薬と、特定の病原体を列挙するための適切なＦＩＳＨ試薬とを含む。
【0054】
次いで、本発明のカートリッジを使用して得られた抗微生物薬感受性試験結果は、感染性病原体についての抗微生物薬感受性プロファイルを決定するため、および患者が有効な抗微生物剤で処置され得るように患者に処置決定を伝えるために使用される。
【0055】
標的細胞を特異的に検出および定量化するための本発明のカートリッジ中に取り込まれる検出可能な標識には、標的特異的蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むプローブを含む）、蛍光抗体、特異的および非特異的リガンド、レクチン、染料、または標的に結合する色素が含まれ得る。ある特定の実施形態では、磁気タグが、標的微生物を磁気的に選択しイメージングする前に、標的微生物に結合する検出可能な標識と組み合わせて使用される。分離は、本明細書に記載される試験デバイス内で生じ得、磁場が、イメージングされる試験デバイス中の検出表面上に標識された微生物を沈着させるために使用され得る。ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号に記載される色素クッション層が、ユーザーによる検体調製ステップを最小化または排除するため、洗浄ステップを排除するため、および背景シグナルを低減させるために、分離およびイメージングステップにおいて使用され得る。その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号および米国特許第８，０２１，８４８号に記載されるデジタル非拡大イメージング技術は、例えば、単一細胞を含む標識された微生物を定量化するために使用され得る。
【0056】
本発明のカートリッジは、抗微生物薬感受性を決定するための方法を実行するように設計され得る。かかる方法は、好ましくは、症候性感染を有すると疑われる患者から検体を得るステップを含み、検体型は、感染性病原体（複数可）を潜在的に含む。次いで、検体は、カートリッジデバイス中に導入され、複数のアリコートへと分割される。１つのアリコートは、インキュベーション前の病原体細胞のベースライン濃度を決定するために即座に分析される。このアリコートについて、病原体細胞は、蛍光標識され、磁気的にタグ化され、色素クッションを介して引き付けられ、カートリッジ中のイメージングウェルのイメージング表面上に沈着し、イメージングされ、イメージ分析を使用して定量化される。他のアリコートは、全てカートリッジ内で、成長培地および種々の抗微生物剤の存在下で３５℃でインキュベートされる。種々の抗微生物薬の存在下での差次的成長の後に、病原体細胞は、蛍光標識され、磁気的にタグ化され、色素クッションを介して引き付けられ、カートリッジ中のイメージングウェルのイメージング表面上に沈着し、イメージングされ、イメージ分析を使用して定量化される。抗微生物薬を含むアリコート中の列挙された病原体細胞の数は、抗微生物薬感受性プロファイルおよびどの抗微生物薬が患者を処置するために有効であるかを決定するために、最初に（インキュベーション前に）列挙された病原体細胞の数と比較される。
【0057】
本発明の方法は、感染を検出するステップ、ならびに検体をカートリッジ中に導入する前に感染性病原体細胞を検出および同定するステップ、ならびに標的細胞または微生物の正体に基づいて複数の異なる抗微生物剤を選択するステップを含み得る。標的病原体の同定は、好ましくは、磁気的にタグ化され蛍光標識された標的を含む複合体が特異的に形成されるように、患者からの第１の検体を、第１の標的に結合できる磁気タグおよび蛍光標識に曝露させるステップを含む。磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引する；検出表面をイメージングして、検出可能な標識を検出および定量化し、ここで、検出可能な標識の存在および濃度は、標的病原体が存在するかどうか、およびその標的病原体がどのくらい存在するかを示す。検出ステップは、約３０分未満かかり得る。
【0058】
抗微生物薬感受性試験適用のために設計されたカートリッジについて、標的病原体細胞は、上記のように、差次的成長後に特異的に検出され得る。
【0059】
本発明のカートリッジは、細胞内標的（例えば、毒素、バイオマーカー、宿主－応答因子、ウイルス特異的分子またはウイルス粒子）を検出および定量化するために類似の戦略を使用することができる。標的特異的磁気タグおよび蛍光標識は、好ましくは、かかる標的に結合して、複合体を形成するために使用される。本発明のシステムおよび方法は、イメージングおよびイメージ分析による列挙のために、イメージング表面上にこれらの複合体を沈着させるために使用される。細胞内標的を検出するための標的特異的磁気タグおよび蛍光標識は、好ましくは、標的特異的結合剤（例えば、抗体、アプタマー、受容体、リガンド）にコンジュゲートされた磁気および蛍光粒子である。磁気的にタグ化され蛍光標識された標的複合体の特異的形成は、種々の方法で生じる。磁気タグまたは蛍光標識のいずれかは、標的に特異的に結合するように設計され得る。あるいは、磁気タグおよび蛍光標識は共に、標的に特異的に結合するように設計され得る。いずれの場合にも、磁気的に選択された複合体のイメージングと組み合わせた磁気選択は、検体中の特定の標的の検出および列挙を生じる。磁気タグおよび蛍光標識が標的と関連し得る種々の機構が存在する。
【0060】
磁気タグまたは蛍光標識が標的に非特異的に結合し得る種々の方法が存在する。例えば、種々のカテゴリーの標的にわたって保存された部位に結合する結合性磁気タグまたは蛍光標識は、磁気タグまたは蛍光標識を、その部位に結合する部分（例えば、抗体もしくは他のタンパク質結合パートナー、レクチン、またはリガンド）にコンジュゲートすることによって達成され得る。磁気タグまたは蛍光標識は、一般的な化学的性状またはコロイド性状に起因しても、非特異的に結合し得る。例えば、正に荷電した磁気粒子または蛍光標識は、一般には負に荷電した細菌細胞に非特異的に結合できる。細胞は、種々の色素（例えば、カルコフロール）または蛍光発生色素（例えば、ヨウ化プロピジウム、フルオレセインジアセテート）によって非特異的に標識され得る。染められた蛍光粒子は、それらの化学的性状もしくはコロイド性状のおかげで、またはそれらを上記のものなどの非特異的結合分子にコンジュゲートすることによって、標的細胞に非特異的に結合する蛍光標識として使用され得る。
【0061】
磁気タグまたは蛍光標識はまた、それらが標的に特異的に結合するように、種々の方法で選択され得る。例えば、磁気タグ（またはフルオロフォア）は、標的特異的抗原に結合する抗体にコンジュゲートされ得る。類似の効果のために、磁気タグまたはフルオロフォアは、かかる標的特異的抗体に結合した（または結合し得る）リガンド（例えば、ビオチン）に特異的に結合する分子（例えば、アビジン）にコンジュゲートされ得る。細胞は、それ自体フルオロフォアで標識された標的特異的核酸プローブ（または核酸アナログプローブ）との再会合またはハイブリダイゼーションによっても、特異的に標識され得る。染められた蛍光粒子は、それらを、ある特定の実施形態について記載されるものなどの標的特異的結合分子にコンジュゲートすることによって、標的細胞に特異的に結合する蛍光標識として使用され得、標識およびイメージングステップは、検体部分を、フルオロフォア標識された標的特異的結合分子および磁気粒子に曝露させるステップであって、フルオロフォア標識された標的特異的結合分子および磁気粒子が、標的に結合して複合体を形成する、ステップ；磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引するステップ；ならびに検出表面をイメージングするステップ、を含む。フルオロフォア標識された標的特異的結合分子には、標的細胞に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブが含まれ得る。曝露およびイメージングステップは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）方法論および分析を含み得る。
【0062】
カートリッジおよび関連の方法は、標的の成長を阻害すると決定された抗微生物薬または他の処置を通常は含む、患者の感染を処置するために推奨される抗微生物剤を決定するように動作可能であり得る。標的の成長を阻害する処置の決定は、検体を試験デバイス中に導入した数時間後（例えば、４時間後）に生じ得る。身体検体は、組織検体（例えば、創傷または生検検体）または体液検体であり得る。本発明との使用のために好ましい体液には、呼吸器（例えば、痰気管内吸引物、保護された検体ブラシ、気管支肺胞洗浄液）、血液、尿、糞便、スワブ（例えば、鼻、口腔／咽頭、手術部位、皮膚および軟組織、直腸）および脳脊髄液が含まれるがこれらに限定されない。
【0063】
ある特定の態様では、本発明のカートリッジは、検体中の標的細胞または微生物の治療感受性を決定するように動作可能である。かかるカートリッジは、患者からの体液および標的細胞または微生物を含む検体ならびに機器または機器を受け入れることができる。機器は、好ましくは、検体を試験デバイス内の複数の部分へと分割するように試験デバイスをマニピュレートし；試験デバイス内で複数の異なる治療剤の存在下でこれらの部分をインキュベートし；試験デバイス内でインキュベートされた部分内の標的細胞を蛍光標識および磁気的にタグ化し；磁気的にタグ化され蛍光標識された標的複合体を未結合の蛍光標識から分離し；試験デバイス内でこれらの部分をイメージングして、どの処置（複数可）が標的細胞の複製を阻害するかを決定するために標的複合体を定量化するように動作可能である。
【0064】
システムは、微生物学的適用のために、感染を検出し病原体を同定するために使用され得る、カートリッジ試験デバイスを含み得る。患者検体は、デバイスに添加され得、そこで、患者検体は、複数のアリコートへと分けられ得、その各々は、標識され磁気的にタグ化された標的複合体が形成されるように、磁気タグおよび複数の型の標的特異的な検出可能な標識（例えば、別個のフルオロフォア標識を有する結合分子）と接触され得；磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引する；検出表面をイメージングして、標識された複合体を検出し、特定のアリコート中の、特定の検出可能な標識で標識された複合体の検出は、特定の標的の存在を示す。
【0065】
カートリッジは、抗微生物薬感受性適用のために、検体アリコートを種々の抗微生物剤と接触させ；検体を含むアリコートまたは部分を、標的、磁気タグおよび検出可能な標識による複合体が特異的に形成されるように選択された磁気タグおよび検出可能な標識と接触させ；磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引し；検出表面をイメージングし；イメージ分析を実施して、試験結果を決定するように、機器によって操作可能であり得る。
【0066】
本発明のカートリッジでは、インキュベートされた検体の各々中の同定された標的細胞または微生物の数を検出するステップは、インキュベートされた検体を、標的、磁気タグおよび検出可能な標識による複合体が特異的に形成されるように選択された磁気タグおよび検出可能な標識と接触させるステップ；磁場を複合体に印加して、複合体を検出表面に誘引するステップ；ならびに検出表面をイメージングして、同定された標的の各々の成長に対する治療剤の各々の効果を決定するステップ、を含み得る。
【0067】
複数のアリコートは、抗微生物剤の２倍連続希釈に、または抗微生物薬感受性試験のためのＣＬＳＩブレイクポイントに対応する濃度に好ましくは対応する異なる濃度で存在する同じ抗微生物剤と組み合わされ得る。かかる部分の数および抗微生物薬の濃度は、感受性／耐性結果、カテゴリー的（感受性、中間耐性、耐性またはＳＩＲ結果）または最小阻害濃度（ＭＩＣ）結果を得るために選択され得る。特定の微生物病原体種に対する抗微生物薬の適切な濃度は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）によって記述されている。
【0068】
本発明に従うカートリッジは、多数の精製された細胞を生成するために従来法によって必要とされる時間のかかるステップを排除するために使用することができる。カートリッジには、抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）およびＦＩＳＨ試験を実施するための試薬が予めロードされる。本発明のカートリッジは、従来法によって要求される数日間ではなく数時間で、感染を検出し、感染性病原体および有効な抗微生物剤を同定するために使用される。症状の開始にかなり近い段階で感染を検出し、有効な標的化された抗微生物剤を同定することによって、本発明は、医学的転帰を劇的に改善し得、耐性原因広域スペクトル抗生物質による経験的処置を最小化し得る。
【0069】
特に、本発明のカートリッジは、患者検体から直接的に抗微生物薬感受性結果を迅速に得るために使用される。患者検体は、一般に、従来の抗微生物薬感受性試験のために必要とされる細胞数よりも数桁少ない細胞を含む。本発明のカートリッジを使用して、少数の病原体細胞が、現行の培養－予めの富化依存的方法とは対照的に、非拡大デジタルイメージングを使用する高感度の単一細胞計数によって列挙され得る。さらに、少数の個々の細胞が列挙されるので、本発明は、非常にすぐに － わずか数世代の細菌で － 抗微生物薬および成長培地を含むアリコート中で細胞が数を増加させたかどうかを決定することができる。
【0070】
さらに、患者検体は、試料マトリックスと、感染性病原体とは無関係の共生微生物とを含む。従来法のためのガイドライン、例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＥＣＡＳＴ）からのものは、ペトリ皿中の寒天ベースの成長培地上でのコロニーのクローン性成長から生じる精製された培養細胞を必要とする。これらの細胞は、単一の微生物種のみを含み、試料マトリックスを含まない。
【0071】
上で論じたように、病原体種の正体は、有効な臨床処置選択肢に到達するために抗微生物薬感受性試験結果を正確に解釈するために、既知でなければならない。これは、従来の最も新興の抗微生物薬感受性試験法が細胞の純粋な培養物をなぜ必要とするかの根底にある重要な理由である。抗微生物薬感受性プロファイルを決定するために、従来の最も新興の方法は、標的病原体の成長に対する異なる濃度の異なる抗微生物薬の影響を評価する。これらの方法が、抗微生物薬感受性試験結果を解釈するために、同定された細胞の純粋な集団を必要とする理由は、これらの方法が、抗微生物薬含有アリコートにおける成長を評価するために、非特異的方法、例えば、光散乱または顕微鏡法を使用するからである。１つよりも多くの種、例えば、病原体と、ヒトマイクロバイオームの一部である正常微生物の種とが存在した場合 － これは、ほとんどの初代患者検体においてあてはまる － を考慮する。成長が抗微生物薬含有アリコートにおいて観察された場合、疾患原因病原体、または共生種のうち１つもしくは複数が耐性であり、成長することが可能であったかどうかを、成長を検出するための一般的な方法を使用して言うことは不可能である。
【0072】
抗微生物薬の存在下で病原体が成長するかどうかを検出するために非特異的方法を使用することに起因して、精製された病原体細胞を要求する従来法などとは対照的に、本発明は、種々の抗微生物薬の存在下での病原体の成長を評価するために、病原体特異的検出を使用する。疾患原因病原体細胞のみがインキュベーションステップ後に列挙される（いずれの共生微生物も列挙されない）ので、本発明のカートリッジは、１つのまたは多くの共生微生物種を含む非滅菌初代検体において抗微生物薬感受性を直接的に決定するために使用され得る。
【0073】
本発明に従うカートリッジは、検体が、感染を引き起こすと疑われるのに十分な数の病原体種の細胞を含むかどうかを決定するために、病原体同定のために使用され得る。本発明に従うカートリッジは、１つまたは複数の抗微生物剤のどれが、患者検体中の、感染を引き起こすと疑われる病原体の正常な細胞複製を防止することができるかを決定するために、抗微生物薬感受性試験のために使用され得る。かかる抗微生物剤は、患者の感染を効果的に処置するために、潜在的に使用され得る。
【0074】
単一の検体がカートリッジに添加され得、検体中に存在する標的微生物が種々の薬剤の存在下でインキュベートされるのを可能にするためにウェル間で分割され得るように、カートリッジは、成長培地および種々の抗微生物剤が予めロードされ得る種々の分割またはインキュベーションウェルを含む。インキュベーション後、検体は、種々の抗微生物剤に対する標的微生物の感受性を決定するための差次的成長分析を提供するために、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、処理およびイメージングされ得る。ＡＳＴは、一定の生理的温度でＦＩＳＨを使用し得る。ＦＩＳＨプロトコールを使用すると、カートリッジは、微生物同定試験または抗生物質感受性試験のために有用である。本開示のカートリッジを使用して研究される臨床的検体は、インキュベートされ、患者の温度と一致した温度で試験が実施され、そうして、患者中の成長している関連の感染性細菌が、カートリッジ中で成長し続ける。
【0075】
カートリッジには、体温を顕著に上回って加熱することなしに病原性細菌が蛍光標識およびイメージングすることができるように、蛍光プローブおよび微生物を化学的に透過処理する試薬が予めロードされる。ＦＩＳＨプロトコールは生理的温度で実施されるので、臨床的検体は、臨床的にミスリードする細菌成長パターンを促進する極度の熱に曝露されない。カートリッジは、いずれの検体調製も必要としない、患者検体、例えば、糞便または尿からの直接的な微生物同定または感受性試験のために設計される。カートリッジおよび関連のリーダー機器は、数時間以内に試験結果を提供し、感染の原因またはどの抗生物質処置が有効であるかを迅速かつ容易に同定する能力を臨床医に与える。
【0076】
本発明の好ましい実施形態では、カートリッジは、抗微生物薬感受性試験のために使用され、検体は、微生物学的細胞の複製または成長を促進する栄養成長培地を含む別々の部分へと分割される。これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞の数および品質を決定するための、成長を促進する温度でのインキュベーション前に直接的に処理および分析される参照またはベースライン部分として使用され得る。これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞が生存可能かどうかを確認するために、病原体細胞の成長を促進する温度でインキュベートされ得る。さらに、他の部分は各々、特定の濃度の１つまたは複数の抗微生物剤を含み、病原体細胞複製に対する抗微生物剤の影響を決定するためにインキュベートされる。
【0077】
ユーザーが、検体をカートリッジ中にロードし、結果を受け取る必要があるだけになるように、カートリッジは、その中の検体をマニピュレートし、カートリッジをインキュベートし、必要な処理およびイメージングステップを実施するように動作可能な機器とインターフェース接続し得る。Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の感染が疑われる場合に、ユーザーが、Ｅ．ｃｏｌｉ特異的試薬（例えば、培地、抗微生物薬およびＦＩＳＨプローブ）を予めロードした適切なカートリッジを選択することができるように、カートリッジは、特定の微生物のために特異的に選択された成長培地および抗微生物剤を含み得る。全ての必要な試薬を予めロードしたＡＳＴ特異的カートリッジ、アッセイステップを実施するための別々のステーションおよび機器内でのそれへのランダムアクセスを有する自動機器、ならびに複数のカートリッジおよびアッセイのコンピューター化されたスケジューリングおよびマニピュレーションの組合せを介して、本発明のシステムおよび方法は、検体入力のみを必要とし、診療現場環境においてすぐに実施可能な結果を提供する種々のアッセイを自動的かつ同時に実行することができる。カートリッジおよび関連の機器の自動化された性質により、著しい専門的訓練なしの医療専門家による操作が可能になる。
【0078】
カートリッジには、製造の間に必要な試薬がセットアップされ得、ユーザーが、試験される検体（例えば、患者からの血液検体）を添加し、カートリッジを機器中に挿入する必要があるだけの状態で診療現場設備に分配され得る。本明細書に記載される機器は、実施されているアッセイに従って、アッセイ特異的カートリッジを受け入れ、格納し、ステーション間でアッセイ特異的カートリッジを移動させるために使用されるカルーセルの周囲に位置決めされる、異なるアッセイステップを実施するための種々の異なるステーションを使用する。
【0079】
カートリッジは、検体を受け入れるための検体チャンバー、および異なる抗微生物剤を予めロードしたいくつかの分割またはインキュベーションウェルを含み得る。カートリッジは、複数のイメージングウェルもまた含み得、各イメージングウェルは、単一の分割ウェルに対応する。イメージングウェルは、その差次的成長分析を提供し、特定の標的微生物による患者の感染に対する最も有効な処置を決定するために、種々の薬剤の存在下でのインキュベーション後に標的微生物を処理およびイメージングするための必要な試薬を含み得る。
【0080】
検体チャンバー、分割ウェルおよびイメージングウェルは、一連のチャネルおよびバルブ、例えば、分割ウェルとイメージングウェルとの間に配置されたスライディングバーを介して、互いに選択的に連結され得る。チャネルが、分割ウェルの出口チャネルおよび対応するイメージングウェルの入口チャネルと整列して、それらの間に流体経路を創出することができるように、バーは、垂直チャネルを含み得、水平にスライド可能であり得る。いずれかの方向で水平にスライドされると、バーのチャネルは、これらのウェルと整列しなくなり、それによって、ウェルを隔離し、そこでの流体連通を防止し得る。バルブは、実施されるアッセイステップに依存して、本明細書に記載される機器によって外部からマニピュレートされ得る。
【0081】
カートリッジは、種々の区画間で検体を動かすためにカートリッジ内に圧力勾配を印加するための空気圧供給源への連結のための空気圧または他のインターフェースを含み得る。バルブと連動してマニピュレートされると、空気圧供給源は、カートリッジ内の種々の区画間のチャネルを開放し、次いで、開放チャネルを介して検体流体を指向させるために使用され得る。
【0082】
カートリッジを受け入れマニピュレートするための機器は、複数の試験が実施され得るように異なるステーションにランダムにアクセスするためにカルーセルを使用することができる。正確なコンピュータースケジューリングおよび機器中の種々のステーションへのコンピューター制御されるランダムアクセスは、さらなるユーザー入力なしに種々のアッセイの全てのステップを自動的に実施するために使用される。カートリッジを機器中にロードした後で、ユーザーの次のインタラクションは、機器の場所でまたは遠隔で、アッセイの結果を受け取ることまたは検分することであり得る。結果は、処理された検体から得られたイメージのような単純なものであり得、または種々の抗微生物剤についての微生物同定および感受性スコアなどの自動的解釈を含み得る。
【0083】
ステーションは、カートリッジとインターフェース接続し、その中の検体および試薬をマニピュレートするための流体工学モジュール；標的の磁気選択のための磁気プルダウンステーション；使用したカートリッジの処分のための廃棄物ステーション；アッセイされた検体を分析するためのイメージングステーション；種々のアッセイステップのために必要に応じてカートリッジ上の検体および試薬において温度を維持するためのインキュベーションステーション；ならびに使用したカートリッジの処分のための廃棄物ステーションを含み得る。好ましい実施形態では、アッセイは、全てのステップを通じて一定の温度を使用し得、または機器の内部が要求される温度で維持され得、カルーセルがインキュベーションステップのための格納ステーションとして働き得るようにそれを実施するように、改変され得る。
【0084】
機器は、実施されるアッセイおよび任意の所与のカートリッジについてそのアッセイに必要とされるステップを決定するために、カートリッジ上のコードもしくはタグを読み取ることができ、またはユーザーからの入力を受け取ることができる。機器は、結果を報告するための、患者情報を含む、試験されている検体と関連する情報を記録および追跡するために、その入力を使用することもできる。
【0085】
機器は、プロセッサーおよび非一時的な有形メモリを含んでおり、機器内で実施されているアッセイをスケジューリングおよび制御し、その中のカートリッジを追跡するように動作可能なコンピューターを含み得る。コンピューターは、ユーザーからの情報をもたらしかつ受け取り、結果およびステータス情報を表示するためのユーザーインターフェースを含み得る。コンピューターは、ネットワークに接続され得、アッセイ結果を処理し、接続されたデバイスにネットワークを通じて送るように動作可能であり得る。
【0086】
本発明の機器は、必要なアッセイステップのパフォーマンスのために、カルーセルと種々のステーションとの間でカートリッジを動かすための機械的コンベアアームを含み得る。好ましい実施形態では、カルーセルおよびステーションは、ステーション内にカートリッジを受容し位置決めするようなサイズにされたスロットを含む。カルーセルの回転は、カルーセルスロットを、適切なステーション中の対応するスロットと整列させることができ、機械的コンベアアームは、カートリッジの側面に接触し、整列されたスロットに沿って選択されたステーション中にカートリッジをスライドさせるように動作可能であり得る。機械的コンベアアームは、カートリッジを握ることを回避し、握り機構と関連する詰まりを低減させる。機械的コンベアアームは、カートリッジに隣接し、その一方の側面に原動力を提供するように動作可能な、２つの回転可能なプロングを含み得る。カルーセルおよびステーションスロットの側面は、カートリッジがスライドされる際の側方ガイダンスを提供することができ、カートリッジを動かすための握り機構の必要を回避する。
【0087】
予めロードしたカートリッジは、製造側での試薬の体積および分配の制御を可能にし、自動化機器は、アッセイステップのパフォーマンスおよびそのタイミングを制御する。したがって、システムおよび方法は、ユーザーエラーの潜在性を大きく低減させることができ、未熟なスタッフが専門的訓練なしに種々のアッセイを実施し、専用の現場外試験の遅延およびコストなしに、信頼性のあるすぐに実施可能な結果を得ることを可能にする。
【0088】
好ましい実施形態では、アッセイ特異的カートリッジは、検体微生物に基づいて選択される種々の抗微生物剤の存在下での検体微生物の差次的成長を測定するための微生物特異的ＡＳＴカートリッジを含む。記載される技術およびシステムの頑強な性質は、がんまたは他の細胞などの非微生物標的についての分析も可能にする。例えば、本発明は、治療有効性、耐性モニタリング（抗微生物薬および他の化学療法薬の両方に関する）および治療選択を決定するために有用である。本発明によれば、患者検体、例えば、尿、糞便または血液は、最小限の検体調製もしくは培養を伴って、または検体調製もしくは培養を伴わずに、直接的に分析される。本発明に従って処理される検体は、同定され、種々の抗微生物薬または他の処置モダリティ（例えば、がん細胞に対する化学療法）に曝露され、最も有効な処置の選択を可能にする。微生物感染は同定され得、適切な処置はほんの数時間で決定され得、適切に標的化された治療の遅延を大きく低減させ、積極的な広域スペクトル抗微生物薬による経験的な処置の必要を回避する。本発明により、医療提供者が、感染患者を適切に処置するために、最初に有効な治療を処方することが可能になる。したがって、本発明は、患者転帰を改善し、抗微生物薬耐性の伝播を低減させる機会を提供する。本発明のシステムおよび方法を使用するがんまたは他の細胞およびその処置の治療有効性のモニタリングは、最も有効な処置の迅速な同定を可能にし、治療耐性の発生に際したタイムリーな介入をさらに可能にする。
【0089】
感染検出、標的同定、および有効な処置の決定は、検体調製ステップをほとんどまたは全く伴わずに、患者検体、例えば、唾液、尿、血液、糞便、スワブまたは脳脊髄液から直接的に達成される。例えば、尿検体は、数時間で完了する同定（ＩＤ）および抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のために、試験デバイス中に直接的にピペッティングされる。これは、試験のために純粋な微生物培養物の大きい集団を産生するために１または複数日のコロニー精製を必要とする現行の培養ベースの方法とは対照的である。本発明は、全て試験デバイス内で、微生物もしくは細胞を同定するため、ならびに／または治療感受性および有効性を決定するために、患者検体を受け入れて内部で処理することが可能な試験デバイスおよび機器を提供する。検体中の複数の標的細胞または病原体が同定され得、複数の抗微生物薬または処置に対する感受性が、単一のデバイス中で試験され得る。本発明の試験システムおよび方法は、検体マトリックス、可変の接種材料、および検体中の共生微生物の存在に関して頑強である。本発明の試験により、多微生物感染についての正確な結果も得られる。
【0090】
本発明のシステムおよび方法は、種々の治療の感受性および有効性を決定するために、差次的成長、形態または他の観察可能な変化の追跡を可能にする標識された微生物標的細胞のイメージを提供する。検体は、検体中に存在する標的細胞、微生物または病原体の存在および正体を決定するために、直接的に処理およびイメージングされる。上述のように、処理およびイメージングステップは、カートリッジなどの試験デバイス中で、検体により生じ、試験デバイスの外側での検体調製をほとんど～全く必要としない。時間のかかる検体調製技術を捨て、標的特異的な識別可能な標識を使用することによって、本発明のシステムおよび方法は、３０分間またはそれ未満での、検体中の標的の同定および列挙を可能にする。
【0091】
検体はまた、イメージング前に、種々の型および種々の濃度の抗微生物剤または他の処置の存在下でインキュベートされ得る。インキュベーションは、処理およびイメージングステップが起こる同じ試験デバイス中で、または異なる試験デバイス中で生じ得る。
【0092】
本発明のシステムおよび方法は、標的細胞または微生物を同定し、（別々にまたは同じデバイス内で）治療有効性または検体中の標的の抗微生物薬感受性について試験するために、使用され得る。本発明の好ましい実施形態では、試験デバイスは、検体を別々の部分へと内部で分割し、そこで、これらの部分の一部は、差次的成長を決定するためのイメージングの前に、種々の抗微生物剤の存在下でインキュベートされ得る。これらの部分のうち１つまたは複数は、インキュベートされた部分における成長、細胞毒性または形態変化を決定するためのベースライン参照を提供するために、直接的に処理およびイメージングされ得る。種々の抗微生物薬または他の治療剤中でインキュベートされた部分の成長を定量化することによって、標的の成長を低減または防止することにおける各抗微生物剤の有効性が決定される。
【0093】
本明細書に記載される試験デバイスおよび機器は、様々なクラスの標的（例えば、ウイルス、ヒト細胞、細菌細胞または真菌細胞）に対する薬剤の有効性を同定および試験することが可能であるだけでなく、以下の説明を介して明らかなように、単一の機器における異なる試験適用（例えば、血液感染および呼吸器感染）のために設計された単一のデバイスおよび複数の試験デバイスにおける複数の異なる標的の選択およびマニピュレーションを介してかかる同定および治療的試験を同時に実施することが可能である。したがって、頑強な機能性が、本明細書に記載される機器および試験デバイスによって提供される。
【0094】
標的が同定されると、分析は、その標的に適切な抗微生物剤または処置（例えば、処置において一般に使用されるもの、または同定された標的の成長を阻害することが公知のもの）に限定され得る。先に述べたように、標的細胞または微生物の同定は、標的特異的治療への選択的曝露を可能にする。このように、初期の同定ステップは、ＡＳＴ前または治療有効性試験が開始される前であることが好ましい。同定は、本明細書に記載されるＡＳＴ法において使用されるのと同じ処理およびイメージング技術を使用して実施され得、差次的成長または治療有効性分析に使用されるのと同じ型のデバイス、機器および方法を使用して実施され得る。ある特定の実施形態では、同定および治療的試験は、同じデバイスにおいて、同じ検体（別々の部分へと分割された）に対して実施され得る。標的同定は、他の従来技術、例えば、標的特異的プライマーを用いた増幅、イムノアッセイ、質量分析またはオリゴヌクレオチドプローブアレイ分析を使用して実施することもできる。同定が別々に実施される場合、専用の差次的成長分析デバイスが使用され得る。本発明の処理技術および機器と適合性の専用の同定デバイスは、インキュベーションステップまたはリザーバーの必要を捨てることができる。
【0095】
種々の抗微生物剤の存在下での観察可能な差次的成長は、試験細胞または微生物に依存して異なる時間量を必要とするが、標準的なＡＳＴ技術のために必要とされる日数からは大きく低減される。例えば、尿路感染と一般に関連する微生物の差次的成長は、約４時間またはそれ未満の後に、本発明の技術を使用して尿検体において観察され得る。上述のように、検体中の微生物を同定および定量化することは、３０分間またはそれ未満で達成され得、それによって、試験デバイスへの検体の導入後数時間以内にＡＳＴ結果が得られる。ある特定の実施形態では、技術者が、適切なＡＳＴまたは治療有効性分析を実施するために、適切な試験デバイスを選択でき、患者検体をその中に直接的に導入できるように、種々の標的細胞または微生物に特異的な抗微生物剤または他の治療薬のサブセットを含むＡＳＴまたは治療有効性試験デバイスが提供される。
【0096】
次いで、本発明のシステムおよび方法を使用して得られたＡＳＴ結果は、抗微生物薬耐性を同定し、患者に処置決定を伝えるために使用され、ここで、患者は、ＡＳＴ分析において標的の成長または生存度を最も阻害することが見出された抗微生物剤で処置され得る。
【0097】
検出可能な標識には、蛍光オリゴヌクレオチドまたは抗体プローブ、特異的および非特異的リガンド、レクチン、染料、ならびに標的に結合する色素が含まれ得る。ある特定の実施形態では、磁気タグが、標的微生物を磁気的に選択しイメージングする前に、標的微生物に結合する検出可能な標識と組み合わせて使用される。分離は、本明細書に記載される試験デバイス内で生じ得、磁場が、イメージングされる試験デバイス中の検出表面上に標識された微生物を沈着させるために使用され得る。ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号に記載される色素クッション層が、背景シグナルを低減させるため、および標識された微生物のより正確な定量化を提供するために、分離およびイメージングステップにおいて使用され得る。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号および米国特許第８，０２１，８４８号に記載されるデジタル非拡大イメージング技術は、例えば、単一細胞を含む標識された微生物を定量化するために使用され得る。
【0098】
本発明の態様は、検体中の標的の、抗微生物薬感受性または他の処置に対する他の応答を決定するための方法を提供する。かかる方法は、好ましくは、１つまたは複数の型の標的を含むと疑われる組織または体液検体を得るステップを含む。次いで、検体は、全て試験デバイス内で、試験デバイス中に導入され、複数の部分へと分割され、複数の異なる抗微生物剤の存在下でインキュベートされる。これもまた試験デバイス内で、インキュベートされた部分内の標的は、どの抗微生物剤が標的の成長を阻害するかを決定するために、標識およびイメージングされる。
【0099】
本発明の方法は、検体を試験デバイス中に導入する前に標的細胞を同定するステップ、および標的細胞または微生物の正体に基づいて複数の異なる抗微生物剤を選択するステップを含み得る。標的細胞または微生物の同定は、好ましくは、磁気的にタグ化され蛍光標識された標的を含む複合体が特異的に形成されるように、患者からの第１の検体を、第１の標的に結合できる磁気タグおよび蛍光標識に曝露させるステップを含む。磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引する；検出表面をイメージングして、検出可能な標識を検出し、ここで、検出可能な標識の存在は、第１の標的の存在を示す。同定ステップは、約３０分未満かかり得る。
【0100】
磁気的にタグ化され蛍光標識された標的複合体の特異的形成は、種々の方法で生じる。磁気タグまたは蛍光標識のいずれかは、標的に特異的に結合するように設計され得る。あるいは、磁気タグおよび蛍光標識は共に、標的に特異的に結合するように設計され得る。いずれの場合にも、磁気的に選択された複合体のイメージングと組み合わせた磁気選択は、検体中の特定の標的の検出および列挙を生じる。磁気タグおよび蛍光標識が標的と関連し得る種々の機構が存在する。
【0101】
磁気タグまたは蛍光標識が標的に非特異的に結合し得る種々の方法が存在する。例えば、種々のカテゴリーの標的（例えば、ペプチドグリカン、ＬＰＳまたはグルカン）にわたって保存された部位に結合性磁気粒子（またはフルオロフォア）を結合させることは、磁気粒子（またはフルオロフォア）を、その部位に結合する抗体にコンジュゲートすることによって達成され得る。磁気タグまたは蛍光標識は、一般的な化学的性状に起因しても、非特異的に結合し得る。例えば、正に荷電した磁気粒子またはフルオロフォア標識は、一般には負に荷電した細菌細胞に非特異的に結合できる。細胞は、種々の色素（例えば、カルコフロール）または蛍光発生色素（ヨウ化プロピジウム、フルオレセインジアセテート）によって非特異的に標識され得る。
【0102】
磁気タグまたは蛍光標識はまた、それらが標的に特異的に結合するように、種々の方法で選択され得る。例えば、磁気タグ（またはフルオロフォア）は、標的特異的抗原に結合する抗体にコンジュゲートされ得る。類似の効果のために、磁気タグまたはフルオロフォアは、かかる標的特異的抗体に結合した（または結合し得る）リガンド（例えば、ビオチン）に特異的に結合する分子（例えば、アビジン）にコンジュゲートされ得る。細胞は、それ自体フルオロフォアで標識された標的特異的核酸プローブ（または核酸アナログプローブ）との再会合またはハイブリダイゼーションによっても、特異的に標識され得る。
【0103】
ある特定の実施形態では、標識およびイメージングステップは、検体部分を、標的特異的結合分子、磁気粒子および検出可能な標識に曝露させるステップであって、標的特異的結合分子が、標的、磁気粒子および検出可能な標識を含む複合体を形成する、ステップ；磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引するステップ；ならびに検出表面をイメージングするステップを含む。検出可能な標識には、蛍光マーカーが含まれ得、標的特異的結合分子には、オリゴヌクレオチドプローブが含まれ得る。曝露およびイメージングステップは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を含み得る。
【0104】
本発明の方法は、標的の成長を阻害すると決定された抗微生物薬または他の処置を通常は含む、患者のために推奨される抗微生物薬または他の治療を決定するステップを含み得る。標的の成長を阻害する処置の決定は、検体を試験デバイス中に導入した約４時間未満後に生じ得る。身体検体は、組織検体（例えば、患者からの生検）または体液検体であり得る。本発明との使用のために好ましい体液には、呼吸器（例えば、痰気管内吸引物、保護された検体ブラシ、気管支肺胞洗浄液）、血液、尿、糞便、スワブ（例えば、鼻、口腔／咽頭、手術部位、皮膚および軟組織、直腸）および脳脊髄液が含まれるがこれらに限定されない。
【0105】
ある特定の態様では、本発明は、検体中の標的細胞または微生物の治療感受性を決定するためのシステムを提供する。好ましいシステムは、患者からの体液および標的細胞または微生物を含む検体を受け入れるように動作可能な試験デバイスならびに機器を含む。機器は、好ましくは、検体を試験デバイス内の複数の部分へと分割するように試験デバイスをマニピュレートし；試験デバイス内で複数の異なる治療剤の存在下でこれらの部分をインキュベートし；試験デバイス内でインキュベートされた部分内の標的細胞を蛍光標識および磁気的にタグ化し；磁気的にタグ化され蛍光標識された標的複合体を未結合の蛍光標識から分離し；試験デバイス内でこれらの部分をイメージングして、どの処置（複数可）が標的細胞の複製を阻害するかを決定するために標的複合体を定量化するように動作可能である。
【0106】
システムは、患者からの第１の検体を受け入れるように動作可能な第１の試験デバイスをさらに含み得、機器は、患者からの第１の検体を、第１の標的、磁気タグおよび検出可能な標識による複合体が特異的に形成されるように選択された磁気タグおよび検出可能な標識に曝露し；磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引し；検出表面をイメージングして、検出可能な標識を検出するようにさらに動作可能であり得、ここで、検出可能な標識の存在は、第１の標的の存在を示す。
【0107】
機器は、インキュベートされた検体部分を、標的、磁気タグおよび検出可能な標識による複合体が特異的に形成されるように選択された磁気タグおよび検出可能な標識に曝露し；磁場を試験デバイスに印加して、複合体を検出表面に誘引し；検出表面をイメージングするように動作可能であり得る。
【0108】
本発明の態様は、検体中の標的細胞または微生物の治療感受性を決定するための方法を提供する。方法は、機器によって実施される同定アッセイを使用して、患者からの第１の検体中の１つまたは複数の標的を同定するステップ；第１の検体中の同定された標的細胞または微生物に基づいて、１つまたは複数の治療剤を選択するステップ；治療剤の各々の存在下で、機器内で患者からの検体を別々にインキュベートするステップ；機器を使用して、インキュベートされた検体の各々中の、いくつかの標的細胞、ＣＦＵ、ウイルス負荷、生存標的細胞、または治療有効性（または処置の影響）の他の指標を検出するステップ；および標的の検出された量、形態または他の表現型性状に基づいて、同定された標的の各々について、治療剤（または処置）の各々に対する感受性（または処置の影響）を決定するステップ、を含み得る。
【0109】
同定アッセイは、第１の検体を、標的、磁気タグおよび検出可能な標識による複合体が特異的に形成されるように選択された磁気タグおよび検出可能な標識と接触させるステップ；磁場を複合体に印加して、複合体を検出表面に誘引するステップ；ならびに検出表面をイメージングして、複合体の存在を決定するステップ、を含み得、ここで、複合体の存在は、検体中に存在する標的を同定する。
【0110】
インキュベートされた検体の各々中の同定された標的細胞または微生物の量を検出するステップは、インキュベートされた検体を、標的、磁気タグおよび検出可能な標識による複合体が特異的に形成されるように選択された磁気タグおよび検出可能な標識と接触させるステップ；磁場を複合体に印加して、複合体を検出表面に誘引するステップ；ならびに検出表面をイメージングして、同定された標的の各々の成長に対する治療剤の各々の効果を決定するステップ、を含み得る。
【0111】
複数の部分は、抗微生物薬の２倍連続希釈に好ましくは対応する異なる濃度で存在する同じ抗生物質と組み合わされ得る。この方法で、標的の成長を阻害する抗生物質のレベルを決定することが可能である。かかる部分の数および抗微生物薬の濃度は、感受性／耐性結果、カテゴリー的（感受性、中間耐性、耐性またはＳＩＲ結果）または最小阻害濃度（ＭＩＣ）結果を得るために選択され得る。特定の微生物病原体種に対する抗微生物薬の適切な濃度は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）によって記述されている。
【0112】
ある特定の態様では、本発明は、カートリッジを提供する。カートリッジは、インキュベーションウェル；種特異的微生物プローブ；および透過処理剤を含む。微生物を含む検体が混合ウェル中に送達されると、透過処理剤は、微生物中へのプローブの進入を促進するが、検体は、約４０℃を下回る温度に維持される。プローブは、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含み得る。透過処理剤は、１つまたは複数の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３－１２、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ１００）を含み得る。好ましくは、透過処理剤およびプローブは、インキュベーションウェル中への検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズで提供される。
【0113】
一部の実施形態では、カートリッジは、細菌細胞表面に結合する磁気粒子、および透明壁に隣接する色素クッションを含む。磁場が色素クッションにわたって印加される場合、磁場は、色素クッションを介して磁気粒子を透明壁に引き寄せる。色素クッションは、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体（例えば、イオジキサノールまたはポリビニルピロリドンコーティングされたコロイドシリカ粒子）の溶液（必要に応じて乾燥されたまたは凍結乾燥された）を含み得る。好ましくは、色素クッションおよび透明壁は、インキュベーションウェルと流体連通したイメージングウェル中に提供される。提供される色素クッションは、検体によって湿らされるまで、カートリッジ内のイメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供され得る。磁気粒子は、細菌細胞表面に結合する化学基（例えば、ジエチルアミンエチルデンプン；デキストラン硫酸；ポリアスパラギン酸；ポリアクリル酸；ポリグルタミン酸；ポリスチレンスルホネート；またはポリジアリルジメチルアミン（ｐｏｌｙ－ｄｉａｌｌｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎ））に連結され得、カートリッジには、細菌細胞表面への化学基の結合を促進する化合物がさらに予めロードされ得る。細胞表面への化学基の結合を促進する化合物には、セトリミドが含まれ得る。
【0114】
カートリッジは、互いに平行な複数の対になったイメージングウェル／インキュベーションウェルセットをさらに含み得る。カートリッジは、ユーザーがカートリッジ中に検体をピペッティングすることができる受け入れリザーバーを含み得る。
【0115】
ある特定の実施形態では、カートリッジは、それを通るチャネルを有するガスケットを含むスライド可能ゲートを含む。ゲートが第１の位置に位置決めされる場合、受け入れリザーバーは、少なくとも第１のインキュベーションウェルと流体連通する。ゲートが第２の位置にある場合、受け入れリザーバー、第１のインキュベーションウェルおよび第１のイメージングウェルは全て、互いから密封される。ゲートが第３の位置にある場合、第１のインキュベーションウェルおよび第１のイメージングウェルは、互いに流体連通する。カートリッジは、受け入れリザーバーからの検体をインキュベーションウェル中に分割し、インキュベーションウェルからの液体を対応するイメージングウェル中に引き続いて渡すために、そこからの空気圧を受け入れるように外部機器に連結するためのフィッティングを含み得る。
【0116】
好ましい実施形態では、プローブは、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含む。必要に応じて、カートリッジは、セグメントから１～３０塩基以内の場所でリボソームＲＮＡに結合する少なくとも１つのヘルパープローブオリゴヌクレオチドもまた含む。好ましくは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、１０塩基長と１８塩基長との間であり、少なくとも１つのコンフォメーション拘束された核酸を含む。カートリッジの好ましい実施形態では、試薬組成物、プローブ、ヘルパープローブおよび化合物は、カートリッジ中への検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズとして提供され；色素クッションは、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体の溶液を含み；クッションは、検体によって湿らされるまで、カートリッジ内のイメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供される。
【図面の簡単な説明】
【0117】
【0118】
【0119】
【0120】
【0121】
【0122】
【0123】
【0124】
【0125】
【0126】
【0127】
【0128】
【0129】
【0130】
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【0135】
【0136】
【0137】
【0138】
【0139】
【0140】
【0141】
【0142】
【0143】
【0144】
【0145】
【0146】
【0147】
【0148】
【0149】
【0150】
【0151】
【0152】
【0153】
【0154】
【0155】
【0156】
【0157】
【0158】
【0159】
【0160】
【0161】
［図４１］図４１は、全ての生物、抗生物質および接種レベルに対する全体的な本質的一致（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）およびカテゴリー一致（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）のまとめである。
【0162】
【0163】
【0164】
【0165】
【0166】
【0167】
【0168】
【0169】
【0170】
【0171】
［図５１］図５１は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅの、カルバペネム加水分解Ｂ－ラクタマーゼ耐性株の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉに関するイミペネムのＭＩＣを決定するための新規の迅速ＡＳＴ法とＢＭＤ方法との比較である。
【0172】
［図５２］図５２は、Ｅ．ｃｏｌｉのＭＩＣが、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅの、カルバペネム加水分解Ｂ－ラクタマーゼ耐性株の様々な接種に関する上記方法と一致しており、一方標準的ＢＭＤは一致していないことを示す。
【0173】
【0174】
【0175】
【0176】
【0177】
【0178】
【0179】
【0180】
【0181】
【0182】
【0183】
【0184】
【0185】
【0186】
【0187】
【0188】
【0189】
【0190】
【0191】
【発明を実施するための形態】
【0192】
本発明は、自動化機器と連動して、検体中の標的微生物の抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）分析を自動的に実施するための、ユーザーによる検体調製をほとんどまたは全く必要としないカートリッジを提供する。標的細胞、例えばがん細胞もまた同定され得、種々の処置の治療有効性が本発明のシステムおよび方法を使用して評価され得る。検体中の細胞または微生物は、種々の抗微生物剤の存在下での差次的成長について分析され得、または細胞生存度、形態、ウイルス負荷、細胞機能性、もしくは治療有効性の他の尺度に対する治療剤の効果は、本明細書に記載されるシステムおよび方法を使用して決定され得る。検体マニピュレーション、インキュベーション、処理および分析ステップは、尿路感染の一般的な原因についての尿分析の場合、標的細胞同定については約３０分間足らずで、ＡＳＴ分析については約４時間半足らずで、単一の試験デバイス内で実施される。分析時間は、分析されている標的に基づいて（例えば、標的の成長速度に依存して）および試験されている治療剤に基づいて変動し得る。システムおよび方法は、検体中の標的を正確かつすぐに定量化するために、非拡大デジタルイメージングおよびイメージ分析を使用して特定の標的を検出する。
【0193】
本発明の実施形態は、ユーザーによる細胞精製ステップを必要としない試験を可能にする。無関係なステップを低減させ、ある特定の場合には単一細胞またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を定量化することが可能なイメージング方法およびイメージ分析を使用することによって、標的細胞または微生物同定およびＡＳＴ分析についての患者検体から直接的にすぐに実施可能な結果は、従来技術を用いた場合の複数日間と比較して、ほんの数時間で得られる。試験デバイスは、検体を分割するステップ、異なる抗微生物剤または他の処置の存在下で培養するステップ、ならびに得られた検体部分を処理およびイメージングして、差次的成長を測定し試験された抗微生物剤の有効性を決定するステップの各々を実施するために、機器によって自動的にマニピュレートされ得る。
【0194】
本発明の好ましい実施形態では、カートリッジは、抗微生物薬感受性試験のために使用され、検体は、微生物学的細胞の複製または成長を促進する栄養成長培地を含む別々の部分へと分割される。これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞の数および品質を決定するための、成長を促進する温度でのインキュベーション前に直接的に処理および分析される参照またはベースライン部分として使用され得る。これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞が生存可能かどうかを確認するために、病原体細胞の成長を促進する温度でインキュベートされ得る。さらに、他の部分は各々、特定の濃度の１つまたは複数の抗微生物剤を含み、病原体細胞複製に対する抗微生物剤の影響を決定するためにインキュベートされる。
【0195】
次いで、本発明は、インキュベートされた部分における病原体細胞の数および品質を分析するため、ならびにこれらの結果を、インキュベートされていない参照部分における病原体細胞の数および品質と比較するために、使用され得る。特定の抗微生物剤を含む部分において正常に複製する病原体細胞の能力が顕著に損なわれている場合、その病原体は、分析ソフトウェアによって、その部分における濃度の抗微生物剤に対して感受性であるとスコア化される。あるいは、正常な成長がその部分において顕著に損なわれていない場合、その病原体は、分析ソフトウェアによって、その部分における濃度の抗微生物剤に対して感受性であるとスコア化される。
【0196】
本発明は、評価基準を含み得、例えば、細胞複製は、抗微生物剤（複数可）を含む部分における病原体または微生物標的の抗微生物薬感受性または耐性の決定のために評価される。これらの基準は、標的微生物の種、検体型、抗微生物剤、成長培地組成物、温度およびインキュベーション時間が含まれるがこれらに限定されないパラメーターの特定の組合せについて決定され得る。
【0197】
評価基準は、好ましくは、抗微生物薬感受性試験について受容された参照方法との相関によって、経験的に決定される。１つの標準的な参照方法は、ブロス微量希釈（ＢＭＤ）であり、当業者によって理解される。ブロス微量希釈は、抗微生物剤に対する微生物株の抗微生物薬感受性が標準的な条件下で評価される方法である。標的微生物の精製された細胞は、種々の抗微生物剤の２倍連続希釈を含む規定された栄養成長培地の一連の部分またはアリコートに、規定された濃度で添加される。微生物株の抗微生物薬感受性は、規定された期間の成長インキュベーション後の種々の部分の濁度を視覚的に評価した後に決定される。濁度が視覚的に存在しない、または抗微生物剤を含まない部分と比較して顕著に低下されている、抗微生物剤の最も低い濃度は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）と呼ばれる。抗微生物薬感受性試験のための標準を決定する組織（例えば、ＣＬＳＩまたはＥＵＣＡＳＴ）は、特定の微生物種および特定の抗微生物剤の組合せについてのＭＩＣ値を、臨床実務における特定の治療用量の抗微生物剤の有効性と相関させている。ＭＩＣ値は、カテゴリー的範囲：感受性、中間耐性および耐性へと一般にビニングされる。これらは、ＳＩＲまたはカテゴリー的抗微生物薬感受性試験結果と呼ばれる。この方法で、特定の抗微生物剤に対する特定の種の特定の株についてのＭＩＣは、ＳＩＲまたはカテゴリー的結果として報告され得る。決定するために使用される他の標準的な方法には、－Ｂａｕｅｒまたはディスク拡散および寒天希釈が含まれる。これらの方法は、ＣＬＳＩおよびＥＵＣＡＳＴ文書に記載されており、当業者に公知である。
【0198】
本発明を使用して抗微生物薬感受性試験結果を決定するための評価基準は、ブロス微量希釈法と同様、種々の濃度の特定の抗微生物剤における特定の種の種々の株の細胞複製の程度および品質を評価するために、本発明を使用することによって経験的に決定される。特定の抗微生物剤について、抗微生物薬感受性試験結果（一般に、ＭＩＣまたはＳＩＲカテゴリー的結果）を特定の種の株に割り当てるための基準は、種々の株についての結果が、本発明を使用して、参照ブロス微量希釈法の結果と一貫して相関するように、選択される。例えば、抗微生物薬感受性試験結果を決定するための本発明のシステムおよび方法によって使用され得る基準は、ある特定の温度における栄養成長培地中での、種々の濃度のある特定の抗微生物剤の存在下でのある特定の期間のインキュベーションにわたる、ある特定の種の標的微生物の成長倍率（標的細胞の数における増加倍率）の評価である。この場合、抗微生物薬感受性を評価するための本発明のシステムおよび方法についての使用に関する有効な基準を決定するための経験的な研究は、種々の濃度の抗微生物剤における種の種々の株の成長倍率を評価する。成長倍率についての閾値は、本発明を使用してある株について測定された成長倍率が、同じ抗微生物剤の存在下で成長した同じ株についてのブロス微量希釈の結果と相関するように選択され得る。閾値は、株の成長倍率が閾値を超える場合に、その株が、本発明によって、その濃度の抗微生物剤の存在下で顕著に成長したとカテゴライズされるように、標的種の種々の株を使用して経験的に選択される。株の成長倍率が成長倍率閾値未満である場合、その株は、本発明によって、顕著に成長しなかったとカテゴライズされる。したがって、この例では、成長倍率についての閾値は、参照ブロス微量希釈法および本発明の方法の両方が、種々の株が種々の抗微生物剤濃度において顕著に成長したかしなかったと決定されるかどうかについて同じ結果を返すように選択される。
【0199】
他の評価基準もまた、抗微生物薬感受性試験結果を決定するために本発明によって使用され得る。例えば、本発明は、抗微生物剤中でのインキュベーションによって引き起こされる正常な細胞複製の混乱を反映する形態学的特徴の評価を含み得る。別の例として、インキュベーションステップ後の、抗生物質を含まない部分と比較した、抗微生物剤を含む部分における成長阻害の程度が、評価され得る。複数の評価基準を、特定の濃度の抗微生物剤が標的細胞の正常な細胞複製に対する顕著な混乱を引き起こすかどうかを決定するために同時に使用することもできる。したがって、本発明は、患者検体から直接的に、感染を検出し、感染性病原体を同定し、どの抗微生物薬が処置のために有効かを決定するために使用され得る。
【0200】
患者検体、例えば、尿、糞便、呼吸器、創傷、脳脊髄液または血液は、好ましくは、ユーザーによるいずれの検体調製もなしに、微生物分析のために分析カートリッジ中に直接的に移動される。したがって、多数の純粋な病原体細胞を単離するためのコロニー精製、核酸精製、または他の時間もしくは労働集約的な検体調製プロトコールをユーザーが実施する必要は、好ましくは存在しない。検体は、好ましくは、例えば、生物学的残骸を除去するための予めの富化も浄化もなしに、試験カートリッジ中に直接的にロードされる。カートリッジは、本開示の微生物定量化および同定ならびに抗微生物薬感受性試験のための試薬を含む。検体中の微生物の種特異的標識およびイメージングなどのステップは全て、検体が直接的にロードされたカートリッジ上で行われる。カートリッジは、標的細胞特異的標識、例えば、本発明のシステムおよび方法によって検体中の微生物を同定するために使用される蛍光プローブを含む。微生物を同定するために、機器は、好ましくは、カートリッジ中の標識された微生物をイメージングするためのイメージングサブシステムを含む。
【0201】
本発明のシステムおよび方法を使用して、迅速に感染を検出し、病原体を同定し、抗微生物薬感受性を決定することは、非常に長い培養ステップを必要とする従来法よりもはるかにすぐに、患者感染の有効な処置をガイドする、すぐに実施可能な結果を得るための潜在性を提供する。本発明のシステムおよび方法は、患者検体を分析カートリッジ中に直接的に単純に移動させ、カートリッジを機器中にロードすることによって、約３０分間で感染を検出し感染性病原体を同定し、数時間で抗微生物薬感受性試験結果を決定する能力を臨床医に提供することができる。
【0202】
一部の実施形態では、本発明は、患者検体から直接的な、微生物検出および有効な処置の同定を含む。ある特定の態様では、本発明は、微小生物の同定を提供する。微生物同定は、患者検体、例えば、全血、血漿、血清、尿、痰、唾液、糞便、脳脊髄液、羊水、腹水、膿、リンパ液、膣分泌物、鼻分泌物、嘔吐物、汗および組織から、検体調製ステップなしに直接的に達成される。例えば、方法は、微生物同定のために、尿検体を分析カートリッジデバイス中に直接的に移動させるステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、患者検体を分析カートリッジの試料ウェル中に直接的に移動させるステップ、および種特異的様式で微生物を標識し、標識された微生物をイメージングし、標識された微生物を同定するためにカートリッジを操作するステップを含む。
【0203】
本発明の種々の実施形態では、検体中の微生物は、磁気粒子でタグ化され、種特異的な検出可能な標識で標識される。一部の実施形態では、検出可能な標識は、種特異的蛍光核酸プローブを含み得る。他の検出可能な標識には、標的特異的蛍光抗体もしくはアプタマー、受容体－リガンド対のメンバー、レクチンまたは染料が含まれる。標的特異的核酸プローブは、標的微生物の核酸配列のみに相補的であるように選択され得る。種々の実施形態において使用される磁気粒子は、標的微生物に特異的または非特異的に結合し得る。一部の実施形態では、複数の種が検出され得る。
【0204】
一部の実施形態では、カートリッジを操作するステップは、本発明のカートリッジデバイス内で、感染を検出し；検体中の病原体を同定および定量化し；抗微生物薬感受性を決定するために、カートリッジを機器中にロードすることを含み得る。本発明は、全てカートリッジ内で、微生物を同定しならびに／または治療感受性および有効性を決定するために、患者検体を直接的に受け入れて処理することが可能な分析カートリッジおよび機器を提供する。
【0205】
一部の好ましい実施形態では、別々のカートリッジが、異なる連続する診断機能のために展開される。例えば、好ましい実施形態では、カートリッジは、感染を検出し、病原体を同定し、検体中の病原体を定量化する。感染が検出され病原体が同定されると、患者検体の別の部分は、同定された病原体を処置するための候補である抗微生物剤を含むカートリッジ上で試験される。抗微生物薬感受性試験のために本発明のシステムおよび方法を使用することで、カートリッジは、患者の感染を引き起こす病原体の特定の株を処置するためにどの抗微生物剤が有効であり得るかを決定するために使用され得る。
【0206】
本発明のカートリッジは、生物学的に重要な分子、例えば、毒素およびバイオマーカーの高感度の検出のためにも使用することができる。
【0207】
本発明のシステムおよび方法は、本発明の方法を実施するために分析カートリッジとインタラクトするために使用され得る機器または分析器を含む。機器は、本発明の方法を実施するための複数のサブシステムを含み得る。分析カートリッジは、カートリッジ内の検体を処理するための複数のサブシステムを有する機器中にロードされ得る。好ましい実施形態では、複数のサブシステムのうち１つは、カートリッジ内で標識された微生物をイメージングするためのイメージングサブシステムであり得る。機器のサブシステムには、空気圧サブシステム、磁気サブシステムおよび廃棄物サブシステムもまた含まれ得る。機器は、機器内でカートリッジを動かしマニピュレートするために、カルーセル、プッシャー機構およびタスクスケジューラも含み得る。機器は、処理ステップの全てを一定の温度で実施することが可能である。
【0208】
機器およびデバイスを含む本発明のシステムおよび方法は、感染を検出すること；全ての型の病原体細胞を検出、同定および定量化すること；抗微生物薬感受性を決定すること；毒素、ウイルス、および宿主－応答因子を含むバイオマーカーを検出および定量化すること；ならびに診断的に情報価値のあるヒトまたは宿主細胞を検出および定量化することを含む、広範な診断機能を実施することができる。本発明のシステムおよび方法は、単一のデバイス（例えば、分析カートリッジ）中で、単一の検体に対してかかる診断機能を単独でまたは組み合わせて同時に実施することが可能である。本発明のシステムおよび方法は、（例えば、尿路感染、血液感染および呼吸器感染についての）異なる型の診断試験を実施する複数のかかるデバイスが、単一の機器上で同時に処理され得るように、ランダムアクセス処理の性能を含む。このように、本明細書に記載される機器およびカートリッジは、かかる機能性を提供し、デバイス内で検体を処理するためにしかるべくマニピュレートされ得る。
【0209】
ＡＳＴカートリッジは、アッセイのために必要な試薬を予めロードした一連の相互接続された区画を含み得る。ユーザーは、所望のアッセイおよび検体の型に基づいて、患者からの検体をカートリッジに直接的に添加し、次いで、自動的処理のためにカートリッジを機器中にロードする必要があるだけである。機器は、ユーザー入力を介して、またはカートリッジ自体を読み取ること（例えば、その上のコードをスキャンすること）を介して、実行されるアッセイの型を同定することができる。本明細書に記載される機器は、異なるアッセイのために必要とされ得る種々のステップを実施するための種々のステーションを含み得、アッセイステップのパフォーマンスのために必要に応じて、複数のインプロセスカートリッジを格納し、ステーション間でそれらを移動させるためのカルーセルまたは他の機構を含み得る。
【0210】
カートリッジは、所望のアッセイのステップを実施するために必要に応じて、その中の異なる区画を接続するための種々のバルブおよびチャネルを含み得る。例えば、ＡＳＴアッセイのためのカートリッジは、成長培地および分析される異なる抗微生物薬を予めロードした一連の成長リザーバーを含み得る。カートリッジは、その中で成長後検体を処理し標的を標識するための区画、ならびに標識された標的をイメージングするための窓を提供するイメージングウェルもまた含み得る。機器は、種々のアッセイのために必要に応じて、異なる区画を接続し、それらの間で検体体積を動かすために、カートリッジ中でのバルブおよび圧力の外部マニピュレーションを可能にするために、カートリッジとインターフェース接続する流体工学モジュールを含み得る。
【0211】
図１は、本発明の種々のシステムおよび方法において使用されるカートリッジ１０１を示す。試験カートリッジ１０１は、検体を受け入れるための検体ウェル１０３、分割ウェル１０５、試薬ウェル１０９、イメージングウェル１１１、およびウェル間で検体を動かすためのチャネル１１３、ならびにその動きを制御するスライディングバルブ１０７を含む。カートリッジ１０１は、特異的アッセイのための試薬を含み得る。例えば、試薬ウェル１０９中に、カートリッジは、標的特異的プローブ、透過処理試薬または他の材料を含み得、それらは、ビーズ１４１（例えば、凍結乾燥されたビーズ）中に含まれて提供され得る。
【0212】
示されるように、カートリッジは、互いに平行な複数の対になったイメージングウェル／インキュベーションウェルセットを含み得る。ここで、カートリッジ１０１は、８個の平行な「チャネル」を含むように示され、各チャネルは、分割ウェル１０５、試薬ウェル１０９およびイメージングウェル１１１を含む。カートリッジの実施形態は、２集団の８個チャネルを含み得（さらなる８個のチャネルが、８個の目に見えるチャネルの後ろにある）、１つのカートリッジ全体で１６個のチャネルになる。カートリッジは、その寸法、例えば、高さｈ、長さｌおよび幅ｗ（ここで、ｗは、ｈおよびｌに対して直角に測定される）に従って記載され得る。高さｈは、約３ｃｍと約１０ｃｍとの間であり得る。長さｌは、約５ｃｍと約１２ｃｍとの間であり得る。幅ｗは、約０．５ｃｍと約３ｃｍとの間であり得る。例えば、一実施形態では、ｈは約６ｃｍであり、ｌは約８ｃｍであり、ｗは約２ｃｍである。
【0213】
カートリッジ１０１は、好ましくは、ユーザーがカートリッジ中に検体をピペッティングすることができる検体ウェル１０３を含む。ある特定の実施形態では、カートリッジ１０１は、それを通るチャネルを有するガスケットを含むスライディングバルブ１０７を含む。スライディングバルブ１０７が第１の位置に位置決めされる場合、検体ウェル１０３は、少なくとも第１の分割ウェル１０５と流体連通する。スライディングバルブ１０７が第２の位置にある場合、検体ウェル１０３、第１の分割ウェル１０５および第１の試薬ウェル１０９は全て、互いから密封される。スライディングバルブ１０７が第３の位置にある場合、第１の分割ウェル１０５および第１の試薬ウェル１０９は、互いに流体連通する。
【0214】
カートリッジ１０１は、検体ウェル１０３からの検体を分割ウェル１０５中に分割し（したがって、「分割」）、分割ウェル１０５からの液体を対応する試薬ウェル１０９中に引き続いて渡すために、そこからの空気圧を受け入れるように外部機器に連結するためのフィッティングを含み得る。イメージングウェル１１１は、好ましくは、色素クッション１１５および透明窓（例えば、カートリッジ１０１の底部の）を含む。
【0215】
色素クッション１１５は、イメージングウェル１１１の底部にある材料である。検体の部分がイメージングウェル１１１中に移動されると、これは液体検体層を形成し、色素クッション１１５は、液体検体層の基礎をなす。色素クッションは、好ましくは、粒子の遊走に抵抗し（例えば、密度媒体、ゲルなど）、光の通過を阻害する（例えば、顔料または色素を含むことを介して）材料である。色素クッション１１５に起因して、プローブは、磁気ビーズにも結合した標的に結合した場合にのみ、検出ゾーンに引き寄せられる。色素クッション１１５は、（液体検体層の根底にあるクッション層として存在するので）検出ゾーンを提供する窓から未結合の材料を排除し、未結合のシグナル伝達部分からの光が検出ゾーンに達しないように阻害する（色素クッション層は色素を含み、透明ではないため）。
【0216】
カートリッジ１０１は、空気圧ポート１１７を介して、機器の流体工学モジュールとインターフェース接続することができる。スライディングバルブ１０７は、接続を開放および閉鎖することによって、分割ウェル１０５と試薬ウェル１０９との間での流体の動きを制御することができる。スライディングバルブ１０７は、例えば、ＡＳＴ分析のためのゼロ成長参照を提供するために、または標的細胞もしくは微生物の存在を同定することに焦点を当てているがＡＳＴ分析とは関連しない適用において、検体の１つまたは複数の部分が、分割ウェル１０５を迂回し、試薬ウェル１０９およびイメージングウェル１１１に直接的に進むことを可能にし得る。スライディングバルブ１０７は、機器２０１の流体工学モジュールによってマニピュレートされ得る。好ましい実施形態では、カートリッジ１０１は、希釈剤リザーバー１２１およびボタン１２７を含む。ボタンを（例えば、操作者が手動で、または本開示の機器内で機械的に）押すことで、希釈剤リザーバー１２１中に予めロードされた希釈剤（例えば、食塩水）を分割ウェル１０５中に分配する。本発明の他の実施形態では、バルブ１０７は、ＡＳＴ分析のためのゼロ成長参照またはベースラインを提供するために、１つまたは複数の部分が、分配ウェル１０５を迂回し、１つまたは複数の試薬ウェル１０９およびイメージングウェル１１１に直接的に進むことを可能にするようにも構成され得る。分配ウェル１０５には、成長培地および／または１つもしくは複数の抗微生物剤が予め充填され得る。バルブ１０７は、分配ウェル１０５中に、任意の期間にわたって種々の抗微生物剤の存在下でインキュベートされる検体部分を保持することができる。
【0217】
図２は、カートリッジ１０１を使用して微生物同定および抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）を実施するための機器２０１（例えば、分析器）を示す。機器２０１は、検体の標的細胞同定およびＡＳＴ分析を実施するためにカートリッジ１０１とインタラクトするために使用され得る。持ち上げ開放型ローディングドア２０２は、ローディングトレイへのアクセスを提供するために含められ得る。
【0218】
機器２０１は、プロンプト、結果、報告を表示し、コマンドを受け取るための少なくとも１つのユーザーインターフェース２０３（例えば、タッチスクリーン）を含む。機器６０１は、異なる機能的エリアおよびサブシステムを含み得る。区画は、分析カートリッジを輸送およびインキュベートするためのカルーセル２０５、処理およびインキュベーション装置を収納する上部区画２０７、ならびにエレクトロニクス、イメージングおよび空気圧装置を収納する下部区画２０９を含み得る。本開示の機器２０１および方法は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞を含む種々の標的細胞または微生物を同定および定量化するために使用され得る。成長培地および抗微生物剤を標的細胞または微生物に合わせることによって、ＡＳＴ分析は、種々の標的細胞に対して実施され得る。
【0219】
図３は、機器２０１の例示的な上面図である。機器２０１は、複数の分析カートリッジ１０１を受容および分類するための入力機構３０３、例えば、ローディングトレイを含み得る。
【0220】
機器２０１は、機器２０１内でカートリッジ１０１を受容し、動かし、マニピュレートするために、カルーセル２０５および機械的コンベアアーム３０７を含み得る。機器２０１は、タスクスケジューラもまた含み得る。機器２０１は、好ましくは、分析カートリッジのマニピュレーション、微生物同定およびＡＳＴ分析のパフォーマンス、ならびに結果の生成を自動化するために、コンピューターによって制御される。機器２０１は、本発明の方法を実施するための複数のサブシステムを含み得る。
【0221】
機器２０１のサブシステムには、空気圧サブシステム３０９、磁気サブシステム３１１、イメージングサブシステム３１３および廃棄物サブシステム３１５が含まれ得る。磁気サブシステム３１１は、例えば、イメージングのために分析カートリッジの検出表面上に磁気粒子と標的との複合体を沈着させるために磁場を提供する永久磁石または電磁石を含み得る。イメージングサブシステム３１３は、例えば、上で論じたような米国特許第９，６４３，１８０号および同第８，０２１，８４８号に記載されるもの、ならびに機器２０１のイメージングモジュールに対して分析カートリッジ１０１の検出表面をマニピュレートするためのステージであり得る。イメージングサブシステム３１３は、イメージ処理、分析を提供し、性能を表示するように、コンピューターと動作可能に関連し得る。空気圧サブシステム３０９は、例えば、空気圧または真空によって提供される機能性を使用するスライディングバルブ１０７（例えば、プランジャーおよびアクチュエータ）のマニピュレーションを介して、分析カートリッジ１０１内での検体および試薬の動きを駆動するように動作可能であり得る。一部の実施形態では、水力学的または機械的手段もまた、検体の動きを生じさせるために、空気圧サブシステム３０９中に取り込まれ得る。廃棄物サブシステム３１５は、使用後のカートリッジ１０１の処分のためのレセプタクル（例えば、除去可能なビン）を含み得る。
【0222】
機器２０１は、成長のためのインキュベーションおよび／またはアッセイインキュベーションの間に分析カートリッジを保持（または格納）するための１つまたは複数のインキュベーションエリアもまた含み得る。インキュベーションエリアは、標的細胞または微生物の成長のための所望の温度（例えば、３５℃）でインキュベーションエリアを維持するため、またはアッセイインキュベーションを実施するための、加熱および／または冷却要素ならびにその要素を制御するサーモスタットを含み得る。
【0223】
一部の実施形態では、機械的コンベアアーム３０７は、機器２０１内の種々のサブシステムの中で、分析カートリッジ１０１をマニピュレートするように動作可能であり得る。本発明の一部の実施形態では、機械的コンベアアーム３０７は、機器のカルーセル２０５と種々のサブシステムとの間で、分析カートリッジ１０１の各々を移動させる。機械的コンベアアーム３０７は、カルーセル２０５の方へおよびそこから離れて分析カートリッジ１０１を移動させるために、押す力を印加する。カルーセル２０５は、もう１つのサブシステムに隣接して分析カートリッジ１０１を位置決めするように回転し、次いで、機械的コンベアアーム３０７は、分析カートリッジ１０１をサブシステム上にスライドさせる力を印加し得る。分析カートリッジ１０１は、好ましくは、例えば、機器２０１内で、絞る力または圧縮力によってつかむことは決してない。機器２０１内で分析カートリッジ１０１をスライドさせるまたは押すことで、破片への曝露を低減させる。機器内の種々のステーションまたはサブシステムならびにカルーセル２０５は、カートリッジ１０１を受容し、カルーセル２０５と種々のステーションとの間でそれがスライドされるときにカートリッジ１０１をガイドするようなサイズにされたスロット３１７を含み得る。カルーセル２０５の回転は、機械的コンベアアーム３０７によってカートリッジ１０１がそれに沿ってスライドされ得るガイドまたはトラックが形成されるように、その上のスロット３１７を、ステーション上の対応するスロットと整列させるように機能する。
【0224】
一部の実施形態では、機器２０１は、分析カートリッジ１０１を管理するためのタスクスケジューラを含む。タスクスケジューラは、複数のサブシステムの中での分析カートリッジ１０１の各々の輸送および移動などの動きを制御するように動作可能である。一部の実施形態では、各分析カートリッジ１０１がサブシステム中で費やす時間もまた、タスクスケジューラによって管理され得る。タスクスケジューラは、分析カートリッジ１０１の各々の分析のために必要に応じて、種々のサブシステム上での時間を取っておくことができる。本発明の一部の実施形態では、タスクスケジューラは、カートリッジの内容を同定することによって、分析カートリッジ１０１の動き（即ち、実施される分析のステップ／パラメーター）を管理することができる。スケジューラは、有形の非一時的なメモリ上に記憶され、プロセッサーによって操作されるソフトウェアを含み得る。プロセッサーは、例えば、カルーセルおよび機械的コンベアアーム機構を操作するため、ならびにイメージングデバイスを制御し、イメージングサブシステムまたはステーションから受け取られた際にイメージをメモリ中に記録するために、機器２０１ならびにその上の種々のモーターおよびサブシステムまたはステーション内にあり得るならびに／またはそれと通信し得る。プロセッサーおよびメモリは、入力／出力デバイス２０３、例えば、モニター、キーボード、マウスまたはタッチスクリーンもまた含み得るコンピューターを構成することができる。
【0225】
一部の実施形態では、機器２０１は、分析カートリッジ１０１上に場所決めされた識別子（例えば、バーコード）を分析するように動作可能なリーダーもまた含み得る。分析カートリッジ１０１の内容および必要な処理は、分析カートリッジ１０１上の識別子と関連し得る。分析カートリッジ１０１の各々は、機器２０１によって読み取り可能な識別子を含み得る。機器２０１は、リーダーを介して識別子を読み取ることができ、その識別子を、タスクスケジューラを実行するための特定のセットの指示と関連付けることができる。
【0226】
識別子の読み取りの際に、コンピュータープロセッサーは、その識別子と関連するアッセイ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについてのＡＳＴ分析）にアクセスすることができる。次いで、プロセッサーは、アッセイの必要なステップを実施するためのスケジュールを決定することができ、開始の際に、各ステーションまたはサブシステムが必要とされる時点およびアッセイを完了するためにどのくらいの時間がかかるかを決定することができる。プロセッサーは、そのメモリから、機器中で現在実行中の他のカートリッジのスケジュールにアクセスすることができ、必要な時点における種々のステーションの利用可能性を比較することができる。ある特定のステップ（例えば、インキュベーション）は融通が利き得、スケジュールは、他のカートリッジ上での他のスケジューリングされた操作に適応するために変更され得る様々な長さを提供し得る。ある特定の時点において試験を開始することが、サブシステムまたはステーションのいずれかについて相容れない矛盾を生じる場合、機器は、カートリッジを拒絶し得、アッセイを矛盾なしに開始および実行するのに受容可能な後の時点をユーザーに通知し得る。ある特定の実施形態では、機器は、かかる矛盾を回避するために、２つまたはそれよりも多くの、サブシステムまたはステーションのいずれかを含み得る。例えば、高流量ステーション、例えば、流体工学モジュールは、機器の所望の能力に依存して、２つまたはそれよりも多くを含むことを保証し得る。
【0227】
機器２０１は、ユーザー入力を受け取り、結果、ステータスおよび他の情報を表示するためのユーザーインターフェース２０３を含む。機器２０１は、機器２０１内で所望のインキュベーションまたは反応温度を維持するために囲い込まれる。機器は、ユーザーが分析のためにカートリッジをロードすることができるローディングトレイ３０３へのアクセスを可能にするように開放状態であるアクセスドアを有する。機器２０１は、処理を開始するために内部ドアを開放し、カートリッジをカルーセル中にもたらす前に、ローディングトレイ３０３内のカートリッジ上の識別子を読み取ることができる。こうして、任意のエラーまたはスケジューリング矛盾が存在する場合、それらは、カートリッジを取り付ける前に対処され得る。ローディングトレイ３０３は、機器に対して設定された場所にカートリッジを位置決めして、識別子について、およびカートリッジに係合しそれをカルーセル中にもたらす機械的コンベアアーム機構について既知の場所を機器がスキャンするのを可能にする。カートリッジおよびローディングトレイは、詰まりまたはエラー、例えば、機器のスキャナから外れた場所を指し示す識別子を回避するために、１つの配向でのみトレイ中にカートリッジが挿入され得るように、非対称なフットプリントを含み得る。
【0228】
機器２０１およびカルーセル２０５は、カートリッジ１０１を使用する試験を実施するように動作する。機器２０１を使用すると、カートリッジ１０１は、差次的成長および種特異的検出に基づいて、多微生物検体から迅速な抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）を実施するために有用である。ＡＳＴを決定するために有用な差次的成長は、分割ウェル１０５中での多くの標的細胞および微生物のほんの数時間にわたるインキュベーション後に観察され得る。種々の実施形態では、検体部分は、イメージングウェル中での処理およびイメージングの前に、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間未満にわたって、分割ウェル１０５中でインキュベートされ得る。成長培地および／または抗微生物剤は、検体中の分析される標的細胞または微生物に基づいて選択され得、カートリッジ１０１中に含まれ得る。例えば、同定された標的細胞または微生物の成長を支持することが公知の成長培地および同定された標的を処置するために一般に使用される治療剤または抗微生物剤が選択され得る。種々の実施形態では、カートリッジ１０１には、検体中の標的を同定した（例えば、患者の感染の供給源または特定のがん型を決定した）ユーザーが、標的微生物のＡＳＴ分析または標的細胞の治療有効性分析のために適切な予め包装された試験デバイスを選択することができるように、ある特定の標的のための成長培地および治療剤が予めロードされ得る。
【0229】
適切なインキュベーション期間後、スライディングバルブ１０７は、インキュベートされた検体部分を分割ウェル１０５から試薬ウェル１０９へと移動させるためにマニピュレートされ得る。試薬ウェル１０９には、イメージングのために標的細胞または微生物を標識するための処理試薬が予め充填され得る。処理試薬は、保管のために凍結乾燥され得、流体検体部分および成長培地との接触の際に活性化され得る。例えば、試薬ウェル１０９は、種特異的な検出可能なプローブおよび微生物結合性磁気粒子を含み得る。検体部分が試薬ウェル１０９を通過する際に、微生物結合性磁気粒子は、存在する全ての微生物に結合するが、種特異的な検出可能なプローブは、（例えば、顕微鏡法による）検出のために目的の生物に結合する。
【0230】
一部の適用について、磁気粒子または他の検出可能な標識、例えば、アビジンコーティングされた磁気粒子およびＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎ色素は、非特異的であり得る。例えば、ビオチン標識された標的特異的抗体（即ち、標的特異的結合分子）は、特異的磁気選択のためにアビジン磁気粒子によって次いでタグ化される特定の細胞または微生物を標的化するために使用され得る。全ての細胞がＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎによって標識されるが、磁気的に分離された（即ち、ビオチンタグ化された）標的だけが、イメージングのために検出表面上に沈着する。
【0231】
機器２０１は、イメージングウェル１１１の底部上で、複合体を検出表面に引き寄せるために磁場を使用し得る。イメージングウェル１１１は、本明細書に記載されるイメージングウェル中の上部アッセイ層の下にある高密度不透明水性層を形成する色素クッションを含み得る。複合体化した磁気粒子は、下部色素クッション層を介して押し進められ、イメージングウェル１１１の検出表面上に沈着する。検出表面は、標識された標的細胞または微生物の光学検出を可能にするために透き通っていてもよい。処理および磁場によるプルダウンの後、カートリッジ１０１は、イメージングのためにイメージングステージ上に置かれ得る。標的特異的な蛍光オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光標識のイメージングが標的細胞の定量化（例えば、検体中の標的細菌についての細胞計数）を提供するように、標的細胞を蛍光標識するために使用され得る。
【0232】
カートリッジ１０１は任意の数の成長または分割ウェルならびに対応する処理およびイメージングウェルを有し得るが、好ましくは、ゼロ成長参照検体、および少なくとも２個の別々の治療剤の差次的成長分析のために、少なくとも３個のウェルを有する。一部の実施形態では、試験デバイスは、少なくとも８個またはさらには１６個のウェルを含む。
【0233】
種々の抗微生物剤の存在下での差次的成長後に各検体部分中に存在するいくつかの種特異的に標識された細胞を計数することによって、特定の種に対する各治療剤の効果が決定され得る。どの抗微生物剤が成長を最良に阻害したかを決定することによって、患者の感染を処置する有効な治療が決定され得る。
【0234】
抗微生物薬選択は、検体中の細菌または標的細胞が未知であり、多数のウェルおよび多量の検体が広範囲のランダム試験を可能にするために利用可能である場合には、ランダムであり得る。好ましくは、細菌または他の標的細胞は、既に同定されており、種々の抗微生物薬、例えば、同定された細菌を処置するために一般に使用される抗微生物薬は、しかるべく選択されている。各分割ウェルは、標的細胞成長に対する組み合わされた効果を評価するために、単一の抗微生物剤または抗微生物剤の独自の組合せを含み得る。異なる濃度の異なる抗微生物剤が、異なる分割ウェル中で検体部分またはアリコートと組み合わされ得、一部の分割ウェルは、結果を強化するために同一の抗微生物剤による処置を再現するために使用され得る。一部の分割ウェル中の検体部分またはアリコートは、阻害されていない成長を定量化するためおよび／または非抗微生物推論もしくは試薬不安定性のいずれかに起因する成長阻害を検出するために、抗微生物剤と組み合わされなくてもよい。
【0235】
図４は、カートリッジ１０１中への検体の部分の移動を示す。最初に、ローディングトレイ３０３は、機器２０１から離れて運ばれ得、ベンチトップ上にセットされ得る。カートリッジ１０１を使用するために、検体は、カートリッジ１０１の検体ウェル１０３中に置かれる。これは、検体収集デバイス、例えば、検体収集コンテナ、スワブなどからピペッティングすることによって実施され得る。次いで、カートリッジ１０１は、ローディングトレイ３０３中に置かれ得る。
【0236】
図５は、カートリッジ１０１の使用のための、機器２０１中へのローディングトレイ３０３のユーザーローディングを示す。好ましくは、カートリッジ１０１は、検体を分析するために機器２０１中にロードされる。カートリッジ１０１が機器中に置かれた後、空気圧または類似の力が、チャネル２１３を介して検体ウェル１０３からの検体を分割ウェル１０５中に分割するために使用され得る。
【0237】
検体は、検体の導入とインキュベーションとの間の任意の点で、カートリッジ１０１内で、ある量の成長培地と混合され得る。インキュベーション１１５ステップは、検体１０５中の標的細胞または微生物の測定可能な差次的成長を可能にするために、約３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間もしくは２４時間またはそれよりも長い時間未満持続し得るが、好ましくは、約４時間である。
【0238】
インキュベーション１１５後、インキュベートされた部分１１７は、イメージング１２３のために、例えば、検体部分中の特定の標的細胞と複合体１１９を形成し得る磁気タグおよび検出可能な標識に曝露され得る。次いで、標識された標的１２１複合体は、部分中でイメージング１２３され得、イメージ１２５は、各部分中に存在する標識された標的１２１の量を定量化するために（手動でまたは計算デバイスによって）分析され得る。
【0239】
種々の抗微生物剤の存在下でインキュベートされた部分中の標的細胞または微生物の量を比較することによって、それらの薬剤のうちどれが成長を阻害したかを決定することができる。比較は、好ましくは、インキュベーションなしに元の検体から分割され、処理され、イメージングされた「時間ゼロ」成長参照部分からの標的細胞量を含む。
【0240】
本発明のシステムおよび方法を使用する試験のために企図される標的微生物および細胞には、ウイルス、細菌もしくは真菌細胞、またはヒト細胞、例えば、がん細胞もしくはβ細胞が含まれる。細菌標的の場合、例えば、検体は、種々の抗細菌剤の存在下でインキュベートされ得、検体中の標的細菌成長に対するこれらの薬剤の効果が、有効性を決定するために分析され得る。本明細書に記載されるシステムおよび方法は、がん細胞に対する化学療法剤の細胞傷害効果を測定するため、または検体中のウイルス負荷に対する種々の抗ウイルス剤の有効性を測定するために、等しく適用され得る。種々の標的細胞および微生物にわたって必要とされ得る唯一の変化は、標的特異的結合分子（例えば、細菌細胞表面特異的抗体、ウイルス特異的オリゴヌクレオチドプローブまたは細胞特異的色素）、試験されている処置（例えば、抗ウイルス薬、抗細菌剤またはがん治療）、インキュベーション時間、および一部の場合には、イメージ分析において分析されている特徴（例えば、ＣＦＵ定量化、ウイルス負荷、または細胞数、形態もしくは機能）である。
【0241】
検体は、受け入れウェル１０３中に直接的に挿入され得る。空気圧ポート１１７は、検体をカートリッジ１０１内のウェルに分配するために圧力または真空を印加するために開放され得る。検体は、検体ウェル１０３から分割ウェル１０５へと最初に分配され得、インキュベーションの間にはスライディングバルブ１０７によってそこに保持され得、標識のために試薬ウェル１０９に、次いで、イメージングのためにイメージングウェル１１１に放出され得る。機器の流体工学モジュールは、特定のアッセイの要求に従って、検体および試薬分配と協調してバルブの動きを制御するために、カートリッジとインターフェース接続し得る。
【0242】
図６は、本発明の例示的な方法６０１を示す。方法６０１は、好ましくは、患者からの検体を得るステップを含む。検体には、患者からの身体検体、例えば、血液もしくはその部分（例えば、血漿もしくは血清）、尿、痰、脳脊髄液、糞便、創傷、またはヒト身体から得られた任意の他の検体が含まれ得る。ある特定の実施形態では、獣医学、環境、農業および食品検体が含まれるがこれらに限定されない、非医療的検体が試験され得る。検体は、事前の標的細胞精製を必要とすることなしに、カートリッジの収集管、ウェルまたはリザーバー中に直接的に送達６０７され得または導入され得る。例えば、患者からの直接的な尿検体は、コロニー精製、または試薬との前もっての混合、標的精製、検体の構成要素を除去するための処置、遠心分離、生化学的富化もしくは他の処置を含む検体調製を必要とすることなしに、分析カートリッジ中にピペッティングされ得る。いったん得られると、検体は、分析カートリッジ（例えば、デバイス）中に導入６０７される。検体は、生物学的残骸および他の材料を含み得る。方法６０１は、検体を、１つの種の微小生物のみに結合する標識、即ち、標的種に特異的な標識と共にインキュベート６１３するステップを含む。必要に応じて、透過処理剤が、検体中の細胞を透過処理６２５するために導入され得る。方法６０１は、未結合の標識から検体中の細胞を分離６２９するステップ、および細胞中で結合した標識を検出６３５して、検体中のその種の存在を示すステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、標識は種特異的であり、細胞は一般に、未結合のプローブから分離されることに留意されたい。
【0243】
本開示は、一定の生理的温度で実施され得る蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を実施するための試薬を予めロードしたカートリッジを提供する。本開示のカートリッジは、さもなくば目的の細胞を溶解させ得、タンパク質を変性させ得、異なる細胞もしくは生物の相対的差次的成長速度に過度に影響を与え得、または検体分析プロトコールの化学的構成成分およびプロセスステップに対して有害効果をさもなくば有し得る極度の熱に検体を供する必要なしに、検体内の細胞および生物の遺伝子内容をプローブおよび検出するために使用され得る。一定の生理的温度でＦＩＳＨを実施することができることの１つの重要な特性は、生理的温度で最適な他の生物学的アッセイを実施するために同時に使用される他のカートリッジが機器上にロードされたままで、１つのカートリッジ内で検体が蛍光プローブおよびイメージングされ得ることである。本開示のカートリッジは、生理的温度でＦＩＳＨを使用して微生物同定または抗生物質感受性試験を実施するためのハードウェア、ツーリングおよび試薬を全て含む。試験ステップの一部が、目的の生物の成長を促進するためにインキュベーションを含む場合、生理的温度を顕著に上回って加熱することなしに同じカートリッジの他のウェル内で蛍光プローブハイブリダイゼーションを同時に実施する能力は、時系列的に重複するまたは同時でさえあることを含む、それら自体の時間およびペースで複数のステップが全て進行するのを可能にする。さらに、蛍光プローブハイブリダイゼーションが、分析機器内にロードされそこで操作されるカートリッジ内のウェル内で実施される場合、機器は、機器内で一定の温度を維持しつつ、複数の異なるカートリッジを異なる試験ステップへとルーティングおよびスケジューリングして、カートリッジを多重化することができる。
【0244】
本開示の好ましい実施形態は、生理的温度で動作する蛍光プローブハイブリダイゼーションプロトコールを実施するための試薬がロードされたカートリッジを提供する。一般に、生理的温度は、動物などの生物の体温を指す。本明細書に開示されるプロセスステップ、分子種および化学的試薬は、細胞を溶解させることなしに生理的温度で、蛍光プローブを細胞内の核酸にはハイブリダイズさせるため、およびそれらのプローブをイメージングするために有用である。検体が曝露されステップが実施される温度に関して、融通性が存在する。本開示の方法は、ゆらぎはするが４５℃を超えない温度で有用に実施され得、さらには４０℃を超えない温度で稼働し得る。本開示の方法および組成物は、例えば、３６～３９℃の範囲内の温度で使用される場合、有用かつ機能的である。実際、本開示の方法は、本質的にヒト体温、または約ヒト体温、即ち、健康なヒトについては約３７℃、発熱したヒトについては３８℃、または一部の夜間ヒト温度ゆらぎパターンについては３６℃で温度を維持する機器上で実行され得る。「約」と言うことは、小数点以内などであることを意味することである。即ち、３６．３は約３６．５であり、３７．７は約３７．５とみなす。重要なことは、本明細書に開示されるＦＩＳＨプロトコールが、身体の、例えば、哺乳動物の、好ましくはヒトの約生理的温度で全面的に実施され得ることを理解することである。
【0245】
これらの方法によって許容される温度範囲の１つの利点は、臨床的検体中の微小生物が、ｉｎ ｖｉｖｏ条件に近似する温度条件下で研究され得、そうして、別の生物の出現を抑制しつつ、さもなければ臨床的に顕著ではなかった１つの生物の差次的成長を熱が促進する影響を回避することである。例えば、根底にある主な刺激物がＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓである尿路感染に人が罹患しており、尿検体を加熱することを含む臨床試験が実施される場合、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのさもなくばほんのわずかであった数の細胞の成長を熱が促進する場合には、その臨床試験は、臨床医に適切な処置を指図しない。その試験は、処置される必要がある微小生物を誤同定する。かかる結末を回避するために、本開示は、一定の生理的温度でＦＩＳＨを実施することを可能にする組成物、デバイスおよび方法を提供し、この組成物、デバイスおよび方法は、微小生物を同定する際に特定の有用性を有する。
【0246】
図７は、方法６０１のステップがどのように進行するかを示す。検体は、細胞７０１と、細胞７０１中の１つまたは複数の標的細胞７２３との混合物を含み得る。細胞は、プローブ７０７と共にインキュベートされる。好ましくは、透過処理剤が、標的細胞７２３を含む細胞７０１を透過処理６２５して、標識をその中に拡散させるために使用される。好ましい実施形態では、標識７０７は、標的細胞７２３内の核酸７１５標的に特異的に結合する。細胞は、標識から分離６２９され、細胞を含む部分は、標識を検出６３５するために試験される。本明細書で論じられるように、標識は、好ましくは、プローブ、例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、約１０～１８塩基長）である。細胞は、細胞７０１に結合する磁気粒子を使用し、未結合のプローブをあとに残す密度媒体を介して磁場Ｂを使用して細胞を引き寄せることによって、未結合のプローブ７０７から分離６２９され得る。検出６２５は、分離された細胞を（例えば、顕微鏡を用いて）イメージングすることによって実施され得る。細胞は、密度媒体内または密度媒体下でイメージングされ得、色素クッションとも呼ばれる密度媒体は、イメージ中の任意の光スポットが、そこの標的核酸７１５にハイブリダイズした蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを有する標的細胞７２３の存在を示すように、未結合のプローブからの光がイメージングデバイスに達しないように防止する色素または顔料をさらに含み得る。
【0247】
図８は、本明細書の方法に従う、細胞７０１を透過処理６２５するために使用される透過処理剤８０１を示す。示された実施形態では、薬剤８０１は、３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯによってＣＨＡＰＳＯの名称の下で販売される）とスルホベタイン３－１２（Ｂ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯからＳＢ３－１２として入手可能）との混合物を含む。これらの界面活性剤は、細胞７０１を透過処理６２５して、微生物標的核酸７１５に結合するようにプローブ７０７を進入させる。任意の適切なプローブが、本明細書の方法で使用され得る。インキュベートするステップは、細胞を、細胞を透過処理する試薬に曝露させるステップを含み得、そうして、標識を細胞に進入させ、その中の標的に結合させる。
【0248】
細胞７０１を含む検体が試薬ウェル１０９中に送達されると、透過処理剤８０１は、微生物（例えば、標的細胞７２３）中へのプローブ７０７の進入を促進するが、検体は、約４０℃を下回る温度で維持される。プローブ７０７は、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチド９０１を含み得る。好ましくは、透過処理剤８０１は、１つまたは複数の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３－１２、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ１００）を含む。
【0249】
示されるように、プローブ７０７および透過処理剤８０１は、インキュベーションウェル中への検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズ１４１で提供される。
【0250】
したがって、方法は、種特異的標識（例えば、標的細胞中のＲＮＡに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチド）を検体中に導入するステップ、薬剤（例えば、界面活性剤、例えば、３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯとしても公知）；スルホベタイン３－１２（ｓｂ３－１２としても公知）；ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ１００としても公知）；ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０としても公知）；その他；またはそれらの一部の組合せ）を使用して細胞を必要に応じて透過処理するステップ；未結合の標識を検体中の細胞から分離するステップ；および細胞をイメージングして標識を検出するステップ、を含む。方法は、微生物を含む検体、例えば、臨床的検体を（例えば、ＵＴＩの原因因子について試験するためまたはそれを検出するために）試験するために有用である。本開示に従って実施される場合、方法は、任意の所望の温度、例えば、可変のまたは一定の生理的温度であり得るＦＩＳＨを提供する。
【0251】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、遺伝子マッピングおよび染色体異常の診断などの適用のために提唱されてきた。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２（３）：２３７ （２００５）を参照のこと。これらのプロトコールには、変性された染色体ＤＮＡへの、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識されたプローブのハイブリダイゼーション、および蛍光色素コンジュゲートされた試薬を使用したプローブの検出が関与する。一般に、これらのプロトコールは、プローブ自体および標的ＤＮＡが、プローブハイブリダイゼーション、インキュベーションおよび可視化の前に７０～８０℃で別々に変性される、変性させるステップを必要とする。本開示の方法は、加熱するステップを必要とせず、検体の任意の部分または試薬が約７０℃に、またはさらには４０℃を上回るまで加熱されることを必要としない。本開示の方法のために可能な温度範囲を提供する１つの重要な特性には、プローブ７０７を細胞７０１中に送達するための、透過処理剤（熱ではなく）の使用が関与する。
【0252】
本明細書の方法での使用に適切なプローブには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、改変塩基、コンフォメーション拘束された核酸、またはそれらの組合せを含む核酸プローブが含まれ得る。適切なプローブには、抗体または抗原、結合分子、例えば、マンノース結合性レクチンもしくは他のコレクチンが含まれ得る。分子的または化学的構造および組成物、例えば、ポリエチレングリコール、色素、染料、インターカレート色素、クリスタルバイオレット、サフラニン／カルボールフクシン、または標的に特異的に結合し得る任意の他の組成物もしくは構造。好ましい実施形態では、プローブ７０７は、オリゴヌクレオチドを含む。
【0253】
図９は、好ましい実施形態に従うプローブ７０７を示す。好ましい実施形態では、プローブ７０７は、約８塩基長と２２塩基長との間、好ましくは、約１０塩基長と２２塩基長との間の長さを有するオリゴヌクレオチド９０１を含む。プローブは、好ましくは、２’ヒドロキシル基の自由電子による求核攻撃によって触媒される自己触媒を回避するために、ＤＮＡ塩基を含む（ＲＮＡ塩基が必要に応じて使用され得るまたは含まれ得るが）。プローブは、好ましくは、約４５℃、例えば、４０と５０との間の融解温度を有する。各オリゴヌクレオチド９０１は、好ましくは、少なくとも１つのフルオロフォア４０３で標識される。好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチド９０１は、１つ～数個のコンフォメーション拘束されたヌクレオチド９０５（ロックト核酸または架橋核酸と種々に呼ばれる場合がある）もまた含む。したがって、プローブ７０７は、必要に応じたコンフォメーション拘束された核酸９０５を有する蛍光標識されたＤＮＡオリゴ９０１を含み、より好ましくは、必要に応じて第２のヘルパープローブ９１３と共に、少なくとも１つのヘルパープローブ９０７も同様に含む。
【0254】
ある特定の実施形態では、標識またはプローブ７０７は、微生物ＲＮＡに相補的なプローブオリゴヌクレオチド９０１を含む。微生物リボソームＲＮＡに相補的なプローブオリゴ９０１について、オリゴ９０１は、好ましくは、１０ｎｔと１８ｎｔとの間の長さを一般に有する。Ｔｍは、およそ４５℃である。これらは、ｒＲＮＡの構造に注目することによって設計される。ヘルパープローブは、リボソーム構造を破壊する。ｒＲＮＡを標的化する１つの理由は、コピー数が非常に高いからである。細胞１つ当たり数千コピーが存在するので、事実上のシグナル増幅が得られる。したがって、方法１０１の好ましい実施形態は、１つまたは複数の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳＯおよびＳＢ３－１２のうち１つまたは複数）を含む試薬を使用し、微生物リボソームＲＮＡを標的化するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。具体的には、プローブは、目的の標的種にしかないリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドである。好ましくは、蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドは、１０塩基長と１８塩基長との間であり、少なくとも１つのコンフォメーション拘束された核酸を含む。また好ましくは、プローブオリゴ９０１は、少なくとも１つのヘルパープローブ９０７および必要に応じて第２のヘルパープローブ９１３と共に提供される。
【0255】
図１０は、小サブユニットリボソームリボ核酸（ｓｓｒＲＮＡ）２１５、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ１６ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。他の細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉと正確に同じ１６Ｓ ｒＲＮＡを有さないものの、リボソームの二次構造は高度に保存されており（Ｗｏｅｓｅ ＆ Ｆｏｘ， １９７７を参照のこと）、したがって、示されたらせんのほとんどは、他の細菌において、容易に同定可能なホモログを有する。１６Ｓ ｒＲＮＡ内の好ましい標的には、ｈ４４；ｈ２７；ｈ１６；ｈ１７；ｈ１８；ｈ２５；ｈ２７；ｈ９；ｈ１０；ｈ１３；ｈ２３；ｈ１９；およびｈ４３が含まれる。参照によって取り込まれるＦｕｃｈｓ， ２０００， Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ｈｅｌｐｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６（８）：３６０３－７を参照のこと。暫定的プローブ設計を決めたら、オンラインツール、例えば、Ｇｅｒｍａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅによってサポートされるウェブサイトとして利用可能なＳＩＬＶＡ、「ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅｓ」を使用して、特異性および包括性を試験することができる。共に参照によって取り込まれるＰｒｕｅｓｓｅ， ２００７， ＳＩＬＶＡ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｈｅｃｋｅｄ ａｎｄ ａｌｉｇｎｅｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ＡＲＢ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５：７１８８－７１９６およびＱｕａｓｔ， ２０１３， Ｔｈｅ ＳＩＬＶＡ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ： ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌｓ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１ （Ｄ１）：Ｄ５９０－Ｄ５９６を参照のこと。プローブオリゴ９０１は、好ましくは、少なくとも１つの架橋またはロックト核酸を含む。ヘルパープローブ９０７、９１３について、オリゴ９０１よりも低い特異性（ＳＩＬＶＡツールを参照のこと）を有することが許容可能である。ヘルパープローブ９０７、９１３は、好ましくは、約２０ｎｔ長であり得る。
【0256】
リボソームＲＮＡの二次構造は、プローブ設計の原理ならびにヘルパープローブの設計および役割を示すために有益である。好ましくは、オリゴ９０１が微生物リボソームＲＮＡのセグメントにハイブリダイズする場合、ヘルパープローブ９０７および任意の必要に応じた第２のヘルパープローブ９１３は、蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドが結合するセグメントから１～３０塩基以内の場所でリボソームＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドである。例えば、ヘルパープローブは、ハイブリダイズしたプローブオリゴ９０１のすぐ上流および下流で微生物リボソームＲＮＡにハイブリダイズし得る。ヘルパープローブ９０７、９１３がない場合、標的部位のアクセス不能性が、１６Ｓ ｒＲＮＡとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションについての問題を提示し得る。本明細書では、プローブ標的部位に隣接して結合する未標識のオリゴヌクレオチド（ヘルパー９０７、９１３）が、弱いプローブハイブリダイゼーションシグナルを増加させるために使用される。ヘルパープローブは、蛍光シグナルを増強するために使用され得る。参照によって取り込まれるＦｕｃｈｓ， ２０００， Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ｈｅｌｐｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６（８）：３６０３－７を参照のこと。
【0257】
プローブ標的配列を選ぶ際の考慮事項には、ＦＩＳＨプローブの理論的特異性および包括性を決定すること、ＬＮＡ塩基の場所を最適化すること、ならびに特異的プローブのためのヘルパープローブを設計することが含まれる。多くの病原体標的は、使用され得る特異的であることが示されているＦＩＳＨプローブ（公開された通りの、または本開示の温度に適応するために短縮された）を既に有している。それらの多くは、ｒＲＮＡ標的化オリゴヌクレオチドプローブについてのオンライン情報源であるｐｒｏｂｅＢａｓｅ中に見出される。共に参照によって取り込まれるＬｏｙ， ２００７， ｐｒｏｂｅＢａｓｅ－－ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｒＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ： ｎｅｗ ｆｅａｔｕｒｅｓ ２００７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５： Ｄ８００－Ｄ８０４およびＬｏｙ， ２００３， ｐｒｏｂｅＢａｓｅ－－ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｒＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：５１４－５１６を参照のこと。ＦＩＳＨは、通常、はるかに高い温度で実施され、したがって、これらの供給源からのプローブは、方法１０１のために短縮または改変される必要があり得ることに留意されたい。属を入力するためにオンラインツール「ＤＥＣＩＰＨＥＲ」を使用することもでき、その属に特異的な１６Ｓ上の領域をＤＥＣＩＰＨＥＲツールに示唆させることもできる。参照によって取り込まれるＷｒｉｇｈｔ， ２０１４， Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｒＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｄｕａｌ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと。
【0258】
オンラインツールから始める場合であれ、手動でプローブを設計する場合であれ、アラインメント（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷによって作成された１６Ｓ ｒＲＮＡペアワイズ配列アラインメントに対するプローブ）を試験することおよび標的配列がマッチする（好ましくは、複数のマッチを有する）が、他の病原体はマッチしない領域を選択することは、有益であり得る。包括性（包括度）および特異性を試験することは、有益であり得る。Ｔｍは、４０℃を超えるべきである（本開示の方法は、３５℃で動作するため）。より高い融解温度が好ましい場合があるが、どのくらい高い温度にできるかは、オフターゲット配列にどのくらい多くのミスマッチが存在するかに依存する。本開示に従うプローブオリゴは、４０℃と６０℃との間の融解温度を有する（例えば、２または３個のＬＮＡ塩基を有する、１６Ｓ ｒＲＮＡ中のらせんｈ１７に相補的な１０～１８ｎｔ長のＤＮＡプローブの場合）。中央部のミスマッチは、末端部のミスマッチよりも識別力が高い。ミスマッチの強度の順序：（最もましなものから最も悪いものまで）：Ｇ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ａ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｃ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ｃ。好ましくは、よりアクセス可能なｒＲＮＡの領域を選ぶ。
【0259】
プローブ７０７は、特定の標的微生物を標識するために使用される。方法６０１の別の一部は、未結合のプローブから細胞７０１を分離６２９するステップを含む。任意の適切な方法または技術が、未結合のプローブから細胞７０１を分離６２９するために使用され得る。未結合のプローブから細胞７０１を分離するための適切な技術には、遠心分離、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、カラム分離、１つもしくは複数のヌクレアーゼを介した未結合のプローブの消化、その他、またはそれらの組合せが含まれる。好ましい実施形態では、細胞７０１は、磁気粒子の使用によって、未結合のプローブ７０７から分離６２９される。例えば、インキュベーション６１３ステップは、細胞を、細胞の表面に結合する磁気粒子に曝露させるステップを含み得る。
【0260】
例えば、抗体、コラーゲン含有Ｃ型レクチン（ｌｅｃｔｉｏｎ）（コレクチン、例えば、マンノース結合性レクチンとしても公知）、または細菌細胞に結合する化学基に結合した磁気粒子を含む、細胞の表面に結合する任意の適切な磁気粒子が使用され得る。ある特定の好ましい実施形態では、磁気粒子は、好ましくは、ＰＡＡを含む。
【0261】
図１１は、細菌細胞表面に結合する化学基１１１１を含む磁気粒子１１０５を示す。化学基１１１１には、例えば、ジエチルアミンエチルデンプン；デキストラン硫酸；ポリアスパラギン酸；ポリアクリル酸；ポリスチレンスルホネート；ポリジアリルジメチルアミン；またはそれらの組合せが含まれ得る。示されるように、磁気粒子１１０５は、ポリアスパラギン酸化学基１１１１を含む。この粒子は、ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ｆｌｕｉｄＭＡＧ－ＰＡＡとして販売される。ｆｌｕｉｄＭＡＧ－ＰＡＡ粒子は、細菌の表面に結合するポリアスパラギン酸である。細胞は、細菌細胞表面への化学基１１１１の結合を促進する化合物１１２１の存在下で、磁気粒子１１０５に曝露され得る。
【0262】
粒子１１０５を細胞７０１に効果的に結合させるために、細胞表面へのＰＡＡの結合を促進する薬剤１１２１を含めることが有益であり得る。任意の適切な薬剤１１２１が、結合を促進するために含められ得る。例えば、一部の実施形態では、薬剤は、セトリミドとしても公知の、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）を含む異なる第４級アンモニウム塩の混合物を含む。セトリミドは、磁気捕捉のために細胞表面へのＰＡＡの結合を促進し、グラム陽性生物での特定のトラブルを解決する。グラム陰性生物は、トラブルなしにｆｌｕｉｄＭＡＧ－ＰＡＡに結合することが見出され得る。目的の標的微小生物がグラム陽性である場合、薬剤１１２１（例えば、セトリミド）を含めることが好ましい場合がある。したがって、方法６０１の好ましい実施形態では、標識は、その種にしかないリボソームＲＮＡ２１５に相補的な蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチド９０１を含み；インキュベート６１３するステップは、細胞を、細菌細胞７０１の表面に結合する磁気粒子１１０５に曝露させるステップも含み；分離６２９するステップは、磁場Ｂを細胞７０１に印加するステップを含む。
【0263】
図１２は、印加された磁場Ｂを使用して密度勾配媒体１２０１を介して細胞７０１を引き寄せることによって未結合のプローブ７００から分離６２９される、磁気粒子１１０５結合した細胞７０１を示す。分離６２９するステップが、色素クッション１１５にわたって磁気粒子１１０５結合した細胞７０１を分配するステップ、および磁場Ｂを使用して、結合した細胞７０１を、色素クッション１１５を介してイメージング表面１２０５上に引き寄せて、未結合のプローブ７００を色素クッション１１５の表面上に残すステップ、を含み得るように、密度媒体１２０１は、描写された管またはイメージングウェル１１１（「色素クッション１１５」を提供するための色素を含み得る）内に供給され得る。次いで、検出６３５するステップは、イメージング表面１２０５を蛍光顕微鏡でイメージングするステップを含み得、全てのステップは、４０℃を下回る温度で実施され得る。好ましくは、これらのステップは、約３６℃と３９℃との間の温度で実施される。したがって、示されるように、インキュベート６１３するステップは、細胞を、細菌細胞の表面に結合する磁気粒子１１０５に曝露させるステップを含み、分離６２９するステップは、磁場Ｂを使用して、結合した細胞を未結合の標識から離して引き寄せるステップを含む。好ましくは、分離６２９するステップは、色素クッション１１５の表面にわたって磁気粒子結合した細胞を分配するステップ、および磁場を使用して、結合した細胞を、色素クッション１１５を介してイメージング表面１２０５上に引き寄せて、未結合の標識を色素クッションの表面上に残すステップ、を含む。
【0264】
論じられるように、分離６２９の実施形態は、色素クッションを提供するための色素を含み得る密度勾配媒体１２０１を使用する。したがって、色素クッション１１５は、色素をさらに含む密度勾配媒体を含む材料である。
【0265】
色素クッション１１５は、例えば、未結合のプローブ７００からの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体（例えば、検体への曝露の前に必要に応じて乾燥されたまたは凍結乾燥された、イオジキサノールまたはポリビニルピロリドンコーティングされたコロイドシリカ粒子の溶液）であり得る。クッションは、反応の未選択の構成要素を検出ゾーンから排除するための高密度材料を含み得る。クッションは、反応構成要素よりも一般に高密度の層（液体、または乾燥されたもしくは凍結乾燥された）である。クッションは、例えば、スクロース、ジアトリゾエート、イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐとしても公知）、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌまたはアルブミンを含む種々の密度薬剤を単独でまたは組み合わせて（および種々の濃度で）含み得る。実施形態は、他の密度薬剤、例えば、他の一般に使用される密度薬剤、例えば、イオジキサノール、ジアトリゾ酸ナトリウム、ナトリウム、スクロース、および他の糖、オリゴ糖、合成ポリマー（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ）、ならびに塩、例えば、塩化セシウム、臭化カリウムなどもまた取り込み得る。実施形態は、使用において、異なるシグナル伝達特徴および部分を一致させるために色素を使用し得る。例えば、色素Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ Ｏが、蛍光標識Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン）と共に使用され得る。一実施形態は、アッセイウェル中にピペッティングされる、２ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｒｏｍｏｔｒｏｐｅ Ｒ２および１０％ｖ／ｖ ＯｐｔｉＰｒｅｐ（イオジキサノールの６０％ｗ／ｖ溶液）プラス５％ｗ／ｖトレハロースである色素クッション試薬の６５μＬアリコートを使用する。色素クッションは、カートリッジ１０１のイメージングウェル１１１中に予めアリコート化された、１５％ＯｐｔｉＰｒｅｐおよび５ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｒｏｍｏｔｒｏｐｅ Ｒ２であり得る。
【0266】
イメージングウェル１１１に関して、色素クッション１１５は、任意の必要に応じた色素を含むイオジキサノールまたはポリビニルピロリドンの溶液を調製し、イメージングウェル１１１中で溶液を乾燥または凍結乾燥させて色素クッション９１５を形成することによって、形成され得る。次いで、色素クッション９１５は、本質的に固体になる（例えば、乾燥されて、例えば、イメージングウェル１１１は、使用まで、上下逆を含む任意の配向で保管され得る）。液体検体がイメージングウェル１１１中に送達されると、液体は、色素クッション１１５を再水和する。実際、方法６０１における使用に関して本明細書を通じて開示され論じられる試薬は、例えば、一定の生理的ＴでのＦＩＳＨのためのプロトコールにおける後の使用のために、乾燥されたまたは凍結乾燥された形態で提供され得る。これは、試薬が調製され、カートリッジ上に乾燥状態でロードされることを可能にし、このカートリッジは次いで、出荷または保管され得、本開示の方法において後に使用され得る。
【0267】
好ましい実施形態では、カートリッジ１０１は、細菌細胞表面に結合する磁気粒子１１０５；およびイメージング表面１２０５を提供する透明壁に隣接する色素クッション１１５もまた含む。磁場が色素クッション１１５にわたって印加される場合、磁場は、色素クッションを介して透明壁へと磁気粒子１１０５を引き寄せる。好ましくは、磁気粒子１１０５（および結合を促進する任意の化合物６２１）もまた、凍結乾燥されたビーズ１４１中に含まれる。色素クッション１１５は、未結合のプローブ７００からの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体１２０１の溶液を含む。示された実施形態では、色素クッション１１５および透明壁１２０５は、試薬ウェル１０９と流体連通したイメージングウェル１１１中に提供される。色素クッション１１５は、ゲルとして、または検体によって湿らされるまで、カートリッジ内のイメージングウェル中に乾燥されたもしくは凍結乾燥された状態で、提供され得る。
【0268】
好ましくは、凍結乾燥されたビーズ１４１中の磁気粒子１１０５は、細菌細胞表面に結合する化学基を含み、カートリッジは、細菌細胞表面への化学基の結合を促進する化合物をさらに含む。細胞表面への化学基の結合を促進する化合物は、セトリミドであり得、化学基は、例えば、ジエチルアミンエチルデンプン；デキストラン硫酸；ポリアスパラギン酸；ポリアクリル酸；ポリグルタミン酸；ポリスチレンスルホネート；またはポリジアリルジメチルアミンであり得る。
【0269】
プローブ７０７は、凍結乾燥されたビーズ１４１中に、特定の細菌種のリボソームＲＮＡ ２１５のセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチド９０１として提供され得、ビーズ１４１は、好ましくは、セグメントから１～３０塩基以内の場所でリボソームＲＮＡに結合する少なくとも１つのヘルパープローブオリゴヌクレオチドもまた含む。蛍光標識されたオリゴヌクレオチド９０１は、１０塩基長と１８塩基長との間であり得、例えば、一部の実施形態では一定の生理的温度であるＦＩＳＨにおける使用のための少なくとも１つのコンフォメーション拘束された核酸を含む。
【0270】
試薬組成物、プローブ、ヘルパープローブおよび化合物は、カートリッジ１０１中への検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズ１４１として提供される。色素クッション１１５は、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体１２０１を含む。色素クッション１１５は、検体によって湿らされるまで、カートリッジ内のイメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供され得る。方法６０１およびカートリッジ１０１は、抗生物質感受性試験を実施するために使用され得る。
【0271】
図１３は、生理的温度でのＦＩＳＨが抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）を実施するために使用されるワークフローを示す。検体は、カートリッジ１０１の検体ウェル１０３中にロードされる。分割ウェル１０５は、異なる抗生物質または異なる濃度の抗生物質のいずれかの、抗生物質を含む。１つの「チャネル」は、対照として、または成長のベースラインを確立するために、抗生物質を含まなくてもよい。カートリッジは、空気圧の供給源、ゲートスイッチ、および蛍光顕微鏡または類似のイメージング機器に接続される。ゲートスイッチは、スライディングバルブを第１の位置にスライドさせ、検体ウェル１０３は、分割ウェル１０５と流体連通する。空気圧は、フィッティングを介して印加され、検体は、分割ウェル間で分割される。本明細書で、検体は、分割ウェル１０５にわたって分配された複数の抗生物質と共にインキュベートされ得る。
【0272】
スライディングバルブ１０７は、第３の位置にスライドされ、ここで、分割ウェル１０５は、試薬ウェル１０９と流体連通する。空気圧が印加され、検体のアリコートは、分割ウェル１０５からそれぞれの試薬ウェル１０９に送達される。各試薬ウェル１０９において、検体アリコートは、微小生物の種の標的核酸に特異的なプローブならびに磁気粒子と共に、４５℃を超えることなくインキュベートされる。スライディングバルブ１０７は、第２の位置にスライドされ、ここで、試薬ウェルは密封される。検体は、イメージングウェル１１１に送達され、磁場が、検体中のインタクトな細胞を未結合のプローブから分離するために印加される。これは、カートリッジを磁石上にスライドさせることによって実施され得る。場Ｂは、細胞をイメージング表面上に引き付ける。インタクトな細胞内の結合したプローブは、各アリコート検体内の種の成長を定量化するために検出される。成長またはその欠如は、どの抗生物質がどの分割ウェル１０５中に存在したかと、逆に相関付けられ得る。病原体成長が検出されない（例えば、蛍光顕微鏡法が蛍光を示さない）イメージングウェル１１１については、検体は、対応する分割ウェル１０５中に存在した抗生物質に対して感受性であることが示される。
【0273】
カートリッジ１０１の利点は、それらが、ステップを自動化するためにカートリッジ１０１とインタラクトする機器との使用に適している点である。
【0274】
検出可能な標識には、蛍光分子、放射性同位体、質量分析のための質量タグ、または化学発光分子が含まれ得る。検出可能な標識は、標的細胞または微生物に優先的に結合するために、標的特異的部分を含み得る。標的特異的結合分子には、例えば、標的特異的分子もしくは抗原に対する抗体、または標的特異的核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプローブが含まれ得る。好ましい実施形態では、微生物の検出可能な標識化は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を構成する。ＦＩＳＨ分析は、核酸（または核酸アナログ）プローブ部分を含む蛍光プローブおよび標的特異的核酸配列と再会合を介して結合するフルオロフォアプローブ部分を使用し、その結果、標的は、光学的に次いで検出され得る。例えば、標的特異的１６Ｓ ｒＲＮＡを標的化するプローブは、微小生物を選択的にタグ化し検出するために使用され得る。参照により本明細書に組み込まれるＶｏｌｋｈａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｌｌｏｗｓ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３８（２）：８３０－８３８を参照のこと。同定アッセイについて、いくつかの別個の標的特異的蛍光プローブが、単一の検体中の複数の別個のカテゴリーの標的を独立して同定するために使用され得る。別個の蛍光プローブは、アッセイ再会合条件下で、蛍光プローブの核酸プローブ部分が、別個のカテゴリーの標的細胞または微生物についての標的特異的細胞核酸配列と優先的に再会合するように設計された、別個の核酸プローブ部分を含み得る。プローブ再会合の詳細な論述は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３０２２８５９９号に見出すことができる。
【0275】
別個の蛍光プローブ上のフルオロフォアは、別個のフォトニックシグナルを有し得、その結果、アッセイにおける異なるカテゴリーの標的細胞または微生物についての蛍光シグナルは、それらの別個のフォトニックシグナルによって識別され得る。複数の別個のフォトニックシグナルを識別するためのイメージング方法は、当業者に公知である。例えば、複数のイメージは、別個のフルオロフォアの作用スペクトルに対応する励起および発光光学フィルターの別個の対を使用して獲得することができる。したがって、単一の検体部分は、単一の処理およびイメージングウェル中で、複数の特定の標的細胞または微生物の存在について試験され得る。
【0276】
ある特定の実施形態では、検体中の標的細胞または微生物の同定および／または定量化のためのＦＩＳＨ分析は、試薬交換なしに、細胞固定なしに、等温で実施され得、反応を開始することとイメージング結果を得ることとの間が約３０分間またはそれ未満での自動的オンデバイス処理を可能にする。
【0277】
いくつかのカートリッジが、インキュベーションおよびＦＩＳＨ分析について同じ温度に維持され得、それによって、機器の内部について単一の温度のみを必要とし、異なる温度で維持した別々のインキュベーションチャンバーの必要を回避するように、本明細書に記載されるＦＩＳＨ分析は、一定の生理的温度で実施され得る。
【0278】
一般に、生理的温度は、動物などの生物の体温を指す。本明細書に開示されるプロセスステップ、分子種および化学的試薬は、細胞を溶解させることなしに生理的温度で、蛍光プローブを細胞内の核酸にハイブリダイズさせるため、およびそれらのプローブをイメージングするために有用である。検体が曝露されステップが実施される温度に関して、融通性が存在する。本開示の方法は、ゆらぎはするが４５℃を超えない温度で有用に実施され得、さらには４０℃を超えない温度で稼働し得る。本開示の方法および組成物は、例えば、３６～３９℃の範囲内の温度で使用される場合、有用かつ機能的である。実際、本開示の方法は、本質的にヒト体温、または約ヒト体温、即ち、健康なヒトについては約３７℃、発熱したヒトについては３８℃、または一部の夜間ヒト温度ゆらぎパターンについては３６℃で温度を維持する機器上で実行され得る。「約」と言うことは、小数点以内などであることを意味することである。即ち、３６．３は約３６．５であり、３７．７は約３７．５とみなす。重要なことは、本明細書に開示されるＦＩＳＨプロトコールが、身体の、例えば、哺乳動物の、好ましくはヒトの約生理的温度で全面的に実施され得ることを理解することである。
【0279】
これらの方法によって許容される温度範囲の１つの利点は、臨床的検体中の微小生物が、ｉｎ ｖｉｖｏ条件に近似する温度条件下で研究され得、そうして、別の生物の出現を抑制しつつ、さもなければ臨床的に顕著ではなかった１つの生物の差次的成長を熱が促進する影響を回避することである。例えば、根底にある主な刺激物がＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓである尿路感染に人が罹患しており、尿検体を加熱することを含む臨床試験が実施される場合、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのさもなくばほんのわずかであった数の細胞の成長を熱が促進する場合には、その臨床試験は、臨床医に適切な処置を指図しない。その試験は、処置される必要がある微小生物を誤同定する。かかる結末を回避するために、本開示は、一定の生理的温度で実施され得るＦＩＳＨを実施するための組成物、デバイスおよび方法を提供し、この組成物、デバイスおよび方法は、微小生物を同定する際に特定の有用性を有する。
【0280】
種特異的標識（例えば、標的細胞中のＲＮＡに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチド）は、検体中に導入され得、細胞は、薬剤（例えば、界面活性剤、例えば、３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯとしても公知）；スルホベタイン３－１２（ｓｂ３－１２としても公知）；ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ１００としても公知）；ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０としても公知）；その他；またはそれらの一部の組合せ）を使用して必要に応じて透過処理され得る。標識された種は、検体中の未結合の標識から分離され得；細胞は、標識を検出するためにイメージングされ得る。かかる方法は、微生物を含む検体、例えば、臨床的検体を（例えば、ＵＴＩの原因因子について試験するためまたはそれを検出するために）試験するために有用である。本開示に従って実施される場合、方法は、任意の可変の温度、例えば、一定の生理的温度で実施され得るＦＩＳＨの実施を可能にする。
【0281】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、遺伝子マッピングおよび染色体異常の診断などの適用のために提唱されてきた。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２（３）：２３７ （２００５）を参照のこと。これらのプロトコールには、変性された染色体ＤＮＡへの、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識されたプローブのハイブリダイゼーション、および蛍光色素コンジュゲートされた試薬を使用したプローブの検出が関与する。一般に、これらのプロトコールは、プローブ自体および標的ＤＮＡが、プローブハイブリダイゼーション、インキュベーションおよび可視化の前に７０～８０℃で別々に変性される、変性させるステップを必要とする。本開示の方法は、加熱するステップを必要とせず、検体の任意の部分または試薬が約７０℃に、またはさらには４０℃を上回るまで加熱されることを必要としない。本開示の方法のために可能な温度範囲を提供する１つの重要な特性には、プローブを細胞中に送達するための、透過処理剤（熱ではなく）の使用が関与する。
【0282】
透過処理剤は、３－（［３－コラミドプロピル］ジメチル－アンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯによってＣＨＡＰＳＯの名称の下で販売される）とスルホベタイン３－１２（Ｂ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯからＳＢ３－１２として入手可能）との混合物を含み得る。これらの界面活性剤は、細胞を透過処理して、微生物標的核酸に結合するようにプローブを進入させる。任意の適切なプローブが、本明細書の方法で使用され得る。
【0283】
本明細書の方法での使用に適切なプローブには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、改変塩基、コンフォメーション拘束された核酸、またはそれらの組合せを含む核酸プローブが含まれ得る。適切なプローブには、抗体または抗原、結合分子、例えば、マンノース結合性レクチンもしくは他のコレクチンが含まれ得る。分子的または化学的構造および組成物、例えば、ポリエチレングリコール、色素、染料、インターカレート色素、クリスタルバイオレット、サフラニン／カルボールフクシン、または標的に特異的に結合し得る任意の他の組成物もしくは構造。好ましい実施形態では、プローブ７０７は、オリゴヌクレオチドを含む。
【0284】
プローブは、約８塩基長と２２塩基長との間、好ましくは、約１０塩基長と２２塩基長との間の長さを有するオリゴヌクレオチドを含み得る。プローブは、好ましくは、２’ヒドロキシル基の自由電子による求核攻撃によって触媒される自己触媒を回避するために、ＤＮＡ塩基を含む（ＲＮＡ塩基が必要に応じて使用され得るまたは含まれ得るが）。プローブは、好ましくは、約４５℃、例えば、４０と５０との間の融解温度を有する。各オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１つのフルオロフォアで標識される。好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、１つ～数個のコンフォメーション拘束されたヌクレオチド（ロックト核酸または架橋核酸と種々に呼ばれる場合がある）もまた含む。したがって、プローブは、必要に応じたコンフォメーション拘束された核酸を有する蛍光標識されたＤＮＡオリゴを含み、より好ましくは、必要に応じて第２のヘルパープローブと共に、少なくとも１つのヘルププローブも同様に含む。
【0285】
ある特定の実施形態では、標識またはプローブは、微生物ＲＮＡに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを含む。微生物リボソームＲＮＡに相補的なプローブオリゴについて、オリゴは、好ましくは、１０ｎｔと１８ｎｔとの間の長さを一般に有する。Ｔｍは、およそ４５℃である。ヘルパープローブは、リボソーム構造を破壊するために使用され得る。ｒＲＮＡを標的化する１つの理由は、コピー数が、細菌細胞内のメッセンジャーおよびトランスファーＲＮＡと比較して非常に高いからである。細胞１つ当たり数千コピーが存在するので、フルオロフォアなどのシグナル伝達分子をｒＲＮＡ標的化プローブに連結させることで、単一細胞中の数千の標的による事実上のシグナル増幅が生じる。したがって、引き続く蛍光イメージングにおいて単一細胞を選び出すことは、標的細菌細胞中のかかる高濃度の標識によって得られるシグナルノイズ比を考慮すると、より容易である。したがって、方法の好ましい実施形態は、１つまたは複数の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳＯおよびＳＢ３－１２のうち１つまたは複数）を含む試薬を使用し、微生物リボソームＲＮＡを標的化するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。具体的には、プローブは、目的の標的種にしかないリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドは、１０塩基長と１８塩基長との間であり、少なくとも１つのコンフォメーション拘束された核酸を含む。また好ましくは、プローブオリゴは、少なくとも１つのヘルパープローブおよび必要に応じて第２のヘルパープローブと共に提供される。
【0286】
好ましくは、オリゴが微生物リボソームＲＮＡのセグメントにハイブリダイズする場合、ヘルパープローブおよび任意の必要に応じた第２のヘルパープローブは、蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドが結合するセグメントから１～３０塩基以内の場所でリボソームＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドである。例えば、ヘルパープローブは、ハイブリダイズしたプローブオリゴのすぐ上流および下流で微生物リボソームＲＮＡにハイブリダイズし得る。ヘルパープローブがない場合、標的部位のアクセス不能性が、１６Ｓ ｒＲＮＡとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションについての問題を提示し得る。ある特定の実施形態では、プローブ標的部位に隣接して結合する未標識のオリゴヌクレオチドが、弱いプローブハイブリダイゼーションシグナルを増加させるために使用される。ヘルパープローブは、蛍光シグナルを増強するために使用され得る。参照によって取り込まれるＦｕｃｈｓ， ２０００， Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ｈｅｌｐｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６（８）：３６０３－７を参照のこと。プローブ標的配列を選ぶ際の考慮事項には、ＦＩＳＨプローブの理論的特異性および包括性を決定すること、ＬＮＡ塩基の場所を最適化すること、ならびに特異的プローブのためのヘルパープローブを設計することが含まれる。多くの病原体標的は、使用され得る特異的であることが示されているＦＩＳＨプローブ（公開された通りの、または本開示の温度に適応するために短縮された）を既に有している。それらの多くは、ｒＲＮＡ標的化オリゴヌクレオチドプローブについてのオンライン情報源であるｐｒｏｂｅＢａｓｅ中に見出され得る。共に参照によって取り込まれるＬｏｙ， ２００７， ｐｒｏｂｅＢａｓｅ－－ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｒＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ： ｎｅｗ ｆｅａｔｕｒｅｓ ２００７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５： Ｄ８００－Ｄ８０４およびＬｏｙ， ２００３， ｐｒｏｂｅＢａｓｅ－－ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｒＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：５１４－５１６を参照のこと。従来のＦＩＳＨ反応は、通常、好ましい一定の生理的温度法において使用される温度よりもはるかに高い温度で実施されることに留意されたい。したがって、従来の供給源からのプローブは、本明細書に記載される方法における使用のために短縮または改変される必要があり得る。属を入力するためにオンラインツール「ＤＥＣＩＰＨＥＲ」を使用することもでき、その属に特異的な１６Ｓ上の領域をＤＥＣＩＰＨＥＲツールに示唆させることもできる。参照によって取り込まれるＷｒｉｇｈｔ， ２０１４， Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｒＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｄｕａｌ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと。オンラインツールから始める場合であれ、手動でプローブを設計する場合であれ、アラインメント（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷによって作成された１６Ｓ ｒＲＮＡペアワイズ配列アラインメントに対するプローブ）を試験することおよび標的配列がマッチする（好ましくは、複数のマッチを有する）が、他の病原体はマッチしない領域を選択することは、有益であり得る。包括性（包括度）および特異性を試験することは、有益であり得る。Ｔｍは、４０℃を超えるべきである（本開示の方法は、３５℃で動作するため）。より高い融解温度が好ましい場合があるが、どのくらい高い温度にできるかは、オフターゲット配列にどのくらい多くのミスマッチが存在するかに依存する。本開示に従うプローブオリゴは、４０℃と６０℃との間の融解温度を有する（例えば、２または３個のＬＮＡ塩基を有する、１６Ｓ ｒＲＮＡ中のらせんｈ１７に相補的な１０～１８ｎｔ長のＤＮＡプローブの場合）。中央部のミスマッチは、末端部のミスマッチよりも識別力が高い。ミスマッチの強度の順序：（最もましなものから最も悪いものまで）：Ｇ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ａ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｃ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ｃ。好ましくは、よりアクセス可能なｒＲＮＡの領域を選ぶ。
【0287】
暫定的プローブ設計を決めたら、オンラインツール、例えば、Ｇｅｒｍａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅによってサポートされるウェブサイトとして利用可能なＳＩＬＶＡ、「ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅｓ」を使用して、特異性および包括性を試験することができる。共に参照によって取り込まれるＰｒｕｅｓｓｅ， ２００７， ＳＩＬＶＡ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｈｅｃｋｅｄ ａｎｄ ａｌｉｇｎｅｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ＡＲＢ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５：７１８８－７１９６およびＱｕａｓｔ， ２０１３， Ｔｈｅ ＳＩＬＶＡ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ： ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌｓ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１ （Ｄ１）：Ｄ５９０－Ｄ５９６を参照のこと。プローブオリゴは、好ましくは、少なくとも１つの架橋またはロックト核酸を含む。ヘルパープローブについて、オリゴよりも低い特異性（ＳＩＬＶＡツールを参照のこと）を有することが許容可能である。ヘルパープローブは、好ましくは、約２０ｎｔ長であり得る。
【0288】
標的細胞が標識された後、本明細書に記載されるカートリッジおよび機器は、背景シグナルを低減させるために、イメージングのために未結合の標識から標識された細胞を分離するように動作可能である。任意の適切な方法または技術が、未結合のプローブから細胞を分離するために使用され得る。未結合のプローブから細胞を分離するための適切な技術には、遠心分離、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、カラム分離、１つもしくは複数のヌクレアーゼを介した未結合のプローブの消化、その他、またはそれらの組合せが含まれる。これらの方法は閉鎖されたカートリッジ内で実施されるので、未結合の標識を除去するための従来の洗浄ステップは、実現困難である。好ましい実施形態では、細胞は、磁気粒子の使用によって、未結合のプローブから分離される。例えば、インキュベーションステップは、細胞を、細胞の表面に結合する磁気粒子に曝露させるステップを含み得る。
【0289】
磁気粒子は、細菌細胞表面に結合する化学基を含み得る。化学基には、例えば、ジエチルアミンエチルデンプン；デキストラン硫酸；ポリアスパラギン酸；ポリアクリル酸；ポリスチレンスルホネート；ポリジアリルジメチルアミン；またはそれらの組合せが含まれ得る。かかる粒子は、例えば、ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ｆｌｕｉｄＭＡＧ－ＰＡＡとして販売される。ｆｌｕｉｄＭＡＧ－ＰＡＡ粒子は、細菌の表面に結合するポリアスパラギン酸である。細胞は、細菌細胞表面への化学基の結合を促進する化合物の存在下で、磁気粒子に曝露され得る。
【0290】
粒子を細胞に効果的に結合させるために、細胞表面へのＰＡＡの結合を促進する薬剤を含めることが有益であり得る。任意の適切な薬剤が、結合を促進するために含められ得る。例えば、一部の実施形態では、薬剤は、セトリミドとしても公知の、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）を含む異なる第４級アンモニウム塩の混合物を含む。セトリミドは、磁気捕捉のために細胞表面へのＰＡＡの結合を促進し、グラム陽性生物での特定のトラブルを解決する。グラム陰性生物は、トラブルなしにｆｌｕｉｄＭＡＧ－ＰＡＡに結合することが見出され得る。目的の標的微小生物がグラム陽性である場合、薬剤（例えば、セトリミド）を含めることが好ましい場合がある。したがって、方法の好ましい実施形態では、標識は、その種にしかないリボソームＲＮＡに相補的な蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドを含み；インキュベートするステップは、細胞を、細菌細胞の表面に結合する磁気粒子に曝露させるステップも含み；分離するステップは、磁場Ｂを細胞に印加するステップを含む。
【0291】
磁気粒子結合した細胞は、機器内の磁気サブシステムまたはステーションによって提供されるような印加された磁場を使用して密度勾配媒体を介して細胞を引き寄せることによって、未結合のプローブから分離され得る。分離するステップが、色素クッションにわたって磁気粒子結合した細胞を分配するステップ、および磁場を使用して、結合した細胞を、色素クッションを介してイメージングまたは検出表面上に引き寄せて、未結合のプローブを色素クッションの表面上に残すステップ、を含み得るように、密度媒体は、管またはウェル（「色素クッション」を提供するための色素を含み得る）内に供給され得る。次いで、検出するステップは、イメージング表面を蛍光顕微鏡でイメージングするステップを含み得、全てのステップは、４０℃を下回る温度で実施され得る。好ましくは、これらのステップは、約３６℃と３９℃との間の温度で実施される。
【0292】
論じられるように、分離の実施形態は、色素クッションを提供するための色素を含み得る密度勾配媒体を使用する。したがって、色素クッションは、色素をさらに含む密度勾配媒体を含む材料である。
【0293】
色素クッションは、例えば、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体（例えば、検体への曝露の前に必要に応じて乾燥されたまたは凍結乾燥された、イオジキサノールまたはポリビニルピロリドンコーティングされたコロイドシリカ粒子の溶液）であり得る。クッションは、反応の未選択の構成要素を検出ゾーンから排除するための高密度材料を含み得る。クッションは、反応構成要素よりも一般に高密度の層（液体、または乾燥されたもしくは凍結乾燥された）である。クッションは、例えば、スクロース、ジアトリゾエート、イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐとしても公知）、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌまたはアルブミンを含む種々の密度薬剤を単独でまたは組み合わせて（および種々の濃度で）含み得る。実施形態は、他の一般に使用される密度薬剤、例えば、イオジキサノール、ジアトリゾ酸ナトリウム、ナトリウム、スクロース、および他の糖、オリゴ糖、合成ポリマー（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ）、ならびに種々の塩、例えば、塩化セシウム、臭化カリウムなどを含む他の密度薬剤もまた取り込み得る。実施形態は、使用において、異なるシグナル伝達特徴および部分を一致させるために色素を使用し得る。例えば、色素Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ Ｏが、蛍光標識Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン）と共に使用され得る。
【0294】
色素クッションは、任意の必要に応じた色素を含むイオジキサノールまたはポリビニルピロリドンの溶液を調製し、カートリッジのイメージングウェル中で溶液を乾燥または凍結乾燥させることによって、形成され得る。次いで、色素クッションは、本質的に固体になる（例えば、乾燥されて、例えば、ウェルは、使用まで、上下逆を含む任意の配向で保管され得る）。液体検体がウェル中に送達されると、液体は、色素クッションを再水和する。実際、方法における使用に関して本明細書を通じて開示され論じられる試薬は、生理的温度を下回っても超えてもよい一定の生理的温度または周期的温度でのＦＩＳＨのためのプロトコールにおける後の使用のために、乾燥されたまたは凍結乾燥された形態で提供され得る。これは、試薬が調製され、カートリッジ上に乾燥状態でロードされることを可能にし、このカートリッジは次いで、出荷または保管され得、本開示の方法において後に使用され得る。
【0295】
磁気粒子、検出可能な標識および標的特異的結合分子は、好ましくは、検体中に存在する任意の標的と複合体を形成する。磁気粒子および印加された磁場は、洗浄ステップなしに、結合した検出可能な標識を、溶液中の未結合の検出可能な標識から物理的に分離するために使用され得る。米国特許第９，６４３，１８０号に記載される色素クッション層は、磁気粒子および磁場と連動して、標識された標的細胞または微生物を、高密度色素層を介して引き寄せ、イメージング分析のために試験デバイスのウェル中の検出表面上にそれらを沈着させるために使用され得る。色素クッション層中の色素は、好ましくは、イメージングのための機器によって使用される励起光および発光を吸収するように選択される。したがって、アッセイ層中の未結合の標識化部分からのシグナルは、検出表面上に磁気的に沈着した標識された標的細胞または微生物複合体からのシグナルの検出を顕著には妨害しない。同様に、色素クッションの使用は、アッセイ層中にこれもまた含まれる検体マトリックスからのいずれの自己蛍光も、沈着した標識された標的細胞複合体からのシグナルの検出を顕著には妨害しないように防止する。色素クッションのこれらの性状は、ユーザーによる検体調製なしに、かつ試験デバイスから未結合の標識を除去するための洗浄ステップなしに、標的細胞または微生物を検出することを可能にし得る。
【0296】
標識された標的細胞または微生物のデジタルイメージングは、デジタルイメージャーを使用して達成され得る。蛍光標識化の好ましい場合には、種々のレンズ、照明供給源、励起光供給源およびフィルターが使用され得る。イメージングモジュールは、溶液中の、またはウェルもしくは試験デバイス中の検出表面に引き寄せられた、検出可能に標識された標的細胞または微生物のデジタルイメージを生成することが可能な任意のデバイスを含み得る。イメージングモジュールは、例えば、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、ラインスキャンカメラ、ＣＭＯＳアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、フォトダイオードアレイ、光電子増倍管アレイ、または他の型のデジタルイメージング検出器を含み得る。
【0297】
イメージングは、単一セットの条件の下で実施され得、または光供給源、フィルターおよび／もしくはレンズは、異なる光学的に識別可能な標識（例えば、異なる標的細胞または微生物に対応する異なる蛍光プローブ）を検出するために、イメージ間で変更され得る。米国特許第９，６４３，１８０号および同第８，０２１，８４８号に記載されるイメージング技術および機器は、個々の細菌または他の標的細胞の観察および列挙を可能にし得る。
【0298】
本発明のシステムおよび方法は、機器および試験デバイスを制御するように、ならびに／またはイメージング結果を処理するように動作可能なコンピューターを含み得る。コンピューターは、非一時的なメモリデバイスに連結されたプロセッサーを含み得る。メモリは、好ましくは、プロセッサーによって実行可能な指示を記憶して、システムに、機器内の試験デバイスをマニピュレートさせ、標識された標的細胞のイメージを得させ処理させる。
【0299】
プロセッサーは、処理操作を実施する任意のデバイスまたはデバイスのシステムを指す。プロセッサーは、一般に、中央処理装置（ＣＰＵ）を提供するために、チップ、例えば、シングルコアまたはマルチコアチップを含む。プロセスは、ＩｎｔｅｌまたはＡＭＤからのチップによって提供され得る。プロセッサーは、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって商標ＸＥＯＮ Ｅ７の下で販売されるマイクロプロセッサーまたはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって商標ＯＰＴＥＲＯＮ ６２００の下で販売されるマイクロプロセッサーなどの、任意の適切なプロセッサーであり得る。
【0300】
メモリは、機械可読形式のデータまたは指示を記憶するデバイスまたはデバイスのシステムを指す。メモリは、開示されるコンピューターのプロセッサーのうち１つまたは複数によって実行される場合に本明細書に記載される方法または機能の一部または全てを達成することができる１つまたは複数のセットの指示（例えば、ソフトウェア）を含み得る。好ましくは、コンピューターは、非一時的なメモリ、例えば、ソリッドステートドライブ、フラッシュドライブ、ディスクドライブ、ハードドライブ、加入者識別モジュール（ＳＩＭ）カード、セキュアデジタルカード（ＳＤカード）、マイクロＳＤカード、もしくはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、光学および磁気媒体、その他、またはそれらの組合せを含む。
【0301】
入力／出力デバイスは、コンピューター中にまたはその外にデータを移動させるための機構またはシステムである。例示的な入力／出力デバイスには、ビデオディスプレー装置（例えば、液晶ディスプレー（ＬＣＤ）または陰極線管（ＣＲＴ））、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス）、ディスクドライブ装置、シグナル生成デバイス（例えば、スピーカー）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロフォン、セルラー無線周波数アンテナ、および例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ－Ｆｉカードまたはセルラーモデムであり得るネットワークインターフェースデバイスが含まれる。入力／出力デバイスは、ユーザーが機器を制御し、機器によって試験デバイスから得られたデータを受け取るのを可能にするために使用され得る。
【0302】
分析カートリッジ１０１は、機器または機器中のリーダーによって分析または読み取られた場合に、カートリッジを機器内での処理のための指示のセットと関連させ、ある特定の患者による関連のアッセイ結果のための、検体供給源に関する情報を含み得る、バーコードステッカーなどの識別子を有する。
【実施例】
【0303】
（実施例１）
新規の迅速な蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用するグラム陰性細菌についての検出限界（ＬｏＤ）
新規の迅速な蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用するグラム陰性細菌についての検出限界（ＬｏＤ）
【0304】
概説：以下の実施例は、非常に低い濃度の細胞を、新規等温蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用して検出することができることを実証している。３つの一般的なヒト尿路感染（ＵＴＩ）病原体についての検出限界が示される。
実験方法：
実験方法：
【0305】
細菌細胞調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １９１３８、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ９７２１についての細菌培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３～５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５～３時間成長させて対数期成長を達成することによって得た。細胞が、０．１５～０．３０の、６００ｎｍにおける光学密度読み取りに達した後、細胞を氷上に少なくとも１５分間置き、その後希釈した。冷却後、細胞を、１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に、アッセイされる濃度（およそ１９２００、９６００、４８００、２４００、１２００、６００、３００および１５０コロニー形成単位（ＣＦＵ）／反応）になるように希釈した。より正確な細胞濃度のために、これらの推定された細菌入力を、コロニー計数を使用して調整した。プレート計数を、対数期培養物をＭＨＢＩＩ中に約５００ＣＦＵ／ｍＬになるように希釈し、１００μＬをＴＳＡプレート上にプレートし、３５℃で１６～２４時間の成長後にコロニーを計数することによって決定した。平均プレート計数を使用して、試験した各濃度中に存在する実際のＣＦＵを計算した。
【0306】
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）およびカルボキシルコーティングされた高鉄磁気粒子（Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログＣＭ－０２５－１０Ｈ）を使用して、細菌細胞を非特異的に捕捉した。各粒子を、ポリアスパラギン酸粒子については１反応当たりおよそ１．３８×１０９粒子、カルボキシル粒子については１反応当たり３．４６×１０９粒子の終濃度で、５０ｍＭ Ｅｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中に１：４０希釈した。緑色色素を含む蛍光磁気ミクロスフェア（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を、３×１０６粒子／ｍＬの終濃度で懸濁物に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。磁気粒子混合物を、使用直前に１分間超音波処理して、凝集を最小化した。
【0307】
ＦＩＳＨプローブの調製：Ｅ．ｃｏｌｉおよびＫ．ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅのための２つの種特異的ＤＮＡオリゴマーセットならびにＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのための１つの種特異的ＤＮＡオリゴマーセットを、８０～８５℃の間の水浴中で１０分間加熱し、次いで、氷上に置いて、凝集を低減させた。ＤＮＡオリゴマーセットは、オリゴヌクレオチドの５’末端、または５’末端および３’末端の両方のいずれかにおいて蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７Ｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識した種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ならびに特異的プローブに隣接してまたはその近傍で結合する、リボソームサブユニットの局所的二次構造を破壊し、標識された特異的プローブの、標的ｒＲＮＡに対するより高いハイブリダイゼーション効率を可能にするように設計された２～６個のヘルパーオリゴヌクレオチドを含んだ。この実施例で使用したプローブ配列は、図１７中の表Ａに示される。
【0308】
乾燥されたハイブリダイゼーション緩衝剤プレートの調製：１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログＳ６６３９）、２．６％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、２．４％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．４３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）および０．６％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５）の混合物を調製した。３０ｕＬのこの混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、５０℃の対流式オーブン中に置き、一晩乾燥させた。１００ｕＬの液体をこれらのウェルに添加すると、３×ＳＳＣ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）および０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５）の正確なハイブリダイゼーション緩衝剤濃度が達成される。
【0309】
検出限界（ＬｏＤ）アッセイ手順：目的の細菌に適切なＤＮＡオリゴヌクレオチドセットの混合物を、尿および濃縮カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｓｔｏｃｋ（ＭＨＢＩＩ）と合わせて、１×ＭＨＢＩＩおよび３０％のプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を含む最終溶液を作製した。プローブ濃度は、異なる細菌種の間で変動したが、標識されたオリゴヌクレオチドについては０．２～０．６μＭ、対応するヘルパープローブについては１．５～６μＭの範囲であった。９０ｕＬのこの混合物を、適切な乾燥されたハイブリダイゼーション緩衝剤プレート中に置いた。１０ｕＬの磁気粒子混合物を添加し、その後、１０ｕＬの適切な細胞希釈物を添加した。各細胞濃度の１２個の複製およびブランク（細菌を含まない培地）の２４個の複製を、試験した各標的細菌について評価した。１００μＬの最終反応混合物を、１ウェル当たり５０μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含むマイクロタイタープレートに移動させ、３５℃で３０分間インキュベートして、「色素クッション」の再水和、細菌細胞の標識化、および細菌細胞表面への磁気粒子の結合を同時に可能にした。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを、磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置いて、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。
【0310】
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）ラボラトリーイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の高精度リニアステージを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを位置決めする。機器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。焦点粒子（ｆｏｃｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ励起フィルターでイメージングし、２０ミリ秒の曝露で２フレームを捕捉する。
【0311】
データ分析：各細胞濃度において、検出された蛍光物体の数を決定した。８つ全ての細胞濃度からのデータを、線形回帰直線にフィットさせ、最も低い３つの細胞入力の傾き、切片および標準偏差を使用して、試験した各細菌についてのブランク上限（ＬｏＢ）および検出限界（ＬｏＤ）を決定した。
結果：
結果：
【0312】
試験した３つ全ての細菌は、低い検出限界を示した。図１４、図１５および図１６は、ＬｏＢおよびＬｏＤを計算するために使用した線形フィットを用いてＥ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて生成したデータを示す。ＬｏＢおよびＬｏＤを、単一の反応ウェル中の検出可能なＣＦＵで示す。
【0313】
結論。この実施例に記載される新規かつ迅速なＦＩＳＨ法は、最小限に処理された尿マトリックスを使用して、１反応当たり約５００ＣＦＵまたはそれ未満の検出限界の、高感度の方法であることが示される。
【0314】
バリエーション。この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法のパフォーマンスの例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）、尿の濃度および尿処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。
【0315】
図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １９１３８の検出限界（ＬｏＤ）を示す。ブランク上限（ＬｏＢ）は８９ＣＦＵ／アッセイであり、ＬｏＤは２８４ＣＦＵ／アッセイであった。これは、尿の９，４６７ＣＦＵ／ｍｌのＬｏＤに対応する。
【0316】
図１５は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ９７２１の検出限界（ＬｏＤ）を示す。ブランク上限（ＬｏＢ）は１０４ＣＦＵ／アッセイであり、ＬｏＤは５０６ＣＦＵ／アッセイであった。これは、尿の１６，８６７ＣＦＵ／ｍｌのＬｏＤに対応する。
【0317】
図１６は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３の検出限界（ＬｏＤ）を示す。ブランク上限（ＬｏＢ）は１０９ＣＦＵ／アッセイであり、ＬｏＤは３１９ＣＦＵ／アッセイであった。これは、尿の１０，６３３ＣＦＵ／ｍｌのＬｏＤに対応する。
【0318】
図１７は、この実施例で使用したプローブ配列の表である。
【0319】
（実施例２）
包括性：本発明の迅速なＦＩＳＨ法を使用して細菌種の異なる株を検出および同定する
包括性：本発明の迅速なＦＩＳＨ法を使用して細菌種の異なる株を検出および同定する
【0320】
概説。この実施例は、標的化された細菌種について異なる株を検出するための本発明の使用を実証している。１１個の異なるＥ．ｃｏｌｉ株についての生データが示され、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．についてのデータが要約される。細菌細胞標的を、等温蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して３０分で標識し、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）ＣＣＤカメラベースの検出システムで検出した。
実験方法。
実験方法。
【0321】
細菌細胞調製：異なる株についての細菌培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３～５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５～３時間成長させて対数期成長を達成することによって得た。細胞濃度を推定するために６００ｎｍでの光学密度を使用して、細胞を、１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に、１反応当たりおよそ６００ＣＦＵおよび３０００ＣＦＵになるように希釈した。より正確なパーセント細胞検出計算のために、これらの推定された細菌入力を、コロニー計数を使用して調整した。プレート計数を、対数期培養物をＭＨＢＩＩ中に約５００ＣＦＵ／ｍＬになるように希釈し、１００μＬをＴＳＡプレート上にプレートし、３５℃で１６～２４時間の成長後にコロニーを計数することによって決定した。
【0322】
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中に、２．７５×１０１２粒子／ｍＬになるように１：２０希釈した。緑色色素を含む蛍光磁気ミクロスフェア（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を、３×１０６粒子／ｍＬの終濃度で懸濁物に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。磁気粒子混合物を、使用直前に１分間超音波処理して、凝集を最小化した。別々の磁気粒子懸濁物を、以下に記載される時間ゼロおよび時間４時間アッセイのために調製した。
【0323】
細菌細胞の標識化：１００μＬ標識化反応を、希釈した細胞、等温ハイブリダイゼーション緩衝剤（０．９×ＭＨＢＩＩ、３×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログＳ６６３９）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）、０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５））、１６Ｓまたは２３Ｓ細菌ｒＲＮＡに標的化された種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎ標識されたＤＮＡまたはＬＮＡ含有ＤＮＡプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、有効なハイブリダイゼーションを促進するためのヘルパープローブ（ＩＤＴ）および３０μＬのプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を合わせることによって調製した。プローブ配列は、図２０中の表に示される。
【0324】
尿を、製造業者の使用説明書に従って、Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、尿体積に依存してカタログ８９８９３または８９８９２）を介して最初に処理した。次いで、１０μＬの磁気粒子調製物をこの混合物に添加した。最終反応混合物を、５０μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含むマイクロタイタープレートに移動させ、３５℃で３０分間インキュベートして、「色素クッション」の再水和、細菌細胞の標識化、および細菌細胞表面への磁気粒子の結合を同時に可能にした。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを、磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置いて、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。
【0325】
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈラボラトリーイメージングシステム上の標識された細菌細胞は、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の高精度リニアステージを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを位置決めする。機器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。焦点粒子を、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ励起フィルターでイメージングし、２０ミリ秒の曝露で２フレームを捕捉する。
【0326】
データ分析：各細菌について、蛍光物体の数を決定した（アッセイシグナル）。細胞なし条件におけるシグナルの３標準偏差を上回るシグナルが検出された場合、細菌株が検出されたとみなした。
【0327】
結果。図１０５は、１１個のＥ．ｃｏｌｉ株についてのアッセイシグナルを示す。１１個全ての株が、１アッセイ当たりおよそ６００ＣＦＵの細胞入力について、背景「細胞なし」条件を上回って検出された。図１８は、検出された細胞のパーセンテージ（細胞入力ウェルにおける総アッセイシグナル－背景アッセイシグナル／総細胞入力＊１００）として示されるデータを示す。検出効率は株ごとに幾分可変であるが、これは、１１個の異なるＥ．ｃｏｌｉ株の各々を検出するアッセイの能力を阻害しなかった。
【0328】
図１９中の表は、Ｅ．ｃｏｌｉと同じ様式で分析したＥ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．についての包括性結果を要約する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて試験した株は、ＡＴＣＣ １３８３３、ＣＤＣ８０、ＣＤＣ４４、ＣＤＣ８７、ＣＤＣ４７、ＣＤＣ４３、ＢＡＡ２４７０、ＣＤＣ３４、ＣＤＣ３９、ＡＴＣＣ ７００６０３およびＢＡＡ－２４７２であった。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて試験した株は、ＣＤＣ２６３、ＣＤＣ２４２、９７２１、ＣＤＣ２３６、２７８５３、ＢＡＡ－２１１０、ＣＤＣ２３３、１５６９２、ＣＤＣ２３４、ＣＤＣ２４６およびＣＤＣ２６１であった。Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓについて試験した株は、ＣＤＣ１５５、ＣＤＣ２９、ＣＤＣ１５９、ＣＤＣ５９、ＡＴＣＣ ７００２およびＣＤＣ１５６であった。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓについて試験した株は、ＡＴＣＣ １９４３３、ＡＴＣＣ ２９２１２、ＡＴＣＣ ３３１８６、ＡＴＣＣ ５１５７５、ＡＴＣＣ ５１２９９およびＢＡＡ－２１２８を含んだ。
【0329】
結論。この実施例に記載される新規ＦＩＳＨ法は、ＵＴＩを有する患者において臨床症状をもたらす主要な病原体の中にある５つの異なる細菌種について、試験した全ての株を検出した。
【0330】
バリエーション。この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法のパフォーマンスの例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）、尿の濃度および尿処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。
【0331】
図１０５は、およそ６００ＣＦＵ／アッセイ（明るい灰色のバー）および３０００ＣＦＵ／アッセイ（暗い灰色のバー）の入力細胞濃度について、１１個のＥ．ｃｏｌｉ株についてプロットされた平均シグナル（ｎ＝３）を示す。細胞なし対照（ブランク）に由来するシグナルは、図面の左側に示される。エラーバーは、１標準偏差を示す。
【0332】
図１８は、１１個のＥ．ｃｏｌｉ株の各々について検出された入力細胞のパーセンテージ（プレート計数によって決定される）を示す。各バーは、２つの異なる入力細胞レベルの各々から３つずつの、６つの決定の平均を示す。パーセンテージ細胞検出を、［（アッセイシグナル－背景シグナル）／入力細胞］＊１００として計算した。
【0333】
図１９は、４つのさらなる細菌についての包括性結果を与える表である。
【0334】
図２０は、この実施例で使用したプローブ配列を与える表である。
【0335】
（実施例３）
迅速な等温ＦＩＳＨを使用した標的細菌の特異的検出
迅速な等温ＦＩＳＨを使用した標的細菌の特異的検出
【0336】
概説。この実施例は、新規等温ＦＩＳＨ法が、関連の非標的細菌を、非常に高い濃度であっても検出することなしに、標的細菌を特異的に検出することを実証している。この実施例は、これもまた尿路感染（ＵＴＩ）を引き起こす、類似のｒＲＮＡ配列を有する、または共生生物である１６個の他の細菌を検出しないが、Ｅ．ｃｏｌｉを特異的に検出するアッセイ条件を示す。
実験方法。
実験方法。
【0337】
細菌細胞調製：１６個のオフターゲット細菌（表１に列挙される）およびＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ ２５９２２についての細菌培養物を、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）から選択された単一のコロニーから成長させ、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）中に接種し、振盪しながら３５℃で一晩成長させた。５０～８０μＬの一晩培養物を、新鮮なＴＳＢ中に添加し、６００ｎｍにおける光学密度が０．１５～０．３に達するまで、１．５～２時間成長させた。次いで、各細菌を、カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に、およそ１×１０８細胞／ｍＬになるように希釈した。
【0338】
評価する細菌標的の選択：特異性について試験する細菌病原体を、標的細菌のｒＲＮＡ配列とのｒＲＮＡ配列類似性について、またはそれらが、尿路感染（疾患標的）において一般に見出される病原体であり、したがって、これらの生物に対する交差反応性が最も問題になることに起因して、選択した。図２１中の表は、試験した細菌種および株を示す。
【0339】
ＦＩＳＨプローブの調製：Ｅ．ｃｏｌｉのためのＤＮＡプローブセットを、８０～８５℃の間の水浴中で１０分間加熱し、次いで、氷上に置いて、凝集を低減させた。このＤＮＡプローブセットは、図２２中の表に示される。このセットは、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７Ｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識した種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド、および特異的プローブに隣接してまたはその近傍で結合する、リボソームサブユニットの局所的二次構造を破壊し、標識された特異的プローブの、標的ｒＲＮＡに対するより高いハイブリダイゼーション効率を可能にするように設計されたヘルパーオリゴヌクレオチドを含んだ。
【0340】
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中に、２．７５×１０１２粒子／ｍＬになるように１：２０希釈した。緑色色素を含む蛍光磁気ミクロスフェア（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を、３×１０６粒子／ｍＬの終濃度で懸濁物に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。磁気粒子混合物を、使用直前に１分間超音波処理して、凝集を最小化した。
【0341】
細菌細胞の標識化：１００μＬ標識化反応を、希釈した細胞、等温ハイブリダイゼーション緩衝剤（０．９×ＭＨＢＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）、３×ＳＳＣ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ、カタログＳ６６３９）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）、０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５））、１６Ｓまたは２３Ｓ細菌ｒＲＮＡに標的化された種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎ標識されたプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、有効なハイブリダイゼーションを促進するためのヘルパープローブ（ＩＤＴ）および３０μＬのプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を合わせることによって調製した。試験した特異的プローブセットは、図２２中の表に示される。尿を、製造業者の使用説明書に従って、Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、尿体積に依存してカタログ８９８９３または８９８９２）を介して最初に処理した。次いで、１０μＬの磁気粒子調製物を、この混合物に添加した。最終反応混合物を、１ウェル当たり５０μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含むマイクロタイタープレートに移動させ、３５℃で３０分間インキュベートして、「色素クッション」の再水和、細菌細胞の標識化、および細菌細胞表面への磁気粒子の結合を同時に可能にした。各細菌を、１反応当たり１×１０６細胞の終濃度で試験した。この濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉについての決定された検出限界よりもおおよそ３０００倍高い。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを、磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置いて、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。
【0342】
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）ラボラトリーイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の高精度リニアステージを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを位置決めする。機器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。焦点粒子を、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ励起フィルターでイメージングし、２０ミリ秒の曝露で２フレームを捕捉する。
【0343】
データ分析：各細菌について、蛍光物体の数を決定した（アッセイシグナル）。ブランク（細胞の添加なし）におけるシグナルの３標準偏差以内のシグナルが検出された場合、細菌を交差反応性とみなした。
結果。
結果。
【0344】
図２３および図２４は、迅速な新規ＦＩＳＨ法が、Ｅ．ｃｏｌｉのみを検出し、他の１６個の異なるチャレンジ細菌を検出しないことを示している。図１および２は各々、非常に高い濃度（１反応当たり１×１０６細胞）の８個の臨床的に関連するチャレンジ細菌が、標的化されたＥ．ｃｏｌｉ細菌について高いアッセイシグナルを生じる同じアッセイ条件下で検出されないことを示している。２つのバーは、Ｅ．ｃｏｌｉに特異的であるように設計した２つの異なるプローブセットを示す（図２２中の表を参照のこと）。１６個のチャレンジ細菌の各々についてのアッセイシグナルは、細胞なし対照プラス３標準偏差未満であった（１２５）。
【0345】
結論。この実施例に記載される新規の迅速なＦＩＳＨ法は、設計により、Ｅ．ｃｏｌｉを特異的に検出するが、１６個の臨床的に関連する潜在的交差反応性細菌は検出しない。これは、この方法が、感染の臨床処置にとって非常に重要な標的ＵＴＩ病原体の同定のための高い特異性を有することを実証している。
【0346】
バリエーション。この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法のパフォーマンスの例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）、尿の濃度および尿処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓについて高い特異性を実証するアッセイもまた設計されている。
【0347】
図２１は、Ｅ．ｃｏｌｉ検出の特異性を試験するチャレンジ細菌を示す表である。
【0348】
図２２は、この実施例で使用したプローブ配列を示す表である。
【0349】
図２３は、Ｅ．ｃｏｌｉの特異的検出、および８個のチャレンジ細菌の検出がないことを示す。
【0350】
図２４は、Ｅ．ｃｏｌｉの特異的検出、および８個の追加のチャレンジ細菌の検出がないことを示す。
【0351】
（実施例４）
４個の別個の微生物を同時に同定する多重化ＦＩＳＨ法
４個の別個の微生物を同時に同定する多重化ＦＩＳＨ法
【0352】
概説。この実施例は、各細菌のｒＲＮＡに特異的な蛍光標識されたプローブを使用して、単一の反応において、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＫ．ｏｘｙｔｏｃａを同時に検出するための本発明の使用を実証している。各病原体は、異なる励起／発光スペクトル特徴を有する４個の別個のフルオロフォア － 各細菌種について１つ － の使用を介して、混合物中で特異的に検出された。
【0353】
実験方法。細菌細胞成長：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＡＴＣＣ ８７２４についての細菌培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３～５個のコロニーを接種し、３７℃で１．５～３時間成長させて対数期成長を達成することによって得た。次いで、各培養物を、カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＭ５８６０）中に、およそ１．０×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬである６００ｎｍの光学密度が０．１５になるように希釈した。
【0354】
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）およびカルボキシルコーティングされた磁気粒子（Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログＣＭ－０２５－１０Ｈ）を使用して、細菌細胞を非特異的に捕捉した。各粒子を、ポリアスパラギン酸粒子については１反応当たりおよそ１．３８×１０９粒子、カルボキシル粒子については３．４６×１０９の終濃度で、５０ｍＭ Ｅｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中に１：４０希釈した。
【0355】
細菌細胞の標識化：１００μＬ標識化反応を、４個全ての細菌の希釈した細胞、等温ハイブリダイゼーション緩衝剤（０．９×ＭＨＢＩＩ、３×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログＳ６６３９）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）、０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５））、１６Ｓまたは２３Ｓ細菌ｒＲＮＡに標的化された種特異的ＤＮＡプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、有効なハイブリダイゼーションを促進するためのヘルパープローブ（ＩＤＴ）および３０μＬのプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を合わせることによって調製した。次いで、１０μＬの磁気粒子調製物を、この混合物に添加した。プローブ配列およびそれらの色素改変の場所は、図２６中の表に示される。
【0356】
細胞／ハイブリダイゼーション混合物（１ｍＬ）を、カートリッジ中に移動させた。カートリッジを、残りのアッセイステップならびにイメージの獲得および分析を自動化する分析器（以下に記載される）上に置いた。簡潔に述べると、分析器の流体システムは、１ウェル当たり４６μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含む反応混合物を光学窓中に動かした。カートリッジを、分析器内で３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後、カートリッジを、磁石ステーション（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間動かして、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、再水和された「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。磁石ステーションの後、カートリッジを、分析器内のイメージングステーションに動かし、４つの色チャネル（赤（励起６３５／２５ｎｍ、発光６８０／４０ｎｍ）、黄色（励起５３０／２０ｎｍ、発光５７２／２３ｎｍ）、緑（励起４７０／４０ｎｍ、発光５２０／４０ｎｍ）、オレンジ（励起５６９／２５ｎｍ、発光６０９／３４ｎｍ））の各々において、一連のイメージを得た。
【0357】
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ分析器イメージングシステムは、完全に自動化された試験の一部として、ＭｕｌｔｉＰａｔｈカートリッジの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、注文設計された高精度３軸位置決めシステムを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを場所決めする。分析器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、カートリッジイメージングウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。赤チャネルについて、１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。オレンジチャネルについて、２４フレームを、５６９／２５ｎｍ励起および６０９／３４ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。黄色チャネルについて、４８フレームを、５３０／２０ｎｍ励起および５７２／２３ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。緑チャネルについて、３２フレームを、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。標識された細胞をイメージングするための焦点平面を、この実施例において実験的に決定した。
結果。
結果。
【0358】
図２５は、各々４つの入力細菌のうち１つに特異的な４つの色チャネルの各々において蛍光を検出した、完全な獲得されたイメージの一部分を示す。各スポットは、単一細胞または細胞の群に対応する。アルゴリズムを使用して、アーチファクト（例えば、破片）とは別個の意味ある物体を同定し、それらの物体を細胞として計数する。各細菌についての差し込み図でわかるように、類似の数の細胞が予想どおり検出されたが、それは、入力細胞濃度がおよそ同じだったからである。オーバーレイすると、これらのスポットは対応せず、これは、４つの異なる細菌標的で、異なる物体が予想どおり各チャネルにおいて観察されたことを示している。
【0359】
結論。この方法は、単一の迅速なＦＩＳＨ法が、カートリッジの単一のウェルにおいて４つの異なる細菌を同時に検出および定量化するのを可能にする。
バリエーション：
バリエーション：
【0360】
この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法の多重性能の例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）および代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、それに対する特異的プローブを設計することができる他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。
【0361】
図２５は、ＣＣＤイメージング法および各細菌について１つの４つの異なるフルオロフォアを使用して４つの異なる色チャネルにおいて得た同じ視野を示すイメージである。４つ全ての細菌を、単一のウェルにおいて検出することができた。
【0362】
図２６は、この実施例４で使用したプローブ配列の表である。
【0363】
（実施例６）
機器上のカートリッジ内の臨床尿検体におけるＥ．ｃｏｌｉの自動化された迅速ＡＳＴ
機器上のカートリッジ内の臨床尿検体におけるＥ．ｃｏｌｉの自動化された迅速ＡＳＴ
【0364】
概要：この実施例は、細胞の精製を必要とすることなく、４時間で、尿中の標的化細菌病原体（この実施例ではＥ．ｃｏｌｉ）の抗微生物薬感受性を決定するための発明のシステム、デバイス、および方法の使用を実証する。標識化と磁気選別のための、かつ非拡大デジタルイメージングを使用する差示的成長後に特異的標的細胞を定量する、協奏的なＦＩＳＨ方法を使用する実施例。この新たな方法は、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と匹敵する性能を有する。
実験方法：
実験方法：
【0365】
尿検体：尿路感染症（ＵＴＩ）を有する患者から採取され、Ｅ．ｃｏｌｉを含有することが公知の４８個の残遺物である匿名化された尿検体をベスイスラエル病院（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＫｉｒｂｙ医師の研究所から受領した。試料は、採取の１～５日後に受領し、細胞生存率の損失を制限する尿防腐剤を含有した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、存在する細菌のおよそのＣＦＵ／ｍＬを決定し、Ｋｉｒｂｙ医師の研究所によって報告された単一のまたは混合した細菌の形態学を確認するために、従来の尿培養を実施した。簡潔には、較正した１μＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、１μＬをトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）プレート上に均一に広げ、３５℃のインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したように処理およびアッセイした。
【0366】
尿の処理：試験の前に、尿防腐剤および他の妨害する可能性のある化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。各臨床的に陽性の尿試料２．５ｍＬを事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に適用し、製造業者の使用説明書に従って遠心分離した。処理後の細菌の損失を調査するために、上記のように、この処理した試料に関して尿培養を繰り返した。
【0367】
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
【0368】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前の時間０（Ｔ０）におけるアッセイシグナルを各臨床尿検体について決定した。それぞれ処理済尿３０μＬを、種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎで標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブを含有する１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）７０μＬに添加した。使用したプローブ配列を表Ａに示す。次いで、混合物１００μＬを、脱水したハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１） ０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、調製した磁気粒子混合物１０μＬをウェルに添加した。この反応混合物１００μＬを、ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
【0369】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに関する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の露出で１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0370】
抗生物質プレートの調製：予想された最少阻止濃度（ＭＩＣ）よりも１０倍高い濃度で開始して、２倍連続希釈系列で各抗生物質の６つの濃度を含有するマイクロタイタープレートを調製した。使用した抗生物質は、セファゾリン、シプロフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾールであった。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたいだ。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または希釈液を含有する８つのウェルがプレート中に含まれ、抗生物質なしの陽性成長対照および陰性成長対照を可能とした。
【0371】
４時間の成長：時間０での細胞の定量化がなされている間に、処理済臨床尿３２．４μＬと１．４３Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）７５．６μＬを抗生物質プレート（既に抗生物質１２μＬを含有する）の各ウェルに添加した。標準的インキュベーター中で、３５℃で４時間、試料を成長させた。
【0372】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
【0373】
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0374】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の６つの濃度全てを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
結果。
結果。
【0375】
図２７から図３０は、ゴールドスタンダードであるブロス微量希釈方法に一致する３つの個体の尿に関するＭＩＣを得るためにこの方法をどのように使用することができるかを実証する本発明者らのより大きなデータセットからの３つの実施例を示す。
【0376】
図２７は、単一の薬物（ニトロフラントイン）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００１７）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。
【0377】
図２８は、単一の薬物（セファゾリン）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００４７）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。
【0378】
図２９は、単一の薬物（シプロフロキサシン）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００５７）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。
【0379】
図３０は、単一の薬物（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００５２）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。
【0380】
結論。この新規方法は、正確なＡＳＴの結果（ＭＩＣの決定）が、注目すべきことに、長時間に及ぶコロニー精製ステップを用いずに、最小限に処理された尿臨床検体の４時間のみの差示的成長によってなされ得ることを示す。ＡＳＴの結果は、ＭＩＣカテゴリーの抗生物質感受性結果として報告されたかどうかにかかわらず、ゴールドスタンダードであるブロス微量希釈方法と比較するのが好都合である。
【0381】
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度など）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の抗生物質、生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。
【0382】
図２７は、ニトロフラントインを含むＢＩＵＲ００１７を示す。
【0383】
図２８は、セファゾリンを含むＢＩＵＲ０４７を示す。
【0384】
図２９は、シプロフロキサシンを含むＢＩＵＲ０５７を示す。
【0385】
図３０は、トリメトプリム／スルファメトキサゾールを含むＢＩＵＲ０５２を示す。
【0386】
図３１は、この実施例６において使用したプローブ配列の表である。
【0387】
（実施例７）
尿試料中の細菌に関する迅速かつ正確な抗微生物薬感受性試験
尿試料中の細菌に関する迅速かつ正確な抗微生物薬感受性試験
【0388】
概要。この実施例は、細菌を含まない尿中に添加された公知の抗生物質感受性プロファイルを有する病原体の抗微生物薬感受性を正確に決定するための本発明の使用について実証する。抗微生物剤を含有する微生物学的培地における差示的成長、その後の標的特異的細胞の定量化のための本発明と協奏するＦＩＳＨ方法を使用する成長の評価には、ちょうど４．５時間を要した。この新たな方法は、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と匹敵する性能を有する。
実験方法。
実験方法。
【0389】
細菌細胞の調製：公知の耐性プロファイルを有する５０種の細菌株を、ＡＴＣＣまたはＣＤＣ抗生物質耐性バンク（ＡＲバンク）のいずれかから採取し、表Ａに示す。これらのうちのそれぞれに関する細菌培養物は、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に新鮮なトリプシンダイズ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３から５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５から３時間成長させて対数期成長を達成することによって得られた。６００ｎｍの光学密度を使用して細胞濃度を推定し、各培養物をカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中でおよそ５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬまで希釈した。
【0390】
尿の処理：試験する前に、プールしたヒトの尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラムに、４ｍＬの尿の１つの事前に洗浄した１０ｍＬのスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に対する比で適用し、製造業者の使用説明書に従って遠心分離した。
【0391】
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
【0392】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前の時間０（Ｔ０）におけるアッセイシグナルを各細菌について決定した。処理済尿３０μＬ、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの細菌希釈液１０μＬ、ＭＨＢＩＩ（１００μＬ中の１×終濃度）６０μＬならびに標的細菌種に対して適切な種特異的なＡｌｅｘａ６４７Ｎで標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよびそれに関連する未標識ＤＮＡヘルパープローブからなる反応混合物を調製した。使用したプローブ配列を図３５の表に示す。次いで、混合物１００μＬを、脱水したハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）、０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、調製した磁気粒子混合物１０μＬをウェルに添加した。この反応混合物１００μＬを、ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
【0393】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0394】
抗生物質プレートの調製：２倍連続希釈系列で各抗生物質の６つの濃度を含有するマイクロタイタープレートを調製した。２倍希釈系列を、追加の細胞／尿／培地混合物によって正しい抗生物質範囲が得られるように、最終ブロス微量希釈における所望の濃度よりも１０倍高い濃度で調製した。次いで、各抗生物質の希釈液１２ｕＬを９６ウェルプレートの適切なウェル中にアリコートした。異なる抗体を異なる細菌について試験した。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、適切な細菌種に対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたぎ、その結果、カテゴリーの決定（感受性／中間／耐性）はこのデータからなされた。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または他の希釈液を含有するいくつかのウェルは、抗生物質なしの陽性成長対照および陰性成長（細胞なし）対照のために含まれた。抗生物質プレートを－８０℃で凍結させ、使用前に完全に解凍した。
【0395】
４時間の成長：時間０での細胞の定量化がなされている間に、調製した細菌培養物１２μＬ、時間０のアッセイに対してなされたように処理したプールしたヒトの尿３６ｕＬ、２Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）６０ｕＬおよび水２ｕＬを調製した抗生物質プレートの各ウェルに添加した。標準的インキュベーター中で、３５℃で４時間、試料を成長させた。
【0396】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
【0397】
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0398】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の全ての濃度を含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各細菌試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、結果を、ＡＴＣＣまたはＣＤＣによって報告されたＭＩＣ値およびカテゴリーコールと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が各試料に添加されたことを確認するための、または阻害倍率を計算する際に使用するための対照条件である。
【0399】
図３２は、さらに、セフタジジム（ＣＡＺ）に対して試験した細菌について、独占的な糸状菌の存在が（左側（正常細菌）と右側（糸状菌）を比較して、目視で容易に識別することができるように）、その抗生物質濃度において差し迫った細胞死の指標として得られたこと、およびＭＩＣ濃度が、可能ならばこれに従って調整されたことを示す。トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＸＴ）について試験した細菌の場合には、閾値は、阻害倍率（抗生物質と細菌の両方を含有するウェルによって分割された細菌を含有するが抗生物質を含有しないウェルにおけるアッセイシグナル）に基づいて作成された。
結果。
結果。
【0400】
図３３は、ＣＤＣまたはＣＬＳＩにより公表されたＭＩＣと一致する、尿マトリックスの存在下での個々の細菌に関するＭＩＣを得るためにこの方法をどのように使用することができるかを示す。この実施例は、単一の薬物（シプロフロキサシン）に対する単一の細菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ０１２６）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数を示す。公表されたＭＩＣ（≧０．２５μｇ／ｍＬ）は、本発明において記載した新規の、迅速ＡＳＴ方法によって決定したＭＩＣと正確に一致する。成長倍率に関する閾値（この実施例では２０）は、灰色の横線で示す。
【0401】
図３４の表は、試験した全ての株にわたる全体的性能を示す。試験したＭＩＣは、新規ＡＳＴ方法によって決定したＭＩＣが、正確に一致するか、または公表された値の１つの２倍希釈内にある場合に、本質的一致内にある。２つの場合を除き、全ての細菌／抗生物質の組合せが１００％の本質的一致を有した。
【0402】
結論。本新規方法は、多剤耐性機序を有する高度に特徴付けられた細菌株に対して公表された値と一致するＭＩＣの決定が、試料マトリックスの文脈において、４時間のみの成長によってなされ得ることを示す。
【0403】
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度など）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の抗生物質、生物学的検体および特異的プローブが設計され得る他の細菌に明らかに拡張され得る。
【0404】
図３２は、糸状菌（右のパネル）に対する正常細菌（左のパネル）の目視比較である。
【0405】
図３３は、本発明において記載した新規な、迅速ＡＳＴ方法によって得られたＭＩＣが、０．２５μｇ／ｍＬでコールされることを示す。
【0406】
【表A-1】
【表A-2】
【0407】
図３４は、この実施例において試験した全ての細菌および抗生物質に関するＡＳＴの結果の表である。
【0408】
図３５は、この実施例７において使用したプローブ配列の表である。
【0409】
（実施例８）
細胞精製を使用しない臨床尿検体に対する迅速かつ正確な自動ＡＳＴの結果
細胞精製を使用しない臨床尿検体に対する迅速かつ正確な自動ＡＳＴの結果
【0410】
概要。この実施例は、長時間に及ぶ細胞精製ステップを必要としない、４時間での臨床尿試料中の病原体に関するＡＳＴの結果を自動的に決定するための本発明のシステムおよび方法の使用について実証する。自動化された機器は、一定の生理的温度で抗微生物薬感受性を決定するために、試薬を含有するカートリッジにおいて必要とされるステップを実施する。温度は、微生物成長と標的細胞を検出および定量するための本発明の方法との両方に適合する。後者の方法は、ＦＩＳＨに基づく標識化、磁気選別、および非拡大デジタルイメージングを使用する本発明のシステムで実施される。
【0411】
機器の空気圧サブシステムを使用して、カートリッジ内の検体を、様々な濃度の様々な抗微生物剤と微生物学的培地とを含有するポーションまたはアリコート中に自動的に分配する。ポーションのうちの１つを使用して、成長インキュベーションの前に病原体細胞を定量する。このシステムはカートリッジを４時間インキュベートし、次いで、抗微生物剤を含有するウェル中の標的細胞数を定量する。抗微生物剤を含有するインキュベートしたポーション中の細胞数のインキュベーション前に測定した細胞数との比較を使用して、様々な抗生物質における病原体の抗微生物薬感受性を決定する。
【0412】
この実施例は、尿中にＥ．ｃｏｌｉを有する入院患者からの臨床検体において直接的に、迅速かつ自動化された抗微生物薬感受性試験のための本発明の自動化システム、デバイス、および方法を使用する結果を示す。本発明は、ちょうど４時間で、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と比較して正確な性能を実現した。
実験方法。
実験方法。
【0413】
尿検体：尿路感染症（ＵＴＩ）を有する患者から採取され、Ｅ．ｃｏｌｉを含有することが知られている残遺物である匿名化された尿検体をベスイスラエル病院（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＫｉｒｂｙ医師の研究所から受領した。試料は、採取の１～５日後に受領し、細胞生存率の損失を制限する尿防腐剤を含有した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、存在する細菌についておよそのＣＦＵ／ｍＬを決定し、Ｋｉｒｂｙ医師の研究所によって報告された単一または混合した細菌の形態学を確認するために、従来の尿培養を実施した。簡潔には、較正した１μＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、１μＬをトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上に均一に広げ、３５℃のインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したように処理およびアッセイした。
ＡＳＴカートリッジの調製－培地および抗微生物薬
ＡＳＴカートリッジの調製－培地および抗微生物薬
【0414】
４Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号１０１３２０－３５６）２５ｕＬを８個の個々の成長ウェルのそれぞれの中に分配することによってカートリッジを調製する何日か前に（カートリッジの図としての図１を参照されたい）、成長ウェル１および２は時間０の測定のためのものであり（以下の記載を参照されたい）、よって、成長ウェルには成長培地のみが含有されている。成長ウェル３および４も培地しか含有しなかった。これらのウェルは、成長が４時間をかけて観察されることを確認するための陽性対照としての役割を果たす。成長ウェル５および６、ならびに７および８中に、２つの濃度の抗生物質を添加した。これを行うために、１ｍＬ当たりのマイクログラムで標的濃度より２２．２倍高い倍率で濃縮した抗生物質４．５μＬを適切な成長ウェル中に沈着させた。カートリッジは、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）とニトロフラントイン（ＮＩＴ）との両方またはセファゾリン（ＣＦＺ）とトリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＸＴ）との両方のいずれかを２つの濃度で含有した。カートリッジ中の各抗生物質の終濃度については、表１を参照されたい。次いで、培地および抗生物質を４０℃のコンベクションオーブン中で１６～２０時間乾燥させた。
【0415】
ＡＳＴカートリッジの調製－ハイブリダイゼーション試薬
【0416】
３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％ｗ／ｖのセトリミド、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）、および０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７）を含有するハイブリダイゼーション緩衝剤を調製した。トレハロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４４９）をこの混合物中に溶解させ、終濃度を１０％ｗ／ｖとした。このハイブリダイゼーション緩衝剤－トレハロース混合物を８．３μＬ体積のビーズ中で凍結乾燥させた。２つの８．３ｕＬビーズを８つの試薬ウェルのそれぞれの中に入れた（カートリッジ上の位置について、図１を参照されたい）。
ＡＳＴカートリッジの調製－磁気粒子
ＡＳＴカートリッジの調製－磁気粒子
【0417】
ポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を５０ｍＭのＥｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中に１：２０で希釈し、１０％ｗ／ｖのトレハロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４４９）の終濃度を含む１ｍＬ当たり２．７５×１０１４個の粒子の濃度とした。これを希釈するために、緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。次いで、混合物を１０μＬ体積のビーズ（反応ごとに２．６４×１０１２個の粒子）中で凍結乾燥させた。１つの磁気粒子を凍結乾燥させたビーズを２つのハイブリダイゼーションミックスビーズと一緒に８個の試薬ウェルのそれぞれの中に入れた。
試料をカートリッジ中に入れるための手順－尿の処理
試料をカートリッジ中に入れるための手順－尿の処理
【0418】
試験の前に、尿防腐剤および他の妨害する可能性のある化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。各臨床的に陽性の尿試料２．５ｍＬを事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に適用し、製造業者の使用説明書に従って遠心分離した。処理後の細菌損失を調査するために、上記のようにこの処理した試料に関して尿培養を繰り返した。
試料をカートリッジ中に入れるための手順－試料をカートリッジ上に置く
試料をカートリッジ中に入れるための手順－試料をカートリッジ上に置く
【0419】
各処理済尿試料７５０μＬを水１７０５μＬおよび種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブ４５μＬおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブと合わせて、３０％ｖ／ｖの終濃度の尿を含有する溶液を作製した。各細菌に対して使用したオリゴヌクレオチド、それらの濃度および色素標識は表２に見出すことができる。混合物１ｍＬをカートリッジの試料ポットに添加し、カートリッジを分析器上に置いた。
自動分析器上でのＡＳＴカートリッジの実行
自動分析器上でのＡＳＴカートリッジの実行
【0420】
次いで、カートリッジを機器上に置いた後、データ分析以外の全てのその後の作動は自動で行われた。尿／水／ＦＩＳＨプローブ混合物（試料）は、最初に、真空下で、カートリッジ上部の８つの成長ウェル中に向けられた。次いで、最初の２つの成長ウェル中の試料を反応ウェルにすぐに再度位置付け、ハイブリダイゼーション緩衝剤／ＦＩＳＨプローブミックスおよび凍結乾燥させた磁気粒子を再水和させた。次いで、試料は、脱水した「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、コンベクションオーブン中で６０℃で３時間乾燥させた）４６μＬを含有するイメージングウインドウに続き、分析器上で３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後に、次いで、カートリッジを磁石ステーションに再配置させ、強力な永久磁石（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）の上に４分間置いて、標識された磁気粒子と相互作用する細菌細胞をイメージング表面の近傍に移動させた。最後に、カートリッジをイメージングステーションまで動かし、以下に記載した非拡大ＣＣＤイメージャーを使用してイメージングを撮影した。
【0421】
残りの６つの成長ウェル中の試料をその場所に保ち、細菌を、抗生物質の存在下または非存在下で、再水和した培地中で３５℃で４時間成長させた。成長後に、細胞懸濁液を、時間０のアッセイについて行ったように、試薬ウェルに再度位置付け、正確に同じハイブリダイゼーション反応、磁気プルダウン、およびイメージングを上記のように実施した。
分析器のイメージングシステムおよびイメージングプロセス
分析器のイメージングシステムおよびイメージングプロセス
【0422】
ＭｕｌｔｉＰａｔｈ Ａｎａｌｙｚｅｒイメージングシステムは、完全に自動化された試験の一部として、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、カスタム設計された精度の高い３軸位置決めシステムを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この分析器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｅｌｌ全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0423】
データ分析：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度との両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の両濃度を含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率とＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察とを比較して、閾値を、ブロス微量希釈の結果との一致を最大化する成長倍率カットオフのために選択した。細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）条件では成長倍率が多くなり、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）条件では成長倍率の数が少なくなる。これらのカートリッジでは、両濃度の抗生物質がそれらの成長倍率の数に基づいて成長を示さなければ、その尿試料中の細菌は感受性と呼ばれる。低い方の濃度では成長が存在するが、高い方の濃度では成長が存在しない場合、その尿試料中の細菌は、シプロフロキサシン、ニトロフラントインおよびトリメトプリム／スルファメトキサゾールの場合には中間であり、セファゾリンの場合には耐性である。両濃度の抗生物質がそれらの成長倍率閾値に基づいて成長を示す場合、その尿試料中の細菌は耐性と呼ばれる。全ての感受性／耐性コールデータを、ＣＬＳＩ対応の標準的ＢＭＤにおけるＭＩＣ決定によって作製された感受性／耐性コールと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
結果。
結果。
【0424】
図３７は、Ｅ．ｃｏｌｉ株を含有した臨床尿試料ＢＩＵＲ００６７を含有する２つのカートリッジ中の４つの複製の平均成長倍率を示す。このグラフは、２つの異なるカートリッジ中の４つの複製にわたるシプロフロキサシンとニトロフラントインとのそれぞれの２つの濃度のそれぞれにおける平均成長倍率を示す。両抗生物質に対する成長倍率値２を使用して、ＭｕｌｉｔＰａｔｈアッセイは、両シプロフロキサシン（ＣＩＰ）濃度を成長とコールし、両ニトロフラントイン（ＮＩＴ）濃度を成長なしとコールする。したがって、ＭｕｌｉｔＰａｔｈによって、ＢＩＵＲ００６７はシプロフロキサシンに対して耐性であり、ニトロフラントインに対して感受性である。この尿から単離され、ＣＬＳＩ－標準的ブロス微量希釈で試験されたＥ．ｃｏｌｉ株は、これらの感受性／耐性コールと一致した。
【0425】
図３９は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅ株を含有した臨床尿試料ＢＩＵＲ００８４を含有する２つのカートリッジ中の４つの複製の平均成長倍率を示す。このグラフは、２つの異なるカートリッジ中の４つの複製にわたるセファゾリンとトリメトプリム／スルファメトキサゾールとのそれぞれの２つの濃度のそれぞれにおける平均成長倍率を示す。両抗生物質に対する成長倍率値２を使用して、ＭｕｌｉｔＰａｔｈアッセイは、セファゾリンとトリメトプリム／スルファメトキサゾールとの両抗生物質の濃度の全てを成長とコールする。したがって、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのこの株は、両抗生物質に対して耐性である。これは、社内でなされた両方のＣＬＳＩ－標準的ブロス微量希釈と一致する。
【0426】
結論。この実施例は、尿中にＥ．ｃｏｌｉを有する入院患者からの臨床検体において直接的に、迅速かつ自動化された抗微生物薬感受性試験のための本発明の自動化システム、デバイス、および方法を使用する結果を示す。本発明は、ちょうど４時間で、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と比較して正確な性能を実現した。
【0427】
バリエーション。この実施例は、カートリッジに関するこの新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順ならびに反応物および抗微生物薬の安定化に対する変更、異なる細菌標的、異なる抗微生物剤などを使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。
【0428】
図３６は、Ｍｕｌｔｉｐａｔｈ（商標）ＵＴＩ－ＡＳＴカートリッジを示す。
【0429】
図３７は試験した抗生物質の濃度の表を示している。
【0430】
図３８は、この実施例８において使用したオリゴヌクレオチドの表である。
【0431】
図３９は、ＢＩＵＲ００６７の結果を示す。
【0432】
図４０は、ＢＩＵＲ００８４の結果を示す。
【0433】
（実施例９）
尿検体における直接的な迅速ＡＳＴ方法は、様々な病原体濃度に対して頑強である
尿検体における直接的な迅速ＡＳＴ方法は、様々な病原体濃度に対して頑強である
【0434】
概要。可変的な接種濃度に対する頑強性は、検体に直接由来する検体を試験する際に、標的細胞の濃度が知られていないため、迅速ＡＳＴ方法にとって重要である。この実施例は、人為的検体に対して、広範囲の標的細胞濃度を網羅する場合に、尿検体から直接的に正確かつ一致する結果をもたらす本発明の使用を実証する。この実施例は、１０％の尿の存在下でのＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ－００４３の可変的な細胞入力によって、ＡＳＴに対するゴールドスタンダードであるブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較して正確なＡＳＴの結果が実現されることを実証する。
【0435】
実験手順。
【0436】
抗生物質プレートの調製：２倍連続希釈系列で３から５つの抗生物質のいずれかの濃度を含有する抗生物質プレートを、所望の終濃度よりも１０倍高い濃度の１０μＬを９６ウェルプレートのウェル中に分配することによって調製した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、試験した細菌株に対するＣＬＳＩにより報告されたＭＩＣをまたいだ。以下の抗生物質の全てまたはサブセットを用いてプレートを調製した：セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、４つのウェルは、陽性（抗生物質の非存在下での細菌成長）および陰性（細菌細胞なし）の対照を可能とするための水を含有した。
【0437】
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３、およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ－００４３に関する細菌培養物は、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に新鮮なトリプシンダイズ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３から５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５から３時間成長させて対数期成長を達成することによって得られた。これらの細胞を、様々な接種（２×１０３ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）に対して、１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中で希釈した。より正確な細胞濃度のために、これらの推定された細菌入力を、コロニー計数を使用して調整した。プレート計数は、対数期培養物をＭＨＢＩＩ中で約５００ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、ＴＳＡプレート上に１００μＬをプレーティングし、３５℃で１６から２４時間の成長後にコロニーを計数することによって決定した。平均プレート計数を使用して、試験した各濃度で存在する実際のＣＦＵを計算した。
【0438】
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
【0439】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前のアッセイシグナル（時間０またはＴ０）を各生物および接種について決定した。各試料１０μＬをハイブリダイゼーション緩衝剤８０μＬに添加し、３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、１％のＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３０２３）、１％のＮＯＧ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号０８００１）、１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）、種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブの終濃度とした。使用したオリゴヌクレオチドプローブを表Ｂに示す。プールした尿（社内で採取し濾過した）１０μＬを混合物に直接添加することによって、終濃度１０％の尿を得た。次いで、上記のように調製した磁気粒子混合物１０μＬを添加した。この反応混合物１００μＬを１ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）（乾燥－クッションプレート）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
【0440】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0441】
４時間の成長：時間０での細胞の定量化がなされている間に、各生物接種材料１０μＬ、プールした尿１０μＬ、および１Ｘ ＭＨＢＩＩ ７０μＬを抗生物質プレート（既に抗生物質１０μＬを含有する）の適切なウェルに添加した。標準的エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間、試料を成長させた。
【0442】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートのうちの１０μＬ（１０％）をマイクロタイタープレートに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、１００μＬのハイブリダイゼーション緩衝剤、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
【0443】
比較方法：本明細書に記載の新規ＡＳＴ方法を使用する結果を、ＣＬＳＩ Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0444】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度との両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の全ての濃度を含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各試料接種について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
結果。
結果。
【0445】
以下の図は、この方法が、ゴールドスタンダードであるブロス微量希釈方法と一致する一方で、接種レベルの変化に対してどのように頑強であるかを示す。
【0446】
図４１は、新規ＡＳＴ方法により得られた結果を、試験した全ての薬物に対して単一の濃度で実施した標準的ＢＭＤの結果と比較する。３行目は、新規ＡＳＴ方法およびゴールドスタンダードであるＢＭＤによって得られたＭＩＣを比較した。全てのＭＩＣコールは、ＣＬＳＩに対応するＢＭＤの１回の２倍希釈（本質的一致）内にあった。４行目は、ＭＩＣに基づくカテゴリーの抗生物質感受性の結果（Ｓ＝感受性、Ｉ＝中間、Ｒ＝耐性）を比較した（カテゴリー一致）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａのサブセットの濃度は、ブロス微量希釈においてＭＩＣと異なるカテゴリーコールを与えるが、これらの全ては、標準的ＡＳＴ方法論によって軽度のエラーとして分類されるに過ぎなかった。
【0447】
図４２は、標準的ブロス微量希釈方法（２４時間のＢＭＤ、破線）と比較したＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９に対する全ての接種レベルに関して上記した新規４時間の方法により得られたＭＩＣ（塗りつぶしの丸）を示す。この新規方法により決定した全てのＭＩＣは本質的一致内にあった（影付きの領域）。図４３は、図４２に関する生データを示す。
【0448】
結論。本明細書で提示された迅速な４時間のＡＳＴ方法は、広範囲の標的細胞濃度に対して初期細胞濃度に対して頑強である。可変的な接種濃度に対する頑強性は、検体に直接由来する検体を試験する際に、標的細胞の濃度が知られていないため、迅速ＡＳＴ方法にとって重要である。
【0449】
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに特異的プローブが設計され得る他の細菌および非細菌病原体に、ならびに他の抗微生物剤または化学薬剤に対して、明らかに拡張され得る。
【0450】
図４１は、全ての生物、抗生物質および接種レベルに対する全体的な本質的一致およびカテゴリー一致のまとめである。
【0451】
図４２は、従来のＢＭＤ方法と比較した、本明細書に記載の新たな方法を使用して得られた様々な接種レベルに関するＭＩＣの結果を示す。
【0452】
図４３は、得られた様々な接種レベルに関するＭＩＣの結果のまとめである。
【0453】
図４４は、この実施例９において使用したプローブ配列の表である。
【0454】
（実施例１０）
細胞精製を用いない複数の細菌種を含有する尿臨床検体における標的病原体に対する迅速な抗微生物薬感受性試験
細胞精製を用いない複数の細菌種を含有する尿臨床検体における標的病原体に対する迅速な抗微生物薬感受性試験
【0455】
概要。抗微生物薬感受性試験に関する現在の方法には、他の微生物を含まない標的病原体細胞の純粋な集団を確保するために長時間に及ぶ培養ベースのコロニー精製が必要とされる。通常の方法であるコロニー精製は、結果を実現するために２～５日を要する。その間、患者は、感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適でない場合があり、さらに完全に無効である可能性のある強力な広域スペクトルの抗生物質により経験的に処置される。加えて、広域スペクトルの抗生物質による経験的処置によって、抗生物質耐性の広がりがもたらされる。
【0456】
現在の方法は、これらの方法が、濁度の増加などの非特異的検出方法を使用するため、どの抗微生物剤が微生物学的培地中の標的病原体の成長を阻害するかを決定するために、長時間に及ぶ細胞精製プロセスを必要とする。細胞複製物の非特異的測定を使用する場合、仮に標的病原体の細胞のみが含有されるならば、見られる成長は標的病原体によるものであることを知ることができるに過ぎない。ほとんどの医療用検体は滅菌されていないため、現在の抗微生物薬感受性試験方法では細胞の精製が行われなければならない。検体は、一般的に、ヒトの体で生息する良性の通常の細菌集団であるヒトマイクロバイオームを構成する微生物を含有する。
【0457】
対照的に、本発明の方法は、コロニー精製ステップを用いずに、検体から直接的に正確な抗微生物薬感受性試験結果を実現することができる。この方法は、抗微生物剤を含有する微生物学的培地中で標的病原体に特異的な成長を評価するという点で、現在の方法と異なる。
【0458】
この実施例は、迅速な抗微生物薬感受性試験方法によって、１５個の異なる培養陰性尿試料に関する尿マトリックス（１０％）を含む人為的試料中で、Ｅ．ｃｏｌｉ株に関する最少阻止濃度（ＭＩＣ）が正確に決定されることを実証する。ここで、本発明者らは、新たな方法を使用する抗微生物薬感受性試験結果が正確であり、高濃度の他の微生物種を含有する尿試料中のオフターゲット細菌によって有意に影響を受けないことを示す。
実験手順。
実験手順。
【0459】
抗生物質プレートの調製：実験手順を開始する前に、２倍連続希釈系列で５つの濃度を含有するプレートを、所望の濃度よりも１０倍高い濃度の１０μＬを分配することによって調製した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたいだ。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水を含有する４つのウェルが、陽性および陰性の対照を可能とするためにプレート中に含まれた。
【0460】
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、ならびに８つの他のオフターゲット種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ ４３８６４、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １９６０６、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ １２２２８、Ｍ． ｌｕｔｅｕｓ（環境分離株）、Ｃ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｍｕｍ ＡＴＣＣ ２３３４８－ＢＡＡ ９４９、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ００４３、およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ０１４１）のうちの３から５個のコロニーを、５ｍＬのＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）中にそれぞれ別々に接種し、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に希釈した。Ｅ．ｃｏｌｉをおよそ５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（最終アッセイ濃度は５×１０５ＣＦＵ／ｍである）まで希釈し、一方、他のオフターゲット種は様々な接種のために希釈した（１×１０５から５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲に及ぶ）。
【0461】
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
【0462】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前（時間０またはＴ０）のアッセイシグナルをＥ．ｃｏｌｉの各種について決定した。各試料１０μＬをハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、１％のＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３０２３）、１％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号０８００１）、１Ｘ カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）、Ｅ．ｃｏｌｉ－特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブ）８０μＬに添加した。プローブ配列を図５０の表に示す。プールした尿（社内で採取し濾過した）１０μＬを混合物に直接添加することによって、終濃度９．１％の尿を得た。上記のように調製した磁気粒子混合物１０μＬをこの混合物に直接添加した。ここで、ハイブリダイゼーション混合物、尿、および磁気粒子を含有する試料１００μＬを１ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
【0463】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0464】
４時間の成長：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ ２４６９を３つの抗微生物剤：シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、レボフロキサシン（ＬＶＸ）、およびニトロフラントイン（ＮＩＴ）に対するそれらの感受性について試験した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ ２４６９を５つの抗微生物剤：セファゾリン（ＣＦＺ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、レボフロキサシン（ＬＶＸ）、ニトロフラントイン（ＮＩＴ）、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＸＴ）に対して試験した。これらの抗微生物剤を含有する抗生物質プレートを、上記方法に従って調製した。時間０での細胞の定量化がなされている間に、いずれかのＥ．ｃｏｌｉ種（５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬ、オフターゲット種（１×１０５から５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬ、プールした尿１０μＬ、およびＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）６０μＬを、抗生物質１０μＬを既に含有する抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。
【0465】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートのうちの１０μＬ（１０％）を乾燥させた「色素クッション」を含有するマイクロタイタープレートに移し、時間０のアッセイに関して上記したように、ハイブリダイゼーション緩衝剤、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子の混合物１００μＬと合わせた。
【0466】
比較方法：本明細書に記載の新規アッセイ方法に関する結果を、Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0467】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の全ての濃度含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各細菌試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。
結果。
結果。
【0468】
示されたデータは、上記４時間のＡＳＴ方法が滅菌されていない試料に対して頑強である一方、余分な細菌が存在するＣＬＳＩ ＢＭＤ方法が頑強でないことを実証する。
【0469】
図４７は、ニトロフラントインの存在下で、最大１００倍過剰な漸増濃度のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９に関するデータを示す。ＣＬＳＩ様ブロス微量希釈方法におけるＥ．ｃｏｌｉのＭＩＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の添加によって影響を受け（図ではＸとマークした）、ここで、ＭＩＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの非存在下での８から１００倍過剰のＳ．ａｕｒｅｕｓでの３２まで増加する。対照的に、本発明において記載した新規４時間のＡＳＴアッセイ（ＭｕｌｔｉＰａｔｈ、丸）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞の量にかかわらず、同じＭＩＣ（８）（破線）を有した。
【0470】
図４７から図４９は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９のみが存在するＣＬＳＩブロス微量希釈と比較した、この新規方法（ＭｕｌｔｉＰａｔｈ）を使用して決定した生のＭＩＣ値を示す。図４６の表は、漸増するオフターゲット細菌の存在下でのＥ．ｃｏｌｉの全体的な本質的一致を示す。単一の条件 －ニトロフラントインと１ｅ７のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ－ のみが本質的一致の欠如をもたらしたが、これは、全ての抗生物質および全てのオフターゲット細菌にわたって１００％の一致を有したカテゴリー感受性／中間／耐性の決定を変化させなかった。
【0471】
結論。この実施例は、抗微生物薬感受性試験のために本発明を使用すると、他の種の他の微生物をさらに多数含有する試料においてさえも、標的病原体に関する正確な抗微生物薬感受性試験の結果を達成するために細胞精製が必要でないことを実証する。
【0472】
バリエーション：この実施例は、この新規ＦＩＳＨ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、別の代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。
【0473】
図４５は、Ｅ．ｃｏｌｉに関するＭＩＣはＳ．ａｕｒｅｕｓの様々な接種に関して上記方法と一致しているが、一方、ＢＭＤに関するＭＩＣはＳ．ａｕｒｅｕｓの増加と共に増加することを示す。
【0474】
図４６は、標準的ＢＭＤに対するオフターゲット微生物の様々な接種レベルとのＥ．ｃｏｌｉに関する一致のまとめを示す。
【0475】
図４７は、オフターゲット微生物（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の標準的ＢＭＤの様々な接種レベルとのＥ．ｃｏｌｉの一致を示す。
【0476】
図４８は、オフターゲット微生物（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ）の標準的ＢＭＤの様々な接種レベルとのＥ．ｃｏｌｉの一致を示す。
【0477】
図４９は、オフターゲット微生物（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の標準的ＢＭＤの様々な接種レベルとのＥ．ｃｏｌｉの一致を示す。
【0478】
図５０は、この実施例１０において使用したプローブ配列の表である。
【0479】
（実施例１１）
迅速な抗微生物薬感受性試験は、ベータ－ラクタマーゼを発現する細菌の存在下でラクタム抗生物質に対して正確である
迅速な抗微生物薬感受性試験は、ベータ－ラクタマーゼを発現する細菌の存在下でラクタム抗生物質に対して正確である
【0480】
概要。抗微生物薬感受性試験に関する現在の方法には、他の微生物を含まない標的病原体細胞の純粋な集団を確保するために長時間に及ぶ培養ベースのコロニー精製が必要とされる。通常の方法であるコロニー精製は、結果を実現するために２～５日を要する。その間、患者は、感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適でない場合があり、さらに完全に無効である可能性のある強力な広域スペクトルの抗生物質により経験的に処置される。加えて、広域スペクトルの抗生物質による経験的処置によって、抗生物質耐性の広がりがもたらされる。
【0481】
現在の方法が、これらの方法が、濁度の増加などの非特異的検出方法を使用するため、どの抗微生物剤が微生物学的培地中の標的病原体の成長を阻害するかを決定するために、長時間に及ぶ細胞精製プロセスを必要とする理由の１つである。細胞複製物の非特異的測定を使用する場合、仮に標的病原体の細胞のみが含有されるならば、見られる成長は標的病原体によるものであることを知ることができるに過ぎない。
【0482】
対照的に、本発明の方法は、コロニー精製ステップを用いずに、検体から直接的に正確な抗微生物薬感受性試験結果を実現することができる。この方法は、抗微生物剤を含有する微生物学的培地中で標的病原体に特異的な成長を評価するという点で、現在の方法と異なる。本発明者らは、別の実施例において、本発明の方法が、オフターゲット種由来の多数の細胞の存在下で正確であることを実証する。
【0483】
この実施例では、本発明者らは、オフターゲット種の存在下での標的病原体に関する抗微生物薬感受性試験を実施することによって生じ得る別の課題に対処する。ここで、本発明者らは、本発明の方法が、試験される抗微生物剤を分解することが公知の酵素を作製する多数のオフターゲット種を含有する人為的尿検体中の標的病原体に関する正確な抗微生物薬感受性試験の結果を実現することを実証する。理論的には、このことは、抗微生物薬感受性試験の結果を変更するのに十分有意に抗微生物剤の濃度を変化させる可能性がある。
【0484】
この実施例では、本発明者らは、迅速な抗微生物薬感受性試験によって、このタイプの抗微生物剤を分解する酵素を生成する多数のオフターゲット病原体の存在下で、２つのカルバペネム抗生物質（メロペネムおよびイミペネム）に関する正確な抗微生物薬感受性試験の結果が達成されることを実証する。
【0485】
実験手順。抗生物質プレートの調製：抗生物質プレートは、標的ＭＩＣへの滅菌されていない試料の影響の実施例において記載されたように調製した。
【0486】
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、ほとんどの抗生物質に対して感受性である細菌株およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ０１４１（多くの他の耐性遺伝子の中で、ベータ－ラクタマーゼＯＸＡ－１８１を発現する株）のうちの３から５個のコロニーを、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）５ｍＬ中にそれぞれ別々に接種し、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に希釈した。Ｅ．ｃｏｌｉを５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ（ＣＬＳＩの標準的濃度）まで希釈し、一方、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは様々な接種のために希釈した（１×１０６から５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲に及ぶ）。
【0487】
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり３．７５×１０６個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
【0488】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前の時間０（Ｔ０）におけるアッセイシグナルを各臨床尿検体について決定した。それぞれ処理済尿３０μＬを、種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎで標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブを含有する１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）７０μＬに添加した。使用したプローブ配列を表Ａに示す。次いで、混合物１００μＬを、脱水したハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、調製した磁気粒子混合物１０μＬをウェルに添加した。この反応混合物１００μＬを、ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
【0489】
標識化細胞のイメージング ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0490】
４時間の成長：変化するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ－ＯＸＡ接種の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉを２つの抗微生物剤：イミペネムおよびメロペネムに対する感受性について試験した。時間０での細胞の定量化がなされている間に、Ｅ．ｃｏｌｉ種（５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（１×１０６から１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬまたは培地（対照）１０ｕＬ、プールした尿１０μＬ、およびＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）６０μＬを、抗生物質１０μＬを既に含有する抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。
【0491】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
【0492】
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0493】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の６つの濃度全てを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
結果。
結果。
【0494】
図５１は、イミペネム抗生物質を分解するベータ－ラクタマーゼを生成することによってイミペネム抗生物質に耐性であるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅ株の漸増量の存在下での、イミペネムに対して感受性のＥ．ｃｏｌｉ株のＭＩＣを示す。本発明の新規な迅速ＡＳＴ方法をＢＭＤ方法と比較する。新規な４．５時間のＡＳＴ方法は、一貫して１μｇ／ｍＬイミペネム未満のＭＩＣを有するさらに高濃度のベータ－ラクタマーゼを生成するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅの存在によって影響を受けない。対照的に、１６～２４時間の成長後のＢＭＤ方法は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅのレベルの増加に伴う感受性Ｅ．ｃｏｌｉ株に関するＭＩＣの増加を示し、この抗生物質に対して耐性であると誤って決定されることになる。
【0495】
図５２は、ラクタム系抗生物質であるメロペネムに関して同様の結果を示す。
【0496】
結論。本発明の新規の４．５時間のＡＳＴ方法は、抗生物質を分解するカルバペネマーゼ（ｃａｒｂａｐｅｍａｓｅ）酵素を発現する高濃度の耐性細菌の存在下においても、カルバペネム抗微生物剤に対して感受性の細菌の正確なＭＩＣ決定を示す。
【0497】
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度など）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、ラクタム感受性細菌とベータ－ラクタマーゼ発現細菌のさらなるペアリングに拡張され得る。
【0498】
図５１は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅの、耐性、カルバペネム加水分解Ｂ－ラクタマーゼ株の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉに関するイミペネムのＭＩＣを決定するための新規迅速ＡＳＴ方法およびＢＭＤ方法の比較である。
【0499】
図５２は、Ｅ．ｃｏｌｉのＭＩＣが、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅの、耐性、カルバペネム加水分解Ｂ－ラクタマーゼ株の様々な接種に関する上記方法と一致しており、一方、ここでは標準的ＢＭＤは一致していないことを示す。
【0500】
図５３は、この実施例１１において使用したプローブ配列の表である。
【0501】
（実施例１２）
培養ベースの細胞精製を用いない尿中の細菌の正確で迅速な抗微生物薬感受性試験。
培養ベースの細胞精製を用いない尿中の細菌の正確で迅速な抗微生物薬感受性試験。
【0502】
概要：抗微生物薬感受性試験のための現在の方法には、病原体細胞をまさに含まない検体自体の純粋な集団を確保するために長時間に及ぶ培養ベースのコロニー精製が必要とされる。結論として、どの抗生物質が感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適であるかを示す抗微生物薬感受性試験の結果を２～５日間利用できない。その間、患者は、感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適でない場合があり、さらに完全に無効である可能性のある強力な広域スペクトルの抗生物質により経験的に処置される。加えて、広域スペクトルの抗生物質による経験的処置によって、抗生物質耐性の広がりがもたらされる。
【0503】
対照的に、本発明の方法は、長時間に及ぶコロニー精製ステップを用いずに検体から直接的に正確な抗微生物薬感受性試験の結果を実現することができる。ここで、本発明者らは、新たな抗微生物薬感受性試験の結果は、尿試料中の細菌がコロニー精製を用いずに試験される際に有意な影響を受けないことを示す。この実施例は、迅速な抗微生物薬感受性試験方法によって、１５個の異なる培養陰性尿試料に関する尿マトリックス（１０％）を含む人為的試料中で、Ｅ．ｃｏｌｉ株に関する最少阻止濃度（ＭＩＣ）が正確に決定されることを実証する。
【0504】
実験手順。尿検体：１５種の培養陰性臨床尿試料（残遺物）は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。試料は、採取後７日を超えて受領し、使用まで－８０℃で保管した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、試料が培養陰性であったことを決定するために従来の尿培養を尿に関して実施した。簡潔には、較正した１ｕＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上に均一に広げ、３５℃のエアーインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したようにアッセイした。
【0505】
抗生物質プレートの調製：予想された最少阻止濃度（ＭＩＣ）よりも１０倍高い濃度で開始して、２倍連続希釈系列で各抗生物質の６つの濃度を含有するマイクロタイタープレートを調製した。使用した抗生物質は、セファゾリン、シプロフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾールであった。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたいだ。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または希釈液を含有する８つのウェルがプレート中に含まれ、抗生物質なしの陽性成長対照および陰性成長対照を可能とした。
【0506】
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＡＡ－２４６９）の対数培養を、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）５ｍＬ中に接種した３から５個のコロニーを使用して成長させ、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中で、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（それぞれ１００μＬの反応物中で５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの終濃度として）に希釈した。
【0507】
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
【0508】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前（時間０またはＴ０）のアッセイシグナルを各尿試料について決定した。希釈したＥ．ｃｏｌｉ １０μＬをハイブリダイゼーション緩衝剤７０μＬに添加した：終濃度：３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、１％のＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ３０２３）、１％のＮＯＧ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号０８００１）、１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）（２Ｘストックから）（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＭ５８６６）、ならびに非特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブ（プローブレベル、配列、および濃度については表Ａを参照されたい）。１０％の尿の終濃度は、各個体の尿１０μＬを混合物に直接添加することによって得られた。上記のように調製した磁気粒子混合物１０μＬをこの混合物に直接添加した。ここで、ハイブリダイゼーション混合物、尿、および磁気粒子を含有する試料１００μＬを１ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、コンベクションオーブン中で、６０℃で３時間乾燥させた）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
【0509】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0510】
４時間の成長：スパイクされた培養陰性臨床ＵＴＩ尿試料を５つの抗微生物剤に対するそれらの感受性について試験した：セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール。これらの抗微生物剤を含有する抗生物質プレートを、上記方法に従って調製した。時間０での細胞の定量化がなされているのと同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ １０μＬ、尿１０μＬ、および１Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＭ５８６０）７０μＬを、抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。
【0511】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
【0512】
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0513】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の６つの濃度全てを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
【0514】
結果。以下の図は、ＡＳＴの結果にマトリックスの影響はほとんど存在しないことを示す。
【0515】
図５４は、レボフロキサシンに関して尿が存在しないゴールドスタンダードであるＣＬＳＩ ＢＭＤ方法によって決定されたＭＩＣ（破線）と比較した、新規ＡＳＴ方法によって決定されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９のＭＩＣ（黒丸）を示す。影付きの領域は本質的一致の領域であり、これは、一般的に、ＣＬＳＩ対応のＢＭＤプロセスに関する許容される誤差の範囲内であると考えられる。新規ＡＳＴ方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９に関して決定されたレボフロキサシンに関するＭＩＣのほとんどは、ＣＬＳＩ方法と正確に一致し、残りの２つは２倍の本質的一致ゾーンの範囲内にあった。
【0516】
図５５は、５種の抗生物質全てについて得られた結果をまとめる。標準的ＢＭＤに対する１００％の本質的一致と１００％のカテゴリー一致が、新規ＡＳＴ法を使用して、１５種の培養陰性臨床尿試料にわたって観察された。
【0517】
図５６は、試験した５つの抗生物質にわたってＣＬＳＩ対応のＢＭＤプロセスにおいて観察されたＭＩＣと比較した、新規ＡＳＴ方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉによりスパイクされた１５個の培養陰性臨床尿試料に関して決定されたＭＩＣを示す。この図は、標準的ＢＭＤに対する、１５個のスパイクインされた培養陰性臨床ＵＴＩ尿試料のそれぞれとのレボフロキサシンに関する１００％の本質的一致を示す。
【0518】
結論。本発明の方法は、１５個の別個の尿マトリックス全てにおいて試験された５つの抗生物質全てに対してＵＴＩ病原体（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関するＭＩＣ（ゴールドスタンダードであるＢＭＤ方法に対して本質的一致ゾーン内）を正確に決定した。よって、この新規の４時間の抗微生物薬感受性試験は、長時間に及ぶ成長ベースのコロニー精製を必要とすることなく、尿検体から直接的に正確な結果をもたらす能力を有し、実質的な時間を節約する。迅速なＡＳＴの結果によって、正しく、有効な抗生物質処置の素早い開始、および抗生物質耐性の広がりを加えることの回避を可能にすることによって患者のケアを改善することができる。
【0519】
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）および尿の濃度を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の細菌および非細菌病原体ならびに尿以外の最小限に処理された臨床マトリックスに明らかに適応され得る。
【0520】
図５４は、１５個の尿にわたる本質的一致を示す。
【0521】
図５５は、標準的ＢＭＤに対して、１５個のスパイクインされた培養陰性臨床ＵＴＩ尿試料のそれぞれに関する１００％の本質的一致および１００％のカテゴリー一致を示す。
＊セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール。
＊セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール。
【0522】
図５６は、標準的ＢＭＤ方法（「ＣＬＳＩ対応の」）と比較した、新規ＡＳＴ方法によって決定されたＥ．ｃｏｌｉによりスパイクされた１５個の尿試料に関するＭＩＣを示す。濃度（μｇ／ｍＬ）。
【0523】
図５８は、この実施例１２において使用したプローブ配列の表である。
【0524】
（実施例１３）
複数菌における複数の標的に関する迅速かつ正確なＡＳＴ
複数菌における複数の標的に関する迅速かつ正確なＡＳＴ
【0525】
概要。多微生物感染症は、創傷を含む多くのタイプの感染症において一般的である。生命を脅かす可能性のあるこのような感染症では、どの抗微生物剤が各感染病原体に対して有効であり得るかを決定することが重要である。現在の抗微生物薬感受性試験方法は、多微生物感染症における多数の各感染病原体を、それらが分析され得る前に精製するために２～５日を要する。
【0526】
この実施例は、長時間に及ぶコロニー精製を必要とせずに、患者の検体から直接的に、ちょうど４．５時間で迅速なＡＳＴの結果を生じる本発明のシステムおよび方法に関する可能性を実証する。本方法は、ブロス微量希釈の参照基準結果と比較した、人為的な２つの標的複数菌混合物における各標的種に関する正確なＡＳＴの結果（ＭＩＣ値）を達成する。
実験手順。
実験手順。
【0527】
抗生物質プレートの調製：６つのシプロフロキサシン濃度の２倍連続希釈系列を含有するマイクロタイタープレートを調製した。２倍希釈系列を、追加の細胞／尿／培地混合物によって正しい抗生物質範囲が得られるように、最終ブロス微量希釈における所望の濃度よりも１０倍高い濃度で調製した。次いで、各抗生物質の希釈液１０ｕＬを９６ウェルプレートの適切なウェル中にアリコートした。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または他の希釈液を含有する十分なウェルが、抗生物質なしの陽性成長対照のために含まれた。抗生物質プレートを－８０℃で凍結させ、使用前に完全に解凍した。
【0528】
培養物の調製：感受性株と耐性株の両方を４つの異なる生物に対して選択した（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ００７６、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ００４３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＤＣ ０２３３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＤＣ ０２３６、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２、およびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＡＴＣＣ １９４３４）。試験した株および各抗生物質に対するそれらの耐性を表Ａに示す。各株をＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）５ｍＬ中に接種した３から５個のコロニーと一緒に、別々に成長させ、３５℃で１～２時間振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に１×１０７ＣＦＵ／ｍＬまで希釈した。
【0529】
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）の溶液を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０のアッセイと４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を用いて同一の手順を行った。
【0530】
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前（時間０またはＴ０）のアッセイシグナルを各種および株について決定した。標的Ａ５μＬを、生物ごとに５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの終濃度のために、標的Ｂ５μＬまたはＭＨＢ ＩＩ ５μＬのいずれかと合わせ、ハイブリダイゼーション緩衝剤（終濃度：３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム ｐＨ７）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．２５Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号５０３－８４－０）、５％のＰＥＧ ＭＷ ３３５０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ－３６４０）、７．５％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３０２１）、０．２％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）、種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブ（配列および濃度は表Ｂに見られる））８０μＬに添加した。１０％の尿の終濃度は、プールした尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲ１００００７Ｐ－２４２０３）１０μＬを総反応液１００μＬのために混合物に直接添加することによって得られた。上記のように調製したＳｉＭａｇ－Ｑ磁気粒子混合物（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの株が標識されている条件に関する）またはＦｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ磁気粒子混合物（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．が標識された条件に関する）のいずれか１０μＬをこの混合物に直接添加した。ここで、ハイブリダイゼーション混合物、尿、および磁気粒子を含有する試料１００μＬを５０μＬの色素クッション（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、６０℃で乾かした）（乾燥－クッションプレート）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後に、マイクロタイタープレートを強力な永久磁石（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、標識された磁気粒子と相互作用する細菌細胞をイメージング表面の近傍に移動させた。
【0531】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0532】
４時間の成長：２つの種を含有する複数菌試料を１種の抗微生物剤：シプロフロキサシンに対する感受性について試験した。これらの抗微生物剤を含有する抗生物質プレートを、上記方法に従って調製した。時間０での細胞の定量化がなされているのと同時に、標識される種と検出される種のいずれか５μＬおよび複数菌ＵＴＩ感染症において存在し得る（しかし標識しない）細菌種または対照としてのＭＨＢ ＩＩのいずれか５μＬ、プールした尿１０μＬ、およびＭＨＢ ＩＩ ７０μＬを、抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。この実施例における各株は、１回の例では、標識された標的種としての、別の例では、複数菌のペアの未標識メンバーとしての役割を果たす。
【0533】
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートのうちの１０μＬ（１０％）をマイクロタイタープレートに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、１００μＬのハイブリダイゼーション緩衝剤、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
【0534】
比較方法：本明細書に記載の新規ＡＳＴ方法を使用する結果を、ＣＬＳＩ Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。
【0535】
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および全部で６つの濃度のシプロフロキサシンを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各試料接種について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、ＭＩＣの結果を、ＣＬＳＩ Ｍ１００Ｅｄ２８ ２０１８ガイドラインに基づく感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。
結果。
結果。
【0536】
図６０は、第２の感受性または耐性細菌の存在にかかわらず、新規の４．５時間のＡＳＴ法によって標的細菌に関して決定した全てのＭＩＣが、各標的細菌（第２の細菌の非存在下で決定した）に関するゴールドスタンダードであるＢＭＤ方法に対して認められた２倍の忍容性範囲内であった（本質的一致と称される）ことを示す。
【0537】
図６１は、新たなＡＳＴ方法による各標的細菌に関する感受性および耐性のカテゴリーの決定は、これらの対の組合せによっても影響を受けず、ＢＭＤの決定と１００％一致したことを示す。
【0538】
結論。本発明のＡＳＴ方法は、現在の方法で必要とされる時間を消費するコロニー精製を必要とすることなく、４．５時間で複数菌試料における各種に関する抗生物質感受性を正確に決定することができる。この結果は、今日の方法で必要とされる日数よりもむしろ適正な時間で生命を脅かす多微生物感染症を有効に処置することができる抗微生物剤を決定する本発明の可能性を示す。
【0539】
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）ならびに代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体、他の細菌および他の抗生物質に明らかに拡張され得る。
【0540】
図６１は、この実施例において使用したシプロフロキサシンの感受性株と耐性株とを示す。
【0541】
図６２は、この実施例１３において使用したプローブ配列の表の最初の半分である。
【0542】
図６３は、この実施例１３において使用したプローブ配列の表の２番目の半分である。
【0543】
図６４は、２つの標的生物による多微生物感染症に関する本質的一致を示す。以下に見られるように、上記ＡＳＴ方法によって、標準的ＢＭＤに対する１００％の本質的一致が得られる。
【0544】
図６５は、２つの標的生物による多微生物感染症に関するカテゴリー一致を示す。以下に見られるように、上記ＡＳＴ方法によって、標準的ＢＭＤに対する１００％のカテゴリー一致が得られる。
【0545】
（実施例１４）
自動化された機器上のカートリッジ中の単一の検体における複数の標的病原体の迅速かつ正確な検出
自動化された機器上のカートリッジ中の単一の検体における複数の標的病原体の迅速かつ正確な検出
【0546】
概要。２種以上の細菌種によって引き起こされる感染である多微生物感染症は一般的である。病原体を同定するための現在の、培養に基づく方法およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦに基づく方法には、標的種それぞれの多数の細胞を別々に精製するために長時間に及ぶコロニー精製ステップが必要とされる。この実施例は、全てのアッセイ試薬を含有する自動化された分析器の内側の使い捨ての消耗カートリッジにおいて、人為的尿試料中に存在する複数種の標的病原体を３０分間で検出および同定する本発明のＦＩＳＨ方法の使用について実証する。本実施例は、多微生物感染症の複数の標的病原体を迅速かつ特異的に同定する本発明のシステムおよび方法の可能性を示す。
実験手順。
実験手順。
【0547】
尿検体：１０種の培養陰性臨床尿試料（残遺物）は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。試料は、採取後７日を超えて受領し、使用まで－８０℃で保管した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、試料が培養陰性であることを決定するために従来の尿培養を尿に関して実施した。簡潔には、較正した１ｕＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）プレート上に均一に広げ、３５℃のエアーインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したように処理およびアッセイした。
【0548】
尿処理：同定（ＩＤ）を実施する前に、尿防腐剤および他の妨害する可能性のある化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。各臨床的に陰性の尿試料２．５ｍＬを事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム、７Ｋ ＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に適用した。製造業者によって説明された通り、試料を遠心分離によってカラムに通過させた。
【0549】
カートリッジ内での脱水試薬の調製：同定（ＩＤ）を実施する前に、２．２×に濃縮されたハイブリダイゼーション緩衝剤（６．７Ｘ ＳＳＣ（１ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．４％ｗ／ｖのセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、１．７１％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、１．６％ｗ／ｖのＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）、および０．２９Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））４５μＬをカートリッジの試薬ウェルのうちの６つ中に分配した。分析器による処理後に最終１００ｕＬ体積で再水和させると、標準的な１×ハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）、０．１８％のセトリミド、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ、０．７２％のＳＢ３－１２、および０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン）が実現されることになる。それぞれ標的種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブの混合物１．８μＬを試薬ウェルの８つのうちの２つに添加した（１カートリッジ中の各標的ごとにＮ＝２）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＩＳＨオリゴヌクレオチドプローブのセットをカートリッジの場所Ａ１およびＡ２に対応する試薬ウェルに添加し、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプローブセットをカートリッジの場所Ａ３およびＡ４に対応する試薬ウェルに添加し、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａプローブセットをカートリッジの場所Ａ５およびＡ６に対応する試薬ウェルに添加した。次いで、ハイブリダイゼーション緩衝剤および特異的プローブを含有するこれらのカートリッジウェルを５０℃のコンベクションオーブン中で１６～２０時間インキュベートし、材料を脱水した。
【0550】
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、１０％ｗ／ｖのトレハロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４４９）の終濃度で、５０ｍＭのＥｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子の濃度まで１：２０で希釈した。この希釈のために、緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。次いで、混合物を１０μＬ体積のビーズ（反応ごとに２．６４×１０１２個のＰＡＡ粒子）中で凍結乾燥させ、１つのビーズを６つの試薬ウェルのそれぞれの中に入れた。
【0551】
培養物の調製：３つの異なる標的病原体（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３）の対数培養を、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）５ｍＬ中に接種した３から５個のコロニーと共に別々に成長させ、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中で、約５×１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。
【0552】
同定のための細菌細胞の標識化およびイメージング：３０％の処理済尿の終濃度で目的の２種の細菌を含有する人為的複数菌混合物（全部で２種の細菌の組合せを３つ）中の各標的病原体について、アッセイシグナルを決定した。各複数菌の組合せを１０個の固有の異なる培養陰性臨床試料中で試験した（全部で３０個の尿を試験した）。細菌標的Ａ（反応ごとに約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）１０３．５μＬ、細菌標的Ｂ（反応ごとに約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）１０３．５μＬ、尿３６０μＬ、および６３３μＬを合わせて総体積１．２ｍＬとし、この混合物１ｍＬをカートリッジの試料添加ポートに移した。次いで、カートリッジを機器上に置き、その後の動作は全て自動的に実施された。試料は、最初に、真空下で、カートリッジ上部の６つの成長ウェル中に向けられた。次いで、試料を反応ウェルにすぐに移動させ、ハイブリダイゼーション緩衝剤／ＦＩＳＨプローブミックスおよび凍結乾燥させた磁気粒子を再水和させた。次いで、試料は、脱水した「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、コンベクションオーブン中で６０℃で３時間乾燥させた）４５μＬを含有する光学ウインドウに続き、分析器上で３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後に、カートリッジを磁石ステーションに再度位置付け、強力な永久磁石（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）の上に４分間置き、標識した磁気粒子と相互作用する細菌細胞をウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。最後に、カートリッジをイメージングステーションまで動かし、以下に記載した非拡大ＣＣＤイメージャーを使用してイメージングを得た。簡潔には、標識された細菌細胞をイメージングするために、緑色チャネルで蛍光磁気マイクロスフェアの連続イメージ、決定された焦点面、および赤色チャネルで得たその場所の対応するイメージを撮ることによって、個々のウェルそれぞれに焦点が当てられた。
【0553】
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）分析器イメージングシステムは、完全に自動化された試験の一部として、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、カスタム設計された精度の高い３軸位置決めシステムを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この分析器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｅｌｌ全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。
【0554】
データ分析：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数と物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。アッセイシグナルが１３０を超えると、チャネルのシグナルが検出されたと考えられた。
【0555】
結果。データは、存在しない病原体は検出せずに（すなわち、非標的細菌に対するＦＩＳＨプローブの交差反応性なし）単一の試料中の２つの標的病原体の同定に成功することを実証する。
【0556】
図６６は、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ混合試料が試験されるカートリッジを実行することを示す（Ｎ＝１０）。
【0557】
図６６は、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ混合試料が試験されるカートリッジを実行することを示す（Ｎ＝１０）。
【0558】
図６８は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ混合試料が試験されるカートリッジを実行することを示す（Ｎ＝１０）。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのカートリッジ番号６は、そのカートリッジが有効な結果を得ることができなかったため、分析から除去した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのカートリッジ番号９のＡ３では、ウェル中のシグナルが異常に高く表れる原因となるアーチファクトが観察され、そのため、このシグナルの複製は排除された。この除外された点（ウェルＡ４）の複製はこのアーチファクトを有さず、そのため、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは依然として検出されずとしてカテゴライズされた。アッセイシグナルは異なるカートリッジにわたり変化したが、すでに記載されたもの以外の全ての場合に、培養陰性尿に添加された２種の細菌が検出されたが、一方、添加されなかった細菌に関するプローブを含有するウェル中では非常に低いシグナルしか観察されない。
【0559】
結論。この実施例は、消耗カートリッジの内部に安定化試薬を含む自動化された分析器で実施される本発明の恒温ＦＩＳＨ方法によって、人為的尿試料中の複数の標的細菌種が特異的に同定され得ることを実証する。このことは、多微生物感染症における複数の病原体を同定する本方法の可能性を示す。この実施例はまた、異種間の検出が観察されなかったため、本方法の特異性も実証する。
【0560】
バリエーション。この実施例は、カートリッジに関するこの新規ＦＩＳＨ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイの化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順ならびに反応物の安定化に対する変更（構成成分の凍結乾燥）を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。
【0561】
図６６は、標的病原体が、それらの種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブを含有するウェルにおいてのみ検出されることを示す。
【0562】
図６７は、標的病原体が、それらの種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブを含有するウェルにおいてのみ検出されることを示す。
【0563】
図６８は、標的病原体が、それらの種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブを含有するウェルにおいてのみ検出されることを示す。
【0564】
図６９は、表「実施例１４の表Ａ」であり、標的病原体が検出され、一方、他の非標的病原体が検出されなかったことを示す。
【0565】
図７０は、表「実施例１４の表Ｂ」であり、この実施例１４において使用したプローブ配列を示す。
【0566】
（実施例１６）
カルボキシ－フルオレセインジアセテートを使用する生きた細菌の非特異的検出
カルボキシ－フルオレセインジアセテートを使用する生きた細菌の非特異的検出
【0567】
概要。この実施例では、大面積イメージングを使用して、蛍光発生エステラーゼ基質で染色された個々のＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌細胞標的を検出した。この基質は、インタクトな生細胞の細胞膜を通って拡散することができ、これらは両方とも、代謝的に活性な細胞において見られるエステラーゼ酵素によって、作用した際に蛍光かつ荷電した状態になる。これらの荷電した蛍光生成物は、もはや細胞膜を通って受動的に拡散することができず、インタクトな細胞中に捕捉される。よって、この技法は、活性エステラーゼとインタクトな細胞膜とを有する細胞のみが適切に染色されるため、死細胞から生細胞を識別することができる。この実施例では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞は、蛍光発生基質であるカルボキシ－フルオレセインジアセテート（ｃＦＤＡ）により標識され、非拡大デジタルイメージングを使用してイメージングされる。
実験方法。
細菌細胞の調製：
実験方法。
細菌細胞の調製：
【0568】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３をＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、ＢＤ カタログ番号２１１８２２）中で終夜成長させた。終夜培養物１００ｕＬを新鮮なＴＳＢ培地５ｍｌ中に接種することによってＳ．ａｕｒｅｕｓを対数培養させ、３５℃で２．５時間振盪インキュベーター中でさらにインキュベートした。
磁気粒子の調製：
磁気粒子の調製：
【0569】
抗体がコンジュゲートした磁気粒子を、標準的ＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）カップリング化学を使用して、磁気粒子（Ａｄｅｍｔｅｃ、２９２ｎｍ）をニワトリ抗プロテインＡ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にカップリングさせることによって作製した。
細菌細胞の標識化および捕捉：
細菌細胞の標識化および捕捉：
【0570】
このアッセイは９６ウェルのマイクロタイタープレート中で行われ、各ウェルは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＴＳＢ中に１０，０００個の細胞）またはＴＳＢのみ（無細胞対照）４０ｕＬ、１０ｍＭのｃＦＤＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５ｕＬおよび抗体がコンジュゲートした磁気粒子（２ｅ１０／ｍＬ）５ｕＬを含んだ。反応物を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物４０ｕＬを、黒色の透明底半面積マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６７５０９６、ＶＷＲ パーツ番号８２０５０－０５６）中に予めアリコートされた「色素クッション」（５ｍｇ／ｍＬのＣｈｒｏｍｏｔｒｏｐｅ ２Ｒを含む１５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ）７５ｕｌ上に注意深く重ねた。マイクロタイタープレートを磁場上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
細菌細胞のイメージング：
細菌細胞のイメージング：
【0571】
標識化細胞：磁気粒子複合体の磁気捕捉後に、マイクロタイタープレートをＣＣＤデジタルカメラ（ＩＤＳ、モデルＵＩ－２２５０ＳＥ－Ｍ）の上のステージ上に置き、光学フィルターを通してＬＥＤからの光で照らした（４６９ｎｍ、３５ｎｍのＦＷＨＭ）。発光フィルター（５２０～３５ｎｍ）を通過する蛍光シグナルをカメラで検出し、蛍光複合体のイメージを作成した。個々の細胞を列挙するＦＬｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｉｒｓｔ Ｌｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、イメージを分析した。
結果。
結果。
【0572】
図１４６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞（左のパネル）は明るい蛍光スポットとして検出され、一方、細胞を含まない培地（右のパネル）はデブリとしてカテゴライズされる物体のみを含有することを示す。標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞を含む視野のスポットの数は約５０００個であり、予測された入力細菌の数とよく相関する。
【0573】
図５９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細胞（左のパネル）およびＴＳＢ培地のみ（右のパネル）を示す。
【0574】
結論。この実施例は、細菌を非特異的に列挙するための方法を実証する。このアプローチを使用して、検体中の広範囲の細菌種を網羅する混合集団から細胞の総数を計数することができる。詳細には、本実施例は、遍在するエステラーゼ酵素を含有する生存可能な細胞を非特異的に標識する蛍光基質であるカルボキシ－フルオレセインジアセテートで標識された少数の細菌細胞を列挙するための本発明の非拡大イメージング方法の可能性を実証した。
【0575】
バリエーション。ＳＴＹＯおよびＳＹＢＲファミリーの染料、ヨウ化プロピジウム、ならびにＤＡＰＩなどの核酸染料を含む非特異的な細胞の標識化のための他の染料が存在する。他の染料は、使用することができる生細胞または死細胞を識別する。例えば、他の蛍光発生基質、またはインタクトな細胞膜を通過することができるかもしくは通過することができないＤＮＡ染料を、ｃＦＤＡまたはＦＤＡの代わりにまたはそれと併せて使用することができる。蛍光検出のための複数の励起波長および吸収波長を使用することによって、複数の染料および色素が識別され得る。物体に関連する蛍光スペクトルを使用して、細胞が生細胞として計数されるか死細胞として計数されるかを決定することができる。さらに、特定の種類の細菌の生化学的活性に対して特異的である蛍光発生基質を使用して、その存在を決定することができる。例えば、蛍光発生□－ガラクトシダーゼ基質は、大腸菌群に特異的である□－ガラクトシダーゼによって、その蛍光産物に切断され得る。この方法論は、ほとんどの細菌および複数の細菌種を含有する検体にも適用可能である。本方法は、最小限の処理により多くの異なる臨床検体の種類（例えば、尿、痰、スワブ、髄液など）において細菌を検出するのに好適である。
【0576】
（実施例１５）
ＤＮＡ染色色素を使用する細菌の非特異的検出
ＤＮＡ染色色素を使用する細菌の非特異的検出
【0577】
概要。この実施例では、大面積イメージングを使用して、ＤＮＡ結合染料で染色された個々の生きたＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌細胞標的を検出した。このＤＮＡ結合色素は、インタクトな生細胞の細胞膜を通って拡散することができ、これらは、細菌のＤＮＡに結合した後に高度に蛍光性になる。一旦ＤＮＡに結合すると、これらの色素は、もはやインタクトな細胞膜を通って容易かつ受動的に拡散することができず、インタクトな細胞中に捕捉される。この技法は、インタクトな細胞膜を有する生細胞が、死細胞または易感染性膜を有する細胞と比較して、異なる色素で異なって染色されるため、生細胞を死細胞から識別することが重要である場合に有用であり得る。この実施例では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ＤＮＡ結合蛍光色素であるＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎにより標識され、非拡大大面積ＣＣＤイメージングを使用してイメージングされる。
実験方法。
細菌細胞の調製：
実験方法。
細菌細胞の調製：
【0578】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３をＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、ＢＤカタログ番号２１１８２２）中で終夜成長させた。終夜培養物１００ｕＬを新鮮なＴＳＢ培地５ｍｌ中に接種し、３５℃で２．５時間、振盪インキュベーター中でさらにインキュベートすることによってＳ．ａｕｒｅｕｓを対数培養させた。
磁気粒子の調製：
磁気粒子の調製：
【0579】
抗体がコンジュゲートした磁気粒子を、標準的ＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）カップリング化学を使用して、磁気粒子（Ａｄｅｍｔｅｃ、２９２ｎｍ）をニワトリ抗プロテインＡ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にカップリングさせることによって作製した。
細菌細胞の標識化および捕捉：
細菌細胞の標識化および捕捉：
【0580】
このアッセイは９６ウェルのマイクロタイタープレート中で行われ、各ウェルは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＴＳＢ中に１０，０００個の細胞）またはＴＳＢのみ（無細胞対照）４０ｕＬ、５００倍希釈したＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素（カタログ番号Ｓ７５６３、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５ｕＬおよび抗体がコンジュゲートした磁気粒子（２ｅ１０／ｍＬ）５ｕｌを含んだ。反応物を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物４０ｕＬを、黒色の透明底半面積マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６７５０９６、ＶＷＲ パーツ番号８２０５０－０５６）中に予めアリコートされた「色素クッション」（５ｍｇ／ｍＬのＣｈｒｏｍｏｔｒｏｐｅ ２Ｒを含む１５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ）７５ｕｌ上に注意深く重ねた。マイクロタイタープレートを磁場上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
細菌細胞のイメージング：
細菌細胞のイメージング：
【0581】
標識化細胞：磁気粒子複合体の磁気捕捉後に、マイクロタイタープレートをＣＣＤデジタルカメラ（ＩＤＳ、モデルＵＩ－２２５０ＳＥ－Ｍ）の上のステージ上に置き、光学フィルターを通してＬＥＤからの光で照らした（４６９ｎｍ、３５ｎｍのＦＷＨＭ）。発光フィルター（５２０～３５ｎｍ）を通過する蛍光シグナルをカメラで検出し、蛍光複合体のイメージを作成した。個々の細胞を列挙するＦＬｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｉｒｓｔ Ｌｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、イメージを分析した。
結果。
結果。
【0582】
図１４６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞（左のパネル）が明るい蛍光スポットとして検出され、一方、細胞を含まない培地（右のパネル）がデブリとしてカテゴライズされる物体のみを含有することを示す。標識されたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞を含む視野のスポット数は約５０００個であり、予測された入力細菌の数とよく相関する。
【0583】
図５９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞（左のパネル）およびＴＳＢ培地のみ（右のパネル）を示す。
【0584】
結論。この大面積の、非拡大イメージングシステムは、生細胞を非特異的に標識するＤＮＡ結合色素である、ＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎで標識される細菌細胞を検出および列挙することが可能である。
【0585】
バリエーション。生細胞または死細胞を識別する他の色素を使用してもよい。例えば、インタクトな細胞膜を通過することができるかまたは通過することができない他の蛍光ＤＮＡ染料を、ＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎの代わりにまたはそれと併せて使用することができる。蛍光検出のための複数の励起波長および吸収波長を使用することによって、複数の染料および色素が識別され得る。物体に関連する蛍光スペクトルを使用して、細胞が生細胞として計数されるか死細胞として計数されるかを決定することができる。さらに、特定の種類の細菌の生化学的活性に対して特異的である蛍光発生基質を使用して、その存在を決定することができる。例えば、蛍光発生□－ガラクトシダーゼ基質は、大腸菌群に特異的である□－ガラクトシダーゼによって、その蛍光産物に切断され得る。この方法論は、ほとんどの細菌および複数の細菌種を含有する検体にも適用可能である。本方法は、最小限の処理により多くの異なる臨床検体の種類（例えば、尿、痰、スワブ、髄液など）において細菌を検出するのに好適である。ＳＹＴＯ／ＳＹＢＲファミリーの染料、ヨウ化プロピジウム、およびＤＡＰＩの他のメンバーを含む、他の核酸染料は、細菌細胞を非特異的に標識することができる。
【0586】
（実施例５）
抗体をコーティングした磁気粒子および蛍光標識された抗体を使用する多形核好中球（ＰＭＮ）の特異的検出
抗体をコーティングした磁気粒子および蛍光標識された抗体を使用する多形核好中球（ＰＭＮ）の特異的検出
【0587】
概要。多形核好中球（ＰＭＮ）の存在および数は、感染症を検出するのに診断上有益であり得る。例えば、尿試料中の好中球の数が少ないことは、尿路感染症を除外することの助けとなる。この実施例では、非拡大デジタルイメージングを使用して、蛍光標識された抗体で染色された多形核好中球（ＰＭＮ）標的を列挙した。この実施例では、本発明者らは、多形核好中球（ＰＭＮ）の表面に存在する捕捉および検出に特異的な分子である抗ＣＤ１５および抗ＣＤ１６抗体を使用した。一実施形態では、抗ＣＤ１５抗体は、ＰＭＮ捕捉のために使用される磁気粒子および非拡大デジタルイメージングを使用する検出のための蛍光標識された抗ＣＤ１６抗体にコンジュゲートされた。
実験方法。
血液試料
実験方法。
血液試料
【0588】
健康なドナーに由来する新鮮な血液試料をＲｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手し、ＰＭＮの供給源として使用した。
磁気粒子の調製：
磁気粒子の調製：
【0589】
抗体がコンジュゲートした磁気粒子を、標準的ＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）カップリング化学を使用して、磁気粒子（Ａｄｅｍｔｅｃ、２９２ｎｍ）をマウス抗ＣＤ１５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にカップリングさせることによって作製した。
検出抗体
検出抗体
【0590】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗ヒトＣＤ１６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を検出抗体として使用した。
ＰＭＮの標識化および捕捉
ＰＭＮの標識化および捕捉
【0591】
９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいてアッセイを行った。各ウェルは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３８ｕｌ、新鮮な血液試料２ｕＬ、またはＰＢＳ（ＰＭＮなしの対照）２ｕＬ、Ａｌｅｘａ－４８８により標識された抗ＣＤ－１６抗体（１ｕｇ）５ｕＬおよび抗体がコンジュゲートした磁気粒子（２ｅ１０／ｍＬ）５ｕｌを含んだ。反応物を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物４０ｕＬを、黒色の透明底半面積マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６７５０９６、ＶＷＲ パーツ番号８２０５０－０５６）中に予めアリコートされた「色素クッション」（５ｍｇ／ｍＬのＣｈｒｏｍｏｔｒｏｐｅ ２Ｒを含む１５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ）７５ｕｌ上に注意深く重ねた。マイクロタイタープレートを磁場上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
ＰＭＮのイメージング：
ＰＭＮのイメージング：
【0592】
標識されたＰＭＮ：磁気粒子複合体の磁気捕捉後に、マイクロタイタープレートをＣＣＤデジタルカメラ（ＩＤＳ、モデルＵＩ－２２５０ＳＥ－Ｍ）の上のステージ上に置き、光学フィルターを通してＬＥＤからの光で照らした（４６９ｎｍ、３５ｎｍのＦＷＨＭ）。発光フィルターを通過する蛍光シグナル（５２０～３５ｎｍ）をカメラで検出し、蛍光複合体のイメージを作成した。個々の細胞を列挙するＦＬｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｉｒｓｔ Ｌｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、イメージを分析した。
結果。
結果。
【0593】
図６０は、ＭｕｌｔｉＰａｔｈアッセイによって血液試料中に存在するＰＭＮが特異的に検出され、一方、血液試料を含まない緩衝剤は非常に低い検出可能な蛍光シグナルしか有さないことを示すＭｕｌｔｉＰａｔｈアッセイの結果を示す。
【0594】
結論。この大面積の、非拡大イメージングシステムは、細胞表面マーカーに対して蛍光標識された抗体で標識される血液試料由来のＰＭＮを検出および列挙することが可能である。この結果は、診断上有益なヒトまたは宿主の細胞を列挙するための本発明のシステムおよび方法の可能性を示す。
【0595】
バリエーション。他の細胞特異的抗体を使用して、様々な生体試料中で異なる細胞を検出することができる。例えば、他の細胞表面マーカーの抗体は、異なる診断上有益な細胞を認識することができる。例えば、扁平上皮細胞を定量することは、肺炎の診断において呼吸試料の質を評価するために重要である。複数の抗体／細胞表面マーカーを使用することができ、標識された細胞は、蛍光検出のために複数の励起波長および吸収波長を使用することによって識別され得る。物体に関連する蛍光スペクトルを使用して、特定の種類の細胞のシグナルであるか否かを決定することができる。
参照による組込み
参照による組込み
【0596】
特許、特許出願、特許公報、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書に対する参照および引用は、本開示全体を通してなされる。全てのこのような文書は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
均等物
均等物
【0597】
本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の様々な修正およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書において引用された科学文献および特許文献への参照を含む、この文書の全内容から当業者に対して明らかとなるであろう。本明細書における主題は、本発明の様々な実施形態およびその均等物において、本発明の実践のために採用され得る重要な情報、例証およびガイダンスを含有する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のためのカートリッジであって、
検体チャンバー；
前記検体チャンバーと選択可能に流体連通し、１つまたは複数の抗微生物剤を含む、複数の分割ウェル；および
前記分割ウェルと選択可能に流体連通した複数の試薬ウェルであって、各試薬ウェルが、微生物結合性磁気粒子および種特異的微生物プローブを含む、複数の試薬ウェル
を含む、カートリッジ。
（項目２）
前記検体チャンバーと前記複数の分割ウェルと前記複数の試薬ウェルとの間の流体連通のチャネルを開放および閉鎖するために前記カートリッジの外側から操作可能なスライド可能バルブをさらに含む、項目１に記載のカートリッジ。
（項目３）
前記スライド可能バルブが、前記スライド可能バルブが第１の位置にある場合には、前記検体チャンバーと前記分割ウェルとの間の直接的流体連通を提供し、第２の位置にある場合には、前記分割ウェルの各々から、前記試薬ウェルの対応するウェルへの接続を提供するチャネルを含む、項目２に記載のカートリッジ。
（項目４）
各種特異的微生物プローブが、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含む、項目１に記載のカートリッジ。
（項目５）
前記微生物結合性磁気粒子が、種特異的でない、項目４に記載のカートリッジ。
（項目６）
前記磁気粒子が、細菌細胞表面に結合する、項目５に記載のカートリッジ。
（項目７）
前記試薬ウェルの対応するウェルと各々が選択可能に流体連通した１つまたは複数のイメージングウェルをさらに含む、項目１に記載のカートリッジ。
（項目８）
各イメージングウェルが、検出表面および色素クッションを含む、項目７に記載のカートリッジ。
（項目９）
前記色素クッションが、前記検出表面に隣接した密度勾配媒体および色素を含み、前記色素クッションにわたって磁場を印加する際に、前記磁気粒子および結合した細菌が、前記色素クッションを介して前記検出表面に引き寄せられる、項目８に記載のカートリッジ。
（項目１０）
前記微生物結合性磁気粒子および前記種特異的微生物プローブが、前記カートリッジ中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズとして提供される、項目１に記載のカートリッジ。
（項目１１）
インキュベーションウェル；
種特異的微生物プローブ；および
透過処理剤
を含み、微生物を含む検体が混合ウェル中に送達される場合に、前記透過処理剤が、前記検体を約４０℃を下回る温度に維持しながら、微生物中への前記プローブの進入を促進する、カートリッジ。
（項目１２）
前記プローブが、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含む、項目１１に記載のカートリッジ。
（項目１３）
前記透過処理剤が、１つまたは複数の界面活性剤を含む、項目１１に記載のカートリッジ。
（項目１４）
前記透過処理剤および前記プローブが、前記インキュベーションウェル中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズで提供される、項目１３に記載のカートリッジ。
（項目１５）
細菌細胞表面に結合する磁気粒子；および
透明壁に隣接する色素クッション
をさらに含み、磁場が前記色素クッションにわたって印加される場合に、前記磁場が、前記色素クッションを介して前記磁気粒子を前記透明壁に引き寄せる、項目１１に記載のカートリッジ。
（項目１６）
前記色素クッションが、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体の溶液を含む、項目１５に記載のカートリッジ。
（項目１７）
前記色素クッションおよび前記透明壁が、前記インキュベーションウェルと流体連通したイメージングウェル中に提供される、項目１５に記載のカートリッジ。
（項目１８）
前記色素クッションが、検体によって湿らされるまで、前記カートリッジ内の前記イメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供される、項目１７に記載のカートリッジ。
（項目１９）
互いに平行な複数の対になったイメージングウェル／インキュベーションウェルセットをさらに含む、項目１７に記載のカートリッジ。
（項目２０）
ユーザーが前記カートリッジ中に前記検体をピペッティングすることができる受け入れリザーバーをさらに含む、項目１９に記載のカートリッジ。
（項目２１）
それを通るチャネルを有するガスケットを含むスライド可能ゲートをさらに含み、前記ゲートが第１の位置に位置決めされる場合には、前記受け入れリザーバーが、少なくとも第１のインキュベーションウェルと流体連通し；前記ゲートが第２の位置にある場合には、前記受け入れリザーバー、前記第１のインキュベーションウェルおよび第１のイメージングウェルが全て、互いから密封され、前記ゲートが第３の位置にある場合には、前記第１のインキュベーションウェルおよび前記第１のイメージングウェルが互いに流体連通する、項目２０に記載のカートリッジ。
（項目２２）
前記受け入れリザーバーからの前記検体を前記インキュベーションウェル中に分割し、前記インキュベーションウェルからの液体を対応するイメージングウェル中に引き続いて渡すために、そこからの空気圧を受け入れるように外部機器に連結するためのフィッティングをさらに含む、項目２１に記載のカートリッジ。
（項目２３）
前記磁気粒子が、前記細菌細胞表面に結合する化学基を含み、前記カートリッジが、前記細菌細胞表面への前記化学基の結合を促進する化合物をさらに含む、項目１５に記載のカートリッジ。
（項目２４）
前記細胞表面への前記化学基の結合を促進する前記化合物が、セトリミドを含み、
前記化学基が、ジエチルアミンエチルデンプン；デキストラン硫酸；ポリアスパラギン酸；ポリアクリル酸；ポリグルタミン酸；ポリスチレンスルホネート；およびポリジアリル
ジメチルアミンからなる群から選択される化学基を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記プローブが、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含み、前記カートリッジが、前記セグメントから１～３０塩基以内の場所で前記リボソームＲＮＡに結合する少なくとも１つのヘルパープローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目２５に記載のカートリッジ。
（項目２６）
前記蛍光標識されたオリゴヌクレオチドが、１０塩基長と１８塩基長との間であり、少なくとも１つのコンフォメーション拘束された核酸を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
試薬組成物、前記プローブ、前記ヘルパープローブおよび前記化合物が、前記カートリッジ中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズとして提供され、
前記色素クッションが、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体の溶液を含み、
前記クッションが、検体によって湿らされるまで、前記カートリッジ内の前記イメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供される、項目２６に記載のカートリッジ。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のためのカートリッジであって、
検体チャンバー；
前記検体チャンバーと選択可能に流体連通し、１つまたは複数の抗微生物剤を含む、複数の分割ウェル；および
前記分割ウェルと選択可能に流体連通した複数の試薬ウェルであって、各試薬ウェルが、微生物結合性磁気粒子および種特異的微生物プローブを含む、複数の試薬ウェル
を含む、カートリッジ。
（項目２）
前記検体チャンバーと前記複数の分割ウェルと前記複数の試薬ウェルとの間の流体連通のチャネルを開放および閉鎖するために前記カートリッジの外側から操作可能なスライド可能バルブをさらに含む、項目１に記載のカートリッジ。
（項目３）
前記スライド可能バルブが、前記スライド可能バルブが第１の位置にある場合には、前記検体チャンバーと前記分割ウェルとの間の直接的流体連通を提供し、第２の位置にある場合には、前記分割ウェルの各々から、前記試薬ウェルの対応するウェルへの接続を提供するチャネルを含む、項目２に記載のカートリッジ。
（項目４）
各種特異的微生物プローブが、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含む、項目１に記載のカートリッジ。
（項目５）
前記微生物結合性磁気粒子が、種特異的でない、項目４に記載のカートリッジ。
（項目６）
前記磁気粒子が、細菌細胞表面に結合する、項目５に記載のカートリッジ。
（項目７）
前記試薬ウェルの対応するウェルと各々が選択可能に流体連通した１つまたは複数のイメージングウェルをさらに含む、項目１に記載のカートリッジ。
（項目８）
各イメージングウェルが、検出表面および色素クッションを含む、項目７に記載のカートリッジ。
（項目９）
前記色素クッションが、前記検出表面に隣接した密度勾配媒体および色素を含み、前記色素クッションにわたって磁場を印加する際に、前記磁気粒子および結合した細菌が、前記色素クッションを介して前記検出表面に引き寄せられる、項目８に記載のカートリッジ。
（項目１０）
前記微生物結合性磁気粒子および前記種特異的微生物プローブが、前記カートリッジ中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズとして提供される、項目１に記載のカートリッジ。
（項目１１）
インキュベーションウェル；
種特異的微生物プローブ；および
透過処理剤
を含み、微生物を含む検体が混合ウェル中に送達される場合に、前記透過処理剤が、前記検体を約４０℃を下回る温度に維持しながら、微生物中への前記プローブの進入を促進する、カートリッジ。
（項目１２）
前記プローブが、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含む、項目１１に記載のカートリッジ。
（項目１３）
前記透過処理剤が、１つまたは複数の界面活性剤を含む、項目１１に記載のカートリッジ。
（項目１４）
前記透過処理剤および前記プローブが、前記インキュベーションウェル中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズで提供される、項目１３に記載のカートリッジ。
（項目１５）
細菌細胞表面に結合する磁気粒子；および
透明壁に隣接する色素クッション
をさらに含み、磁場が前記色素クッションにわたって印加される場合に、前記磁場が、前記色素クッションを介して前記磁気粒子を前記透明壁に引き寄せる、項目１１に記載のカートリッジ。
（項目１６）
前記色素クッションが、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体の溶液を含む、項目１５に記載のカートリッジ。
（項目１７）
前記色素クッションおよび前記透明壁が、前記インキュベーションウェルと流体連通したイメージングウェル中に提供される、項目１５に記載のカートリッジ。
（項目１８）
前記色素クッションが、検体によって湿らされるまで、前記カートリッジ内の前記イメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供される、項目１７に記載のカートリッジ。
（項目１９）
互いに平行な複数の対になったイメージングウェル／インキュベーションウェルセットをさらに含む、項目１７に記載のカートリッジ。
（項目２０）
ユーザーが前記カートリッジ中に前記検体をピペッティングすることができる受け入れリザーバーをさらに含む、項目１９に記載のカートリッジ。
（項目２１）
それを通るチャネルを有するガスケットを含むスライド可能ゲートをさらに含み、前記ゲートが第１の位置に位置決めされる場合には、前記受け入れリザーバーが、少なくとも第１のインキュベーションウェルと流体連通し；前記ゲートが第２の位置にある場合には、前記受け入れリザーバー、前記第１のインキュベーションウェルおよび第１のイメージングウェルが全て、互いから密封され、前記ゲートが第３の位置にある場合には、前記第１のインキュベーションウェルおよび前記第１のイメージングウェルが互いに流体連通する、項目２０に記載のカートリッジ。
（項目２２）
前記受け入れリザーバーからの前記検体を前記インキュベーションウェル中に分割し、前記インキュベーションウェルからの液体を対応するイメージングウェル中に引き続いて渡すために、そこからの空気圧を受け入れるように外部機器に連結するためのフィッティングをさらに含む、項目２１に記載のカートリッジ。
（項目２３）
前記磁気粒子が、前記細菌細胞表面に結合する化学基を含み、前記カートリッジが、前記細菌細胞表面への前記化学基の結合を促進する化合物をさらに含む、項目１５に記載のカートリッジ。
（項目２４）
前記細胞表面への前記化学基の結合を促進する前記化合物が、セトリミドを含み、
前記化学基が、ジエチルアミンエチルデンプン；デキストラン硫酸；ポリアスパラギン酸；ポリアクリル酸；ポリグルタミン酸；ポリスチレンスルホネート；およびポリジアリル
ジメチルアミンからなる群から選択される化学基を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記プローブが、特定の細菌種のリボソームＲＮＡのセグメントに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含み、前記カートリッジが、前記セグメントから１～３０塩基以内の場所で前記リボソームＲＮＡに結合する少なくとも１つのヘルパープローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目２５に記載のカートリッジ。
（項目２６）
前記蛍光標識されたオリゴヌクレオチドが、１０塩基長と１８塩基長との間であり、少なくとも１つのコンフォメーション拘束された核酸を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
試薬組成物、前記プローブ、前記ヘルパープローブおよび前記化合物が、前記カートリッジ中への前記検体の送達によって再水和および溶解される凍結乾燥されたビーズとして提供され、
前記色素クッションが、未結合のプローブからの光を吸収する色素をさらに含む密度勾配媒体の溶液を含み、
前記クッションが、検体によって湿らされるまで、前記カートリッジ内の前記イメージングウェル中に乾燥されたまたは凍結乾燥された状態で提供される、項目２６に記載のカートリッジ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
