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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-18
(45)【発行日】2025-03-27
(54)【発明の名称】樹状細胞の培養方法
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20250319BHJP
C07K 5/083 20060101ALI20250319BHJP
C07K 5/09 20060101ALI20250319BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20250319BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20250319BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20250319BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250319BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20250319BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20250319BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20250319BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20250319BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20250319BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250319BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
C07K5/083
C07K5/09
C07K7/08
C07K14/00
C12N5/0784 ZNA
A61P35/00
A61P31/00
A61P29/00
A61P37/02
A61K38/06
A61K38/07
A61K38/08
A61K38/10
A61K38/16
C12N15/62 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2023566847
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-09
(86)【国際出願番号】 KR2022006397
(87)【国際公開番号】W WO2022235072
(87)【国際公開日】2022-11-10
【審査請求日】2023-10-27
(31)【優先権主張番号】10-2021-0059019
(32)【優先日】2021-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0052836
(32)【優先日】2022-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】523408215
【氏名又は名称】ナノファエンテック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＦＡＥＮＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ） ６０４Ｈｏ， ６ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， ８８， Ｓｏｍａｎｇ－ｇｉｌ， Ｊｕｃｈｏｎ－ｍｙｅｏｎ， Ｇｉｍｈａｅ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｎａｍ－ｄｏ ５０９６９， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】クァク， ジョング ユング
(72)【発明者】
【氏名】マザ， ペリー エーン メイソン
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】Innate Immunity，2011年，Vol.17, No.3，pp.338-352，10.1177/1753425910371396
【文献】Biomaterials，2010年，pp.1-11，doi:10.1016/j.biomaterials.2010.06.025
【文献】BLOOD，2002年，Vol.99,No.9，pp.3263-3271
【文献】Front. Immunol.，2017年，Vol.8，1866 (pp.1-11)，doi: 10.3389/fimmu.2017.01866
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ ５／０７８４
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３１／００
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３７／０２
Ａ６１Ｋ ３８／０６
Ａ６１Ｋ ３８／０７
Ａ６１Ｋ ３８／０８
Ａ６１Ｋ ３８／１０
Ａ６１Ｋ ３８／１６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
樹状細胞間のインテグリン結合部位に結合するフィブロネクチン由来のペプチドを含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物であって、
前記ペプチドは、配列番号１を含むアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２を含むアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号３を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項2】
前記配列番号１を含むアミノ酸配列からなるペプチド、前記配列番号２を含むアミノ酸配列からなるペプチド、および前記配列番号３を含むアミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ長さが３～１１ａａである、請求項１に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項3】
前記配列番号１を含むアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１、４または５のアミノ酸配列からなるペプチドであり、前記配列番号２を含むアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号２、６または７のアミノ酸配列からなるペプチドであり、前記配列番号３を含むアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項4】
前記ペプチドは、前記配列番号１を含むアミノ酸配列からなるペプチド、前記配列番号２を含むアミノ酸配列からなるペプチド、および前記配列番号３を含むアミノ酸配列からなるペプチドがリンカーで連結されている、請求項１に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項5】
前記リンカーは、アミノ酸ＧおよびＳからなり、長さが２～８ａａである、請求項４に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項6】
前記リンカーは、配列番号８～１１のいずれか一つを含むアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項7】
前記ペプチドは、配列番号１２～１４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項8】
前記ペプチドは、処理対象である樹状細胞２×１０５／ｍＬに対して２００μｇ／ｍＬ以上の濃度で含まれる、請求項１に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項9】
前記樹状細胞は、単核球、脾臓またはリンパ節由来のものである、請求項１に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項10】
試験管内（in vitro）で使用するためのものである、請求項１に記載の樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【請求項11】
分離された樹状細胞に請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物を処理するステップを含む、樹状細胞の培養方法。
【請求項12】
前記組成物が処理された樹状細胞に免疫刺激剤を処理して樹状細胞の活性化を誘導するステップをさらに含む、請求項１１に記載の樹状細胞の培養方法。
【請求項13】
前記免疫刺激剤は、バクテリア製剤、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＬＰＳおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の樹状細胞の培養方法。
【請求項14】
分離された樹状細胞に請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物を処理して非活性化状態で前記樹状細胞を培養するステップと、前記樹状細胞を活性化するステップと、
前記活性化された樹状細胞と免疫細胞を共培養するステップとを含む、免疫細胞の活性化方法。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の樹状細胞間のインテグリン結合部位に結合するフィブロネクチン由来のペプチドと、それと混合された樹状細胞とを含む、樹状細胞組成物。
【請求項16】
請求項１５に記載の細胞組成物を有効成分として含む、癌、感染性疾患、慢性炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療または予防用薬学組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リンパ組織から分離された未成熟初代樹状細胞の培養方法に関し、具体的には、フィブロネクチン（fibronectin）由来ペプチドの組み合わせ、これらのペプチドで構成されるリンカーペプチドにより活性化を起こさない状態を維持しながら培養できる培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
樹状細胞（Dendritic cells、DCs）は、自然免疫応答と獲得免疫応答との間の関連性を提供する抗原提示細胞である。樹状細胞は全身に広く分布しており、脾臓、リンパ節、粘膜、腸、表皮組織でいくつかのサブタイプに分けられる。脾臓において、樹状細胞のサブタイプはマクロファージや単核球のタイプとはよく区別され、特徴付けられている。
【0003】
非活性樹状細胞は、低レベルで主要組織適合性複合体クラスＩＩ（major histocompatibility class－II、MHC－II）の表面分子と共刺激分子を発現し、炎症誘発性サイトカインをほとんど産生しない。樹状細胞は、スカベンジャー受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、マンノース受容体などのパターン認識受容体によって病原体を直接検出することができ、貪食作用により、病原菌や損傷細胞から派生した有害シグナルおよびその周辺での抗原を貪食する。これらの受容体によって活性化された樹状細胞は、抗原取り込み能の減少、ＭＨＣ－ＩＩの発現増加、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０のような共刺激分子および化学受容体であるＣＣＲ７の発現が増加した細胞型に転換され、様々な種類のサイトカインを分泌し、リンパ節への移動が増加することが特徴である。この活性化された樹状細胞は、特定の抗原に対するＴ細胞応答を強力に誘導する。
【0004】
抗原を貪食して処理するプロセスは、非活性樹状細胞によって行われる。この安定した樹状細胞の免疫学的機能を測定し、細胞治療剤として利用する場合の最大の問題は、組織由来の初代樹状細胞（primary DC）の分離と培養にある。細胞培養のために分離された初代樹状細胞は、培養状態で１２時間以内に非活性型から活性型へ自然活性化（spontaneous activation）される。自然活性化された樹状細胞は生存期間が非常に短いため、長期培養ができない。培養条件下で樹状細胞の数を減らしたり、半固体ゲルなどで培養したりすると、自然活性化が多少減少することが観察されたため、樹状細胞間の結合や接触によって発生することが報告されているが、樹状細胞の活性化に関与する具体的な因子や、非活性型を維持して培養できる技術については未だ報告されていない。
【0005】
脾臓およびリンパ節の三次元構造と細胞外基質は、細胞の相互作用を調節し、組織内の細胞間の凝集にも重要な役割を果たす。極少量のコラーゲンのみがリンパ節の近位部（paracortical region）に存在し、脾臓のようなリンパ組織には主な細胞外基質としてフィブロネクチンが発現しており、ラミニン（laminin）の発現は極めて少ない。サイトカインを用いて単核球から分化させた樹状細胞は、フィブロネクチンやラミニンでコーティングしたプレートで培養した場合、樹状細胞の形態が変化して非活性型に維持されることが報告されている。
【0006】
前述のような様々な技術的限界のため、リンパ組織から分離した初代樹状細胞を培養するよりは、遺伝体の転換により形質転換された樹状細胞株や、前駆細胞から分化した樹状細胞を用いる技術などが適用されている。現在、最も一般的に培養用に用いている樹状細胞は、骨髄細胞または単核球から分化させた樹状細胞で、ＧＭ－ＣＳＦ（granulocyte macrophage－colony stimulating factor）および腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor、TNF－α）のような炎症因子が存在する状態でこれらの前駆細胞から分化した細胞である。したがって、これらの前駆細胞から分化した樹状細胞は、骨髄細胞または単核球の細胞培養によって誘導され得るが、体内では炎症状態で血液から単細胞が組織に出て生体内で現れる炎症性樹状細胞に属する。しかし、この場合、リンパ節に存在する初代樹状細胞ではなく単核球から分化する過程で活性化された樹状細胞は、培養状態では刺激されていない樹状細胞とは異なり比較的安定した機能を維持することができる。また、ナノマイクロハイブリッド繊維をベースとした細胞培養用構造物を用いて、脾臓から分離した樹状細胞を非活性状態に維持しながら安定的に培養できる培養方法、および非活性樹状細胞の分析方法が報告されている。
【0007】
本発明では、免疫組織から分離した初代樹状細胞の生存を維持しつつ、機能的に非活性状態で存在し、抗原を貪食し、免疫や炎症刺激を受ける場合には活性型に変化できる技術を提供することにより、生体内で起こり得る樹状細胞の免疫学的応答を培養状態で実現することができる。このようにして分離した初代樹状細胞は、Ｔ細胞の増殖を誘発するか、またはＴ細胞と共培養してサイトカインの分泌を誘発することにより、癌、ウイルス感染、自己免疫疾患、臓器移植、アレルギーおよび関節リウマチなどの疾患に対する免疫細胞治療剤としての開発可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、リンパ組織から分離した初代樹状細胞を非活性型に維持できる特定のペプチドを含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物を提供することを目的とする。
【0009】
また、本発明は、前記培養方法により培養された樹状細胞と免疫細胞とを共培養するステップを含む、免疫細胞の活性化方法を提供することを目的とする。
【0010】
また、本発明は、非活性化状態で２４時間以上維持される分離された樹状細胞を含む樹状細胞組成物、およびそれを有効成分として含む、癌の治療または予防用薬学組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
１．樹状細胞間のインテグリン結合部位に結合するフィブロネクチン由来のペプチドを含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0012】
２．前記項目１において、前記ペプチドは、配列番号１～３のいずれか一つを含むアミノ酸配列からなるペプチドである、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0013】
３．前記項目１において、前記ペプチドは、配列番号１～３のいずれか一つのアミノ酸配列を含み、長さが３～１１ａａである、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0014】
４．前記項目１において、前記ペプチドは、配列番号１～７のいずれか一つのアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つである、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0015】
５．前記項目１において、前記ペプチドは、配列番号１～３のいずれか一つを含むアミノ酸配列の２以上がリンカーで連結されている、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0016】
６．前記項目５において、前記リンカーは、アミノ酸Ｇ及びＳからなり、長さが２～８ａａである、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0017】
７．前記項目５において、前記リンカーは、配列番号８～１１のいずれか一つを含むアミノ酸配列からなる、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0018】
８．前記項目５において、前記ペプチドは、配列番号１２～１４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0019】
９．前記項目１において、前記ペプチドは、処理対象である樹状細胞２×１０５／ｍＬに対して、２００μｇ／ｍＬ以上の濃度で含まれる、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物。
【0020】
１０．前記項目１において、前記樹状細胞は、単核球、脾臓またはリンパ節由来のものである、樹状細胞の活性化抑制用組成物。
【0021】
１１．前記項目１において、試験管内（in vitro）で使用するためのものである、樹状細胞の活性化抑制用組成物。
【0022】
１２．分離された樹状細胞に前記項目１～１１のいずれか一つに記載の組成物を処理するステップを含む、樹状細胞の培養方法。
【0023】
１３．前記項目１２において、前記組成物が処理された樹状細胞に免疫刺激剤を処理して樹状細胞の活性化を誘導するステップをさらに含む、樹状細胞の培養方法。
【0024】
１４．前記項目１３において、前記免疫刺激剤は、バクテリア製剤、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＬＰＳおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）からなる群より選択される少なくとも１つである、樹状細胞の培養方法。
【0025】
１５．分離された樹状細胞に前記項目１～１１のいずれか一つに記載の組成物を処理して非活性状態で前記樹状細胞を培養するステップと、
前記樹状細胞を活性化するステップと、
前記活性化された樹状細胞と免疫細胞を共培養するステップとを含む、免疫細胞の活性化方法。
前記樹状細胞を活性化するステップと、
前記活性化された樹状細胞と免疫細胞を共培養するステップとを含む、免疫細胞の活性化方法。
【0026】
１６．前記項目１～１１のいずれか一つに記載の樹状細胞間のインテグリン結合部位に結合するフィブロネクチン由来のペプチドと、これと混合された樹状細胞とを含む、樹状細胞組成物。
【0027】
１７．前記項目１６に記載の細胞組成物を有効成分として含む、癌、感染性疾患、慢性炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療または予防用薬学組成物。
【発明の効果】
【0028】
本発明は、フィブロネクチンタンパク質配列のうち細胞接着ドメインの配列を含むペプチドの組み合わせを有効成分として含む、樹状細胞の非活性維持細胞培養組成物に関し、脾臓及びリンパ節などのリンパ組織由来樹状細胞の培養剤としての効果に関する。前記ペプチドの組み合わせは、樹状細胞の非活性を維持するか、または免疫刺激剤によって細胞を活性化し、Ｔ細胞の増殖および活性化を誘導することにより、癌、自己免疫疾患および炎症性疾患の免疫学的診断または免疫細胞治療剤のための組成物として有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】図１は、本発明のペプチド混合物を添加していない状態で培養した脾臓樹状細胞（spleen DC、sDC）の分布を共焦点顕微鏡で観察した結果と細胞群集程度（cell clustering）を示すものである。
【図2】図２は、本発明のペプチド混合物および刺激剤を添加していない状態で培養した脾臓樹状細胞のフローサイトメトリーの結果であり、樹状細胞の表面に時間依存的にＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現が増加することを確認した結果である。
【図4】図４は、本発明のペプチド混合物を添加していない状態でフィブロネクチンまたはラミニンを濃度別に添加して６時間培養した後、脾臓樹状細胞の表面におけるＣＤ８６とＭＨＣ－ＩＩの発現程度を測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図5】図５は、本発明のペプチド混合物を添加していない状態でフィブロネクチンまたはラミニンを２００μｇ／ｍＬ濃度別に添加して６時間培養した後、脾臓樹状細胞の表面におけるＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現程度を測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図10】図１０は、様々な組み合わせの３種のペプチド混合物を添加した状態で６時間または２４時間培養した後、脾臓樹状細胞におけるＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現程度を、フィブロネクチンを添加した培養状態と比較して測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図12】図１２は、本発明のペプチド混合物を添加していない状態で培養した樹状細胞の培養液に分泌されたＴＮＦ－αの量を時間別に測定した酵素免疫分析法（Enzyme－linked immunosorbent assay, ELISA）の結果である。
【図14】図１４は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで免疫刺激剤であるＬＰＳ（lipopolysaccharide）を添加／無添加の状態で２４時間培養した後、脾臓樹状細胞におけるＣＤ８６の発現程度を測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図15】図１５は、ペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加したＰＣＬ（polycaprolactone）ナノファイバーメンブレンで免疫刺激剤であるＬＰＳを添加／無添加の状態で２４時間培養した後、脾臓樹状細胞におけるＣＤ８６の発現程度を測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図16】図１６は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで免疫刺激剤であるＬＰＳを添加／無添加の状態で２４時間培養した後、脾臓樹状細胞から分泌されたＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ４０の量を測定したＥＬＩＳＡの結果である。
【図17】図１７は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで免疫刺激剤であるＬＰＳを添加／無添加の状態で２４時間培養した後、骨髄由来樹状細胞（bone marrow－derived DC、BMDCs）におけるＣＤ８６の発現程度を測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図18】図１８は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを濃度別に添加した培養プレートでＬＰＳを添加状態で２４時間培養した後、骨髄由来樹状細胞におけるＣＤ８６の発現程度を測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図19】図１９は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを濃度別に添加した培養プレートでＬＰＳを添加状態で２４時間培養した後、骨髄由来樹状細胞から分泌されたＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ４０の量を測定したＥＬＩＳＡの結果である。
【図20】図２０は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで免疫刺激剤であるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を添加して２４時間培養した後、脾臓樹状細胞におけるＣＤ８６の発現程度をＬＰＳと比較測定したフローサイトメトリーの結果である。
【図21】図２１は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで免疫刺激剤であるＬＰＳまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を添加して２４時間培養した脾臓樹状細胞と、異種型マウスから分離した後、ＣＦＳＥ（carboxyfluorescein succinimidyl ester）で蛍光染色したＴ細胞との混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction）によるＴ細胞増殖に対するフローサイトメトリーの結果である。
【図22】図２２は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで免疫刺激剤であるＬＰＳまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を添加して２４時間培養した脾臓樹状細胞と、異種型マウスから分離したＴ細胞とを４日間共培養した後、分泌されるサイトカインの量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図23】図２３は、３種のペプチド混合物またはフィブロネクチンを添加した培養プレートで６時間培養した初代脾臓樹状細胞の生存率を７－ＡＡＤ（7－aminoactinomycin D）染色によるフローサイトメトリーにより測定した結果である。
【図27】図２７は、リンカーペプチドまたはＬＰＳを添加し、脾臓初代樹状細胞を２４時間培養した後、分泌される腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor, TNF－α）の濃度を測定したＥＬＩＳＡの結果である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明は、樹状細胞間のインテグリン結合部位に結合するフィブロネクチン由来のペプチドを含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物を提供する。
【0031】
樹状細胞（Dendritic cell）は、免疫細胞で病原菌物質を処理して免疫系の他の細胞のために表面に抗原を表示することで抗原伝達細胞として機能するので、自然免疫応答と獲得免疫応答との間の媒介体として機能する。樹状細胞の種類としては、例えば、単核球由来樹状細胞、脾臓由来樹状細胞、またはリンパ組織由来樹状細胞があるが、これらに限定されるものではない。
【0032】
樹状細胞間のインテグリン結合部位は、細胞－基質、細胞－細胞間結合および相互作用に重要な役割を果たす部位であってもよい。前記ペプチドがそのようなインテグリン結合部位に結合する場合、細胞－細胞間の相互作用を抑制し、細胞間のシグナル伝達、自己活性化などを抑制することができる。
【0033】
前記フィブロネクチン由来のペプチドは、細胞外基質タンパク質の一つであるフィブロネクチンの配列の一部からなり、フィブロネクチンの配列の一部以外の他のアミノ酸配列をさらに含むことができる。
【0034】
すなわち、本発明は、フィブロネクチンの樹状細胞間のインテグリン結合部位に結合する部位のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物を含む。
【0035】
前記フィブロネクチンの配列は、具体的には、フィブロネクチンを構成するドメインのうち細胞接着ドメインの配列を含むことができる。
【0036】
前記ペプチドは、ＲＧＤ（配列番号１）、ＬＤＶ（配列番号２）またはＰＨＳＲＮ（配列番号３）を含む配列からなっていてもよく、例えば、ＲＧＤ（配列番号１）、ＬＤＶ（配列番号２）、ＰＨＳＲＮ（配列番号３）、ＫＧＲＧＤＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＳ（配列番号５）、ＧＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ（配列番号６）またはＥＩＬＤＶＰＳＴ（配列番号７）であってもよい。
【0037】
前記ペプチドの長さは３～１１ａａであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0038】
前記ペプチドは、ＲＧＤ、ＬＤＶまたはＰＨＳＲＮを含むアミノ酸配列の２以上がリンカー（linker）で連結されていてもよい。
【0039】
前記リンカーは、アミノ酸Ｇ及びＳからなり、長さが２～８ａａ（amino acid）であってもよい。例えば、前記リンカーは、ＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１）を含むアミノ酸配列からなっていてもよい。
【0040】
例えば、前記ペプチドは、ＰＨＳＲＮＧＳＲＧＤＧＳＬＤＶ（配列番号１２）、ＰＨＳＲＮＧＧＧＳＲＧＤＧＧＧＳＬＤＶ（配列番号１３）、またはＰＨＳＲＮＧＧＧＳＧＧＧＳＲＧＤＧＧＧＳＬＤＶ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むことができる。
【0041】
本明細書の実施形態における「リンカーペプチド」とは、前述のように複数のペプチドがリンカーで連結されているペプチドを意味する。
【0042】
前記組成物は、前記ペプチドを２種以上含むものであってもよい。
【0043】
本発明の組成物は、樹状細胞の自己活性化を抑制するために、２×１０５／ｍＬの樹状細胞に対して、前記ペプチドを特定濃度以上で含むことができる。その濃度は、例えば、５０μｇ／ｍＬ以上、１００μｇ／ｍＬ以上、２００μｇ／ｍＬ以上、３００μｇ／ｍＬ以上、４００μｇ／ｍＬ以上または５００μｇ／ｍＬ以上であり、具体的には、５０～８００μｇ／ｍＬ、５０～５００μｇ／ｍＬ、１００～８００μｇ／ｍＬ、１００～６００μｇ／ｍＬ、１００～５００μｇ／ｍＬ、１００～３００μｇ／ｍＬ、１００～２００μｇ／ｍＬ、１５０～２５０μｇ／ｍＬ、２００～８００μｇ／ｍＬ、２００～５００μｇ／ｍＬまたは３００～５００μｇ／ｍＬであるが、これらに限定されるものではない。
【0044】
本発明の組成物は樹状細胞－媒介免疫応答を調節することができ、具体的には、樹状細胞の自己活性化の抑制または樹状細胞の自己抗原提示能を調節することができるが、これに限定されるものではない。
【0045】
「樹状細胞の自己活性化」とは、分離された樹状細胞が培養状態で１２時間以内に非活性型から活性型に転換される自然活性化現象を意味する。この現象は、樹状細胞間の結合や接触によって発生することが報告されている。前記の活性化された樹状細胞は、生存期間が非常に短く、長期培養ができなという欠点がある。そのため、活性化の抑制は、抗原を貪食して処理できる非活性形態に分離された樹状細胞を培養できるようにする。
【0046】
本発明の活性化抑制用組成物は、生体内（in vivo）または試験管内（in vitro）で使用できるが、好ましくは試験管内（in vitro）で使用するためのものであってもよい。
【0047】
また、本発明は、樹状細胞の自己活性化抑制用組成物を処理するステップを含む樹状細胞の培養方法を提供する。
【0048】
自己活性化抑制用組成物は前述の通りであり、前記組成物の処理濃度および処理時間は樹状細胞の自己活性化を抑制できれば、特定の濃度および時間に限定されない。処理濃度は、例えば、細胞数２×１０５／ｍＬ当たりに５０～５００μｇ／ｍＬ、１００～４００μｇ／ｍＬまたは０～３００μｇ／ｍＬであり、処理時間は、例えば、２～４８時間、６～４８時間、４～２４時間、６～１８時間、４～１２時間、６～８時間、または６～２４時間であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0049】
本発明の樹状細胞の培養方法は、免疫刺激剤を処理して樹状細胞の活性化を誘導するステップをさらに含むことができる。前記免疫刺激剤とは、樹状細胞に抗原を露出させて表面に抗原を表示する細胞への転換を誘発する物質を意味する。その種類としては、例えば、バクテリア製剤、ＣＤ４０アゴニストＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＬＰＳおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）があるが、これらに限定されるものではない。
【0050】
前記樹状細胞の培養は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ナノファイバーからなる構造体上において３次元で行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0051】
また、本発明は免疫細胞の活性化方法を提供する。
【0052】
免疫細胞の活性化方法は、分離された樹状細胞に前記組成物を処理し、非活性化の状態で前記樹状細胞を培養するステップと、前記樹状細胞を活性化するステップと、前記活性化した樹状細胞と免疫細胞を共培養するステップとを含む。
【0053】
前記免疫細胞とは、免疫系において免疫応答に関与する細胞であり、細胞治療剤として用いられる細胞を意味し得る。その種類としては、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、自然殺害細胞（ＮＫ細胞）、自然殺害Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）、肥満細胞、または骨髄由来食細胞があるが、これらに限定されるものではない。
【0054】
前記組成物を処理して樹状細胞を非活性化状態で培養するステップは、樹状細胞の培養方法で説明した通りである。
【0055】
樹状細胞を活性化するステップは、非活性形態の樹状細胞に成熟化因子または免疫刺激剤を処理することにより行うことができる。前記成熟化因子または免疫刺激剤は、樹状細胞の表面にＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０またはＣＤ４０の発現が増加するように誘導する物質であれば、その種類を限定せず、例えば、バクテリア製剤、ＣＤ４０アゴニストＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＬＰＳまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）であってもよい。
【0056】
活性化された樹状細胞と免疫細胞を共培養するステップは、免疫細胞の増殖およびサイトカインの分泌を誘導するためのものであり、活性化された樹状細胞を基準に共培養する免疫細胞数の割合は、例えば１～５０、４～３０、５～２５、１０～３０または１５～２５であり、共培養時間は、２～１４４時間、４～１２０時間、１２～９６時間、２４～９６時間、４８～９６時間、または４８時間～７２時間であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0057】
また、本発明は、前記ペプチドと、それと混合された樹状細胞とを含む樹状細胞組成物を提供する。
【0058】
前記組成物の樹状細胞は、非活性化状態を、例えば６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、または４８時間以上維持するものであり、好ましくは、６～２４時間、６～４８時間、１２～４８時間、または１２時間～２４時間であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0059】
前記細胞組成物は、前述の樹状細胞の活性化抑制用組成物によって非活性化状態が維持された樹状細胞を含むものであり、前記樹状細胞は、具体的には、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０またはＣＤ４０因子の発現増加が抑制された樹状細胞であってもよい。
【0060】
前記樹状細胞は刺激を受けて活性化されるまでは生存を維持しながら機能的に抗原を貪食することができ、活性化された樹状細胞とは異なり長期培養が可能である。そのため、体外でＴ細胞の増殖を誘発するか、またはＴ細胞と共培養してサイトカインの分泌を促進することにより、様々な疾患に対する免疫細胞治療剤の開発を可能とする。
【0061】
また、本発明は、前記樹状細胞組成物を有効成分として含む、癌、細菌およびウイルス感染性疾患、慢性炎症性疾患、又は自己免疫疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【0062】
前記癌は、例えば、肺癌、喉頭癌、胃癌、大腸／直腸癌、肝癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸部癌、前立腺癌、腎癌、上皮細胞に由来する癌腫（carcinoma）、骨癌、筋肉癌、脂肪癌、結合組織細胞に由来する肉腫（sarcoma）、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫の造血細胞に由来する血液癌、神経組織に発生する腫瘍、甲状腺癌、結腸癌、精巣癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膀胱癌、上皮癌、腺癌、食道癌、中皮腫、皮膚癌または黒色腫であるが、これらに限定されるものではない。
【0063】
前記感染性疾患とは、細菌、スピロヘータ、リケッチア、ウイルス、真菌または寄生虫などの病原体に感染して引き起こされる疾患であるが、これらに限定されるものではない。
【0064】
前記慢性炎症性疾患とは、炎症が長期間蓄積して発生する疾患であり、細胞の老化と変形を引き起こし、免疫反応を過度に活性化させて免疫系を乱すことが知られており、それに伴い、肥満、糖尿病などの代謝疾患または自己免疫疾患まで誘発することが報告されている。
【0065】
前記自己免疫疾患とは、人体内部の免疫系が外部抗原ではなく内部の正常細胞を攻撃して発生する疾患であり、例えば、関節リウマチ、アトピー、ループス、クローン病、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎または多発性硬化症などがあるが、これらに限定されるものではない。
【0066】
前記癌、感染性疾患または免疫疾患の他にも、免疫細胞を治療剤として利用できる疾患であれば、その種類に関係なく本発明の細胞組成物を有効成分とし、当該疾患の治療または予防用薬学組成物として用いることができる。
【0067】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容を限定するものではない。
【0068】
実施例１．脾臓樹状細胞の分離および培養
マウス脾臓樹状細胞は、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓にＥＤＴＡ－ＢＳＳ（Balanced Salt Solution）緩衝液とコラゲナーゼ（collagenase）溶液（１００ユニットのコラゲナーゼタイプＩＶを含むＤＭＥＭ、低グルコースを含む培地）を入れ、手術用はさみで細かく切った後、６ｍｌのコラゲナーゼ処理溶液を混ぜて３０分間培養する。分離した全脾臓組織を７０μＭのセルストレーナー（Falcon）を用いて濾過し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を分離する。赤血球溶解緩衝剤（Sigma Aldrich）を加えて赤血球を除去し、１０％ウシ血清（Fetal Bovine Serum，FBS）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で２回洗浄する。樹状細胞はＣＤ１１ｃ＋抗体が結合したマイクロビーズで反応させ、ＣＤ１１ｃ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（MACS、Milteni Biotec、USA）を用いて分離した。
マウス脾臓樹状細胞は、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓にＥＤＴＡ－ＢＳＳ（Balanced Salt Solution）緩衝液とコラゲナーゼ（collagenase）溶液（１００ユニットのコラゲナーゼタイプＩＶを含むＤＭＥＭ、低グルコースを含む培地）を入れ、手術用はさみで細かく切った後、６ｍｌのコラゲナーゼ処理溶液を混ぜて３０分間培養する。分離した全脾臓組織を７０μＭのセルストレーナー（Falcon）を用いて濾過し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を分離する。赤血球溶解緩衝剤（Sigma Aldrich）を加えて赤血球を除去し、１０％ウシ血清（Fetal Bovine Serum，FBS）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で２回洗浄する。樹状細胞はＣＤ１１ｃ＋抗体が結合したマイクロビーズで反応させ、ＣＤ１１ｃ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（MACS、Milteni Biotec、USA）を用いて分離した。
【0069】
図１では、脾臓から分離した初代樹状細胞を４８ウェルプレートに分注し、３７℃および５％ ＣＯ２を維持する細胞チャンバ中で２４時間培養し、細胞が単一の細胞として分布するか、または集まるクラスタリング（clustering）の程度を共焦点顕微鏡（Olympus confocal microscope FV1000, Olympus Corporation；n＝5）の微分干渉（Differential interference contrast，DIC）画像で観察した。その場合、培養時間の経過に伴って細胞の凝集がさらに増加することが示された。この現象は細胞数が２×１０５／ｍＬよりも１×１０６／ｍＬの密度においてより顕著に示された。単一の細胞と細胞同士が集まっているクラスター（cluster）の数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH、6 Bethesda）を用いて測定した。＊は０ｈと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0070】
実施例２．フローサイトメトリーを用いた樹状細胞の活性化の測定
刺激を受けていない定常な状態の樹状細胞は、ＭＨＣ－ＩＩおよび共刺激分子としてのＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０などの表現因子の発現が非常に低い状態であり、非活性型の表現型を有するが、活性化された樹状細胞はこれらの標識子の発現が顕著に増加する。
刺激を受けていない定常な状態の樹状細胞は、ＭＨＣ－ＩＩおよび共刺激分子としてのＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０などの表現因子の発現が非常に低い状態であり、非活性型の表現型を有するが、活性化された樹状細胞はこれらの標識子の発現が顕著に増加する。
【0071】
図２では、脾臓から分離した初代樹状細胞を培養した場合に自己活性化が起こるかどうかを判断するために、樹状細胞を２４ウェルプレートに２×１０５／ｍＬで分注し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３７℃と５％ ＣＯ２の条件下で６時間培養した後、フローサイトメトリー（MACSQuant VYB flow cytometer、Miltenyi Biotec）を用いて樹状細胞の表面におけるＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現レベルを分析した。フローサイトメトリーを用いて測定した結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（Tree Star、Ashland）を用いて分析した。ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現程度は、ＣＤ１１ｃで染色された細胞のパーセントで表し、ＭＨＣ－ＩＩの発現程度は、蛍光の平均蛍光強度であるＭＦＩ（mean fluorescence intensity）で表した。その結果、樹状細胞の表面におけるＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現程度は時間依存的に増加することが示された。
【0072】
実施例３．フィブロネクチンを添加した培地における脾臓樹状細胞の培養
図３では、ＲＰＭＩ－１６４０培地に２００μｇ／ｍＬの濃度でフィブロネクチンまたはラミニンを添加し、脾臓から分離したＣＤ１１ｃ＋初代樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注して６時間培養した後、細胞の分布を共焦点顕微鏡で観察した。フィブロネクチンを添加した場合、細胞の凝集が顕著に減少することが示された。これはフィブロネクチンが樹状細胞間の凝集を阻害する細胞外基質因子である可能性を示唆する。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
図３では、ＲＰＭＩ－１６４０培地に２００μｇ／ｍＬの濃度でフィブロネクチンまたはラミニンを添加し、脾臓から分離したＣＤ１１ｃ＋初代樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注して６時間培養した後、細胞の分布を共焦点顕微鏡で観察した。フィブロネクチンを添加した場合、細胞の凝集が顕著に減少することが示された。これはフィブロネクチンが樹状細胞間の凝集を阻害する細胞外基質因子である可能性を示唆する。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0073】
図４では、様々な濃度のフィブロネクチンまたはラミニンを添加して脾臓樹状細胞を６時間培養した後、ＣＤ８６やＭＨＣ－ＩＩの発現程度をフローサイトメトリーで測定した。その結果、２００μｇ／ｍＬ濃度のフィブロネクチンによっては自己活性化が起こらず、２００μｇ／ｍＬ濃度以上のラミニンによっては自己活性化が抑制されなかった。このことから、本発明では、２００μｇ／ｍＬ濃度のフィブロネクチンが脾臓樹状細胞の自己活性化に最も有効であることが確認された。＊は０μｇ／ｍＬ濃度と比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0074】
図５では、２００μｇ／ｍＬ濃度のフィブロネクチンでＣＤ１１ｃ＋脾臓樹状細胞を６時間培養した場合、ＣＤ８６やＭＨＣ－ＩＩの発現だけでなくＣＤ８０及びＣＤ４０の発現も増加しないことが示された。
【0075】
実施例４．フィブロネクチンタンパク質のアミノ酸配列から製造したペプチドを添加した培地における脾臓樹状細胞の培養
図６では、細胞接着を媒介する細胞外基質タンパク質の一つであるフィブロネクチン中のアミノ酸塩基配列では、アルギニン－グリシン－アスパルテート（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ、ＲＧＤ）（以下、「Ｐ１」という。配列番号１）等が細胞膜のインテグリンタンパク質に結合する部位に相当し、その他にＬｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（ＬＤＶ）（以下、「Ｐ２」という。配列番号２）、およびＰｒｏ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｓｎ（ＰＨＳＲＮ）（以下、「Ｐ３」という。配列番号３）塩基配列も同様の役割を果たすことが知られているので、これらの塩基配列で構成されるペプチドをペプトロン社（ＰＥＰＴＲＯＮ，ＩＮＣ．）に依頼して製造した。フィブロネクチンタンパク質中のＲＧＤなどのモチーフは、インテグリンと結合して細胞－基質、細胞－細胞間の結合に作用する。ＲＧＤペプチド以外の類似ペプチドとしては、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＫＧＲＧＤＳ）（以下、「Ｐ１－１」という。配列番号４）、ＧＲＧＤＳ（以下、「Ｐ１－２」という。配列番号５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（ＧＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ）（以下、「Ｐ２－１」という。配列番号６）、Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（ＥＩＬＤＶＰＳＴ）（以下、「Ｐ２－２」という。配列番号７）を製造して使用した。対照群としては、コラーゲン中のインテグリン結合モチーフに相当するアミノ酸塩基配列としてのＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ（ＧＦＯＧＥＲ）（以下、「Ｐ４」という。配列番号１８）、ラミニン中のインテグリン結合モチーフの１つであるアミノ酸塩基配列としてのＴｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）（以下、「Ｐ５」という。配列番号１９）とＩｌｅ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ（以下、「Ｐ６」という。配列番号２０）を製造して使用した。
図６では、細胞接着を媒介する細胞外基質タンパク質の一つであるフィブロネクチン中のアミノ酸塩基配列では、アルギニン－グリシン－アスパルテート（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ、ＲＧＤ）（以下、「Ｐ１」という。配列番号１）等が細胞膜のインテグリンタンパク質に結合する部位に相当し、その他にＬｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（ＬＤＶ）（以下、「Ｐ２」という。配列番号２）、およびＰｒｏ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｓｎ（ＰＨＳＲＮ）（以下、「Ｐ３」という。配列番号３）塩基配列も同様の役割を果たすことが知られているので、これらの塩基配列で構成されるペプチドをペプトロン社（ＰＥＰＴＲＯＮ，ＩＮＣ．）に依頼して製造した。フィブロネクチンタンパク質中のＲＧＤなどのモチーフは、インテグリンと結合して細胞－基質、細胞－細胞間の結合に作用する。ＲＧＤペプチド以外の類似ペプチドとしては、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＫＧＲＧＤＳ）（以下、「Ｐ１－１」という。配列番号４）、ＧＲＧＤＳ（以下、「Ｐ１－２」という。配列番号５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（ＧＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ）（以下、「Ｐ２－１」という。配列番号６）、Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（ＥＩＬＤＶＰＳＴ）（以下、「Ｐ２－２」という。配列番号７）を製造して使用した。対照群としては、コラーゲン中のインテグリン結合モチーフに相当するアミノ酸塩基配列としてのＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ（ＧＦＯＧＥＲ）（以下、「Ｐ４」という。配列番号１８）、ラミニン中のインテグリン結合モチーフの１つであるアミノ酸塩基配列としてのＴｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）（以下、「Ｐ５」という。配列番号１９）とＩｌｅ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ（以下、「Ｐ６」という。配列番号２０）を製造して使用した。
【0076】
図７では、脾臓樹状細胞を培養するとき、製造したペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加して６時間後、ＣＤ８６の発現程度を測定した。各ペプチドを単独で処理した場合は、脾臓樹状細胞におけるＣＤ８６の発現が抑制されなかったが、Ｐ１、Ｐ１－２及びＰ２－１ペプチドを共に処理した場合は、ＣＤ８６の発現が顕著に減少する結果が得られた。これらの３種のペプチドで細胞を処理した場合と比較して、２種のペプチドを共に処理した場合は発現が抑制されなかった。＊はＰ１、Ｐ１－２及びＰ２－１の条件と比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0077】
図８では、脾臓樹状細胞培養液中に製造されたＰ３ペプチドを２００μｇ／ｍＬの濃度としてＰ１（２００μｇ／ｍＬ）、Ｐ２（２００μｇ／ｍＬ）と組み合わせて添加し、６時間または２４時間培養した。その場合、細胞の群集形成が顕著に抑制された。これと比較して、コラーゲンやラミニンタンパク質由来のペプチドであるＰ４、Ｐ５及びＰ６の３種のペプチドを同時に添加しても群集形成が抑制されないことが示され、また、ラニミン由来のペプチドであるＰ５及びＰ６を添加しても抑制現象が示されなかった。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0078】
図９では、脾臓樹状細胞培養液にＰ３ペプチドと共に、Ｐ１とＰ２及びこれらのペプチドのアミノ酸を含有するペプチドを３種類の組み合わせで添加して６時間培養した後、ＣＤ８６の発現程度をフローサイトメトリーで測定した。Ｐ３（２００μｇ／ｍＬ）を含有しながら他の２種類のペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合、ＣＤ８６の発現は全ての測定において顕著に減少した。特に、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３ペプチドを添加した場合、またはＰ１－２、Ｐ２－１及びＰ３ペプチドを添加した場合には、最も顕著な抑制効果が得られた。これと比較して、Ｐ３を６００μｇ／ｍＬの濃度で単独処理した場合には、抑制効果が示されなかった。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0079】
図１０では、脾臓樹状細胞培養液に３種類のペプチドを添加し、６時間または２４時間培養した場合、ＣＤ８６以外のＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ４０の発現が抑制されるかどうかをフローサイトメトリーで測定した。その結果、フィブロネクチンと共にＰ１、Ｐ２及びＰ３ペプチドを添加した場合、またはＰ１－２、Ｐ２－１及びＰ３ペプチドを添加した場合には、これらの発現が顕著に抑制されることを確認した。これに対して、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６ペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合には、抑制効果が示されず、ラミニンを単独で処理しても何の影響もなかった。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0080】
実施例５．ペプチドを添加して培養した脾臓樹状細胞におけるＣＤ８６の発現に対する蛍光染色の測定
図１１では、脾臓樹状細胞（２×１０５／ｍＬ）を培養するとき、製造したペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、６時間後にＰＥ－結合抗ＣＤ８６抗体（eBioscience）を用いて、ＣＤ８６の発現程度を、蛍光染色後に共焦点顕微鏡で測定した。初代脾臓樹状細胞を一定時間培養した後、細胞内ＣＤ８６、アクチン（F－actin）および核染色を行った。アクチンの発現はＦＩＴＣ－結合ファロイジン（phalloidin）（eBioscience）で染色し、核染色はＨｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Sigma－Aldrich）で行った。このために、４８ウェルプレートで培養した細胞を４％パラホルムアルデヒド固定液に入れた後、室温で２０分間固定した。
図１１では、脾臓樹状細胞（２×１０５／ｍＬ）を培養するとき、製造したペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、６時間後にＰＥ－結合抗ＣＤ８６抗体（eBioscience）を用いて、ＣＤ８６の発現程度を、蛍光染色後に共焦点顕微鏡で測定した。初代脾臓樹状細胞を一定時間培養した後、細胞内ＣＤ８６、アクチン（F－actin）および核染色を行った。アクチンの発現はＦＩＴＣ－結合ファロイジン（phalloidin）（eBioscience）で染色し、核染色はＨｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Sigma－Aldrich）で行った。このために、４８ウェルプレートで培養した細胞を４％パラホルムアルデヒド固定液に入れた後、室温で２０分間固定した。
【0081】
次に、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Sigma－Aldrich）溶液で常温において５分間浸透させ、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した。非特異的染色を除去するために、０．２％ウシ血清アルブミン（Sigma－Aldrich）溶液で室温で２０分間反応させた後、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した。その後、ＣＤ８６抗体およびファロイジン（phalloidin）を０．２％ウシ血清アルブミン溶液に１：４０の割合で希釈して４０分間反応させた後、Ｔｒｉｓ緩衝溶液で３回洗浄してスライドガラスに載せ、細胞の核染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液で対照染色し、カバーガラスを覆って封入した。その後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｋ１ナノスコープ）を用いて細胞を観察した。
【0082】
実施例６．培養された脾臓樹状細胞からのＴＮＦ－αの分泌とペプチドの影響
図１２では、脾臓初代樹状細胞を１×１０６／ｍＬで分注し、２４時間培養した後、培養液にこれらの細胞から分泌されるＴＮＦ－αの濃度を測定したところ、時間依存的に分泌が増加することが示された。ＴＮＦ－αの濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D systems）を使用し、マイクロプレートリーダー（Synergy H1、Biotek）を用いて４５０ｎｍで測定した。しかし、樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注した場合、ＣＤ８６の発現は増加するが、ＴＮＦ－αの分泌は増加しないことが示された（結果を提出せず）。＊は３ｈと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
図１２では、脾臓初代樹状細胞を１×１０６／ｍＬで分注し、２４時間培養した後、培養液にこれらの細胞から分泌されるＴＮＦ－αの濃度を測定したところ、時間依存的に分泌が増加することが示された。ＴＮＦ－αの濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D systems）を使用し、マイクロプレートリーダー（Synergy H1、Biotek）を用いて４５０ｎｍで測定した。しかし、樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注した場合、ＣＤ８６の発現は増加するが、ＴＮＦ－αの分泌は増加しないことが示された（結果を提出せず）。＊は３ｈと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0083】
図１３では、脾臓初代樹状細胞を１×１０６／ｍＬで分注し、２４時間培養しながらＰ１、Ｐ２及びＰ３のペプチドを添加するか、又はＰ１－２、Ｐ２－１及びＰ３ペプチドを添加した場合、ＴＮＦ－αの分泌が顕著に減少することが示された。また、フィブロネクチンを添加して培養した場合もまた、培養液ではＴＮＦ－αがほとんど測定されず、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６ペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合は、ＴＮＦ－αの分泌が抑制されなかった。このことから、初代樹状細胞の活性化は、ＴＮＦ－αの分泌とは直接的な関係がないと見られるが、活性化された細胞から分泌されるＴＮＦ－αの量は、フィブロネクチンやペプチドの組み合わせによって効果的に抑制されることが見られる。＊は３ｈと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0084】
実施例７．ペプチドおよびフィブロネクチンを添加しながら培養した脾臓樹状細胞の活性化の誘導
図１４では、２４時間培養した脾臓初代樹状細胞のＣＤ８６の発現程度は、活性化誘導剤である大腸菌のＬＰＳを１μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に増加するＣＤ８６の発現程度と類似に測定され、自己活性化が起こる培養条件にＬＰＳを追加して処理してもＣＤ８６の発現はそれ以上増加しないことが示された。フィブロネクチンを添加して培養した脾臓樹状細胞のＣＤ８６発現は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを処理した場合にも増加しなかったが、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のペプチドを添加するか、Ｐ１－２、Ｐ２－１及びＰ３のペプチドを添加して培養した、自己活性化が抑制された樹状細胞は、ＬＰＳの刺激によってＣＤ８６の発現が顕著に増加する結果が得られた。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。＊＊は－ＬＰＳと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
図１４では、２４時間培養した脾臓初代樹状細胞のＣＤ８６の発現程度は、活性化誘導剤である大腸菌のＬＰＳを１μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に増加するＣＤ８６の発現程度と類似に測定され、自己活性化が起こる培養条件にＬＰＳを追加して処理してもＣＤ８６の発現はそれ以上増加しないことが示された。フィブロネクチンを添加して培養した脾臓樹状細胞のＣＤ８６発現は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを処理した場合にも増加しなかったが、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のペプチドを添加するか、Ｐ１－２、Ｐ２－１及びＰ３のペプチドを添加して培養した、自己活性化が抑制された樹状細胞は、ＬＰＳの刺激によってＣＤ８６の発現が顕著に増加する結果が得られた。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。＊＊は－ＬＰＳと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0085】
実施例８．ナノファイバーメンブレンで培養した脾臓樹状細胞の活性化程度とペプチドおよびＬＰＳの影響
図１５では、ポリカプロラクトン（poly－caprolactone，PCL）で製造したナノファイバーメンブレンで２４時間培養した初代脾臓樹状細胞においても、培養プレートの培養条件と同様に自然活性化が起こり、ＣＤ８６の発現が顕著に増加することが示された。ナノファイバー構造体は、ポリカプロラクトン（Sigma, MW 80,000）をクロロホルム溶媒に１５％（ｗ／ｖ）の割合で添加し、この溶液（５ｍｌ）を８μｌ／ｍｉｎの紡糸速度で２０ｃｍの紡糸距離を置き、２５Ｇ金属シリンジを使用して１０ＫＶの状態で電気紡糸機（Ｎａｎｏ－ＮＣ）を用いて電気紡糸法で製造した。ポリカプロラクトンナノファイバーで培養した脾臓樹状細胞のＣＤ８６発現に対するペプチドの組み合わせおよびＬＰＳの影響は、図１４に示す培養プレートで得られた結果と類似した結果を示した。したがって、ナノファイバーメンブレンのような三次元培養条件下でも脾臓樹状細胞の自然活性化の程度は、二次元培養と類似した態様を示した。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。＊＊は－ＬＰＳと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
図１５では、ポリカプロラクトン（poly－caprolactone，PCL）で製造したナノファイバーメンブレンで２４時間培養した初代脾臓樹状細胞においても、培養プレートの培養条件と同様に自然活性化が起こり、ＣＤ８６の発現が顕著に増加することが示された。ナノファイバー構造体は、ポリカプロラクトン（Sigma, MW 80,000）をクロロホルム溶媒に１５％（ｗ／ｖ）の割合で添加し、この溶液（５ｍｌ）を８μｌ／ｍｉｎの紡糸速度で２０ｃｍの紡糸距離を置き、２５Ｇ金属シリンジを使用して１０ＫＶの状態で電気紡糸機（Ｎａｎｏ－ＮＣ）を用いて電気紡糸法で製造した。ポリカプロラクトンナノファイバーで培養した脾臓樹状細胞のＣＤ８６発現に対するペプチドの組み合わせおよびＬＰＳの影響は、図１４に示す培養プレートで得られた結果と類似した結果を示した。したがって、ナノファイバーメンブレンのような三次元培養条件下でも脾臓樹状細胞の自然活性化の程度は、二次元培養と類似した態様を示した。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。＊＊は－ＬＰＳと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0086】
実施例９．ペプチドおよびフィブロネクチンを添加しながら培養した脾臓樹状細胞のサイトカイン分泌能
図１６では、ペプチドの組み合わせを添加した状態で２４時間培養した脾臓初代樹状細胞をＬＰＳで刺激した場合、炎症性サイトカインおよびＴｈ１誘発サイトカインが正常に分泌されるかを測定した結果を示した。ペプチドを添加して培養した細胞では、非活性型を維持してＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ４０の分泌がほとんど測定されなかったが、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ処理により、培養液では高濃度で測定された。これに対して、フィブロネクチンを添加して培養した脾臓樹状細胞は、ＬＰＳで刺激を与えた場合、サイトカインを生成できないことが示された。このことから、フィブロネクチンは脾臓樹状細胞の非活性化を維持できるが、刺激剤による活性化作用を抑制する欠点があることが分かる。＊は－ＬＰＳと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
図１６では、ペプチドの組み合わせを添加した状態で２４時間培養した脾臓初代樹状細胞をＬＰＳで刺激した場合、炎症性サイトカインおよびＴｈ１誘発サイトカインが正常に分泌されるかを測定した結果を示した。ペプチドを添加して培養した細胞では、非活性型を維持してＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ４０の分泌がほとんど測定されなかったが、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ処理により、培養液では高濃度で測定された。これに対して、フィブロネクチンを添加して培養した脾臓樹状細胞は、ＬＰＳで刺激を与えた場合、サイトカインを生成できないことが示された。このことから、フィブロネクチンは脾臓樹状細胞の非活性化を維持できるが、刺激剤による活性化作用を抑制する欠点があることが分かる。＊は－ＬＰＳと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0087】
実施例１０．骨髄由来樹状細胞の刺激剤による活性化に対するペプチドおよびフィブロネクチンの影響に関する調査
脾臓樹状細胞と比較して、骨髄由来樹状細胞（bone marrow derived DC、BMDC）をＬＰＳで刺激した場合、ペプチドの組み合わせ及びフィブロネクチンの添加がどのように影響するかを測定した。
脾臓樹状細胞と比較して、骨髄由来樹状細胞（bone marrow derived DC、BMDC）をＬＰＳで刺激した場合、ペプチドの組み合わせ及びフィブロネクチンの添加がどのように影響するかを測定した。
【0088】
マウス骨髄由来樹状細胞は、マウス骨髄前駆細胞から分化させて得た。雌Ｃ５７ＢＬ／ ６マウスの大腿骨と脛骨を除去し、骨髄を、２％ＦＢＳを含有するＥＤＴＡ：ＢＳＳ（Balanced Salt Solution）緩衝液１０ｍＬを用いて分離した。赤血球溶解緩衝剤（Sigma Aldrich）で赤血球を除去し、ＥＤＴＡ：ＢＳＳ緩衝液で洗浄した後、７０μｍのセルストレーナー（Falcon）を用いて細胞を濾過した。３×１０６／ｍＬの細胞を６ウェルプレートに分注し、インターロイキン－４（２０ｎｇ／ｍＬ）（JW Creagene）とＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）（JW Creagene）を加えて７日間培養して細胞分化を誘導した。分化した樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ抗体（eBioscience）が結合したマイクロビーズで反応させ、ＣＤ１１ｃ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ（MACS、Milteni Biotec）を用いて分離した後に培養した。
【0089】
図１７では、２×１０５／ｍＬの骨髄由来樹状細胞を２４時間培養しながら、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加するか、またはフィブロネクチンを２００μｇ／ｍＬの濃度で添加しながらＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で細胞を刺激した。ペプチドを含む場合は、ＬＰＳによってＣＤ８６の発現増加が顕著に示されたが、フィブロネクチンによってはＣＤ８６の発現が起こらなかった。
【0090】
図１８では、骨髄由来樹状細胞を２４時間培養しながらフィブロネクチンを濃度別に投与した場合、５０μｇ／ｍＬの濃度からＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）によるＣＤ８６の発現増加が抑制されることが示された。＊は０μｇ／ｍＬの濃度と比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0091】
図１９では、骨髄由来樹状細胞を２４時間培養しながらフィブロネクチンを濃度別に投与した場合、１００μｇ／ｍＬの濃度からＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）によってＴＮＦ－α及びＩＬ－１２ｐ４０の分泌が抑制されることが示された。＊は０μｇ／ｍＬ濃度と比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0092】
図２０では、樹状細胞を含む免疫細胞および炎症細胞のＴｏｌｌ様受容体－４に結合するＬＰＳと比較して、構造的二重らせんＲＮＡと類似し、Ｔｏｌｌ様受容体－３に結合する免疫刺激剤として知られているｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（polyinosinic：polycytidylic acid）を５０μｇ／ｍＬの濃度で投与した。フィブロネクチンを添加して培養した場合は脾臓樹状細胞のＣＤ８６発現の増加が抑制されたが、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合は影響を受けない結果が得られた。＊はＮｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0093】
実施例１１．ペプチドで培養した脾臓樹状細胞によるＴ細胞の増殖及び共培養によるサイトカイン分泌の増加
活性化された樹状細胞の主な役割は、刺激特性によって抗原別Ｔ細胞活性化と増殖を誘導することであるので、培養後自己活性化した脾臓樹状細胞とペプチドを添加しながら培養後ＬＰＳで活性化させた樹状細胞が混合リンパ球反応検査においてＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調べた。Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスから分離した脾臓樹状細胞は、２４時間自己活性化をさせるか、またはペプチドやフィブロネクチンを添加して培養した場合は、ＬＰＳを処理して細胞活性化をさせた。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞分離キット（Miltenyi Biotec，Bergisch－Gladbach，ドイツ）とＭＡＣＳカラム（Miltenyi Biotec）を用いて分離した後、１０μＭ ＣＦＳＥ（Molecular Probes；Thermo Fisher Scientific社、米国）で染色した。活性化された樹状細胞とＣＦＳＥで染色されたＴ細胞とを１：２０の割合で４日間共培養し、Ｔ細胞の増殖程度をＣＦＳＥが減少する細胞のパーセントとして測定した。
活性化された樹状細胞の主な役割は、刺激特性によって抗原別Ｔ細胞活性化と増殖を誘導することであるので、培養後自己活性化した脾臓樹状細胞とペプチドを添加しながら培養後ＬＰＳで活性化させた樹状細胞が混合リンパ球反応検査においてＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調べた。Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスから分離した脾臓樹状細胞は、２４時間自己活性化をさせるか、またはペプチドやフィブロネクチンを添加して培養した場合は、ＬＰＳを処理して細胞活性化をさせた。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞分離キット（Miltenyi Biotec，Bergisch－Gladbach，ドイツ）とＭＡＣＳカラム（Miltenyi Biotec）を用いて分離した後、１０μＭ ＣＦＳＥ（Molecular Probes；Thermo Fisher Scientific社、米国）で染色した。活性化された樹状細胞とＣＦＳＥで染色されたＴ細胞とを１：２０の割合で４日間共培養し、Ｔ細胞の増殖程度をＣＦＳＥが減少する細胞のパーセントとして測定した。
【0094】
図２１では、ペプチドやフィブロネクチンを処理していない対照群の脾臓樹状細胞と比較したところ、ＬＰＳまたはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で活性化された樹状細胞は、共培養した脾臓Ｔ細胞の増殖を多少増加させ、ペプチドで処理した後に活性化させた脾臓樹状細胞もまた、効果的にＴ細胞の増殖を増加させた。しかし、フィブロネクチンを添加して培養した脾臓樹状細胞は、ＬＰＳによる活性化が行われず、Ｔ細胞の増殖を誘導できない結果が得られた。＊は、未処理（untreated）ｓＤＣと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。図２２では、脾臓樹状細胞とＴ細胞とを４日間共培養した後、分泌されたサイトカインの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。対照群やペプチドを添加して培養しながらＬＰＳおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で活性化された樹状細胞とＴ細胞とを共培養した場合は、高濃度のインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－５を分泌したが、フィブロネクチンを添加した状態で活性化された脾臓樹状細胞とＴ細胞とを共培養した場合は、サイトカインの分泌が極めて少なかった。＊は、未処理（untreated）ｓＤＣと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0095】
実施例１２．ペプチドで培養した脾臓樹状細胞の生存率の増加
樹状細胞は、自己活性化が起こり、培養中に細胞死滅が急激に起こる特徴がある。自己活性化の抑制とともに樹状細胞の生存率が変化するかを測定した。細胞の生存率は、７－ＡＡＤで染色した細胞を培養しながら蛍光で染色されない細胞の数をフローサイトメトリーで測定した。
樹状細胞は、自己活性化が起こり、培養中に細胞死滅が急激に起こる特徴がある。自己活性化の抑制とともに樹状細胞の生存率が変化するかを測定した。細胞の生存率は、７－ＡＡＤで染色した細胞を培養しながら蛍光で染色されない細胞の数をフローサイトメトリーで測定した。
【0096】
図２３では、脾臓樹状細胞は６時間培養で顕著に細胞生存率が減少するが、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のペプチドやフィブロネクチンを添加して培養した場合には、７－ＡＡＤ陰性の生存細胞数が顕著に増加することが示された。＊は、未処理（untreated）ｓＤＣと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を示す。
【0097】
実施例１３：培養された初代樹状細胞におけるＣＤ８６の発現に対する３種のペプチドで構成されるリンカーペプチド（linker peptide）の影響の測定
リンカーとしては、アミノ酸リンカーであるＧＳとフレキシブルリンカー（flexible linker）であるＧＧＧＳＧＧＧＳを３種のペプチドであるＲＧＤ（Ｐ１）、ＬＤＶ（Ｐ２）及びＰＨＳＲＮ（Ｐ３）の連結に使用し、ＰＨＳＲＮＧＳＲＧＤＧＳＬＤＶ（「ＬＰ１」という。配列番号１２）、ＰＨＳＲＮＧＧＧＳＲＧＤＧＧＧＳＬＤＶ（「ＬＰ２」という。配列番号１３）、ＰＨＳＲＮＧＧＧＳＧＧＧＳＲＧＤＧＧＧＳＬＤＶ（「ＬＰ３」という。配列番号１４）を製造した。リンカーペプチドは、ペプトロン社（ＰＥＰＴＲＯＮ，ＩＮＣ．、韓国テジョン市）に製造を依頼し、ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬＣＭＳ－２０２０として製造された。対照群としては、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３ペプチドを構成するアミノ酸の配列を混ぜたスクランブル（scrambled）ペプチドであるＳ－Ｐ１（配列番号１５）、Ｓ－Ｐ２（配列番号１６）およびＳ－Ｐ３（配列番号１７）と、これらのスクランブル（scrambled）ペプチドで構成されるリンカーペプチドＳ－ＬＰ１（配列番号２１）、Ｓ－ＬＰ２（配列番号２２）、Ｓ－ＬＰ３（配列番号２３）を製造して使用した。スクランブル（scrambled）ペプチドやスクランブル（scrambled）リンカーペプチドは、元のペプチドと同じアミノ酸数、分子量、等電点（isoelctric point）および親水性を有する。これらのペプチドの配列を表１に示す。
リンカーとしては、アミノ酸リンカーであるＧＳとフレキシブルリンカー（flexible linker）であるＧＧＧＳＧＧＧＳを３種のペプチドであるＲＧＤ（Ｐ１）、ＬＤＶ（Ｐ２）及びＰＨＳＲＮ（Ｐ３）の連結に使用し、ＰＨＳＲＮＧＳＲＧＤＧＳＬＤＶ（「ＬＰ１」という。配列番号１２）、ＰＨＳＲＮＧＧＧＳＲＧＤＧＧＧＳＬＤＶ（「ＬＰ２」という。配列番号１３）、ＰＨＳＲＮＧＧＧＳＧＧＧＳＲＧＤＧＧＧＳＬＤＶ（「ＬＰ３」という。配列番号１４）を製造した。リンカーペプチドは、ペプトロン社（ＰＥＰＴＲＯＮ，ＩＮＣ．、韓国テジョン市）に製造を依頼し、ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬＣＭＳ－２０２０として製造された。対照群としては、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３ペプチドを構成するアミノ酸の配列を混ぜたスクランブル（scrambled）ペプチドであるＳ－Ｐ１（配列番号１５）、Ｓ－Ｐ２（配列番号１６）およびＳ－Ｐ３（配列番号１７）と、これらのスクランブル（scrambled）ペプチドで構成されるリンカーペプチドＳ－ＬＰ１（配列番号２１）、Ｓ－ＬＰ２（配列番号２２）、Ｓ－ＬＰ３（配列番号２３）を製造して使用した。スクランブル（scrambled）ペプチドやスクランブル（scrambled）リンカーペプチドは、元のペプチドと同じアミノ酸数、分子量、等電点（isoelctric point）および親水性を有する。これらのペプチドの配列を表１に示す。
【0098】
【表1】
【0099】
図２４では、様々な濃度のＬＰ１、ＬＰ２及びＬＰ３を８００μｇ／ｍＬの濃度まで添加し、脾臓樹状細胞（２×１０５／ｍＬ）を６時間又は２４時間培養した後、ＣＤ８６の発現程度をフローサイトメトリー（MACSQuant VYB flow cytometer，Miltenyi Biotec）で測定した。測定結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（Tree Star、Ashland）を用いて分析した。培養後の自己活性化によって増加するＣＤ８６の発現増加は、ＬＰ１、ＬＰ２及びＬＰ３によって濃度依存的に抑制され、ＬＰ３の方が最も大きい自己活性抑制効果を示した。＊はｎｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を有する。
【0100】
図２５では、脾臓初代樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注し、２４時間培養しながら、スクランブル（scrambled）ペプチドであるＳ－ＬＰ１、Ｓ－ＬＰ２及びＳ－ＬＰ３のペプチドをそれぞれ８００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合には、ＣＤ８６の発現増加が抑制されないことが示された。また、スクランブル（scrambled）ペプチドであるＳ－Ｐ１、Ｓ－Ｐ２及びＳ－Ｐ３のペプチドをそれぞれ６００μｇ／ｍＬの濃度で同時に処理した場合でも、ＣＤ８６の発現は減少しなかった。
【0101】
実施例１４．リンカーペプチドを添加して培養した脾臓樹状細胞におけるＣＤ８６の発現に対する蛍光染色の測定
図２６では、脾臓樹状細胞（２×１０５／ｍＬ）を４８ウェルプレートに分注し、リンカーペプチドをそれぞれ４００μｇ／ｍＬの濃度で添加して２４時間培養した。培養液にＬＰＳを１μｇ／ｍＬ加えて脾臓樹状細胞の活性化を誘導した。培養した細胞は、４％パラホルムアルデヒド固定液に入れた後、室温で２０分間固定した。ＰＥ－結合抗ＣＤ８６抗体（eBioscience）を用いて蛍光染色した後、共焦点顕微鏡（K1 NanoScope、Seoul）で測定した。細胞内アクチンの発現は、ＦＩＴＣ－結合ファロイジン（phalloidin）（eBioscience）で染色し、核染色はＨｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Sigma－Aldrich）で行った。ＣＤ８６抗体およびファロイジン（phalloidin）を０．２％ウシ血清アルブミン溶液に１：４０の割合で希釈して使用した。培養液で脾臓樹状細胞のみを培養した場合は、ＣＤ８６の発現が顕著に増加したが、フィブロネクチンや３種のペプチドを添加した場合に加えて、リンカーペプチドであるＬＰ１、ＬＰ２及びＬＰ３を添加した場合は、ＣＤ８６を発現する細胞がほとんど観察されなかった。ＬＰＳを添加した場合、フィブロネクチンを含む場合はＣＤ８６を発現する細胞がほとんど測定されなかったが、３種のペプチドの組み合わせ（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）やリンカーペプチドを添加して培養した場合は、ＬＰＳの処理によってＣＤ８６を発現する細胞の数が顕著に増加した。
図２６では、脾臓樹状細胞（２×１０５／ｍＬ）を４８ウェルプレートに分注し、リンカーペプチドをそれぞれ４００μｇ／ｍＬの濃度で添加して２４時間培養した。培養液にＬＰＳを１μｇ／ｍＬ加えて脾臓樹状細胞の活性化を誘導した。培養した細胞は、４％パラホルムアルデヒド固定液に入れた後、室温で２０分間固定した。ＰＥ－結合抗ＣＤ８６抗体（eBioscience）を用いて蛍光染色した後、共焦点顕微鏡（K1 NanoScope、Seoul）で測定した。細胞内アクチンの発現は、ＦＩＴＣ－結合ファロイジン（phalloidin）（eBioscience）で染色し、核染色はＨｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Sigma－Aldrich）で行った。ＣＤ８６抗体およびファロイジン（phalloidin）を０．２％ウシ血清アルブミン溶液に１：４０の割合で希釈して使用した。培養液で脾臓樹状細胞のみを培養した場合は、ＣＤ８６の発現が顕著に増加したが、フィブロネクチンや３種のペプチドを添加した場合に加えて、リンカーペプチドであるＬＰ１、ＬＰ２及びＬＰ３を添加した場合は、ＣＤ８６を発現する細胞がほとんど観察されなかった。ＬＰＳを添加した場合、フィブロネクチンを含む場合はＣＤ８６を発現する細胞がほとんど測定されなかったが、３種のペプチドの組み合わせ（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）やリンカーペプチドを添加して培養した場合は、ＬＰＳの処理によってＣＤ８６を発現する細胞の数が顕著に増加した。
【0102】
実施例１５：培養された脾臓樹状細胞からのＴＮＦ－αの分泌に対するリンカーペプチドの影響
図２７では、脾臓初代樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注し、２４時間培養した場合、培養液に分泌されるＴＮＦ－αの濃度測定には、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ systems）を用いた。濃度は、マイクロプレートリーダー（Synergy H1、Biotek）を用いて４５０ｎｍで測定した。樹状細胞のみを培養した場合、ＴＮＦ－αの濃度は７５±１０ｐｇ／ｍＬと測定され、ＬＰＳ刺激によって顕著に増加した。フィブロネクチン、３種のペプチドの組み合わせ（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）、リンカーペプチドであるＬＰ１、ＬＰ２及びＬＰ３を添加した場合には、ＴＮＦ－αの分泌がほとんど起こらなかった。ＬＰＳを処理した場合には、フィブロネクチンと比較して３種のペプチドの組み合わせ（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）と同様にリンカーペプチドが添加されてもＴＮＦ－αの分泌が顕著に増加した。＊はｎｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を有する。
図２７では、脾臓初代樹状細胞を２×１０５／ｍＬで分注し、２４時間培養した場合、培養液に分泌されるＴＮＦ－αの濃度測定には、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ systems）を用いた。濃度は、マイクロプレートリーダー（Synergy H1、Biotek）を用いて４５０ｎｍで測定した。樹状細胞のみを培養した場合、ＴＮＦ－αの濃度は７５±１０ｐｇ／ｍＬと測定され、ＬＰＳ刺激によって顕著に増加した。フィブロネクチン、３種のペプチドの組み合わせ（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）、リンカーペプチドであるＬＰ１、ＬＰ２及びＬＰ３を添加した場合には、ＴＮＦ－αの分泌がほとんど起こらなかった。ＬＰＳを処理した場合には、フィブロネクチンと比較して３種のペプチドの組み合わせ（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）と同様にリンカーペプチドが添加されてもＴＮＦ－αの分泌が顕著に増加した。＊はｎｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性を有する。
【0103】
実施例１６．リンカーペプチドで培養した脾臓樹状細胞によるＴ細胞の活性化の測定
図２８では、培養時、リンカーペプチドによる自己活性化が起こらない脾臓樹状細胞と、これらの細胞をＬＰＳで活性化させた樹状細胞がＴ細胞の増殖を誘導できるかを調べた。脾臓樹状細胞（２×１０６）は、９６ウェルプレートで２４時間自己活性化させるか、またはリンカーペプチドを添加して自己活性を抑制した後、ＬＰＳで処理しないか、またはＬＰＳで２４時間刺激した。樹状細胞は、１０μＭのオボアルブミン（ovalbumin、OVA）ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（InvivoGen、San Diego、California、USA）で１時間培養した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＯＴ－ＩトランスジェニックマウスからＣＤ８ Ｔ細胞分離キット（Miltenyi Biotec）で分離し、１０μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）で１０分間蛍光染色した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞（１×１０５）とＯＶＡペプチドを処理したＤＣｓ（５×１０３）を１:２０の割合で４日間共培養した後、Ｔ細胞の増殖程度をＣＦＳＥ蛍光染色が陰性である細胞の％で測定した。
図２８では、培養時、リンカーペプチドによる自己活性化が起こらない脾臓樹状細胞と、これらの細胞をＬＰＳで活性化させた樹状細胞がＴ細胞の増殖を誘導できるかを調べた。脾臓樹状細胞（２×１０６）は、９６ウェルプレートで２４時間自己活性化させるか、またはリンカーペプチドを添加して自己活性を抑制した後、ＬＰＳで処理しないか、またはＬＰＳで２４時間刺激した。樹状細胞は、１０μＭのオボアルブミン（ovalbumin、OVA）ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（InvivoGen、San Diego、California、USA）で１時間培養した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＯＴ－ＩトランスジェニックマウスからＣＤ８ Ｔ細胞分離キット（Miltenyi Biotec）で分離し、１０μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）で１０分間蛍光染色した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞（１×１０５）とＯＶＡペプチドを処理したＤＣｓ（５×１０３）を１:２０の割合で４日間共培養した後、Ｔ細胞の増殖程度をＣＦＳＥ蛍光染色が陰性である細胞の％で測定した。
【0104】
自己活性化が起こった樹状細胞は、ＬＰＳを処理しなかった場合、Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった。ＬＰＳで刺激させた場合、自己活性化された細胞やフィブロネクチンで培養した樹状細胞は、Ｔ細胞の増殖を誘導する能力が非常に弱かったが、３種のペプチドの組み合わせやリンカーペプチドで培養した樹状細胞は、Ｔ細胞の増殖を顕著に増加させた。
【0105】
図２９では、Ｔ細胞増殖の測定と同様の条件下で脾臓樹状細胞とＴ細胞を４日間共培養した後、培養液に分泌されたインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）とＴＮＦ－αの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。自己活性化された樹状細胞は、ＬＰＳで刺激した後にＴ細胞と共培養した場合、２．５倍程度のインターフェロン－ガンマとＴＮＦ－αを分泌したが、３種のペプチドの組み合わせを添加して培養するか、またはＬＰ１、ＬＰ２、ＬＰ３リンカーペプチドで培養した樹状細胞は、ＬＰＳで刺激した後にＴ細胞と共培養した場合、サイトカインの分泌が４．５倍以上増加した。＊はｎｏｎｅと比較してＰ＜０．０５以下であり、統計的有意性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【配列表】