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特許7652808ＶＨＨを含むＡＤＣ又はＡＯＣと、サポニン又はリガンド－サポニンコンジュゲートとを含む組み合わせ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-03-18
(45)【発行日】2025-03-27
(54)【発明の名称】ＶＨＨを含むＡＤＣ又はＡＯＣと、サポニン又はリガンド－サポニンコンジュゲートとを含む組み合わせ
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20250319BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20250319BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250319BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20250319BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250319BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20250319BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20250319BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20250319BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20250319BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20250319BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250319BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20250319BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20250319BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20250319BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61K47/54
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K39/395 L
A61K39/395 C
A61K31/7088
A61P35/00
A61P37/02
A61P29/00 101
A61P43/00
A61P31/12
A61P3/06
A61P13/02
A61P7/00
A61P1/16
A61K48/00
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N5/09
【請求項の数】
33
(21)【出願番号】P 2022579893
(86)(22)【出願日】2020-07-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-04
(86)【国際出願番号】 EP2020069338
(87)【国際公開番号】W WO2021259506
(87)【国際公開日】2021-12-30
【審査請求日】2023-07-07
(31)【優先権主張番号】2025901
(32)【優先日】2020-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(73)【特許権者】
【識別番号】521271727
【氏名又は名称】サプリーム テクノロジーズ，ベー．フェー．
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＰＲＥＭＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｌａａｎ ９ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ａ１２－１ ３７２１ ＭＡ Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】ポステル，ルーベン
(72)【発明者】
【氏名】ヘアマンス，ガイ
(72)【発明者】
【氏名】フュッヒ，ヘンドリック
【審査官】三上 晶子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００８－５０５９５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Hendrik FUCHS et al.，“Glycosylated Triterpenoids as Endosomal Escape Enhancers in Targeted Tumor Therapies”，Biomedicines，2017年03月29日，Vol. 5, No. 4，p.14，DOI: 10.3390/biomedicines5020014
【文献】Cheenu BHARGAVA et al.，“Targeted dianthin is a powerful toxin to treat pancreatic carcinoma when applied in combination wi，Molecular Oncology，2017年09月15日，Vol. 11, No. 11，p.1527-1543，DOI: 10.1002/1878-0261.12115
【文献】Roger GILABERT-ORIOL et al.，“Immunotoxins Constructed with Ribosome-Inactivating Proteins and their Enhancers: A Lethal Cocktai，Current Pharmaceutical Design，2014年10月22日，Vol. 20, No. 42，p.6584-6643，DOI: 10.2174/1381612820666140826153913
【文献】Xue-Wei CAO et al.，“Analysis of Triterpenoid Saponins Reveals Insights into Structural Features Associated with Potent Protein Drug Enhancement Effects”，Molecular Pharmaceutics，2020年01月17日，DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.9b01158
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－ ４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００－ ４３／００
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ ５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
－少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、前記エフェクター分子が天然、合成、または修飾オリゴヌクレオチドを含む、またはそれらからなる、第１のコンジュゲート；－第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、前記結合分子とサポニンは直接又はリンカーを介して互いに共有結合しているサポニンとを含む第２のコンジュゲートであって、前記サポニンは１２，１３－デヒドロオレアナンのタイプに属するビデスモシドトリテルペングリコシドであり、前記サポニンはグルクロン酸官能基を含む分岐炭水化物側鎖をＣ ３ 位に有し、前記サポニンはデオキシ炭水化物を含む分岐炭水化物側鎖をＣ ２８ 位に有し、前記第２の細胞表面分子は、前記第１の細胞表面分子と同じであるか又は異なり、前記第１の細胞表面分子および前記第２の細胞表面分子が異なる場合、前記第１の細胞表面分子および前記第２の細胞表面分子は、同一の標的細胞に存在する、第２のコンジュゲート；並びに、任意選択により
－薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤
を含む単一の医薬組成物。
【請求項2】
前記ｓｄＡｂは、抗体の重鎖に由来するＶＨドメイン；
抗体の軽鎖に由来するＶＬドメイン；及び
ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源又はＩｇ－ＮＡＲ起源に由来する重鎖抗体（ＨＣＡｂ）に由来するＶＨＨドメイン
のいずれか１つ以上である、請求項１に記載の単一の医薬組成物。
【請求項3】
前記第１のコンジュゲートは、前記少なくとも１つのエフェクター分子に共有結合した少なくとも２つのｓｄＡｂを含む、請求項１または２に記載の単一の医薬組成物。
【請求項4】
前記ｓｄＡｂは、ＨＩＶｇｐ４１、ＣＤ７１、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＤ４４ｖ６、ＦＡＰ、ＥＧＦ－ＩＲ、インテグリン、シンデカン－１、血管インテグリンαＶベータ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣａｎＡｇ、インテグリンαＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソテリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＥＧＦＲ１、ＲＡＮＫＬ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＣＤ１６、ＣＸＣＲ７（ＡＣＫＲ３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）から選択される受容体である第１の細胞表面分子に結合することができ、または、抗ＣＤ７１ ｓｄＡｂ、抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２０ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ１２５ ｓｄＡｂ、抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３０ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３３ ｓｄＡｂ、抗血管インテグリンαｖβ３ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２２ ｓｄＡｂ、抗ＣＥＡ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ４４ｖ６ ｓｄＡｂ、抗ＦＡＰ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、抗ＣａｎＡｇ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５６ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３８ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ６ ｓｄＡｂ、抗ＩＧＦ－１Ｒ ｓｄＡｂ、抗インテグリン ｓｄＡｂ、抗シンデカン－１ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ７９ｂ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ１ ｓｄＡｂ、抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＸＣＲ７ ｓｄＡｂ、及び抗ＨＩＶｇｐ４１から選択される受容体である第１の細胞表面分子に結合することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項5】
前記第１のコンジュゲートは、ＨＥＲ２、ＣＤ７１、ＨＩＶｇｐ４１及び／又はＥＧＦＲに結合することができるｓｄＡｂを含み、または、前記第１のコンジュゲートは、クローン１１Ａ４、クローン１８Ｃ３、クローン２２Ｇ１２、クローンＱ１７若しくはクローンＱ１７－Ｃタグによって産生されるｓｄＡｂから選択されるＨＥＲ２に結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＥＧＦＲ Ｑ８６－Ｃタグによって産生されるＥＧＦＲに結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＣＤ７１ Ｑ５２－Ｃタグによって産生されるＣＤ７１に結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８－Ｃタグによって産生されるＨＩＶｇｐ４１に結合するためのｓｄＡｂ；又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１のいずれか１つのｃＤＮＡによってコードされるｓｄＡｂ；又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６～７２のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項6】
前記エフェクター分子は、ＢＮＡ、ゼノ核酸若しくはｓｉＲＮＡを含むか、又はそれらからなり、及び／又は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、３’－フルオロヘキシトール核酸（ＦＨＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）、又はその誘導体のいずれか１つ以上から選択され、例えば、ＨＳＰ２７タンパク質発現をサイレンシングするためのＢＮＡ、又はアポリポタンパク質Ｂ発現をサイレンシングするためのＢＮＡである、請求項１～５のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項7】
前記エフェクター分子におけるオリゴヌクレオチドは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋型核酸（ＢＮＡＮＣ）、ＢＮＡベースのｓｉＲＮＡ、及びＢＮＡベースのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ－ＡＯＮ）のいずれか１つ以上から選択され、及び／又は、抗ｍｉＲＮＡ、ＢＮＡ－ＡＯＮ、又はｓｉＲＮＡ、例えばＢＮＡベースのｓｉＲＮＡのいずれか１つから選択され、及び／又は、
遺伝子をサイレンシングすることができ（そのような遺伝子を含む細胞中に存在する場合）、前記遺伝子は次の遺伝子：アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、デルタ－アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）、アンチトロンビン３（ＡＴ３）、グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）、補体成分Ｃ５（ＣＣ５）、Ｂ型肝炎ウイルスのＸ遺伝子（ＨＢＶ）、ＨＢＶのＳ遺伝子、α－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のいずれか１つであり、且つ／又は異常なｍｉＲＮＡを標的とすることができ（そのようなｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在する場合）、及び／又は、
ｍＲＮＡを標的とすることができ（そのようなｍＲＮＡを含む細胞中に存在する場合）、前記ｍＲＮＡは次のタンパク質：アポＢ、ＴＴＲ、ＰＣＳＫ９、ＡＬＡＳ１、ＡＴ３、ＧＯ、ＣＣ５、ＨＢＶのＸ遺伝子の発現産物、ＨＢＶのＳ遺伝子の発現産物、ＡＡＴ及びＬＤＨのいずれか１つの発現に関与するか、又はｍｉＲＮＡ機能に拮抗、若しくはｍｉＲＮＡ機能を回復させることができる（このようなｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在する場合）、請求項１～６のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項8】
前記サポニンは、２α－ヒドロキシオレアノール酸；
１６α－ヒドロキシオレアノール酸；
ヘデラゲニン（２３－ヒドロキシオレアノール酸）；
１６α，２３－ジヒドロキシオレアノール酸；
ギプソゲニン；
キラ酸；
プロトエシゲニン２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－２２－アセテート；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１，２２－ビス（２－メチルブタ－２－エノエート）；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－１６，２２－ジアセテート；
ジギトゲニン；
３，１６，２８－トリヒドロキシオレアナン－１２－エン；及び
ギプソゲン酸
から選択されるアグリコンコア構造を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項9】
前記サポニンはキラ酸及びギプソゲニンから選択されるアグリコンコア構造を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項10】
前記サポニンは、前記サポニンのアグリコンコア構造のＣ３原子又はＣ２８原子に結合した第１の糖鎖を含み、且つ／或いは前記サポニンは、前記サポニンのアグリコンコア構造のＣ２８原子に結合した第２の糖鎖を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項11】
前記サポニンは、ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ－、
Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－［Ｇｌｃ－（１→４）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
から選択される第１の糖鎖を含み、
且つ／又は
前記サポニンは、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ａｒａ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ａｒａ－、
Ｘｙｌ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１は４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ２－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ２は４Ｚ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ３－（→４）］－３－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ３は４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→３）－（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→４）－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→２）－［４－ＯＡｃ－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→４）］－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ａｒａ／Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ／Ｆｕｃ－（１→４）－［Ｇｌｃ／Ｇａｌ－（１→２）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ４－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ４は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ５－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ５は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ６－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ６は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ７－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ７は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ８－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ８は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ９－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ９は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１０－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１０は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１１－（→３）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１１は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１２－（→３）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１２は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、及び
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→６）］－Ｇａｌ－、
から選択される第２の糖鎖を含む、請求項１０に記載の単一の医薬組成物。
【請求項12】
前記サポニンは、キラヤ樹皮サポニン、ディプサコシドＢ、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＤ、マクラントイジンＡ、エスクレントシドＡ、フィトラッカゲニン、エシナート、ＡＳ６．２、ＮＰ－００５２３６、ＡＭＡ－１、ＡＭＲ、α－ヘデリン、ＮＰ－０１２６７２、ＮＰ－０１７７７７、ＮＰ－０１７７７８、ＮＰ－０１７７７４、ＮＰ－０１８１１０、ＮＰ－０１７７７２、ＮＰ－０１８１０９、ＮＰ－０１７８８８、ＮＰ－０１７８８９、ＮＰ－０１８１０８、ＳＡ１６４１、ＮＰ－０１７６７４、ＮＰ－０１７８１０、ＡＧ１、ＮＰ－００３８８１、ＮＰ－０１７６７６、ＮＰ－０１７６７７、ＮＰ－０１７７０６、ＮＰ－０１７７０５、ＮＰ－０１７７７３、ＮＰ－０１７７７５、ＳＡ１６５７、ＡＧ２、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１９０４、ＳＯ１８６２、ＱＳ－７、ＱＳ１８６１、ＱＳ－７ａｐｉ、ＱＳ１８６２、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１Ｂ－ｘｙｌ、β－エシン、エシンＩａ、チャ種子サポニンＩ、チャ種子サポニンＪ、アッサムサポニンＦ、ジギトニン、プリムラ酸１及びＡＳ６４Ｒ、または、これらの立体異性体、並びに／或いはこれらの組み合わせから選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項13】
前記第２のコンジュゲートは、前記第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、その結合分子は、前記第２の細胞表面分子に結合するためのタンパク質性リガンド、例えばＥＧＦ若しくはサイトカイン、又は前記第２の細胞表面分子に結合することができる免疫グロブリン若しくは前記免疫グロブリンの少なくとも１つの結合断片若しくは結合ドメインなどのリガンドのいずれか１つ以上であり、または、前記第２の細胞表面分子は、異常細胞上に存在する細胞表面受容体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項14】
前記第２のコンジュゲートは、抗体、又はその結合断片若しくは結合ドメイン、或いは受容体リガンドなどの前記第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、第２の細胞表面受容体は、ＨＩＶｇｐ４１、又は腫瘍細胞特異的受容体である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項15】
前記第２のコンジュゲートは、ＣＤ７１、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＤ４４ｖ６、ＦＡＰ、ＥＧＦ－ＩＲ、インテグリン、シンデカン－１、血管インテグリンαＶベータ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣａｎＡｇ、インテグリンαＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソテリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＥＧＦＲ１、ＲＡＮＫＬ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＣＤ１６、ＣＸＣＲ７（ＡＣＫＲ３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）から選択される細胞表面受容体である、請求項１４に記載の単一の医薬組成物。
【請求項16】
前記第２のコンジュゲートは、前記第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、この結合分子は抗ＣＤ７１抗体ＯＫＴ－９、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ペルツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オレゴボマブ、エドレコロマブ、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ブレンツキシマブ、ゲムツズマブ、ｈｕＭｙ９－６、エタラシズマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ピナツズマブ、モキセツモマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢ４、抗ＣａｎＡｇ抗体ｈｕＣ２４２、抗ＣＤ５６抗体ｈｕＮ９０１、抗ＣＤ３８抗体ＯＫＴ－１０、ダラツムマブ、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、抗ＣＡ６抗体ＤＳ６、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体３Ｂ７、シクスツムマブ、抗インテグリン抗体ＣＮＴＯ ９５、抗シンデカン－１抗体Ｂ－Ｂ４、ポラツズマブ、及び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項17】
前記第２のコンジュゲートが、前記結合分子中のスルフヒドリル基にチオ－エーテル結合を介して共有結合している前記サポニンを含み、リンカーＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）を介した共有結合が前記サポニンのアグリコンコア構造のＣ２３位のアルデヒド基に共有結合し、システインのスルフヒドリル基などの前記結合分子中のスルフヒドリル基に共有結合している、及び／又は、前記サポニンは、前記サポニンのアグリコンコア構造のＣ２３位にアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンのタイプに属するビデスモシドトリテルペンサポニンであり、前記サポニンのアグリコンコア構造のＣ３β－ＯＨ基の第１の糖鎖にグルクロン酸単位を含む前記サポニンを含み、前記サポニン又はその誘導体は前記第１の糖鎖のグルクロン酸単位のカルボキシル基を介して、又は、
前記サポニンは、前記少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造のＣ３β－ＯＨ基の前記第１の糖鎖中にグルクロン酸単位を含むサポニンを含み、このグルクロン酸単位はリンカーに共有結合している、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項18】
前記第２のコンジュゲートは、２つ以上の共有結合したサポニンを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項19】
前記２つ以上の共有結合したサポニンは、少なくとも１つの切断可能なリンカーを介して共有結合している、請求項１８に記載の単一の医薬組成物。
【請求項20】
前記２つ以上の共有結合したサポニンは、少なくとも１つのオリゴマー分子又はポリマー分子を含み、前記２つ以上のサポニンが共有結合している、共有結合サポニンコンジュゲートの一部であり、前記共有結合サポニンコンジュゲートは前記結合分子に共有結合している、請求項１９に記載の単一の医薬組成物。
【請求項21】
前記共有結合サポニンコンジュゲートの前記ポリマー分子又は前記オリゴマー分子は、線状ポリマー、分岐ポリマー及び／若しくは環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、ＤＮＡ、ポリペプチド、ポリ－リシン、ポリ－エチレングリコール、オリゴ－エチレングリコール（ＯＥＧ）、又はこれらのポリマー構造及び／若しくはオリゴマー構造の集合体から選択される、ポリマー構造および／またはオリゴマー構造を含む、請求項２０に記載の単一の医薬組成物。
【請求項22】
前記共有結合サポニンコンジュゲートの前記ポリマー分子又は前記オリゴマー分子は、ポリ－アミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである、デンドロンである、請求項２１に記載の単一の医薬組成物。
【請求項23】
前記共有結合サポニンコンジュゲートの１～８個が前記結合分子に結合しており、前記少なくとも１つの共有結合サポニンコンジュゲートは、デンドロンに基づいている、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項24】
前記サポニンは切断可能なリンカーを介して前記結合分子に共有結合している、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項25】
前記切断可能なリンカーは、酸性条件、還元条件、酵素条件並びに／又は光誘導条件下で切断される、請求項２４に記載の単一の医薬組成物。
【請求項26】
前記切断可能なリンカーは、酸性条件下で切断されるヒドラゾン結合及びヒドラジド結合から選択される切断可能な結合、並びに／又はタンパク質分解を受けやすい結合、並びに／又は還元条件下で切断を受けやすい結合を含む、請求項２５に記載の単一の医薬組成物。
【請求項27】
前記切断可能なリンカーは、酸性条件下、インビボにて切断される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項28】
前記切断可能なリンカーは、ｐＨ≦５．５で切断される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項30】
遺伝子欠損に関連する疾患を治療するための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の単一の医薬組成物。
【請求項31】
前記サポニンはＳＯ１８６１若しくはＱＳ－２１である、請求項３０に記載の単一の医薬組成物。
【請求項32】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内にトランスファーするインビトロの方法であって、ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、請求項１～２８のいずれか一項に記載の第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする請求項１～２８のいずれか一項に記載の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のコンジュゲートとに、インビトロで接触させる工程、
を含み、それにより、前記第１のコンジュゲートの前記細胞外から前記細胞内へのトランスファーを確立する、方法。
【請求項33】
－少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、前記エフェクター分子が天然、合成、または修飾オリゴヌクレオチドを含む、またはそれらからなる、第１のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第１の医薬組成物；及び、
－第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、前記結合分子とサポニンは直接又はリンカーを介して互いに共有結合しているサポニンとを含む第２のコンジュゲートであって、前記サポニンは１２，１３－デヒドロオレアナンのタイプに属するビデスモシドトリテルペングリコシドであり、前記サポニンはグルクロン酸官能基を含む分岐炭水化物側鎖をＣ ３ 位に有し、前記サポニンはデオキシ炭水化物を含む分岐炭水化物側鎖をＣ ２８ 位に有し、前記第２の細胞表面分子は、前記第１の細胞表面分子と同じであるか又は異なり、前記第１の細胞表面分子および前記第２の細胞表面分子が異なる場合、前記第１の細胞表面分子および前記第２の細胞表面分子は、同一の標的細胞に存在し、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第２のコンジュゲートを含む第２の医薬組成物；
を含む２つ以上の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、少なくとも１つのエフェクター分子、及び第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む第１のコンジュゲートを含み、
且つサポニン、その誘導体、又は第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／若しくはその誘導体とを含む第２のコンジュゲートを含み、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドである、医薬組み合わせに関する。本発明はまた、第１のコンジュゲート及びサポニン（誘導体）を含む組成物に関し、又は第１のコンジュゲート、及びサポニン（誘導体）を含む第２のコンジュゲートを含む組成物に関する。さらに、本発明は、薬剤として使用するための、また、癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、アミロイドーシス、酵素欠損に関連する疾患、ウイルス感染症などの感染症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、α１－アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシスの治療又は予防に使用するための、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物に関する。さらに、本発明は、本発明の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内に、好ましくは前記細胞のサイトゾルにインビトロ又はエクスビボでトランスファーする方法に関する。本発明はまた、本発明の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内にトランスファーするためのインビトロ又はエクスビボの方法、及び、第１のコンジュゲートが細胞外から前記細胞内に、例えば前記細胞のエンドソーム、エンドリソソーム又はリソソームにトランスファーされたなら、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子を前記細胞のサイトゾル内にトランスファーするためのインビトロ又はエクスビボの方法に関する。
且つサポニン、その誘導体、又は第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／若しくはその誘導体とを含む第２のコンジュゲートを含み、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドである、医薬組み合わせに関する。本発明はまた、第１のコンジュゲート及びサポニン（誘導体）を含む組成物に関し、又は第１のコンジュゲート、及びサポニン（誘導体）を含む第２のコンジュゲートを含む組成物に関する。さらに、本発明は、薬剤として使用するための、また、癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、アミロイドーシス、酵素欠損に関連する疾患、ウイルス感染症などの感染症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、α１－アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシスの治療又は予防に使用するための、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物に関する。さらに、本発明は、本発明の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内に、好ましくは前記細胞のサイトゾルにインビトロ又はエクスビボでトランスファーする方法に関する。本発明はまた、本発明の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内にトランスファーするためのインビトロ又はエクスビボの方法、及び、第１のコンジュゲートが細胞外から前記細胞内に、例えば前記細胞のエンドソーム、エンドリソソーム又はリソソームにトランスファーされたなら、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子を前記細胞のサイトゾル内にトランスファーするためのインビトロ又はエクスビボの方法に関する。
【背景技術】
【0002】
治療的生物学的活性を有する分子は、多くの場合、理論的には、癌などの疾患の治療のための有効な治療薬として、それを必要とするヒト患者に適用するのに適している。典型的な例は、低分子の生物学的に活性な部分である。しかしながら、臨床で現在使用されている潜在的な薬物様分子及び治療薬の全てとは言わないまでも多くは、多くの欠陥及び欠点の少なくとも１つを抱えている。ヒトの身体に投与される場合、治療活性分子は、治療すべき疾患又は健康問題の根底にある側面に向けられた生物学的活性に加えて、オフターゲット効果を発揮し得る。そのようなオフターゲット効果は、望ましくなく、投与された分子の健康上又は生命を脅かす副作用の誘発のリスクを負う。多くの薬物様化合物及び治療部分が第ＩＩＩ相臨床試験又は第ＩＶ相臨床試験（市販後追跡調査）に失敗する原因となるのは、そのような有害事象の発生である。したがって、低分子治療薬などの薬物分子であって、薬物分子の治療効果が、例えば、（１）疾患を引き起こしている生物学的因子又は生物学的プロセスに対して高い特性を有する、（２）十分に安全である、（３）十分に有効である、（４）病気の細胞に十分に向けられ、病気でない細胞に対するオフターゲット活性は全くないかほとんどない、（５）十分にタイミングよく作用するモードを有する（例えば、投与された薬物分子はある特定の時間枠でヒト患者の標的部位に到達し、ある特定の時間枠の間、標的部位に留まる）、及び／又は（６）とりわけ、患者の体内で十分に長く治療活性が続く薬物分子を提供することが強く求められている。残念なことに、今日まで、上記に概説した有益な特徴の多く又は全てを有する「理想的」治療薬は、すでに長く集中的に研究されてきたにもかかわらず、また個々に直面した困難及び欠点のいくつかの領域で目覚ましい進歩があったにもかかわらず、患者が利用できるまでには至っていない。
【0003】
化学療法は、癌治療の最も重要な治療選択肢の１つである。しかしながら、それは、健康な組織における分裂細胞よりも癌細胞に対して特異的であることはないので、低い治療域と関連することが多い。モノクローナル抗体の発明は、正常細胞を温存しながら、細胞傷害性薬剤を癌細胞へ標的化送達するための機構として、それらの特異的結合特性を利用する可能性を提供した。これは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するための、細胞傷害性エフェクター（ペイロード又は弾頭としても知られる）の抗体への化学的結合によって達成することができる。一般的には、それらの非結合形態において限定された治療指数（毒性用量を有効用量と比較する比率）を有する、エムタンシン（ＤＭ１）などの非常に強力なペイロードが使用される。Ｋａｄｃｙｃｌａとしても知られる、トラスツズマブへのＤＭ１の結合（アドトラスツズマブエムタンシン）は、サルにおいて、ＤＭ１の耐容量を少なくとも２倍増強する。過去数十年間、治療用ＡＤＣを開発するために多大な努力及び投資がなされてきた。しかし、有望な前臨床データにもかかわらず、ＡＤＣを臨床に導入することは依然として困難である。臨床使用が承認された最初のＡＤＣは、２０００年の再発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対するゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ、ＣＤ３３を標的、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗｙｅｔｈ）であった。しかしながら、Ｍｙｌｏｔａｒｇはその安全性プロファイルを含む多くの懸念があり、アメリカ食品医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）の要請により市場から撤退した。Ｍｙｌｏｔａｒｇで治療された患者は、従来の化学療法で治療された患者よりも死亡する割合が高いことが認められた。Ｍｙｌｏｔａｒｇは２０１７年に、より低い推奨用量、化学療法との組み合わせ又は単独での異なるスケジュール、及び新しい患者集団で、再び市場への投入が認められた。これまでに臨床使用のために承認されたＡＤＣはわずか５個であり、その間、約５５個のＡＤＣの臨床開発が中止されている。しかしながら、関心は依然として高く、約８０のＡＤＣが、現在、ほぼ６００の臨床試験で、依然として臨床開発中である。
【0004】
患者が通常耐えられない毒性の高いペイロードを使用する可能性があるにもかかわらず、治療指数（毒性用量を有効用量と比較した比率）の低さが臨床開発において多くのＡＤＣの中止を余儀なくしている主要な問題であり、これは、正常細胞に対するオフターゲット毒性、細胞傷害性薬剤に対する耐性の発生、及び循環血液中の薬物の早期放出などのいくつかの機構によって引き起こされ得る。ＡＤＣのＦＤＡによる系統的レビューは、ほとんどのＡＤＣの毒性プロファイルが使用されるペイロードによって分類され、使用される抗体によっては分類され得ないことを見出し、毒性のほとんどがペイロードの早期放出によって決定されることを示唆している。中止された約５５個のＡＤＣのうち少なくとも２３個は、不十分な治療指数が原因であったと推定される。例えば、トラスツズマブテシリンコンジュゲート（ＡＤＣＴ－５０２、ＨＥＲ－２を標的、ＡＤＣ治療薬）の開発が、おそらくかなりのレベルのＨＥＲ－２を発現する肺組織におけるオンターゲット、オフ組織効果によるであろう、狭い治療指数のために、最近中断された。さらに、第３相試験におけるいくつかのＡＤＣは、プライマリーエンドポイントが欠落しているため中止されている。例えば、新たに診断された膠芽腫を有する患者において試験されたデパツキシズマブマホドチンコンジュゲート（ＡＢＴ－４１４、ＥＧＦＲを標的、ＡｂｂＶｉｅ）、及び白金製剤耐性卵巣癌を有する患者において試験されたミルベツキシマブソラブタンシンコンジュゲート（ＩＭＧＮ８５３、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）を標的、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）の第３相試験は、最近中止され、生存利益を示さなかった。いくつかのＡＤＣの臨床的に使用される用量は、その完全な抗癌活性のために十分ではない可能性があることに留意することが重要である。例えば、アドトラスツズマブエムタンシンは、ヒトにおいて３．６ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを有する。乳癌の前臨床モデルにおいて、アドトラスツズマブエムタンシンは３ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベルで腫瘍退縮を誘導したが、１５ｍｇ／ｋｇでより強力な効力が観察された。これは、臨床的に投与された用量では、アドトラスツズマブエムタンシンはその最大の潜在的抗腫瘍効果を発揮し得ないことを示唆している。
【0005】
ＡＤＣは、抗体、ペイロードなどの細胞傷害性部分、及びリンカーから主に構成される。既存の問題を克服するために、ＡＤＣの構成要素の各々を標的とする、新しいＡＤＣの設計及び開発において、いくつかの新規な戦略が提案され、実行されてきた。例えば、抗体成分に適切な抗原性標的を同定し検証することにより、腫瘍における発現レベルが高く、正常組織では発現がほとんどないか又は全くない抗原、循環するＡＤＣに接近可能である細胞表面に存在する抗原、及び結合後にＡＤＣの細胞への内部移行を可能にする抗原を選択することにより、
また活性の代替機構により、ＡＤＣの溶解度及び薬物抗体比（ＤＡＲ）を増強し、細胞外に化学療法剤を輸送することができるタンパク質によって誘導される耐性を克服するリンカーを設計し最適化する、より多くのペイロードを含めることによってＤＡＲ比を増強し、抗体の均一性及び発展性を改善するために抗体を選択し最適化する。ＡＤＣの技術的発展に加えて、治療指数を最大化するため、例えば、分割投与により投与スケジュールを変更する；生体内分布試験を実施する；患者の選択を最適化するためバイオマーカーを含める、応答シグナルを早期に捉え、応答の持続時間及び深さをモニターする；並びに組み合わせ試験を知らせるなどの、新たな臨床及び翻訳戦略もまた展開されている。
また活性の代替機構により、ＡＤＣの溶解度及び薬物抗体比（ＤＡＲ）を増強し、細胞外に化学療法剤を輸送することができるタンパク質によって誘導される耐性を克服するリンカーを設計し最適化する、より多くのペイロードを含めることによってＤＡＲ比を増強し、抗体の均一性及び発展性を改善するために抗体を選択し最適化する。ＡＤＣの技術的発展に加えて、治療指数を最大化するため、例えば、分割投与により投与スケジュールを変更する；生体内分布試験を実施する；患者の選択を最適化するためバイオマーカーを含める、応答シグナルを早期に捉え、応答の持続時間及び深さをモニターする；並びに組み合わせ試験を知らせるなどの、新たな臨床及び翻訳戦略もまた展開されている。
【0006】
臨床的可能性のあるＡＤＣの例としては、ブレンツキシマブベドチン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスドトクス及びポラツズマブベドチンなどのＡＤＣがあり、これらはリンパ性悪性疾患及び多発性骨髄腫の治療選択肢として評価されている。（悪性）Ｂ細胞上のＣＤ７９Ｂに結合するポラツズマブベドチン、及びＣＤ２２に結合するピナツズマブベドチンが臨床試験で試験されており、その試験では、ＡＤＣそれぞれを、ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体であるリツキシマブを同時投与して組み合わせ、ペイロードは提供されない［Ｂ．Ｙｕ ａｎｄ Ｄ．Ｌｉｕ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１９）１２：９４］。これらの例のようなモノクローナル抗体の組み合わせは、ＡＤＣの前述の所望の特徴の多く又は全てを組み合わせる「魔法の弾丸」に到達するためのさらなるアプローチ及び試みである。
【0007】
一方、過去数十年において、核酸に基づく治療薬が開発中である。治療用核酸は、遺伝子治療、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などのアプローチのために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、並びにＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーに基づくことができる。それらの多くは、ＤＮＡ発現又はＲＮＡ発現の阻害によって作用の同じ基本的原理を共有し、それによって疾患関連異常タンパク質の発現を防止する。遺伝子治療の分野で実施されている臨床試験の数が最も多く、世界中でほぼ２６００件の臨床試験が進行又は完了しているが、第３相試験に入るのはわずか約４％である。その後、ＡＳＯを用いた臨床試験が行われる。ＡＤＣと同様に、多数の技術が検討されているにもかかわらず、治療用核酸は、臨床開発中に、細胞への送達及びオフターゲット効果という２つの主要な問題を共有する。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロック核酸（ＬＮＡ）及び架橋型核酸（ＢＮＡ）などのＡＳＯは、標的遺伝子、特に低分子阻害剤又は中和抗体で標的とすることが困難な遺伝子を特異的に阻害する魅力的な戦略として研究されている。現在、様々なＡＳＯの有効性が、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び筋萎縮性側索硬化症などの多くの神経変性疾患、並びにいくつかの癌の病期において研究されている。潜在的な治療剤としてＡＳＯを適用するためには、標的細胞及び組織の細胞質及び／又は核へそれらを送達する安全で且つ有効な方法が必要である。ＡＳＯの臨床的関連性が実証されているが、インビトロ及びインビボの両方での非効率的な細胞への取り込みがＡＳＯの有効性を限定し、治療薬開発の障壁となっている。細胞への取り込みは用量の２％未満であり、有効且つ持続的な転帰を得るには低すぎる活性部位でのＡＳＯ濃度がもたらされ得る。したがって、投与量を増加する必要があるが、これはオフターゲット効果を誘導する。最も一般的な副作用は、補体カスケードの活性化、凝固カスケードの阻害、及び免疫系のトール様受容体媒介性刺激である。
【0008】
化学療法薬は最も一般的には低分子であるが、それらの有効性は、重度のオフターゲット副毒性、並びにそれらの低い溶解性、迅速なクリアランス、及び限られた腫瘍への曝露によって妨げられる。ポリマー－薬物コンジュゲート（ＰＤＣ）などの足場－低分子薬コンジュゲートは、薬理学的活性を有する高分子コンストラクトであり、これは担体足場（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））に結合した低分子薬の１つ以上の分子を含む。
【0009】
このようなコンジュゲート原理は、多くの注目を集め、数十年にわたって研究されてきた。前臨床又は臨床開発中の低分子薬のコンジュゲートの大部分は、腫瘍学的適応症のためのものである。しかし、２０１４年に非腫瘍学的適応症である慢性痛患者におけるオピオイド誘発性便秘症に対し、癌に関係しない最新の唯一の薬剤が承認された（Ｍｏｖａｎｔｉｋ、オピオイドアンタゴニストナロキソンのＰＥＧオリゴマーコンジュゲート、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）。薬物－足場コンジュゲートのヒト対象の治療への適用の変換は、これまでのところ、臨床的効果をほとんど提供していない。例えば、ＰＫ１（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマードキソルビシン；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｆｉｚｅｒによる開発）はマウスモデルにおいて固形腫瘍及び白血病の両方で大きな抗癌活性を示し、腫瘍学的適応について臨床研究下にあった。ヒトにおいて非特異的毒性の有意な減少及び薬物動態の改善を示したにもかかわらず、患者における抗癌効果の改善がわずかであることが判明し、その結果、ＰＫ１のさらなる開発は中止された。
【0010】
足場－低分子薬物コンジュゲートの失敗の原因は、少なくとも部分的には腫瘍部位でのその乏しい蓄積にある。例えば、マウスモデルにおいては、ＰＫ１は、健康な組織（肝臓、腎臓、肺、脾臓、及び心臓）よりも腫瘍において４５～２５０倍高い蓄積を示したが、臨床試験においては、腫瘍における蓄積は患者の少数で観察されただけであった。
【0011】
前述の問題に対する潜在的な解決策は、リポソームなどの薬物送達のためのナノ粒子系の適用である。リポソームは１つ以上のリン脂質二重層からなる球形の小胞であり、これはリン脂質が水中に分散されると自然に形成される。リン脂質の両親媒性はそれに自己組織化、乳化及び湿潤性の特性を提供し、これらの特性は、新しい薬物及び新しい薬物送達システムの設計に使用することができる。リポソーム送達系に封入された薬物は、薬物の直接投与に勝るいくつかの利点、例えば、薬物動態及び薬力学に対する改善及び制御、組織標的化特性、毒性の減少、並びに薬物活性の増強をもたらし得る。そのような成功の例は、低分子化学療法剤ドキソルビシンのリポソーム封入形態（Ｄｏｘｉｌ：ドキソルビシンのペグ化リポソーム封入形態；Ｍｙｏｃｅｔ：非ペグ化リポソームドキソルビシン）であり、これらは臨床使用に承認されている。
【0012】
したがって、所望される場合に非全身使用に適用可能な抗腫瘍療法などの薬物療法を可能にする解決策を見出することが依然として求められており、この場合、薬物は、例えば、許容可能な安全性プロファイル、わずかなオフターゲット活性、十分な有効性、患者の身体からの十分に低いクリアランス率、十分に広い治療域などを有する。
【0013】
欧州特許第１６２３７１５Ｂ１号明細書には、サポニンと組み合わせた、標的細胞特異的結合分子に結合した薬理学的に活性な薬剤を含む組成物が記載されており、標的細胞特異的結合分子は完全長モノクローナル免疫グロブリンＧ型抗体である。薬理学的に活性な薬剤は、例えば毒素である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明の第１の態様は、以下を含む医薬組み合わせに関する：
－少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合している、第１のコンジュゲート；
－サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／又はその誘導体とを含む第２のコンジュゲートであって、結合分子とサポニン又はその誘導体は直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドであり、第２の細胞表面分子は、第１の細胞表面分子と同じであるか又は第１の細胞表面分子とは異なる、サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２のコンジュゲート；並びに、任意選択により
－薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤。
－少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合している、第１のコンジュゲート；
－サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／又はその誘導体とを含む第２のコンジュゲートであって、結合分子とサポニン又はその誘導体は直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドであり、第２の細胞表面分子は、第１の細胞表面分子と同じであるか又は第１の細胞表面分子とは異なる、サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２のコンジュゲート；並びに、任意選択により
－薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤。
【0015】
一実施形態は、以下を含む、少なくとも２つ、好ましくは２つの医薬組成物の形態の本発明の医薬組み合わせである：
－第１のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第１の医薬組成物；並びに
－サポニン及び／又はその誘導体及び／又は第２のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第２の医薬組成物。
－第１のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第１の医薬組成物；並びに
－サポニン及び／又はその誘導体及び／又は第２のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第２の医薬組成物。
【0016】
一実施形態は、第１のコンジュゲート、並びに
・サポニン；
・サポニン誘導体；及び
・第２のコンジュゲート
の少なくとも１つ、好ましくは１つを含み、
且つ任意選択により、薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む、単一の医薬組成物の形態の本発明の医薬組み合わせである。
・サポニン；
・サポニン誘導体；及び
・第２のコンジュゲート
の少なくとも１つ、好ましくは１つを含み、
且つ任意選択により、薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む、単一の医薬組成物の形態の本発明の医薬組み合わせである。
【0017】
本発明の第２の態様は、医薬として使用するための、本発明の医薬組み合わせに関する。
【0018】
本発明の第３の態様は、癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、アミロイドーシス、酵素欠損に関連する疾患、ウイルス感染症などの感染症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、α１－アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシスの治療又は予防に使用するための、本発明の医薬組み合わせに関する。
【0019】
本発明の第４の態様は、本発明の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内に、好ましくは前記細胞のサイトゾルにトランスファーするインビトロ又はエクスビボの方法であって、
ａ）本発明による第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、好ましくは、肝細胞、ウイルス感染細胞、自己免疫細胞及び腫瘍細胞などの異常細胞から選択される工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする本発明の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）本発明のサポニン又はサポニン誘導体を提供するか、或いは、工程ａ）で提供される細胞が本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する場合、本発明の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のサポニン、サポニン誘導体、及びコンジュゲートの任意の１つ以上とに、インビトロ又はエクスビボで接触させる工程、
を含み、それにより、第１のコンジュゲートの細胞外から前記細胞内への、好ましくは前記細胞のサイトゾル内へのトランスファーを確立する、方法に関する。
ａ）本発明による第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、好ましくは、肝細胞、ウイルス感染細胞、自己免疫細胞及び腫瘍細胞などの異常細胞から選択される工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする本発明の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）本発明のサポニン又はサポニン誘導体を提供するか、或いは、工程ａ）で提供される細胞が本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する場合、本発明の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のサポニン、サポニン誘導体、及びコンジュゲートの任意の１つ以上とに、インビトロ又はエクスビボで接触させる工程、
を含み、それにより、第１のコンジュゲートの細胞外から前記細胞内への、好ましくは前記細胞のサイトゾル内へのトランスファーを確立する、方法に関する。
【0020】
定義
「タンパク質性の」という用語はその通常の科学的意味を有し、本明細書ではタンパク質様である分子を指し、その分子が、タンパク質に特徴的な物理化学的特性をある程度有しており、タンパク質の性質を有し、タンパク質に関連し、タンパク質を含有し、タンパク質に関係し、タンパク質に類似し、又はタンパク質であることを意味する。「タンパク質性の」という用語は、例えば「タンパク質性分子」において使用される場合、タンパク質に類似するか又はタンパク質である分子の少なくとも一部の存在を指し、「タンパク質」は少なくとも２残基長のアミノ酸残基の鎖を含むと理解されるべきであり、したがって、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、並びにタンパク質又はタンパク質ドメインの集合体を含む。タンパク質性分子において、少なくとも２つのアミノ酸残基は、例えば、ペプチド結合などのアミド結合によって連結される。タンパク質性分子において、アミノ酸残基は、天然アミノ酸残基及び／又は修飾された天然アミノ酸残基などの人工アミノ酸残基である。好ましい実施形態では、タンパク質性分子は、少なくとも２個のアミノ酸残基、好ましくは２～約２，０００個のアミノ酸残基を含む分子である。一実施形態では、タンパク質性分子は、２～２０個（ペプチドに典型的）のアミノ酸を含む分子である。一実施形態では、タンパク質性分子は、２１～１，０００個のアミノ酸を含む分子である（ポリペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ＥＧＦなどの受容体に対するリガンドに典型的）。好ましくは、アミノ酸残基は、（典型的には）ペプチド結合によって連結される。本発明によれば、前記アミノ酸残基は、（修飾された）（非）天然アミノ酸残基であるか、又はそれを含む。
「タンパク質性の」という用語はその通常の科学的意味を有し、本明細書ではタンパク質様である分子を指し、その分子が、タンパク質に特徴的な物理化学的特性をある程度有しており、タンパク質の性質を有し、タンパク質に関連し、タンパク質を含有し、タンパク質に関係し、タンパク質に類似し、又はタンパク質であることを意味する。「タンパク質性の」という用語は、例えば「タンパク質性分子」において使用される場合、タンパク質に類似するか又はタンパク質である分子の少なくとも一部の存在を指し、「タンパク質」は少なくとも２残基長のアミノ酸残基の鎖を含むと理解されるべきであり、したがって、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、並びにタンパク質又はタンパク質ドメインの集合体を含む。タンパク質性分子において、少なくとも２つのアミノ酸残基は、例えば、ペプチド結合などのアミド結合によって連結される。タンパク質性分子において、アミノ酸残基は、天然アミノ酸残基及び／又は修飾された天然アミノ酸残基などの人工アミノ酸残基である。好ましい実施形態では、タンパク質性分子は、少なくとも２個のアミノ酸残基、好ましくは２～約２，０００個のアミノ酸残基を含む分子である。一実施形態では、タンパク質性分子は、２～２０個（ペプチドに典型的）のアミノ酸を含む分子である。一実施形態では、タンパク質性分子は、２１～１，０００個のアミノ酸を含む分子である（ポリペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ＥＧＦなどの受容体に対するリガンドに典型的）。好ましくは、アミノ酸残基は、（典型的には）ペプチド結合によって連結される。本発明によれば、前記アミノ酸残基は、（修飾された）（非）天然アミノ酸残基であるか、又はそれを含む。
【0021】
「エフェクター分子」、又は「エフェクター部分」という用語は、例えば共有結合コンジュゲートの一部としてエフェクター分子を指す場合、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、例えば、標的分子であるタンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖類、（リン）脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、酵素の任意の１つ以上に選択的に結合し、そのような１つ以上の標的分子の生物学的活性を調節することができる分子を指す。エフェクター分子は、例えば、薬物分子などの小分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡ、ゼノ核酸若しくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、酵素、ペプチド、タンパク質、又はこれらの任意の組み合わせの任意の１つ以上から選択される分子である。したがって、例えば、エフェクター分子又はエフェクター部分は、薬物分子などの小分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡ、ゼノ核酸若しくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、酵素、ペプチド、タンパク質、又はこれらの任意の組み合わせの任意の１つ以上から選択される分子又は部分であり、標的分子であるタンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖類、（リン）脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、酵素の任意の１つ以上に選択的に結合することができ、標的分子に結合すると、そのような１つ以上の標的分子の生物学的活性を調節する。典型的には、エフェクター分子は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞内、例えば前記細胞のサイトゾル内で、生物学的効果を発揮することができる。したがって、典型的なエフェクター分子は、薬物分子、プラスミドＤＮＡ、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に含まれる毒素などの毒素、抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）に含まれるｓｉＲＮＡ、ＢＮＡ、核酸などのオリゴヌクレオチドである。例えば、エフェクター分子は、（細胞内）酵素活性、遺伝子発現、又は細胞シグナル伝達を増加又は減少させることができるリガンドとして作用することができる分子である。本発明の文脈において、エフェクター分子又はエフェクター部分は、エフェクター分子がコンジュゲートの一部である場合、サポニンではなく、ｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子結合分子ではない。
【0022】
「修飾（された）サポニン」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、変性サポニンを提供するために化学修飾に供される前の非誘導体化サポニン中の、アルデヒド基、カルボキシル基、アセテート基、及び／又はアセチル基のいずれかが存在していた位置に、１つ以上の化学修飾を有するサポニン、すなわちサポニン誘導体を指す。例えば、修飾サポニンは、修飾サポニンのベースのサポニン中のアルデヒド基、カルボキシル基、アセテート基及び／又はアセチル基の任意の１つ以上を化学修飾することによって提供される。すなわち、サポニンが提供され、アルデヒド基、カルボキシル基、アセテート基及び／又はアセチル基のいずれかが化学修飾され、修飾サポニンが提供される。例えば、修飾サポニンを提供するために修飾されるサポニンは、天然に存在するサポニンである。典型的には、修飾サポニンは合成サポニンであり、典型的には、修飾サポニンは天然サポニンの修飾であり、したがって、天然サポニンに由来するが、修飾サポニンは天然の対応物を有していても有していなくてもよい合成サポニンに由来することもできる。典型的には、修飾サポニンは天然の対応物を有さない。すなわち、修飾サポニンは、例えば、植物又は樹木により天然に生成されることはない。
【0023】
「アグリコンコア構造」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、１つ又は２つの炭水化物アンテナ又は糖鎖（グリカン）が結合していないサポニンのアグリコンコア又は略してアグリコンを指す。例えば、キラル酸は、ＳＯ１８６１、ＱＳ－７及びＱＳ２１のアグリコンコア構造である。典型的には、サポニンのグリカンは、単糖、又は直鎖又は分岐グリカンなどのオリゴ糖である。
【0024】
「糖鎖」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、グリカン、炭水化物アンテナ、単一の糖部分（単糖）、又は複数の糖部分（オリゴ糖、多糖）を含む鎖のいずれかを指す。糖鎖は糖部分のみから構成され得、又は、例えばＱＳ－２１中に存在するような、４Ｅ－メトキシケイ皮酸、４Ｚ－メトキシケイ皮酸、及び５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸のいずれか１つなどのさらなる部分を含むこともできる。
【0025】
「化学修飾された」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、第２の化学基又は第２の化学部分が提供されるように、第１の化学基又は第１の化学部分の化学修飾を指す。例は、カルボニル基の－（Ｈ）Ｃ－ＯＨ基への化学修飾、アセテート基のヒドロキシル基への化学修飾、化学反応によりそのアルデヒド基にＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）部分が結合したサポニンの提供などである。
【0026】
「化学修飾されたアルデヒド基」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、元のアルデヒド基の新しい化学基による置換をもたらすサポニンのアルデヒド基を含む化学反応によって得られる化学反応生成物を指す。例えば、サポニンの最初のアルデヒド基からの－（Ｈ）Ｃ－ＯＨ基の形成。
【0027】
「化学修飾されたカルボキシル基」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、元のアルデヒド基の新しい化学基による置換をもたらすグルクロン酸部分のカルボキシル基などのサポニンのカルボキシル基、及びさらなる分子を含む化学反応によって得られる化学反応生成物を指す。例えば、サポニンと、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）及び１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）のいずれか１つとの間のコンジュゲートの形成（サポニンのグルクロン酸のカルボキシル基を含む）。
【0028】
糖鎖の名称の文脈における「Ａｐｉ／Ｘｙｌ－」、又は「Ａｐｉ－又はＸｙｌ－」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、アピオース（Ａｐｉ）部分を含むか、又はキシロース（Ｘｙｌ）部分を含む糖鎖を指す。
【0029】
「修飾サポニンがベースとするサポニン」という用語はその通常の科学的意味を有し、本明細書では、修飾サポニンを提供するために修飾されたサポニンを指す。典型的には、修飾サポニンのベースのサポニンは天然に存在するサポニンであり、これが修飾サポニンを提供するための化学修飾に供される。
【0030】
「サポニンをベースとする修飾サポニン」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、修飾サポニンが提供されるように化学修飾工程に供されたサポニンを指し、修飾サポニンが作られたサポニンは、典型的には、天然に存在するサポニンである。
【0031】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、特に、一本鎖分子又は二本鎖分子として提示される、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、合成核酸、例えば、ＢＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短い又は低分子の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを包含する核酸の任意の天然又は合成ストリングを指す。
【0032】
「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」という用語はその通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、１つ又は複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ラクダ科動物ＶＨなどの抗体と、ヒト患者などの対象の細胞と接触させた場合に治療効果を発揮することができる任意の分子、例えば、活性医薬成分、毒素、オリゴヌクレオチド、酵素、低分子薬物化合物などとの任意のコンジュゲートを指す。
【0033】
「抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート」又は「ＡＯＣ」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、１つ又は複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ラクダ科動物ＶＨなどの抗体と、ヒト患者などの対象の細胞と接触した場合に治療効果を発揮することができる任意のオリゴヌクレオチド分子、例えば、一本鎖分子又は二本鎖分子として提示される、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、合成核酸、例えば、ＢＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短い又は低分子の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど例えば、ＢＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを包含する核酸の任意の天然又は合成ストリングから選択されるオリゴヌクレオチドとの任意のコンジュゲートを指す。
【0034】
「架橋型核酸」若しくは略して「ＢＮＡ」又は「ロック核酸」若しくは略して「ＬＮＡ」という用語は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、修飾ＲＮＡヌクレオチドを指す。ＢＮＡはまた、「拘束ＲＮＡ分子」又は「アクセス制限ＲＮＡ分子」とも呼ばれる。ＢＮＡモノマーは、「固定化」Ｃ３’－ｅｎｄｏ糖パッカリングを有する５員、６員又は７員の架橋構造を含有することができる。架橋は、リボースの２’，４’位に合成的に組み込まれ、２’，４’－ＢＮＡモノマーを与える。ＢＮＡモノマーは、当該技術分野で知られる標準的なホスホロアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドポリマー構造に組み込むことができる。ＢＮＡは、高い結合親和性及び安定性を有する構造的に剛直なオリゴヌクレオチドである。
【0035】
リンカーを含む抗体サポニンコンジュゲートなどにおいて使用される用語「Ｓ」は、エンドソーム、エンドリソソーム、及びヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のリソソームにおいて、したがってわずかに酸性の条件下（ｐＨ＜６．６、例えばｐＨ４．０～５．５）でインタクトのままである「安定なリンカー」を示す。
【0036】
リンカーを含む抗体サポニンコンジュゲートなどにおいて使用される用語「Ｌ」は、エンドソーム、エンドリソソーム、及びヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のリソソームのわずかに酸性の条件下（ｐＨ＜６．６、例えばｐＨ４．０～５．５）で切断される「不安定なリンカー」を示す。
【0037】
本明細書及び特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、例えば、類似の要素、組成物、組成物中の成分、又は方法の個々の工程を区別するためであって、必ずしも連続的又は時系列的順序を説明するために使用されるわけではない。用語は適切な状況下で交換可能であり、本発明の実施形態は別段の指定がない限り、本明細書に記載又は例示されている以外の他の順序で動作させることができる。
【0038】
本明細書に記載される本発明の実施形態は、別段の指定がない限り、組み合わせ且つ協働して動作させることができる。
【0039】
さらに、様々な実施形態は、「好ましい」又は「例えば（ｅ．ｇ．）」又は「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」又は「特に」などと呼ばれるが、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明が実施され得る例示的な方法として解釈されるべきである。
【0040】
特許請求の範囲で使用される「含む」という用語は、例えば、その後に列挙される要素又は方法の工程又は組成物の成分に限定されるものと解釈されるべきではなく、他の要素又は他の方法の工程又は特定の組成物における他の成分を排除するものではない。言及された特徴、整数値、（方法）工程又は成分の存在を特定するものとして解釈される必要があるが、１つ又は複数の他の特徴、整数値、工程若しくは成分、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「工程Ａ及びＢを含む方法」という表現の範囲は、工程Ａ及びＢのみからなる方法に限定されるべきではなく、むしろ本発明に関して、方法の列挙した工程がＡ及びＢであるに過ぎず、さらに、特許請求の範囲は、それらの方法の工程の等価物を含むと解釈されるべきである。したがって、「成分Ａ及びＢを含む組成物」という表現の範囲は、成分Ａ及びＢのみからなる組成物に限定されるべきではなく、むしろ、本発明に関して、組成物の列挙した成分がＡ及びＢであるに過ぎず、さらに、特許請求の範囲は、それらの成分の等価物を含むと解釈されるべきである。
【0041】
さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素又は成分に対する言及は、文脈が１つ又は１つのみの要素又は成分が存在することを明確に要求しない限り、２つ以上の要素又は成分が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【0042】
「サポニナムアルブム（Ｓａｐｏｎｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）」という用語は、その通常の意味を有し、本明細書では、ジプソフィラ・パニクラータ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）及びジプソフィラ・アロスティ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ａｒｏｓｔｉｉ）由来のサポニンを含有するＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成されるサポニンの混合物を指し、ＳＡ１６５７及び主にＳＡ１６４１を含有する。
【0043】
「キラヤサポニン」という用語はその通常の意味を有し、本明細書では、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）のサポニン画分、したがって、他の全てのＱＳサポニンの供給源を指し、主にＱＳ－１８及びＱＳ－２１を含有する。
【0044】
「ＱＳ－２１」又は「ＱＳ２１」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ（約６３％）、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ（約３２％）、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ（約３．３％）、及びＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ（約１．７％）の混合物を指す。
【0045】
同様に、「ＱＳ－２１Ａ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ（約６５％）及びＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ（約３５％）の混合物を指す。
【0046】
同様に、「ＱＳ－２１Ｂ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ（約６５％）及びＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ（約３５％）の混合物を指す。
【0047】
「Ｑｕｉｌ－Ａ」という用語は、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の市販の半精製抽出物を指し、様々な量の５０を超える異なるサポニンを含有し、その多くは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ１８、及びＱＳ－２１において見出されるＣ－３β－ＯＨ基にトリテルペン－三糖部分構造Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡａｔを組み込んでいる。Ｑｕｉｌ－Ａに見出されるサポニンは、ｖａｎ Ｓｅｔｔｅｎ（１９９５）の表２に列挙されている［Ｄｉｒｋ Ｃ．ｖａｎ Ｓｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｒｉｔ ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｒｋｅｎ，Ｇｉｊｓｂｅｒｔ Ｚｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｉｄｅｏｎ Ｆ．Ａ．Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏ－ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｃｔｉｖｅ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｑｕｉｌ Ａ， ＲＡＰＩＤ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ，ＶＯＬ．９，６６０－６６６（１９９５）］。Ｑｕｉｌ－Ａ、そしてキラヤサポニンもまた、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンの画分であり、いずれも、大部分が重複する内容を有する多種多様な異なるサポニンを含有する。この２つの画分は、その２つの画分が異なる精製手順によって得られるので、それらの特定の組成が異なっている。
【0048】
用語「ＱＳ１８６１」及び用語「ＱＳ１８６２」は、ＱＳ－７及びＱＳ－７ ａｐｉを指す。ＱＳ１８６１は１８６１ダルトンの分子量を有し、ＱＳ１８６２は１８６２ダルトンの分子量を有する。ＱＳ１８６２は、Ｆｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１９）の表１の第２８行に記載されている［Ｊｕｌｉａｎｅ Ｄｅｉｓｅ Ｆｌｅｃｋ，Ａｎｄｒｅｓａ Ｈｅｅｍａｎｎ Ｂｅｔｔｉ，Ｆｒａｎｃｉｎｉ Ｐｅｒｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｅｄｕａｒｄｏ Ａｒｔｕｒ Ｔｒｏｉａｎ，Ｃｒｉｓｔｉｎａ Ｏｌｉｖａｒｏ，Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｅ Ｇａｓｐａｒｉｎ Ｖｅｒｚａ，Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ ａｎｄ Ｑｕｉｌｌａｊａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ：Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１９，２４，１７１；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２４０１０１７１］。記載されている構造は、ＱＳ－７のａｐｉバリアントＱＳ１８６２である。分子量はグルクロン酸にプロトンを含む形式質量であるので、分子量は１８６２ダルトンである。中性ｐＨでは、分子は脱プロトン化される。陰イオンモードで質量分析法により測定した場合、測定質量は１８６１ダルトンである。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1A】標的２成分アプローチ（１標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ別々に、標的細胞への送達及び内在化のためにＶＨＨ又は抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされる。１）ｍＡｂ－毒素及びＶＨＨ－ＳＯ１８６１は細胞表面受容体に結合し、２）両コンジュゲートの受容体媒介エンドサイトーシスが起こり（コンジュゲートの受容体への結合に続いてコンジュゲート／受容体複合体の内在化が起こる）、３）低エンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が活性化してエンドリソソームエスケープを可能にし、４）細胞質への毒素の放出が起こり、細胞死を誘導する。
【図1B】標的２成分アプローチ（２標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ別々に、標的細胞への送達及び内在化のためにＶＨＨ又は抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされる。１）ｍＡｂ－毒素及びＶＨＨ－ＳＯ１８６１は対応する細胞表面受容体に結合し、２）両コンジュゲートの受容体媒介エンドサイトーシスが起こり（コンジュゲートの受容体への結合に続いてコンジュゲート／受容体複合体の内在化が起こる）、３）低エンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が活性化してエンドリソソームエスケープを可能にし、４）細胞質への毒素の放出が起こり、細胞死を誘導する。
【図1C】標的２成分アプローチ（２標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ別々に、標的細胞への送達及び内在化のためにＶＨＨにコンジュゲートされる。１）ＶＨＨ－毒素及びＶＨＨ－ＳＯ１８６１は対応する細胞表面受容体に結合し、２）両コンジュゲートの受容体媒介エンドサイトーシスが起こり（コンジュゲートの受容体への結合に続いてコンジュゲート／受容体複合体の内在化が起こる）、３）低エンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が活性化してエンドリソソームエスケープを可能にし、４）細胞質への毒素の放出が起こり、細胞死を誘導する。
【図1D】標的２成分アプローチ（２標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ別々に、標的細胞への送達及び内在化のためにＶＨＨ又はｍＡｂにコンジュゲートされる。１）ＶＨＨ－毒素及びｍＡｂ－ＳＯ１８６１は対応する細胞表面受容体に結合し、２）両コンジュゲートの受容体媒介エンドサイトーシスが起こり（コンジュゲートの受容体への結合に続いてコンジュゲート／受容体複合体の内在化が起こる）、３）低エンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が活性化してエンドリソソームエスケープを可能にし、４）細胞質への毒素の放出が起こり、細胞死を誘導する。
【図1E】標的２成分アプローチ（１ターゲット）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ別々に、標的細胞への送達及び内在化のためにＶＨＨ又は抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされる。１）ＶＨＨ－毒素及びｍＡｂ－ＳＯ１８６１は細胞表面受容体に結合し、２）両コンジュゲートの受容体媒介エンドサイトーシスが起こり（コンジュゲートの受容体への結合に続いてコンジュゲート／受容体複合体の内在化が起こる）、３）低エンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が活性化してエンドリソソームエスケープを可能にし、４）細胞質への毒素の放出が起こり、細胞死を誘導する。
【図2A】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＶＨＨ（ＨＥＲ２）－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４）又は１０ｐＭ ＣＤ７１マブ－サポリン（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図2B】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＶＨＨ（ＨＥＲ２）－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４）又は１０ｐＭ ＣＤ７１マブ－サポリン（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図3A】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するトラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４）又はＣＤ７１－サポリン（ＤＡＲ４）＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図3B】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するトラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４）又はＣＤ７１－サポリン（ＤＡＲ４）＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図4A】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＶＨＨ（ＨＥＲ２）－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図4B】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＶＨＨ（ＨＥＲ２）－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図5A】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１））の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図5B】ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１））の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図6A】Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＝／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図6B】Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＝／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図7A】Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＝／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図7B】Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＝／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ処置による細胞キリング（ＭＴＳ）アッセイ）。
【図8A】１標的２成分（ＥＧＦＲ高発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋）及びＣａＳＫｉ（ＥＧＦＲ＋＋）におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００～４００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のセツキシマブコンジュゲートは同じＥＧＦＲ受容体に対して競合するので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、治療組み合わせと比較してより効率的である。両セツキシマブコンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図８Ｂに示されている凡例は、図８Ａのグラフにも関連している。備考：図８Ｄに示されている凡例は、図８Ｃのグラフにも関連している。
【図8B】１標的２成分（ＥＧＦＲ高発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋）及びＣａＳＫｉ（ＥＧＦＲ＋＋）におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００～４００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のセツキシマブコンジュゲートは同じＥＧＦＲ受容体に対して競合するので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、治療組み合わせと比較してより効率的である。両セツキシマブコンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図８Ｂに示されている凡例は、図８Ａのグラフにも関連している。備考：図８Ｄに示されている凡例は、図８Ｃのグラフにも関連している。
【図8C】１標的２成分（ＥＧＦＲ高発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋）及びＣａＳＫｉ（ＥＧＦＲ＋＋）におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００～４００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のセツキシマブコンジュゲートは同じＥＧＦＲ受容体に対して競合するので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、治療組み合わせと比較してより効率的である。両セツキシマブコンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図８Ｂに示されている凡例は、図８Ａのグラフにも関連している。備考：図８Ｄに示されている凡例は、図８Ｃのグラフにも関連している。
【図8D】１標的２成分（ＥＧＦＲ高発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋）及びＣａＳＫｉ（ＥＧＦＲ＋＋）におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００～４００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のセツキシマブコンジュゲートは同じＥＧＦＲ受容体に対して競合するので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、治療組み合わせと比較してより効率的である。両セツキシマブコンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図８Ｂに示されている凡例は、図８Ａのグラフにも関連している。備考：図８Ｄに示されている凡例は、図８Ｃのグラフにも関連している。
【図9A】１標的２成分（ＥＧＦＲ非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は細胞死滅を誘導する。備考：図９Ｂに示されている凡例は、図９Ａのグラフにも関連している。備考：図９Ｄに示されている凡例は、図９Ｃのグラフにも関連している。
【図9B】１標的２成分（ＥＧＦＲ非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は細胞死滅を誘導する。備考：図９Ｂに示されている凡例は、図９Ａのグラフにも関連している。備考：図９Ｄに示されている凡例は、図９Ｃのグラフにも関連している。
【図9C】１標的２成分（ＥＧＦＲ非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は細胞死滅を誘導する。備考：図９Ｂに示されている凡例は、図９Ａのグラフにも関連している。備考：図９Ｄに示されている凡例は、図９Ｃのグラフにも関連している。
【図9D】１標的２成分（ＥＧＦＲ非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞におけるＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は細胞死滅を誘導する。備考：図９Ｂに示されている凡例は、図９Ａのグラフにも関連している。備考：図９Ｄに示されている凡例は、図９Ｃのグラフにも関連している。
【図10A】１標的２成分（ＨＥＲ２高発現）。治療組み合わせによるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋＋＋）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ）６７３ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１０００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、９，４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、１０ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のトラスツズマブコンジュゲートは同じＨＥＲ２受容体に対して競合するので、１０７５ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、治療組み合わせと比較してより効率的である。両トラスツズマブコンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図10B】１標的２成分（ＨＥＲ２高発現）。治療組み合わせによるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋＋＋）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ）６７３ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１０００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、９，４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、１０ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のトラスツズマブコンジュゲートは同じＨＥＲ２受容体に対して競合するので、１０７５ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、治療組み合わせと比較してより効率的である。両トラスツズマブコンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図11A】１標的２成分（ＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。備考：図１１Ｂに示されている凡例は、図１１Ａのグラフにも関連している。備考：図１１Ｄに示されている凡例は、図１１Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図11B】１標的２成分（ＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。備考：図１１Ｂに示されている凡例は、図１１Ａのグラフにも関連している。備考：図１１Ｄに示されている凡例は、図１１Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図11C】１標的２成分（ＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。備考：図１１Ｂに示されている凡例は、図１１Ａのグラフにも関連している。備考：図１１Ｄに示されている凡例は、図１１Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図11D】１標的２成分（ＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。備考：図１１Ｂに示されている凡例は、図１１Ａのグラフにも関連している。備考：図１１Ｄに示されている凡例は、図１１Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図12A】２標的２成分（ＥＧＦＲ高発現及びＨＥＲ２低発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＣａｓｋｉ（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のコンジュゲートは同じ受容体に対して競合しないので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、治療組み合わせ、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと比較して、同等の細胞死滅効率を有する。両コンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図１２Ｂに示されている凡例は、図１２Ａのグラフにも関連している。備考：図１２Ｄに示されている凡例は、図１２Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図12B】２標的２成分（ＥＧＦＲ高発現及びＨＥＲ２低発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＣａｓｋｉ（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のコンジュゲートは同じ受容体に対して競合しないので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、治療組み合わせ、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと比較して、同等の細胞死滅効率を有する。両コンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図１２Ｂに示されている凡例は、図１２Ａのグラフにも関連している。備考：図１２Ｄに示されている凡例は、図１２Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図12C】２標的２成分（ＥＧＦＲ高発現及びＨＥＲ２低発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＣａｓｋｉ（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のコンジュゲートは同じ受容体に対して競合しないので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、治療組み合わせ、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと比較して、同等の細胞死滅効率を有する。両コンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図１２Ｂに示されている凡例は、図１２Ａのグラフにも関連している。備考：図１２Ｄに示されている凡例は、図１２Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図12D】２標的２成分（ＥＧＦＲ高発現及びＨＥＲ２低発現）。治療組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＣａｓｋｉ（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、１００倍低いことを示す。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に、細胞を死滅させる。両方のコンジュゲートは同じ受容体に対して競合しないので、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、治療組み合わせ、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと比較して、同等の細胞死滅効率を有する。両コンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。備考：図１２Ｂに示されている凡例は、図１２Ａのグラフにも関連している。備考：図１２Ｄに示されている凡例は、図１２Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図13A】２標的２成分（ＥＧＦＲ低発現及びＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を増強しないが、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなる。備考：図１３Ｂに示されている凡例は、図１３Ａのグラフにも関連している。備考：図１３Ｄに示されている凡例は、図１３Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図13B】２標的２成分（ＥＧＦＲ低発現及びＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を増強しないが、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなる。備考：図１３Ｂに示されている凡例は、図１３Ａのグラフにも関連している。備考：図１３Ｄに示されている凡例は、図１３Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図13C】２標的２成分（ＥＧＦＲ低発現及びＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を増強しないが、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなる。備考：図１３Ｂに示されている凡例は、図１３Ａのグラフにも関連している。備考：図１３Ｄに示されている凡例は、図１３Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図13D】２標的２成分（ＥＧＦＲ低発現及びＨＥＲ２非発現／低発現）。治療組み合わせによる、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭの固定濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を増強しないが、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。低いＥＧＦＲ受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなる。備考：図１３Ｂに示されている凡例は、図１３Ａのグラフにも関連している。備考：図１３Ｄに示されている凡例は、図１３Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図14A】２標的２成分（ＨＥＲ２高発現及びＥＧＦＲ低発現）。治療組み合わせによるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ）１．５ｐＭの固定濃度のＥＧＦジアンチンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、ＥＧＦジアンチンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、４００倍低いことを示す。Ｂ）、９，４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたＥＧＦジアンチンのタイトレーションは、１０ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋ＥＧジアンチンとは対照的に、細胞を死滅させることができる。両方のコンジュゲートは同じ受容体に対して競合しないので、１０７５ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンは、治療組み合わせ、９．４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンと比較して、同等の細胞死滅効率を有する。両コンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図14B】２標的２成分（ＨＥＲ２高発現及びＥＧＦＲ低発現）。治療組み合わせによるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ）１．５ｐＭの固定濃度のＥＧＦジアンチンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、ＥＧＦジアンチンによる細胞死滅を誘導するために必要とする濃度が、コンジュゲートされたＳＯ１８６１では、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１と比較して、４００倍低いことを示す。Ｂ）、９，４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたＥＧＦジアンチンのタイトレーションは、１０ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋ＥＧジアンチンとは対照的に、細胞を死滅させることができる。両方のコンジュゲートは同じ受容体に対して競合しないので、１０７５ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンは、治療組み合わせ、９．４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンと比較して、同等の細胞死滅効率を有する。両コンジュゲートの同時標的送達のみが、いずれかのコンジュゲートを単独で用いる単独療法とは対照的に、効率的な細胞死滅をもたらす。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図15A】２標的２成分（ＨＥＲ２低発現及びＥＧＦＲ低発現又は高発現）。本発明の治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。セツキシマブ－サポリンの送達のための高いＥＧＦＲ受容体発現レベル（Ｄ）でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の存在下でその効力を変化させず、細胞死滅活性のボトルネックがＨＥＲ２の低すぎる発現レベルにあり、エンドソームエスケープのスイッチを入れる標的細胞内部のＳＯ１８６１が不十分になることにつながることを示している。備考：図１５Ｂに示されている凡例は、図１５Ａのグラフにも関連している。備考：図１５Ｄに示されている凡例は、図１５Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図15B】２標的２成分（ＨＥＲ２低発現及びＥＧＦＲ低発現又は高発現）。本発明の治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。セツキシマブ－サポリンの送達のための高いＥＧＦＲ受容体発現レベル（Ｄ）でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の存在下でその効力を変化させず、細胞死滅活性のボトルネックがＨＥＲ２の低すぎる発現レベルにあり、エンドソームエスケープのスイッチを入れる標的細胞内部のＳＯ１８６１が不十分になることにつながることを示している。備考：図１５Ｂに示されている凡例は、図１５Ａのグラフにも関連している。備考：図１５Ｄに示されている凡例は、図１５Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図15C】２標的２成分（ＨＥＲ２低発現及びＥＧＦＲ低発現又は高発現）。本発明の治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。セツキシマブ－サポリンの送達のための高いＥＧＦＲ受容体発現レベル（Ｄ）でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の存在下でその効力を変化させず、細胞死滅活性のボトルネックがＨＥＲ２の低すぎる発現レベルにあり、エンドソームエスケープのスイッチを入れる標的細胞内部のＳＯ１８６１が不十分になることにつながることを示している。備考：図１５Ｂに示されている凡例は、図１５Ａのグラフにも関連している。備考：図１５Ｄに示されている凡例は、図１５Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図15D】２標的２成分（ＨＥＲ２低発現及びＥＧＦＲ低発現又は高発現）。本発明の治療組み合わせによる、ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）細胞及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）５ｐＭの固定濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１のタイトレーションは、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリンのタイトレーションは、細胞死滅を誘導することができない。低いＨＥＲ２受容体発現は、抗体媒介送達によって十分なＳＯ１８６１を送達する妨げとなり、一方、１５００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。セツキシマブ－サポリンの送達のための高いＥＧＦＲ受容体発現レベル（Ｄ）でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の存在下でその効力を変化させず、細胞死滅活性のボトルネックがＨＥＲ２の低すぎる発現レベルにあり、エンドソームエスケープのスイッチを入れる標的細胞内部のＳＯ１８６１が不十分になることにつながることを示している。備考：図１５Ｂに示されている凡例は、図１５Ａのグラフにも関連している。備考：図１５Ｄに示されている凡例は、図１５Ｃのグラフにも関連している。ＳＰＴ００１はＳＯ１８６１である。
【図16】２標的２成分対Ｔ－ＤＭ１。高いＥＧＦＲ発現及び低いＨＥＲ２発現を有する細胞（Ａ４３１）は、治療組み合わせで効率的に死滅するが、Ｔ－ＤＭ１はそのような低い毒素濃度では有効ではない。Ｔ－ＤＭ１は、１抗体あたり約３．５個のＤＭ１毒素分子を有するトラスツズマブ－エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））である。
【図17A】トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。備考：図１７Ｃに示されている凡例は、図１７Ａ及び１７Ｂの曲線にも関連している。
【図17B】トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。備考：図１７Ｃに示されている凡例は、図１７Ａ及び１７Ｂの曲線にも関連している。
【図17C】トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。備考：図１７Ｃに示されている凡例は、図１７Ａ及び１７Ｂの曲線にも関連している。
【図17D】トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。備考：図１７Ｃに示されている凡例は、図１７Ａ及び１７Ｂの曲線にも関連している。
【図17E】トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。備考：図１７Ｃに示されている凡例は、図１７Ａ及び１７Ｂの曲線にも関連している。
【図18】１Ｔ２Ｃインビボ活性。Ａ４３１担癌マウスにおける５０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の１Ｔ２Ｃ組み合わせは、対照と比較して、強力な腫瘍標的化遺伝子サイレンシングを明らかにする。
【図19】１Ｔ２Ｃインビボ活性。ＰＤＸ腫瘍マウスモデル（高ＨＥＲ２発現）における４０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋０．０２／０．０３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリンの１Ｔ２Ｃ組み合わせは、有効な腫瘍増殖阻害を示す。
【図20】Ａ４３１担癌マウスモデルで試験した２Ｔ２成分系は、腫瘍退縮を明らかにする。
【図21】Ａ４３１担癌マウスモデルで試験した２Ｔ２成分系は、腫瘍退縮及び腫瘍根絶を明らかにする。
【図22A】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＣａＳＫｉ細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ｃａｓｋｉ細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例は図Ｃ及びＤで同じである。
【図22B】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＣａＳＫｉ細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ｃａｓｋｉ細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例は図Ｃ及びＤで同じである。
【図22C】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＣａＳＫｉ細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ｃａｓｋｉ細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例は図Ｃ及びＤで同じである。
【図22D】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＣａＳＫｉ細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ｃａｓｋｉ細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例は図Ｃ及びＤで同じである。
【図23A】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによる、ＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＨｅＬａ細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ａ２０５８細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図23B】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによる、ＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＨｅＬａ細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ａ２０５８細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図23C】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによる、ＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＨｅＬａ細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ａ２０５８細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図23D】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによる、ＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２を標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＨｅＬａ細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７のタイトレーション＋固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）Ａ２０５８細胞に対するトラスツズマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図24A】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｂ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ ＳＫＢＲ３細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン、及び対照。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞に対するＥＧＦジアンチンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。
【図24B】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｂ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ ＳＫＢＲ３細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン、及び対照。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞に対するＥＧＦジアンチンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。
【図25A】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＥＧＦジアンチンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図25B】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＥＧＦジアンチンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図25C】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＥＧＦジアンチンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図25D】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＥＧＦジアンチンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＣ及びＤで同じである。
【図26A】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｂ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ）ＳＫＢＲ３細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン、及び対照。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞に対するセツキシマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。
【図26B】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｂ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ）ＳＫＢＲ３細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン、及び対照。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞に対するセツキシマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。
【図27A】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するセツキシマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例はＣ及びＤで同じである。
【図27B】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するセツキシマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例はＣ及びＤで同じである。
【図27C】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するセツキシマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例はＣ及びＤで同じである。
【図27D】２標的２成分。本発明の治療組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲを標的とした細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４のタイトレーション＋固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン、及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するセツキシマブ－サポリンのタイトレーション＋固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、及び対照。凡例及び／又は軸はＡ及びＢで同じであり、凡例はＣ及びＤで同じである。
【発明を実施するための形態】
【0050】
本発明の第１の目的は、治療域が増加した改善されたＡＤＣ及びＡＯＣを提供すること、並びに、例えば、標的細胞の外部から内部への送達が考慮される場合、又はより詳細には前記標的細胞のサイトゾルにおけるエフェクター分子の送達が考慮される場合、エフェクター分子の有効量又は有効用量の送達のための改善された治療組み合わせ又は改善された医薬組成物を提供することである。本発明の第２の目的は、例えば標的腫瘍細胞に対する、エフェクター分子及びリガンド（腫瘍細胞などの標的異常細胞において、及びその中でエフェクター分子を標的化するための細胞表面分子結合分子）を含むコンジュゲート（の有効量）による、治療すべき疾患に罹患している（ヒト）患者の改善された治療方法を提供すること、すなわち、標的腫瘍細胞のサイトゾルに送達されるエフェクター分子を含むＡＤＣ又はＡＯＣの治療域を改善することである。
【0051】
本発明の目的は、抗癌療法などの治療に使用するための、エフェクター分子活性増強分子と改善されたＡＤＣ又はＡＯＣとの組み合わせを提供することである。本発明の目的はまた、そのような改善されたＡＤＣ又はＡＯＣを含み、且つエフェクター分子活性増強分子を含む、治療用組成物、又は例えば２つの治療用組成物の治療用組み合わせを提供することである。そのようなエフェクター分子活性増強分子は、エフェクター分子が標的細胞内の例えば、好ましくはエンドソーム、エンドリソソーム及び／又はリソソームに送達され、例えばその後、好ましくは前記細胞のサイトゾルに送達されると、前記エフェクター分子の生物学的効果を改善することができる。この標的細胞は、エフェクター分子の分子標的を含む。前記の提供されたエフェクター分子活性増強分子が、それを必要とする（ヒト）患者に投与され、患者が標的細胞を有する場合、前記患者は、エフェクター分子の有効用量に達するために現在必要とされている用量よりも好ましくは低用量のエフェクター分子で高い治療効果、又は少なくとも十分な効果を経験する。このように、エフェクター分子、例えば、ＡＤＣ又はＡＯＣなどのコンジュゲートの一部であるエフェクター分子の治療域は効果的に広がる。
【0052】
生物活性分子（例えば、エフェクター分子）が作用するためには、分子は、例えば、血清中で、細胞表面の外で、又は細胞若しくは細胞小器官の内部で、その標的とそれと係合することができなければならない。ほとんど全てのタンパク質ベースの標的化毒素の活性部分は例えば、その標的調節効果を媒介するためには、標的細胞のサイトゾルに入らなければならない。多くの場合、毒素は、（１）ターゲティング部分の内部移行が不十分で、細胞の外側に結合されたままであるか、（２）内部移行後に細胞表面に戻されるか、又は（３）エンドリソソームに輸送され、そこで分解されるため、効果がないままである。これらの基本的な問題は何十年も知られており、過去数十年の間に５００を超える標的毒素が調べられてきたが、問題はまだ解決されておらず、重度の毒性の警告ラベルが付されているにもかかわらず、２つの抗体標的タンパク質毒素のみが市場に受け入れられている。モキセツモマブパスドトクス－ｔｄｆｋ（ＬＵＭＯＸＩＴＩ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＬＰ）は、今日までにＦＤＡによって再発性又は難治性の有毛細胞白血病用に承認されている。このように承認されたＡＤＣの他のものは、Ｅｌｚｏｎｒｉｓ、Ｏｎｔａｋである。
【0053】
これらの問題を克服するために、毒素を小胞体内の生合成経路の内因性細胞膜輸送複合体に向け直すためのアプローチ、及びエンドソームの膜完全性、すなわち細胞内のエンドサイトーシス経路の区画を破壊又は弱め、したがってエンドソームエスケープを促進するための技術を含む多くの戦略が記載されている。これは、リソソーム向性アミン、カルボン酸イオノフォア、カルシウムチャネルアンタゴニスト、ウイルス、細菌、植物、動物、ヒト及び合成起源の様々な細胞透過性ペプチド、他の有機分子及び光誘導技術の使用を含む。標的化毒素の効力は、典型的には、細胞培養では１００倍又は１０００倍、例外的なケースでは１００万倍よりも多く増加したが、エンドソームエスケープエンハンサーを他の物質と同時投与する必要性は、さらなる副作用、標的特異性の喪失、治療域を決定する困難さ、及び細胞型依存性変動を含む新たな問題を抱える。
【0054】
物理化学的技術を含む全ての戦略は、膜と多かれ少なかれ直接的に相互作用し、本質的に小さい化学分子、二次代謝産物、ペプチド及びタンパク質を含むエンハンサー分子を必要とする。これら全ての物質の共通の特徴は、それら自体は標的細胞特異的ではなく、標的化された毒素以外の動態で分布することである。これは、現在のアプローチの１つの主要な欠点である。
【0055】
本発明のさらなる目的は、ｓｄＡｂをベースとしたＡＤＣ及びｓｄＡｂをベースとしたＡＯＣのための改善されたエンハンサーを提供すること、並びに、例えば、標的細胞の外部から内部への送達が考慮される場合、又はより詳細には前記標的細胞のサイトゾルにおけるエフェクター分子の送達が考慮される場合、エフェクター分子の有効量の送達のための改善された治療組み合わせ又は改善された医薬組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、例えば標的腫瘍細胞に対する、エフェクター分子及びリガンド、すなわちｓｄＡｂを含むコンジュゲートによる、治療すべき疾患に罹患している（ヒト）患者の改善された治療方法を提供すること、すなわち、標的腫瘍細胞のサイトゾルに送達されるエフェクター分子を含み、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣの治療域を改善することである。
【0056】
本発明の目的は、抗癌療法などの治療に使用するためのエフェクター分子増強分子、エフェクター分子の分子標的を含む標的細胞内部に送達されると、エフェクター分子の生物学的効果を改善することができる分子を含む、治療組成物又は例えば２つの治療組成物の治療組み合わせを提供することであり、この提供される分子は、それを必要とし、標的細胞を有する（ヒト）患者に投与されたとき、エフェクター分子の有効用量に達するために現在必要とされる用量よりも低い用量のエフェクター分子で、改善された治療効果又は十分な効果を経験する。このように、エフェクター分子、例えば、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はｓｄＡｂを含むＡＯＣなどのコンジュゲートの一部であるエフェクター分子の治療域は効果的に広がる。
【0057】
特定の実施形態に関して本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。本発明をいくつかの実施形態に関して説明してきたが、当業者であれば、本明細書を読み、図面及びグラフを検討することにより、その代替、変更、変形及び均等物は明らかになるであろう。本発明は、図示した実施形態に決して限定されない。添付の特許請求の範囲によって定義される範囲から逸脱することなく、変更を加えることができる。
【0058】
本発明者らは、抗体薬物コンジュゲート又は抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートなどの本発明の第１のコンジュゲートの治療域が、そのようなＡＤＣ又はＡＯＣが好ましくは、細胞表面分子に対しＡＤＣ又はＡＯＣを標的化するための細胞表面分子結合ｓｄＡｂを含み、それを必要とするヒト癌患者又は腫瘍保有哺乳動物などの同じ対象に、少なくとも１つの共有結合したサポニンを含む第２のコンジュゲートが投与される場合に、増加することを発明し、確立した（ＶＨＨを含むコンジュゲートについては、ｍＡｂ又はｓｄＡｂなどの抗体を含むＡＤＣ又はＡＯＣと組み合わされた場合の、ＩｇＧ又はＶＨＨなどの抗体に共有結合したサポニンの効果の一連のインビトロ及びインビボの腫瘍細胞モデルの例についての実施例の項の、例えば表Ａ５～Ａ７の例及び例えば図４～７を参照し、また、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むコンジュゲートについては、図２、３、８～１３、１６、１６、１８～２３、２６及び２７を参照されたい。サポニンはＩｇＧ又はＶＨＨなどの抗体とコンジュゲートされ、タンパク質毒素などのエフェクター分子又はＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドはＩｇＧ又はｓｄＡｂなどの第２の抗体とコンジュゲートされる。本発明者らは、本発明のサポニンを細胞表面分子に結合するためのリガンド、例えば完全長のインタクトなＩｇＧなどの抗体、又はＶＨＨなどのｓｄＡｂなどの抗体とコンジュゲートさせることにより、細胞表面に細胞表面分子を露出する標的細胞の細胞表面にサポニンを細胞特異的に送達し、その後、細胞、例えば内部に、例えば細胞エンドソーム、エンドリソソーム、リソソーム、及び最終的には細胞サイトゾルに（遊離した）サポニンを送達するコンジュゲート（好ましいのは、サポニンを含むコンジュゲートが細胞エンドソーム、エンドリソソーム、リソソームに入り、結合が切断される（例えば、コンジュゲートが細胞表面分子、すなわち受容体に結合すると、受容体媒介エンドサイトーシスによって入る）と、遊離サポニンが存在するように、サポニンが、ヒト腫瘍細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム、エンドリソソーム、リソソームにおいて切断可能な結合によって共有結合している、サポニン含有コンジュゲートである）が提供されることを、初めて確立し、決定した。そのような細胞標的サポニンコンジュゲートの例は、例えば、以下の実施例の項に概説されるように、サポニン－ＶＨＨコンジュゲート及びサポニン－Ｍａｂコンジュゲートについて図２～２７に提供される。サポニンは、ＥＧＦ、Ｈｅｒ２を標的とするＶＨＨ又はＩｇＧ、ＥＧＦＲを標的とするＩｇＧなどのリガンドにコンジュゲートされる。
【0059】
上記の目的の少なくとも１つは、共有結合したビデスモシドトリテルペングリコシド（トリテルペンサポニン）を含む第２のコンジュゲートなどの、細胞表面分子に結合するｓｄＡｂ、及び本発明のエフェクター分子増強分子を含む、改善されたＡＤＣ、又は改善されたＡＯＣの組み合わせを提供することによって達成される。
【0060】
本発明の第１の態様は、以下を含む医薬組み合わせに関する：
ｏ少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合している、第１のコンジュゲート；
ｏサポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／又はその誘導体とを含む第２のコンジュゲートであって、結合分子とサポニン又はその誘導体は直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドであり、第２の細胞表面分子は、第１の細胞表面分子と同じであるか又は第１の細胞表面分子とは異なる、サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２のコンジュゲート；並びに、任意選択的に
ｏ薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤。
ｏ少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合している、第１のコンジュゲート；
ｏサポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／又はその誘導体とを含む第２のコンジュゲートであって、結合分子とサポニン又はその誘導体は直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドであり、第２の細胞表面分子は、第１の細胞表面分子と同じであるか又は第１の細胞表面分子とは異なる、サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２のコンジュゲート；並びに、任意選択的に
ｏ薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤。
【0061】
本発明者らは、細胞内のエフェクター分子の効果を考慮すると、ｓｄＡｂを含む第１のコンジュゲートの一部であるエフェクター分子が、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンなどのサポニンの影響下で高効率で細胞内に送達されることを立証した。より具体的には、本発明者らは、細胞内のエフェクター分子の効果を考慮すると、ｓｄＡｂを含む第１のコンジュゲートの一部であるエフェクター分子が、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンなどの本発明のサポニンの影響下で高効率で細胞のサイトゾル内に送達されることを立証した。すなわち、例えば第２のコンジュゲートの一部としての、サポニンの非存在下では、腫瘍細胞の準最適用量の第１のコンジュゲートとの接触によって、細胞内のエフェクター分子の活性をもたらさない（標的細胞はエフェクター分子の生物学的活性によって効率的に死滅しない）。しかしながら、標的腫瘍細胞を、エフェクター分子を含む第１のコンジュゲートと遊離サポニン及び／又はサポニンを含む第２のコンジュゲートの両方と接触させると、効率的な腫瘍細胞死滅が確定する。
【0062】
本発明をより詳細に説明するために、本発明における細胞の物質取り込みプロセス及び使用される用語を最初に説明する。小胞出芽による細胞外物質の細胞内への取り込みは、エンドサイトーシスと呼ばれる。前記小胞出芽は、（１）サイトゾルのタンパク質クラスリンによって媒介される受容体依存性リガンドの取り込み、（２）コレステロール結合タンパク質カベオリンによって媒介される脂質ラフトの取り込み、（３）非特異的流体の取り込み（ピノサイトーシス）、又は（４）非特異的粒子の取り込み（ファゴサイトーシス）によって特徴付けることができる。エンドサイトーシスの全てのタイプは、エンドサイトーシス経路と呼ばれる小胞輸送及び物質選別の以下の細胞プロセスに至る。エンドサイトーシス経路は複雑であり、完全にはわかっていない。初期には、オルガネラが新たに形成され、エンドサイトーシス経路に沿って次のオルガネラに成熟すると考えられていた。今日では、エンドサイトーシス経路が、小胞輸送によって連結される安定なコンパートメントを含むとの仮説が立てられている。コンパートメントは、細胞に必須の特定の一連の機能に特化した、複雑で多機能の膜オルガネラである。小胞は組成が単純な一過性のオルガネラであると考えられ、既存のコンパートメントから出芽することによって新たに形成される膜封入容器と定義される。コンパートメントとは対照的に、小胞は、生理学的に不可逆な一連の生化学的変化である成熟を受けることができる。初期のエンドソーム及び後期のエンドソームは、エンドサイトーシス経路における安定なコンパートメントであり、一方、一次エンドサイトーシス小胞、ファゴソーム、多小胞体（エンドソーム担体小胞とも呼ばれる）、分泌顆粒、及びさらにリソソームは小胞である。エンドサイトーシス小胞は原形質膜で生じ、クラスリン被覆ピットから最も顕著に生じるが、最初に、およそｐＨ６．５の主要な選別コンパ－メントである初期エンドソームと融合する。内在化したカーゴ及び膜の大部分は、リサイクリング小胞（リサイクル経路）を介して原形質膜にリサイクルされる。分解されるべき成分は、多小胞体によって酸性の後期エンドソーム（ｐＨ６未満）に輸送される。リソソームは成熟リソソーム酵素を貯蔵し、必要に応じてそれらを後期エンドソームコンパートメントに送達することができる小胞である。生じたオルガネラは、ハイブリッドオルガネラ又はエンドリソソームと呼ばれる。リソソームは、リソソーム再形成と呼ばれる過程でハイブリッド細胞オルガネラから出芽する。後期エンドソーム、リソソーム、及びハイブリッドオルガネラは極めて動的なオルガネラであり、それらの区別は多くの場合困難である。エンドサイトーシスされた分子の分解は、エンドリソソームの内部で起こる。エンドソームエスケープは、エンドサイトーシス経路の、好ましくはクラスリン媒介エンドサイトーシスの、又はリサイクル経路の、あらゆる種類のコンパートメント又は小胞の内腔からのサイトゾルへの物質の能動的又は受動的放出である。したがって、エンドソームエスケープには、以下に限定されないが、エンドソーム、エンドリソソーム又はリソソーム（それらの中間オルガネラ及びハイブリッドオルガネラを含む）からの放出が含まれる。サイトゾルに入った後、前記物質は、核などの他の細胞単位に移動する可能性がある。本発明の文脈におけるグリコシド分子（サポニン）は、特にエンドソームエスケープを促進することによって、エフェクター分子の効果を増強することができる化合物である。グリコシド分子はエンドサイトーシス経路及びリサイクル経路のコンパートメント及び小胞の膜と相互作用して、前記エフェクター分子を漏出しやすくし、その結果、エンドソームエスケープが増強される。
【0063】
「エフェクター分子の効果を改善する」という用語は、サポニンがエフェクター分子の機能的効力（例えば、毒素又は薬物の治療指数；生物工学的プロセスにおける修飾因子の代謝効率；細胞培養研究実験における遺伝子のトランスフェクション効率）を、好ましくはその標的への関与を可能にするか又は改善することによって増加させることを意味する。抗原特異的免疫応答の加速、長期化、又は増強は、好ましくは含まれない。治療効力には、投与量の低下及び／又は副作用の減少による治療効果の増大が含まれるが、これらに限定されない。「エフェクター分子の効果を改善する」はまた、効果の欠如のために使用することができなかった（例えば、エフェクター分子であるとは知られていなかった）エフェクター分子が、細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂを含む本発明の第１のコンジュゲートの一部として、且つ遊離サポニン（誘導体）と組み合わせて、及び／又は共有結合したサポニン（誘導体）を含む本発明の第２のコンジュゲートと組み合わせて使用した場合に有効になることを意味し得る。有益であるか又は所望され、本発明により提供されるような、例えば、本発明の第１のコンジュゲートによる細胞標的ｓｄＡｂを含むＡＯＣ、又は本発明の第１のコンジュゲートによる細胞標的ｓｄＡｂを含むＡＯＣの一部としてのエフェクター分子と、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンとの組み合わせに起因し得る他の効果はいかなるものも、「改善された効果」であると考えられる。本発明の文脈において、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンなどのサポニンは、本発明による細胞表面分子結合ｓｄＡｂを含むＡＯＣ又は細胞表面分子結合ｓｄＡを含むＡＤＣなどの第１の別個のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の機能的効力の「エンハンサー」である。
【0064】
本発明に至るまでの、例えば本発明のサポニンなどの、細胞表面分子標的コンジュゲートの一部ではない遊離グリコシドによる標的毒素増強の１つの主な欠点は、標的毒素が受容体媒介エンドサイトーシスによって内部移行される（標的毒素が受容体に結合した後、標的毒素コンジュゲート／受容体複合体が内部移行する）一方、グリコシドが原形質膜を通って受動的に拡散し、おそらくコレステロールとの相互作用によってエンドソーム膜に到達することである。原理的には、本発明の第２のコンジュゲートにおけるサポニンなどのグリコシドは、遊離した非コンジュゲート形態である場合、任意の細胞に侵入することができ、標的でない細胞（オフターゲット細胞）にも進入することができ、標的毒素を有効に放出するための標的細胞におけるエンハンサーの利用効率が低くなり、非標的細胞における副作用の可能性が生じる。１つの主な問題は、標的化毒素及びグリコシドの侵入が異なる動態で進行し、これらの動態が細胞（株）間、及び組織間で異なり、その結果、２つの物質（例えば、遊離サポニンを有する、細胞表面分子に結合するためのｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣ）を適用するための正しい時間差が、腫瘍（細胞（株））間で大きく変化し得ることである。さらに、生物においては、これらの物質の遊離、吸収、分布、代謝及び排出も異なる。さらに、非標的細胞によるグリコシドの非特異的取り込みは、これらの細胞において望ましくない効果を誘導し得る。これは、例えば、リソソームに送達されるべきであった化合物のサイトゾル送達、抗原提示の障害などであり得る。グリコシド及び標的薬物の非標的投与もまた、薬物開発において問題となり得、関連当局（例えば、ＦＤＡ又はＥＭＡ）による製造認可を妨げるか、又は少なくとも遅延させ得る。本発明の文脈における標的毒素又は標的薬物とは、毒素又は薬物が標的細胞の膜結合分子（細胞表面分子）を特異的に標的としている、例えば、標的細胞の細胞膜上の構造（結合部位、エピトープ）を特異的に認識するｓｄＡｂなどの抗体に結合した毒素又は薬物を意味する。
【0065】
したがって、エンハンサーが標的細胞のエンドサイトーシス経路の酸性コンパートメント内で有効濃度で利用可能であり、毒素との相乗効果を示すために、エフェクター分子と同じ経路によって、例えば標的リガンドによって、標的細胞にグリコシド（本発明のサポニン）を導くことは非常に有用である。したがって、本発明は、標的化リガンド（結合分子）によって、エフェクター分子とエンドソームエスケープエンハンサー（すなわち、本発明のサポニン）の両方を、標的細胞のエンドサイトーシス経路の酸性コンパートメントに向け直すための新規な方法を提供する。本発明の第２のコンジュゲート中にサポニンを含むターゲティングリガンドは、本発明のエフェクター分子を含む第１のコンジュゲートに含まれるターゲティングリガンド、すなわちｓｄＡｂと同じであっても、異なっていてもよい。ターゲティングリガンドが異なる場合、両方のターゲティングリガンドが、異なるが腫瘍細胞などの同じ標的細胞上に存在する第１及び第２の細胞表面分子に結合することが理解される。例えば、サポニン部分を含む本発明の第２のコンジュゲートは、ＥＧＦＲ又はＣＤ７１又はＨＥＲ２に結合することができ、例えば、エフェクター部分及び細胞表面分子結合ｓｄＡｂを含む第１のコンジュゲートは、ＥＧＦＲ又はＣＤ７１又はＨＥＲ２に結合することができ、本発明の第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、同じ細胞受容体又は異なる細胞受容体に結合する。
【0066】
本発明者らは、細胞内のエフェクター分子の効果を考慮すると、ｓｄＡｂなどのターゲティングリガンドを含む第１のコンジュゲートの一部であるエフェクター分子が、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンの影響下で高効率で細胞内に送達されることを立証した。驚くべきことに、ＶＨＨなどの相対的に小さいサイズのｓｄＡｂにもかかわらず、エフェクター分子を含み、そのようなｓｄＡｂを含む本発明の第１のコンジュゲートの標的細胞表面受容体への結合は、エフェクター分子及びｓｄＡｂが第１のコンジュゲートに含まれるときになお起こっており、ｓｄＡｂは、ＶＨＨであることが好ましい。驚くべきことに、ＶＨＨなどの相対的に小さいサイズのｓｄＡｂにもかかわらず、サポニンを含み、ｓｄＡｂを含む本発明の第２のコンジュゲートの標的細胞表面受容体への結合は、サポニン及びｓｄＡｂが第２のコンジュゲートに含まれるときになお起こっており、ｓｄＡｂは、ＶＨＨであることが好ましい。本発明の第１のコンジュゲートを形成するＶＨＨなどのｓｄＡｂへのエフェクター分子の結合は、細胞表面分子に結合するＶＨＨの能力を考慮すると、例えば立体障害をもたらさない。本発明の第２のコンジュゲートを形成するＶＨＨなどのｓｄＡｂへのサポニンの結合は、細胞表面分子に結合するＶＨＨの能力を考慮すると、例えば立体障害をもたらさない。すなわち、本発明の第２のコンジュゲートによるｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子結合リガンドに共有結合したサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートの非存在下では、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はｓｄＡｂを含むＡＯＣ（すなわち、本発明の第１のコンジュゲート）の準最適用量と例えば腫瘍細胞との接触により、細胞内エフェクター分子活性はもたらされない（標的細胞はエフェクター分子の生物学的活性によって効率よく死滅しない）。しかしながら、標的腫瘍細胞を、エフェクター分子とｓｄＡｂとを含む本発明の第１のコンジュゲート、例えばＡＤＣ又はＡＯＣと、遊離サポニン及び／又はサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートとともに接触させると、効率的な腫瘍細胞死滅が達成される。
【0067】
単一の細胞表面分子を本発明の第２のコンジュゲート及びＡＤＣ又はＡＯＣ、すなわち本発明の第１のコンジュゲートの標的とすることにより、或いは第２の細胞表面分子を本発明の第２のコンジュゲートの標的とし、ＡＤＣ又はＡＯＣ、すなわち本発明の第１のコンジュゲートを第１の細胞表面分子の標的とすることにより（ここで、第１の細胞表面分子と第２の細胞表面分子は異なり、且つ同じ標的細胞に存在する）、細胞表面に細胞表面分子を露出する標的細胞のサイトゾル内部への、本発明の第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体に結合したサポニンの送達、及びエフェクター分子及び第１の細胞表面分子に結合するためのｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣの送達は、例えば、細胞をＡＤＣのみと接触させ、細胞を本発明のサポニンを含む第２のコンジュゲートと同時に接触させず、したがって、細胞を標的とするサポニン（本発明の第２のコンジュゲート）を存在させない場合と比較して改善され、且つ特異性が増す。第１のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂによる標的化のため、及びｓｄＡｂなどの抗体などの第２のコンジュゲートに含まれる細胞表面分子結合分子による標的化のために選択された異常細胞は、理想的には、細胞表面分子を標的とする分子が結合することができるエピトープを細胞表面分子に高度（すなわち、例えば腫瘍細胞又は自己免疫細胞などの標的細胞における標的細胞表面分子の発現が、例えば健康な細胞などの非標的細胞における発現よりも相対的に高い）保持し、且つ／又は第１のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂの結合のため、及び第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体の結合のために標的細胞表面分子におけるエピトープを、特に、患者の（隣接する）健康な細胞が考慮される場合、暴露する。好ましくは、本発明の第１のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂにより標的とされた細胞表面分子、及び本発明の第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子を標的とする分子により標的とされた細胞表面分子は、健康な細胞と比較して、標的（疾患、腫瘍）細胞に比較的高度に且つ／又は特異的に発現する。一実施形態は、腫瘍細胞受容体などの第１のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂのための標的細胞表面分子が、健康な（隣接する）細胞表面における細胞表面分子の発現と比較して、特異的に、又は比較的高い程度で発現する、本発明の第１のコンジュゲートである。一実施形態は、腫瘍細胞受容体などの第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子を標的とする分子のための標的細胞表面分子が、健康な（隣接する）細胞表面における細胞表面分子の発現と比較して、特異的に、又は比較的高い程度で発現する、本発明の第２のコンジュゲートである。したがって、標的細胞表面分子のエピトープは、理想的には標的の疾患細胞に固有であり、且つ標的細胞の表面に少なくとも特異的に存在し曝露される。標的細胞の細胞表面分子のエピトープに本発明の第１のコンジュゲートが結合した後、コンジュゲートと標的細胞表面分子との複合体のエンドサイトーシスが起こる（受容体（標的細胞表面分子）にコンジュゲートが結合した後、コンジュゲート／レセプター複合体が内部移行する）。標的細胞の細胞表面分子のエピトープに本発明の第２のコンジュゲートが結合した後、第２のコンジュゲートと標的細胞表面分子との複合体のエンドサイトーシスが起こる（標的細胞表面分子（細胞表面受容体）にコンジュゲートが結合した後、コンジュゲート／レセプター複合体が内部移行する）。第１及び第２のコンジュゲートは、標的化されるべきでない健康な細胞と比較して、標的細胞に十分な程度に特異的に発現するか、又は一意的に発現する細胞表面分子との結合相互作用によってのみ標的細胞に侵入することができるので、本発明の第２のコンジュゲートと同じ細胞表面分子を標的とするか、又は本発明の第２のコンジュゲートによって標的とされる細胞表面分子と同じ標的細胞に存在するが異なる細胞表面分子を標的とするＡＤＣ又はＡＯＣ（本発明の第１のコンジュゲート）に含まれる治療的に活性な量のエフェクター部分、及び本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンの蓄積は、標的細胞の内部でのみ可能であり、標的細胞表面分子の発現レベルが特定の最小発現閾値を上回る場合に生じる。同時に、第１のコンジュゲートの、細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂに結合したエフェクター部分が、本発明の共有結合したサポニンを有する第２のコンジュゲートの存在下でのみ、その細胞内の（例えば、細胞傷害性又は遺伝子サイレンシング）活性を発揮することができるという事実はまた、共有結合したサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートの存在なしにＡＤＣへ細胞を曝露した場合と比較して、例えば、エフェクター部分の標的とされ影響されることを意味しない健康な細胞及び健康な組織に対するエフェクター部分の負の望ましくない副作用に対するセーフガードを提供する。すなわち、本発明の第１のコンジュゲート、例えば、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣ、及びサポニンを含む第２のコンジュゲートが結合し得る、曝露された細胞表面分子の発現が十分に低いか又は発現しない場合、理想的には、エフェクター分子を含む本発明の第１のコンジュゲート及びサポニンを含む第２のコンジュゲートを、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンの影響下でＡＤＣ又はＡＯＣのエフェクター部分のエンドソームエスケープをもたらす量まで、（非標的の）健康細胞へ侵入させることができない。ＡＤＣ又はＡＯＣは、本発明の第２のコンジュゲートを含むサポニンの存在下では、ＡＤＣ又はＡＯＣを本発明の第２のコンジュゲートの非存在下で、したがってサポニンの非存在下の治療レジメンで適用した場合と比較して、より低用量で使用することができるので、健康な細胞におけるＡＤＣの侵入又はＡＯＣの侵入の程度は低く、例えば、腫瘍細胞及び自己免疫細胞などの標的疾患細胞の標的化及び死滅を考慮した場合、望ましくない副作用の発生リスクは既により低い。
【0068】
第１のコンジュゲートにｓｄＡｂを含めることは、ＩｇＧ（完全長免疫グロブリン）、又はその結合断片若しくは結合ドメインなどの抗体を含めることと比較して多くの利点を有する。重要なことに、ｓｄＡｂはＩｇＧに存在するＦｃテールを含まないので、コンジュゲートが投与される宿主の内皮細胞などの細胞のＦｃ受容体へのコンジュゲートの結合によるオフターゲット副作用のリスクは、本発明の第１のコンジュゲートがヒト対象などの哺乳動物に投与される場合には存在しない。したがって、本発明の第１のコンジュゲートのリスクプロファイルは、ＩｇＧベースのＡＤＣ及びＡＯＣと比較して、又はＦｃテールを含むＡＤＣ又はＡＯＣと比較して改善される。加えて、本発明の第１のコンジュゲートはＦｃ受容体によって結合することができないので、第１のコンジュゲートは、目的とする標的の第１の細胞表面分子とは異なる細胞表面受容体による第１のコンジュゲートの望ましくない捕捉が少ないか、又は全くないため、完全長抗体をベースとしたＡＤＣ及びＡＯＣと同じエフェクター分子活性に達するために必要とされる用量よりも低い用量で既に有効である。さらに、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧと比較して、ｓｄＡｂのサイズは比較的小さいため、本発明の第１のコンジュゲートの組織透過性は良好であり、これは、第１のコンジュゲートが（腫瘍）細胞内部のエフェクター分子の生物学的活性に基づく治療を必要とする患者に投与されたときの標的細胞に到達するのに有益である。本発明の第１のコンジュゲートにおいてｓｄＡｂを適用することのこれらの全ての利点は、同様のＡＤＣ又はＡＯＣにおいて、Ｆｃテールを含むＩｇＧなどのより大きな抗体又はその断片を適用した場合と比較して、本発明の第１のコンジュゲートに含まれる場合、エフェクター分子の治療域を改善する。エフェクター分子が例えば毒素であり、ＡＤＣがＩｇＧに基づき、且つ同じエフェクター分子を含む同じ用量である場合、標的腫瘍細胞の場合の標的細胞死滅の改善は、例えば、準最適以下である。本発明の態様により、ｓｄＡｂを含むコンジュゲート、すなわち、本発明の第１のコンジュゲートの一部として、より低用量のエフェクター分子で患者を治療することが可能になり、同じエフェクター分子を含む抗体ベースのＡＤＣ又はＡＯＣが使用される場合に必要とされるより高用量と比較して、標的細胞において同じ又は改善されたエフェクター分子媒介効果に達する。より低い用量での本発明のそのような第１のコンジュゲートの投与は、例えば、標的でない健康細胞への非特異的侵入により、患者の副作用発生リスクを低下させる。これは、例えば、第１のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂが標的とする第１の細胞表面分子が標的（腫瘍）細胞で多く発現するが、そのような標的細胞における発現が一意的ではない場合に重要である。低用量の第１のコンジュゲートは、そのような非腫瘍の健康な細胞などの低発現体への第１のコンジュゲートの結合のリスクを低下させる。
【0069】
本発明者らはまた、第１のコンジュゲートがサポニンの存在下で、又はより具体的にはサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートの存在下で標的細胞と接触する場合、本発明の第１のコンジュゲートの治療域が広がることを見出した。第１の細胞表面分子、すなわち、第１のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂの標的を有し、且つ第２の細胞表面分子（本発明の実施形態によれば、第１及び第２の両方の細胞表面分子が同じ細胞表面分子である場合に、これは本質的に真である）、すなわち、第２のコンジュゲートに含まれる結合分子の標的を有する標的細胞が、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートの両方と接触する場合、エフェクター分子の有効用量は、第２のコンジュゲートの非存在下（又は遊離サポニンの非存在下）で標的細胞が第１のコンジュゲートと接触する場合よりも低い。サポニンを含む第２のコンジュゲートの存在又は遊離サポニンの存在は、第１のコンジュゲートの治療域及びエフェクター分子の治療域が広がるように、標的細胞におけるエフェクター分子の活性を増強する。エフェクター分子の十分な効率は、標的細胞を本発明の第１及び第２の両コンジュゲートと接触させた場合、より低い用量で達成される。サポニン又はその機能的誘導体の存在下で第１のコンジュゲートを標的細胞と接触させた場合、サポニンのエフェクター分子増強活性が考慮される場合、同様の効果が本発明者らによって見出されるが、共有結合したサポニンを含む第２のコンジュゲートを第１のコンジュゲートと組み合わせた場合に確立された有効用量と比較して、遊離サポニン（誘導体）のの濃度は１００倍～１０００倍高い。したがって、サポニン又はその誘導体に結合分子を提供する（すなわち、本発明の第２のコンジュゲート）なら、第１及び第２のコンジュゲートを共にその表面に両方の細胞表面分子を発現する標的細胞と接触された場合、より良好なエフェクター分子活性増強効果がもたらされる。標的細胞内部へのエフェクター分子の送達において、また前記細胞のエンドソーム、エンドリソソーム又はリソソームからサイトゾルへの送達において、標的化サポニンは遊離サポニンよりも低い用量で既に有効であり、エフェクター分子はその標的結合パートナーに結合し、その生物学的活性（例えば、標的細胞が腫瘍細胞であり、エフェクター分子が例えば毒素である場合、細胞死滅）を発揮する。
【0070】
同時に、本発明者らは、第１のコンジュゲートを含む第１の医薬組成物と、遊離サポニン（誘導体）、又は遊離サポニン（誘導体）を含む第２のコンジュゲートを含む第２の医薬組成物との組み合わせを提供し、また、
第１のコンジュゲート及び遊離サポニン（誘導体）又は第２のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供し、それらは、完全長抗体又はその構築物を含むＦｃをベースとした現行のＡＤＣ又はＡＯＣと比較して、治療域を改善し、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の有効用量がエフェクター分子をベースとする治療を必要とする患者に投与された場合の副作用の誘発リスクを低減し、第１のコンジュゲートの標的細胞内部への送達、より具体的にはそのような標的細胞のサイトゾル内部へのエフェクター分子の送達を改善する。本発明のそのような第１のコンジュゲートを、遊離サポニン（誘導体）又は第２のコンジュゲートと共に、エフェクター分子をベースとした治療を必要とする患者に投与することは本発明の一部であるが、第１のコンジュゲートと組み合わせを第２のコンジュゲートを適用することが好ましい。
第１のコンジュゲート及び遊離サポニン（誘導体）又は第２のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供し、それらは、完全長抗体又はその構築物を含むＦｃをベースとした現行のＡＤＣ又はＡＯＣと比較して、治療域を改善し、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の有効用量がエフェクター分子をベースとする治療を必要とする患者に投与された場合の副作用の誘発リスクを低減し、第１のコンジュゲートの標的細胞内部への送達、より具体的にはそのような標的細胞のサイトゾル内部へのエフェクター分子の送達を改善する。本発明のそのような第１のコンジュゲートを、遊離サポニン（誘導体）又は第２のコンジュゲートと共に、エフェクター分子をベースとした治療を必要とする患者に投与することは本発明の一部であるが、第１のコンジュゲートと組み合わせを第２のコンジュゲートを適用することが好ましい。
【0071】
一実施形態は、以下を含む、少なくとも２つ、好ましくは２つの医薬組成物の形態の本発明の医薬組み合わせである：
－第１のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第１の医薬組成物；並びに
－サポニン及び／又はその誘導体及び／又は第２のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第２の医薬組成物。
－第１のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第１の医薬組成物；並びに
－サポニン及び／又はその誘導体及び／又は第２のコンジュゲートを含み、任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む第２の医薬組成物。
【0072】
一実施形態は、第１のコンジュゲート、並びに
・サポニン；
・サポニン誘導体；及び
・第２のコンジュゲート
の少なくとも１つ、好ましくは１つを含み、
且つ任意選択により、薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む、単一の医薬組成物の形態の本発明の医薬組み合わせである。
・サポニン；
・サポニン誘導体；及び
・第２のコンジュゲート
の少なくとも１つ、好ましくは１つを含み、
且つ任意選択により、薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む、単一の医薬組成物の形態の本発明の医薬組み合わせである。
【0073】
本発明の一態様は、以下を含む医薬組成物に関する：
ｏ少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合している、第１のコンジュゲート；
ｏサポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／又はその誘導体とを含む第２のコンジュゲートであって、結合分子とサポニン又はその誘導体は直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドであり、第２の細胞表面分子は、第１の細胞表面分子と同じであるか又は第１の細胞表面分子とは異なる、サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２のコンジュゲート；並びに、任意選択的に
ｏ薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤。
ｏ少なくとも１つのエフェクター分子と、第１の細胞表面分子に結合するための単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とを含み、これらは直接又はリンカーを介して互いに共有結合している、第１のコンジュゲート；
ｏサポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２の細胞表面分子に結合するための結合分子と、サポニン及び／又はその誘導体とを含む第２のコンジュゲートであって、結合分子とサポニン又はその誘導体は直接又はリンカーを介して互いに共有結合しており、サポニン又はその誘導体はモノデスモシドトリテルペングリコシド又はビデスモシドトリテルペングリコシドであり、第２の細胞表面分子は、第１の細胞表面分子と同じであるか又は第１の細胞表面分子とは異なる、サポニン及び／又はその誘導体、並びに／或いは第２のコンジュゲート；並びに、任意選択的に
ｏ薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤。
【0074】
一実施形態は、第１のコンジュゲートが、抗体、好ましくは免疫グロブリンＧ起源の、好ましくはヒト起源の抗体の重鎖に由来するＶＨドメイン；抗体、好ましくは免疫グロブリンＧ起源の、好ましくはヒト起源の抗体の軽鎖に由来するＶＬドメイン；各種の重鎖新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインなどのラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源又はＩｇ－ＮＡＲ起源などに由来する重鎖抗体（ＨＣＡｂ）などに由来するＶＨＨドメイン（好ましくは、ＨＣＡｂはラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源に由来する）のいずれか１つ以上であるｓｄＡｂを含み；好ましくはｓｄＡｂは、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源（ラクダ科動物ＶＨ）由来のＨＣＡｂに由来する、例えばラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、ビクーナ、グアナコ及びフタコブラクダのＨＣＡｂに由来するＶＨＨである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0075】
特に、ＶＨＨドメインは、本発明の第１のコンジュゲートにおける適用に好適であり、実際、本発明の第２のコンジュゲートにおける適用にも好適である。このようなＶＨＨドメインは、高い安定性、すなわちアンフォールディングに対する抵抗性、例えばＩｇＧ中に存在し、ＩｇＧが２つのＶドメインによって結合パートナーに結合するのに必要とするなどの第２のＶドメインの存在を必要とすることなく結合パートナーに結合する能力、当該技術分野で知られた技術（ラクダ科動物の免疫化技術、ファージディスプレイ技術など）によるそれらの生成の容易さ、完全長ＩｇＧで見られるよりもより高い組織を貫通する能力（この能力は、標的（腫瘍）細胞がそのような（臓器）組織の内部又は一部として位置する場合に有益である）で一般に知られている。さらに、このようなＶＨＨドメインは免疫グロブリンＧ型抗体に共通のＦｃテールを欠いており、その結果、ＶＨＨドメインなどのｓｄＡｂを含むコンジュゲートを投与することによるＦｃ受容体媒介性副作用は起こり得ない（このような副作用は、Ｆｃテールを含む治療用完全長免疫グロブリンが投与される対象において起こり得る）。
【0076】
一実施形態は、第１のコンジュゲートが少なくとも１つのエフェクター分子に共有結合した単一の第１のｓｄＡｂを有するか、又は少なくとも１つのエフェクター分子に結合した２つ以上のｓｄＡｂを有するか、又は少なくとも１つのエフェクター分子に結合した少なくとも２つのｓｄＡｂの全てを有する少なくとも２つのｓｄＡｂを含み、例えば、少なくとも２つのｓｄＡｂのそれぞれは、少なくとも１つのエフェクター分子の１つ以上に結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0077】
一実施形態は、ｓｄＡｂは、同じｓｄＡｂである少なくとも２つのｓｄＡｂ、好ましくは２～８つのｓｄＡｂ、より好ましくは２～４つのｓｄＡｂを含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0078】
一実施形態は、第１の細胞表面分子の同じ結合部位に結合することができる１～８つのｓｄＡｂを含み、少なくとも１つのエフェクター分子は１～８つのｓｄＡｂのうちの単一の第１のｓｄＡｂに結合しているか、又は少なくとも１つのエフェクター分子はｓｄＡｂのうちの２つ以上（存在するなら）に結合しており、且つ／或いは少なくとも１つのエフェクター分子のそれぞれは、ｓｄＡｂの１つ以上が単一のエフェクター分子にそれぞれ結合するように、単一のｓｄＡｂに別々に結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0079】
互いに共有結合した複数のｓｄＡｂからなる（線状）ストリングを含む本発明の第１のコンジュゲート（及び／又は本発明の第２のコンジュゲート）を提供することにより、標的細胞に対し高い親和性をもって結合するコンジュゲートの能力の利益を提供することができ、これにより、標的細胞によるコンジュゲートの取り込み（エンドサイトーシス）を改善することができる。
【0080】
エフェクター分子に対するサポニンのエンドソームエスケープ増強効果の適用を考慮する場合、同期が、マウスで成功した送達戦略とヒトにおけるその適用との間のミッシングリンクである。実際、本発明者らは、本発明によるサポニンを含む第２のコンジュゲートの存在なしに、遊離サポニンと例えばＡＤＣをマウスに別々に投与しても、遊離サポニンを存在させずにＡＤＣで処置した対照動物と比較して、腫瘍増殖の遅延、腫瘍退縮、腫瘍増殖の減少及び緩慢化などの所望する抗腫瘍活性が得られないことを、一連のインビボマウス腫瘍モデルで立証した。インビボ腫瘍モデルについての図１８～２１、及び本明細書の以下の実施例の項に記載の実施例も参照されたい。遊離サポニンを、様々な投与経路から、ＡＤＣの投与時に対して様々な時点で投与（ＡＤＣを投与する前、投与中、及び投与後に遊離サポニンを投与）した。インビボ腫瘍モデルで試験したＡＤＣは、セツキシマブ－ジアンチン（遊離ＳＯ１８６１と共に）、又はトラスツズマブ－サポリン（遊離ＳＯ１８６１と共に）であった。遊離サポニンの用量の変化によって、有効な抗腫瘍活性が提供されることはなかった。言及したＡＤＣは、それ自体、腫瘍を有する動物にいかなる有益な抗腫瘍効果も与えない用量で投与された。驚くべきことに、本発明者らは、ヒト腫瘍細胞を使用する様々なインビトロでの哺乳動物細胞ベースのバイオアッセイ、及び／又は様々なインビボ動物腫瘍モデルにおいて、ＡＤＣ又はＡＯＣ、すなわち本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせて本発明による第２のコンジュゲートで細胞又は動物を処置することにより、有益な抗腫瘍活性が達成され得ることを立証した。
【0081】
任意選択により本発明による足場（以下を参照されたい；１つ又は複数のサポニン部分が共有結合したオリゴマー又はポリマー構造を含む共有結合サポニンコンジュゲートなどの足場）を含む、本発明の第２のコンジュゲート。例えば、切断可能な又は切断不可能な結合によって共有結合したサポニン（例えば、ＳＯ１８６１、ＱＳ－２１）を有する三官能性リンカーである足場、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＯＫＴ－９などのモノクローナル抗体、しかし好ましくはＶＨＨなどのｓｄＡｂなどの第２のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とする分子に共有結合で連結された足場、或いは、例えば、４つのサポニン分子などの４つの部分が結合することができるデンドロン、例えばＧ４－デンドロン又はＧ５－デンドロンなどデンドロン、又は、例えば８つのサポニンを結合するためのデンドロンである足場（デンドロンは、第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体へ（共有）結合するための化学基を含む）。さらなる実施形態及び実施例の項を参照すると、本発明によるこれらの足場のいくつかが例示され、例えば、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるタンパク質性毒素によって発揮される細胞毒性が考慮される場合、又は腫瘍細胞における遺伝子サイレンシングが考慮される場合、インビボ及び／又はインビトロの抗腫瘍細胞活性を示す。
【0082】
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＡＤＣと遊離サポニンによる腫瘍を有する動物の処置が考慮される場合に観察される失敗を考慮すると、標的細胞、例えば腫瘍細胞又は自己免疫細胞のエンドサイトーシス経路のコンパートメント又は小胞において、少なくとも１つのサポニン及びエフェクター部分、好ましくは毒素又はオリゴヌクレオチドの両方の存在を同期させることが好ましい。ＡＤＣ及び遊離サポニンを用いて、インビボで相乗効果を得るために後期エンドソーム中の分子の存在を同期させることは、本発明者らの試みによれば有益には得られなかった。一態様では、本発明は、好ましくは、エフェクター部分及び（腫瘍）細胞表面分子に結合するｓｄＡｂを含む第１のコンジュゲート（例えば、ＡＤＣ又はＡＯＣ）を、サポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートと組み合わせることに関して、少なくとも以下の問題を解決する：いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、（共有結合性の）、特に単一で切断可能である、保持可能な結合のために使用され得るサポニン内の唯一の合理的な化学基が、エンドソームエスケープ活性のために必要である。免疫増強アジュバント物質の使用が暗示されたワクチン接種レジメンにおけるサポニンの適用以外の臨床試験において、サポニンが薬学的に活性な物質と組み合わせて使用されていない理由は、既知の制限である可能性が最もが高いが、例えば、本発明のサポニン及び本明細書に例示されるサポニンの顕著なエンドソームエスケープエンハンサー効果は１０年以上前から知られている。例えば、共有結合したサポニンを有する本発明の第２のコンジュゲートを、例えば、いくつかのサポニンを担持する足場に関連して提供することは、少なくとも部分的に、これらの困難を解決する。例えば、標的細胞のエンドソーム、エンドリソソーム及びリソソームにおいて明らかなように、わずかに酸性のｐＨ（ｐＨ＜６，５）の影響下で切断される切断可能な結合によって共有結合したサポニンを有する本発明の第２のコンジュゲートの提供は、第２のコンジュゲートが細胞の内部にエンドサイトーシスされ送達されると、第２のコンジュゲートから切断された遊離サポニンが前記エンドソーム、エンドリソソーム又はリソソームの内部に存在するため、これらの問題を少なくとも部分的に解決する。驚くべきことに、アジュバント成分としてサポニンを含むワクチン接種の文脈でのそれらの免疫増強活性のために以前に適用されたサポニンは、今や、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣ、すなわち本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせて使用された場合、インビトロ及びインビボでの抗腫瘍活性のための、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体への（共有）結合にも好適である。
【0083】
一実施形態は、ｓｄＡｂは単一のｓｄＡｂであるか、又は少なくとも２つ、好ましくは２つのｓｄＡｂであり、ｓｄＡｂはＨＩＶｇｐ４１などの第１の細胞表面分子に結合することができるか、又は第１の細胞表面分子が腫瘍細胞特異的受容体などの腫瘍細胞表面受容体、より好ましくは、ＣＤ７１、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＤ４４ｖ６、ＦＡＰ、ＥＧＦ－ＩＲ、インテグリン、シンデカン－１、血管インテグリンαＶベータ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣａｎＡｇ、インテグリンαＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソテリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＥＧＦＲ１、ＲＡＮＫＬ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＣＤ１６、ＣＸＣＲ７（ＡＣＫＲ３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）から選択される受容体、最も好ましくは：ＨＥＲ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＸＣＲ７、ＣＤ７１及びＥＧＦＲ１から選択される受容体である、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0084】
本発明の第１のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂが標的細胞上に特異的に発現する細胞表面分子に対する結合特異性を有することは、本発明の一部である。「特異的に発現する」とは、本明細書では、標的細胞のみにおける細胞表面分子の固有の発現と理解されるべきである（ここで、例えば、第１のコンジュゲートに結合しない健康な細胞は標的ではない）、又は、本明細書では、コンジュゲートに結合しないか、若しくは少なくとも非常に低い程度の結合である、例えば健康な細胞における細胞表面分子の低い発現と比較して、標的細胞における標的細胞表面分子の上方制御された若しくは比較的高い発現と理解されるべきである。これらの列挙された細胞受容体は、第１のコンジュゲートの標的である細胞に対して十分に特異的な細胞表面分子であり、したがって、第１のコンジュゲートによる結合のための好ましい候補である。標的細胞における細胞表面分子の発現を、本発明の第１のコンジュゲートが標的とすることを意味しない他の細胞における発現と比較した場合、特定の細胞表面分子の特異性が高いほど、細胞内部のエフェクター分子の活性を考慮した場合、治療域はより良好であると理解される。例えば、第１のコンジュゲートが標的化するのに好適な標的は、他の腫瘍細胞特異的受容体の中で、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、例えばＥＧＦＲ１、及びＣＤ７１である。
【0085】
一実施形態は、第１のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂは単一のｓｄＡｂであるか、又は少なくとも２つ、好ましくは２つのｓｄＡｂであり、ｓｄＡｂは、抗ＣＤ７１ ｓｄＡｂ、抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２０ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ１２５ ｓｄＡｂ、抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３０ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３３ ｓｄＡｂ、抗血管インテグリンαｖβ３ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２２ ｓｄＡｂ、抗ＣＥＡ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ４４ｖ６ ｓｄＡｂ、抗ＦＡＰ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、抗ＣａｎＡｇ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５６ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３８ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ６ ｓｄＡｂ、抗ＩＧＦ－１Ｒ ｓｄＡｂ、抗インテグリン ｓｄＡｂ、抗シンデカン－１ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ７９ｂ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ１ ｓｄＡｂ、抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＸＣＲ７ ｓｄＡｂ、及び抗ＨＩＶｇｐ４１から選択され、ｓｄＡｂは、好ましくはＶＨＨであり、より好ましくはるラクダ科動物ＶＨである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0086】
一実施形態は、第１のコンジュゲートは、ＨＥＲ２、ＣＤ７１、ＨＩＶｇｐ４１及び／又はＥＧＦＲに結合することができるｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、好ましくはＶＨＨであり、より好ましくはラクダ科動物ＶＨである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0087】
一実施形態は、第１のコンジュゲートは、クローン１１Ａ４、クローン１８Ｃ３、クローン２２Ｇ１２、クローンＱ１７若しくはクローンＱ１７－Ｃタグによって産生されるｓｄＡｂから選択されるＨＥＲ２に結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＥＧＦＲ Ｑ８６－Ｃタグによって産生されるＥＧＦＲに結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＣＤ７１ Ｑ５２－Ｃタグによって産生されるＣＤ７１に結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８－Ｃタグによって産生されるＨＩＶｇｐ４１に結合するためのｓｄＡｂ；又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１のいずれか１つのｃＤＮＡによってコードされるｓｄＡｂ；又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６～７２のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つを含み、任意選択で、第１のコンジュゲートはさらに、アルブミンに結合するための共有結合したｓｄＡｂ、例えば、配列番号３３、３４及び３５のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つ以上を含み、好ましくは、ｓｄＡｂはＶＨＨであり、より好ましくはラクダ科動物ＶＨである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。本発明の第１のコンジュゲートへの組み込みに好適なＶＨＨは、例えば、単一ドメイン抗体データベース（Ｗｉｌｔｏｎ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８））、特許出願の米国特許出願公開第２０１６／０２５１４４０号明細書（抗ＣＤ１２３、抗ＣＥＡＣＡＭ）、米国特許第９６８３０４５号明細書（抗ｃ－Ｍｅｔ）、米国特許出願公開第２００９／０２５２６８１号明細書（抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ－１Ｒ）、米国特許第９９６９８０５号明細書（抗ＨＥＲ２）、米国特許出願公開第２０１９００２３７９６Ａ１号明細書（抗ＨＥＲ３）、並びにＫｉｊａｎｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）（抗ＨＥＲ２のため）及びＭｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）（抗ＨＥＲ２のため）に見出される。抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ３、抗ＣＤ１２３、抗ＣＥＡＣＡＭ、抗ｃ－Ｍｅｔ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ－１Ｒ、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ１９、抗ＨＥＲ１及び抗ＶＧＦＲ２に好適な一連のＶＨＨのアミノ酸配列及び／又はｃＤＮＡ配列もまた、腫瘍細胞特異的受容体に結合するそれらの能力を考慮して、配列番号１～３２及び３６～７２として、本明細書の以下に提供される。特に、腫瘍細胞特異的受容体ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ及びＣＤ７１のいずれかの結合部位に結合することができるＶＨＨは、本発明の第１のコンジュゲートへの組み込みに好適である。本発明者らは、そのような受容体のいずれか１つを標的とするＶＨＨを含むＡＤＣが、ｓｄＡｂに結合したエフェクター分子の送達に有効であることを明らかにした。例えば、実施例の項、及び図４～７を参照されたい。
【0088】
一実施形態は、エフェクター分子が、薬物分子などの低分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡ、ゼノ核酸若しくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、酵素、ペプチド、タンパク質、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含むか、又はそれらからなる、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0089】
一実施形態は、エフェクター分子が、ベクター、遺伝子、細胞自殺誘導導入遺伝子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｍＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｖａｕｌｔ／ｓｕｐｅｒｉｏｒ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－２－４－ｂｎａｎｃ－ｂａｓｅｄ－ｓｈｏｒｔ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ａｓｐｘ、３’－フルオロヘキシトール核酸（ＦＨＮＡ）、プラスミド、グリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）、又はその誘導体のいずれか１つ以上から選択され、より好ましくはＢＮＡ、例えば、ＨＳＰ２７タンパク質発現をサイレンシングするためのＢＮＡ、又はアポリポタンパク質Ｂ発現をサイレンシングするためのＢＮＡである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0090】
一実施形態は、エフェクター分子が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋型核酸（ＢＮＡＮＣ）、ＢＮＡベースのｓｉＲＮＡ、及びＢＮＡベースのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ－ＡＯＮ）のいずれか１つ以上から選択されるオリゴヌクレオチドである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0091】
一実施形態は、エフェクター分子が、抗ｍｉＲＮＡ、ＢＮＡ－ＡＯＮ、又はｓｉＲＮＡ、例えばＢＮＡベースのｓｉＲＮＡのいずれか１つから選択され、好ましくは化学修飾されたｓｉＲＮＡ、代謝的に安定なｓｉＲＮＡ、及び化学修飾され代謝的に安定なｓｉＲＮＡから選択されるオリゴヌクレオチドである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0092】
一実施形態は、エフェクター分子は遺伝子をサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチドであり（そのような遺伝子を含む細胞中に存在する場合）、遺伝子は次の遺伝子：アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、デルタ－アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）、アンチトロンビン３（ＡＴ３）、グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）、補体成分Ｃ５（ＣＣ５）、Ｂ型肝炎ウイルスのＸ遺伝子（ＨＢＶ）、ＨＢＶのＳ遺伝子、α－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のいずれか１つであり、且つ／又は異常なｍｉＲＮＡを標的とすることができる（そのようなｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在する場合）、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0093】
一実施形態は、エフェクター分子がｍＲＮＡを標的とすることができるオリゴヌクレオチドであり（そのようなｍＲＮＡを含む細胞中に存在する場合）、ｍＲＮＡが次のタンパク質：アポＢ、ＰＣＳＫ９、ＴＴＡＳ１、ＡＴ３、ＧＯ、ＣＣ５、ＨＢＶのＸ遺伝子の発現産物、ＨＢＶのＳ遺伝子の発現産物、ＡＡＴ及びＬＤＨのいずれか１つの発現に関与するか、又は発癌性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏ－ｍｉＲ）を阻害する、若しくはｏｎｃｏ－ｍｉＲの発現を抑制するなどのｍｉＲＮＡ機能に拮抗、若しくはｍｉＲＮＡ機能を回復させることができる（このようなｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在する場合）、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0094】
一実施形態は、エフェクター分子が、好ましくはペプチド、タンパク質、酵素及びタンパク質毒素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのタンパク質性分子を含むか又はそれからなる、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。本発明者らは、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ７１のいずれかに結合するｓｄＡｂ（このｓｄＡｂは、第１のコンジュゲートにおいて、毒素、例えばタンパク質毒素、例えばジアンチン又はサポリンと組み合わされる）が選択された場合、非常に有効な腫瘍細胞死滅が達成されることを見出した。本発明のこのような第１のコンジュゲートの高い有効性を示す実施例は、実施例の項において提供され、図４～７に示される。
【0095】
一実施形態は、エフェクター分子が、ウレアーゼ及びＣｒｅ－リコンビナーゼ、タンパク性毒素、リボソーム不活性化タンパク質、タンパク質毒素、細菌毒素、植物毒素の少なくとも１つを含むか又はそれからなり、より好ましくは、アポプチンなどのウイルス毒素；志賀毒素、志賀様毒素、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素（ＰＥ）又はＰＥの外毒素Ａ、完全長又はトランケート型ジフテリア毒素（ＤＴ）、コレラ毒素などの細菌毒素；α－サルシンなどの真菌毒素；植物毒素、例えば、リボソーム不活性化タンパク質、及び２型リボソーム不活性化タンパク質のＡ鎖、例えば、ジアンチン（例えば、ジアンチン－３０又はジアンチン－３２）、サポリン（例えば、サポリン－Ｓ３又はサポリン－Ｓ６）、ブーガニン又はブーガニンの脱免疫化誘導体デブーガニン、志賀様毒素Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシン、リシンＡ鎖、モデシン、モデシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ボルケンシン、ボルケンシンＡ鎖、ビスクミン、ビスクミンＡ鎖を含む；又はカエルＲＮアーゼ、若しくはグランザイムＢ、若しくはヒトアンギオゲニンなどの動物若しくはヒト毒素、或いはこれらの任意の毒性断片又は毒性誘導体のいずれか１つ以上から選択され；好ましくは、タンパク質毒素はジアンチン及び／又はサポリンである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0096】
一実施形態は、エフェクター分子が、少なくとも１つのペイロードを含むか又はそれからなる、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0097】
一実施形態は、エフェクター分子が、リボソームを標的とする毒素、伸長因子を標的とする毒素、チューブリンを標的とする毒素、ＤＮＡを標的とする毒素、及びＲＮＡを標的とする毒素の少なくとも１つ、より好ましくは、エムタンシン、パスドトクス、メイタンシノイド誘導体ＤＭ１、メイタンシノイド誘導体ＤＭ４、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、ベドチン）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ、マホドチン）、カリケアミシン、Ｎ－アセチル－γ－カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、ベンゾジアゼピン、ＣＣ－１０６５アナログ、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、シクロホスファミド、エトポシド、ドセタキセル、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ミトキサントロン、チューブリシン、インドリノベンゾジアゼピン、ＡＺ１３５９９１８５、クリプトフィシン、リゾキシン、メトトレキサート、アントラサイクリン、カンプトテシンアナログ、ＳＮ－３８、ＤＸ－８９５１ｆ、エキサテカンメシレート、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素のトランケート型形態（ＰＥ３８）、デュオカルマイシン誘導体、アマニチン、α－アマニチン、スプライソスタチン、タイランスタチン、オゾガマイシン、テシリン、アンバースタチン２６９、及びソラブタンシン、又はこれの誘導体のいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0098】
一実施形態は、第一のコンジュゲートが抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、例えば、以下のＡＤＣのいずれか１つに由来する、少なくとも１つのｓｄＡｂ及び毒素を含むＡＤＣを含むか又はそれからなる、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である：ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスドトクス、及びポラツズマブベドチン。ｓｄＡｂがそのようなヒト抗体に由来する場合、そのようなヒト抗体のＶＨドメインは、当該技術分野で知られるドメイン安定性（ヒトＶＨドメインの「ラクダ化」）に関していくらかの改善を必要とし得ることは理解されよう。
【0099】
本発明におけるＡＤＣ又はＡＯＣ（すなわち、本発明の第１のコンジュゲート）の一部として有用なエフェクター部分は、好ましくはその効果を発揮するための後期エンドソームエスケープに依存する。例えば、シュードモナス外毒素などのいくつかのエフェクター分子は、「後期エンドソーム」の前に他のオルガネラに再経路指定され、したがって、通常、本発明による第２のコンジュゲートと組み合わせるためのＡＤＣへの組み込みの恩恵を受けない。しかしながら、このような毒素は、例えば、再経路指定に関与するシグナルペプチドを欠失させることによって、本発明での使用に適合させることができる。特に、毒性が高く、細胞を死滅させるためにエンドソームをエスケープさせる必要のある分子が１分子のみである毒素は、効力が低下するように改変し得る。少なくとも２個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも１００個の毒素分子がエンドソームをエスケープし（サイトゾルに入る）場合、細胞を死滅させる毒素を使用することが好ましい。本発明の医薬組成物に含まれる、又は医薬組み合わせに含まれる、本発明の第１のコンジュゲートは、共有結合によりコンジュゲートされ機能化足場、すなわち、標的細胞、例えば、腫瘍細胞又は自己免疫細胞において、結合した１つ又は複数のエフェクター部分を含む足場を標的とするための共有結合により結合した１つ又は複数のエフェクター部分を含む、オリゴマー若しくはポリマー分子又は三官能性リンカーなどの足場を含むことがさらに好ましい。さらに、オフターゲット毒性を低減するために、細胞膜非透過性低分子毒素が、細胞膜透過性毒素よりも好ましいエフェクター分子である。
【0100】
好ましくは、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンによってエフェクター部分効果が増強される、本発明の第２のコンジュゲートと組み合わせるためのＡＤＣ又はＡＯＣ（すなわち、本発明の第１のコンジュゲート）に含まれるエフェクター部分は、エンドサイトーシスされると、第１のコンジュゲート（すなわち、ＡＤＣ、ＡＯＣ）から脱離する（例えば、第１のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とする部分として第１のコンジュゲート中に存在するｓｄＡｂなどの抗体から脱離する）。これは、例えば、酸性、還元性、酵素又は光誘導性条件下で切断する切断可能な結合によって達成することができる。
【0101】
本発明者らは、ＢＮＡ（ＨＳＰ２７）などの共有結合したアンチセンスＢＮＡを備え、同じか又は異なり、共有結合したサポニンを備えた腫瘍細胞を標的とするモノクローナル抗体又はｓｄＡｂ（すなわち、本発明の第２のコンジュゲート）と組み合わせた腫瘍細胞を標的とするモノクローナル抗体又はｓｄＡｂ（本発明の第１のコンジュゲート）を腫瘍細胞に接触させると、細胞を標的とするリガンドに（切断可能な結合により）結合したＢＮＡ（すなわち、第１のコンジュゲート）と抗体（例えば、本発明の第２のコンジュゲートのｓｄＡｂ）に（切断可能な結合により）結合したサポニンの両方が、対照、及びサポニン（ＳＯ１８６１）を含む本発明の第２のコンジュゲートの非存在下でのＢＮＡを有するＡＯＣと比較して、インビボの腫瘍においてＨＳＰ２７をサイレンシングすることができることを示す。したがって、ＡＤＣ（本発明の第１のコンジュゲート）を、本発明のサポニンを含む第２のコンジュゲートと一緒に投与するか、又は本発明の抗体－ＢＮＡコンジュゲートなどの抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ここで、抗体はＶＶＨＨである）を、本発明のサポニンを含む第２のコンジュゲートと一緒に投与することにより、ＡＤＣ又はＡＯＣに、本発明の第２のコンジュゲートの非存在下、同じ用量でのＡＤＣ又はＡＯＣのみでは見られない抗腫瘍細胞活性が与えられる。アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）［Ｙ Ｚｈａｎｇ，Ｚ Ｑｕ，Ｓ Ｋｉｍ，Ｖ Ｓｈｉ，Ｂ Ｌｉａｏ１，Ｐ Ｋｒａｆｔ，Ｒ Ｂａｎｄａｒｕ，Ｙ Ｗｕ，ＬＭ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ ＩＤ Ｈｏｒａｋ，Ｄｏｗｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）１８，３２６－３３３］によるオリゴ核酸配列を有するＢＮＡであった。注目すべきことに、本発明者らの知る限り、ＢＮＡは、遊離核酸としての適用のために設計されている。本発明者らは、アンチセンスＢＮＡがリガンド又は抗体、例えばｍＡｂ又はｓｄＡｂ、例えばＶＨＨと（非）切断可能なリンカーを介して共有結合され得ることを、遺伝子サイレンシング活性がインビトロで、さらに重要なことには、腫瘍を有する動物の腫瘍細胞においてインビボで保持される方法で初めて実証した。ＢＮＡベースのＡＯＣ、すなわち本発明の第１のコンジュゲートを提供するこの方法は、それを必要とするヒト（癌）患者に標的化ＢＮＡを投与するための新しい方法を開く。
【0102】
一実施形態は、サポニンが、
２α－ヒドロキシオレアノール酸；
１６α－ヒドロキシオレアノール酸；
ヘデラゲニン（２３－ヒドロキシオレアノール酸）；
１６α，２３－ジヒドロキシオレアノール酸；
ギプソゲニン；
キラ酸；
プロトエシゲニン２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－２２－アセテート；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１，２２－ビス（２－メチルブタ－２－エノエート）；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－１６，２２－ジアセテート；
ジギトゲニン；
３，１６，２８－トリヒドロキシオレアナン－１２－エン；及び
ギプソゲン酸
から選択されるアグリコンコア構造を含むか、又はサポニン誘導体がそれから誘導されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、サポニンがキラ酸及びギプソゲニンから選択されるアグリコンコア構造を含むか又はサポニン誘導体がそれに由来し、より好ましくはサポニンがアグリコンコア構造キラ酸を含むか又はサポニン誘導体がそれに由来する、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
２α－ヒドロキシオレアノール酸；
１６α－ヒドロキシオレアノール酸；
ヘデラゲニン（２３－ヒドロキシオレアノール酸）；
１６α，２３－ジヒドロキシオレアノール酸；
ギプソゲニン；
キラ酸；
プロトエシゲニン２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－２２－アセテート；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１，２２－ビス（２－メチルブタ－２－エノエート）；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－１６，２２－ジアセテート；
ジギトゲニン；
３，１６，２８－トリヒドロキシオレアナン－１２－エン；及び
ギプソゲン酸
から選択されるアグリコンコア構造を含むか、又はサポニン誘導体がそれから誘導されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、サポニンがキラ酸及びギプソゲニンから選択されるアグリコンコア構造を含むか又はサポニン誘導体がそれに由来し、より好ましくはサポニンがアグリコンコア構造キラ酸を含むか又はサポニン誘導体がそれに由来する、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0103】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、このようなサポニンが細胞中で、前記細胞のエンドソーム中で、本発明の第２のコンジュゲートの一部として、これらのエフェクター分子と共局在化する場合、又は（例えば、第２のコンジュゲートが標的細胞のエンドソーム又はリソソームの内部に送達されると、第２のコンジュゲートから分離されて）エンドソーム内部で遊離形態にある場合、及びエフェクター分子及び細胞を標的とするｓｄＡｂを有する第１のコンジュゲートの存在下で細胞に曝される場合、サポニンのアグリコンコア構造（本明細書では「アグリコン」とも呼ばれる）中のアルデヒド基（又はその誘導体）の存在は、本発明によるＡＤＣ又はＡＯＣなどの第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子のエンドソームエスケープを刺激及び／又は増強するサポニンの能力にとって有益である。したがって、アルデヒド基を有するアグリコンを有するサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートが好ましい。キラ酸及びギプソゲニン中では、アルデヒド基はアグリコンのＣ２３原子にある。
【0104】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体が、好ましくはＣ３原子に結合した、サポニン又はサポニン誘導体のアグリコンコア構造のＣ３原子又はＣ２８原子に結合した第１の糖鎖を任意選択で含み、且つ／或いはサポニン又はサポニン誘導体が、サポニン又はサポニン誘導体のアグリコンコア構造のＣ２８原子に結合した第２の糖鎖を任意選択で含み、好ましくは少なくとも１つのサポニンが第１及び第２の糖鎖を含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。したがって、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンが２つのグリカン（糖鎖）を有する場合、第１の糖鎖はアグリコンコア構造のＣ３位に結合し、第２の糖鎖はアグリコンコア構造のＣ２８位に結合する。
【0105】
一実施形態は、
・サポニン又はサポニン誘導体が、
ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ－、
Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－［Ｇｌｃ－（１→４）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、及び
これらの誘導体から選択される第１の糖鎖を含み、
且つ／又は
・サポニン又はサポニン誘導体が、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ａｒａ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ａｒａ－、
Ｘｙｌ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１は４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ２－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ２は４Ｚ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ３－（→４）］－３－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ３は４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→３）－（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→４）－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→２）－［４－ＯＡｃ－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→４）］－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ａｒａ／Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ／Ｆｕｃ－（１→４）－［Ｇｌｃ／Ｇａｌ－（１→２）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ４－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ４は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ５－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ５は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ６－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ６は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ７－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ７は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ８－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ８は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ９－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ９は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１０－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１０は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１１－（→３）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１１は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１２－（→３）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１２は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→６）］－Ｇａｌ－、及び
これらの誘導体から選択される第２の糖鎖を含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
・サポニン又はサポニン誘導体が、
ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ－、
Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－［Ｇｌｃ－（１→４）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、及び
これらの誘導体から選択される第１の糖鎖を含み、
且つ／又は
・サポニン又はサポニン誘導体が、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ａｒａ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ａｒａ－、
Ｘｙｌ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１は４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ２－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ２は４Ｚ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ３－（→４）］－３－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ３は４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→３）－（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→４）－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→２）－［４－ＯＡｃ－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→４）］－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ａｒａ／Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ／Ｆｕｃ－（１→４）－［Ｇｌｃ／Ｇａｌ－（１→２）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ４－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ４は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ５－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ５は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ６－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ６は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ７－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ７は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ８－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ８は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ９－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ９は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１０－（→４）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１０は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１１－（→３）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１１は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１２－（→３）］－Ｆｕｃ－（ここで、Ｒ１２は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である））
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→６）］－Ｇａｌ－、及び
これらの誘導体から選択される第２の糖鎖を含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0106】
したがって、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンが２つのグリカン（糖鎖）を有する場合、第１の糖鎖はアグリコンコア構造のＣ３位に結合し、第２の糖鎖はアグリコンコア構造のＣ２８位に結合する。
【0107】
一実施形態は、第２のコンジュゲート中のサポニン又はサポニン誘導体は第１の糖鎖を含み、且つ請求項２４又は２５に記載の第２の糖鎖を含み、第１の糖鎖は２つ以上の糖部分を含み、第２の糖鎖は２つ以上の糖部分を含み、アグリコンコア構造はキラ酸又はギプソゲニン又はその誘導体であり、以下の１つ、２つ又は３つ、好ましくは１つ又は２つを満たす、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である：
ｉ．アグリコンコア構造中のアルデヒド基は誘導体化されている、
ｉｉ．第１の糖鎖中のグルクロン酸部分のカルボキシル基は誘導体化されている、及び
ｉｉｉ．第２の糖鎖中の少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基は誘導体化されている。
ｉ．アグリコンコア構造中のアルデヒド基は誘導体化されている、
ｉｉ．第１の糖鎖中のグルクロン酸部分のカルボキシル基は誘導体化されている、及び
ｉｉｉ．第２の糖鎖中の少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基は誘導体化されている。
【0108】
一実施形態は、第２のコンジュゲート中のサポニン又はサポニン誘導体が以下を含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である：
ｉ．
－アルコールへの還元；
－Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応によるヒドラゾン結合への変換（ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意選択により、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される）；
－Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）との反応によるヒドラゾン結合への変換（ここで、ＢＭＰＨのマレイミド基は、任意選択により、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される）；又は
－Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）との反応によるヒドラゾン結合への変換（ここで、ＫＭＵＨのマレイミド基は、任意選択により、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される）
によって誘導体化されたアルデヒド基を含むアグリコンコア構造：
ｉｉ．２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）又はＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応によるアミド結合への変換によって誘導体化された、カルボキシル基、好ましくはグルクロン酸部分のカルボキシル基を含む第１の糖鎖；
ｉｉｉ．脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への変換によって誘導体化されたアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）を含む第２の糖鎖；又は
ｉｖ．２つ又は３つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉ．の任意の組み合わせ、好ましくは２つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉ．の任意の組み合わせ。
ｉ．
－アルコールへの還元；
－Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応によるヒドラゾン結合への変換（ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意選択により、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される）；
－Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）との反応によるヒドラゾン結合への変換（ここで、ＢＭＰＨのマレイミド基は、任意選択により、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される）；又は
－Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）との反応によるヒドラゾン結合への変換（ここで、ＫＭＵＨのマレイミド基は、任意選択により、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される）
によって誘導体化されたアルデヒド基を含むアグリコンコア構造：
ｉｉ．２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）又はＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応によるアミド結合への変換によって誘導体化された、カルボキシル基、好ましくはグルクロン酸部分のカルボキシル基を含む第１の糖鎖；
ｉｉｉ．脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への変換によって誘導体化されたアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）を含む第２の糖鎖；又は
ｉｖ．２つ又は３つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉ．の任意の組み合わせ、好ましくは２つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉ．の任意の組み合わせ。
【0109】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体が、キラヤ樹皮サポニン、ディプサコシドＢ、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＤ、マクラントイジンＡ、エスクレントシドＡ、フィトラッカゲニン、エシナート、ＡＳ６．２、ＮＰ－００５２３６、ＡＭＡ－１、ＡＭＲ、α－ヘデリン、ＮＰ－０１２６７２、ＮＰ－０１７７７７、ＮＰ－０１７７７８、ＮＰ－０１７７７４、ＮＰ－０１８１１０、ＮＰ－０１７７７２、ＮＰ－０１８１０９、ＮＰ－０１７８８８、ＮＰ－０１７８８９、ＮＰ－０１８１０８、ＳＡ１６４１、ＡＥ Ｘ５５、ＮＰ－０１７６７４、ＮＰ－０１７８１０、ＡＧ１、ＮＰ－００３８８１、ＮＰ－０１７６７６、ＮＰ－０１７６７７、ＮＰ－０１７７０６、ＮＰ－０１７７０５、ＮＰ－０１７７７３、ＮＰ－０１７７７５、ＳＡ１６５７、ＡＧ２、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１９０４、ＳＯ１８６２、ＱＳ－７、ＱＳ１８６１、ＱＳ－７ａｐｉ、ＱＳ１８６２、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１Ａ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１Ａ－ｘｙｌｏ、ＱＳ－２１Ｂ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１Ｂ－ｘｙｌｏ、β－エシン、エシンＩａ、チャ種子サポニンＩ、チャ種子サポニンＪ、アッサムサポニンＦ、ジギトニン、プリムラ酸１及びＡＳ６４Ｒ、若しくはこれらの誘導体、又はこれらの立体異性体、並びに／或いはこれらの組み合わせから選択され、好ましくはサポニン又はサポニン誘導体はＱＳ－２１又はＱＳ－２１誘導体、ＳＯ１８６１又はＳＯ１８６１誘導体、ＳＡ１６４１又はＳＡ１６４１誘導体、及びＧＥ１７４１又はＧＥ１７４１誘導体のいずれか１つ以上であり、より好ましくはＱＳ－２１誘導体又はＳＯ１８６１誘導体であり、最も好ましくはＳＯ１８６１誘導体であり、ここで、好ましくは、このようなサポニン誘導体は本発明によるサポニン誘導体である、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0110】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体が、ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン、サポニナムアルブム、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシドＡ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４、若しくはこれらの誘導体、又はこれらの立体異性体、並びに／或いはこれらの任意の組み合わせから選択され、好ましくはサポニン誘導体はＳＯ１８６１誘導体、及び／又はＧＥ１７４１誘導体、及び／又はＳＡ１６４１誘導体、及び／又はＱＳ－２１誘導体であり、より好ましくはサポニン誘導体はＳＯ１８６１誘導体又はＱＳ－２１誘導体であり、最も好ましくはサポニン誘導体は本発明によるＳＯ１８６１誘導体である。
【0111】
このようなトリテルペングリコシド型のサポニンは、第１のコンジュゲートに含まれ、細胞のエンドソーム（又はリソソーム）に存在するエフェクター分子のエンドソームエスケープを、該サポニンが第２のコンジュゲートの一部として又は遊離形態で細胞内にそのようなエフェクター分子と共局在する場合、増強することができる。本発明者らは、これらのサポニンのエンドソームエスケープ増強活性が、サポニンを本発明の第２のコンジュゲートの一部として細胞と接触させた場合、約１００～１０００倍強力であることを立証した。遊離サポニンは、細胞のサイトゾル中のエフェクター分子の送達を、そのような細胞を第１のコンジュゲートの一部としてのエフェクター分子及びサポニンと接触させた場合、標的細胞の外からエンドソームの内部へ、最終的には前記細胞のサイトゾル内へのエフェクター分子の同程度の送達を達成するために必要な、本発明の第２のコンジュゲートに含まれる同じサポニンの濃度と比較して、１００～１０００倍高い濃度で刺激することができる。そのようなエンドソームエスケープ増強活性を示すサポニン、並びに第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子のサイトゾル送達を増強する能力が実証されたサポニンと高い構造的類似性を有するサポニンを表Ａ１に列挙する。サポニンが本発明の第２のコンジュゲートの一部である場合、第２のコンジュゲートの結合分子、例えば、抗体又はｓｄＡｂの、標的細胞上の第２の細胞表面結合部位への結合時、及び前記細胞のエンドソームへのエンドサイトーシス後のサポニンの標的化送達は、したがって、同じ細胞を、標的細胞の第２の細胞表面分子への結合のための抗体又はｓｄＡｂなどの結合分子を備えていない遊離の非標的化サポニン（誘導体）と接触させた場合と比較して、約１００～１０００倍有効である。特定の実施形態では、第２のコンジュゲートに含まれる結合分子はｓｄＡｂである。例えば、ＩｇＧ型の抗体又はその断片、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖと比較して、本発明の第２のコンジュゲートのｓｄＡｂのサイズが小さいことは、第２のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂの結合のための第２の結合部位を露出させる標的細胞による効率的な取り込み、例えば、エンドサイトーシスによる取り込みに寄与する。通常、本発明の第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂは、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂが標的とする細胞表面受容体と同じ又は異なる標的細胞の細胞表面受容体、例えば腫瘍細胞特異的細胞表面受容体に結合することができる。このように、本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、例えば、第１及び第２の細胞表面受容体を発現する腫瘍細胞へのエンドサイトーシスに特に好適であり、これらの第１及び第２の細胞表面受容体は、同じであっても異なっていてもよい。
【0112】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、その結合分子は、
第２の細胞表面分子に結合するためのタンパク質性リガンド、例えばＥＧＦ若しくはサイトカイン、又は第２の細胞表面分子に結合することができる免疫グロブリン若しくは前記免疫グロブリンの少なくとも１つの結合断片若しくは結合ドメインなどのリガンドのいずれか１つ以上であり、ここで、免疫グロブリンは、好ましくはモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体、ＩｇＧ、ｓｄＡｂ、少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は少なくとも１つのＶＨドメインを含むか又はそれからなる分子、可変重鎖新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメイン、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｃａｂ断片などの抗体のいずれか１つ以上である、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
第２の細胞表面分子に結合するためのタンパク質性リガンド、例えばＥＧＦ若しくはサイトカイン、又は第２の細胞表面分子に結合することができる免疫グロブリン若しくは前記免疫グロブリンの少なくとも１つの結合断片若しくは結合ドメインなどのリガンドのいずれか１つ以上であり、ここで、免疫グロブリンは、好ましくはモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体、ＩｇＧ、ｓｄＡｂ、少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は少なくとも１つのＶＨドメインを含むか又はそれからなる分子、可変重鎖新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメイン、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｃａｂ断片などの抗体のいずれか１つ以上である、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0113】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、第２の細胞表面分子が、腫瘍細胞などの異常細胞、自己免疫細胞、ウイルス感染細胞などの感染細胞上に存在する細胞表面受容体である、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0114】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、抗体、又はその結合断片若しくは結合ドメイン、例えばｓｄＡｂ、或いは受容体リガンドなどの第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、第２の細胞表面受容体が、好ましくは、ＨＩＶｇｐ４１、又は腫瘍細胞特異的受容体などの腫瘍細胞表面受容体であり、より好ましくは、ＣＤ７１、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＤ４４ｖ６、ＦＡＰ、ＥＧＦ－ＩＲ、インテグリン、シンデカン－１、血管インテグリンαＶβ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣａｎＡｇ、インテグリンαＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソテリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＥＧＦＲ１、ＲＡＮＫＬ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＣＤ１６、ＣＸＣＲ７（ＡＣＫＲ３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）から選択される細胞表面受容体であり、最も好ましくは、ＨＥＲ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＸＣＲ７、ＣＤ７１、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ１から選択される細胞表面受容体である、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0115】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、第２の細胞表面分子に結合するための結合分子を含み、この結合分子は以下から選択される免疫グロブリン、好ましくは以下に由来するか、又は以下に基づくｓｄＡｂである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である：ＩｇＧ型ＯＫＴ－９などの抗ＣＤ７１抗体、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブなどの抗ＣＤ２０抗体、オレゴボマブなどの抗ＣＡ１２５抗体、エドレコロマブなどの抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）抗体、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体、ブレンツキシマブなどの抗ＣＤ３０抗体、ゲムツズマブ、ｈｕＭｙ９－６などの抗ＣＤ３３抗体、エタラシズマブなどの抗血管インテグリンαｖβ３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体、エプラツズマブ、ピナツズマブなどの抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２２抗体モキセツモマブの結合断片（Ｆｖ）、ヒト化モノクローナル抗体イノツズマブ、ラベツズマブなどの抗ＣＥＡ抗体、ビバツズマブなどの抗ＣＤ４４ｖ６抗体、シブロツズマブなどの抗ＦＡＰ抗体、ｈｕＢ４などの抗ＣＤ１９抗体、ｈｕＣ２４２などの抗ＣａｎＡｇ抗体、ｈｕＮ９０１などの抗ＣＤ５６抗体、ダラツムマブなどの抗ＣＤ３８抗体、ＯＫＴ－１０ 抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、ＤＳ６などの抗ＣＡ６抗体、シクスツムマブなどの抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体、３Ｂ７、ＣＮＴＯ ９５などの抗インテグリン抗体、Ｂ－Ｂ４などの抗シンデカン－１抗体、ポラツズマブなどの抗ＣＤ７９ｂ、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体、好ましくは抗ＨＩＶｇｐ４１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体のいずれか１つ、より好ましくは トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、マツズマブ、抗ＣＤ７１抗体、ＯＫＴ－９のいずれか１つ、最も好ましくはトラスツズマブ、セツキシマブ、抗ＣＤ７１抗体 ＯＫＴ－９。
【0116】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、ＨＥＲ２、ＣＤ７１、ＨＩＶｇｐ４１及び／又はＥＧＦＲに結合することができるｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、好ましくはＶＨＨであり、より好ましくはラクダ科動物ＶＨである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0117】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、クローン１１Ａ４、クローン１８Ｃ３、クローン２２Ｇ１２、クローンＱ１７若しくはクローンＱ１７－Ｃタグによって産生されるｓｄＡｂから選択されるＨＥＲ２に結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＥＧＦＲ Ｑ８６－Ｃタグによって産生されるＥＧＦＲに結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＣＤ７１ Ｑ５２－Ｃタグによって産生されるＣＤ７１に結合するためのｓｄＡｂ；又はクローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８－Ｃタグによって産生されるＨＩＶｇｐ４１に結合するためのｓｄＡｂ；又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１のいずれか１つのｃＤＮＡによってコードされるｓｄＡｂ；又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６～７２のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂを含み、任意選択で、第１のコンジュゲートはさらに、アルブミンに結合するための共有結合したｓｄＡｂ、例えば、配列番号３３、３４及び３５のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つ以上を含み、好ましくは、ｓｄＡｂはＶＨＨであり、より好ましくはラクダ科動物ＶＨである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。本発明の第２のコンジュゲートへの組み込みに好適なＶＨＨは、例えば、単一ドメイン抗体データベース（Ｗｉｌｔｏｎ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８））、特許出願の米国特許出願公開第２０１６／０２５１４４０号明細書（抗ＣＤ１２３、抗ＣＥＡＣＡＭ）、米国特許第９６８３０４５号明細書（抗ｃ－Ｍｅｔ）、米国特許出願公開第２００９／０２５２６８１号明細書（抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ－１Ｒ）、米国特許第９９６９８０５号明細書（抗ＨＥＲ２）、米国特許出願公開第２０１９００２３７９６Ａ１号明細書（抗ＨＥＲ３）、並びにＫｉｊａｎｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）（抗ＨＥＲ２のため）及びＭｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）（抗ＨＥＲ２のため）に見出される。抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ３、抗ＣＤ１２３、抗ＣＥＡＣＡＭ、抗ｃ－Ｍｅｔ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ－１Ｒ、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ１９、抗ＨＥＲ１及び抗ＶＧＦＲ２に好適な一連のＶＨＨのアミノ酸配列及び／又はｃＤＮＡ配列もまた、腫瘍細胞特異的受容体に結合するそれらの能力を考慮して、配列番号１～３２及び３６～７２として、本明細書の以下に提供される。特に、腫瘍細胞特異的受容体ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ及びＣＤ７１のいずれかの結合部位に結合することができるＶＨＨは、本発明の第２のコンジュゲートへの組み込みに好適である。本発明者らは、サポニンと、そのような受容体のいずれか１つを標的とするＶＨＨを含む結合分子とのコンジュゲートがｓｄＡｂに結合したサポニンの送達に有効であることを明らかにした。例えば、実施例の項、及び図２～４を参照されたい。
【0118】
これらの細胞表面分子は、典型的には、少なくともある程度、腫瘍細胞特異性を有する腫瘍細胞上に存在する。腫瘍細胞特異性は、これらの受容体を本発明の第１及び第２のコンジュゲートのための好適な標的にし、したがって、第１のコンジュゲート中のｓｄＡｂは、そのような細胞表面受容体に結合することができ、したがって、抗体又はｓｄＡｂなどの本発明の第２のコンジュゲートに含まれる結合分子は、そのような細胞表面受容体に結合することができる。腫瘍細胞は一般に、抗体又はその結合フラグメント若しくはドメインなどの腫瘍細胞受容体を標的とする結合分子を含み、標的腫瘍細胞の内部、より具体的には前記腫瘍細胞のサイトゾル中に送達されるサポニンを含む第２のコンジュゲートの標的とされる。本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンは、細胞、例えば本発明の第２のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂなどの第２のコンジュゲートの結合分子が標的とする（腫瘍）細胞のサイトゾルにおいて、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の放出及び送達を刺激することができるので、ｓｄＡｂなどの結合分子の標的（腫瘍）細胞表面分子として、例えばＡＤＣ及びＡＯＣの標的として機能するのに適していることで知られている細胞表面受容体を選択することが特に好適である。それに伴い、本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンと共に、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣである第１のコンジュゲートの一部であるエフェクター分子の共送達に好適である。腫瘍細胞特異的受容体を本発明の第２のコンジュゲートで標的とすることにより、第２のコンジュゲートの一部としてのサポニンの標的細胞エンドソーム及び／又はリソソームへのエンドサイトーシス及び送達が促進される。腫瘍細胞をまたＡＤＣ若しくはＡＯＣ、例えば本発明の第１のコンジュゲートと接触させる場合、そのようなＡＤＣ又はＡＯＣ又は本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子は、エンドソーム又はリソソームに共送達され、サポニンの影響下で、続いて標的細胞のサイトゾルに送達される。前述のように、本発明の第２のコンジュゲートの一部としての標的化サポニンの適用は、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の生物学的活性を考慮した場合、受容体リガンド、抗体又はｓｄＡｂなどの細胞標的結合分子を欠く遊離サポニンの適用と比較して、サポニンの刺激効果の約１００倍～１０００倍の増強をもたらす。本発明の第２のコンジュゲートにおけるラクダ科動物ＶＨなどの小さいｓｄＡｂの適用は、抗体をベースとしたＡＤＣで一般に観察されるクリアランス速度と比較して、第２のコンジュゲートが投与されたヒト対象の循環及び身体からの本発明の第２のコンジュゲートのクリアランスを防止又は遅延させる。これが、前述したように、ｓｄＡｂを含む第１のコンジュゲートについても明らかである。加えて、ｓｄＡｂのサイズが比較的小さいため、例えば、サポニンに結合した抗体のより大きいサイズと比較して、連結したタンパク質ドメインの存在に起因する標的細胞内部のサポニン活性を制限又は妨害するリスクが限られる。一般に、サポニンに連結した分子のサイズが小さいほど、結合した分子、例えばＶＨＨなどの抗体ドメインの存在に起因する、細胞内のサポニン活性に対する干渉のリスクは小さくなる。さらに、ｓｄＡｂの比較的小さいサイズは、腫瘍組織などの組織におけるそれらの急速な分布をもたらし、本発明の第２のコンジュゲートによる標的細胞への到達を改善し、それと共に、例えばＡＤＣ、ＯＡＣにおいて一般的に適用される相対的に大きいサイズのＩｇＧと比較して、標的細胞への結合（の程度）を改善する。本発明の第２のコンジュゲートにおいてｓｄＡｂを適用することの多くの利点の１つ（これは、例えばＡＤＣ及びＡＯＣすなわち本発明の第１のコンジュゲートにおいてｓｄＡｂを適用することにも当てはまる）は、例えばＩｇＧ型の通常の抗体に共通のＦｃテールが存在しないことである。本発明の第１及び第２のコンジュゲートのｓｄＡｂにＦｃテールが存在しないことは、第１及び第２のコンジュゲートがそれを必要とする患者に投与された場合のＦｃγ受容体媒介オフターゲット効果、例えば、Ｆｃγ受容体活性化に関連する望ましくない副作用の発生を防止する。Ｆｃテールの欠如は、例えば抗体をベースとしたＡＤＣが投与される患者の細胞にＦｃが結合することによって生じる副作用のリスクを排除する。本発明のコンジュゲートを含むｓｄＡｂは、このＦｃ媒介性の望ましくない副作用のリスクを有さないが、腫瘍細胞がＡＤＣ（比較的低用量で；実施例の項も参照されたい）及び本発明の第２のコンジュゲート（比較的低用量で；実施例の項も参照されたい）の両方と接触した場合、そのような第１及び第２のコンジュゲートが、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の増強において非常に効率的で且つ有効であることを、本発明者らは明らかにした。
【0119】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、結合分子中のスルフヒドリル基にチオ－エーテル結合を介して共有結合しているサポニン又はサポニン誘導体を含み、リンカーＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）を介した共有結合がサポニン又はサポニン誘導体のアグリコンコア構造のＣ２３位のアルデヒド基に共有結合し、システインのスルフヒドリル基などの結合分子中のスルフヒドリル基に共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0120】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、サポニン又はその誘導体のアグリコンコア構造のＣ２３位に任意選択によるアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンのタイプに属するビデスモシドトリテルペンサポニン又はその誘導体であり、サポニンのアグリコンコア構造のＣ３β－ＯＨ基の第１の糖鎖にグルクロン酸単位を含むサポニン又はサポニン誘導体を含み、サポニン又はその誘導体は第１の糖鎖のグルクロン酸単位のカルボキシル基を介して、好ましくは少なくとも１つのリンカーを介して結合分子のアミノ酸残基に共有結合しており、アミノ酸残基は好ましくはシステイン及びリジンから選択される、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0121】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、少なくとも１つのサポニン又はその誘導体のアグリコンコア構造のＣ３β－ＯＨ基の第１の糖鎖中にグルクロン酸単位を含むサポニン又はその誘導体を含み、このグルクロン酸単位はリンカーに共有結合しており、このリンカーは好ましくは結合分子中のアミン基、例えば、リシンのアミン基又は結合分子のＮ末端にアミド結合を介して共有結合しており、好ましくは、グルクロン酸単位は、リンカー、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）に共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0122】
一実施形態は、第２のコンジュゲートが、２つ以上の共有結合したサポニン又はその誘導体、好ましくは２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２、６４、１２８若しくは１～１００、又はその間の任意の数、例えば７、９、１２のサポニン又はその誘導体を含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0123】
一実施形態は、２つ以上の共有結合したサポニン又はサポニン誘導体は、結合分子のアミノ酸残基に、好ましくはシステイン及び／若しくはリジンに直接共有結合し、且つ／又は少なくとも１つのリンカー及び／若しくは少なくとも１つの切断可能なリンカーを介して共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。リンカーを介した、第２の細胞表面分子のための抗体、ｓｄＡｂ又はリガンドなどの結合分子へのサポニンの結合は、サポニンを結合するための結合分子の結合部位を考慮した場合、柔軟性を提供する。さらに、そのようなリンカーは、ｓｄＡｂなどの結合分子とサポニンとの間のスペーサーとして作用することができ、その結果、結合分子は細胞表面分子の結合部位に結合する能力を維持し、また、サポニンは、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子のエンドソームエスケープを増強するその能力を維持する（ｓｄＡｂなどの結合分子が細胞表面分子に結合し、第１のコンジュゲートが標的とする細胞のエンドソーム又はリソソームに第２のコンジュゲートがエフェクター分子と共に共局在化した場合）。
【0124】
一実施形態は、２つ以上の共有結合したサポニン又はサポニン誘導体が、少なくとも１つのオリゴマー分子又はポリマー分子を含み、２つ以上のサポニン又はサポニン誘導体が共有結合している、共有結合サポニンコンジュゲートの一部であり、共有結合サポニンコンジュゲートは結合分子に共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物であって、このような共有結合サポニンコンジュゲートは、単結合を介して、好ましくは（切断可能である）リンカーを介して、抗体又はｓｄＡｂなどの第２のコンジュゲートに含まれる結合分子に結合することができる、複数のサポニン部分のための担体として機能する。共有結合サポニンコンジュゲートは、これらのサポニンを共有結合するための結合部位を含む選択されたオリゴマー又はポリマー構造のタイプに関連して、任意の選択された数の共有結合したサポニン部分、例えば１～２００個のサポニン部分を有することができるので、本発明の第２のコンジュゲート中のサポニン部分の数を考慮した場合に、このような共有結合サポニンコンジュゲートの適用は自由度を提供する。例えば、本発明の第１のコンジュゲートに含まれる選択されたエフェクター分子のサイトゾル送達のために、本発明の第２のコンジュゲート中に存在するサポニンの数を、エフェクター分子のサイトゾル送達を刺激するのに十分な数のサポニン部分を有する共有結合サポニンコンジュゲートを提供することによって適合させることができる（共有結合サポニンコンジュゲートが本発明の第２のコンジュゲートの一部である場合、及びエフェクター分子がその生物学的活性を発揮すべき標的細胞のエンドソーム又はリソソーム中に第２のコンジュゲートと共局在化する場合）。
【0125】
一実施形態は、そのような共有結合サポニンコンジュゲートの１～８個、より好ましくはそのような共有結合サポニンコンジュゲートの２～４個が結合分子に結合しており、少なくとも１つの共有結合サポニンコンジュゲートは、任意選択によりデンドロンに基づいており、任意選択により１～３２個のサポニン又はサポニン誘導体、好ましくは２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２個、又はその間の任意の数、例えば７、９、１２個のサポニン又はサポニン誘導体は、少なくとも１つの共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に、直接又はリンカーを介して、共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。好ましくは、共有結合サポニンコンジュゲートの１つ又は２つは、本発明の第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂなどの単一の結合分子に結合している。多くの目的のために、単一のサポニン又は単一の共有結合サポニンコンジュゲートの、第２のコンジュゲートに含まれる抗体又はｓｄＡｂなどの単一の結合分子への結合は、標的細胞及び前記細胞のサイトゾル内へのエフェクター分子送達の効率的な刺激に十分であり、ここで、エフェクター分子は、本発明の第１のコンジュゲートに含まれている。典型的には、４、８又は１６個のサポニンが本発明の第２のコンジュゲートに含まれ、例えば、４又は８個のサポニンが本発明の第２のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂなどの結合分子に結合した単一の共有結合サポニンコンジュゲートに含まれる。典型的には、そのような本発明の第２のコンジュゲートは、サポニン若しくはサポニン又は共有結合サポニンコンジュゲートが結合している単一の抗体又は単一のｓｄＡｂを含み、好ましくは、単一のサポニン又は単一の共有結合サポニンコンジュゲートが第２のコンジュゲートの一部である。
【0126】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体が切断可能なリンカーを介して結合分子に共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0127】
一実施形態は、切断可能なリンカーが、酸性条件、還元条件、酵素条件並びに／又は光誘導条件下で切断され、好ましくは、切断可能なリンカーは、酸性条件下で切断されるヒドラゾン結合及びヒドラジド結合から選択される切断可能な結合、並びに／又はタンパク質分解、例えばカテプシンＢによるタンパク質分解を受けやすい結合、並びに／又はジスルフィド結合などの還元条件下で切断を受けやすい結合を含む、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0128】
一実施形態は、切断可能なリンカーが、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞のエンドソーム及び／又はリソソームに存在するような酸性条件下、好ましくはｐＨ４．０～６．５、より好ましくはｐＨ≦５．５でインビボにて切断される、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。エンドソーム及びリソソームに見られるような条件下で切断可能であるそのような切断可能なリンカーは、サポニンを本発明の第２のコンジュゲートの残部から切断する際、エンドソーム又はリソソーム内部へ遊離サポニンを送達しやすくする。このように、本発明の第２のコンジュゲートは、標的細胞上の第２の細胞表面分子への抗体又はｓｄＡｂなどの結合分子の特異的結合時のサポニンの細胞を標的とした送達、及び細胞内、すなわちエンドソーム（又はリソソーム）内の遊離サポニンの存在の利益を組み合わせ、これはエンドソーム（又はリソソーム）から標的細胞のサイトゾルへの、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の送達を刺激及び／又は促進する遊離サポニンの能力に寄与する。
【0129】
一実施形態は、共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子が結合分子に、好ましくは結合分子のアミノ酸残基に共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0130】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体は、本発明による切断可能なリンカーを介して、共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合している。本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0131】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体が、共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に、イミン結合、ヒドラゾン結合、ヒドラジド結合、オキシム結合、１，３－ジオキソラン結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、アミド結合、ペプチド結合又はエステル結合のいずれか１つ以上を介して、好ましくはリンカーを介して共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0132】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体がＣ２３位にアルデヒド官能基を含むアグリコンコア構造を含み、サポニンは、任意選択により、サポニンのアグリコンコア構造のＣ３β－ＯＨ基の第１の糖鎖にグルクロン酸官能基を含み、アルデヒド官能基は共有サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子への共有結合に関与し、且つ／又は、グルクロン酸官能基は（存在する場合）は共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子への共有結合に関与し、サポニン又はサポニン誘導体の結合は直接共有結合を介するか、又はリンカーを介し、リンカーは切断可能なリンカー又は安定なリンカーである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。ここで、安定とは、サポニンと、ｓｄＡｂなどの結合分子との間の結合、又はサポニンとオリゴマー又はポリマー構造との間の結合を指し、この結合は、細胞内の酸性条件下、特にそのような細胞のエンドソーム又はリソソーム内の酸性条件下で、インタクトなままである（切断されない）。さらに、そのような安定な結合は、例えば、共有結合サポニンコンジュゲートを含む本発明の第２のコンジュゲートが投与されるヒト対象の循環内及び臓器内で、インタクトなままである（すなわち、切断されない）。対照的に、抗体若しくはｓｄＡｂなどの第２のコンジュゲートに含まれる結合分子への、又はオリゴマー構造若しくはポリマー構造へのサポニンの結合に関連した切断可能なリンカーは、ヒト細胞、例えば腫瘍細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームの内部に見られるような酸性条件下で切断される結合を指し、その一方で、そのような切断可能なリンカーは、そのような切断可能な結合を含む第２のコンジュゲートが循環又は臓器に、すなわち、例えば本発明の第２のコンジュゲートが投与されるヒト対象の外部細胞中に存在する場合、インタクトなままである（切断されない）。
【0133】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体のアグリコンコア構造のＣ２３位におけるアルデヒド官能基がリンカーＥＭＣＨに共有結合しており、このＥＭＣＨは、共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子中又はポリマー分子中のスルフヒドリル基、例えばシステインのスルフヒドリル基にチオ－エーテル結合を介して共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。サポニンのアグリコンのアルデヒド基へのＥＭＣＨリンカーの結合は、ヒドラゾン結合の形成をもたらす。このようなヒドラゾン結合は、エンドソーム及びリソソーム内の酸性条件下で切断可能な結合の典型的な例である。本発明の第２のコンジュゲート中の抗体若しくはｓｄＡｂなどの第２のコンジュゲートに含まれる結合分子、又は共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー構造若しくはポリマー構造に結合するサポニンであって、そのような共有結合サポニンコンジュゲートが第２のコンジュゲートの結合分子に、例えば本発明の第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂに結合しているサポニンは、第２のコンジュゲートの抗体又はｓｄＡｂなどの結合分子が結合することができる第２の細胞表面分子を露出する標的細胞のエンドソーム又はリソソームに送達されると、本発明の第２のコンジュゲートから放出可能である。このように、本発明の第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂなどの結合分子に結合したサポニンは、細胞外からエンドソーム（又はリソソーム）にトランスファーされ、エンドソーム（又はリソソーム）において、ヒドラゾン結合のｐＨ駆動切断の際に第２のコンジュゲートから放出される。エンドソーム（又はリソソーム）において、遊離サポニンは、エンドソーム（又はリソソーム）に共局在化する本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子のサイトゾルへの送達を考慮した場合、その刺激活性を発揮することができる。驚くべきことに、本発明者らは、サポニンについて、サポニンがエンドソーム又はリソソーム中に遊離形態で存在することが、サポニンのエンドソームエスケープ促進活性にとって必須ではないことを立証した。また、例えば、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンは、それぞれ第１及び第２のコンジュゲートの一部としてのエフェクター分子及びサポニンの両方が、第１の細胞表面分子及び第２の細胞表面分子（これらは同じであっても異なっていてもよい）を発現する同じ標的細胞と接触すると、エンドソーム／リソソームから標的細胞のサイトゾルへの、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子の送達を増強する。
【0134】
一実施形態は、サポニン又はサポニン誘導体のアグリコンコア構造のＣ３β－ＯＨ基における第１の糖鎖のグルクロン酸官能基がリンカーＨＡＴＵに共有結合しており、このＨＡＴＵは、共有結合サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子中のアミン基、例えば、リシンのアミン基又はタンパク質のＮ末端に、アミド結合を介して共有結合している、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。ＨＡＴＵリンカーがサポニン及び第２のコンジュゲートの結合分子、例えば、ｓｄＡｂに結合する場合、サポニンは、例えば、ｓｄＡｂのＮ末端又はｓｄＡｂに存在するリジンのアミン基に結合する。
【0135】
一実施形態は、共有結合サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子が、結合分子、好ましくは結合分子のアミノ酸残基に結合し、共有結合サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子にクリックケミストリー基を含み、クリックケミストリー基は、好ましくはテトラジン、アジド、アルケン若しくはアルキン、又はこれらの基の環状誘導体から選択され、より好ましくはクリックケミストリー基はアジドである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。
【0136】
一実施形態は、共有結合サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子が、線状ポリマー、分岐状ポリマー及び／若しくは環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、ＤＮＡ、ポリペプチド、ポリ－リシン、ポリ－エチレングリコール、オリゴ－エチレングリコール（ＯＥＧ）、例えばＯＥＧ３、ＯＥＧ４及びＯＥＧ５から選択されるポリマー構造及び／若しくはオリゴマー構造、又はこれらのポリマー構造及び／若しくはオリゴマー構造の集合体を含み、集合体は、好ましくは、共有架橋によって構築され、好ましくは、共有結合サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子は、デンドロン、例えばポリ－アミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである、本発明の医薬組み合わせ又は医薬組成物である。本発明の第２のコンジュゲートに組み込まれる選択されたサポニンの数によって駆動されて、オリゴマー構造又はポリマー構造のタイプとサイズ若しくは長さとが選択される。すなわち、本発明の第２のコンジュゲートを形成するために、ｓｄＡｂなどの第２のコンジュゲートに含まれる結合分子に結合するサポニンの数により、所望の数のサポニンを結合するのに十分な量の結合部位を有する好適なオリゴマー又はポリマー構造を選択することができ、それにより、本発明の第２のコンジュゲートを提供するために、抗体、受容体リガンド又はｓｄＡｂなどの結合分子に結合する選択された数のサポニン部分を有する共有結合サポニンコンジュゲートを提供することができる。例えば、ＯＥＧの長さ又はデンドロン若しくはポリリシン分子のサイズにより、そのようなオリゴマー又はポリマー構造に共有結合することができるサポニンの最大数が決定される。
【0137】
したがって、本発明による第２のコンジュゲートは、少なくとも１つのサポニンを含む。この文脈における「少なくとも１つ」は、第２のコンジュゲートが１つのサポニン分子を含むが、また、数個（例えば、２、３又は４個）のサポニン又は多数（例えば、１０、２０又は１００個）のサポニンも含み得ることを意味する。用途に応じて、第２のコンジュゲートは共有結合したサポニンを含む共有結合した足場（共有結合サポニンコンジュゲート）を含むことができ、足場は、規定された数のサポニンを含むように設計することができる。好ましくは、本発明による第２のコンジュゲートは、乱数ではなく、規定された数又は範囲のサポニンを含む。これは、製造販売承認に関連する医薬品開発にとって特に有利である。この点において、規定された数とは、第２のコンジュゲートが好ましくは以前に規定された数のサポニンを含むことを意味する。これは、例えば、サポニンが（共有結合的に）結合するための特定の数の可能な部分を有するポリマー構造を含む足場を設計することによって達成される。理想的な状況下では、これらの部分の全てがサポニンに結合し、足場は以前に規定された数のサポニンを含む。最適な数を使用者が必要に応じて容易に試験することができるように、例えば、２、４、８、１６、３２、６４個などのサポニンを含む標準的な足場セットを提供することが想定される。一実施形態は、本発明の足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を含む本発明の第２のコンジュゲートであり、サポニンは、規定された範囲で存在し、例えば、非理想的な状況下で、ポリマー構造中に存在する全ての部分がサポニンに結合するわけではない。そのような範囲は、例えば、足場１つ当たり２～４個のサポニン分子、足場１つ当たり３～６個のサポニン分子、足場１つ当たり４～８個のサポニン分子、足場１つ当たり６～８個のサポニン分子、足場１つ当たり６～１２個のサポニン分子などであり得る。このような場合、本発明による足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を含む第２のコンジュゲートは、したがって、範囲が２～４と規定される場合、２、３又は４個のサポニンを含む。
【0138】
足場は基本的に、足場に共有結合したサポニンの種類とは無関係であり、足場は、本発明の第２のコンジュゲートにおいて、受容体リガンド、ｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子結合分子にその後（順番に）共有結合する。したがって、足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を含む本発明の第２のコンジュゲートは、プラットフォーム技術のための基礎となる生成物である。本発明の第２のコンジュゲートにおける少なくとも１つの共有結合したサポニンは、本発明による、ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣなどの本発明の第１のコンジュゲートに含まれる、細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂに結合したエフェクター部分の細胞内送達を媒介するので、本発明による足場技術は、ＡＤＣ又はＡＯＣ（すなわち、本発明の第１のコンジュゲート）を、サポニンと、例えば、また好ましくは、標的細胞表面分子、例えば、また好ましくは、受容体及びそれに結合したコンジュゲートのエンドサイトーシスに関与する受容体に結合するためのｓｄＡｂなどの抗体を含む、本発明の第２のコンジュゲートと組み合わせることによって、サポニンによる制御された細胞内エフェクター部分送達を媒介するシステムである。足場は、サポニンと、第２のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子を標的とするリガンドに連結することができる最適化された機能的に活性な単位を、ｓｄＡｂなどのリガンド中の単一且つ所定の位置に提供する。
【0139】
一実施形態は、本発明による足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を含む本発明の第２のコンジュゲートであり、ポリマー又はオリゴマー構造のモノマーの数は、正確に規定された数又は範囲である。好ましくは、ポリマー又はオリゴマー構造は、ポリ（アミン）、例えばポリエチレンイミン及びポリ（アミドアミン）、などの構造、又はポリエチレングリコール、ポリ（エステル）、例えばポリ（ラクチド）、ポリ（ラクタム）、ポリラクチド－コ－グリコリドコポリマー、ポリ（デキストリン）、又はペプチド若しくはタンパク質などの構造、又は天然及び／若しくは人工ポリアミノ酸、例えばポリ－リシン、ＤＮＡポリマー、安定化ＲＮＡポリマー若しくはＰＮＡ（ペプチド核酸）ポリマーなどの構造を含み、これらは、直鎖状、分岐状若しくは環状のポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、又はこれらの構造の集合体（単体又は混合物）の形態を有する。好ましくは、ポリマー又はオリゴマー構造は生体適合性であり、ここで、生体適合性とは、ポリマー又はオリゴマー構造が生物において実質的な急性又は慢性の毒性を示さず、そのまま排泄されるか、又は身体の代謝によって排泄可能で且つ／又は生理学的な化合物に完全に分解され得ることを意味する。集合体は、共有架橋結合若しくは非共有結合及び／又は引力によって構築することができる。したがって、それらはまた、ナノゲル、ミクロゲル若しくはヒドロゲルを形成することができ、又はそれらは、無機ナノ粒子、コロイド、リポソーム、ミセル、又はコレステロール及び／若しくはリン脂質を含む粒子様構造体などの担体に結合することができる。前記ポリマー又はオリゴマー構造は、好ましくは、グリコシド分子（及び／又は、リガンド、モノクローナル抗体若しくはｓｄＡｂなどのその断片などの担体分子（ここで、本発明においてはｓｄＡｂが好ましい）の結合のための、正確に規定された数又は範囲の結合部分（化学基）を有する。ポリマー又はオリゴマー構造中の正確に規定された数又は範囲の結合部分（化学基）の、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは（約）１００％が、本発明による足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）のグリコシド分子（本発明のサポニン）によって占められている。
【0140】
好ましくは、デンドロンは、フォーカルポイントと呼ばれる、ツリーの起点に単一の化学的にアドレス可能な基を有する、分岐した明確に規定されたツリー様ポリマーである。デンドリマーは、２つ以上のデンドロンがそれらのフォーカルポイントで接続された接合体である。デンドロン化ポリマーは、１つ以上のデンドロンのフォーカルポイントがポリマーに接続した接合体である。好ましい実施形態では、本発明による足場であって、ポリマー又はオリゴマー構造は、線状、分岐状若しくは環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、又はこれらの構造の集合体（単体又は混合物）を含み、集合体は共有架橋結合又は非共有結合性引力によって構築することができ、且つ、ナノゲル、ミクロゲル、又はヒドロゲルを形成することができ、好ましくは、ポリマーは、ポリ（アミン）、例えばポリエチレンイミン及びポリ（アミドアミン）の誘導体、並びにポリエチレングリコール、ポリ（エステル）、例えばポリ（ラクチド）、ポリ（ラクタム）、ポリラクチド－コ－グリコリドコポリマー、及びポリ（デキストリン）などの構造体、並びに天然及び／若しくは人工ポリアミノ酸、例えばポリ－リシン、又はペプチド若しくはタンパク質、又はＤＮＡポリマー、安定化ＲＮＡポリマー若しくはＰＮＡ（ペプチド核酸）ポリマーなどの構造体である足場が提供される。好ましくは、ポリマー又はオリゴマー構造は生体適合性である。
【0141】
本発明の第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂ及び本発明の第１のコンジュゲート中、すなわちＡＤＣ又はＡＯＣ中のｓｄＡｂなどの結合分子が、異なる腫瘍細胞特異的受容体などの異なる細胞表面分子を標的とする場合、２つの異なる標的はいずれも、第１のコンジュゲート、すなわちＡＤＣ又はＡＯＣに含まれるエフェクター分子、及び本発明の第２のコンジュゲートに含まれるサポニンが共送達されるべき標的細胞の表面に存在することは理解されるであろう。ＡＤＣ又はＡＯＣ（本発明の第１のコンジュゲート）及び本発明の第２のコンジュゲートが異なる（腫瘍）細胞受容体を標的とする場合、利点は、本発明の第１のコンジュゲート（ＡＤＣ又はＡＯＣ）及び本発明の第２のコンジュゲートの用量を、標的細胞を含む異なる細胞型の混合物と接触させたときの、本発明の第１のコンジュゲート（ＡＤＣ又はＡＯＣ）及び本発明の第２のコンジュゲートの組み合わせをそれを必要とする患者に（同時）投与した場合に起こるような、例えば、その表面に２つの細胞表面分子のうちの１つを有する細胞に対するオフターゲット効果のリスクが低減されることである。治療有効量のエフェクター分子を標的細胞内に送達するには低すぎる本発明の第１のコンジュゲート（ＡＤＣ又はＡＯＣ）の用量を投与することによって、ＡＤＣ又はＡＯＣが、本発明の第２のコンジュゲートの形態の標的化サポニンの非存在下で、そのような標的細胞に結合した場合、ＡＤＣ又はＡＯＣ（本発明の第１のコンジュゲート）が結合し得る細胞表面分子を発現し得るが、本発明の第２のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂなどの結合分子の標的を発現しない細胞の侵入は、したがって、例えば、ＡＤＣを考慮した場合の細胞毒性を誘導しない。ＡＤＣ又はＡＯＣ（本発明の第１のコンジュゲート）を結合するための受容体及び本発明の第２のコンジュゲートを結合するための受容体の両方を有する標的細胞においてのみ、両受容体を発現する前記標的細胞内部に共局在するサポニンの影響下でエンドソームエスケープが起こったならば、エフェクター分子の用量は前記細胞のサイトゾルにおいてその生物学的効果を発揮するのに十分である。
【0142】
いくつかの実施形態では、本発明の第２のコンジュゲートに含まれるｓｄＡｂなどの結合分子及び本発明の第１のコンジュゲート（すなわち、ＡＤＣ又はＡＯＣ）に含まれるｓｄＡｂは、同じ腫瘍細胞特異的受容体などの同じ細胞表面分子を標的とする。このように、単一の腫瘍細胞特異的受容体のみが存在した場合、ＡＤＣ又はＡＯＣ（本発明の第１のコンジュゲート）と本発明の第２のコンジュゲートの両方の、そのような単一タイプの標的受容体を有する標的細胞の内部への同時送達が可能である。腫瘍細胞特異的受容体、例えば、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ７１などの単一細胞特異的表面分子を用いた標的細胞内へのそのような同時送達の利点は、サポニンを有する本発明の第２のコンジュゲート及びＡＤＣ又はＡＯＣ（すなわち、本発明の第１のコンジュゲート）によるそのような標的腫瘍細胞の特異的標的化に十分に特異的である単一受容体のみを発現する腫瘍細胞を標的とし得る可能性である。そのような単一の特異的受容体を選択し、標的化することにより、標的化サポニン及び標的化エフェクター分子を腫瘍細胞内に同時送達することが可能になり、その結果、そのような治療困難な腫瘍細胞に、有効用量のエフェクター分子を依然として効果的に提供することができる。
【0143】
本発明の一態様は、医薬として使用するための、本発明の医薬組み合わせ又は本発明による医薬組成物に関する。
【0144】
本発明の一態様は、癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、アミロイドーシス、酵素欠損に関連する疾患、ウイルス感染症などの感染症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、α１－アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシスの治療又は予防に使用するための、本発明の医薬組み合わせ又は本発明による医薬組成物に関する。
【0145】
驚くべきことに、本発明者らは、いかなる腫瘍細胞死滅ももたらさない本発明の第１のコンジュゲート、すなわちＡＤＣの用量が、エフェクター分子を含む本発明の第１のコンジュゲートを本発明の第２のコンジュゲートの存在下で腫瘍細胞と接触させた場合、効率的な腫瘍細胞死滅に十分であることを見出した。例を図４～７に示す。例えば、ＡＤＣ抗ＣＤ７１ ＶＨＨ－毒素、抗ＨＥＲ２ ＶＨＨ－毒素、又は抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ－毒素などの本発明の第１のコンジュゲートの用量は、腫瘍細胞と接触させた場合、腫瘍細胞に対して毒性効果を発揮しない。典型的な毒素は、タンパク質毒素、例えば、ジアンチン及びサポリンである。しかしながら、本発明の第１のコンジュゲートが本発明の第２のコンジュゲートと一緒に同時投与される場合、効率的な腫瘍細胞死滅が達成される。本発明の第２のコンジュゲートは、例えば、抗ＨＥＲ２ ＶＨＨ－ＳＯ１８６１、抗ＣＤ７１ ＶＨＨ－ＳＯ１８６１、抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ－ＳＯ１８６１、セツキシマブ－ＳＯ１８６１、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１である。本発明の第１のコンジュゲートは、例えば、ＨＥＲ２、ＣＤ７１又はＥＧＦＲに結合することができるＶＨＨを含むＡＤＣなどのＡＤＣであり、例えば、ＡＤＣは、ジアンチン又はサポリンなどのタンパク質毒素を含む。前述したように、本発明の第２のコンジュゲートを適用することにより、本発明の第１のコンジュゲート、すなわちＡＤＣ又はＡＯＣに含まれるエフェクター分子の標的細胞内における効率的な生物学的活性を達成するのに必要なサポニン用量は、サポニンを含む第２のコンジュゲートを本発明の第１のコンジュゲート、すなわちＡＤＣ又はＡＯＣと標的細胞へ同時投与した場合、本発明の第１のコンジュゲートを遊離サポニンと共に標的細胞へ同時投与した場合に必要とする遊離サポニンの用量と比較して、約１００～１０００倍低い。これにより、本発明の第２のコンジュゲートは、本発明の第１のコンジュゲート、すなわちＡＤＣ又はＡＯＣを含むｓｄＡｂを、標的化されたサポニン（本発明の第２のコンジュゲート）の非存在下でそれを必要とする患者に投与する場合に、腫瘍細胞に有効でないであろうＡＤＣ又はＡＯＣの用量で増強し、さらに、本発明の第２のコンジュゲートは、本発明の第１のコンジュゲート、すなわちＡＤＣ又はＡＯＣのエフェクター分子の増強を考慮した場合、既に比較的低い用量で、すなわち、ｓｄＡｂなどの腫瘍細胞を標的とする結合分子と共に提供されない遊離サポニンがエフェクター分子の増強に十分に有効でない用量で、既に十分に有効である。併せて、ＡＤＣ又はＡＯＣが本発明の第２のコンジュゲートの存在下で患者に同時投与された場合、低い用量で既に有効であるので、治療有効量の本発明の第１のコンジュゲート、すなわち、腫瘍細胞を標的とするｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣを用いて、治療を必要とするヒト患者を治療するための改善された方法を提供する。本発明の第１及び第２のコンジュゲートの多くの利点の１つは、第１のコンジュゲートのｓｄＡｂ部分に、好ましくは第２のコンジュゲートにも、Ｆｃテールが存在しないことにある。Ｆｃテールの欠如は、Ｆｃ受容体を有する患者のオフターゲット細胞へのコンジュゲートの望ましくない結合を防止し、さもなければ、この結合は、そのようなＦｃテールが存在する場合、多くの従来のＡＤＣ、ＡＯＣに見られるような副作用をもたらし得る。Ｆｃテールを含む抗体ベースのＡＤＣ及びＦｃテールを含むＡＯＣは、そのようなＩｇＧベースのＡＤＣ、ＡＯＣのＦｃ受容体への望ましくない結合のために、効力の低下を被る。Ｆｃ受容体結合の結果として、そのようなＩｇＧベースのＡＤＣ及びＡＯＣの有効用量が低下する。それに伴い、Ｆｃテールの欠如は、この点でいくつかの利点を提供する。第１のコンジュゲート、好ましくは第２のコンジュゲートもまた、Ｆｃ受容体へのオフターゲット及び望ましくない結合は起こり得ない。これにより、本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、標的受容体媒介エンドサイトーシス及びエンドソーム内への本発明の第１及び第２のコンジュゲートの送達を考慮した場合、ＩｇＧベースのコンジュゲートで見られる欠点である、Ｆｃ受容体結合のためにコンジュゲートが「失われる」ことがないので、より低い有効用量を有する。結果として、本発明の第１のコンジュゲートの治療域は、ｓｄＡｂがＦｃテールを含む従来のＩｇＧに置き換えられた場合に達成されるであろう治療域よりも広くなる。同様に、結果として、本発明の第２のコンジュゲートの治療域は、第２のコンジュゲート中のｓｄＡｂが、標的細胞上の第２の細胞表面分子に結合するための結合分子、例えば、Ｆｃテールを含む従来のＩｇＧによって置き換えられる場合に達成されるであろう治療域よりも広くなる。
【0146】
一実施形態は、サポニンがＳＯ１８６１若しくはＱＳ－２１であるか、又はサポニン誘導体がＳＯ１８６１誘導体若しくはＱＳ－２１誘導体、好ましくは本発明のサポニン誘導体である、本発明の使用のための医薬組み合わせ、又は本発明による使用のための医薬組成物である。
【0147】
一実施形態は、本発明の使用のための医薬組み合わせ、又は本発明による使用のための医薬組成物であって、
－前記使用は、ヒト対象における癌の治療又は予防におけるものであり；且つ／又は
－前記使用は、それを必要とする患者における癌の治療又は予防におけるものであり、第１及び第２の細胞表面分子は同一若しくは異なる腫瘍細胞表面分子、好ましくは腫瘍細胞特異的表面分子であり、ｓｄＡｂ及び第２のコンジュゲートの結合分子は、腫瘍細胞表面分子、好ましくは腫瘍細胞特異的表面分子に結合し；且つ／又は
－医薬組み合わせ、好ましくは治療有効量の医薬組み合わせが、それを必要とする患者、好ましくはヒト患者に投与される
医薬組み合わせ、又は本発明による使用のための医薬組成物である。
－前記使用は、ヒト対象における癌の治療又は予防におけるものであり；且つ／又は
－前記使用は、それを必要とする患者における癌の治療又は予防におけるものであり、第１及び第２の細胞表面分子は同一若しくは異なる腫瘍細胞表面分子、好ましくは腫瘍細胞特異的表面分子であり、ｓｄＡｂ及び第２のコンジュゲートの結合分子は、腫瘍細胞表面分子、好ましくは腫瘍細胞特異的表面分子に結合し；且つ／又は
－医薬組み合わせ、好ましくは治療有効量の医薬組み合わせが、それを必要とする患者、好ましくはヒト患者に投与される
医薬組み合わせ、又は本発明による使用のための医薬組成物である。
【0148】
本発明のさらなる態様は、本発明の第１のコンジュゲートを細胞外から前記細胞内に、好ましくは前記細胞のサイトゾルにトランスファーするインビボ又はエクスビボの方法であって、
ａ）本発明による第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、好ましくは、肝細胞、ウイルス感染細胞、自己免疫細胞及び腫瘍細胞などの異常細胞から選択される工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする本発明の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）本発明のサポニン又はサポニン誘導体を提供し、且つ／或いは、工程ａ）で提供される細胞が本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する場合、本発明の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のサポニン、サポニン誘導体、及びコンジュゲートのいずれか１つ以上とに、インビトロ又はエクスビボで接触させる工程、
を含み、それにより、第１のコンジュゲートの細胞外から前記細胞内への、好ましくは前記細胞のサイトゾル内へのトランスファーを確立する、方法に関する。
ａ）本発明による第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、好ましくは、肝細胞、ウイルス感染細胞、自己免疫細胞及び腫瘍細胞などの異常細胞から選択される工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする本発明の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）本発明のサポニン又はサポニン誘導体を提供し、且つ／或いは、工程ａ）で提供される細胞が本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する場合、本発明の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のサポニン、サポニン誘導体、及びコンジュゲートのいずれか１つ以上とに、インビトロ又はエクスビボで接触させる工程、
を含み、それにより、第１のコンジュゲートの細胞外から前記細胞内への、好ましくは前記細胞のサイトゾル内へのトランスファーを確立する、方法に関する。
【0149】
一実施形態は、本発明の第１のコンジュゲートを本発明による細胞外から前記細胞内にトランスファーするためのインビトロ又はエクスビボの方法であって、第１のコンジュゲートが前記細胞内にトランスファーされたなら、第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター分子を細胞のエンドソーム、エンドリソソーム又はリソソームから細胞のサイトゾル内へさらにトランスファーするために、
ａ）本発明による第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、好ましくは、肝細胞、ウイルス感染細胞、自己免疫細胞及び腫瘍細胞などの異常細胞から選択される工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする本発明の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）本発明のいずれか１つのサポニン又はサポニン誘導体を提供するか、或いは、好ましくは、工程ａ）で提供される細胞が本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する場合、本発明の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のサポニン、サポニン誘導体、及びコンジュゲートのいずれか１つ以上とに、インビトロ又はエクスビボで接触させる工程、
を含み、それにより、細胞外から前記細胞内への第１のコンジュゲートのトランスファーを確立し、且つ、それにより、第１のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の前記細胞のサイトゾルへの、任意選択で、第１のコンジュゲートの一部として、又はエンドソーム、エンドリソソーム若しくはリソソーム中の第１のコンジュゲートから切断された遊離エフェクター分子としての送達を確立する方法である。
ａ）本発明による第１の細胞表面分子をその表面に発現し、任意選択で、本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、好ましくは、肝細胞、ウイルス感染細胞、自己免疫細胞及び腫瘍細胞などの異常細胞から選択される工程；
ｂ）工程ａ）で提供される細胞へトランスファーする本発明の第１のコンジュゲートを提供する工程；
ｃ）本発明のいずれか１つのサポニン又はサポニン誘導体を提供するか、或いは、好ましくは、工程ａ）で提供される細胞が本発明による第２の細胞表面分子をその表面に発現する場合、本発明の第２のコンジュゲートを提供する工程；
ｄ）工程ａ）の細胞を、工程ｂ）の第１のコンジュゲートと、工程ｃ）のサポニン、サポニン誘導体、及びコンジュゲートのいずれか１つ以上とに、インビトロ又はエクスビボで接触させる工程、
を含み、それにより、細胞外から前記細胞内への第１のコンジュゲートのトランスファーを確立し、且つ、それにより、第１のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の前記細胞のサイトゾルへの、任意選択で、第１のコンジュゲートの一部として、又はエンドソーム、エンドリソソーム若しくはリソソーム中の第１のコンジュゲートから切断された遊離エフェクター分子としての送達を確立する方法である。
【0150】
正式な用語を使用すれば、グリコシドは、糖基がそのアノマー炭素を介して別の基にグリコシド結合により結合している任意の分子である。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明の文脈におけるサポニンなどのグリコシド分子は、特にエフェクター部分のエンドソームエスケープを促進することによって、エフェクター部分の効果をさらに増強することができるような分子である。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、グリコシド分子（本発明のサポニン、例えば、本明細書及び特許請求の範囲に例示されるもの）は、エンドサイトーシス及びリサイクル経路のコンパートメント及び小胞の膜と相互作用し、それらから前記エフェクター部分を漏れやすくし、増大したエンドソームエスケープを増大させる。「足場はエフェクター部分のエンドソームエスケープを増大させることができる」という用語は、本発明の第２のコンジュゲートにおいて、リンカーを介して若しくは直接、ｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体に結合しているか、又は足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）のポリマー若しくはオリゴマー構造を介して結合している、少なくとも１つのサポニン（グリコシド分子）が、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター部分のエンドソームエスケープを、両分子がエンドソーム、例えば後期エンドソーム内にあり、任意選択で、また好ましくは、少なくとも１つのサポニンが本発明の第２のコンジュゲートから、例えば、前記第２のコンジュゲートに含まれるリンカー又はポリマー若しくはオリゴマー構造から、例えば、少なくとも１つのグリコシド（サポニン）と第２のコンジュゲートとの間の（例えば、足場のポリマー若しくはオリゴマー構造、及び／又はリンカーを介した）切断可能な結合の切断することによって放出された後に、増大させることができることを意味する。本発明による少なくとも１つのサポニンと、本発明の第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの抗体などの細胞表面分子を標的とするリガンドとの間の任意選択でリンカー又は足場を介した結合は、「安定な結合」であってもよいが、これは、そのような結合が、例えば酵素によって、エンドソーム内で切断され得ないことを意味するものではない。例えば、サポニンは、任意選択によりリンカー又は足場のオリゴマー若しくはポリマー構造の一部と一緒に、残りのリンカー断片又はオリゴマー若しくはポリマー構造から切断されてもよい。例えば、プロテアーゼが（タンパク質性）リンカー又はタンパク質性ポリマー構造、例えばアルブミンを切断し、それによって少なくとも１つのサポニンを放出することができる。しかしながら、グリコシド分子（好ましくはサポニン）が活性形態で、好ましくは本発明の第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする分子に、任意選択によりリンカー及び／又はオリゴマー若しくはポリマー足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を介して結合する（結合するように調製される）前の元の形態で放出され、したがって、グリコシド（サポニン）はそのような切断後に、その天然構造を有するか、又はグリコシド（サポニン）はそのような切断後に、それに結合した化学基又はリンカー（の一部）を有し、一方、グリコシド生物活性（サポニン生物活性）、例えば、同じエンドソーム又はリソソームに存在するエフェクター部分に対するエンドソーム／リソソームエスケープ増強活性は、グリコシド（サポニン）と、任意選択的に本発明のリンカー及び／又は足場を含む、ｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体との間の結合の前記切断時に、維持又は回復することが好ましい。本発明に関して、例えば、サポニンと第２のコンジュゲート中の細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂのアミノ酸残基との間の結合、リンカー、（足場、すなわち、本発明の共有結合サポニンコンジュゲートの）ポリマー若しくはオリゴマー構造、リガンド、（モノクローナル）免疫グロブリン又はその結合ドメイン若しくは断片、及び／又はエフェクター（エフェクター部分、エフェクター分子）に関した「安定な」という用語は、例えばｐＨ差、塩濃度、又はＵＶ光、還元条件によって結合が容易に破壊されないか、又は容易に破壊されないように少なくとも設計されていることを意味する。本発明に関して、例えば、サポニンと細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂとの間の結合、リンカー、アミノ酸残基、共有結合サポニンコンジュゲートのポリマー若しくはオリゴマー構造、リガンド、抗体、及び／又はエフェクターに関した「切断可能な」という用語は、結合が、例えば、ｐＨ差、塩濃度、還元条件下などによって容易に破壊されるように設計されていることを意味する。当業者は、そのような切断可能な結合及びそれらを調製する方法をよく知っている。
【0151】
本発明に先立って、市場にＡＤＣ及びＡＯＣを導入することの主要なハードルの１つは、小さな治療域であった：ＡＤＣ又はＡＯＣの治療有効用量は（許容できない）副作用を伴い、患者のＡＤＣによる治療の進展及び意義を妨げる。エフェクター分子及び細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂ及び本発明の第２のコンジュゲート、例えばｓｄＡｂ－サポニンコンジュゲートを含む本発明の第１のコンジュゲートの適用により、ペイロードを保有するＡＤＣと共に、又は本発明によるＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたｓｄＡｂと共に、１つ又は複数のグリコシド分子（サポニン）を（標的）細胞に誘導することが可能になった。特に、ＡＤＣ若しくはＡＯＣのエフェクター部分、又はペイロードと（タンパク質性）細胞表面分子を標的とする分子との任意の他のコンジュゲート、及びエフェクター部分１個当たり（所定の、制御可能な）特定の数又は範囲のグリコシド分子（サポニン）を、細胞のエンドサイトーシス経路などを介して、細胞のサイトゾルに同時に特異的に誘導することは、以前は不可能であった。前述したように、本発明のＡＤＣ又はＡＯＣ（すなわち、本発明の第１のコンジュゲート）及び第２のコンジュゲートは同じ細胞表面分子、又は異なる細胞表面分子を標的とすることができ、２つの異なる細胞表面分子は、腫瘍細胞又は自己免疫細胞などの同じ標的細胞の表面に発現する。
【0152】
本発明により提供される解決には、本発明の第２のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とする分子、例えば抗体、好ましくはｓｄＡｂへの少なくとも１つのサポニンの共有結合が含まれる。本発明により提供されるさらなる解決には、（第１に）オリゴマー又はポリマー足場を使用してグリコシド分子（サポニン）を重合させること、及び本発明の第２のコンジュゲートに含まれる細胞表面分子を標的とする分子に、共有結合したサポニンのクラスターを提供し、例えばエンドサイトーシス後に、サポニンの作用様式が所望される細胞内部位での１つ又は複数のサポニンの再単量体化を可能にすることが含まれる。この文脈において、「重合する」とは、第２のコンジュゲートの細胞表面分子結合分子、例えばｓｄＡｂなどの抗体へのサポニン分子の、例えばリンカーを介した、又は直接に、又は足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を形成するポリマー若しくはオリゴマー構造を介した、可逆的及び／又は不可逆的な多重コンジュゲーション、或いは、足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）を形成するためにポリマー若しくはオリゴマー構造を形成する（修飾）サポニンの可逆的及び／又は不可逆的多重コンジュゲーションを意味する。この文脈における「再単量体化」とは、第２のコンジュゲートから、サポニンを第２のコンジュゲートのｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とするリガンドへ連結するリンカーから、又は足場から、例えばエンドサイトーシス後の足場から、サポニンを切断し、結合していないサポニンの（天然の）化学的状態に戻すことを意味し、結合していないサポニンは、サポニンをリンカー、第２のコンジュゲートのアミノ酸残基、若しくは足場に連結するための化学基、及び／又はアルデヒド基若しくはカルボン酸基などのサポニンの化学基に結合した（化学）リンカーなどのさらなる化学基を含んでいても含んでいなくてもよい。サポニンの複雑な化学的性質のため、例えば、足場又は他の連結リンカーにおけるサポニンの「重合」、及び、例えばエンドサイトーシス後の細胞内などの所望の位置におけるそれらの「再単量体化」は、困難な課題であった。特に、第２のコンジュゲートを提供するための細胞表面分子結合分子へ共有結合させるための共有結合グリコシドを含むリンカー及び足場、例えばトリテルペノイドサポニン（グリコシドの重合）を提供するために使用する化学反応は、通常、水を含まない有機溶媒中で起こるが、サポニン、及び例えば、結合したサポニンを担持するための足場として適用される生体適合性ポリマーは水溶性分子である。修飾されていないサポニンの化学的特性は、それ自体、重合を妨げ、抗体、例えばｓｄＡｂなどの細胞表面分子結合分子に（直接）複数のサポニンを結合するために可能な他の１つの溶液は、ｓｄＡｂなどの抗体は典型的には十分な結合部位を提供せず、また、結合生成物はかなり不均一となり、且つ／又はサポニンなどの生物学的に活性な分子と、ｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする抗体とを結合すると、サポニンの活性に影響し阻害するリスク、及び／又は、例えば、本発明のこのようなサポニン含有第２コンジュゲートにおいて一緒に結合される、ｓｄＡｂの細胞表面分子への結合に影響し阻害するリスクを有するので、あまり有望ではないと推定された。本発明の実施形態は、これらの欠点の少なくとも１つを解決する。
【0153】
サポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートが、１つ以上の（切断可能な）リンカー及び／又は任意選択の足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）をさらに含むかどうかにかかわらず、酸性環境を妨害し、少なくとも１つのグリコシド（サポニン）のエンドソームエスケープ機能を阻害する可能性があるかどうかは、実施例の項に記載され、当該技術分野で知られているアッセイで容易に決定することができる。阻害は、「５０％の細胞死滅を誘導するのに必要なグリコシド（本発明のサポニン）の増加倍量」として記載される。本発明の足場又は第２のコンジュゲートは、陽性対照としてクロロキンを使用した場合に観察される５０％の細胞死滅を得るのに必要なグリコシド分子（サポニン）を少なくとも増加させる増加をもたらさないことが好ましい。或いは、また好ましくは、１つ以上の（切断可能な）リンカー及び／又は任意選択の足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）をさらに含むかどうかにかかわらず、サポニンを含む第２のコンジュゲートは、５０％の細胞死滅を誘導するためにグリコシド分子の少なくとも４倍の増加をもたらすことはなく、より好ましくは少なくとも２倍の増加をもたらすことはない。増加倍数はアッセイで測定する必要があり、陽性対照としてのクロロキンはグリコシド量、好ましくはサポニン量の２倍増加を誘導し、ここで、サポニンは、５０％の細胞死滅を観察するための本発明のサポニンのいずれか１つ以上である（先の実施形態）。
【0154】
前述のように、本発明による第２のコンジュゲートに含まれる少なくとも１つのサポニンは、本発明で定義される少なくとも現在のエフェクター部分及び新しいエフェクター部分の有効性を増加させる。有効性を低下させることなく、ＡＤＣ又はＡＯＣなどの細胞表面分子結合ｓｄＡｂをさらに含む、本発明の第１のコンジュゲートに含まれるエフェクター部分の投与量を低下させるため、潜在的な副作用は減少する。したがって、本発明は本発明による第２のコンジュゲートと本発明による第１のコンジュゲートとの組み合わせを提供し、また、本発明は、医療において使用するための、又は医薬として使用するための、本発明による第１のコンジュゲートを提供する。本発明の一態様は、医薬として使用するための、本発明の医薬組成物に関し、医薬組成物は、本発明の第１のコンジュゲートを含む。本発明の一態様は、医薬として使用するための本発明の医薬組成物に関し、医薬組成物は本発明の第１のコンジュゲートを含み、且つ本発明の第２のコンジュゲートを含む。
【0155】
本発明の第２のコンジュゲートに含まれるエンドソームエスケープエンハンサー、すなわち本発明のサポニンのために、以下のいくつかの好ましい特徴を挙げることができる：（１）それらは、好ましくは、毒性がなく、免疫応答を引き起こさない、（２）それらは、好ましくは、エフェクター部分のオフターゲット細胞のサイトゾルへの取り込みを媒介しない、（３）作用部位におけるそれらの存在は、好ましくは、エフェクター部分の存在と同期している、（４）それらは、好ましくは、生分解性又は排出可能である、及び（５）それらは、好ましくは、エンドソームエスケープエンハンサーが組み合わされる、エフェクター分子の生物学的活性とは無関係の生物の生物学的プロセスを実質的に妨害しない、例えば、ホルモンと相互作用しない。前述の基準を少なくともある程度満たす本発明のサポニンの例は、ビデスモシドトリテルペン、好ましくはビデスモシドトリテルペンサポニン、例えばＳＯ１８６１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＧＥ１７４１、及び本発明によるさらなるサポニンであり、本明細書全体にわたって列挙される。
【0156】
医薬を製造するための、本発明による第１のコンジュゲートの使用もまた提供される。医薬を製造するための、本発明による第１のコンジュゲート及び本発明の第２のコンジュゲートの使用もまた提供される。特に癌治療薬、特に古典的な化学療法薬は、副作用で有名である。ＡＤＣ又はＡＯＣなどの第１のコンジュゲートに含まれる薬学的に活性な物質、及び本発明の第２のコンジュゲート分子に含まれるサポニンの両方の、時間及び場所の標的化及び同期化のために、本発明による第１のコンジュゲートは特に医薬としての使用に有益であり、又は本発明による第１のコンジュゲートと本発明の第２のコンジュゲートとの組み合わせは特に医薬としての使用、特に癌を治療する方法における使用に有益であり、ここで、医薬は、本発明のＡＤＣ若しくはＡＯＣ（本発明の第１のコンジュゲート）及び本発明の第２のコンジュゲートを含む単一の組成物であるか、又は本発明の第１のコンジュゲート、例えばＡＤＣ若しくはＡＯＣを含む第１の医薬組成物と、本発明の第２のコンジュゲートを含む第２の医薬組成物との治療組み合わせである。したがって、本発明は、癌を治療する方法において使用するための、本発明による第１のコンジュゲートを提供する。本発明はまた、後天性又は遺伝性障害、特に単一遺伝子欠損障害を治療する方法において使用するための、本発明による第１のコンジュゲートを提供する。したがって、第２のコンジュゲートは、少なくとも１つのサポニンと、腫瘍細胞又は自己免疫細胞などの異常標的細胞において第２のコンジュゲートを標的とするためのｓｄＡｂとを含み、本発明の第２のコンジュゲートは、本発明のＡＤＣ又はＡＯＣなどの、エフェクター部分及びｓｄＡｂを含む本発明の少なくとも１つの第１のコンジュゲートと組み合わされる。したがって、本発明の一態様は、本発明による第２のコンジュゲートに関し、この第２のコンジュゲートは、癌又は自己免疫疾患の治療のための方法において使用するための、共有結合したサポニンと、ｓｄＡｂなどの細胞表面分子結合抗体とを含み、方法は、本発明による第１のコンジュゲートを、それを必要とする癌患者などの対象に投与することをさらに含む。
【0157】
医療における本発明の第一及び第二のコンジュゲートのさらなる用途は、産生する酵素の量又は機能性が不十分である標的細胞における細胞内酵素を置換するための方法における使用である。本発明の第２のコンジュゲートは、例えば、標的細胞内酵素の置換のために、置換される酵素又は遺伝子治療のためのオリゴヌクレオチドを含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせて、それを必要とする患者に投与される。生じた疾患は、遺伝性又は後天性であり得る。ほとんどの場合、対症療法のみが可能であり、いくつかの稀な疾患では、不十分な治療選択肢が、関係する患者の寿命の短縮につながる。そのような疾患の例はフェニルケトン尿症であり、これは、アミノ酸フェニルアラニンの代謝低下をもたらす先天性代謝異常である。この疾患は、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼの遺伝子の変異を特徴としている。フェニルケトン尿症は、今日まで治癒不可能である。発生率は約１：１０，０００であり、最も高い発生率が知られているトルコでは１：２，６００である。結合したサポニンと共に、本発明の第２のコンジュゲートに含まれる細胞表分子を標的とする抗体、好ましくはＶＨＨなどのｓｄＡｂと、同じ若しくは異なる細胞表面分子結合ｓｄＡｂ及びフェニルアラニンヒドロキシラーゼを含む第１のコンジュゲート、又は同じ若しくは異なる細胞表面分子結合ｓｄＡｂを、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする結合したポリヌクレオチドと共に含む第１のコンジュゲートとは、本発明の第２のコンジュゲート中の好適な特異的抗体又はｓｄＡｂを使用し、且つ本発明による第１のコンジュゲート中の好適な特異的ｓｄＡｂを使用することによって、肝細胞を標的化し、肝細胞における欠損酵素を置換するために使用することができる。これは、それに結合したサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲート、及び、この例では、本発明によるそれに結合した酵素又はオリゴヌクレオチドなどのエフェクター分子を含む本発明の第１のコンジュゲートの、置換又は遺伝子治療のための使用の一例である、好ましい実施形態では、遺伝子治療又は置換療法の方法において使用するための本発明による第２のコンジュゲートは、細胞表面分子結合ｓｄＡｂ及び酵素又は酵素をコードする核酸を含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせて提供される。
【0158】
本発明の第１及び第２のコンジュゲートを用いて、２成分の非ウイルス性の臨床的に適用可能な遺伝子送達技術を設計し製造することが、今や可能になった。例えば、本発明の第２のコンジュゲートは、遺伝子送達技術のための第１及び第２のコンジュゲートの非ウイルスベースの組み合わせの開発を可能にし、それは、より低い治療用量での治療有効性を増強し、それによって患者の健康を改善する。本発明の第２のコンジュゲートは、特に、（腫瘍、自己免疫）細胞表面特異的分子に結合するためのモノクローナル抗体又はｓｄＡｂなどの共有結合した細胞表面分子を標的とする抗体を含み、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドなどのエフェクター部分を含み、ＶＨＨなどの細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂを含む第１のコンジュゲートと組み合わせた場合、遺伝子送達の分野における長年にわたる主要なボトルネックを克服する、すなわち、エンドソーム膜を介してサイトゾル／ヌクレオソル内へ遺伝子治療産物を効率的に、安全に、且つ費用効率よくトランスファーさせることを可能にする。実際に、遺伝子治療は、広範な疾患における未来の高度な治療のための最も有望な治療選択肢の１つである。遺伝子送達の成功には、標的細胞の認識並びに遺伝子のサイトゾル及びヌクレオソルへの取り込みを必要とする。非ウイルス遺伝子治療の分野における主要な問題の１つは、患者における治療的使用のための遺伝子材料の非効率的で且つ不十分な安全送達である。
【0159】
したがって、リガンド又は好ましくは抗体（断片、ドメイン、好ましくはｓｄＡｂ）などの細胞を標的とし、細胞表面分子を標的とする細胞標的化分子を含み、アンチセンスＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含み、細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂを含む第一のコンジュゲートを含むＡＯＣ又はｓｄＡｂなどの本発明の第一のコンジュゲートと組み合わせた本発明の第二のコンジュゲートを適用した場合、本発明者らは今や、遺伝子送達分野において長年にわたって主要なボトルネックであった、遺伝子治療産物のエンドソーム膜を介したサイトゾル／ヌクレオソル内への安全なトランスファーの問題を克服することを可能にした。本発明の第１及び第２のコンジュゲートの組み合わせは、任意のアドレス可能な細胞型の、全ての知られた遺伝子薬剤による標的化、及びその後の遺伝子の効率的なサイトゾルへの送達を可能にするために設計された技術を示し、それによって、遺伝性障害に限らず、がん治療にも、したがって、大きな患者群にとっても重要なより良い患者治療を確実にする。本発明の第１及び第２のコンジュゲートに基づく技術は、標的化リガンド、又は（モノクローナル）（腫瘍細胞特異的）抗体若しくはその断片、又は好ましくはＶＨＨなどのｓｄＡｂなどの細胞表面分子を標的とする分子のための、本明細書に例示されるようなサポニンなどのエンドソームエスケープエンハンサー（ＥＥＥ）のための担体として機能するポリマー又はオリゴマー足場（本発明の共有結合サポニンコンジュゲート）、及び本発明による実施形態のサポニンを含む本発明の第２のコンジュゲートを含んでもよい。この場合、本発明の第１のコンジュゲートは、ｓｄＡｂなどの第１の細胞表面分子結合分子、及びエフェクター部分、ここではＬＮＡ又はＢＮＡなどのエフェクター遺伝子を含む。例えば細胞を標的とする抗体（断片）又はｓｄＡｂを含む、本発明の第２のコンジュゲートの、同じ又は異なる細胞表面を標的とするｓｄＡｂ及びＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせた使用は、いかなる種類の生物学的高分子もサイトゾル及び核にもたらす可能性を有する。新しいターゲティングリガンド、ｓｄＡｂ及びモノクローナル（ヒト、ヒト化）抗体の開発が、世界中の多くの研究グループ及び企業によって継続的に行われている。癌細胞などの疾患細胞のサイトゾルにおける送達を目的とするオリゴヌクレオチドについても同様である。したがって、本発明の第１及び第２のコンジュゲートはまた、現在及び将来のターゲティングｓｄＡｂ及び抗体をクリックケミストリーによって使用することができ、カスタマイズされた薬物適用を可能にし、組織及び細胞ターゲティング技術の分野における将来の開発を可能にする分子ツールとして存在し、したがって、本発明による第１のコンジュゲートはまた、現在及び将来の治療用オリゴヌクレオチド（並びに、タンパク質毒素などのペイロード）をクリックケミストリーによって例えばｓｄＡｂに連結するか、又は連結することができ、カスタマイズされた薬物適用を可能にし、組織及び細胞ターゲティング技術の分野における将来の開発を可能にする分子ツールとして存在する。本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、細胞表面分子を標的とする分子として抗体及びリガンドを含むことができるが、ｓｄＡｂが好ましい。遺伝子治療薬の世界市場は急速に成長しており、癌、心血管疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＨＩＶ及び多くの稀な（単一遺伝子）疾患などの広範な疾患領域のための潜在的な治療を対象としている。現在のウイルスベクターベースの遺伝子治療技術は、安全性、製造物流、及び関連する高コストなどの重大な課題を有する。本発明の第２のコンジュゲートは、送達する遺伝子及び細胞表面を標的とする分子、すなわちｓｄＡｂを含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせた場合、現在のウイルス遺伝子送達技術の代替となる技術プラットフォームでの使用を可能にする。したがって、本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、癌、心血管疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＨＩＶ感染症、及び多くの稀な（単一遺伝子）疾患などの疾患の非ウイルス遺伝子治療を開発するためのアプローチに組み入れるのに好適である。本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、標的アンチセンスＢＮＡをベースとするなどの非ウイルスベクターをベースとした遺伝子治療薬を作製することによって、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及びオリゴヌクレオチドベースの治療薬の分野を変革するための新規な治療の開発に好適である。本発明の第２のコンジュゲートの、特にｓｄＡｂなどの抗体及びサポニンを含む共有結合性コンジュゲートで、細胞表面分子結合分子、すなわちｓｄＡｂ及びＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと組み合わせた適用は、本発明によって可能になる多くの有益なアプローチの１つである。例えば、本発明の第１及び第２のコンジュゲートの使用は、哺乳動物細胞のエンドサイトーシス経路の利用を可能にする。エンドサイトーシスは治療薬の送達のために利用され、本発明の第２のコンジュゲートは、第１のコンジュゲートに含まれる例えばｓｉＲＮＡの取り込み及びエンドソームエスケープの改善に寄与する。好適には、本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、例えばペイロード、オリゴヌクレオチドのための送達エンハンサーとして作用する小分子と共に好適に使用される。これによって、本発明のサポニンを有し、リガンドなどの共有結合的に結合した細胞を標的とする部分、好ましくは抗体（ドメイン又は断片、好ましくはＶＨＨ）を有する、本発明の第２のコンジュゲートと組み合わされた、ＢＮＡなどの共有結合したオリゴヌクレオチドを有し、共有結合した細胞を標的とする部分、すなわちｓｄＡｂ、好ましくはＶＨＨを有する本発明の第１のコンジュゲートは、遊離非標的化サポニンを含む２つの成分としてそれらを適用し、それ故、治療的承認及び臨床的適用性が複雑になることに関する、現在のエンドソームエスケープエンハンサー及び遺伝子治療産物で見られる現在の問題の解決策を提供する。サポニンを包含する本発明のそのような第２のコンジュゲートは、ＢＮＡなどの遺伝子産物及び（腫瘍）細胞標的化部分、すなわちｓｄＡｂを含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わされているからである。したがって、本発明は、エンドソームエスケープエンハンサー（例えば、本発明の実施形態及び提供する実施例のグリコシド）及び第２のターゲティングリガンド又は抗体（例えば、本発明の実施形態による、及び本明細書の以下の実施例の項で例示されるｓｄＡｂ）が本発明の第２のコンジュゲートに含まれ、遺伝子治療産物（ＢＮＡなどの本発明によるオリゴヌクレオチド）、及び本発明の第２のコンジュゲートに包含される同一又は異なる細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂなどの第１の細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂを含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わされ、第１の細胞表面分子を標的とするｓｄＡｂが、本発明の第２のコンジュゲートの細胞表面分子を標的とする分子として同一又は異なる細胞表面分子に結合する、非ウイルス遺伝子送達技術を提供する。したがって、本発明のそのような第１及び第２のコンジュゲートは、広範囲の疾患及び大きな患者群のための現在及び将来の高分子薬物の治療機会を提供する。少なくとも１つのサポニンと、免疫グロブリン又はｓｄＡｂなどの少なくとも１つの特異的細胞標的化部分とを含む本発明のこのような第２のコンジュゲートを、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つの特異的細胞標的化部分、すなわちｓｄＡｂを含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせて適用することにより、非細胞表面分子標的化遊離エンドソームエスケープエンハンサー（例えば、細胞表面分子結合抗体とコンジュゲートしていないサポニン）及び遺伝子治療産物を別々に適用する現在の方法にとって明らかであり、この現在の方法では両化合物が相互作用部位に同時に存在することを保証しない問題に対処する。この問題は本発明の第２のコンジュゲートを、核酸を含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせて使用することによって解決された。ここで、本発明の第２のコンジュゲート及び第１のコンジュゲートの両方は、細胞表面分子を標的とする分子、例えば、第２のコンジュゲートを考慮した場合、本発明による、ｓｄＡｂなどの抗体を含み、第１のコンジュゲートを考慮した場合、ｓｄＡｂを含む。すなわち、本発明の第２のコンジュゲートとオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートとのそのような組み合わせは、両方の化合物、すなわちサポニン及びＢＮＡなどの遺伝子産物の（時間及び場所の）同期化が増大した非ウイルス遺伝子送達技術を提供する。
【0160】
遺伝子治療は、嚢胞性線維症、舞踏病、ハンチントン病又は血友病などの遺伝性の、以前は不治であった疾患を助けることができる。しかしながら、現在、いくつかの問題が解決されていない。例えば、治療遺伝子は、体内の特定の標的細胞に正確に到達しなければならない。一方、治療遺伝子は標的細胞に吸収されなければならないが、治療遺伝子は破壊されてはならない。現在の遺伝子治療は、遺伝子のためのフェリーとしてウイルスを使用する方法である。しかしながら、これらの手順はかなりのリスクを伴い、他の生体分子の導入に転用することはできない。一実施形態は、（植物由来の）グリコシド（例えば、本発明のサポニンのいずれか１つ）を含む本発明の第２のコンジュゲートであって、遺伝子が担体分子として本発明の第１のコンジュゲートに含まれる場合に、そのような遺伝子の送達を可能にするだけでなく、標的細胞に導入すべき異なる治療用生体分子の送達も可能にするプラットフォーム技術を使用するためのコンジュゲートである。したがって、本発明の第２のコンジュゲートは、嚢胞性線維症、舞踏病、ハンチントン病又は血友病のための核酸に基づく治療法を開発するために使用される。これにより、本発明の第２のコンジュゲートを用いて、嚢胞性線維症、ハンチントン病、及び血友病を有する患者を含む、遺伝性疾患を有する患者の健康を改善するための新しい遺伝子治療戦略が利用可能である。本発明の一部として、植物由来のエンドソームエスケープエンハンサー（グリコシド；すなわち本発明のサポニン）と、本発明の単一の第２のコンジュゲートに含まれるターゲティングリガンド（例えば、ｓｄＡｂなどの抗体）とを、ＶＨＨなどの細胞表面分子結合ｓｄＡｂ及び遺伝子治療産物を含む本発明の第１のコンジュゲートと組み合わせるために組み合わせる非ウイルス遺伝子送達技術が開発される。本発明の第１及び第２のコンジュゲートに基づいて得られる非ウイルス遺伝子治療は、現在利用可能な戦略よりも低い用量の遺伝子を含む第１のコンジュゲートで、約４０倍の送達効率を示す。これにより、本発明の第２のコンジュゲートは、嚢胞性線維症患者のような欠陥遺伝子の修復又は置換のため、また、例えば癌細胞を破壊するための特定の遺伝子の標的化送達のためなど、臨床用途で使用するためのものである。実際、本発明の第１及び第２のコンジュゲートは、嚢胞性線維症、ハンチントン病及び血友病などの遺伝的欠陥によって引き起こされ、現在治癒させることができないあらゆる疾患の治療レジメンにおける適用に好適である。本発明の第１及び第２のコンジュゲートを用いる遺伝子治療は、現在の以下の２つの問題を解決するのに役立つ。第１に、本発明の第２のコンジュゲートにより、体内の特定の標的細胞に治療遺伝子を含む第１のコンジュゲートを送達することが可能であり、第２に、治療遺伝子は、例えば本発明のオリゴマー又はポリマー足場（本発明の共有結合エフェクター分子コンジュゲート）を本発明の第１及び第２のコンジュゲートの一部として使用することによって、サポニン及び標的細胞に結合するための抗体又はｓｄＡｂなどのターゲティング部分（本発明の第２のコンジュゲート）が存在し、且つ、オリゴヌクレオチド産物及び標的細胞に結合するための、ターゲティングｓｄＡｂ（本発明の第１のコンジュゲート）が存在するために、標的細胞の内部に入るが、破壊されることはない。
【0161】
本発明はまた、癌を治療する方法であって、本発明による第２のコンジュゲートを含む医薬を、それを必要とする患者に、本発明の第１のコンジュゲート、すなわちエフェクター分子及び細胞表面分子結合ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣと組み合わせて投与すること、好ましくは、有効用量の前記医薬を、それを必要とする患者、好ましくはヒト癌患者に投与することを含む方法を提供する。
【0162】
投与に好適な形態に関する考慮すべき事項は、当該技術分野において知られており、毒性効力、溶解度、投与経路、及び活性の維持が含まれる。例えば、血流に注入される薬理学的組成物は、可溶性でなければならない。
【0163】
好適な剤形は、用途又は投与経路、例えば経皮又は注入に依存する。そのような剤形は、標的細胞が多細胞宿主中に存在するかどうかにかかわらず、化合物が標的細胞に到達できるようにしなければならない。他の因子は当技術分野において知られており、それには、毒性、及び化合物又は組成物がその効果を発揮するのを遅らせる剤形などの考慮事項が含まれる。
【0164】
【表1】
【0165】
【表2】
【0166】
【表3】
【0167】
【表4】
【0168】
【表5】
【実施例】
【0169】
実施例及び例示的実施形態
実施例１．ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋ｍＡｂ－サポリン（１Ｔ２Ｃ及び２Ｔ２Ｃ）
１標的２成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ＶＨＨ及びｍＡｂは同じ細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ａ）。２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ＶＨＨはｍＡｂと異なる細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ｂ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、末端システイン残基（Ｃｙｓ）を介して抗ＨＥＲ２ＶＨＨにＤＡＲ１でコンジュゲートさせた（不安定）させた（ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１）。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を、固定濃度１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（タンパク質毒素サポリンにＤＡＲ４でコンジュゲートされたＣＤ７１モノクローナル抗体）又は固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素サポリンにＤＡＲ４でコンジュゲートされたトラスツズマブ）に対してタイトレーションした。ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又は５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンの両方との組み合わせで、ＳＫ－ＢＲ－３における低濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１での細胞死滅の増強が明らかになった（ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図２Ａ）。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１単独の同等濃度は、高濃度（ＩＣ５０＝４，０００ｎＭ）で細胞死滅を誘導したが、ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン、又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋トラスツズマブ－サポリンの同等濃度は、細胞死滅活性を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５０００ｎＭ；図２Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）においては、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリンの組み合わせが高濃度（ＩＣ５０＝２．０００ｎＭ；図２Ｂ）で細胞死滅活性を示す一方、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンの組み合わせは、はるかに高い濃度（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図２Ｂ）で細胞死滅活性を示した。ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋トラスツズマブ－サポリンの同等濃度は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において細胞死滅活性を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５．０００ｎＭ；図２Ｂ）。
実施例１．ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋ｍＡｂ－サポリン（１Ｔ２Ｃ及び２Ｔ２Ｃ）
１標的２成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ＶＨＨ及びｍＡｂは同じ細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ａ）。２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ＶＨＨはｍＡｂと異なる細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ｂ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、末端システイン残基（Ｃｙｓ）を介して抗ＨＥＲ２ＶＨＨにＤＡＲ１でコンジュゲートさせた（不安定）させた（ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１）。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を、固定濃度１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（タンパク質毒素サポリンにＤＡＲ４でコンジュゲートされたＣＤ７１モノクローナル抗体）又は固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素サポリンにＤＡＲ４でコンジュゲートされたトラスツズマブ）に対してタイトレーションした。ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又は５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンの両方との組み合わせで、ＳＫ－ＢＲ－３における低濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１での細胞死滅の増強が明らかになった（ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図２Ａ）。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１単独の同等濃度は、高濃度（ＩＣ５０＝４，０００ｎＭ）で細胞死滅を誘導したが、ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン、又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋トラスツズマブ－サポリンの同等濃度は、細胞死滅活性を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５０００ｎＭ；図２Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）においては、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリンの組み合わせが高濃度（ＩＣ５０＝２．０００ｎＭ；図２Ｂ）で細胞死滅活性を示す一方、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンの組み合わせは、はるかに高い濃度（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図２Ｂ）で細胞死滅活性を示した。ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋トラスツズマブ－サポリンの同等濃度は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において細胞死滅活性を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５．０００ｎＭ；図２Ｂ）。
【0170】
この全ては、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨのＨＥＲ２を標的とするＶＨＨへのコンジュゲーションが、標的化タンパク質毒（同一又は異なる細胞表面受容体を標的としている）のエンドソームエスケープ及び細胞質送達を増強し、ＨＥＲ２発現細胞の細胞死滅をもたらすことを示している。
【0171】
次に、トラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンを、固定濃度９００ｎＭのＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、低濃度のトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンと組み合わせた９００ｎＭのＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１はＳＫ－ＢＲ－３の効率的な細胞死滅を既に誘導した（ＩＣ５０＝０．０００１ｐＭ；図３Ａ）が、一方ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ又はトラスツズマブ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨは高濃度になって（それぞれＩＣ５０＝５０ｐＭ；ＩＣ５０＝４００ｐＭ；図３）細胞死滅を誘導し得たことが明らかになった。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）においては、ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は、ＩＣ５０＝０．０１ｐＭで細胞死滅を示し、一方、トラスツズマブ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は、ＩＣ５０＝２，０００ｐＭで活性を示した。トラスツズマブ－サポリン＋９００ｎＭのＨＥＲ２ＶＨＨ又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨは、（それぞれＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ及びＩＣ５０＝２０ｐＭ、図３Ｂ）になってようやく細胞死滅を示した。この全ては、ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋発現細胞において、比較的低濃度のトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンが有効であり、比較的低濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）と組み合わせて細胞死滅を誘導し得ることを示す。
【0172】
注：実施例を含む説明全般を通して、及び特許請求の範囲において、「ＶＨＨ」及び「ＶＨＨ」は、同じタイプの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を指すものと理解されるべきである。
【0173】
実施例２．ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋ＶＨＨ－ジアンチン（２Ｔ２Ｃ）
２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ１－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ２タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、各ＶＨＨは別の細胞表面受容体を認識する（図１Ｃ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、ＨＥＲ２を標的とするＶＨＨの末端システイン残基にコンジュゲートし、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）を生成した。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５０ｐＭのＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンに対してタイトレーションし、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、比較的低濃度のＶＨＨＨＥＲ２－Ｌ－ＳＯ１８６１での細胞死滅の増強が明らかになった（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図４Ａ） ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１単独の同等濃度は、高濃度（ＩＣ５０＝４，０００ｎＭ）で細胞死滅を誘導したが、ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの同等濃度は、細胞死滅を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図４Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋））においては、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋５０ｐＭＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの組み合わせは高濃度（ＩＣ５０＝６００ｎＭ；図４Ｂ）で細胞死滅活性を示したが、ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋５０ｐＭＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの同等濃度は細胞死滅活性を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図４Ｂ）。
２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ１－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ２タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、各ＶＨＨは別の細胞表面受容体を認識する（図１Ｃ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、ＨＥＲ２を標的とするＶＨＨの末端システイン残基にコンジュゲートし、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）を生成した。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５０ｐＭのＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンに対してタイトレーションし、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、比較的低濃度のＶＨＨＨＥＲ２－Ｌ－ＳＯ１８６１での細胞死滅の増強が明らかになった（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図４Ａ） ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１単独の同等濃度は、高濃度（ＩＣ５０＝４，０００ｎＭ）で細胞死滅を誘導したが、ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの同等濃度は、細胞死滅を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図４Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋））においては、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋５０ｐＭＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの組み合わせは高濃度（ＩＣ５０＝６００ｎＭ；図４Ｂ）で細胞死滅活性を示したが、ＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋５０ｐＭＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの同等濃度は細胞死滅活性を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図４Ｂ）。
【0174】
次に、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンを、固定濃度９００ｎＭのＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、低濃度のＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンと組み合わせた９００ｎＭのＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１はＳＫ－ＢＲ－３細胞の効率的な細胞死滅を誘導した（ＩＣ５０＝０．０５ｐＭ；図５Ａ）が、一方ＣＤ７１ＶＨＨジアンチン又はＣＤ７１ＶＨＨＨ－ジアンチン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨは高濃度になって（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）；図５Ａ）細胞死滅を誘導し得たことが明らかになった。さらに、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンをまた、固定濃度７７ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）に対してタイトレーションし、これによって、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）細胞における細胞死滅活性の強い増強も明らかになった（（ＩＣ５０＜０．０００１ｐＭ））。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ－／ＣＤ７１＋）においては、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は非常に高い濃度（ＩＣ５０＝１０ｐＭ、図５Ｂ）になって細胞死滅を示し、一方、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ、又はＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）はＩＣ５０＝２，０００ｐＭ；図５Ｂ）になって細胞死滅を示した。
【0175】
この全ては、高ＨＥＲ２／ＣＤ７１発現細胞において、比較的低濃度のＶＨＨＣＤ７１－ジアンチンが有効であり、低濃度のＶＨＨＨＥＲ２－ＳＯ１８６１コンジュゲートと組み合わせて細胞死滅を誘導し得ることを示す。
【0176】
本発明による組み合わせは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）においては、細胞死滅活性を全く示さなかった。これは、十分な受容体の発現がなければ、細胞内に送達されるＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び細胞質送達を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。
【0177】
実施例３．ＶＨＨ－ジアンチン＋ｍＡｂ－ＳＯ１８６１（１Ｔ２Ｃ及び２Ｔ２Ｃ）
１標的２成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは同じ細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ｅ）。２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは同じ細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ｄ）。
１標的２成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは同じ細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ｅ）。２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは同じ細胞表面受容体を認識し結合する（図１Ｄ）。
【0178】
ジアンチン－Ｃ（末端システインを有するジアンチン）を、ＨＥＲ２を標的とするＶＨＨ、ＣＤ７１を標的とするＨＨ、ＥＧＦＲを標的とするＨＨの末端システイン残基にコンジュゲートして、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）及びＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）を生成した。
【0179】
ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチンを、固定濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）に対してタイトレーションし、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）に対する標的かタンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、７７ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた非常に低濃度のＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンが、Ａ４３１細胞の効率的な細胞死滅を誘導した（ＩＣ５０＜０．０００１ｐＭ；図６Ａ）のに対し、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン単独は、ＩＣ５０＝２０００ｐＭで活性を示したことを明らかになった。ＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１、及びＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１の他の２つの組み合わせは、それぞれＩＣ５０＝２０ｐＭ及びＩＣ５０＝５０ｐＭで効率的な細胞死滅を示したが、ＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン単独では、Ａ４３１細胞において効率的な細胞死滅を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図６Ａ）。Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）においては、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、及びＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１は、それぞれＩＣ５０＝３．０００ｐＭ及びＩＣ５０＝１．０００ｐＭで細胞死滅活性を示したが、他の全ての処理又は組み合わせでは、Ａ２０５８細胞において、ＩＣ５０＝１０，０００ｐＭのＶＨＨ－毒素まで細胞死滅を示さなかった（図６Ｂ）。
【0180】
これは、セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、３つの異なるＶＨＨ－ジアンチンコンジュゲートのエンドソームエスケープを効率的に誘導することができ、それによって、Ａ４３１細胞における細胞死滅の誘導が増強されることを示している。
【0181】
次に、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチンを、固定濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）に対してタイトレーションし、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＝／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、７７ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた非常に低濃度のＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンが、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の効率的な細胞死滅を誘導した（ＩＣ５０＜０．０００１ｐＭ；図７Ａ）のに対し、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン単独は、ＩＣ５０＝１０，０００ｐＭで活性を示したことを明らかになった。ＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１、及びＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１の他の２つの組み合わせは、それぞれＩＣ５０＝４００ｐＭ及びＩＣ５０＝６ｐＭで効率的な細胞死滅を示したが、ＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン単独では、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において効率的な細胞死滅を誘導することができなかった（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図７Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）においては、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、及びＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭセツキシマブ－ＳＯ１８６１は、それぞれ、ＩＣ５０＝３０００ｐＭ及びＩＣ５０＝２０００ｐＭで細胞死滅活性を示したが、他の全ての処理又は組み合わせでは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において、ＩＣ５０＝１０，０００ｐＭのＶＨＨ－ジアンチンまで細胞死滅を示さなかった（図７Ｂ）。これは、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、３つの異なるＶＨＨ－ジアンチンコンジュゲートのエンドソームエスケープを効率的に誘導することができ、それによって、ＳＫ－ＢＲ－３細胞における細胞死滅の誘導が増強されることを示している。
【0182】
材料及び方法
材料
ＳＯ１８６１は、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）から得た生植物抽出物から単離され精製された。ＶＨＨは、ＱＶＱ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから購入した（ＨＥＲ２ＶＨＨ：クローン名：Ｑ１７ｃ；ＣＤ７１ＶＨＨ：クローン名：Ｑ５２ｃ；ＥＧＦＲＶＨＨ：クローン名：Ｑ８６ｃ）。トラスツズマブ（Ｔｒａｓ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）は、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入した。ＣＤ７１モノクローナル抗体は、ＢｉｏＣｅｌｌ（Ｏｋｔ９、＃ＢＥ００２３）から購入した。カスタムトラスツズマブ－サポリン及び抗ＣＤ７１ｍａｂ－サポリンコンジュゲートは製造され、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。単一のＣ末端システインを有するジアンチン変異体のジアンチン－Ｃｙｓ（Ｄｉａ－Ｃｙｓは、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅによって製造された。
材料
ＳＯ１８６１は、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）から得た生植物抽出物から単離され精製された。ＶＨＨは、ＱＶＱ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから購入した（ＨＥＲ２ＶＨＨ：クローン名：Ｑ１７ｃ；ＣＤ７１ＶＨＨ：クローン名：Ｑ５２ｃ；ＥＧＦＲＶＨＨ：クローン名：Ｑ８６ｃ）。トラスツズマブ（Ｔｒａｓ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）は、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入した。ＣＤ７１モノクローナル抗体は、ＢｉｏＣｅｌｌ（Ｏｋｔ９、＃ＢＥ００２３）から購入した。カスタムトラスツズマブ－サポリン及び抗ＣＤ７１ｍａｂ－サポリンコンジュゲートは製造され、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。単一のＣ末端システインを有するジアンチン変異体のジアンチン－Ｃｙｓ（Ｄｉａ－Ｃｙｓは、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅによって製造された。
【0183】
トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（２ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ビス－トリスプロテインゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ染色済みタンパク質標準（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）タンパク質染色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ５０Ｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、９９．６％、ＶＷＲ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス・ＨＣＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－ヒスチジン（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄ－（＋）－トレハロース脱水物（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標） ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、グアニジン塩酸塩（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物（ＥＤＴＡ－Ｎａ２、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、無菌フィルター０．２μｍ及び０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ４及びＴ１５濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、テトラ（エチレングリコール）スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＨＳＰ２７ ＢＮＡジスルフィドオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、［Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウム－ヘキサフルオロホスファート］（ＨＡＴＵ、９７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（ＡＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－システイン（９８．５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、脱イオン水（ＤＩ）はＵｌｔｒａｐｕｒｅ Ｌａｂ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｅｒｃｋ）から新しく取った、ニッケル－ニトリロトリ酢酸アガロース（Ｎｉ－ＮＴＡアガロース、Ｐｒｏｔｉｎｏ）、グリシン（９９．５％、ＶＷＲ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（エルマン試薬、ＤＴＮＢ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、重炭酸ナトリウム（９９．７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸ナトリウム（９９．９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）充填ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ脱塩カラム、ＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム０．５、２、５及び１０ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心フィルターＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｔ４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ、及びＴ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｂｉｏｓｅｐ ｓ３０００ ａＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｖｉｖａｃｅｌｌ限外濾過ユニット１０及び３０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）。
【0184】
方法
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１（１２１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）及びＥＭＣＨ・ＴＦＡ（１１０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）に、メタノール（過剰乾燥、３．００ｍＬ）及びＴＦＡ（０．０２０ｍＬ、０．２６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。１．５時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１生成物に対応する画分を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（１２０ｍｇ、９０％）を白色の綿毛状固体として得た。
ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９６％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０６９［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．０８４
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１（１２１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）及びＥＭＣＨ・ＴＦＡ（１１０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）に、メタノール（過剰乾燥、３．００ｍＬ）及びＴＦＡ（０．０２０ｍＬ、０．２６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。１．５時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１生成物に対応する画分を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（１２０ｍｇ、９０％）を白色の綿毛状固体として得た。
ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９６％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０６９［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．０８４
【0185】
細胞生存率アッセイ
処理後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、製造者の説明書に従って実施したＭＴＳアッセイによって細胞生存率を決定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。簡潔に記載すると、ＭＴＳ溶液を、１０％ＦＢＳを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）で２０×に希釈した。細胞を１ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ウェル当たり１００μＬの希釈ＭＴＳ溶液を加えた。プレートを３７℃で約２０～３０分間インキュベートした。続いて、４９２ｎｍのＯＤを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。定量化のために、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを全ての他のウェルから差し引いた後、処理／未処理細胞の細胞生存率を、処理ウェルのバックグラウンド補正済シグナルを未処理ウェルのバックグラウンド補正済シグナルで割ることによって算出した（×１００）。
処理後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、製造者の説明書に従って実施したＭＴＳアッセイによって細胞生存率を決定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。簡潔に記載すると、ＭＴＳ溶液を、１０％ＦＢＳを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）で２０×に希釈した。細胞を１ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ウェル当たり１００μＬの希釈ＭＴＳ溶液を加えた。プレートを３７℃で約２０～３０分間インキュベートした。続いて、４９２ｎｍのＯＤを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。定量化のために、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを全ての他のウェルから差し引いた後、処理／未処理細胞の細胞生存率を、処理ウェルのバックグラウンド補正済シグナルを未処理ウェルのバックグラウンド補正済シグナルで割ることによって算出した（×１００）。
【0186】
ＦＡＣＳ分析
１０ｃｍの皿に、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補充したＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）によって、５００，０００ｃ／プレートで播種し、４８時間（５％ＣＯ２、３７℃）、９０％のコンフルエンシーに達するまでインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理（ＴｒｙｐｌＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）して単一細胞とした。０．７５×１０６個の細胞を１５ｍＬファルコンチューブに移し、遠心分離した（１，４００ｒｐｍ、３分）。細胞ペレットを沈めたまま、上清を廃棄した。ボルテックスシェーカー上でファルコンチューブを穏やかにタッピングすることによってペレットを解離させ、細胞を４ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）で洗浄した。洗浄後、細胞を３ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）に再懸濁し、３つの丸底ＦＡＣＳチューブに等分した（１ｍＬ／チューブ）。細胞を再度遠心分離し、２００μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）、又は１９５μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）中に５μＬの抗体を含む２００μＬの抗体溶液に再懸濁した。ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（＃３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＥＧＦＲ受容体を染色した。ＰＥ抗ヒトＨＥＲ２ ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（＃３２４４０８ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＨＥＲ２受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、その対応するアイソタイプ対照として使用した。ＰＥ抗ヒトＣＤ７１（＃３３４１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いてＣＤ７１受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をその対応するアイソタイプ対照として用いた。試料を、チューブローラーミキサー上で４℃にて３０分間インキュベートした。その後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＰＦＡ溶液を用いて室温で２０分間固定した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために２５０～３５０μＬの冷ＰＢＳに再懸濁した。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。種々の細胞におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ７１の細胞表面発現の分析結果を、表Ａ２にまとめる。
１０ｃｍの皿に、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補充したＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）によって、５００，０００ｃ／プレートで播種し、４８時間（５％ＣＯ２、３７℃）、９０％のコンフルエンシーに達するまでインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理（ＴｒｙｐｌＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）して単一細胞とした。０．７５×１０６個の細胞を１５ｍＬファルコンチューブに移し、遠心分離した（１，４００ｒｐｍ、３分）。細胞ペレットを沈めたまま、上清を廃棄した。ボルテックスシェーカー上でファルコンチューブを穏やかにタッピングすることによってペレットを解離させ、細胞を４ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）で洗浄した。洗浄後、細胞を３ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）に再懸濁し、３つの丸底ＦＡＣＳチューブに等分した（１ｍＬ／チューブ）。細胞を再度遠心分離し、２００μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）、又は１９５μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）中に５μＬの抗体を含む２００μＬの抗体溶液に再懸濁した。ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（＃３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＥＧＦＲ受容体を染色した。ＰＥ抗ヒトＨＥＲ２ ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（＃３２４４０８ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＨＥＲ２受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、その対応するアイソタイプ対照として使用した。ＰＥ抗ヒトＣＤ７１（＃３３４１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いてＣＤ７１受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をその対応するアイソタイプ対照として用いた。試料を、チューブローラーミキサー上で４℃にて３０分間インキュベートした。その後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない、２％ＦＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＰＦＡ溶液を用いて室温で２０分間固定した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために２５０～３５０μＬの冷ＰＢＳに再懸濁した。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。種々の細胞におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ７１の細胞表面発現の分析結果を、表Ａ２にまとめる。
【0187】
【表6】
【0188】
ＶＨＨ－ＳＯ１８６１のコンジュゲート化手順
ＶＨＨのアリコートに、新しく調製したＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを加え、この混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、得られたＶＨＨ－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを用いてＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過により精製した。得られたＶＨＨ－ＳＨに、新しく調製したＳＰＴ－ＥＭＣＨ溶液を加え、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で一晩インキュベートした。
ＶＨＨのアリコートに、新しく調製したＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを加え、この混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、得られたＶＨＨ－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを用いてＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過により精製した。得られたＶＨＨ－ＳＨに、新しく調製したＳＰＴ－ＥＭＣＨ溶液を加え、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で一晩インキュベートした。
【0189】
インキュベーション後、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１混合物のアリコートを取り出し、エルマンアッセイによって特性を明らかにし、ＳＯ１８６１の組み込みを確認した。このコンジュゲートを、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）で溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムにより精製して、精製ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を得た。アリコートを０．２μｍに濾過し、濃縮し、１．０ｍｇ／ｍｌに標準化してＶＨＨ－ＳＯ１８６１を得た。
【0190】
ＶＨＨ－ジアンチンのコンジュゲート化手順
ジアンチン－Ｃｙｓを、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用する限外濾過によって濃縮し、緩衝液をＴＢＳ（ｐＨ７．５）に交換した。濃縮されたジアンチン－Ｃｙｓに、新しく調製したＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを添加し、この混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら２０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、得られたジアンチン－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過によって精製し、次いで、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）への遠心分離－洗浄サイクルを繰り返した。得られたジアンチン－ＳＨを、新しく調製したＤＭＳＯ中のＤＴＭＥ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で６０分間インキュベートした。その後、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを用いてＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過によりに精製し、ジアンチン－ＤＴＭＥを得た。ジアンチン－ＤＴＭＥを、コンジュゲートするまで２０℃で保存した。同時に、ＶＨＨのアリコートを、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用する限外濾過によって濃縮し、緩衝液をＴＢＳ（ｐＨ７．５）に交換した。濃縮したＶＨＨに、新しく調製したＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを添加し、この混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、得られたＶＨＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過によって精製し、次いで、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ４ ５ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）への遠心分離－洗浄サイクルを繰り返した。得られたＶＨＨ－ＳＨのアリコートをジアンチン－ＤＴＭＥと反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物をｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを用いて濃縮し、１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを用いたゲル濾過により精製し、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）に溶出した。
ジアンチン－Ｃｙｓを、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用する限外濾過によって濃縮し、緩衝液をＴＢＳ（ｐＨ７．５）に交換した。濃縮されたジアンチン－Ｃｙｓに、新しく調製したＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを添加し、この混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら２０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、得られたジアンチン－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過によって精製し、次いで、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）への遠心分離－洗浄サイクルを繰り返した。得られたジアンチン－ＳＨを、新しく調製したＤＭＳＯ中のＤＴＭＥ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で６０分間インキュベートした。その後、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを用いてＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過によりに精製し、ジアンチン－ＤＴＭＥを得た。ジアンチン－ＤＴＭＥを、コンジュゲートするまで２０℃で保存した。同時に、ＶＨＨのアリコートを、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用する限外濾過によって濃縮し、緩衝液をＴＢＳ（ｐＨ７．５）に交換した。濃縮したＶＨＨに、新しく調製したＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを添加し、この混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、得られたＶＨＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過によって精製し、次いで、ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ４ ５ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）への遠心分離－洗浄サイクルを繰り返した。得られたＶＨＨ－ＳＨのアリコートをジアンチン－ＤＴＭＥと反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物をｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを用いて濃縮し、１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを用いたゲル濾過により精製し、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）に溶出した。
【0191】
抗体－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４
トラスツズマブ、セツキシマブは、以下、「Ａｂ」と称する。Ａｂを、１、２、３、４、５及び６のＤＡＲでマイケル型チオール－エンコンジュゲート化反応によってサポニンＳＯ１８６１－ＥＭＣＨにコンジュゲートさせた。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ分子は、その構造とそのマレイミド官能基との間に不安定な（Ｌ）ヒドラゾン結合を得て、サポニンとＡｂとの間に不安定な結合を生成する。手順は、トラスツズマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４について例示的に記載する。
トラスツズマブ、セツキシマブは、以下、「Ａｂ」と称する。Ａｂを、１、２、３、４、５及び６のＤＡＲでマイケル型チオール－エンコンジュゲート化反応によってサポニンＳＯ１８６１－ＥＭＣＨにコンジュゲートさせた。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ分子は、その構造とそのマレイミド官能基との間に不安定な（Ｌ）ヒドラゾン結合を得て、サポニンとＡｂとの間に不安定な結合を生成する。手順は、トラスツズマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４について例示的に記載する。
【0192】
セツキシマブ（４０ｍｇ、８．０ｍｌ）の溶液に、それぞれ１０μｌ／ｍｌのトリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス・ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）を得た。
【0193】
セツキシマブを４分割し（それぞれ９．７３ｍｇ、４．８６４ｍｇ／ｍｌ、６５ｎｍｏｌ）、新しく調製したＴＣＥＰ溶液のアリコート（０．５～２．０ｍｇ／ｍｌ、１．１５～７．０２モル当量、７５～４５５ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、ローラーミキシングしながら２０℃で３００分間インキュベートした。インキュベーション後（ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの添加前）、約１ｍｇ（０．２１０ｍｌ）のＡｂ－ＳＨのアリコートを各混合物から取り出し、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用してＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過により精製した。
これらのアリコートの特性を、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイによって明らかにした（チオール対Ａｂ比＝それぞれ２．０、４．２、５．９及び６．８）。バルクＡｂ－ＳＨのそれぞれに、新しく調製したＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ溶液のアリコート（２ｍｇ／ｍｌ、１「チオール」当たり１．３モル当量、０．１５～０．６１μｍｏｌ、０．１６～０．６３ｍｌ）を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で１２０分間インキュベートした。各コンジュゲート化反応の他に、脱塩したＡｂ－ＳＨの２つのアリコート（０．２５ｍｇ、１．６７ｎｍｏｌ）を、それぞれ正及び負の対照として、ＮＥＭ（１「チオール」当たり１．３モル当量、４．３～１７．４ｎｍｏｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液の２．２～８．７μｌ）又はＴＢＳ（ｐＨ７．５）緩衝液（２．２～８．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーション後（ＮＥＭの添加前）、０．２００ｍｌのＡｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨのアリコートを取り出し、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用してＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過により精製した。このアリコートの特性をＵＶ－ｖｉｓによって明らかにし、並行して、陽性対照及び陰性対照の特性をエルマンアッセイによって明らかにし、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ組み込みを得た。バルクＡｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ混合物に、新しく調製したＮＥＭ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ、２．５～１０モル当量、０．１５～０．５８μｍｏｌ）のアリコートを添加し、混合物を、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）で溶出するｚｅｂａスピン脱塩カラムによって精製し、精製セツキシマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）コンジュゲートを得た。この生成物を２．５ｍｇ／ｍｌに標準化し、０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分配した。トラスツズマブ－Ｌ－ＳＯ１８６１コンジュゲートの反応条件及び結果、並びにセツキシマブ－Ｌ－ＳＯ１８６１コンジュゲートの反応条件及び結果を表Ａ３及び表Ａ４に要約する。
これらのアリコートの特性を、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイによって明らかにした（チオール対Ａｂ比＝それぞれ２．０、４．２、５．９及び６．８）。バルクＡｂ－ＳＨのそれぞれに、新しく調製したＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ溶液のアリコート（２ｍｇ／ｍｌ、１「チオール」当たり１．３モル当量、０．１５～０．６１μｍｏｌ、０．１６～０．６３ｍｌ）を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いで、２０℃で１２０分間インキュベートした。各コンジュゲート化反応の他に、脱塩したＡｂ－ＳＨの２つのアリコート（０．２５ｍｇ、１．６７ｎｍｏｌ）を、それぞれ正及び負の対照として、ＮＥＭ（１「チオール」当たり１．３モル当量、４．３～１７．４ｎｍｏｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液の２．２～８．７μｌ）又はＴＢＳ（ｐＨ７．５）緩衝液（２．２～８．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーション後（ＮＥＭの添加前）、０．２００ｍｌのＡｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨのアリコートを取り出し、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用してＴＢＳ（ｐＨ７．５）へのゲル濾過により精製した。このアリコートの特性をＵＶ－ｖｉｓによって明らかにし、並行して、陽性対照及び陰性対照の特性をエルマンアッセイによって明らかにし、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ組み込みを得た。バルクＡｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ混合物に、新しく調製したＮＥＭ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ、２．５～１０モル当量、０．１５～０．５８μｍｏｌ）のアリコートを添加し、混合物を、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）で溶出するｚｅｂａスピン脱塩カラムによって精製し、精製セツキシマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）コンジュゲートを得た。この生成物を２．５ｍｇ／ｍｌに標準化し、０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分配した。トラスツズマブ－Ｌ－ＳＯ１８６１コンジュゲートの反応条件及び結果、並びにセツキシマブ－Ｌ－ＳＯ１８６１コンジュゲートの反応条件及び結果を表Ａ３及び表Ａ４に要約する。
【0194】
【表7】
【0195】
【表8】
【0196】
タンパク質毒素又はサポニンに共有結合した抗体及び受容体リガンドに関する多数の実施形態の概要
ｍＡｂ：トラスツズマブ（ＨＥＲ２）又はセツキシマブ（ＥＧＦＲ）
リガンド：ＥＧＦ
タンパク質毒素：リボソーム不活化たんぱく質、サポリン、ジアンチン
サポニンとリガンドのエンドソームエスケープ増強コンジュゲート：
ｍＡｂ－ＳＯ１８６１エンドソームエスケープ増強コンジュゲート
・切断可能ヒドラゾンリンカーを含む
・トラスツズマブ－ＳＯ１８６１ ＤＡＲ ４．０
・セツキシマブ－ＳＯ１８６１ ＤＡＲ ３．７；
インビトロ又はインビボ試験モデルにおいて、サポニンとリガンドのエンドソームエスケープ増強コンジュゲートは、以下と組み合わされる：
ｍＡｂ／リガンド－タンパク質毒素コンジュゲート
・切断不可能な化学リンカーを含有するか、又は組換え融合タンパク質である
・トラスツズマブ－サポリン ＤＡＲ ３．０
・セツキシマブ－サポリン ＤＡＲ ２．６
・トラスツズマブ－ジアンチン ＤＡＲ １．０
・ＥＧＦ－ジアンチン（融合タンパク質） ＤＡＲ １．０
・ＩｇＧ－サポリン ＤＡＲ ２．２
ｍＡｂ：トラスツズマブ（ＨＥＲ２）又はセツキシマブ（ＥＧＦＲ）
リガンド：ＥＧＦ
タンパク質毒素：リボソーム不活化たんぱく質、サポリン、ジアンチン
サポニンとリガンドのエンドソームエスケープ増強コンジュゲート：
ｍＡｂ－ＳＯ１８６１エンドソームエスケープ増強コンジュゲート
・切断可能ヒドラゾンリンカーを含む
・トラスツズマブ－ＳＯ１８６１ ＤＡＲ ４．０
・セツキシマブ－ＳＯ１８６１ ＤＡＲ ３．７；
インビトロ又はインビボ試験モデルにおいて、サポニンとリガンドのエンドソームエスケープ増強コンジュゲートは、以下と組み合わされる：
ｍＡｂ／リガンド－タンパク質毒素コンジュゲート
・切断不可能な化学リンカーを含有するか、又は組換え融合タンパク質である
・トラスツズマブ－サポリン ＤＡＲ ３．０
・セツキシマブ－サポリン ＤＡＲ ２．６
・トラスツズマブ－ジアンチン ＤＡＲ １．０
・ＥＧＦ－ジアンチン（融合タンパク質） ＤＡＲ １．０
・ＩｇＧ－サポリン ＤＡＲ ２．２
【0197】
実施例４～９について：
材料：
トラスツズマブ及びセツキシマブは、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入した。ＳＯ１８６１は、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって、サポナリア・オフィキナリス Ｌ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）から得た生植物抽出物から単離され精製された。
方法
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１は、サポナリア・オフィキナリス Ｌ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）（Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨ）から得、当該技術分野で知られた従来の工程によってＥＭＣＨに結合させた。
ＳＯ１８６１の抗体へのコンジュゲート化
トラスツズマブ－ＳＯ１８６１及びセツキシマブ－ＳＯ１８６１のカスタム生産は、ＦｌｅｅｔＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＵＫ）によって行われた。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを抗体のシステインにコンジュゲートさせた。
トラスツズマブ及びセツキシマブへのサポリンのコンジュゲート化
カスタムトラスツズマブ－サポリン及びセツキシマブ－サポリンコンジュゲートは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で製造され、そこから購入した。ＩｇＧ－サポリン及びサポリンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した
ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで行い、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアによりデータ分析した。ＦＡＣＳ抗体は以下のとおりであった：１）アイソタイプ：ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κアイソタイプＣｔｒｌ（ＦＣ）（４００１２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）．ＥＧＦＲ：ＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）ＨＥＲ２：ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（３２４４０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
ジアンチン生成
ジアンチンを細菌培養物中で発現させ、このたんぱく質を当該技術分野で知られた従来の細胞培養及びタンパク質精製工程に従って精製した。
抗体のジアンチンへのコンジュゲート化
抗体とジアンチンへのコンジュゲート化は、当該技術分野で知られている一般的な手順に従った。
細胞培養
細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補充したＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
細胞生存率アッセイ
細胞を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで１ウェル当たり５．０００～１０．０００個播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗体にコンジュゲートしたＳＯ１８６１（すなわち、本発明の「結合分子」又は「エンドソームエスケープ増強コンジュゲート」）及び標的化毒素（すなわち、「結合分子」）を共に１０×最終濃度で含有するＰＢＳ中の１０×濃縮処理混合物試料を調製した。培地を細胞培養プレートから除去し、１８０μＬの培養培地に置き換え、続いて１ウェル当たり２０μＬの処理混合物を添加した。対照については、対応する濃度の抗体結合ＳＯ１８６１のみ、抗体のみ、ＳＯ１８６１のみ、標的化毒素のみ、又はビヒクル対照として化合物を含まないＰＢＳを含有する１０×処理混合物試料を調製した。エンドソーム酸性化阻害剤（クロロキン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）又はバフィロマイシンＡ１（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用した場合、処理工程１における細胞培養培地を、１μＭのクロロキン又は０．２μＭのバフィロマイシンＡ１を含有する１８０μＬの培地に置き換えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、１０×処理混合物試料を添加した。残りのインキュベーション及び処理工程は、当該技術文で知られた標準的な手順に従って行った。
材料：
トラスツズマブ及びセツキシマブは、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入した。ＳＯ１８６１は、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって、サポナリア・オフィキナリス Ｌ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）から得た生植物抽出物から単離され精製された。
方法
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１は、サポナリア・オフィキナリス Ｌ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）（Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨ）から得、当該技術分野で知られた従来の工程によってＥＭＣＨに結合させた。
ＳＯ１８６１の抗体へのコンジュゲート化
トラスツズマブ－ＳＯ１８６１及びセツキシマブ－ＳＯ１８６１のカスタム生産は、ＦｌｅｅｔＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＵＫ）によって行われた。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを抗体のシステインにコンジュゲートさせた。
トラスツズマブ及びセツキシマブへのサポリンのコンジュゲート化
カスタムトラスツズマブ－サポリン及びセツキシマブ－サポリンコンジュゲートは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で製造され、そこから購入した。ＩｇＧ－サポリン及びサポリンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した
ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで行い、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアによりデータ分析した。ＦＡＣＳ抗体は以下のとおりであった：１）アイソタイプ：ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κアイソタイプＣｔｒｌ（ＦＣ）（４００１２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）．ＥＧＦＲ：ＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）ＨＥＲ２：ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（３２４４０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
ジアンチン生成
ジアンチンを細菌培養物中で発現させ、このたんぱく質を当該技術分野で知られた従来の細胞培養及びタンパク質精製工程に従って精製した。
抗体のジアンチンへのコンジュゲート化
抗体とジアンチンへのコンジュゲート化は、当該技術分野で知られている一般的な手順に従った。
細胞培養
細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補充したＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
細胞生存率アッセイ
細胞を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで１ウェル当たり５．０００～１０．０００個播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗体にコンジュゲートしたＳＯ１８６１（すなわち、本発明の「結合分子」又は「エンドソームエスケープ増強コンジュゲート」）及び標的化毒素（すなわち、「結合分子」）を共に１０×最終濃度で含有するＰＢＳ中の１０×濃縮処理混合物試料を調製した。培地を細胞培養プレートから除去し、１８０μＬの培養培地に置き換え、続いて１ウェル当たり２０μＬの処理混合物を添加した。対照については、対応する濃度の抗体結合ＳＯ１８６１のみ、抗体のみ、ＳＯ１８６１のみ、標的化毒素のみ、又はビヒクル対照として化合物を含まないＰＢＳを含有する１０×処理混合物試料を調製した。エンドソーム酸性化阻害剤（クロロキン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）又はバフィロマイシンＡ１（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用した場合、処理工程１における細胞培養培地を、１μＭのクロロキン又は０．２μＭのバフィロマイシンＡ１を含有する１８０μＬの培地に置き換えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、１０×処理混合物試料を添加した。残りのインキュベーション及び処理工程は、当該技術文で知られた標準的な手順に従って行った。
【0198】
処理後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、製造者の説明書に従って実施したＭＴＳアッセイによって細胞生存率を決定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。簡潔に記載すると、ＭＴＳ溶液を、１０％ＦＢＳを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）で２０×に希釈した。細胞を１ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、その後、１ウェル当たり１００μＬの希釈ＭＴＳ溶液を加えた。プレートを３７℃で約２０～３０分間インキュベートした。続いて、４９２ｎｍの光学密度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。定量化のために、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを全ての他のウェルから差し引いた後、処理／未処理細胞の割合を、未処理ウェルのバックグラウンド補正済シグナルを処理ウェルのバックグラウンド補正済シグナルで割ることによって算出した。
【0199】
結果
実施例４．１標的２成分系
１標的２成分系はｍＡｂ１－タンパク質毒素とｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせ処理であり（図１Ａ、Ｅを参照）、２標的２成分系はｍＡｂ１－タンパク質毒素とｍＡｂ２－ＳＯ１８６１、又はｍＡｂ２－タンパク質毒素とｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせである（図１Ｂ～Ｄ）。
実施例４．１標的２成分系
１標的２成分系はｍＡｂ１－タンパク質毒素とｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせ処理であり（図１Ａ、Ｅを参照）、２標的２成分系はｍＡｂ１－タンパク質毒素とｍＡｂ２－ＳＯ１８６１、又はｍＡｂ２－タンパク質毒素とｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせである（図１Ｂ～Ｄ）。
【0200】
セツキシマブ－ＳＯ１８６１（サポニン分子ＳＯ１８６１にコンジュゲートされたＥＧＦＲを認識し結合するモノクローナル抗体；エンドソームエスケープ増強コンジュゲート）を、固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン（タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたＥＧＦＲを認識し結合するモノクローナル抗体）に対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、高ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を測定した。高ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１又はＣａＳＫｉ）は、１０ｐＭのセツキシマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲート化ＳＯ１８６１と組み合わせた場合、効率的な細胞死滅を示した（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝６００ｎＭ及びＣａｓｋｉ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝７００ｎＭ；図８Ａ、８Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、セツキシマブ－サポリンをセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた場合、強力な細胞死滅が、低濃度のＳＯ１８６１で既に誘導された（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝５ｎＭ及びＣａｓｋｉ［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝８ｎＭ；図８Ａ、８Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較して、エンドソームエスケープの誘導により効果的であることを示している。次に、セツキシマブ－サポリンを、固定濃度３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、ＥＧＦＲ発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。高ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１又はＣａＳＫｉ）は、高濃度のセツキシマブ－サポリンでのみ非標的化非コンジュゲート３００ｎＭ ＳＯ１８６１と組み合わせて細胞死滅を示し（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ；ＣａＳｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ；図８Ｃ、８Ｄ；表Ａ７）、一方、低濃度のセツキシマブ－サポリン濃度と組み合わせた３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１は既に効率的な細胞死滅を誘導した（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．４ｐＭ；ＣａＳＫｉ：［毒素］ＩＣ５０＝２ｐＭ；図８Ｃ及び８Ｄ；表Ａ７）。高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）を低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた場合、最高の細胞死滅効率が達成される（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．０３ｐＭ；ＣａＳｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝０．０２ｐＭ；図８Ｃ、８Ｄ；表Ａ７）。この全ては、比較的低濃度のＳＯ１８６１がセツキシマブにコンジュゲートされた場合、比較的低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせて、高ＥＧＦＲ発現細胞を効率的に死滅させることができることを示している。低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、１標的２成分系では、両コンジュゲートが同じＥＧＦＲ受容体に対し競合するため、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への侵入に役割を果たさず、このため依然として最も効果的である。受容体競合原理はまた、７５ｎＭのセツキシマブが無くても（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ；ＣａＳｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ）有っても（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝１０００ｐＭ；Ｃａｓｋｉ：ＩＣ５０＝１０００ｐＭから；図８Ｃ、８Ｄ）、セツキシマブ－毒素のタイトレーション処理で明確に示されている。
【0201】
次に、セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度１０ｐＭのセツキシマブ－サポリンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、低／非ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を測定した。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）は、１０ｐＭのセツキシマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせてようやく細胞死滅を示し、一方、ＥＧＦＲ（Ａ２０５８）を発現しないＡ２０５８細胞は全く感受性がなかった（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図９Ａ、９Ｂ；表Ａ６）．１０ｐＭのセツキシマブ－サポリンと濃度を漸増させたセツキシマブ－ＳＯ１８６１との組み合わせは、両細胞株において有意な細胞死滅を誘導しなかった（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図９Ａ、９Ｂ；表Ａ６）．これは、十分な受容体の発現がなければ、細胞内のＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び毒素媒介細胞死滅を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。次に、セツキシマブ－サポリンを、固定濃度３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、低／非ＥＧＦＲ発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）は、非常に高濃度のセツキシマブ－サポリンを２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１又は３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせてようやく細胞死滅を示し、一方、Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ）は、試験した濃度では感受性はなかった（ＨｅＬａ：［毒素］ＩＣ５０＝６０ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図９Ｃ、９Ｄ；表Ａ７）。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）では、低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示し、一方、Ａ２０５８細胞では、非常に高濃度のセツキシマブ－サポリンを１５００ｎＭの非標的化ＳＯ１８６１と組み合わせてようやく、特異的な細胞死滅が誘導される（Ｈｅｌａ：［毒素］ＩＣ５０＝０．０３ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＝２０ｐＭ；図９Ｃ、９Ｄ；表Ａ６）．この全ては、ＥＧＦＲ受容体発現が低いか又は発現しない細胞は、細胞内への十分なＳＯ１８６１及び毒素の侵入を促進するだけの十分なＥＧＦＲ受容体が欠如しているために、セツキシマブ－ＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。
【0202】
トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（サポニン分子ＳＯ１８６１にコンジュゲートされたＨＥＲ２を認識し結合するモノクローナル抗体；本発明によるエンドソームエスケープ増強コンジュゲート）を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたＨＥＲ２を認識し結合するモノクローナル抗体）に対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、高ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を測定した。高ＨＥＲ２発現細胞（ＳＫＢＲ３）は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた場合、効率的な細胞死滅を示した（ＳＫＢＲ３；図１０Ａ、１０Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、トラスツズマブ－サポリンをトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた場合、低濃度のＳＯ１８６１で既に強力な細胞死滅が誘導された（ＳＫＢＲ３；図１０Ａ、１０Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較して、エンドソームエスケープの誘導により効果的であることを示している。次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度５０ｎＭトラスツズマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。高ＨＥＲ２発現細胞（ＳＫＢＲ３又はＢＴ４７４）は、高濃度のトラスツズマブ－サポリンを非標的化非コンジュゲート１０ｎＭ ＳＯ１８６１と組み合わせてようやく細胞死滅を示し（表Ａ７）、一方、低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた１０ｎＭトラスツズマブ－ＳＯ１８６１は既に効率的な細胞死滅を誘導した（表Ａ７）。高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）を低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた場合、最高の細胞死滅効率が達成される（表Ａ７） この全ては、低濃度のＳＯ１８６１がトラスツズマブにコンジュゲートされた場合、比較的低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせて、高ＨＥＲ２発現細胞を効率的に死滅させることができることを示している。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、１標的２成分系では、両コンジュゲートが同じＥＧＦＲ受容体に対し競合するため、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への侵入に役割を果たさず、このため、依然として最も効果的である。受容体競合原理はまた、２．５ｎＭのトラスツズマブの有無にかかわらず、トラスツズマブ毒素のタイトレーション処理で明確に示されている（ＳＫＢＲ３：［毒素］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ）。
【0203】
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、低／非ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を測定した。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＪＩＭＴ１；Ａ４３１）は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせてようやく細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１１Ａ、１１Ｂ；表Ａ６）．５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンと、濃度を増加させたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１との組み合わせは、両細胞株において有意な細胞死滅を誘導しなかった（ＪＩＭＴ１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１１Ａ、１１Ｂ；表Ａ６）．これは、十分な受容体の発現がなければ、細胞内のＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び毒素媒介細胞死滅を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度１０ｎＭトラスツズマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、低／非ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。低ＨＥＲ２発現細胞（ＪＩＭＴ１；Ａ４３１）は、１０ｎＭトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた高濃度トラスツズマブ－サポリンで有意な細胞死滅を示さない（ＪＩＭＴ－１：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１１Ｃ、１１Ｄ；表Ａ７）．低ＨＥＲ２発現細胞においては、低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、（効率的な細胞死滅を示す（ＪＩＭＴ１：［毒素］ＩＣ５０＝０．１ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．８ｐＭ；図１１Ｃ、１１Ｄ；表Ａ５）。この全ては、ＨＥＲ２受容体発現が低い細胞は、細胞内への十分なＳＯ１８６１及び毒素の侵入を促進するだけの十分なＨＥＲ２受容体が欠如しているために、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。
【0204】
実施例５．２標的２成分系
セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を測定した。Ａ４３１及びＣａＳｋｉ細胞は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた場合、効率的な細胞死滅を示した（Ａ４３１及びＣａｓｋｉ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；図１２Ａ、１２Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、トラスツズマブ－サポリンをセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた場合、強力な細胞死滅が、低濃度のＳＯ１８６１で既に誘導された（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１２ｎＭ及びＣａｓｋｉ［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝４０ｎＭ；図１２Ａ、１２Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較して、エンドソームエスケープの誘導により効果的であることを示している。次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１及びＣａＳｋｉ）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。３００ｎＭの非標的非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた高濃度のトラスツズマブ－サポリンでは、効率的な細胞死滅は観察されず（Ａ４３１及びＣａｓｋｉ：：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１２Ｃ、１２Ｄ；表Ａ７）、一方、低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１は、既に効率的な細胞死滅を誘導した（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝３ｐＭ；ＣａＳＫｉ：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ；図１２Ｃ及び１２Ｄ；表Ａ７）。Ａ４３１細胞では、高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１を低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた場合、同等の細胞死滅効率が達成される（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ；図１２Ｃ；表Ａ７）。Ｃａｓｋｉ細胞では、これらの細胞におけるＥＧＦＲ発現がＡ４３１と比較して有意に低く、したがって、ＳＯ１８６１のＣａｓｋｉ細胞への標的化送達があまり十分ではないという事実のため、応答はセツキシマブ－ＳＯ１８６１及びトラスツズマブ－サポリンの組み合わせと比較してわずかに強かった（Ｃａｓｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝０．２ｐＭ；図１２Ｄ；表Ａ７を参照）。この全ては、低濃度のＳＯ１８６１がセツキシマブにコンジュゲートされた場合、比較的低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせて、高ＥＧＦＲ発現細胞を効率的に死滅させることができることを示している。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、２標的２成分系では、両コンジュゲートが異なる受容体により、すなわち、ＳＯ１８６１はＥＧＦＲにより、毒素はＨＥＲ２受容体により送達されるため、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への侵入に役割を果たさず、このため、同等の活性を有する。
セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を測定した。Ａ４３１及びＣａＳｋｉ細胞は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた場合、効率的な細胞死滅を示した（Ａ４３１及びＣａｓｋｉ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；図１２Ａ、１２Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、トラスツズマブ－サポリンをセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた場合、強力な細胞死滅が、低濃度のＳＯ１８６１で既に誘導された（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１２ｎＭ及びＣａｓｋｉ［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝４０ｎＭ；図１２Ａ、１２Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較して、エンドソームエスケープの誘導により効果的であることを示している。次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１及びＣａＳｋｉ）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。３００ｎＭの非標的非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた高濃度のトラスツズマブ－サポリンでは、効率的な細胞死滅は観察されず（Ａ４３１及びＣａｓｋｉ：：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１２Ｃ、１２Ｄ；表Ａ７）、一方、低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１は、既に効率的な細胞死滅を誘導した（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝３ｐＭ；ＣａＳＫｉ：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ；図１２Ｃ及び１２Ｄ；表Ａ７）。Ａ４３１細胞では、高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１を低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた場合、同等の細胞死滅効率が達成される（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ；図１２Ｃ；表Ａ７）。Ｃａｓｋｉ細胞では、これらの細胞におけるＥＧＦＲ発現がＡ４３１と比較して有意に低く、したがって、ＳＯ１８６１のＣａｓｋｉ細胞への標的化送達があまり十分ではないという事実のため、応答はセツキシマブ－ＳＯ１８６１及びトラスツズマブ－サポリンの組み合わせと比較してわずかに強かった（Ｃａｓｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝０．２ｐＭ；図１２Ｄ；表Ａ７を参照）。この全ては、低濃度のＳＯ１８６１がセツキシマブにコンジュゲートされた場合、比較的低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせて、高ＥＧＦＲ発現細胞を効率的に死滅させることができることを示している。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、２標的２成分系では、両コンジュゲートが異なる受容体により、すなわち、ＳＯ１８６１はＥＧＦＲにより、毒素はＨＥＲ２受容体により送達されるため、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への侵入に役割を果たさず、このため、同等の活性を有する。
【0205】
次に、セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、低／非ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を測定した。低ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせてようやく細胞死滅を示した（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ｆ図１３Ａ、１３Ｂ；表Ａ６）。５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンと、濃度を増加させたセツキシマブ－ＳＯ１８６１との組み合わせは、両細胞株において、高濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１でようやく有意な細胞死滅を示した（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１３Ａ、１３Ｂ；表Ａ６）。これは、十分な受容体の発現がなければ、細胞内のＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び毒素媒介細胞死滅を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、低／非ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。低／非ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞（ＨｅＬａ及びＡ２０５８）は、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＨｅＬａ）と組み合わせた高濃度のトラスツズマブ－サポリン濃度では、有意な細胞死滅を示さない（ＨｅＬａ：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１３Ｃ、１３Ｄ；表Ａ７）。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示す（ＨｅＬａ：［毒素］ＩＣ５０＝０．４ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＝０．５ｐＭ；図１３Ｃ、１３Ｄ；表Ａ５）。この全ては、低／非ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現を有する細胞は、細胞内での毒素の効率的な細胞質送達を確実にするだけの十分なＳＯ１８６１の侵入を促進する十分なＥＧＦＲ受容体が欠如しているために、セツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。
【0206】
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦ－ジアンチンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、高ＨＥＲ２／低ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を測定した。ＳＫＢＲ３は、１．５ｐＭのＥＧＦ－ジアンチンを、高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた場合、効率的な細胞死滅を示した（ＳＫＢＲ３：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝８００ｎＭ；図１４Ａ；表Ａ６）。しかしながら、ＥＧＦ－ジアンチンをトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた場合、低濃度のコンジュゲートＳＯ１８６１で既に強力な細胞死滅が誘導された（ＳＫＢＲ３：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝２ｎＭ；図１４Ａ；表Ａ５）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較して、エンドソームエスケープの誘導により効果的であることを示している。次に、ＥＧＦ－ジアンチンを、固定濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、ＳＫＢＲ３に対する標的タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。１０ｎＭの非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた高濃度のＥＧＦ－ジアンチンでは、効率的な細胞死滅は観察されず（ＳＫＢＲ３（示す）及びＢＴ４７４（示さず）：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１４Ｂ；表Ａ７）、一方、低濃度のＥＧＦ－ジアンチン濃度と組み合わせた９．４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１は、既に効率的な細胞死滅を誘導した（ＳＫＢＲ３：［毒素］ＩＣ５０＝３ｐＭ（示す）；ＢＴ４７４：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ（示さず）；図１４Ｂ；表Ａ７）。同等の細胞死滅効率は、高濃度（１０７５ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１を低濃度のＥＧＦ－ジアンチンと組み合わせた場合に達成される；図１４Ｂ；表Ａ７）。この全ては、低濃度のＳＯ１８６１がトラスツズマブにコンジュゲートされた場合、比較的低濃度のＥＧＦ－ジアンチンと組み合わせて、高ＨＥＲ２発現細胞を効率的に死滅させることができることを示している。低濃度のＥＧＦ－ジアンチンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、２標的２成分系では、両コンジュゲートが異なる受容体により、すなわち、ＳＯ１８６１はＨＥＲ２により、毒素はＥＧＦＲ受容体により送達されるため、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への侵入に役割を果たさず、このため、同等の活性を有する。
【0207】
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を、固定濃度５ｐＭのセツキシマブ－サポリンに対してタイトレーションし（ＳＯ１８６１の濃度で算出）、低ＨＥＲ２、低／高ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を測定したところ、５ｐＭのセツキシマブ－サポリンを高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた場合に細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１５Ａ、２２Ｂ；表Ａ６）。５ｐＭのセツキシマブ－サポリンと、濃度を増加させたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１との組み合わせは、両細胞株において、高濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１でようやく有意な細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１５Ａ、１５Ｂ；表Ａ６）。これは、十分な受容体の発現がなければ、細胞内のＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び毒素媒介細胞死滅を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。次に、セツキシマブ－サポリンを、固定濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１に対してタイトレーションし、ＪＩＭＴ－１及びＡ４３１に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。高濃度のセツキシマブ－サポリンを１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせてようやく細胞死が観察された（ＪＩＭＴ－１：［毒素］ＩＣ５０＞９０ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＞２０ｐＭ；図１５Ｃ、１５Ｄ；図Ａ７）。低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示す（ＪＩＭＴ－１：［毒素］ＩＣ５０＝０．０２ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．０３ｐＭ；図１５Ｃ、１５Ｄ；表Ａ５）。この全ては、低ＨＥＲ２、低／高ＥＧＦＲ発現を有する細胞は、細胞内での毒素の効率的な細胞質送達を確実にするだけの十分なＳＯ１８６１の侵入を促進する十分なＨＥＲ２受容体が欠如しているために、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。Ａ４３１細胞においては、非常に高いＥＧＦＲ発現でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１によるＳＯ１８６１の取り込みを促進し得るＨＥＲ２受容体が欠如しているために、ＳＯ１８６１は閾値に到達せず、このため、セツキシマブ－サポリンによる効率的な細胞死滅はもたらされなかった。
【0208】
実施例６．
２標的２成分系は、非常に低い標的発現細胞の細胞死滅をもたらす。Ａ４３１細胞においては、Ｔ－ＤＭ１がナノモル濃度で細胞を死滅させ、一方、標的化２成分系はピコモル濃度で細胞を効率的に死滅させることができる（毒素濃度の約７０００倍の減少）（図１６）
２標的２成分系は、非常に低い標的発現細胞の細胞死滅をもたらす。Ａ４３１細胞においては、Ｔ－ＤＭ１がナノモル濃度で細胞を死滅させ、一方、標的化２成分系はピコモル濃度で細胞を効率的に死滅させることができる（毒素濃度の約７０００倍の減少）（図１６）
【0209】
実施例７．作用機序
エンドソーム酸性化がブロックされると、ＳＰＴ００１（植物由来サポニン、ＳＯ１８６１）が低エンドソームｐＨでようやく活性になるという事実のために、標的化２成分系は活性ではない。
エンドソーム酸性化がブロックされると、ＳＰＴ００１（植物由来サポニン、ＳＯ１８６１）が低エンドソームｐＨでようやく活性になるという事実のために、標的化２成分系は活性ではない。
【0210】
実施例８
エンドソーム酸性化阻害剤が標的化２成分系活性を遮断し、エンドソームの酸性化が遮断された場合にＳＯ１８６１機能が低下することを示す。
エンドソーム酸性化阻害剤が標的化２成分系活性を遮断し、エンドソームの酸性化が遮断された場合にＳＯ１８６１機能が低下することを示す。
【0211】
実施例９
図１７Ａ－Ｅは、トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧに結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。
図１７Ａ－Ｅは、トラスツズマブ（図１７Ａ）、セツキシマブ（図１７Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図１７Ｃ）、遊離毒素のサポリン（図１７Ｄ）及びジアンチン（図１７Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧに結合したサポリン（図１７Ｄ）、並びに遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わされた非細胞結合ＩｇＧと結合したサポリン（図１７Ｅ）を、示した細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触させた場合の相対細胞生存率を示す。
【0212】
トラスツズマブ及びセツキシマブは、ほとんどの細胞株に曝露された場合、細胞生存率に影響を及ぼさないか又はほとんど影響を及ぼさず、トラスツズマブが比較的高用量でＳＫ－ＢＲ－３細胞に曝露された場合、細胞生存率にいくらかの影響を及ぼし、セツキシマブが比較的高用量でＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に曝露された場合、細胞生存率にいくらかの影響を及ぼす。
【0213】
ＴＤＭ－１又はアドトラスツズマブエムタンシンは、以下の治療に米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された標的療法である：過去にＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（化学名：トラスツズマブ）及びタキサン化学療法で治療されたＨＥＲ２陽性転移性乳癌；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びタキサンによる新補助化学療法（術前）後に残存疾患が認められた場合の術後の早期ＨＥＲ２陽性乳癌。ＴＤＭ－１は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと化学療法薬のエムタンシンとの組み合わせである。図１７Ｃは、ＴＤＭ－１が試験した全ての細胞株で細胞生存率の低下をもたらすことを示している。
【0214】
試験した細胞株の細胞表面分子のいずれにも親和性を有さない対照ＩｇＧに結合した遊離毒素のサポリン及びジアンチン並びに毒素サポリンは、１００００ｐＭまでの試験した広範囲の毒素濃度で細胞生存率に影響を及ぼさないか、又はほとんど及ぼさない。
【0215】
毒素サポリンが非細胞結合ＩｇＧに結合した場合、このコンジュゲートを遊離サポニンＳＯ１８６１と組み合わせると、ＩｇＧ－サポリンの用量依存的な相対細胞生存率の低下がもたらされる（図１７Ｅ）。
【0216】
【表9】
【0217】
表Ａ５の説明：
＊ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、５ｎＭを超える全てのＣセツキシマブ［］で２０～２５％の細胞生存率の低下を示す
＊＊ＳＫ－ＢＲ－３細胞は、１ｎＭのトラスツズマブで２０％の細胞生存率の低下を示し、１ｎＭを超える全てのトラスツズマブで３０～３５％の減少を示す
＊ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、５ｎＭを超える全てのＣセツキシマブ［］で２０～２５％の細胞生存率の低下を示す
＊＊ＳＫ－ＢＲ－３細胞は、１ｎＭのトラスツズマブで２０％の細胞生存率の低下を示し、１ｎＭを超える全てのトラスツズマブで３０～３５％の減少を示す
【0218】
【表10】
【0219】
【表11】
【0220】
実施例１０－ＡＤＣと組み合わせた本発明のコンジュゲートによる哺乳類の担癌動物の処置は、生存及び腫瘍退縮をもたらす
雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにヒトＡ４３１腫瘍細胞の懸濁液を皮下注射した。異種移植動物腫瘍モデルにおいて、マウスの皮膚下にヒト表皮癌が発生した。腫瘍細胞の注射後、異種移植腫瘍を約１７０～１８０ｍｍ３のサイズに発達させた。Ａ４３１腫瘍細胞は、以下の特徴を有する：高ＥＧＦＲ発現体、中程度のＣＤ７１発現体、低ＨＥＲ２発現体。
雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにヒトＡ４３１腫瘍細胞の懸濁液を皮下注射した。異種移植動物腫瘍モデルにおいて、マウスの皮膚下にヒト表皮癌が発生した。腫瘍細胞の注射後、異種移植腫瘍を約１７０～１８０ｍｍ３のサイズに発達させた。Ａ４３１腫瘍細胞は、以下の特徴を有する：高ＥＧＦＲ発現体、中程度のＣＤ７１発現体、低ＨＥＲ２発現体。
【0221】
表６Ａに、対照マウス及び担癌マウスの処置の結果を示す。担癌マウスを、異種移植腫瘍の細胞表面受容体であるヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、ヒトＥＧＦＲ、又はヒトＣＤ７１に向かう示された抗体で処置した。セツキシマブをサポニンＳＯ１８６１と共有結合させた。ＳＯ１８６１にまず、リンカーＥＭＣＨ（Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド）を提供した。このＥＭＣＨは、スルフヒドリル（抗体の還元システイン）をカルボニル（アルデヒド又はケトン；ここではサポニンのＣ－２３位のアルデヒドのカルボニル）に共有結合させるためのマレイミド－ヒドラジド架橋剤である。サポニン－ＥＭＣＨをセツキシマブの還元されたシステインに共有結合させ、ＥＭＣＨとシステイン側鎖との間にチオエーテル共有結合を形成した。ＡＤＣのトラスツズマブ－サポリン（共有結合コンジュゲート）及び抗ＣＤ７１ ｍＡｂ（ＯＫＴ－９、ＩｇＧ）－サポリン（共有結合コンジュゲート）を、マウスにおけるそれらの腫瘍攻撃効力について試験し、ＡＤＣによる処置の開始後の時間における腫瘍体積として測定した。ＡＤＣの用量は、腫瘍モデルにおける準最適用量あった。すなわち、以前の実験から、準最適用量のＡＤＣでは、腫瘍の退縮又は腫瘍増殖の停止を観察することができないことが立証された。
【0222】
これらの結果は、ＡＤＣ単独での担癌マウスの処置を考慮した場合、有効ではない（腫瘍増殖、マウスの死を防げない（安楽死））用量でのＡＤＣの、サポニン、すなわちＳＯ１８６１に共有結合した腫瘍細胞特異的受容体を標的とする抗体からなる本発明のコンジュゲート、単独で投与された場合、有効ではない用量で（腫瘍増殖、マウスの死を防げない（安楽死））、癌に罹患しているマウスに投与される共有結合コンジュゲートとの組み合わせ療法が、処置された動物の腫瘍の退縮及び長期生存（実験の期間を超える）として表される、効率的且つ有効な処置レジメンを提供することを実証する。単独で投与された場合に抗腫瘍活性を有さない本発明の共有結合されたサポニン含有コンジュゲートと組み合わされたＡＤＣの準最適用量は、したがって、癌患者の有効な治療選択肢を提供し、ＡＤＣの相対的に低い用量が有効である。低用量のＡＤＣは有害事象のリスクが少ないか又は副作用が全くないという見込みを有する。加えて、ＡＤＣの有効性を考慮した場合、サポニン担持コンジュゲートの促進効果は、当該実施例が実証するように、ＡＤＣの有効性が組み合わせ療法の設定において改善されるので、腫瘍患者の治療を考慮した場合、以前は有効性を欠くことが証明されたＡＤＣが、新たな注目及び価値を獲得し得ることを示す。ヒトの臨床現場で以前に調査されたが、その後、いくつかのＡＤＣはさらなる臨床研究から取り消された当該技術分野で知られているＡＤＣが参照される。特に、有効性の欠如が観察されたため、及び／又は許容できない有害事象が発生したために臨床開発が終了したＡＤＣは、試験したセツキシマブ－サポニンなどの共有結合したサポニン含有コンジュゲートと組み合わせた場合に、癌患者にとって新たな価値を獲得する可能性のあるＡＤＣである。
【0223】
【表12】
【0224】
実施例１１－エンドソーム／リソソームエスケープ増強活性を有する、ＱＳ－２１を含むキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）のサポニン混合物
スキームＱは、一連のＱＳ－２１サポニンの共通の分子構造を示す（一部、Ｃｏｎｒａｄｏ Ｐｅｄｅｂｏｓ，Ｌａｅｒｃｉｏ Ｐｏｌ－Ｆａｃｈｉｎ，Ｒａｍｏｎ Ｐｏｎｓ，Ｃｉｌａｉｎｅ Ｖ．Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｈｕｇｏ Ｖｅｒｌｉ，Ａｔｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｍｉｃｅｌｌｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＱＳ－２１ Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１９，３７４４－３７６０から出典；４つのイソ型、ここで、示されたグリカンのそれぞれはＲ基として結合し得る）。キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｓ４５２１；Ｒｏｔｈ、製品番号６８５７；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、製品「Ｑｕｉｌ－Ａ」）から得られる水溶性サポニンの混合物は、混合物中に存在する少なくとも１つの個々のサポニン、例えばＱＳ－２１のエンドソーム／リソソームエスケープ増強特性に基づいて、又は混合物に含まれるＱＳ－２１及びＱＳ－７などの２つ以上のサポニンの組み合わせに基づいて、本発明のエンドソーム／リソソームエスケープ増強コンジュゲート、組成物及び組み合わせにおいて適用され得る。
スキームＱは、一連のＱＳ－２１サポニンの共通の分子構造を示す（一部、Ｃｏｎｒａｄｏ Ｐｅｄｅｂｏｓ，Ｌａｅｒｃｉｏ Ｐｏｌ－Ｆａｃｈｉｎ，Ｒａｍｏｎ Ｐｏｎｓ，Ｃｉｌａｉｎｅ Ｖ．Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｈｕｇｏ Ｖｅｒｌｉ，Ａｔｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｍｉｃｅｌｌｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＱＳ－２１ Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１９，３７４４－３７６０から出典；４つのイソ型、ここで、示されたグリカンのそれぞれはＲ基として結合し得る）。キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｓ４５２１；Ｒｏｔｈ、製品番号６８５７；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、製品「Ｑｕｉｌ－Ａ」）から得られる水溶性サポニンの混合物は、混合物中に存在する少なくとも１つの個々のサポニン、例えばＱＳ－２１のエンドソーム／リソソームエスケープ増強特性に基づいて、又は混合物に含まれるＱＳ－２１及びＱＳ－７などの２つ以上のサポニンの組み合わせに基づいて、本発明のエンドソーム／リソソームエスケープ増強コンジュゲート、組成物及び組み合わせにおいて適用され得る。
【0225】
本発明者らは、２．５マイクログラム／ｍｌの用量のキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンの混合物が、細胞ベースのバイオアッセイにおいて哺乳動物腫瘍細胞を用いて試験した場合、ジアンチンのエンドソームエスケープを増強することができることを実証した。細胞に曝露したエフェクター分子は、リガンドＥＧＦに共有結合したジアンチンであった：ＥＧＦ－ジアンチン。試験した細胞は、遊離サポニンについては腫瘍細胞株ＨｅＬａであり、セツキシマブに共有結合された場合のサポニンの試験ではＡ４３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＣａＳｋｉ及びＡ２０５８であった。
【0226】
【化1】
【0227】
実施例１２
１標的２成分系（１Ｔ２Ｃ）は、図１Ａ、Ｅに示すように、ｍＡｂ１－タンパク質毒素及びｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせ処理である。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨはシステイン残基（Ｃｙｓ）を介して、ＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴはリシン残基を介して、セツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識及び結合するモノクローナル抗体）に、いずれもＤＡＲ ４でコンジュゲートさせ、２つのコンジュゲート、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４を生成した。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内投与、（ｉ．ｐ．））及びセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））の組み合わせを、ＥＧＦＲ腫瘍標的化遺伝子サイレンシング活性についてＡ４３１異種移植マウス腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍が約１５０ｍｍ３のサイズに達した１２日目に投薬を開始し、最初の投薬の７２時間後に腫瘍試料を採取し、対照遺伝子ｍＲＮＡ発現レベル（参照遺伝子）と比較してＨＳＰ２７遺伝子発現について分析した。これにより、５０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の１回の投与が、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又はセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の単独療法の単回投与と比較して、Ａ４３１腫瘍においてＨＳＰ２７遺伝子発現の５０％の減少をもたらしたことが明らかになった（図１８）。ビヒクル対照腫瘍と比較して、４０％のＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングの減少が観察された。これは、１Ｔ２Ｃ発明による、セツキシマブコンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブコンジュゲートＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴの組み合わせが、固形腫瘍細胞の細胞質における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な標的化送達を誘導し、それによって、インビボで、腫瘍標的化遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、且つ可能にする。
１標的２成分系（１Ｔ２Ｃ）は、図１Ａ、Ｅに示すように、ｍＡｂ１－タンパク質毒素及びｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせ処理である。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨはシステイン残基（Ｃｙｓ）を介して、ＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴはリシン残基を介して、セツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識及び結合するモノクローナル抗体）に、いずれもＤＡＲ ４でコンジュゲートさせ、２つのコンジュゲート、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４を生成した。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内投与、（ｉ．ｐ．））及びセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））の組み合わせを、ＥＧＦＲ腫瘍標的化遺伝子サイレンシング活性についてＡ４３１異種移植マウス腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍が約１５０ｍｍ３のサイズに達した１２日目に投薬を開始し、最初の投薬の７２時間後に腫瘍試料を採取し、対照遺伝子ｍＲＮＡ発現レベル（参照遺伝子）と比較してＨＳＰ２７遺伝子発現について分析した。これにより、５０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の１回の投与が、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又はセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の単独療法の単回投与と比較して、Ａ４３１腫瘍においてＨＳＰ２７遺伝子発現の５０％の減少をもたらしたことが明らかになった（図１８）。ビヒクル対照腫瘍と比較して、４０％のＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングの減少が観察された。これは、１Ｔ２Ｃ発明による、セツキシマブコンジュゲートＳＯ１８６１＋セツキシマブコンジュゲートＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴの組み合わせが、固形腫瘍細胞の細胞質における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な標的化送達を誘導し、それによって、インビボで、腫瘍標的化遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、且つ可能にする。
【0228】
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してトラスツズマブ（ヒトＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）に、ＤＡＲ ４でコンジュゲートさせ、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を生成した。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びトラスツズマブ－サポリン（トラスツズマブタンパク質毒素コンジュゲート）の組み合わせを、高ＨＥＲ２発現レベルの、トラスツズマブ単独療法に抵抗性があるマウス腫瘍モデル（患者由来異種移植腫瘍モデル、ＰＤＸ）において試験した。４０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内投与、（ｉ．ｐ．）） ＋０．０３（１、８日目）／０．０２（１５、２２、３０、３６、４３日目）ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））の１Ｔ２Ｃ発明による組み合わせが、ビヒクル対照及び４０ｍｇ／ｋｇトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又は０．０３／０．０２ｍｇ／ｋｇトラスツズマブ－サポリン単独療法と比較して、強力な腫瘍増殖阻害を示した（図１９）。さらに、低用量の組み合わせ（４０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋０．０１ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン）で処置された癌担持マウスでは、腫瘍増殖阻害活性は観察されなかった（図２６）。これは、トラスツズマブコンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブコンジュゲートタンパク質毒素の１Ｔ２Ｃ組み合わせが、固形腫瘍細胞の細胞質における治療用タンパク質毒素の効率的な標的化送達を誘導し、それによってインビボで腫瘍細胞死及び腫瘍増殖阻害を誘導することを示し、且つ可能にする。
【0229】
実施例１３．２標的２成分系（インビボ）
２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ２タンパク質毒素の組み合わせ処置である（図１Ｂ～Ｄ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨをシステイン残基（Ｃｙｓ）を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にＤＡＲ４でコンジュゲートさせ、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を生成した。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンの組み合わせを、図１Ｂ～Ｄに示すように、ＥＧＦＲ腫瘍標的化細胞死滅についてＡ４３１（＋＋／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）異種移植「ヌード」マウス腫瘍モデルにおいて試験した。用量漸増を行い、治療効果を決定した（９日目：０．３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．１ｍｇ／ｋｇのセＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、１４、１８日目：０．１ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、２１日目：０．０５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋１５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、２８日目：０．０２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０２ｍｇ／ｋｇのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋１５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４トラスツズマブ－サポリン／セツキシマブ－ＳＯ１８６１）。対照はそれぞれ同じ投与スキームであり、セツキシマブ（ｉ．ｖ．）のみを２５ｍｇ／ｋｇ、処置日毎に投与した）。３２日目（縦の破線）、３５日目及び３９日目に、本発明者らは、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内注射（ｉ．ｐ．）＋０．０２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０２ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（静脈内投与（ｉ．ｖ．））の２Ｔ２Ｃ発明による組み合わせを開始し、これにより、ビヒクル対照、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又は０．０２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン／ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン単独療法と比較して、両２Ｔ２Ｃ組み合わせ群は強力な腫瘍退縮を示すことが明らかになった（図２０）。２Ｔ２Ｃ系は、臨床的に使用されているＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体であるセツキシマブよりも優れている。次に、本発明者らは同じ実験を行ったが、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内注射（ｉ．ｐ．））＋０．０３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０３ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（静脈内投与（ｉ．ｖ．））の処置で試験を開始し、９日目及び１４日目に投与し、その後、１週間に１回投与した。本発明による２Ｔ２Ｃ系は、全てのマウスで腫瘍退縮を示し、両方の２Ｔ２Ｃ群中の１匹のマウスでは、完全な腫瘍根絶（腫瘍体積＝０ｍｍ３）を示した（図２１）。また、ここでは、対照が腫瘍体積を強く増加させ、一方、このＡ４３１マウスモデルの陽性対照であるセツキシマブは、腫瘍増殖阻害のみを示し、退縮は示さなかった（図２１）。これは、セツキシマブコンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブコンジュゲートタンパク質毒素又はＣＤ７１ｍａｂコンジュゲートタンパク質毒素の２Ｔ２Ｃ系アプローチが、担癌マウスの固形腫瘍の細胞質に高効率で標的タンパク質毒素送達をインビボで誘導し、これにより、一部のマウスで完全な腫瘍根絶が誘導され、他のマウスでも大サイズの腫瘍（２０００ｍｍ３）の強力な腫瘍退縮が誘導されることを示し、且つ可能にする。
２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ２タンパク質毒素の組み合わせ処置である（図１Ｂ～Ｄ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨをシステイン残基（Ｃｙｓ）を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にＤＡＲ４でコンジュゲートさせ、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を生成した。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンの組み合わせを、図１Ｂ～Ｄに示すように、ＥＧＦＲ腫瘍標的化細胞死滅についてＡ４３１（＋＋／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）異種移植「ヌード」マウス腫瘍モデルにおいて試験した。用量漸増を行い、治療効果を決定した（９日目：０．３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．１ｍｇ／ｋｇのセＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、１４、１８日目：０．１ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、２１日目：０．０５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋１５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、２８日目：０．０２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０２ｍｇ／ｋｇのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋１５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４トラスツズマブ－サポリン／セツキシマブ－ＳＯ１８６１）。対照はそれぞれ同じ投与スキームであり、セツキシマブ（ｉ．ｖ．）のみを２５ｍｇ／ｋｇ、処置日毎に投与した）。３２日目（縦の破線）、３５日目及び３９日目に、本発明者らは、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内注射（ｉ．ｐ．）＋０．０２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０２ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（静脈内投与（ｉ．ｖ．））の２Ｔ２Ｃ発明による組み合わせを開始し、これにより、ビヒクル対照、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又は０．０２ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン／ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン単独療法と比較して、両２Ｔ２Ｃ組み合わせ群は強力な腫瘍退縮を示すことが明らかになった（図２０）。２Ｔ２Ｃ系は、臨床的に使用されているＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体であるセツキシマブよりも優れている。次に、本発明者らは同じ実験を行ったが、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内注射（ｉ．ｐ．））＋０．０３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－サポリン又は０．０３ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（静脈内投与（ｉ．ｖ．））の処置で試験を開始し、９日目及び１４日目に投与し、その後、１週間に１回投与した。本発明による２Ｔ２Ｃ系は、全てのマウスで腫瘍退縮を示し、両方の２Ｔ２Ｃ群中の１匹のマウスでは、完全な腫瘍根絶（腫瘍体積＝０ｍｍ３）を示した（図２１）。また、ここでは、対照が腫瘍体積を強く増加させ、一方、このＡ４３１マウスモデルの陽性対照であるセツキシマブは、腫瘍増殖阻害のみを示し、退縮は示さなかった（図２１）。これは、セツキシマブコンジュゲートＳＯ１８６１＋トラスツズマブコンジュゲートタンパク質毒素又はＣＤ７１ｍａｂコンジュゲートタンパク質毒素の２Ｔ２Ｃ系アプローチが、担癌マウスの固形腫瘍の細胞質に高効率で標的タンパク質毒素送達をインビボで誘導し、これにより、一部のマウスで完全な腫瘍根絶が誘導され、他のマウスでも大サイズの腫瘍（２０００ｍｍ３）の強力な腫瘍退縮が誘導されることを示し、且つ可能にする。
【0230】
実施例１４．２標的２成分系（インビトロ）
結果
２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ２－タンパク質毒素の組み合わせ処理である（図１Ｂ～Ｄ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にＤＡＲ３．７でコンジュゲートさせた。（セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７）。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素のサポリンにコンジュゲートさせたトラスツズマブ）に対してタイトレーションし、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１、ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－；ＣａＳＫｉ、ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を、図１Ｂ～Ｄに示すように決定した。これにより、低濃度のセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７での強い細胞死滅が明らかになった（Ａ４３１：ＩＣ５０＝３ｎＭ及びＣａＳＫｉ ＩＣ５０＝１０ｎＭ；図２２Ａ、２２Ｂ）が、一方、同等の濃度のセツキシマブ、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７又はセツキシマブ＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞においていかなる細胞死滅活性も全く誘導することができなかった。これは、比較的低濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１コンジュゲートがトラスツズマブコンジュゲートタンパク質毒素のエンドソームエスケープを（非有効濃度で）効率的に増強し、それによって、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞の効率的な細胞死滅を誘導することを示している。
結果
２標的２成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ２－タンパク質毒素の組み合わせ処理である（図１Ｂ～Ｄ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にＤＡＲ３．７でコンジュゲートさせた。（セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７）。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素のサポリンにコンジュゲートさせたトラスツズマブ）に対してタイトレーションし、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１、ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－；ＣａＳＫｉ、ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を、図１Ｂ～Ｄに示すように決定した。これにより、低濃度のセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７での強い細胞死滅が明らかになった（Ａ４３１：ＩＣ５０＝３ｎＭ及びＣａＳＫｉ ＩＣ５０＝１０ｎＭ；図２２Ａ、２２Ｂ）が、一方、同等の濃度のセツキシマブ、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７又はセツキシマブ＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞においていかなる細胞死滅活性も全く誘導することができなかった。これは、比較的低濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１コンジュゲートがトラスツズマブコンジュゲートタンパク質毒素のエンドソームエスケープを（非有効濃度で）効率的に増強し、それによって、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞の効率的な細胞死滅を誘導することを示している。
【0231】
次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７に対してタイトレーションし、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７が、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞において既に効率的な細胞死滅を誘導し（Ａ４３１：ＩＣ５０＝５ｐＭ；及びＣａＳＫｉ：ＩＣ５０＝１ｐＭ；図２２Ｃ及び２２Ｄ）、一方、トラスツズマブ－サポリン単独、又はトラスツズマブ－サポリン＋７５ｎＭセツキシマブは、両細胞株において有意な細胞死滅活性を示さない（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）（図２２Ｃ、２２Ｄ）ことが明らかになった。この全ては、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞において、低濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１コンジュゲートと組み合わせた比較的低濃度のトラスツズマブ－サポリンが有効であり、細胞死滅を誘導し得ることを示している。
【0232】
次に、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７を、固定濃度５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンに対してタイトレーションし、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）又はＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を、図１Ｂ～Ｄに示すように測定した。ＨｅＬａ（＋／－／ＨＥＲ２＋／－）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞はいずれも、低濃度のセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７＋５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンで細胞死滅を示さない（ＨｅＬａ：ＩＣ５０＝４００ｎＭ；Ａ２０５８：ＩＣ５０＞４００ｎＭ；図２３０Ａ、２３Ｂ）で細胞死滅を示さない。これは、十分な受容体発現がなければ、細胞内に送達されるＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び細胞質送達を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。次に、トラスツズマブ－サポリンを、固定濃度７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７に対してタイトレーションし、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）又はＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－））に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）及びＡ２０５８（－／ＨＥＲ２＋／－））細胞はいずれも、細胞死滅活性を示さなかった（ＨｅＬａ：ＩＣ５０＞１０．０００ｐＭ；Ａ２０５８：ＩＣ５０＞１０．０００ｐＭ；図２３Ｃ、２３Ｄ）。この全ては、ＥＧＦＲ受容体の発現が低いか又は発現しない細胞は、細胞の細胞質内での毒素のエンドソームエスケープを確実にするのに十分なＳＯ１８６１の抗体媒介送達を促進する十分なＥＧＦＲ受容体（閾値）が欠如しているために、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７＋トラスツズマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。
【0233】
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してトラスツズマブ（ヒトＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）に、ＤＡＲ ４でコンジュゲートさせた（トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチン（ＥＧＦＲ標的化リガンド毒素融合タンパク質）に対してタイトレーションし、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３：ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、低濃度のトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチン（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｎＭ；図２４Ａ）での強い細胞死滅を明らかになったが、一方、同等濃度のトラスツズマブ、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４、又はトラスツズマブ＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンは、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞において、細胞死滅活性を誘導することができなかった。これは、トラスツズマブコンジュゲートＳＯ１８６１が、ＥＧＦ融合タンパク質毒素のエンドソームエスケープを（非有効濃度で）効率的に増強し、それによって、高ＨＥＲ２／低ＥＧＦＲ発現細胞の細胞死滅を誘導することを示している。
【0234】
次に、ＥＧＦジアンチンを、固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４に対してタイトレーションし、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）発現細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、低濃度のＥＧＦジアンチンと組み合わせた２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞において既に効率的な細胞死滅を誘導した（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｐＭ）（図２４Ｂ）が、ＥＧＦジアンチン単独又はＥＧＦジアンチン＋２．５ｎＭ トラスツズマブは細胞死滅活性を示さない（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）（図２４Ｂ）ことが明らかになった。この全ては、高ＨＥＲ２／低ＥＧＦＲ発現細胞において、低濃度のトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４と組み合わせてようやく比較的低濃度のＥＧＦジアンチンが有効であり、細胞死滅を誘導し得ることを示している。
【0235】
次に、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、固定濃度１．５ｐＭのＥＧＦジアンチンに対してタイトレーションし、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。両細胞株は、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの組み合わせに対して全く感受性がなかった。（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図２５Ａ、２５Ｂ）。これは、十分なＨＥＲ２受容体発現がなければ、細胞内に送達されるＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び細胞質送達を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。
【0236】
次に、ＥＧＦジアンチンを、固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４に対してタイトレーションし、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。両細胞株は、２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の有無にかかわらず、高濃度のＥＧＦジアンチンで細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＝１０，０００ｐＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＝２００ｐＭ 図２５Ｃ、２５Ｄ）。
【0237】
この全ては、ＨＥＲ２受容体の発現が低いか又は発現しない細胞は、細胞の細胞質内での毒素のエンドソームエスケープを確実にするのに十分なＳＯ１８６１の抗体媒介送達を促進する十分なＨＥＲ２受容体（閾値）が欠如しているために、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３．７＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。
【0238】
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してトラスツズマブ（ヒトＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）に、ＤＡＲ ４でコンジュゲートさせた（トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、固定濃度５ｐＭのセツキシマブ－サポリン（ＥＧＦＲ標的抗体－タンパク質毒素コンジュゲート）に対してタイトレーションし、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３：ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を図１Ｂ～Ｄに示すように測定した。これにより、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞において、低濃度のトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリンでの強い細胞死滅（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｎＭ；図２６Ａ）が明らかになったが、一方、同等濃度のトラスツズマブ、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又はトラスツズマブ＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリンは、細胞死滅活性を誘導することができなかった。これは、トラスツズマブコンジュゲートＳＯ１８６１が、セツキシマブコンジュゲートタンパク質毒素のエンドソームエスケープを（非有効濃度で）効率的に増強し、それによって、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞の細胞死滅を誘導することを示している。
【0239】
次に、セツキシマブ－サポリンを、固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び７５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４に対してタイトレーションし、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３：ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。これにより、低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４が、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において効率的な細胞死滅を既に誘導し（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｐＭ；図２６Ｂ）、一方、セツキシマブ－サポリン単独又はセツキシマブ－サポリン＋２．５ｎＭトラスツズマブが、高濃度のトラスツズマブ－サポリンでようやく細胞死滅を示した（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＞４０００ｐＭ；図２６Ｂ）ことが明らかとなった。この全ては、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞において、低濃度のトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４と組み合わせてようやく比較的低濃度のセツキシマブ－サポリンが有効になり、細胞死滅を誘導し得ることを示している。
【0240】
次に、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、固定濃度５ｐＭのセツキシマブ－サポリンに対してタイトレーションし、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。両細胞株は、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がなかった。（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図２７Ａ、２７Ｂ）。これは、十分なＨＥＲ２受容体発現がなければ、細胞内に送達されるＳＯ１８６１が、タンパク質毒素のエンドソームエスケープ及び細胞質送達を誘導する有効濃度（閾値）に達しないことを示している。
【0241】
次に、セツキシマブ－サポリンを、固定濃度２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４に対してタイトレーションし、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）細胞に対する標的化タンパク質毒素媒介細胞死滅を測定した。両細胞株は、２．５ｎＭトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（の有無にかかわらず、同様のセツキシマブ－サポリン濃度で細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＝８０ｐＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＝１００ｐＭ；図２７Ｃ、２７Ｄ）。
【0242】
この全ては、ＨＥＲ２受容体の発現が低いか又発現しない細胞は、細胞の細胞質内での毒素のエンドソームエスケープを確実にするのに十分なＳＯ１８６１の抗体媒介送達を促進する十分なＨＥＲ２受容体（閾値）が欠如しているために、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋セツキシマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性がないことを示している。
【0243】
参考文献
・Ｗｉｌｔｏｎ， Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） “ｓｄＡｂ－ＤＢ：Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄａｔａｂａｓｅ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７（１１）：２４８０－２４８４．
。ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．８ｂ００４０７
・Ｍａｒｔａ Ｋｉｊａｎｋａ ＆ Ｆｒａｎｋ－Ｊａｎ Ｗａｒｎｄｅｒｓ ＆ Ｍｏｈａｍｅｄ Ｅｌ Ｋｈａｔｔａｂｉ ＆ Ｍａｒｊｏｌｉｊｎ Ｌｕｂ－ｄｅ Ｈｏｏｇｅ ＆ Ｇｏｏｉｔｚｅｎ Ｍ．ｖａｎ Ｄａｍ ＆ Ｖａｓｉｌｉｓ Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ ＆ Ｌｉｅｓｂｅｔｈ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ＆ Ｓａｂｒｉｎａ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＆ Ｐａｕｌ Ｍ．Ｐ．ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎ， “Ｒａｐｉｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ＶＨＨｓ ｓ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ｆｏｒ ｉｍａｇｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｇｅｒｙ”， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ （２０１３） ４０：１７１８－１７２９ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５９－０１３－２４７１－２
・Ｋａｒｅｎ Ｍｅｒｃｉｅｒ， Ｒａｉｍｏｎｄ Ｈｅｕｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｉｒａｚ Ｆｒｙｄｍａｎ， “Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ （ＳＰＲｉ） － Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｑ１７ｃ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， Ｈｏｒｉｂａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＳＰＲｉ ４２， ２０１９
・Ｗｉｌｔｏｎ， Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） “ｓｄＡｂ－ＤＢ：Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄａｔａｂａｓｅ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７（１１）：２４８０－２４８４．
。ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．８ｂ００４０７
・Ｍａｒｔａ Ｋｉｊａｎｋａ ＆ Ｆｒａｎｋ－Ｊａｎ Ｗａｒｎｄｅｒｓ ＆ Ｍｏｈａｍｅｄ Ｅｌ Ｋｈａｔｔａｂｉ ＆ Ｍａｒｊｏｌｉｊｎ Ｌｕｂ－ｄｅ Ｈｏｏｇｅ ＆ Ｇｏｏｉｔｚｅｎ Ｍ．ｖａｎ Ｄａｍ ＆ Ｖａｓｉｌｉｓ Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ ＆ Ｌｉｅｓｂｅｔｈ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ＆ Ｓａｂｒｉｎａ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＆ Ｐａｕｌ Ｍ．Ｐ．ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎ， “Ｒａｐｉｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ＶＨＨｓ ｓ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ｆｏｒ ｉｍａｇｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｇｅｒｙ”， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ （２０１３） ４０：１７１８－１７２９ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５９－０１３－２４７１－２
・Ｋａｒｅｎ Ｍｅｒｃｉｅｒ， Ｒａｉｍｏｎｄ Ｈｅｕｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｉｒａｚ Ｆｒｙｄｍａｎ， “Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ （ＳＰＲｉ） － Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｑ１７ｃ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， Ｈｏｒｉｂａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＳＰＲｉ ４２， ２０１９
【0244】
配列番号
配列番号１：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ２Ｒｂ１７ｃのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
配列番号１：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ２Ｒｂ１７ｃのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0245】
【化2】
【0246】
配列番号２：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ２Ｒｂ１７ｃのアミノ酸配列
【0247】
【化3】
【0248】
配列番号３：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ＮＢ２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0249】
【化4】
【0250】
配列番号４：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ＮＢ２のアミノ酸配列
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号５：抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｐｃＮＢ２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号５：抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｐｃＮＢ２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
【0251】
【化5】
【0252】
配列番号６：抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｐｃＮＢ２のアミノ酸配列、合成コンストラクト
ＭＥＶＱＬＶＥＫＧＧＧＲＶＱＡＧＧＳＬＲＬＲＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＲＩＲＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＲＭＲＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＲＶＴＶＳＫＨＨＨＨＨＨ
配列番号７：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ７Ｄ１２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＭＥＶＱＬＶＥＫＧＧＧＲＶＱＡＧＧＳＬＲＬＲＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＲＩＲＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＲＭＲＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＲＶＴＶＳＫＨＨＨＨＨＨ
配列番号７：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ７Ｄ１２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0253】
【化6】
【0254】
配列番号８：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ７Ｄ１２のアミノ酸配列
ＡＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号９：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ９Ｇ８のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＡＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号９：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ９Ｇ８のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0255】
【化7】
【0256】
配列番号１０：ラクダ科動物由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ９Ｇ８のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＶＡＩＮＷＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＹＱＩＮＳＧＮＹＮＦＫＤＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１１：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＶＡＩＮＷＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＹＱＩＮＳＧＮＹＮＦＫＤＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１１：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
【0257】
【化8】
【0258】
配列番号１２：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ１のアミノ酸配列、合成コンストラクト
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＶＩＮＤＦＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＶＡＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＶＧＧＲＤＬＧＷＰＹＥＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＶＩＮＤＦＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＶＡＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＶＧＧＲＤＬＧＷＰＹＥＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
【0259】
【化9】
【0260】
配列番号１４：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ２のアミノ酸配列、合成コンストラクト
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＮＫＴＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＧＳＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＮＲＬＧＰＡＡＬＲＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１５：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ３のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＮＫＴＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＧＳＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＮＲＬＧＰＡＡＬＲＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１５：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ３のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
【0261】
【化10】
【0262】
配列番号１６：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ３のアミノ酸配列、合成コンストラクト
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＶＲＶＮＹＫＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＴＳＲＮＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＲＡＨＨＡＰＶＲＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１７：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ４のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＶＲＶＮＹＫＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＴＳＲＮＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＲＡＨＨＡＰＶＲＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１７：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ４のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、合成コンストラクト
【0263】
【化11】
【0264】
配列番号１８：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ４のアミノ酸配列、合成コンストラクト
ＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＶＴＩＴＤＥＤＭＴＲＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＬＮＴＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＨＥＫＡＡＤＭＮＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－８５のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＶＴＩＴＤＥＤＭＴＲＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＬＮＴＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＨＥＫＡＡＤＭＮＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－８５のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0265】
【化12】
【0266】
配列番号２０：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－８５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＳＣＥＡＳＧＦＮＡＭＴＳＩＤＳＷＴＤＡＶＫＧＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＦＡＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＬＳＫＣＹＴＲＶＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧ
配列番号２１：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－３７のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＳＣＥＡＳＧＦＮＡＭＴＳＩＤＳＷＴＤＡＶＫＧＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＦＡＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＬＳＫＣＹＴＲＶＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧ
配列番号２１：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－３７のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0267】
【化13】
【0268】
配列番号２２：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－３７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＹＭＶＧＩＫＴＥＲＤＧＶＫＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＲＦＴＩＰＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＴＥＥＮＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧ
配列番号２３：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ１６のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＹＭＶＧＩＫＴＥＲＤＧＶＫＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＲＦＴＩＰＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＴＥＥＮＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧ
配列番号２３：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ１６のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0269】
【化14】
【0270】
配列番号２４：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ｓｄＡｂ ＮＢ１６のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＧＶＤＧＴＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＳＩＳＳＩＧＩＧＹＹＳＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＶＹＹＣＧＲＲＷＩＧＹＲＣＧＮＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２５：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ３６のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＧＶＤＧＴＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＳＩＳＳＩＧＩＧＹＹＳＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＶＹＹＣＧＲＲＷＩＧＹＲＣＧＮＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２５：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ３６のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0271】
【化15】
【0272】
配列番号２６：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ３６のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＲＹＴＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＶＡＩＴＡＦＧＳＰＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＮＮＴＩＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＭＹＹＣＡＡＲＧＳＳＧＴＳＹＫＷＮＥＹＧＳＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２７：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ９１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＲＹＴＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＶＡＩＴＡＦＧＳＰＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＮＮＴＩＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＭＹＹＣＡＡＲＧＳＳＧＴＳＹＫＷＮＥＹＧＳＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２７：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ９１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0273】
【化16】
【0274】
配列番号２８：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ９１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＫＹＴＳＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＶＶＡＨＩＤＳＧＰＲＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＬＹＬＥＭＳＴＬＫＰＤＤＴＡＭＹＹＣＡＡＧＰＭＹＳＧＳＣＮＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２９：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ａ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＫＹＴＳＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＶＶＡＨＩＤＳＧＰＲＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＬＹＬＥＭＳＴＬＫＰＤＤＴＡＭＹＹＣＡＡＧＰＭＹＳＧＳＣＮＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２９：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ａ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0275】
【化17】
【0276】
配列番号３０：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ａ１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＧＩＳＧＳＣＬＬＥＤＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３１：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ｂ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＧＩＳＧＳＣＬＬＥＤＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３１：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ｂ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
【0277】
【化18】
【0278】
配列番号３２：キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ｂ１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＤＮＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＧＳＥＧＲＲＹＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＡＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＴＶＧＦＣＳＳＱＹＧＭＥＦＶＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３３：抗マウス血清アルブミン ｓｄＡｂ ＭＳＡ２１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＦＴＦＳＲＦＧＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＶＥＷＶＳＧＩＳＳＬＧＤＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＮＰＧＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３４：抗ヒト血清アルブミン ｓｄＡｂ Ａｌｂ－１のアミノ酸配列
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３５：抗ヒト血清アルブミン ｓｄＡｂ Ａｌｂ２３のアミノ酸配列（ヒト化、最適化Ａｌｂ１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３６：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ７Ａ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＤＲＴＦＳＳＮＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＧＷＧＧＬＥＴＨＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＲＹＹＣＡＶＳＳＴＲＴＶＩＹＴＬＰＲＭＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３７：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ７Ｄ１２のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３８：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ７Ｃ１２のアミノ酸配列
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＴＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３９：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ４Ｂ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＴＦＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＶＩＩＳＧＧＳＴＨＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＭＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＫＫＦＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４０：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ３Ｇ７のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＳＩＳＴＩＮＶＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＥＩＴＲＳＧＲＴＮＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＮＬＥＤＴＡＶＹＹＣＲＴＩＤＧＳＷＲＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４１：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ２Ｃ７のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＮＹＡＩＶＩＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＦＶＡＡＩＮＷＮＳＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＬＮＡＲＮＴＶＹＬＱＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＤＣＡＡＳＨＤＳＤＹＧＧＴＮＡＮＬＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４２：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ１Ｃ７のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＲＴＡＮＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＴＷＮＳＧＴＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＦＩＳＫＤＳＡＫＮＴＩＹＬＥＭＮＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＡＡＶＩＴＰＴＲＧＹＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４３：抗ＣＥＡＣＡＭ ＶＨＨＮｂＣＥＡ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＹＧＳＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＡＩＮＲＧＧＧＹＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＤＹＹＣＡＡＳＧＶＬＧＧＬＨＥＤＷＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４４：抗ＣＥＡＣＡＭ ＶＨＨＣＥＡ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＹＧＳＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＡＶＡＡＩＮＲＧＧＧＹＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＤＹＹＣＡＡＳＧＶＬＧＧＬＨＥＤＷＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４５：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５７Ａ０７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＧＮＶＭＧＷＹＲＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＡＩＡＳＧＧＳＩＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＳＨＰＰＴＬＰＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４６：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５７Ｂ０４のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＮＦＲＦＮＳＭＧＷＷＲＲＲＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＡＩＴＳＧＤＩＴＮＹＲＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＶＫＮＴＶＹＬＱＭＮＴＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＮＴＦＰＰＩＡＤＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４７：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５１Ｄ０９のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＧＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＳＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＩＬＬＹＲＬＹＧＹＥＥＧＤＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４８：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５５Ｃ０５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＰＡＧＤＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＬＮＴＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＣＥＥＶＡＡＩＮＷＮＧＶＹＲＤＹＡＤＳＡＫＧＲＥＴＡＳＲＤＮＡＭＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＴＡＴＱＧＷＤＲＨＴＥＰＳＤＦＧＳＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４９：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５０Ｆ０７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＧＳＴＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＧＧＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＲＩＳＡＧＴＡＦＷＬＷＳＤＹＥＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５０：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５５Ｆ０３のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＰＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＹＷＳＮＧＫＴＱＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＮＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＤＫＤＥＴＧＦＲＴＬＰＩＡＹＤＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５１：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５５Ａ０１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＲＡＬＮＭＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＮＥＲＥＦＶＡＡＴＳＳＳＧＧＳＴＳＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＲＣＡＡＳＰＹＶＳＴＰＴＭＮＩＬＥＥＹＲＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５２：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０４Ｅ０９のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＬＣＩＤＡＳＤＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＴＰＩＧＬＳＳＳＣＬＬＥＹＤＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５３：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０６Ｂ０８のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＳＲＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＤＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＰＮＴＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＹＲＳＧＳＹＹＱＡＳＥＷＴＲＰＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５４：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０６Ｃ１２のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＤＹＦＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＥＩＳＣＩＳＮＳＤＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＩＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＴＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＰＶＧＬＧＰＦＣＫＴＴＮＤＹＤＹＳＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５５：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０６Ｆ１０のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＧＧＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＬＧＬＳＳＳＣＨＧＤＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５６：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ２１Ｆ６のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＹＹＬＮＡＭＧＷＦＲＱＧＰＧＫＤＲＥＦＶＡＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５７：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ４Ｃ７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＡＷＶＳＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＤＬＮＮＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５８：抗Ｈｅｒ３のＶＨＨ１７Ｂ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＧＧＬＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＩＡＫＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＮＳＥＤＴＡＶＹＹＣＲＭＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５９：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ１８Ｇ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＬＦＫＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＲＲＥＬＶＡＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＷＮＡＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＨＳＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭＹＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６０：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ３４Ｃ７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＧＬＳＣＶＡＳＧＳＩＦＲＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＶＤＮＡＷＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＶＥＤＴＡＶＹＹＣＮＬＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６１：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ４７Ｄ５のアミノ酸配列
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＧＦＮＤＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＲＶＧＶＴＳＳＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＶＮＡＫＤＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＤＱＲＬＤＧＳＴＬＡＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６２：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ２Ｄ３のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６３：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ５Ｆ７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６４：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１３Ｄ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＳＬＤＤＹＧＭＴＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＮＰＥＤＴＡＶＹＹＣＧＱＧＷＫＩＶＰＴＮＰＲＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６５：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ２Ｂ４のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＳＬＤＤＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＳＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＱＧＷＫＩＲＰＴＩＰＭＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６６：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ２Ｇ２のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＳＬＤＤＹＧＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＮＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＲＧＷＫＩＶＰＴＤＬＧＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６７：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１３Ｇ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＩＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＮＷＳＧＳＨＳＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＰＧＷＧＴＡＰＬＳＴＳＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６８：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１２Ｅ３３のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＭＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＬＳＮＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＹＤＡＤＦＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＧＷＧＴＧＲＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６９：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１３Ｆ２１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＳＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＴＩＶＳＩＮＡＴＳＷＹＲＱＡＰＧＮＱＲＥＬＶＡＴＩＩＧＤＧＲＴＨＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＡＡＡＮＬＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＳＤＴＡＩＹＳＣＮＡＮＧＩＥＳＹＧＷＧＮＲＨＦＮＹＷＴＶＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７０：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１１Ａ１０１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＰＧＶＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＴＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＬＡＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７１：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１１Ａ２２のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＩＡＧＩＲＷＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＶＳＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７２：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１２Ｄ４４のアミノ酸配列
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＩＡＧＩＲＷＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＡＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＧＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＶＳＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＤＮＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＧＳＥＧＲＲＹＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＡＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＴＶＧＦＣＳＳＱＹＧＭＥＦＶＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３３：抗マウス血清アルブミン ｓｄＡｂ ＭＳＡ２１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＦＴＦＳＲＦＧＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＶＥＷＶＳＧＩＳＳＬＧＤＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＮＰＧＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３４：抗ヒト血清アルブミン ｓｄＡｂ Ａｌｂ－１のアミノ酸配列
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３５：抗ヒト血清アルブミン ｓｄＡｂ Ａｌｂ２３のアミノ酸配列（ヒト化、最適化Ａｌｂ１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３６：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ７Ａ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＤＲＴＦＳＳＮＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＧＷＧＧＬＥＴＨＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＲＹＹＣＡＶＳＳＴＲＴＶＩＹＴＬＰＲＭＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３７：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ７Ｄ１２のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３８：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ７Ｃ１２のアミノ酸配列
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＴＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３９：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ４Ｂ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＴＦＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＶＩＩＳＧＧＳＴＨＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＭＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＫＫＦＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４０：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ３Ｇ７のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＳＩＳＴＩＮＶＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＥＩＴＲＳＧＲＴＮＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＮＬＥＤＴＡＶＹＹＣＲＴＩＤＧＳＷＲＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４１：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ２Ｃ７のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＮＹＡＩＶＩＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＦＶＡＡＩＮＷＮＳＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＬＮＡＲＮＴＶＹＬＱＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＤＣＡＡＳＨＤＳＤＹＧＧＴＮＡＮＬＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４２：抗インシュリン様成長因子１受容体ＶＨＨ１Ｃ７のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＲＴＡＮＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＴＷＮＳＧＴＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＦＩＳＫＤＳＡＫＮＴＩＹＬＥＭＮＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＡＡＶＩＴＰＴＲＧＹＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４３：抗ＣＥＡＣＡＭ ＶＨＨＮｂＣＥＡ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＹＧＳＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＡＩＮＲＧＧＧＹＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＤＹＹＣＡＡＳＧＶＬＧＧＬＨＥＤＷＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４４：抗ＣＥＡＣＡＭ ＶＨＨＣＥＡ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＹＧＳＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＡＶＡＡＩＮＲＧＧＧＹＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＤＹＹＣＡＡＳＧＶＬＧＧＬＨＥＤＷＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４５：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５７Ａ０７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＧＮＶＭＧＷＹＲＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＡＩＡＳＧＧＳＩＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＳＨＰＰＴＬＰＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４６：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５７Ｂ０４のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＮＦＲＦＮＳＭＧＷＷＲＲＲＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＡＩＴＳＧＤＩＴＮＹＲＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＶＫＮＴＶＹＬＱＭＮＴＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＮＴＦＰＰＩＡＤＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４７：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５１Ｄ０９のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＧＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＳＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＩＬＬＹＲＬＹＧＹＥＥＧＤＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４８：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５５Ｃ０５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＰＡＧＤＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＬＮＴＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＣＥＥＶＡＡＩＮＷＮＧＶＹＲＤＹＡＤＳＡＫＧＲＥＴＡＳＲＤＮＡＭＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＴＡＴＱＧＷＤＲＨＴＥＰＳＤＦＧＳＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４９：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５０Ｆ０７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＧＳＴＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＧＧＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＲＩＳＡＧＴＡＦＷＬＷＳＤＹＥＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５０：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５５Ｆ０３のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＰＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＹＷＳＮＧＫＴＱＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＮＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＤＫＤＥＴＧＦＲＴＬＰＩＡＹＤＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５１：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ５５Ａ０１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＲＡＬＮＭＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＮＥＲＥＦＶＡＡＴＳＳＳＧＧＳＴＳＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＲＣＡＡＳＰＹＶＳＴＰＴＭＮＩＬＥＥＹＲＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５２：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０４Ｅ０９のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＬＣＩＤＡＳＤＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＴＰＩＧＬＳＳＳＣＬＬＥＹＤＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５３：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０６Ｂ０８のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＳＲＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＤＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＰＮＴＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＹＲＳＧＳＹＹＱＡＳＥＷＴＲＰＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５４：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０６Ｃ１２のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＤＹＦＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＥＩＳＣＩＳＮＳＤＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＩＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＴＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＰＶＧＬＧＰＦＣＫＴＴＮＤＹＤＹＳＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５５：抗ｃ－ＭＥＴ ＶＨＨ０６Ｆ１０のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＧＧＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＬＧＬＳＳＳＣＨＧＤＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５６：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ２１Ｆ６のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＹＹＬＮＡＭＧＷＦＲＱＧＰＧＫＤＲＥＦＶＡＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５７：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ４Ｃ７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＡＷＶＳＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＤＬＮＮＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５８：抗Ｈｅｒ３のＶＨＨ１７Ｂ５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＧＧＬＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＩＡＫＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＮＳＥＤＴＡＶＹＹＣＲＭＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５９：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ１８Ｇ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＬＦＫＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＲＲＥＬＶＡＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＷＮＡＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＨＳＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭＹＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６０：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ３４Ｃ７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＧＬＳＣＶＡＳＧＳＩＦＲＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＶＤＮＡＷＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＶＥＤＴＡＶＹＹＣＮＬＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６１：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ４７Ｄ５のアミノ酸配列
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＧＦＮＤＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＲＶＧＶＴＳＳＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＶＮＡＫＤＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＤＱＲＬＤＧＳＴＬＡＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６２：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ２Ｄ３のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６３：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ５Ｆ７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６４：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１３Ｄ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＳＬＤＤＹＧＭＴＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＮＰＥＤＴＡＶＹＹＣＧＱＧＷＫＩＶＰＴＮＰＲＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６５：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ２Ｂ４のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＳＬＤＤＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＳＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＱＧＷＫＩＲＰＴＩＰＭＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６６：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ２Ｇ２のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＳＬＤＤＹＧＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＮＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＲＧＷＫＩＶＰＴＤＬＧＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６７：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１３Ｇ１１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＩＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＮＷＳＧＳＨＳＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＰＧＷＧＴＡＰＬＳＴＳＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６８：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１２Ｅ３３のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＭＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＬＳＮＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＹＤＡＤＦＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＧＷＧＴＧＲＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６９：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１３Ｆ２１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＳＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＴＩＶＳＩＮＡＴＳＷＹＲＱＡＰＧＮＱＲＥＬＶＡＴＩＩＧＤＧＲＴＨＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＡＡＡＮＬＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＳＤＴＡＩＹＳＣＮＡＮＧＩＥＳＹＧＷＧＮＲＨＦＮＹＷＴＶＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７０：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１１Ａ１０１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＰＧＶＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＴＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＬＡＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７１：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１１Ａ２２のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＩＡＧＩＲＷＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＶＳＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７２：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ１２Ｄ４４のアミノ酸配列
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＩＡＧＩＲＷＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＡＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＧＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＶＳＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
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【図8D】
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【配列表】